CN114457075B - 一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 - Google Patents
一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114457075B CN114457075B CN202111535765.1A CN202111535765A CN114457075B CN 114457075 B CN114457075 B CN 114457075B CN 202111535765 A CN202111535765 A CN 202111535765A CN 114457075 B CN114457075 B CN 114457075B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- shrna
- cells
- pxylp1
- double
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用,通过RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备,将双链DNA oligo与线性化的载体相连,将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞进行阳性克隆,构建短发夹RNA慢病毒载体,敲低TSCC内源性PXYLP1基因的表达,抑制了TSCC细胞的增殖能力,诱导了TSCC细胞的凋亡,从而抑制体内肿瘤生长。
Description
技术领域
本发明涉及癌症治疗领域,具体涉及短发夹RNA介导敲低舌鳞癌细胞PXYLP1的方法及其应用。
背景技术
舌鳞状细胞癌(TSCC)是常见的恶性肿瘤之一,具有高死亡率与发病率。它的发展是一个涉及遗传改变和表观遗传修饰的多步骤过程。TSCC是许多变量的致病因素,多种遗传改变和环境因素的积累,如烟草使用,饮酒,慢性炎症和人乳头瘤病毒(HPV)感染等,最近一些报道表明年轻成人的TSCC在发病率增加,特别是在女性中,远处转移率较高,预后较差。因此,由不同风险因素引起的TSCC可能具有不同的分子基础,涉及细胞周期控制和衰老控制的丧失,细胞凋亡的失调,以及口腔扁平苔藓和白班的发生等方面。
目前化合物或天然提取物质在舌鳞状细胞癌的治疗中应用比较广泛,例如CN110680815 A和CN 111773218 A,但是小干扰RNA生物药物在制备治疗舌鳞状细胞癌方面的应用较少,化疗药物副作用大,选择性差,靶向性较低,应用有局限性。
评价肿瘤生物学行为的主要指标有肿瘤细胞增殖、生长形成能力、凋亡等。本研究通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达,观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响,为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向治疗方案提供参考。探索无创、安全和便捷的方式检测特异性基因PXYLP1,有利于辅助舌鳞癌诊断、治疗和预后预测。
发明内容
针对上述存在的技术不足,本发明的目的是提供一种短发夹RNA介导敲低舌鳞癌细胞PXYLP1的方法,通过通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达,以实现抑制肿瘤的作用。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA,所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链,所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列,所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列,所述的正链和反链退火,形成带粘性末端的双链DNA:
SEQ 1:
5’-CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG-3’
SEQ 2:
5’-AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG-3’。
优选地,所述shRNA干扰靶点为CGGTAAGAAACCAGTATCT。
本发明的第二个目的是提供一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体,所述慢病毒载体由上述合成的双链DNA克隆入慢病毒载体GV 115中制成。
本发明的第三个目的是提供所述的慢病毒载体的构建方法,包括以下步骤:
1)针对RNA干扰靶点序列设计合成双链DNA oligo:合成权利要求1所述的DNAoligo的正链和反链,将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中,90℃水浴15min;自然冷却至室温后,形成带粘性末端的双链DNA;
2)线性化载体的制备:使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化,37℃反应1h,切胶回收目的片段;
3)生成双链DNA oligo与线性化载体的连接产物:将步骤1)得到的双链DNA oligo与步骤2)得到的线性化载体于20μl反应体系中,16℃反应1h-3h,连接产物命名为psc54972;
4)克隆转化:将步骤3)连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞,对阳性克隆进行PCR鉴定;
5)质粒抽提:将测序正确的菌液转接于培养基中,提取质粒,将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。
