CN107475296A - 一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，主要涉及一种表达鸡4型腺病毒(FADV4)fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用。所述载体以pMD19T‑Simple载体为基础，TA克隆位点插入FADV4fiber2基因、lacz基因，以及用于同源重组的鸡痘病毒的基因组复制非必须片段LTYB和RTYB。所述方法包括步骤如下：质粒pMD‑TYB；构建质粒pMD22；构建质粒pMD22‑lacz；构建中间载体pMD22‑TYB‑lacz；扩增FADV4 fiber2基因；构建重组鸡痘病毒转移载体pMD22‑TYB‑lacz‑F4；将转移载体pMD22‑TYB‑lacz‑F4与鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞，鉴定选出阳性，继续传代培养；鉴定重组鸡痘病毒的表达效果。本发明构建的重组鸡痘病毒转移载体为研制高效的表达鸡4型腺病毒的重组鸡痘病毒基因工程活载体疫苗奠定基础。

Description

一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体 及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及一种表达鸡4型腺病毒(FADV4)fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用。
背景技术
禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是一种无囊膜的双链DNA病毒，衣壳呈规则的20面体结构，直径约80～110nm，属于腺病毒科禽腺病毒属，根据其群特异性抗原的不同禽腺病毒可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共3群。Ⅰ群禽腺病毒主要从鸡、火鸡、鹅及其它禽类获得，分为5个种(A～E)，每个种内的病毒主要根据交叉中和试验结果进一步分为12个血清型(FAdV1～12)。禽腺病毒C包括禽腺病毒4型和10型(FAdV-4、FAdV-10)，其主要临床和病理症候群为心包积水综合征、包涵体肝炎等。
禽腺病毒衣壳主要由六邻体(hexon)和五邻体(penton)构成，而五邻体结合着两根纤维突起，为纤维蛋白(fiber)，两根纤维蛋白分别为fiber1和fiber2，纤维蛋白可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用，其中fiber2基因能够增加鸡群的抗体水平，在遭受禽腺病毒的攻击时提供更好的保护作用。(AnnaSchachner,Ana Marek,Barbara Jaskulska,Ivana Bilic,Michael Hess，RecombinantFAdV-4 fiber-2 protein protects chickens against hepatitis–hydropericardiumsyndrome(HHS).Vaccine 32，2014:1086-1092)
2015年6月份以来，我国江苏、安徽、河南、山东、辽宁、内蒙等地的鸡群陆续发生了不明原因的以心包积液、肝脏肿大为特征的疾病。根据病变，该病被称为“鸡心包积液-肝炎综合征”。通过病原分离鉴定和动物回归试验，许多专家学者们以不同的方式，最终确定该病的病原为禽腺病毒4型(fowl adenovirus 4，FAdV-4)(孙跃勇中兽医理论解析安卡拉1008-4754.2015.12.014)。该病于1987年最早发现于巴基斯坦卡拉奇市附件的安卡拉地区，故也称为安卡拉病，我国之前尚未见该病发生与流行的报道。
该病主要发生于20～30日龄的肉鸡，包括817、肉杂等，自然发病日龄最小的为7日龄。发病后4～8天为死亡高峰，病程为8～15天，死亡率达20％～30％。发病日龄越小，死亡率越高。鸡死亡前均正常采食，无明显临床表现而突然倒地死亡(常维山，王涛鸡心包积液综合征(安卡拉病)病原分离检测疾病防治1008-4754.2015.12.013)。同时20～70日龄以及200～300日龄的蛋鸡也有发生，但死亡率低于肉鸡。
目前，该病仍有发生与流行，给我国养鸡业造成了一定的经济损失，因而对该疾病的防控显得尤为关键。在疫苗方面，目前有疫苗厂家生产了相应的鸡胚灭活疫苗、细胞培养的灭活疫苗，但效果不是很理想，灭活疫苗只能一定程度上阻止该病的发生，在免疫预防中使用时所存在的一些不足，如抗体产生慢，无法区分疫苗免疫和野毒感染而无法进行疫情监测，免疫效果差，需要多次免疫，增加了成本等，因此需要开发更加有效的疫苗来对鸡4型腺病毒进行防控。
足见，现有技术还有待完善。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒(rFPV FADV4 fiber2)转移载体的构建及其方法和应用，为研制高效的表达鸡4型腺病毒的重组鸡痘病毒基因工程活载体疫苗奠定基础。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒(rFPV FADV4 fiber2)转移载体，所述载体以pMD19T-Simple载体为基础，在pMD19T-Simple载体TA克隆位点插入含有鸡痘病毒的早晚期启动子LP2EP2启动下的FADV4 fiber2基因(SEQ ID NO:7)、P11启动子启动下的lacz基因(SEQ ID NO:5)，以及用于同源重组的鸡痘病毒的基因组复制非必须片段LTYB(SEQ ID NO:2)、RTYB(SEQ ID NO:3)。
一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒(rFPV FADV4 fiber2)转移载体的构建方法，该转移载体的构建流程图见图1所示，包括步骤如下：
(1)构建含同源重组臂基因的质粒pMD-TYB；
(2)构建质粒pMD22；
(3)构建质粒pMD22-lacz；
(4)构建中间载体pMD22-TYB-lacz；
(5)扩增FADV4 fiber2基因，所得扩增产物序列为SEQ ID NO：7所示；
(6)构建重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-F4，序列如SEQ ID NO：1所示；
(7)将转移载体pMD22-TYB-lacz-F4与鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，鉴定选出阳性，继续传代培养；
