CN107334777A - 干扰btf3在抑制黑色素瘤细胞增殖中的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干扰BTF3在抑制黑色素瘤细胞增殖中的新用途，更进一步，本发明提供下调BTF3表达或BTF3活性的物质在制备诊断和/或治疗黑色素瘤的药物或装置中的用途，还提供一种干扰黑色素瘤细胞BTF3的方法。在黑色素瘤细胞中干扰目的基因BTF3的表达可抑制黑色素瘤细胞的增殖并促进其凋亡，或可实现黑色素瘤的精准治疗。上述方法可实现对黑色素瘤细胞中BTF3的干扰，可具体应用于黑色素瘤的研究、诊断和治疗中；并且，由此构建的干扰黑色素瘤细胞中BTF3的慢病毒或类似物可以进一步用在制备诊断和/或治疗黑色素瘤的药物或装置中，或者用在黑色素瘤细胞的实验模型建立或研究中。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及干扰BTF3在抑制黑色素瘤细胞增殖中的新用途。
背景技术
黑色素瘤是皮肤癌相关死亡的最主要原因，并在过去几年呈现上升趋势。虽然手术、放疗和化疗显著改善了局部黑色素瘤患者的临床获益，但对晚期或转移性黑色素瘤患者的治疗仍提出了挑战。因此，我们迫切需要找到能够特异性抑制黑色素瘤细胞增殖的方法，以期提高晚期黑色素瘤患者的生存期及生活质量。
为此，人们进行了大量研究，例如CN201010544055.0公开了针对恶性黑色素瘤的诊断和治疗的生物分子——黑色素瘤细胞相关的长非编码RNA的RNA干扰靶点RNA，以及它们在制备治疗黑色素瘤疾病药物中的用途。尽管如此，该文献没有启示通过对细胞内本身存在的转录调控因子的干扰来实现对黑色素瘤的诊断和治疗，尤其是没有启示BTF3基因与此的关系。
BTF3（Basic transcription factor 3），即基本转录因子3，是一种常见的RNA聚合酶Ⅱ的转录因子，主要参与细胞凋亡的调控。目前已发现其在多种肿瘤细胞中过度表达，主要包括结肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤细胞，但在黑色素瘤细胞中的表达情况研究尚未涉及。本申请发明人对此进行了研究，并进一步证实了BTF3基因在黑色素瘤细胞中的表达情况以及干扰其表达后对于黑色素瘤细胞产生的作用，为黑色素瘤的研究、诊断及治疗提供了一种新方法。
发明内容
本申请发明人通过干扰目的基因BTF3，抑制了黑色素瘤细胞的增殖以及促进其凋亡，揭示了其在临床上的应用价值。据此，本发明提供干扰BTF3在抑制黑色素瘤细胞增殖中的用途。
更进一步，本发明提供下调BTF3表达或BTF3活性的物质在制备诊断和/或治疗黑色素瘤的药物或装置中的用途。
在一个具体的实施方案中，所述下调BTF3表达或BTF3活性的物质的制备包括以下步骤：
1）shRNA靶点设计，目的基因BTF3 RNAi慢病毒构建；
2）目的基因RNAi慢病毒包装，得到慢病毒；
所述慢病毒即为所述下调BTF3表达或BTF3活性的物质。
在一个更具体的实施方案中，所述步骤1）包括：在完成RNA干扰靶点设计后，合成含干扰序列的单链DNA oligo（DNA寡核苷酸），退火配对产生双链DNA；随后通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体；将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子，送测序验证，对测序结果比对正确的克隆进行质粒抽提，用于下游病毒包装。
在一个更具体的实施方案中，所述步骤2）包括：采用三质粒（GV115，Helper 1.0 ，Helper 2.0 ）共转染293T细胞，在转染完成后的48-72h进行病毒收获，采用浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，最后根据严格的质量标准测定慢病毒的各项指标。
在一个具体的实施方案中，所述装置为试剂盒。
本发明还提供一种干扰黑色素瘤细胞BTF3的方法，包括以下步骤：
1）shRNA靶点设计，目的基因BTF3 RNAi慢病毒构建；
2）目的基因RNAi慢病毒包装，得到慢病毒；
3）用慢病毒感染黑色素瘤细胞。
上述方法可实现对黑色素瘤细胞中BTF3的干扰，可具体应用于黑色素瘤的研究、诊断和治疗中。并且，由此构建的干扰黑色素瘤细胞中BTF3的慢病毒或类似物可以进一步用在制备诊断和/或治疗黑色素瘤的药物或装置中，或者用在黑色素瘤细胞的实验模型建立或研究中。
在一个具体的实施方案中，所述步骤1）包括：在完成RNA干扰靶点设计后，合成含干扰序列的单链DNA oligo，退火配对产生双链DNA；随后通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体；将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子，送测序验证，对测序结果比对正确的克隆进行质粒抽提，用于下游病毒包装。
在一个具体的实施方案中，所述步骤2）包括：采用三质粒共转染293T细胞，在转染完成后的48-72h进行病毒收获，采用浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，最后根据严格的质量标准测定慢病毒的各项指标。