本发明的第四个目的是提供所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。
本发明的有益效果在于:本研究通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达,包括针对PXYLP1基因的干扰靶点序列,包装构建慢病毒,对PXYLP1基因进行敲减后,发现显著影响舌鳞癌细胞CAL-27细胞和SCC-25细胞的增殖,影响细胞生长形成能力,并促进细胞的凋亡,并通过体内实验进行了验证,表明该基因可能调控肿瘤的发生发展,可能成为舌鳞癌的一个潜在治疗靶点,为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向治疗方案提供参考。探索无创、安全和便捷的方式检测特异性基因PXYLP1,有利于辅助舌鳞癌诊断、治疗和预后预测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为为线粒化载体的琼脂糖凝胶电泳图;其中泳道1:1kb Marker:从上至下依次为10kb,8kb,6kb,5kb,4kb,3.5kb,3kb,2.5kb,2kb,1.5kb,1kb,750bp,500bp,250bp;泳道2:Age I和EcoR I双酶切线性化后的载体质粒;泳道3:没有酶切的载体质粒;
图2为RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图;
图3为琼脂糖凝胶电泳检测条带;其中泳道1:阴性对照(ddH2O),排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果;泳道2:自连对照(空载体自连对照组);泳道3:250bp Marker:从上至下依次为5kb,3kb,2kb,1.5kb,1kb,750bp,500bp,250bp,100bp;泳道4-8:单克隆psc54972-1,2,3,4,5;
图4为PXYLP1在癌组织和癌旁组织中的表达差异图;
图5为PXYLP1在SCC-25细胞和CAL-27细胞中mRNA的表达丰度;
图6为CAL-27细胞被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA或对照shRNA psc3741的慢病毒;
图7为SCC-25细胞被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA或对照shRNA psc3741的慢病毒;
图8为mRNA水平PXYLP1基因消减效率示意图,其中左侧为CAL-27细胞结果,右侧为SCC-25细胞结果;
图9为靶点降低PXYLP1基因蛋白水平表达,左侧为CAL-27细胞结果,右侧为SCC-25细胞结果;
图10为使用FACS细胞凋亡实验来评估shPXYLP1组CAL-27细胞的凋亡情况结果图;
图11为使用FACS细胞凋亡实验来评估shPXYLP1组SCC-25细胞的凋亡情况结果图;
图12为敲减PXYLP1后CAL-27细胞周期的变化结果图;
图13为敲减PXYLP1后SCC-25细胞周期的变化结果图;
图14为敲减PXYLP1后CAL-27细胞的增殖速率变化Celigo细胞计数结果显示图;
图15为敲减PXYLP1后SCC-25细胞的增殖速率变化Celigo细胞计数结果显示图;
图16为敲减PXYLP1后CAL-27细胞的增殖速率变化MTT检测结果显示显示图;
图17为敲减PXYLP1后SCC-25细胞的增殖速率变化MTT检测结果显示显示图;
图18为敲减PXYLP1后,实验组(KD)和对照组(NC)CAL-27异种移植物的肿瘤大小和重量变化对比图;
图19为敲减PXYLP1后,实验组(KD)和对照组(NC)动物活体成像实验显示对比图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明的发明方法进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。
我们的研究发现设计针对PXYLP1基因的干扰靶点序列,包装构建慢病毒,对PXYLP1基因进行敲减后,会显著影响舌鳞癌细胞CAL-27细胞和SCC-25细胞的增殖,影响细胞生长形成能力,并促进细胞的凋亡,并通过体内实验进行了验证。表明该基因可能调控肿瘤的发生发展,可能成为舌鳞癌的一个潜在治疗靶点。
(一)实验方法
1、基因信息
在线资源TCGA数据库(http://ualcan.path.uab.edu/)用于生成舌鳞癌中癌与癌旁组织样本中PXYLP1表达差异。
2、细胞系和细胞培养
CAL-27和SCC-25TSCC细胞系购自中国科学院(中国上海),两种细胞系均在液氮罐中取出进行复苏,在补充有10%胎牛血清(FBS),100U/mL青霉素和100μg/100mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养,并在37℃下在含5%CO2的潮湿气氛中温育。Western Blot外源验证靶点有效性。
3、RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备
3.1 RNA干扰靶点设计
根据RNA干扰序列设计原则,以PXYLP1基因为模板,设计多个19-21nt RNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后,选取以下序列作为干扰靶点。
3.2 DNA oligo序列合成
根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列,并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外,在正链3’端添加TTTTT终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链DNA oligo。
*CCGG:AgeI酶切位点;AATTC:EcoRI酶切位点;G:EcoRI酶切位点互补序列。