(8)鉴定重组鸡痘病毒的表达效果。
进一步的，一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒(rFPV FADV4fiber2)转移载体的构建方法，具体包括步骤如下：
(1)构建含同源重组臂基因的质粒pMD-TYB：以购自本公司大华农生物科技公司的鹌鹑化弱毒株(CVCC AV1003)鸡痘病毒疫苗所抽提的核酸作为模板，使用引物设计软件premier5.0根据GenBank上FPV毒株(GenBank:AF198100.1)的序列设计引物LTYB-F/R、RTYB-F/R(见表1)分别扩增左右同源臂序列，先将扩增的左同源臂序列(SEQ ID NO:2)TA克隆至pMD19T-Simple载体，为质粒pMD-LTYB，再将扩增的右同源臂序列(SEQ ID NO:3)插入到NotI和EcoRI位点间，为含有左右同源重组臂的质粒pMD-TYB；
(2)构建质粒pMD22：合成含鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2、P11启动子的多克隆位点序列SEQ ID NO:4，并通过TA克隆至pMD19T-Simple载体中，形成质粒pMD22；
(3)构建质粒pMD22-lacz：以质粒pSV-β-Galactosidase Control Vector为模板，设计引物lacz-F/R(见表1)扩增lacz序列(SEQ ID NO:5)，使用infusion酶将扩增的lacz序列插入质粒pMD22的XhoI位点，形成质粒pMD22-lacz；
(4)构建中间载体pMD22-TYB-lacz：将质粒pMD22-lacz、pMDTYB用NotI酶切连接，形成含有左右同源臂、鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2的多克隆位点、P11启动下lacz基因的中间转移载体pMD22-TYB-lacz(SEQ ID NO:6)；
(5)扩增FADV4 fiber2基因：根据FADV4 HB151株fiber2基因序列设计引物F4-fiber2-F/R(见表1)；以鸡场采集样品分离的病毒F4毒株为模板扩增FADV4 fiber2基因，所得扩增产物序列为SEQ ID NO：7所示；
(6)构建重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-F4：将(5)中所得的FADV4fiber2基因(SEQ ID NO:7)插入到质粒pMD22-TYB-lacz(SEQ ID NO:6)的SmaI位点，即得表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-F4，序列如SEQ IDNO：1所示；
(7)将转移载体pMD22-TYB-lacz-F4与鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，用X-gal进行蓝白斑筛选，挑取蓝斑鉴定阳性，继续传代直至所有斑都为蓝斑为止；
(8)通过间接免疫荧光鉴定重组鸡痘病毒的表达效果。
进一步的，所述步骤(3)中FADV4 fiber2基因通过用infusion酶无缝连接方法插入到质粒pMD22-TYB-lacz的SmaI位点。
进一步的，所述步骤(7)中鸡胚成纤维细胞(CEF)制备方法包括：
①将选好的两枚9-10日龄的发育良好的SPF胚用5％的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘；②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头、四肢和内脏；③再用PH7.2的PBS冲洗两次；④用手术剪剪成小块(2-3mm)，用PH7.2的PBS冲洗两次；⑤约加20ml 0.25％胰酶溶液，37℃消化15min，期间5min轻摇一次；⑥消化结束，将细胞消化倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中过滤；⑦将过滤液2000rpm离心5min，弃去上清液，将细胞用100ml含10％FCS的DMEM培养基溶解；⑧用六孔板每个孔接种2ml，37℃，5％CO2培养箱培养16h左右。
进一步的，所述转移载体或所述方法构建所得的载体在制备FPV载体疫苗中的应用。
运用上述载体或上述方法所构建的载体制备抗鸡4型腺病毒FPV载体疫苗的方法，包括步骤：将上述挑取的鉴定为阳性的蓝斑继续接种于铺满单层的CEF细胞上，于37℃，5％CO2培养箱孵育2h后继续进行蓝白斑筛选纯化，如此反复进行多代次的纯化，直至所有病变出现的空斑均为蓝斑，则纯化完成；将纯化好的病毒液再接种于CEF细胞上进行传代，收集病毒液，利用该病毒液生产抗鸡4型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体疫苗。
本发明有益效果：
本发明中转移载体构建过程中已先将含有鸡痘病毒的基因组TYB非复制区片段、鸡痘病毒的早晚期启动子LP2EP2、筛选基因lacz基因的中间质粒pMD22-TYB-lacz构建好，只需用infusion方法直接将FADV4 fiber2基因插入到pMD22-TYB-lacz中，消除了使用酶切连接方法中因为插入基因中含有酶切位点与载体的一些冲突，大大提高了效率。
近二十年来，FPV载体疫苗的研究取得了巨大的进展，有多种病毒的保护性抗原在FPV载体中得到重组表达，对疾病的预防控制起到很重要作用。相比减毒疫苗的安全性问题、灭活疫苗抗体产生慢、成本高等问题，重组鸡痘载体疫苗显得更有优势。本发明构建的重组鸡痘病毒转移载体为研制高效的表达鸡4型腺病毒的重组鸡痘病毒基因工程活载体疫苗奠定基础。
附图说明
图1：表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体的构建流程图。
图2 FADV4 fiber2 PCR扩增图。1：FADV4 fiber2；2：阴性对照；3：DL2000。
图3重组病毒rFPV-FADV4 fiber2感染CEF后蚀斑图。
图4重组鸡痘病毒rFPV-FADV4 fiber2PCR鉴定图。1：阴性；2：阳性；3-4：rFPV-FADV4 fiber2纯化第五代挑取不同蓝色空斑抽提DNA；5-6：rFPV-FADV4 fiber2纯化第二代挑取不同蓝色空斑抽提DNA 7：DL2000。
图5 TYB引物鉴定重组病毒rFPV-FADV4 fiber2 PCR结果。1：鸡痘DNA对照；2：rFPV-FADV4 fiber2纯化第四代病毒抽提DNA；3：rPV4-FADV4 fiber2纯化第五代病毒抽提DNA 4：阴性；5：rFPV-FADV4 fiber2转移质粒阳性对照；6：DL10000。
