CN114457075B - 一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用，通过RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备，将双链DNA oligo与线性化的载体相连，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞进行阳性克隆，构建短发夹RNA慢病毒载体，敲低TSCC内源性PXYLP1基因的表达，抑制了TSCC细胞的增殖能力，诱导了TSCC细胞的凋亡，从而抑制体内肿瘤生长。

Description

一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及癌症治疗领域，具体涉及短发夹RNA介导敲低舌鳞癌细胞PXYLP1的方法及其应用。
背景技术
舌鳞状细胞癌(TSCC)是常见的恶性肿瘤之一,具有高死亡率与发病率。它的发展是一个涉及遗传改变和表观遗传修饰的多步骤过程。TSCC是许多变量的致病因素，多种遗传改变和环境因素的积累，如烟草使用，饮酒，慢性炎症和人乳头瘤病毒(HPV)感染等，最近一些报道表明年轻成人的TSCC在发病率增加，特别是在女性中，远处转移率较高，预后较差。因此，由不同风险因素引起的TSCC可能具有不同的分子基础，涉及细胞周期控制和衰老控制的丧失，细胞凋亡的失调，以及口腔扁平苔藓和白班的发生等方面。
目前化合物或天然提取物质在舌鳞状细胞癌的治疗中应用比较广泛，例如CN110680815 A和CN 111773218 A，但是小干扰RNA生物药物在制备治疗舌鳞状细胞癌方面的应用较少，化疗药物副作用大，选择性差，靶向性较低，应用有局限性。
评价肿瘤生物学行为的主要指标有肿瘤细胞增殖、生长形成能力、凋亡等。本研究通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达，观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响，为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向治疗方案提供参考。探索无创、安全和便捷的方式检测特异性基因PXYLP1，有利于辅助舌鳞癌诊断、治疗和预后预测。
发明内容
针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种短发夹RNA介导敲低舌鳞癌细胞PXYLP1的方法，通过通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达，以实现抑制肿瘤的作用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链，所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列，所述的正链和反链退火，形成带粘性末端的双链DNA：
SEQ 1：
5’-CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG-3’
SEQ 2：
5’-AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG-3’。
优选地，所述shRNA干扰靶点为CGGTAAGAAACCAGTATCT。
本发明的第二个目的是提供一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体，所述慢病毒载体由上述合成的双链DNA克隆入慢病毒载体GV 115中制成。
本发明的第三个目的是提供所述的慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
1)针对RNA干扰靶点序列设计合成双链DNA oligo：合成权利要求1所述的DNAoligo的正链和反链，将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min；自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链DNA；
2)线性化载体的制备：使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化，37℃反应1h，切胶回收目的片段；
3)生成双链DNA oligo与线性化载体的连接产物：将步骤1)得到的双链DNA oligo与步骤2)得到的线性化载体于20μl反应体系中，16℃反应1h-3h，连接产物命名为psc54972；
4)克隆转化：将步骤3)连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行PCR鉴定；
5)质粒抽提：将测序正确的菌液转接于培养基中，提取质粒，将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。
本发明的第四个目的是提供所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本研究通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达，包括针对PXYLP1基因的干扰靶点序列，包装构建慢病毒，对PXYLP1基因进行敲减后，发现显著影响舌鳞癌细胞CAL-27细胞和SCC-25细胞的增殖，影响细胞生长形成能力，并促进细胞的凋亡，并通过体内实验进行了验证，表明该基因可能调控肿瘤的发生发展，可能成为舌鳞癌的一个潜在治疗靶点，为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向治疗方案提供参考。探索无创、安全和便捷的方式检测特异性基因PXYLP1，有利于辅助舌鳞癌诊断、治疗和预后预测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为为线粒化载体的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道1：1kb Marker：从上至下依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp；泳道2：Age I和EcoR I双酶切线性化后的载体质粒；泳道3：没有酶切的载体质粒；