3.3.双链DNA oligo制备
将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度20μM),90℃水浴15min。自然冷却至室温后,形成带粘性末端的双链。
4、线性化载体制备
按照NEB说明书配制50μl反应体系,使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化。
37℃(最适温度)反应1h,之后切胶回收目的片段。线粒化载体的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。
5、RNA干扰慢病毒载体构建
5.1连接
按照Fermentas T4 DNA Ligase说明书配制20μl反应体系,将双链DNA oligo与线性化的载体相连。
于16℃反应1h-3h,连接产物命名为psc54972,之后进行转化实验。
5.2转化
将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,详细操作步骤如下:
1)将10μl连接产物psc54972加入到100μl大肠杆菌感受态细胞中,冰浴30min。
2)42℃热激90sec,冰浴2min。
3)加入500μL无抗生素的LB液体培养基,200rpm于37℃摇床震荡培养1h。
4)取150μl菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上,于37℃培养箱中过夜培养。
5.3阳性克隆的PCR鉴定
5.3.1 RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图如图2所示。
5.3.2引物
5.3.3 PCR扩增
按下表配制20μl PCR反应体系,用无菌枪头挑取单个菌落为模板,进行PCR扩增,反应条件为:94℃3min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,22次循环;72℃5min。PCR结束后,取5μl产物,1%琼脂糖凝胶电泳检测条带。琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。
PCR条带大小
连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为:341bp;
没有连接入shRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为:307bp。
由此判断psc54972-1,2,4为阳性克隆,保存鉴定结果正确的克隆,并进行测序。
5.4阳性克隆测序结果分析
以鉴定引物-F进行阳性克隆测序,挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆用于下一步实验。
psc54972测序结果
*shRNA干扰序列插入片段用下划线标注,其中AgeI酶切位点被破坏。
5.5质粒抽提
将测序正确的菌液转接于150ml含Amp抗生素的LB液体培养基中,37℃摇床震荡培养过夜。按照EndoFree Maxi Plasmid Kit说明书提取质粒,质检合格的质粒进入下游流程。
详细操作步骤如下:
1)8000rpm离心4min收集菌体;
2)加入7ml P1,震荡混匀;
3)加入7ml P3,颠倒混匀6~8次,静置5min;
4)加入7ml P4,颠倒混匀6~8次,冰浴10min;
5)9000rpm离心10min,将上清转移到过滤器CS中,过滤后加入10ml异丙醇混匀;
6)向吸附柱中加入2.5ml的平衡液BL,8000rpm离心2min,倒掉收集管中的废液,将柱子放回备用;
7)将上清分两次倒入吸附柱中,8000rpm离心2min,弃废液;
8)向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(已加入无水乙醇),相同转速离心2min,弃废液,重复该步骤一次;
9)向吸附柱中加入3ml无水乙醇,8000rpm离心2min,弃废液;
10)9500rpm空甩5min,除去残留的漂洗液;
11)将吸附柱转移至一新的白管中,在柱中心滴加800μl洗脱缓冲液TB(先预热),室温放置5min,然后9500rpm离心2min;
12)将管中的洗脱液转移到一干净的1.5mlEP管中,-20℃保存;
取样电泳,使用分光光度计(Thermo_Nanodrop 2000)测定质粒浓度,质检。
将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。
6、RNA提取和qPCR
按照制造商的方案,使用Trizol从TSCC细胞系中提取总RNA。并根据制造商的说明书用M-MLV RT合成cDNA其中反转录引物来自广州市锐博生物科技公司。然后两步法进行Real-Time PCR检测PXYLP1在CAL-27细胞和SCC-25细胞中mRNA的表达丰度,MicroRNA PCR引物来自广州市锐博生物科技公司。人内源性肌动蛋白(ACTB)用作内参基因对照和比较阈值循环法(2-ΔCt)方法用于计算mRNA的相对表达水平。在Stratagene Mx3000P上使用SYBRGreen master mix进行qPCR。
引物信息:
7、慢病毒转染细胞并通过qPCR和Western印迹测量PXYLP1 shRNA的干扰效率
由GeneChem Co,Ltd(中国上海)构建并合成PXYLP1 shRNA干扰慢病毒载体。PXYLP1 shRNA干扰靶序列是5'-CGGTAAGAAACCAGTATCT-3'(shPXYLP1),并且使用5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'作为阴性对照(shCtrl)。根据制造商的说明,通过实时PCR测定慢病毒滴度,并且用感染复数(MOI)为20的慢病毒载体转染到CAL-27细胞和SCC-25细胞中。接种细胞(2×105个细胞/mL)置于6孔板上并孵育,成功感染的细胞为绿色荧光蛋白阳性,72h后在荧光显微镜下观察,并使用定量实时PCR(qPCR)和Western Blot测定PXYLP1D shRNA的干扰效率。检测蛋白敲减效率。