在一个具体的实施方案中，所述步骤3）包括：培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。可采用荧光标记慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察BTF3的表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，显示黑色素瘤细胞感染良好，可收集细胞进入下游实验。
本发明还提供一种通过干扰BTF3研究黑色素瘤细胞的方法，其在上述步骤1）至步骤3）的基础上，还包括步骤4）：通过qPCR检测mRNA水平目的基因敲减效率。
在一个具体的实施方案中，所述黑色素瘤细胞为A375黑色素瘤细胞。
在一个更具体的实施方案中，通过干扰BTF3研究黑色素瘤细胞的方法包括如下步骤：
（1）shRNA靶点设计，目的基因BTF3 RNAi慢病毒构建
完成RNA干扰靶点设计后，合成含干扰序列的单链DNA oligo，退火配对产生双链DNA；随后通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体；将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子，送测序验证，对测序结果比对正确的克隆进行质粒抽提，用于下游病毒包装。
（2）目的基因RNAi慢病毒包装
采用三质粒共转染293T细胞，在转染完成后的48-72h进行病毒收获（即未纯化的细胞上清液），采用相应的浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，最后根据严格的质量标准测定慢病毒的各项指标。
（3）慢病毒感染目的细胞
培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。
（4）通过qPCR检测mRNA水平目的基因敲减效率
（5）细胞功能实验检测
细胞功能实验检测主要包括干扰目的基因BTF3对细胞周期、凋亡、克隆形成等方面的影响。
本发明通过实验证实了干扰BTF3基因能够抑制黑色素瘤细胞的增殖和促进肿瘤细胞的凋亡。
附图说明
图1显示了BTF3基因在黑色素瘤细胞中表达情况；
图2显示了qPCR检测mRNA水平BTF3基因消减效率；
图3显示了BTF3基因消减对细胞周期的影响；
图4显示了BTF3基因消减对细胞凋亡的影响；
图5显示了BTF3基因消减对细胞克隆形成能力影响的实物图；
图6显示了BTF3基因消减对细胞克隆形成能力影响的统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点随具体实施例描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明精神和范围下可以对本发明的技术方案和细节进行修改及替换，但这些修改和替换均落入本发明保护的范围内。
实施例
按照下述步骤构建慢病毒并进行感染：
1）shRNA靶点设计、目的基因BTF3 RNAi慢病毒构建
完成RNA干扰靶点设计后，合成含干扰序列的单链DNA oligo，退火配对产生双链DNA；随后通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体；将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子，送测序验证，对测序结果比对正确的克隆进行质粒抽提，用于下游病毒包装。具体步骤如下：
（1）根据RNA干扰序列设计原则，以BTF3基因为模板，设计多个19-21nt RNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取CGAAGAAGCCTGGGAATCA作为干扰靶点。
（2）根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加TTTTT终止信号，而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链DNA oligo。
（3）将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中（终浓度100M），90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。
（4）按照NEB说明书配制50μl反应体系，使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化。按照Fermentas T4 DNA Ligase说明书配制20μl反应体系，将双链DNA oligo与线性化的载体相连。
（5）将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，详细操作步骤如下：
①将10μl连接产物加入到100μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min。
②42℃热激90sec，冰浴2min。
③加入500 µL无抗生素的LB液体培养基，200rpm于37℃摇床震荡培养1hr。
④取150μl菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。