图2为RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图；
图3为琼脂糖凝胶电泳检测条带；其中泳道1：阴性对照(ddH2O)，排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果；泳道2：自连对照(空载体自连对照组)；泳道3：250bp Marker：从上至下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道4-8：单克隆psc54972-1,2,3,4,5；
图4为PXYLP1在癌组织和癌旁组织中的表达差异图；
图5为PXYLP1在SCC-25细胞和CAL-27细胞中mRNA的表达丰度；
图6为CAL-27细胞被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA或对照shRNA psc3741的慢病毒；
图7为SCC-25细胞被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA或对照shRNA psc3741的慢病毒；
图8为mRNA水平PXYLP1基因消减效率示意图，其中左侧为CAL-27细胞结果，右侧为SCC-25细胞结果；
图9为靶点降低PXYLP1基因蛋白水平表达，左侧为CAL-27细胞结果，右侧为SCC-25细胞结果；
图10为使用FACS细胞凋亡实验来评估shPXYLP1组CAL-27细胞的凋亡情况结果图；
图11为使用FACS细胞凋亡实验来评估shPXYLP1组SCC-25细胞的凋亡情况结果图；
图12为敲减PXYLP1后CAL-27细胞周期的变化结果图；
图13为敲减PXYLP1后SCC-25细胞周期的变化结果图；
图14为敲减PXYLP1后CAL-27细胞的增殖速率变化Celigo细胞计数结果显示图；
图15为敲减PXYLP1后SCC-25细胞的增殖速率变化Celigo细胞计数结果显示图；
图16为敲减PXYLP1后CAL-27细胞的增殖速率变化MTT检测结果显示显示图；
图17为敲减PXYLP1后SCC-25细胞的增殖速率变化MTT检测结果显示显示图；
图18为敲减PXYLP1后，实验组(KD)和对照组(NC)CAL-27异种移植物的肿瘤大小和重量变化对比图；
图19为敲减PXYLP1后，实验组(KD)和对照组(NC)动物活体成像实验显示对比图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明的发明方法进行详细描述和说明。其内容是对本发明的解释而非限定本发明的保护范围。
我们的研究发现设计针对PXYLP1基因的干扰靶点序列，包装构建慢病毒，对PXYLP1基因进行敲减后，会显著影响舌鳞癌细胞CAL-27细胞和SCC-25细胞的增殖，影响细胞生长形成能力，并促进细胞的凋亡，并通过体内实验进行了验证。表明该基因可能调控肿瘤的发生发展，可能成为舌鳞癌的一个潜在治疗靶点。
(一)实验方法
1、基因信息
在线资源TCGA数据库(http://ualcan.path.uab.edu/)用于生成舌鳞癌中癌与癌旁组织样本中PXYLP1表达差异。
2、细胞系和细胞培养
CAL-27和SCC-25TSCC细胞系购自中国科学院(中国上海)，两种细胞系均在液氮罐中取出进行复苏，在补充有10％胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素和100μg/100mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养，并在37℃下在含5％CO2的潮湿气氛中温育。Western Blot外源验证靶点有效性。
3、RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备
3.1 RNA干扰靶点设计
根据RNA干扰序列设计原则，以PXYLP1基因为模板，设计多个19-21nt RNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取以下序列作为干扰靶点。
Figure BDA0003412516500000051
3.2 DNA oligo序列合成
根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加TTTTT终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链DNA oligo。
Figure BDA0003412516500000052
＊CCGG：AgeI酶切位点；AATTC：EcoRI酶切位点；G：EcoRI酶切位点互补序列。
3.3.双链DNA oligo制备
将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度20μM)，90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。
4、线性化载体制备
按照NEB说明书配制50μl反应体系，使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化。
Figure BDA0003412516500000061
37℃(最适温度)反应1h，之后切胶回收目的片段。线粒化载体的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。
5、RNA干扰慢病毒载体构建
5.1连接
按照Fermentas T4 DNA Ligase说明书配制20μl反应体系，将双链DNA oligo与线性化的载体相连。
Figure BDA0003412516500000062
于16℃反应1h-3h，连接产物命名为psc54972，之后进行转化实验。
5.2转化
将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，详细操作步骤如下：