9、蛋白质印迹
用冰冷的PBS洗涤细胞两次,并用RIPA缓冲液裂解。在浓度为10%SDS-PAGE凝胶上分离含有30μg蛋白质的等份细胞裂解物,并在300mA恒流条件下电转150min,将蛋白转移到PVDF膜上。将膜在含有5%脱脂牛奶的TBST缓冲液中封闭,并与Anti-PXYLP1:1:500、Anti-β-actin;1:10000稀释过夜,然后与Anti-Rabbit IgG:1:100000孵育。使用ECL试剂盒结合X光片使条带可视化。
10、Celigo细胞计数法检测细胞生长
用0.25%胰蛋白酶消化TSCC细胞以制备单细胞悬浮液,然后用血细胞计数器计数细胞。将细胞(2×103个细胞/孔)接种到96孔板上,并在37℃,5%CO2培养箱中培养24小时。从铺板后第二天开始,每天Celigo细胞计数器检测读板一次,连续5天检测读板,通过调整分析设置的输入参数,精确计算并统计分析具有绿色荧光的细胞数。细胞计数倍数表示相对于第1天的平均值的每个时间点的细胞计数,表明细胞增殖的变化,对数据进行统计绘图,绘出5天的细胞增殖曲线。
11、MTT测定细胞活力
将慢病毒转染的TSCC细胞系中细胞(1.5×103个细胞/孔)接种到96孔板中并孵育24小时。然后,向每个孔板中加入20μL的PBS中的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑溴化物。20μL MTT在37℃下温育4小时后,弃去上清液,将沉淀物溶于100μl二甲基亚砜中。使用酶标仪在490nm处测量每个孔的吸光度,OD490倍代表相对于第1天的平均值的每个时间点的OD值,表明细胞增殖的变化。
12、Annexin V-APC单染法细胞凋亡检测
在转染72小时后将细胞接种(2×105个细胞/mL)到6孔板上并孵育至约85%汇合。收获上清液和贴壁细胞,离心,用4℃预冷的PBS溶液洗涤,并以1×106个细胞/mL的密度在1×binding buffer中重悬。按照制造商的说明使用膜联蛋白V凋亡检测试剂盒APC用Annexin V-APC在室温下将细胞染色15分钟。流式细胞术在Guava easyCyte HT系统上进行,并使用Guava InCyte软件(Millipore)进行分析。
13、细胞周期检测
在转染72小时后将细胞接种(2×105个细胞/mL)到6孔板上并孵育至约80%汇合。收获上清液和贴壁细胞,离心,用4℃预冷的D-Hanks溶液洗涤,离心,用4℃预冷的75%乙醇固定细胞1h,再次离心,去固定液,用4℃预冷的D-Hanks溶液洗涤。细胞染色液配制:40×PI母液(2mg/mL):100×RNase母液(10mg/mL):1×D-Hanks=25:10:1000。加入1ml的细胞染色液重悬,上机检测。流式细胞术在Guava easyCyte HT系统上进行,并使用ModFit软件(Millipore)进行分析。
14、动物成瘤及活体成像
4周龄的雄性裸鼠购自上海凌昌生物科技有限公司。在特定无菌条件下饲养,在研究期间,动物可免费获得高压灭菌食品和水。分为两组,实验组(KD)和对照组(NC),将1×107shPXYLP1(KD)或shCtrl(NC)细胞(CAL-27)皮下植入每只小鼠的右侧腋下,30天后开始收集数据,称取裸鼠体重,测量肿瘤的长径和短径,然后每3-4天测量一次,共10次。结束前,对小鼠进行活体成像,先按10ul/g剂量腹腔注射D-Luciferinn(15mg/mL)。15分钟后,通过腹腔注射剂量为10ul/g的0.7%戊巴比妥钠麻醉动物。数分钟后待动物麻醉,将其放置于活体成像仪下进行成像,观察荧光,保存数据。固定小鼠,用医用剪刀和镊子取出肿瘤组织,并称重,用5-0针缝合肌肉层和皮肤层,用碘伏擦拭消毒。之后,通过过量注射2%戊巴比妥钠(0.5ml)对实验动物实施安乐死。在他们完全失去知觉后,再进行颈椎脱臼确认死亡。
(二)实验结果
1、PXYLP1在HNSCC组织中过表达
在我们的调查中,PXYLP1表达数据来自在线TCGA数据库(https://www.cancer.gov/,访问日期2021年7月10日)。TCGA数据库现存528例头颈部肿瘤的样本,其中包含成对样本RNAseq数据的舌鳞癌样本一共15例。结果显示,该基因在TCGA数据库舌鳞癌中癌与癌旁组织样本的表达存在明显差异(如下表)。折线图更加直观的PXYLP1在TCGARNA-seq各个样本中的原始数据的差异表达(图4)。
2、PXYLP1基因在舌鳞癌细胞中表达
用ACTB做内参作标准化对照,使用real-time quantitative PCR的方法评估PXYLP1,在SCC-25细胞和CAL-27细胞中mRNA的表达丰度如图5所示。
3、PXYLP1 shRNA慢病毒抑制PXYLP1mRNA和蛋白质表达
为了研究PXYLP1的潜在作用,我们进行shRNA干扰以敲低CAL-27细胞和SCC-25细胞中的PXYLP1。CAL-27细胞(如图6)和SCC-25细胞(图7)被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA或对照shRNA psc3741的慢病毒。通过qPCR和Western印迹测量PXYLP1 shRNA的干扰效率。如图8所示,与阴性对照细胞(shCtrl)相比PXYLP1的shRNA(shPXYLP1)细胞系,mRNA表达量受到抑制(P<0.05),其中CAL-27细胞敲减效率达到65.1%,SCC-25细胞敲减效率达到82.3%。此外,蛋白质印迹结果表明(图9),在CAL-27细胞和SCC-2细胞中shRNA介导的敲低后,PXYLP1的蛋白质水平显着降低,靶点对PXYLP1基因的内源表达在蛋白质水平有显著的敲减作用,是有效靶点。
4、PXYLP1的敲减诱导了TSCC细胞的凋亡