（6）阳性克隆的鉴定，保存鉴定结果正确的克隆，并进行测序。挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆用于下一步实验。
（7）将测序正确的菌液转接于150 ml含Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜。按照EndoFree Maxi Plasmid Kit说明书提取质粒，质检合格的质粒进入下游流程。
2）目的基因RNAi慢病毒包装
采用三质粒共转染293T细胞，在转染完成后的48-72h进行病毒收获（即未纯化的细胞上清液），采用相应的浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，最后根据严格的质量标准测定慢病毒的各项指标。具体步骤如下：
（1）质粒转染与慢病毒收获
转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度约5×106细胞/15 ml，重新接种于10 cm细胞培养皿，37℃、5% CO2 培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染；
转染前2 h更换为无血清培养基；
向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(GV载体质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg)，与相应体积的转染试剂混合均匀，调整总体积为1 ml，在室温下温育15 min；
混合液缓慢滴加至293T细胞培养液中，混匀，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养；
培养6 h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10 ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；
缓慢加入含10%血清的细胞培养基20 ml，于37℃、5% CO2培养箱内继续培养48-72 h。
（2）慢病毒浓缩与纯化
根据细胞状态，收集转染后48 h（转染即可计为0 h）的293T细胞上清液；
于4℃、4000 g 离心10 min，除去细胞碎片；
以0.45 μm滤器过滤上清液于40 ml超速离心管中；
分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内,设置离心参数为25000 rpm，离心时间为2 h，离心温度控制在4℃；
离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液（可用PBS或细胞培养基替代），轻轻反复吹打重悬；
经充分溶解后，高速离心10000 rpm、5min后，取上清按要求分装；
准备样品待检测。
（3）慢病毒质量检测
慢病毒的质量控制要点包括物理状态检测、无菌检测及病毒滴度检测。经过检测，均符合要求。并进一步感染目的细胞。
3）慢病毒感染目的细胞
培养生长状态良好的A375细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。荧光标记慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察BTF3的表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进入下游实验。
4）qPCR检测mRNA水平目的基因敲减效率（>50%）
为验证本发明的效果，进行以下实验：
实验1
为了检测BTF3基因在黑色素瘤细胞中的表达情况，我们选择了3株人黑色素瘤细胞，分别为A375、MUM-2、MUM-2C细胞系，BTF3基因表达情况通过real-time quantitative PCR（RT-qPCR）检测，并且以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase））作为内参基因对照，检测得到的ΔCt值分别为2.55、2.20和2.42（图1）。当ΔCt值≤12时，该细胞中基因表达丰度为高；当12<ΔCt值<16时，该细胞中基因表达丰度为中；当ΔCt值≥16时，该细胞中基因表达丰度为低。因此，可见BTF3基因在黑色素瘤细胞中均表达，且均为高表达丰度，在MUM-2B中丰度最高，在A375细胞中基因表达含量最低。
实验2
为了进一步检测干扰目的基因BTF3后对于基因表达的影响，使用基因表达丰度最低的A375细胞系，并以GAPDH作为内参基因对照，使用shCtrl及shBTF3慢病毒感染A375细胞，用RT-qPCR检测基因表达情况。从qPCR的结果中发现，经shRNA慢病毒感染后，实验组A375细胞中BTF3基因在mRNA水平的表达量明显受到抑制（p<0.05），且敲减效率达到75.5%（图2）。可见，干扰目的基因BTF3后降低了mRNA的表达水平，且敲除效率达到了我们要求的比例。其中，shCtrl作为对照组参与实验，其为正常目的细胞、加阴性对照病毒感染的细胞组，其他步骤与shBTF3操作相同。
实验3