1)将10μl连接产物psc54972加入到100μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min。
2)42℃热激90sec，冰浴2min。
3)加入500μL无抗生素的LB液体培养基，200rpm于37℃摇床震荡培养1h。
4)取150μl菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。
5.3阳性克隆的PCR鉴定
5.3.1 RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图如图2所示。
5.3.2引物
Figure BDA0003412516500000071
5.3.3 PCR扩增
按下表配制20μl PCR反应体系，用无菌枪头挑取单个菌落为模板，进行PCR扩增，反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，22次循环；72℃5min。PCR结束后，取5μl产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带。琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。
Figure BDA0003412516500000072
PCR条带大小
连接入shRNA片段的阳性克隆PCR片段大小为：341bp；
没有连接入shRNA片段的空载体克隆PCR片段大小为：307bp。
由此判断psc54972-1,2,4为阳性克隆，保存鉴定结果正确的克隆，并进行测序。
5.4阳性克隆测序结果分析
以鉴定引物-F进行阳性克隆测序，挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆用于下一步实验。
psc54972测序结果
Figure BDA0003412516500000081
＊shRNA干扰序列插入片段用下划线标注，其中AgeI酶切位点被破坏。
5.5质粒抽提
将测序正确的菌液转接于150ml含Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜。按照EndoFree Maxi Plasmid Kit说明书提取质粒，质检合格的质粒进入下游流程。
详细操作步骤如下：
1)8000rpm离心4min收集菌体；
2)加入7ml P1，震荡混匀；
3)加入7ml P3，颠倒混匀6～8次，静置5min；
4)加入7ml P4，颠倒混匀6～8次，冰浴10min；
5)9000rpm离心10min，将上清转移到过滤器CS中，过滤后加入10ml异丙醇混匀；
6)向吸附柱中加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将柱子放回备用；
7)将上清分两次倒入吸附柱中，8000rpm离心2min，弃废液；
8)向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(已加入无水乙醇)，相同转速离心2min，弃废液，重复该步骤一次；
9)向吸附柱中加入3ml无水乙醇，8000rpm离心2min，弃废液；
10)9500rpm空甩5min，除去残留的漂洗液；
11)将吸附柱转移至一新的白管中，在柱中心滴加800μl洗脱缓冲液TB(先预热)，室温放置5min，然后9500rpm离心2min；
12)将管中的洗脱液转移到一干净的1.5mlEP管中，-20℃保存；
取样电泳，使用分光光度计(Thermo_Nanodrop 2000)测定质粒浓度，质检。
将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。
6、RNA提取和qPCR
按照制造商的方案，使用Trizol从TSCC细胞系中提取总RNA。并根据制造商的说明书用M-MLV RT合成cDNA其中反转录引物来自广州市锐博生物科技公司。然后两步法进行Real-Time PCR检测PXYLP1在CAL-27细胞和SCC-25细胞中mRNA的表达丰度，MicroRNA PCR引物来自广州市锐博生物科技公司。人内源性肌动蛋白(ACTB)用作内参基因对照和比较阈值循环法(2-ΔCt)方法用于计算mRNA的相对表达水平。在Stratagene Mx3000P上使用SYBRGreen master mix进行qPCR。
引物信息：
Figure BDA0003412516500000091
7、慢病毒转染细胞并通过qPCR和Western印迹测量PXYLP1 shRNA的干扰效率
由GeneChem Co，Ltd(中国上海)构建并合成PXYLP1 shRNA干扰慢病毒载体。PXYLP1 shRNA干扰靶序列是5'-CGGTAAGAAACCAGTATCT-3'(shPXYLP1)，并且使用5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'作为阴性对照(shCtrl)。根据制造商的说明，通过实时PCR测定慢病毒滴度，并且用感染复数(MOI)为20的慢病毒载体转染到CAL-27细胞和SCC-25细胞中。接种细胞(2×105个细胞/mL)置于6孔板上并孵育，成功感染的细胞为绿色荧光蛋白阳性，72h后在荧光显微镜下观察，并使用定量实时PCR(qPCR)和Western Blot测定PXYLP1D shRNA的干扰效率。检测蛋白敲减效率。
9、蛋白质印迹
用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并用RIPA缓冲液裂解。在浓度为10％SDS-PAGE凝胶上分离含有30μg蛋白质的等份细胞裂解物，并在300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上。将膜在含有5％脱脂牛奶的TBST缓冲液中封闭，并与Anti-PXYLP1：1:500、Anti-β-actin；1:10000稀释过夜，然后与Anti-Rabbit IgG：1:100000孵育。使用ECL试剂盒结合X光片使条带可视化。
10、Celigo细胞计数法检测细胞生长
用0.25％胰蛋白酶消化TSCC细胞以制备单细胞悬浮液，然后用血细胞计数器计数细胞。将细胞(2×103个细胞/孔)接种到96孔板上，并在37℃，5％CO2培养箱中培养24小时。从铺板后第二天开始，每天Celigo细胞计数器检测读板一次，连续5天检测读板，通过调整分析设置的输入参数，精确计算并统计分析具有绿色荧光的细胞数。细胞计数倍数表示相对于第1天的平均值的每个时间点的细胞计数，表明细胞增殖的变化，对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。
11、MTT测定细胞活力
将慢病毒转染的TSCC细胞系中细胞(1.5×103个细胞/孔)接种到96孔板中并孵育24小时。然后，向每个孔板中加入20μL的PBS中的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑溴化物。20μL MTT在37℃下温育4小时后，弃去上清液，将沉淀物溶于100μl二甲基亚砜中。使用酶标仪在490nm处测量每个孔的吸光度，OD490倍代表相对于第1天的平均值的每个时间点的OD值，表明细胞增殖的变化。
12、Annexin V-APC单染法细胞凋亡检测
在转染72小时后将细胞接种(2×105个细胞/mL)到6孔板上并孵育至约85％汇合。收获上清液和贴壁细胞，离心，用4℃预冷的PBS溶液洗涤，并以1×106个细胞/mL的密度在1×binding buffer中重悬。按照制造商的说明使用膜联蛋白V凋亡检测试剂盒APC用Annexin V-APC在室温下将细胞染色15分钟。流式细胞术在Guava easyCyte HT系统上进行，并使用Guava InCyte软件(Millipore)进行分析。
13、细胞周期检测
在转染72小时后将细胞接种(2×105个细胞/mL)到6孔板上并孵育至约80％汇合。收获上清液和贴壁细胞，离心，用4℃预冷的D-Hanks溶液洗涤，离心，用4℃预冷的75％乙醇固定细胞1h，再次离心，去固定液，用4℃预冷的D-Hanks溶液洗涤。细胞染色液配制：40×PI母液(2mg/mL)：100×RNase母液(10mg/mL)：1×D-Hanks＝25：10：1000。加入1ml的细胞染色液重悬，上机检测。流式细胞术在Guava easyCyte HT系统上进行，并使用ModFit软件(Millipore)进行分析。
14、动物成瘤及活体成像
4周龄的雄性裸鼠购自上海凌昌生物科技有限公司。在特定无菌条件下饲养，在研究期间，动物可免费获得高压灭菌食品和水。分为两组，实验组(KD)和对照组(NC)，将1×107shPXYLP1(KD)或shCtrl(NC)细胞(CAL-27)皮下植入每只小鼠的右侧腋下，30天后开始收集数据，称取裸鼠体重，测量肿瘤的长径和短径，然后每3-4天测量一次，共10次。结束前，对小鼠进行活体成像,先按10ul/g剂量腹腔注射D-Luciferinn(15mg/mL)。15分钟后，通过腹腔注射剂量为10ul/g的0.7％戊巴比妥钠麻醉动物。数分钟后待动物麻醉，将其放置于活体成像仪下进行成像,观察荧光,保存数据。固定小鼠，用医用剪刀和镊子取出肿瘤组织，并称重，用5-0针缝合肌肉层和皮肤层，用碘伏擦拭消毒。之后，通过过量注射2％戊巴比妥钠(0.5ml)对实验动物实施安乐死。在他们完全失去知觉后，再进行颈椎脱臼确认死亡。
(二)实验结果
1、PXYLP1在HNSCC组织中过表达
在我们的调查中，PXYLP1表达数据来自在线TCGA数据库(https://www.cancer.gov/,访问日期2021年7月10日)。TCGA数据库现存528例头颈部肿瘤的样本，其中包含成对样本RNAseq数据的舌鳞癌样本一共15例。结果显示，该基因在TCGA数据库舌鳞癌中癌与癌旁组织样本的表达存在明显差异(如下表)。折线图更加直观的PXYLP1在TCGARNA-seq各个样本中的原始数据的差异表达(图4)。
Figure BDA0003412516500000121
2、PXYLP1基因在舌鳞癌细胞中表达
用ACTB做内参作标准化对照，使用real-time quantitative PCR的方法评估PXYLP1，在SCC-25细胞和CAL-27细胞中mRNA的表达丰度如图5所示。
3、PXYLP1 shRNA慢病毒抑制PXYLP1mRNA和蛋白质表达
为了研究PXYLP1的潜在作用，我们进行shRNA干扰以敲低CAL-27细胞和SCC-25细胞中的PXYLP1。CAL-27细胞(如图6)和SCC-25细胞(图7)被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA或对照shRNA psc3741的慢病毒。通过qPCR和Western印迹测量PXYLP1 shRNA的干扰效率。如图8所示，与阴性对照细胞(shCtrl)相比PXYLP1的shRNA(shPXYLP1)细胞系，mRNA表达量受到抑制(P<0.05)，其中CAL-27细胞敲减效率达到65.1％，SCC-25细胞敲减效率达到82.3％。此外，蛋白质印迹结果表明(图9)，在CAL-27细胞和SCC-2细胞中shRNA介导的敲低后，PXYLP1的蛋白质水平显着降低，靶点对PXYLP1基因的内源表达在蛋白质水平有显著的敲减作用，是有效靶点。
4、PXYLP1的敲减诱导了TSCC细胞的凋亡
为了研究PXYLP1是否涉及TSCC细胞系的调节凋亡能力，使用FACS细胞凋亡实验来评估shPXYLP1组舌鳞癌细胞的凋亡情况。结果表明，shPXYLP1组细胞凋亡率明显比shCtrl组细胞更高(P<0.05，图10和图11)，表明PXYLP1基因与CAL-27细胞和SCC-25细胞的凋亡显著相关(P<0.05)。
5、PXYLP1的敲减影响细胞周期
shRNA慢病毒感染5天后，CAL27细胞实验组处于S期的细胞减少(P<0.05)，处于G1期的细胞增多(P<0.05)，处于G2/M期的细胞减少(P<0.05)；SCC-25细胞实验组处于S期的细胞减少(P<0.05)，处于G1期的细胞增多(P<0.05)，处于G2/M期的细胞减少(P<0.05)，提示PXYLP1基因与CAL27、SCC-25细胞的周期显著相关(图12和图13)。
6、PXYLP1的敲减抑制了TSCC细胞的增殖能力
为了评估PXYLP1在TSCC增殖中的作用，在转染培养后5天，连续5天对shPXYLP1组和shCtrl组的舌鳞癌细胞(CAL-27细胞和SCC-25细胞)进行Celigo和MTT检测。Celigo细胞计数结果显示，shPXYLP1组的舌鳞癌细胞增殖速率明显低于阴性对照组(P<0.05)，特别是在第4天与第5天(图14和图15)。MTT检测结果显示shPXYLP1组CAL27、SCC-25细胞的增殖速率受到显著抑制(P<0.05)。提示PXYLP1基因与CAL27、SCC-25细胞的增殖能力显著相关(图16和图17)。
7、PXYLP1基因敲除抑制体内肿瘤生长
在异种移植小鼠中进一步检测到敲除PXYLP1对CAL-27细胞的抑制作用。与NC组相比，剔除PXYLP1后，KD组CAL-27异种移植物的肿瘤大小和重量显著受到抑制(P<0.05)(图18)。此外，动物活体成像实验显示KD组荧光表达低于NC组(P<0.05)(图19)。因此，这与体外实验结果一致。体内实验结果表明，敲除PXYLP1可抑制肿瘤生长。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 徐州市中心医院
<120> 一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggcccggt aagaaaccag tatctctcga gagatactgg tttcttaccg ggtttttg 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattcaaaaa cccggtaaga aaccagtatc tctcgagaga tactggtttc ttaccggg 58

Claims (6)

1.一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链，所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列，所述的正链和反链退火，形成带粘性末端的双链DNA：
SEQ 1：
5’-CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG-3’
SEQ 2：
5’-AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG-3’。
2.根据权利要求1所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA干扰靶点为CGGTAAGAAACCAGTATCT。
3.一种权利要求1所述的敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体由权利要求1合成的双链DNA克隆入慢病毒载体GV 115中制成。
4.一种权利要求3所述的慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)针对RNA干扰靶点序列设计合成双链DNA oligo：合成权利要求1所述的DNA oligo的正链和反链，将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min；自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链DNA；
2)线性化载体的制备：使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化，37℃反应1h，切胶回收目的片段；
3)生成双链DNA oligo与线性化载体的连接产物：将步骤1)得到的双链DNA oligo与步骤2)得到的线性化载体于20μl反应体系中，16℃反应1h-3h，连接产物命名为psc54972；
4)克隆转化：将步骤3)连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行PCR鉴定；
5)质粒抽提：将测序正确的菌液转接于培养基中，提取质粒，将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。
5.如权利要求1所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。
6.如权利要求2所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110582578A (zh) * 2017-02-10 2019-12-17 洛克菲勒大学 用于细胞类型特异性谱分析以鉴定药物靶标的方法
CN110747195A (zh) * 2019-09-26 2020-02-04 徐州市中心医院 一种抑制人EDARADD基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180305719A1 (en) * 2017-04-19 2018-10-25 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Vectors For Integration Of DNA Into Genomes And Methods For Altering Gene Expression And Interrogating Gene Function

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110582578A (zh) * 2017-02-10 2019-12-17 洛克菲勒大学 用于细胞类型特异性谱分析以鉴定药物靶标的方法
CN110747195A (zh) * 2019-09-26 2020-02-04 徐州市中心医院 一种抑制人EDARADD基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用

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