为了研究PXYLP1是否涉及TSCC细胞系的调节凋亡能力,使用FACS细胞凋亡实验来评估shPXYLP1组舌鳞癌细胞的凋亡情况。结果表明,shPXYLP1组细胞凋亡率明显比shCtrl组细胞更高(P<0.05,图10和图11),表明PXYLP1基因与CAL-27细胞和SCC-25细胞的凋亡显著相关(P<0.05)。
5、PXYLP1的敲减影响细胞周期
shRNA慢病毒感染5天后,CAL27细胞实验组处于S期的细胞减少(P<0.05),处于G1期的细胞增多(P<0.05),处于G2/M期的细胞减少(P<0.05);SCC-25细胞实验组处于S期的细胞减少(P<0.05),处于G1期的细胞增多(P<0.05),处于G2/M期的细胞减少(P<0.05),提示PXYLP1基因与CAL27、SCC-25细胞的周期显著相关(图12和图13)。
6、PXYLP1的敲减抑制了TSCC细胞的增殖能力
为了评估PXYLP1在TSCC增殖中的作用,在转染培养后5天,连续5天对shPXYLP1组和shCtrl组的舌鳞癌细胞(CAL-27细胞和SCC-25细胞)进行Celigo和MTT检测。Celigo细胞计数结果显示,shPXYLP1组的舌鳞癌细胞增殖速率明显低于阴性对照组(P<0.05),特别是在第4天与第5天(图14和图15)。MTT检测结果显示shPXYLP1组CAL27、SCC-25细胞的增殖速率受到显著抑制(P<0.05)。提示PXYLP1基因与CAL27、SCC-25细胞的增殖能力显著相关(图16和图17)。
7、PXYLP1基因敲除抑制体内肿瘤生长
在异种移植小鼠中进一步检测到敲除PXYLP1对CAL-27细胞的抑制作用。与NC组相比,剔除PXYLP1后,KD组CAL-27异种移植物的肿瘤大小和重量显著受到抑制(P<0.05)(图18)。此外,动物活体成像实验显示KD组荧光表达低于NC组(P<0.05)(图19)。因此,这与体外实验结果一致。体内实验结果表明,敲除PXYLP1可抑制肿瘤生长。
以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 徐州市中心医院
<120> 一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggcccggt aagaaaccag tatctctcga gagatactgg tttcttaccg ggtttttg 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattcaaaaa cccggtaaga aaccagtatc tctcgagaga tactggtttc ttaccggg 58
Claims (6)
1.一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA,其特征在于,所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链,所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列,所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列,所述的正链和反链退火,形成带粘性末端的双链DNA:
SEQ 1:
5’-CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG-3’
SEQ 2:
5’-AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG-3’。
2.根据权利要求1所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA,其特征在于,所述shRNA干扰靶点为CGGTAAGAAACCAGTATCT。
3.一种权利要求1所述的敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体,其特征在于,所述慢病毒载体由权利要求1合成的双链DNA克隆入慢病毒载体GV 115中制成。
4.一种权利要求3所述的慢病毒载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)针对RNA干扰靶点序列设计合成双链DNA oligo:合成权利要求1所述的DNA oligo的正链和反链,将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中,90℃水浴15min;自然冷却至室温后,形成带粘性末端的双链DNA;
2)线性化载体的制备:使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化,37℃反应1h,切胶回收目的片段;
3)生成双链DNA oligo与线性化载体的连接产物:将步骤1)得到的双链DNA oligo与步骤2)得到的线性化载体于20μl反应体系中,16℃反应1h-3h,连接产物命名为psc54972;
4)克隆转化:将步骤3)连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞,对阳性克隆进行PCR鉴定;
5)质粒抽提:将测序正确的菌液转接于培养基中,提取质粒,将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。
5.如权利要求1所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。