为进一步明确BTF3基因在黑色素瘤细胞中的作用，我们对A375细胞进行了细胞周期分析。分别使用shCtrl及shBTF3慢病毒感染A375细胞，培养5天后流式检测细胞周期。结果显示，敲除BTF3基因后A375细胞更多的停留在G1期及S期（图3）。在A375细胞中G1期细胞所占比例从45.28%（shCtrl）增加到48.48%（shBTF3）。同样的，S期细胞所占百分比从39.73%（shCtrl）上升到43.04%（shBTF3）。
实验4
为了探讨干扰BTF3基因对于细胞凋亡的影响，A375细胞分别被shCtrl及shBTF3慢病毒感染，培养5天后收集细胞，Annexin-V-APC被流式细胞仪用于检测A375细胞凋亡状况（图4）。结果表明：shBTF3在A375细胞中有更高的凋亡比例，相比于对照组（shCtrl）4.24%的凋亡比例，实验组（shBTF3）的这一数值达到了14.37%。这些结果表明敲除目的基因BTF3可以促进A375细胞的凋亡。
实验5
为了检测敲除BTF3基因是否可抑制黑色素瘤细胞的生长，细胞克隆检测在A375细胞中进行（图5和图6），实验组（shBTF3）与対照组（shCtrl）克隆集落形成的数量分别为3和160。集落形成的结果表明，敲除BTF3基因可显著抑制黑色素瘤细胞集落形成活性。
以上实验结果显示，在黑色素瘤细胞中干扰目的基因BTF3的表达可抑制黑色素瘤细胞的增殖并促进其凋亡，或还可实现黑色素瘤的精准治疗。
Claims (10)
1.干扰BTF3在抑制黑色素瘤细胞增殖中的用途。
2.下调BTF3表达或BTF3活性的物质在制备诊断和/或治疗黑色素瘤的药物或装置中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述下调BTF3表达或BTF3活性的物质的制备包括以下步骤：
1）shRNA靶点设计，目的基因BTF3 RNAi慢病毒构建；
2）目的基因RNAi慢病毒包装，得到慢病毒；
所述慢病毒即为所述下调BTF3表达或BTF3活性的物质。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述步骤1）包括：在完成RNA干扰靶点设计后，合成含干扰序列的单链DNA oligo，退火配对产生双链DNA；随后通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体；将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子，送测序验证，对测序结果比对正确的克隆进行质粒抽提，用于下游病毒包装。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述步骤2）包括：采用三质粒共转染293T细胞，在转染完成后的48-72h进行病毒收获，采用浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，最后根据严格的质量标准测定慢病毒的各项指标。
6.根据权利要求2至5任一项所述的用途，其特征在于，所述装置为试剂盒。
7.一种干扰黑色素瘤细胞BTF3的方法，包括以下步骤：
1）shRNA靶点设计，目的基因BTF3 RNAi慢病毒构建；
2）目的基因RNAi慢病毒包装，得到慢病毒；
3）用慢病毒感染黑色素瘤细胞。
8.根据权利要求7所述的干扰黑色素瘤细胞中BTF3的方法，其特征在于，所述步骤1）包括：在完成RNA干扰靶点设计后，合成含干扰序列的单链DNA oligo，退火配对产生双链DNA；随后通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体；将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子，送测序验证，对测序结果比对正确的克隆进行质粒抽提，用于下游病毒包装。
9.根据权利要求7所述的干扰黑色素瘤细胞中BTF3的方法，其特征在于，所述步骤2）包括：采用三质粒共转染293T细胞，在转染完成后的48-72h进行病毒收获，采用浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，最后根据严格的质量标准测定慢病毒的各项指标。
10.一种通过干扰BTF3研究黑色素瘤细胞的方法，其特征在于，在权利要求7至9任一项所述的基础上，还包括步骤：
4）通过qPCR检测mRNA水平目的基因敲减效率。
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| CN113462644A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-10-01 | 吉林大学第一医院 | 一种高效3d培养脂肪干细胞的方法 |
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| US20030004124A1 (en) * | 2001-05-21 | 2003-01-02 | The Regents Of The University Of California | BTF3: an inhibitor of apoptosis |
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