图6重组病毒rFPV-FADV4 fiber2感染CEF细胞间接免疫荧光图。
图7正常CEF细胞间接免疫荧光图。
图8鸡痘病毒感染CEF细胞间接免疫荧光图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
实施例1表达鸡4型腺病毒(FADV4)fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体构建
1.材料
1.1病毒毒株和细胞
鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株(CVCC AV1003)购自本公司大华农生物科技公司，鸡4型腺病毒毒株(F4)为鸡场采集于实验室保存，鸡胚成纤维细胞(CEF)用温氏公司SPF鸡胚制备。
1.2质粒和菌种
感受态JM109购自宝生物公司，含鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2的多克隆位点、筛选基因lacz基因及用于同源重组的鸡痘病毒的基因组TYB非复制区片段的质粒pMD22-TYB-lacz为本实验室构建。
1.3主要试剂
高保真酶PrimeSTAR、限制性内切酶SmaI、infusion试剂盒、IPTG、X-gal购自TAKARA公司，DNA回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司，DNA抽提试剂盒购自Axygen公司，胎牛血清(FCS)和DMEM培养基购自Thermo公司，转染试剂购自life公司、荧光显微镜为Leica公司。
2.方法：
表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-F4的构建流程见图1。
3.具体步骤：
3.1鸡痘病毒液准备：制备CEF细胞，待细胞长至80％左右时，加入适量用DMEM基础培养基稀释的鸡痘疫苗毒株，37℃，5％CO2培养1h，加入含2％FCS的DMEM培养基培养72h左右，收获病毒，反复冻融三次，盲传10代，收集每代病毒液备用。
3.2转移载体pMD22-TYB-lacz-F4的构建：
根据FADV4 HB151株(GenBank:KU587519.1)fiber2基因序列设计引物F4-fiber2-F、F4-fiber2-R(序列见表1)，以本实验保存毒株F4为模板用高保真酶PrimeSTAR扩增FADV4fiber2基因片段(SEQ ID NO:7)，结果如图2中编号1所示，扩增出片段为1440bp，送上海生工测序可确认为为FADV4 fiber2基因片段，用infusion酶无缝连接方法将所扩增的片段插入载体pMD22-TYB-lacz(SEQ ID NO:6)的SmaI位点，即得表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-F4(SEQ ID NO:1)。
表1引物序列表
实施例2对实施例1中的转移载体pMD22-TYB-lacz-F4进行效果验证
重组鸡痘病毒鉴定
根据质粒试剂盒使用说明抽提实施例1中的转移载体pMD22-TYB-lacz-F4，制备CEF细胞，细胞长至80％左右时，接种鸡痘疫苗毒株病毒液，37℃孵育2h，洗涤细胞后将转移载体pMD22-TYB-lacz-F4根据Lipofectamine 2000试剂使用说明方法进行转染，待细胞产生80％病变时收集细胞，反复冻融三次，用X-gal进行蓝白斑筛选，如图3所示，挑取蓝斑，反复冻融三次，抽提DNA，用引物F4-fiber2-F、F4-fiber2-R进行PCR检测，结果如图4所示，扩增出1440bp的片段，证明fiber2已重组到鸡痘病毒基因组中。再将表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒(rFPV-FADV4 fiber2)进行多次筛选纯化，直至出现的斑都为蓝斑为止，同时将纯化的病毒用根据同源臂TYB基因设计的引物TYB-JC-F、TYB-JC-R(见表1)进行PCR检测，结果如图5所示，图中编号1为FPV病毒抽提的DNA扩增片段，大小为703bp，编号5为转移质粒rFPV-FADV4 fiber2扩增片段，大小为5315bp，编号4为阴性对照，编号2-3为纯化的重组病毒rFPV-FADV4fiber2挑取的不同克隆蓝斑抽提的DNA扩增结果，如图所示，编号2、3只出现了5315bp的片段，而没有出现703bp片段，表明转移质粒已重组到了FPV病毒中，并且得到了纯化。
表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒表达效果的验证
将表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒(rFPV-FADV4 fiber2)进行多次筛选纯化，将纯化得到的rFPV-FADV4 fiber2接种于用24孔板培养的CEF细胞中，置于37℃二氧化碳培养箱培养，待出现明显病变后，用PBS洗两遍；冷甲醇固定，PBS洗三遍；加1％BSA封闭1h，用PBS洗三遍；加入1:100稀释的鸡抗FADV4的一抗37℃孵育2h，用PBST洗三遍；再加入1∶200稀释的兔抗鸡IgG-FITC荧光二抗，室温孵育1h，PBST洗三遍；置于倒置荧光显微镜下观察结果，同时以正常CEF细胞及感染了鸡痘病毒的CEF细胞作为对照。结果如图6-8所示，可以看出只有感染了rFPV-FADV4 fiber2的CEF细胞上出现了特异性的绿色荧光，表明重组鸡痘病毒rFPV-FADV4 fiber2感染了CEF细胞后有效的表达了FADV4的fiber2抗原。
实施例3抗鸡4型腺病毒FPV载体疫苗制备
将转移载体pMD22-TYB-lacz-F4与鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，用X-gal进行蓝白斑筛选，挑取蓝斑鉴定阳性，继续传代直至所有斑都为蓝斑为止，将挑取的鉴定为阳性的蓝斑继续接种于铺满单层的CEF细胞上，于37℃，5％CO2培养箱孵育2h后继续进行蓝白斑筛选纯化，如此反复进行多代次的纯化，直至所有病变出现的空斑均为蓝斑，则纯化完成；将纯化好的病毒液再接种于CEF细胞上进行传代，收集病毒液，该病毒液可用于生产抗鸡4型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体疫苗。
抗鸡4型腺病毒FPV载体疫苗效力的实验室验证
将纯化好的rFPV-FADV4 fiber2重组病毒在CEF细胞上传代十次，均能产生病变，每三代左右使用X-gal染色空斑计数进行一次病毒滴度检测，经检测rFPV-FADV4 fiber2重组病毒传至第十代时病毒滴度为5*105PFU/ml，同时用检测引物F4-fiber2-F/R进行检测也为阳性。
抗鸡4型腺病毒FPV载体疫苗临床试验验证
本发明还初步研究了重组鸡痘病毒rFPV-FADV4 fiber2在动物体内的免疫效果，结果显示该重组病毒在动物体内可产生良好的免疫效果。
用重组病毒(rFPV-FADV4 fiber2)(5×105PFU/羽)经翅皮下注射接种于10天龄的SPF鸡上，同时设空白组、免疫某公司灭活疫苗做对照，分别于免疫前、免后三周采血，通过ELISA方法检测机体抗体水平变化。步骤：用包被缓冲液将表达FADV4 fiber2的蛋白稀释至3μg/ml，每孔加100ul，于96孔板中37℃，包被2h；1％BSA，37℃封闭1h；加入上述所采的稀释了200倍的血清，37℃孵育2h，用PBST洗三遍，每次洗3min；再加入羊抗鸡HRP酶标记二抗37℃孵育1h，用PBST洗三遍，每次洗3min；加底物TMB显色，37℃20min；最后加终止液终止，将板置于酶标仪中，在OD450下读数；结果如下：免疫前整体抗体水平OD值为0.31，免疫后三周，空白组平均OD值为0.27，某公司灭活疫苗为0.70，rFPV-FADV4 fiber2重组病毒为0.75，结果初步显示该重组病毒在动物体内可产生良好免疫效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
<110> 广东温氏食品集团股份有限公司
<120> 一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用
<160> 7
<210> 1
<211> 10579
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt agaactcggt acgcgcggat 420
cttccagaga ttacaacggc atgactaccg agtatagata aagatttaga aatcatttct 480
aagaaattta gatactgatg tatacaagta taactaatag cgagtaattt attttgttct 540
atagcttcat tatatttttt taaagcagat acaagttgtg tatttagagc gtcgttaaag 600
taaacagtat ttccttctac atttaatgaa ctcaataaca tatttcccga aggtaataat 660
cttgaccaag ggaaaataga atattcacgg tataagaaac atacagaata accattttct 720
attaactttt caacagaaat agctcctctc atacccgtac taaaattctc taaaaatctg 780
actggttttt tttctaaaga tactctagtc cctccagatg tgactaaagc tacacgcctg 840
tttttctctt tttgtaattt tacccaatta ttaatgttag tagtcgtgtc cattttttta 900
atataagaat ttatattagg ttaatttata agaaaccaat actttaaatc tctaattcgt 960
tgttctaaac aacagttatg gtttcttaaa ttgttgattc atgataatat tatcgtaata 1020
attctattat tgaaatatct agtctcgttt ttgagataaa tattacgaat aaagcatatt 1080
catatcaaag caacattagc tttacattta agttgtacta cgcatacgca cgaagtacct 1140
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gccggatatt ccttacactt ggtttcgaat aggtactgat agtaaacttg tttattatgt 1320
actatttgat ccaatagttc tagtttatta cctctgtgat caaagactgt agttttgtta 1380
gcgacccatg tagaactact ttcacaagat aagtatattc cttcactggt attacctaca 1440
gacaataatt catctatgct tcgtttacca cgatgttcta tattcggagt acgagtacta 1500
aaaacaactt tagatgtatc taatttatcg tttataagat aaggattagt aaattggagt 1560
aacgatccct tgcatactat acctaataca catataaaga ttagccttct aaaattacag 1620
gggtgcgtat ggtatgccat tcttatttat atatgaactt actaattaag taatagaata 1680
tgtctcagta ataattgacg gtacactgta gtatttgatt ccactagtaa acacataaat 1740
tccttaccat tatgtttatt atccactaat agttctctaa taaaaaatgt agagttttgt 1800
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ccgggaccgg cccaaaacat tctcgctgac gaacctttcc taccacaccc tacacatatt 1920
aagctagtag tatttatatc ttcaggcagt ctagtaatat taacgtaggt acaatcttcg 1980
cgtgttacag gacagcattc tcgcacaccg tcggaatttt ttcttgcgtt ttccggaaga 2040
tatccttcta ggtctagaag cggccgccct gcccggttat tattattttt gacaccagac 2100
caactggtaa tggtagcgac cggcgctcag ctggaattcc gccgatactg acgggctcca 2160
ggagtcgtcg ccaccaatcc ccatatggaa accgtcgata ttcagccatg tgccttcttc 2220
cgcgtgcagc agatggcgat ggctggtttc catcagttgc tgttgactgt agcggctgat 2280
gttgaactgg aagtcgccgc gccactggtg tgggccataa ttcaattcgc gcgtcccgca 2340
gcgcagaccg ttttcgctcg ggaagacgta cggggtatac atgtctgaca atggcagatc 2400
ccagcggtca aaacaggcgg cagtaaggcg gtcgggatag ttttcttgcg gccctaatcc 2460
gagccagttt acccgctctg ctacctgcgc cagctggcag ttcaggccaa tccgcgccgg 2520
atgcggtgta tcgctcgcca cttcaacatc aacggtaatc gccatttgac cactaccatc 2580
aatccggtag gttttccggc tgataaataa ggttttcccc tgatgctgcc acgcgtgagc 2640
ggtcgtaatc agcaccgcat cagcaagtgt atctgccgtg cactgcaaca acgctgcttc 2700
ggcctggtaa tggcccgccg ccttccagcg ttcgacccag gcgttagggt caatgcgggt 2760
cgcttcactt acgccaatgt cgttatccag cggtgcacgg gtgaactgat cgcgcagcgg 2820
cgtcagcagt tgttttttat cgccaatcca catctgtgaa agaaagcctg actggcggtt 2880
aaattgccaa cgcttattac ccagctcgat gcaaaaatcc atttcgctgg tggtcagatg 2940
cgggatggcg tgggacgcgg cggggagcgt cacactgagg ttttccgcca gacgccactg 3000
ctgccaggcg ctgatgtgcc cggcttctga ccatgcggtc gcgttcggtt gcactacgcg 3060
tactgtgagc cagagttgcc cggcgctctc cggctgcggt agttcaggca gttcaatcaa 3120
ctgtttacct tgtggagcga catccagagg cacttcaccg cttgccagcg gcttaccatc 3180
cagcgccacc atccagtgca ggagctcgtt atcgctatga cggaacaggt attcgctggt 3240
cacttcgatg gtttgcccgg ataaacggaa ctggaaaaac tgctgctggt gttttgcttc 3300
cgtcagcgct ggatgcggcg tgcggtcggc aaagaccaga ccgttcatac agaactggcg 3360
atcgttcggc gtatcgccaa aatcaccgcc gtaagccgac cacgggttgc cgttttcatc 3420
atatttaatc agcgactgat ccacccagtc ccagacgaag ccgccctgta aacggggata 3480
ctgacgaaac gcctgccagt atttagcgaa accgccaaga ctgttaccca tcgcgtgggc 3540
gtattcgcaa aggatcagcg ggcgcgtctc tccaggtagc gaaagccatt ttttgatgga 3600
ccatttcggc acagccggga agggctggtc ttcatccacg cgcgcgtaca tcgggcaaat 3660
aatatcggtg gccgtggtgt cggctccgcc gccttcatac tgcaccgggc gggaaggatc 3720
gacagatttg atccagcgat acagcgcgtc gtgattagcg ccgtggcctg attcattccc 3780
cagcgaccag atgatcacac tcgggtgatt acgatcgcgc tgcaccattc gcgttacgcg 3840
ttcgctcatc gccggtagcc agcgcggatc atcggtcaga cgattcattg gcaccatgcc 3900
gtgggtttca atattggctt catccaccac atacaggccg tagcggtcgc acagcgtgta 3960
ccacagcgga tggttcggat aatgcgaaca gcgcacggcg ttaaagttgt tctgcttcat 4020
cagcaggata tcctgcacca tcgtctgctc atccatgacc tgaccatgca gaggatgatg 4080
ctcgtgacgg ttaacgcctc gaatcagcaa cggcttgccg ttcagcagca gcagaccatt 4140
ttcaatccgc acctcgcgga aaccgacatc gcaggcttct gcttcaatca gcgtgccgtc 4200
ggcggtgtgc agttcaacca ccgcacgata gagattcggg atttcggcgc tccacagttt 4260
cgggttttcg acgttcagac gtagtgtgac gcgatcggca taaccaccac gctcatcgat 4320
aatttcaccg ccgaaaggcg cggtgccgct ggcgacctgc gtttcaccct gccataaaga 4380
aactgttacc cgtaggtagt cacgcaactc gccgcacatc tgaacttcag cctccagtac 4440
agcgcggctg aaatcatcat taaagcgagt ggcaacatgg aaatcgctga tttgtgtagt 4500
cggtttatgc agcaacgaga cgtcacggaa aatgccgctc atccgccaca tatcctgatc 4560
ttccagataa ctgccgtcac tccagcgcag caccatcacc gcgaggcggt tttctccggc 4620
gcgtaaaaat gcgctcaggt caaattcaga cggcaaacga ctgtcctggc cgtaaccgac 4680
ccagcgcccg ttgcaccaca gatgaaacgc cgagttaacg ccatcaaaaa taattcgcgt 4740
ctggccttcc tgtagccagc tttcatcaac attaaatgtg agcgagtaac aacccgtcgg 4800
attctccgtg ggaacaaacg gcggattgac cgtaatggga taggtcacgt tggtgtagat 4860
gggcgcatcg taaccgtgca tctgccagtt tgaggggacg acgacagtat cggcctcagg 4920
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ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct 5040
attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg 5100
gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac gggatcgctc gaggaattca tttatagcat 5160
agaaaaaaac aaaatgaaat tctactatat ttttacatac atatattcta aatatgaaag 5220
tggtgattgt gactagcgta gcatcgctct agaataaaaa ttaattaatt atggatttac 5280
gggagggagg ccgctggaca gctgtagagc acgggtccca cgatcatggt tccgctgttg 5340
tttggattaa aaatgctcgc gttcgtgcac tgcagactat agcatagaag ggtgtatcgc 5400
tctccggagg ccgaaaccgg cacggggagg acgcggatcc ctatgtttcc cgggttccag 5460
gcacctgtta ccaccgggct gaacacttgg aattccccga tggatggttc atagtatcca 5520
ttggccgagt acgtccatgg gctggtcacg ctcctattgg ccatgggttc aaagtccgtg 5580
agggtggcgg tggaggggct gaccgttccc gcttgaatcc cggaggggtt gcattgctgg 5640
agataggcgg acacccaaaa ggtgaaccat ttggcattgg cggagttgag gtccccaggg 5700
cgattcccca tggtggcgct gtccaatttc aagtagaggg aggtaacaag gagcccctgt 5760
atgttccact gttgaaggta gtaggcgcaa gagaaggcgt tcgcgctgga attgacggtc 5820
gtggcattgt aggtgttgag gctgggactt cccgagacaa aagtagcgat gggtgtggag 5880
acgctccccc ctccgaccac ggttaaagcg cccgcggtca ccgctagggt attagtgtcg 5940
tacttcagcc ctaggccatt ggcggagacc gtaagcggtc cgctgggatc cggtttcact 6000
tccagagtgt tgttgacaat ctgtaggctt tcatccacgg aaacgcccac tcccgaactg 6060
tcggcttgga tgcctccctg cgcttttagg ttgagttcca gcactccgct tccggtcgag 6120
gtgttgaccg tgaacatgtt aggattgatc tcgaggtcga taccactgct atcggcagtg 6180
atgggtcctt gttggttgag gtgtacgccc agttctccct gatccacgag caaggtgtcg 6240
tccacgctga cccccagtcc acccgcggtg gaatccaatc cgccggacgg gtcgactttt 6300
acggccagtt cccagtcatc gttgaccatt acggtcactc cgtcgacctt gacgtccagt 6360
ccatcggggg tgatgtccag ggccccttcg gggtcaacgg ccaccgccag ttgaccttgg 6420
gcgttgacat cgagactggg gtcgtgggcc aagtccaccg atctgttctt gatgatgatg 6480
ggatcggtga cgttgagcgt aagctgtccg ccctggtcca ctaggggtcc tgagcctccc 6540
aaaaaaggcg ggttgagccc tccgacgggg tcggccacgt aatcgaaagg ataaaccagg 6600
tcaagctggg atgctctcac catgcgtttg gcgcgcttga ttggagccgg ggaaggtccc 6660
gcttcggtct cgggcttccc gttttcggaa tgtcttcttt taggggcccg gagcatgggc 6720
atttattatc gataattaca attcaatttt aggatacaga tctatttata tgccaaaaaa 6780
aaaaaaaaaa aaaagagtcg acctaggcgg ccgctatgaa ttccttctgg acacgatatc 6840
tatcctacta agtatgtatg gtatttattt atcaattaat ctgcgtatgt agtaactact 6900
acagcgtttc taagatcatc atgtcctaca attttatttc tttgacgtcg tgtttatatc 6960
attttctgtt ttgggataat aattttctct aatataaaat tatatattaa ttctttttct 7020
atattgaagt gatttaatta aagaaaatat gtaatcttta tctaattagg tttttcctta 7080