6.如权利要求2所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111535765.1A CN114457075B (zh) | 2021-12-15 | 2021-12-15 | 一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111535765.1A CN114457075B (zh) | 2021-12-15 | 2021-12-15 | 一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114457075A CN114457075A (zh) | 2022-05-10 |
CN114457075B true CN114457075B (zh) | 2023-05-02 |
Family
ID=81406280
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111535765.1A Active CN114457075B (zh) | 2021-12-15 | 2021-12-15 | 一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114457075B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110582578A (zh) * | 2017-02-10 | 2019-12-17 | 洛克菲勒大学 | 用于细胞类型特异性谱分析以鉴定药物靶标的方法 |
CN110747195A (zh) * | 2019-09-26 | 2020-02-04 | 徐州市中心医院 | 一种抑制人EDARADD基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20180305719A1 (en) * | 2017-04-19 | 2018-10-25 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Vectors For Integration Of DNA Into Genomes And Methods For Altering Gene Expression And Interrogating Gene Function |
-
2021
- 2021-12-15 CN CN202111535765.1A patent/CN114457075B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110582578A (zh) * | 2017-02-10 | 2019-12-17 | 洛克菲勒大学 | 用于细胞类型特异性谱分析以鉴定药物靶标的方法 |
CN110747195A (zh) * | 2019-09-26 | 2020-02-04 | 徐州市中心医院 | 一种抑制人EDARADD基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114457075A (zh) | 2022-05-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110747195B (zh) | 一种抑制人EDARADD基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 | |
CN115969980B (zh) | Rna解旋酶dhx33抑制剂在制备用于治疗胃癌的药物中的应用 | |
CN110564727B (zh) | 人gpd2基因抑制剂及其应用 | |
CN110791566B (zh) | 人shcbp1基因的用途及相关产品 | |
CN110917357B (zh) | 人gsdmb基因的用途及相关产品 | |
CN114457075B (zh) | 一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 | |
CN111349701B (zh) | Rsph14基因用途、rsph14抑制剂用途、核酸分子、构建体及组合物 | |
CN113528528B (zh) | 一种促进耐伊马替尼慢性髓细胞白血病细胞K562/G01凋亡shRNA及其应用 | |
CN110938691B (zh) | 人dus4l基因的用途及相关产品 | |
CN107334777A (zh) | 干扰btf3在抑制黑色素瘤细胞增殖中的新用途 | |
CN110904104B (zh) | 人hist1h2bk基因的用途及相关产品 | |
CN114181937A (zh) | 一种沉默人LINC01614表达的shRNA分子及其应用 | |
CN104630221B (zh) | 抑制肿瘤细胞生长的shRNA及其重组载体与应用 | |
CN110129443B (zh) | Fcho2基因在制备宫颈癌放疗增敏药物的应用 | |
CN113917145A (zh) | 人capn7基因的用途及相关产品 | |
CN113913423A (zh) | 人cfap65基因的用途及相关产品 | |
CN110938628B (zh) | 人urb1基因的用途及相关产品 | |
CN110882390B (zh) | 人lsm5基因的用途及相关产品 | |
CN109750040B (zh) | Heatr1基因或蛋白的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN110863047B (zh) | 人ccdc154基因的用途及相关产品 | |
CN111304327B (zh) | 人grpel2基因的用途及相关产品 | |
CN111073889B (zh) | 人cspg5基因的用途及相关产品 | |
CN111269910B (zh) | 人depdc1基因的用途及相关产品 | |
CN111228502A (zh) | 人ube2s基因的用途及相关产品 | |
CN111705060B (zh) | 一种NCAPD2基因的shRNA及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |