CN101066448A - 重组鸡痘病毒疫苗rFPV－1218AIH5/H9及其构建方法、用途 - Google Patents
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Abstract
重组鸡痘病毒疫苗rFPV－1218AIH5/H9及其构建方法、用途，涉及重组鸡痘病毒疫苗构建技术领域。先分别将含H5亚型AIV HA基因片段和含H9亚型AIV HA基因片段置于各自启动子下游，背向串联插入到含FPV复制非必需片段FPV12－18和报告基因(LacZ)的插入鸡痘病毒表达载体p12－18中构建成转移载体；再用转移载体转染已感染wt－FPV的鸡胚成纤维细胞，通过同源重组获得共表达H5和H9亚型AIV HA基因的不受母源抗体干扰的病毒疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组鸡痘病毒疫苗，特别是一种用鸡痘病毒新的复制非必需区构建共表达H5和H9亚型禽流感病毒主要保护性抗原基因的重组鸡痘病毒联合疫苗。
背景技术
鸡痘病毒(Fowlpox Virus，简称：FPV)为痘病毒科、禽痘病毒属的成员，是迄今发现的动物病毒中最大的一种病毒。最独特的性质是它们在感染细胞的胞浆复制，而不在细胞核内。成熟的病毒粒子为砖型，大小为250×350nm，FPV的基因组为双股线性DNA，大小约300kb，分子量约为2～4×105KD，G+C含量达35％，且其DNA不具有感染性。通过重组DNA技术，以FPV为载体研制禽类基因工程重组活病毒疫苗，或哺乳动物非复制型重组活病毒载体疫苗受到越来越多研究者的重视。FPV基因组宠大，可插入较长外源基因，构建多价或多联重组病毒活疫苗，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。FPV载体与已报道的病毒载体如痘苗病毒、乳头状瘤病毒、腺病毒、细小病毒、马立克氏病病毒、烟草花叶病毒等相比具有明显的优势。FPV自然条件下只感染禽类，但能在哺乳动物细胞产生顿挫性感染，虽不产生有感染性的子代病毒粒子，却能自动合成加工外源抗原并提呈到细胞表面，刺激机体产生免疫应答反应。
已有多种类型的具有生物活性的蛋白质在重组鸡痘病毒(recombinantfowlpox virus，rFPV)中得到表达。如禽流感病毒(即：AIV)的血凝素基因(HA)、新城疫病毒(NDV)的融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因、马立克氏病病毒(MDV)的gB基因、传染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2基因、狂犬病病毒糖蛋白和麻疹病毒融合蛋白基因等，以表达外源基因的rFPV进行免疫，在SPF鸡或无母源抗体的商品鸡均可提供特异性的免疫保护，因此，FPV载体不仅可以用作家禽的疫苗，而且可以用作哺乳动物的疫苗。
现有技术中，FPV疫苗在商品禽中已使用了70多年，此疫苗可引起轻微的、自限性局部感染。同时，FPV宿主范围较窄，仅感染禽，因此是相对比较安全的疫苗病毒。
鸡痘病毒载体已经研究了近二十年，但能应用于临床的重组病毒寥寥无几，原因何在？一个主要原因就是母源抗体的干扰。就拿我国的现状来说，为控制疫情的发生，减少经济损失，种鸡一般需要反复接种针对MDV、NDV、AIV、IBDV、FPV等的多种疫苗，导致我国的商品鸡普遍带有高母源抗体。其中针对H9N2亚型AIV的母源抗体高达27-28，H5N1亚型AIV的母源抗体也达到了25-26，这就给商品鸡疫苗的使用和疫情的监测带来不便。
Taylor等发现，在有较高ND母源抗体的试验鸡上，共表达NDV F和HN基因的重组FPV的抵抗NDV强毒攻击的免疫保护率较在SPF鸡上有所下降。因此，针对外源基因的抗体干扰了重组FPV的免疫(Taylor J，Christensen L，Gettig R，et al.Efficacy of a recombinant fowlpox-basedNewcastle disease virus vaccine candidate against velogenic and respiratorychallenge.Avian Dis，1996，40(1)：173-80.)。本室共构建的9个表达HPAIV基因的rFPVs无论是否能够诱导HI抗体，在SPF鸡上均能抵抗强毒AIV的攻击，免疫保护率均为100％，构建的3个共表达HPAIV和MPAIV HA基因的重组苗在SPF鸡上均能抑制MPAIV的排出，免疫效力与油苗相当。而在带有高水平AIV母源抗体的商品鸡上，保护率均有不同程度的下降。表明针对外源蛋白的母源抗体对重组FPV的免疫效力确实存在一定的影响。另有构建的NDV的主要保护性抗原的重组病毒疫苗进行的商品鸡试验试验结果也表明，重组FPV的免疫效力因存在针对NDV或AIV的母源抗体而受到很大的影响(丁炜东，曹丽萍，张体银等.表达新城疫病毒F和HN基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性和免疫效力试验.中国兽医杂志，2005，41：10-14.韦栋平，刘玉良，邵卫星等.共表达新城疫F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒.微生物学报，2004，44：14-18.)。
为了获得理想的重组病毒首先得进行病毒复制非必需区的克隆与筛选，外源基因只有插入到病毒基因的复制非必需区才有可能实现蛋白产物的表达，而且载体表达外源基因直接受其在载体中插入位点的制约，因此非必需区的获得是构建重组病毒的先决条件。病毒复制非必需区又有严格的非必需区及一般非必需区之分，在构建重组病毒时必须选择严格的复制非必需区，才能维持亲本株的复制能力及保证重组病毒的免疫效力。
根据本实验室的前期研究发现，本室以前构建的插入载体p11S的复制非必需区FPV7S正好处于开放性阅读框架上，可能破坏了IL-18结合蛋白基因。目前已有学者发现，经细胞表达的IL-18结合蛋白能够抑制机体IL-18依赖性IFN-γ的产生(Xiang Y，Moss B.IL-18 binding and inhibition ofinterferon induction by human poxvirus encoded proteins.Proc Natl Acad Sci，1999，96：1537-11542.和Aizawa Y，Akita K，Taniai M，et al.Cloning andexpression of interleukin-18 binding protein.FEBS Lett，1999，445：338-342.)。据实验证实，IL-18是IL-1家族中具有多种功能的致炎症细胞因子，其能够诱导机体产生IFN-γ、Th-1型免疫应答并激活NK细胞的活性，这对小鼠诱导产生有效抗VV感染的免疫应答起到重要的作用。而IL-18结合蛋白可能具有对抗机体炎症反应的功能，对病毒在宿主体内的繁殖与扩散是有利的。
为了解决这一缺陷，孙蕾，刘武杰，陈素娟等重新筛选了鸡痘病毒严格的复制非必需区FPV12-18，构建了大肠埃希氏菌p12-18，载体于2005年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO：1385，其长度为：10450bp。
发明内容
本发明的第一个目的是为了克服现有载体的不足，能增加重组鸡痘病毒基因工程疫苗在商品鸡群使用的实用性，同时保持和增强重组鸡痘病毒的免疫原性及外源插入基因的表达产物的免疫原性，可使用新的鸡痘病毒表达载体表达外源基因，使得重组鸡痘病毒活疫苗早日商品化，提供一种能在母源抗体阳性的商品鸡群使用的重组鸡痘病毒基因工程疫苗。
本发明疫苗为含共表达H5和H9亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒疫苗，于2007年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：1914。
本发明的重组鸡痘病毒中的外源基因既含H5亚型AIV HA基因又含H9亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPV)疫苗，不受母源抗体干扰，能增加重组鸡痘病毒基因工程疫苗在商品鸡群使用的实用性，同时保持和增强重组鸡痘病毒的免疫原性及外源插入基因的表达产物的免疫原性，使得重组鸡痘病毒活疫苗早日应用于临床，一次免疫可预防两种亚型禽流感。
本发明的第二个目的是提供一种重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9的构建方法：
包括以下步骤：
(1)获得含H5亚型AIV HA基因整个阅读框架的基因片段。
(2)获得含H9亚型AIV HA基因整个阅读框架的基因片段。
(3)将上述基因片段置于各自合适的启动子下游，背向串联插入到含FPV复制非必需片段FPV12-18和报告基因(LacZ)的插入鸡痘病毒表达载体p12-18中构建成转移载体p1218AIH5/H9，长度为14000bp。
(4)用转移载体p1218AIH5/H9转染已感染wt-FPV的鸡胚成纤维细胞(CEF)，通过同源重组获得共表达H5和H9亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9。
通过以上方法能得到不受母源抗体干扰的重组鸡痘病毒活疫苗，其方法科学、可靠性强，获得的疫苗稳定性好，纯度高。
步骤(1)中，H5亚型AIV HA基因可以通过以下方法获得，用9-10日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因组的RNA，根据已发表的H5亚型AIV HA基因序列设计引物，
PH5A1 5’-GGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTTTTCTT-3’
PH5A2 5’-GTCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG-3’
先反转录合成cDNA，然后PCR扩增出H5亚型AIV HA基因整个阅读框架。
步骤(2)中，H9亚型AIV HA基因可以通过以下方法获得，用9-10日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因组的RNA，根据已发表的H9亚型AIV HA基因序列设计引物，
PH9A1 5’-GCTGGATCCGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGCT-3’
PH9A2 5’-GTCGGATCCAAGCTTACAAAAAGCCAATTATATACAAATCTTGC-3’
先反转录合成cDNA，然后PCR扩增出H9亚型AIV HA基因整个阅读框架。
分别将H5和H9亚型AIV HA基因连接到T-载体，测序证明所得的基因序列的正确性。
在步骤(3)中，为了分别表达H5和H9亚型AIV HA基因，需要足够长度和功能活性的启动子连接到上述各自基因上。启动子可以是任何能够在重组鸡痘病毒(rFPV)感染细胞中指导基因转录的FPV启动子、痘苗病毒启动子或人工合成启动子，启动子和上述基因可以通过酶切加接的方法或用PCR设计引物加接的方法连接在一起，按常规方法将其插入到含FPV复制非必须片段和报告基因LacZ的FPV插入载体p12-18中，在将此连接产物转化到适当的宿主细胞中，按常规方法纯化并分析重组体，以确保得到正确的转移载体。碱裂解方法制备转移载体的质粒DNA并以PEG纯化质粒DNA。
在步骤(4)中，用GeneJammer TM转染试剂将转移载体分别与wt-FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，将上清稀释液接种长成致密单层的CEF，待出现单个典型蚀斑后，用含有X-gal的营养琼脂覆盖，蓝斑筛选纯化得重组病毒rFPV-1218AIH5/H9。
rFPV中外源基因的插入和表达，可通过核酸杂交、PCR扩增外源基因、重组病毒与特异性抗体结合的反应性及所表达外源基因产物的生物学特性等方法予以鉴定。
最后，还可将共表达H5和H9亚型AIV HA基因的rFPV在CEF单层上增殖，使病毒在CEF中大量扩增。长成完全病变后收获，分别吸取0.1ml病毒液，以细胞培养液作连续10倍稀释，取10-4、10-5、10-6三个稀释度的病毒液接种生长于24孔细胞培养板内的形成致密单层的CEF，每个稀释度接种4孔，每孔接种0.1ml病毒液。37℃培养72h，然后观察病变，计算接种每一稀释度病毒液的CEF上形成的蚀斑数目，根据计数结果计算病毒原液中含有的病毒蚀斑形成单位(PFU)。接种实验用动物。
本发明的第三个目的在于发明重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9的用途，用于防治H5亚型禽流感和用于防治H9亚型禽流感。
本重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9用于防治H5、H9亚型禽流感，特别是禽类皮下使用本发明所述的疫苗，使用量为104-106PFU/羽。可对H5、H9亚型禽流感病毒具有良好的防治效果。
附图说明
图1为H5亚型AIV HA基因的PCR扩增产物电泳图谱。
图中，M列为200bp DNA ladder maker；
1列为G5株HA基因PCR产物。
图2为H9亚型AIV HA基因的PCR扩增产物电泳图谱。
图中，M列为200bp DNA ladder maker；
1列为F株H9A基因PCR产物。
图3为重组质粒p12LSH5A的酶切鉴定电泳图谱。
图中，1列为p1218AI H5(EcoRI)；
2列为p12-18(BamHI+SmaI)；
3列为pTH5A(HindIII+BamHI)；
M列为DL2000+15000。
图4为重组质粒p1218AIH5/H9的酶切鉴定电泳图谱。
图中，1列为pPELH9(HindIII)；
2列为p1218AI H5(EcoRI)；
3列为p1218AIH5(HindIII)；
4列为p1218AIH5/H9(PstI)；
M列为DL2000+15000。
图5-1、5-2、5-3为含H5和H9亚型AIV HA基因的转移载体p1218AIH5/H9的构建图。
图6为纯化重组病毒感染CEF后形成的兰色空斑。
图7为重组病毒感染CEF后表达外源蛋白质的荧光图。
图8为H5亚型AIV HA基因的序列图。
图9为H9亚型AIV HA基因的序列图。
具体实施方式
以下涉及生物材料大肠埃希氏菌p12-18为2005年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO：1385，其长度为：10450bp。
步骤一：H5亚型AIV HA基因的扩增、克隆及序列分析
根据已发表的H5亚型AIV HA基因的序列，设计H5A基因的PCR扩增引物。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
H5A基因的扩增引物：上游引物PH5A1的5’端引入BamHI位点和Kozak序列，下游引物PH5A2的5’端引入BamHI、HindIII位点外，还引入了痘病毒基因组早期基因的转录终止信号。上、下游引物跨幅约为1.7kb，覆盖整个H5A基因编码框。
PH5A1 5’-GGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTTTTCTT-3’
PH5A2 5’-GTCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG-3’
取以上的质粒pTH5A，用Expand High Fidelity PCR system扩增H5A基因。轻轻混匀后，按下列循环参数进行PCR扩增：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，一共进行30个循环；72℃再延伸10min，4℃保存。循环结束后，取5μl PCR反应产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。进行回收和纯化，并与pGEM-Teasy vector进行连接。用BamHI+HindIII双酶切法筛选，以切出1.7Kb大小条带的质粒为阳性重组质粒，命名为pTH5A。阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测序，得到确证。
步骤二：H9亚型AIV HA基因的扩增、克隆及序列分析
根据已发表的H9亚型AIV HA的序列，设计H9N2亚型AIV HA基因的PCR扩增引物。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
H9A基因的扩增引物：上游引物PH9A1的5’端引入BamH I位点和Kozak序列；下游引物PH9A2的5’端引入BamH I、HindIII位点外，还引入了痘病毒基因组早期基因的转录终止信号。上、下游引物跨幅约为1.7kb，覆盖整个H9A基因编码框。
PH9A1 5’-GCTGGATCCGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGCT-3’
PH9A2 5’-GTCGGATCCAAGCTTACAAAAAGCCAATTATATACAAATCTTGC-3’
以质粒pTH9A为模板，用PH9A1和PH9A2引物和Expand High FidelityPCR system对H9A基因进行PCR扩增，使H9A基因翻译起始区前连接一段Kozak序列，终止密码子后连接痘病毒早期转录终止信号T5NT。PCR循环参数：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，一共进行30个循环；循环结束后72℃再延伸10min。PCR产物通过电泳鉴定后，进行回收和纯化，并与pGEM-T easy vector进行连接。用BamHI+HindIII双酶切法筛选，以切出1.7Kb大小条带的质粒为阳性重组质粒，命名为pTH9A。阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测序，得到确证。
步骤三：转移载体(p1218AIH5/H9)的构建
如图5所示，将质粒pTH5A用HindIII酶切经klenow酶补平，酚:氯仿抽提回收线型质粒DNA，再用BamHI酶切电泳回收1.7kb片段，分别与用SmaI和BamHI酶切的载体质粒大肠埃希氏菌p12-18连接，构建成转移载体p1218AIH5。用BamHI酶切质粒pTH9A，回收1.7kb的H9A基因与同样经BamHI酶切的线性质粒pSKIFN连接，得中间载体pSKPELH9A；再将质粒pSKPELH9A用SacI和SalI双酶切，与用SacI和SalI双酶切的PUC18连接得含H9A基因表达盒的中间质粒pPPELH9A。用HindIII酶切质粒pPPELH9A，回收1.9kb左右的H9A基因表达盒PE/L-H9A与经Hind III酶切的线性质粒p1218AIH5连接，筛选阳性重组质粒并命名为p1218AIH5/H9。
步骤四：转染与纯化
转染按GeneJammerTM6转染试剂的说明进行。在60mm培养皿中培养SPF成纤维细胞至形成单层，以0.1MOI的wt-FPV疫苗株感染CEF，37℃培养3～4h，倒去上清用DMEM基础基洗涤两次后加4ml备用。将1-2μgp1218AIH5/H9分别溶于30μl的TE，按1∶6将GeneJammerTM6稀释到100μlDMEM基础培养基中，轻轻混匀，置室温作用15min，将p1218AIH5/H9的上述混合物缓慢滴加至已感染wt-FPV CEF的DMEM基础培养基中混匀；37℃培养6h后换维持液，待细胞完全病变后收获病毒，-70℃～37℃反复冻融3次，低速离心去除细胞碎片，上清用于重组病毒的筛选。
将上清稀释液接种长成致密单层的CEF，待出现单个典型蚀斑后，用含有200μg/ml X-gal的营养琼脂覆盖，37℃培养72h，待出现蓝色蚀斑后挑取蓝色蚀斑进一步克隆纯化，直至在X-gal存在的条件下，重组病毒在CEF上所形成的蚀斑全部呈蓝色。
步骤五：共表达H5和H9亚型AIV HA基因的不同重组鸡痘病毒的鉴定
H9A基因表达产物的鉴定：用rFPV-11SH5H9和rFPV-1218AIH5/H9感染形成致密单层的CEF，并分别设单表达H9A基因的重组鸡痘病毒rFPV-11SH9A与野生型鸡痘病毒作对照。在37℃、5％CO2条件下培养直至出现典型蚀斑后，倾去培养液，以PBS(0.01M，pH7.4)洗涤一次，然后用冷甲醇固定10min；加入稀释度为1∶1000的鼠抗H9N2亚型AIV F株的单克隆抗体，37℃孵育1h；以含0.05％吐温-80的0.01M PBS(简称PBST，pH7.2)洗5min×3次，再加入稀释度为1∶200的羊抗鼠IgG-FITC荧光抗体，37℃孵育1h；用PBST洗涤5min×3次后置荧光显微镜下观察并拍照记录结果。
H5A基因表达产物的鉴定：用rFPV-11SH5H9和rFPV-1218AIH5/H9感染形成致密单层的CEF，并分别设单表达H5A基因的重组鸡痘病毒rFPV-11SH5A与野生型鸡痘病毒作对照。按上述步骤，待单层CEF出现典型蚀斑后用冷甲醇固定，先后用鸡抗H5N1亚型AIV G5株的单克隆抗体和羊抗鼠IgG-FITC荧光抗体与之作用，充分洗涤后置荧光显微镜下观察并拍照记录结果。
应用：重组病毒的免疫效力实验
1、SPF实验鸡接种rFPVs后抵抗H9亚型AIV感染的免疫保护作用(以攻毒后第5天的排毒为指标)
7日龄白来航SPF雏鸡随机分组，分别于颈部皮下免疫rFPV-11SH9A、rFPV-12LSH9A、rFPV-11SH5H9、rFPV-1218AIH5/H9、wt-FPV、PBS和H9亚型AI油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡。于免疫后7，10，14，18，21天采血，分离血清检测HI抗体效价。免疫后21天，用剂量为107ELD50/只的H9亚型AIV F株进行滴鼻攻毒，攻毒后5天采集口腔棉拭子，用10日龄非免疫鸡胚分离病毒。
结果发现，在SPF鸡的免疫保护试验中，各种重组疫苗均能诱生针对H9亚型AIV的特异性HI抗体。由p12-18载体构建的疫苗比由p11S载体构建的相应疫苗诱生的HI抗体水平略高。rFPV-11SH5H9、rFPV-1218AIH5/H9的PI分别为88.89和100。由p12-18载体构建的疫苗比由p11S载体构建的相应疫苗保护率高。
表1.SPF鸡接种rFPVs后抵抗H9亚型AIV感染的免疫保护作用
| 组别 | 攻毒剂量(ELD50/价) | 攻毒途径 | 病毒分离率 | 保护指数(PI) |
| H9 AI killed vaccinerFPV-11SH9ArFPV-12LSH9ArFPV-11SH5H9rFPV-1218AIH5/H9wt-FPVPBS | 107107107107107107107 | 滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼 | 1/102/100/101/100/109/109/10 | 88.8977.7810088.89100-- |
2、rFPVs在SPF鸡抵抗H5亚型AIV的免疫效力(以保护临床不发病不死亡为指标)
7日龄白来航SPF雏鸡随机分组，分别于颈部皮下免疫rFPV-11SH5A、rFPV-12LSH5A、rFPV-11SH5H9、rFPV-1218AIH5/H9、wt-FPV、PBS和H5亚型AI油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡。于免疫后7，10，14，18，21天采血，分离血清检测HI抗体效价。免疫后21天，用剂量为105ELD50/只的A/Goose/Huadong/G5/1996株进行滴鼻攻毒。所有试验鸡于攻毒后持续观察18天，记录试验鸡的发病和死亡情况。
在SPF鸡的免疫保护试验中，无论重组疫苗能否诱生HI抗体的产生，其PI均为100，不同的载体、不同的外源基因组合、不同的亲本病毒的重组病毒免疫效力均没差异。
表2.SPF鸡接种rFPVs后抵抗H5亚型AIV强毒攻击的免疫保护作用
| 组别 | 攻毒剂量 | 攻毒 | 发病率 | 死亡率 | 保护指数 |
| rFPV-11SH5ArFPV-12LSH5ArFPV-11SH5H9rFPV-1218AIH5/H9H5 AI killed vaccinewt-FPVPBS | 105105105105105105105 | 滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼 | 0/100/100/100/100/1010/1010/10 | 0/100/100/100/100/1010/1010/10 | 10010010010010000 |
3、rFPVs在商品鸡抵抗H9亚型AIV的免疫效力(以攻毒后第5天的排毒为指标)
10日龄商品代伊莎蛋鸡随机分组，每组26只鸡，分别于颈部皮下免疫rFPV-11SH9A、rFPV-12LSH9A、rFPV-11SH5H9、rFPV-1218AIH5/H9、wt-FPV、PBS和H9亚型AI油乳剂灭活疫苗免疫商品鸡。于免疫后7，10，14，18，21，24，28天采血分离血清检测HI抗体效价。
免疫后28天，用剂量为107ELD50/只的H9亚型AIV F株进行滴鼻攻毒，攻毒后5天采集口腔棉拭子，用10日龄非免疫鸡胚分离病毒。
在商品鸡的免疫保护试验中，油乳剂灭活苗的PI为83；双联苗rFPV-11SH5H9和rFPV-1218AIH5/H9的P1分别为58和68；由p12-18载体构建的重组疫苗分别比相应的由p11S载体构建的重组疫苗的免疫效力略高。
表3.商品蛋鸡接种rFPVs后抵抗H9亚型AIV感染的免疫保护试验
| 组别 | 攻毒剂量(ELD50/只) | 攻毒途径 | 病毒分离率 | 保护指数(PI) |
| H9 AI killed vaccinerFPV-11SH9ArFPV-12LSH9ArFPV-11SH5H9rFPV-1218AIH5/H9wt-FPVPBS | 107107107107107107107 | 滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼 | 2/263/262/265/264/2612/2612/26 | 8375835868-- |
4、rFPVs在商品鸡抵抗H5亚型AIV的免疫效力(以保护临床不发病不死亡为指标)
10日龄商品代伊莎蛋鸡随机分组，每组26只鸡，分别于颈部皮下免疫rFPV-11SH5A、rFPV-12LSH5A、rFPV-11SH5H9、rFPV-1218AIH5/H9、wt-FPV、PBS和H5亚型AI油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡。于免疫后7，10，14，18，21，24，28天采血分离血清检测HI抗体效价。免疫后28天，用剂量为105ELD50/只的A/Goose/Huadong/G5/1996株进行滴鼻攻毒。所有试验鸡于攻毒后持续观察18天，记录试验鸡的发病和死亡情况。
在商品鸡的免疫保护试验中，双联苗rFPV-11SH5H9和rFPV-1218AIH5/H9的PI分别为27.2和45.4。由p12-18载体构建的疫苗比相应的由p11S载体构建的疫苗免疫效力高。
表4.商品蛋鸡接种rFPVs后抵抗H5亚型AIV强毒攻击的免痘保护试验
| 组别 | 攻毒剂量(ELD50/只) | 攻毒途径 | 死亡率死亡数/总数 | 保护指数(PI) |
| rFPV-11SH5ArFPV-12LSH5ArFPV-11SH5H9rFPV-1218AIH5/H9H5 AI killed vaccinewt-FPVPBS | 105105105105105105105 | 滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼滴鼻点眼 | 16/2610/2611/2610/261/2622/2622/26 | 27.254.25054.595.4-- |
ggatccgcca ccatggagaa aatagtgctt tttctt
gtcgacaaaa aaatctcgta ttagtagaaa caagggtg
gctggatccg ccaccatgga aacaatatca ctaatagct
gtcggatcca agcttacaaa aagccaatta tatacaaatc ttgc
Claims (10)
1、重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9，其特征在于该疫苗为含表达H5和H9亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒疫苗，保藏号为：CGMCC NO：1914。
2、如权利要求1所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)获得含H5亚型AIV HA基因整个阅读框架的基因片段；
(2)获得含H9亚型AIV HA基因整个阅读框架的基因片段；
(3)将上述基因片段置于各自合适的启动子下游，背向串联插入到含FPV复制非必需片段FPV12-18和报告基因的插入鸡痘病毒表达载体p12-18中构建成转移载体p1218AIH5/H9，长度为14000bp；
(4)用转移载体p1218AIH5/H9转染已感染wt-FPV的鸡胚成纤维细胞，通过同源重组获得共表达H5和H9亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9。
3、根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9的制备方法，其特征在于步骤(1)中，H5亚型AIV HA基因可以通过以下方法获得，用9-10日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因组的RNA，通过以下引物
PH5A1 5’-GGATCCGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTTTTCTT-3’
PH5A2 5’-GTCGACAAAAAAATCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTG-3’
先反转录合成cDNA，然后PCR扩增出H5亚型AIV HA基因整个阅读框架。
4、根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9的制备方法，其特征在于步骤(2)中，H9亚型AIV HA基因可以通过以下方法获得，用9-10日龄SPF鸡胚扩增病毒，收集尿囊液，酚-SDS法抽提病毒基因组的RNA，通过以下引物，
PH9A1 5’-GCTGGATCCGCCACCATGGAAACAATATCACTAATAGCT-3’
PH9A2 5’-GTCGGATCCAAGCTTACAAAAAGCCAATTATATACAAATCTTGC-3’
先反转录合成cDNA，然后PCR扩增出H9亚型AIV HA基因整个阅读框架。
5、根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9的制备方法，其特征在于步骤(3)中，启动子是任何能够在重组鸡痘病毒感染细胞中指导基因转录的FPV启动子、痘苗病毒启动子或人工合成启动子。
6、根据权利要求2或5所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9的制备方法，其特征在于步骤(3)中，启动子和步骤(1)、(2)所得基因通过酶切加接的方法或用PCR设计引物加接的方法连接在一起，按常规方法将其插入到含FPV复制非必须片段FPV12-18和报告基因LacZ的FPV插入载体中。
7、根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9的制备方法，其特征在于步骤(4)中，用GeneJammerTM转染试剂将转移载体分别与wt-FPV共转染鸡胚成纤维细胞，将上清稀释液接种长成致密单层的CEF，待出现单个典型蚀斑后，用含有X-gal的营养琼脂覆盖，蓝斑筛选纯化得重组病毒rFPV-1218AIH5/H9。
8、根据权利要求2所述重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9的制备方法，其特征在于将共表达H5和H9亚型AIV HA基因的rFPV在CEF单层上增殖，使病毒在CEF中大量扩增。
9、重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9的用途，其特征在于用于防治H5亚型禽流感。
10、重组鸡痘病毒疫苗rFPV-1218AIH5/H9的用途，其特征在于用于防治H9亚型禽流感。
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