tctaataata gaactgtata cctggtgatc ttcctacttg atttacgtga cctaatataa 7140
ttatttagat atttacctgt ttttcgcata aatataattc ctaaaaatat tattattaag 7200
atattaatat ctattatcca tgataatata tagagaaaca ttatattaat cgccaatcga 7260
atatgaataa catacatagt aataataaag atagcagtta atggcaaact aatattattc 7320
atgataactg ctataaaaga agataatata gcaagatata ttgaagtgtc tatcatatct 7380
tattttatgg ataaaccttt aacggcaact tctaagttac ttattttttg gtttattaaa 7440
ctattggttt tttcgtactt ttcttccaat ttttttgtat ttttctttaa ttttaatatc 7500
tcattatcat gaatgtcgta tagtatttta cttataccct cagagaagaa gccgcttcgt 7560
atctgatctt cattatcaga acctttttta agcctcgtgc aataggagtt agaaagatag 7620
gagttaagta tcttggaaaa attaagtgca atactaggaa aaacccaaca gataatatga 7680
ggcacgagat cgatatgcac atatgttcct acaagttcgt atttataggc actatttgat 7740
gctaatccga tttctaaaac ggctttatta tagataccgt ttttatagtt caatgttttt 7800
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catattttag tagcatttat atatccgttg tattttaaca tgattacttc tatgttcgca 7920
tagttgataa agcaaaagtt ctcatctata tgtttaacgg tgttaggtac aaactccata 7980
ttgtaatact ttcattcaga atagtattgt ttttacattt tttattataa ggaaaaaact 8040
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tcattacagc attattttca ccaagataca ttattttttt aatttctgtg accgtagaac 8160
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ccatgcagct aatcatttga atgtattgtg tgtatccatc tcctttctca gaatatctgc 8280
ccaaaaattc tattttactg acaccagttc cattaacaat cgtcgaacgg caggcgtgca 8340
aacttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 8400
ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 8460
taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 8520
cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 8580
tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 8640
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<210> 2
<211> 1645
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 1523
<212> DNA
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tccgttgtat tttaacatga ttacttctat gttcgcatag ttgataaagc aaaagttctc 1140
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<213> 人工序列
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acacccatcg ctacttttgt ctcgggaagt cccagcctca acacctacaa tgccacgacc 900
gtcaattcca gcgcgaacgc cttctcttgc gcctactacc ttcaacagtg gaacatacag 960
gggctccttg ttacctccct ctacttgaaa ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct 1020
ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 1080
caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga acggtcagcc cctccaccgc caccctcacg 1140
gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg accagcccat ggacgtactc ggccaatgga 1200
tactatgaac catccatcgg ggaattccaa gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg 1260
aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc cccgtgccgg tttcggcctc cggagagcga 1320
tacacccttc tatgctatag tctgcagtgc acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac 1380
agcggaacca tgatcgtggg acccgtgctc tacagctgtc cagcggcctc cctcccgtaa 1440

Claims (8)

1.一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体，其特征在于，所述载体以pMD19T-Simple载体为基础，在pMD19T-Simple载体TA克隆位点插入含有鸡痘病毒的早晚期启动子LP2EP2启动下的FADV4fiber2基因、P11启动子启动下的lacz基因，以及用于同源重组的鸡痘病毒的基因组复制非必须片段LTYB和RTYB。
2.一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤如下：
(1)构建含同源重组臂基因的质粒pMD-TYB；
(2)构建质粒pMD22；
(3)构建质粒pMD22-lacz；
(4)构建中间载体pMD22-TYB-lacz；
(5)扩增FADV4fiber2基因；
(6)构建重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-F4；
(7)将转移载体pMD22-TYB-lacz-F4与鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，鉴定选出阳性，继续传代培养；
(8)鉴定重组鸡痘病毒的表达效果。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述方法具体包括步骤如下：
(1)构建含同源重组臂基因的质粒pMD-TYB：以鹌鹑化弱毒株鸡痘病毒疫苗所抽提的核酸作为模板，使用引物LTYB-F/R、RTYB-F/R分别扩增左右同源臂序列，先将扩增的左同源臂序列TA克隆至pMD19T-Simple载体，为质粒pMD-LTYB，再将扩增的右同源臂序列插入到NotI和EcoRI位点间，为含有左右同源重组臂的质粒pMD-TYB；
(2)构建质粒pMD22：合成含鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2、P11启动子的多克隆位点序列，并通过TA克隆至pMD19T-Simple载体中，形成质粒pMD22；
(3)构建质粒pMD22-lacz：以质粒pSV-β-Galactosidase Control Vector为模板，使用引物lacz-F/R扩增lacz序列，并将扩增的lacz序列插入质粒(2)中所得质粒pMD22的XhoI位点，形成质粒pMD22-lacz；
(4)构建中间载体pMD22-TYB-lacz：将(3)中所得质粒pMD22-lacz、(1)中所得质粒pMDTYB用NotI酶切连接，形成含有左右同源臂、鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2的多克隆位点、P11启动下lacz基因的中间转移载体pMD22-TYB-lacz；
(5)扩增FADV4fiber2基因：使用引物F4-fiber2-F/R；以F4的毒株为模板扩增FADV4fiber2基因；
(6)构建重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-F4：将(5)中所得的FADV4fiber2基因插入到(4)中所得质粒pMD22-TYB-lacz的SmaI位点，即得表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-F4；
(7)将(6)中所得转移载体pMD22-TYB-lacz-F4与鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，用X-gal进行蓝白斑筛选，挑取蓝斑鉴定阳性，继续传代直至所有斑都为蓝斑为止；
(8)鉴定重组鸡痘病毒的表达效果。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中FADV4 fiber2基因通过用infusion酶无缝连接方法插入到质粒pMD22-TYB-lacz的SmaI位点。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(7)中鸡胚成纤维细胞通过如下方法制备：
①将选好的两枚9-10日龄的发育良好的SPF胚用5％的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘；②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头、四肢和内脏；③再用PH7.2的PBS冲洗两次；④用手术剪剪成小块(2-3mm)，用PH7.2的PBS冲洗两次；⑤加20ml 0.25％胰酶溶液，37℃消化15min，期间5min轻摇一次；⑥消化结束，将细胞消化倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中过滤；⑦将过滤液2000rpm离心5min，弃去上清液，将细胞用含10％FCS的DMEM培养基溶解；⑧用六孔板每个孔接种2ml，37℃，5％CO2培养箱培养16h左右。
6.根据权利要求1所述的重组鸡痘病毒转移载体，其特征在于，所述转移载体在制备FPV载体疫苗中的应用。
7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述方法构建所得的重组鸡痘病毒转移载体在制备FPV载体疫苗中的应用。
8.一种抗鸡4型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体疫苗的制备方法，其特征在于，制备方法如下：
(1)将权利要求1所述的载体或权利要求2-5的方法所制得的表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体与鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞，挑取鉴定为阳性的蓝斑继续接种于铺满单层的鸡胚成纤维细胞上，于37℃，5％CO2培养箱孵育2h后继续进行蓝白斑筛选纯化，如此反复进行多代次的纯化，直至所有病变出现的空斑均为蓝斑，则纯化完成；
(2)将纯化好的病毒液再接种于鸡胚成纤维细胞上进行传代，收集病毒液，将该病毒液生产成抗鸡4型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体疫苗。
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