CN105039264A - 一种犬细小病毒增殖方法 - Google Patents

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孙晨
苏建东
杨保收
付旭彬
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Abstract

本发明提供了一种犬细小病毒增殖方法，该方法创新性的利用F81细胞作为犬细小病毒的宿主细胞，尤其有利于病毒的增殖；采用激流式生物反应器较传统的转瓶方式工艺更易于控制，产品质量更加稳定；采用微载体的培养方式可以充分利用培养液，保持了贴壁细胞的生长特性，同时实现了高密度培养的作用。与此同时，本发明针对F81细胞、犬细小病毒自身特性以及生物反应器的培养环境匹配了特定的培养条件，从培养液成分、接种量、条件参数等方面进行了优化设计，使得犬细小病毒增殖效率得到显著提升。本发明以巧妙的技术构思实现了突出的技术效果，且成本较低、易于实现，具备突出的推广前景。

Description

一种犬细小病毒增殖方法
技术领域
本发明涉及病毒培养技术领域，进一步涉及疫苗抗原制备技术领域，具体涉及一种犬细小病毒增殖方法。
背景技术
犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)属细小病毒科细小病毒属，主要感染犬，尤其幼犬，健康犬感染CPV后，病毒主要攻击肠上皮细胞和心肌细胞，分别表现胃肠道症状和心肌炎症状，犬细小病毒具有极强的传染性，犬感染后死亡率较高。对于犬细小病毒感染病例，临床上主要是对症治疗配合高免血清和单克隆抗体治疗，从疗效、成本等方面考虑都不尽理想，综合来看通过疫苗免疫是应对该病毒的根本措施。这就涉及到犬细小病毒抗原的增殖技术。
现有技术中犬细小病毒抗原生产主要采用细胞转瓶培养方法，转瓶工艺生产抗原病毒含量较低，仅为104.5～6.0TCID50/ml，不能提供稳定合格抗原(合格抗原每毫升抗原含量应≥107.0TCID50/ml)，需要进行高倍浓缩，且转瓶工艺劳动强度大，生产一批需要100～200个转瓶，需多人同时进行长时间的消化传代操作，增加污染风险；生产周期长，需要20天；效率较低，每次培养只能收获一次；生产成本较高，人工、场地及原料费用大；对环境要求较高，需要较大的场地和GMP厂房；不同生产批次及同一生产批次的转瓶之间存在较大差异，容易造成批内及批间的抗原质量差异，进而影响病毒抗原质量的稳定性；转瓶清洗需要大量水，并且产生的含毒废水需要专门处理，容易对环境造成污染，如处理不当会造成生物安全和公共卫生问题。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种犬细小病毒增殖方法，以解决现有技术中存在的培养效率较低的技术问题。
本发明解决的另一技术问题是现有技术的犬细小病毒增殖方法质量不稳定。
本发明解决的再一技术问题是现有技术的犬细小病毒增殖方法产量较低。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种犬细小病毒增殖方法，该方法以F81细胞作为宿主细胞增殖犬细小病毒，同时以激流式生物反应器作为细胞培养装置。
优选的，该方法是先以激流式生物反应器培养F81细胞，而后再向细胞培养液中接种犬细小病毒，增殖细小病毒。
优选的，所述培养F81细胞，是在激流式生物反应器中采用微载体悬浮培养的方式培养F81细胞。
优选的，该方法包括以下步骤：
1)向激流式生物反应器中加入细胞培养液，以(0.1～1)×106个细胞/mL培养液的比例接种F81细胞培养，所述反应器中具有微载体；
2)当细胞密度达到(1～10)×106个细胞/mL培养液时以0.01～0.03MOI的接种量向培养液中接入犬细小病毒，继续培养细胞；
3)取培养液固液分离，收集上清即得到犬细小病毒液。
优选的，步骤1)中细胞培养液的加入量为激流式生物反应器最大装液量的1/2～3/4。
优选的，步骤1)中用于接种的F81细胞，是经EDTA-胰酶细胞分散液消化得到F81细胞悬液。
优选的，步骤2)中当细胞密度达到(1～10)×106个细胞/mL培养液时，继续培养细胞4～6h，而后以0.01～0.03MOI的接种量向培养液中接入犬细小病毒，再继续培养细胞。
优选的，步骤3)中当微载体上细胞全部脱落后，取培养液固液分离，收集上清即得到犬细小病毒液。
优选的，所述细胞培养液包括以下成分：85～90％(w/w)的DMEM液，青霉素钠80～120单位/ml，链霉素80～120单位/ml，余量为牛血清；所述培养基pH为7～7.8。
优选的，步骤1)中对细胞的培养或步骤2)中接种犬细小病毒后对细胞的培养，满足以下培养条件：培养温度35～39℃，培养液pH7～7.8，培养液溶氧45～55％，搅拌速度50～70rpm。
在以上技术方案中，生产用F81细胞以及生产用犬细小病毒种毒是由一级种子经活化、传代所得到的；用于培养和接种病毒的细胞需要利用EDTA-胰酶细胞分散液消化，所述EDTA-胰酶细胞分散液的配方可以是：含质量体积分数0.25％的规格1:250胰酶、0.02％EDTA的PBS液；其中规格1:250胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶；所述微载体可以选自商品型号为Cytodex的系列微载体，例如可以是型号为Cytodex1、Cytodex2、Cytodex3的微载体，微载体在使用前，需清洗、灭菌，具体步骤为：1)称量Cytodex微载体500g、使用20LPBS液浸泡过夜；2)用10LPBS液清洗3遍；3)加入10LPBS液浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟；微载体加入反应器中，用DMEM清洗微载体。
本发明方法创新性的利用F81细胞作为犬细小病毒的宿主细胞，尤其有利于病毒的增殖；采用激流式生物反应器较传统的转瓶方式工艺更易于控制，产品质量更加稳定；采用微载体的培养方式可以充分利用培养液，保持了贴壁细胞的生长特性，同时实现了高密度培养的作用。与此同时，本发明针对F81细胞、犬细小病毒自身特性以及生物反应器的培养环境匹配了特定的培养条件，从培养液成分、接种量、条件参数等方面进行了优化设计，使得犬细小病毒增殖效率得到显著提升。本发明以巧妙的技术构思实现了突出的技术效果，且成本较低、易于实现，具备突出的推广前景。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
实施例1
1、生产用细胞的传代与培养
取生长良好的F81细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液(EDTA-胰酶细胞分散液为含质量体积分数0.25％的规格1:250胰酶、0.02％EDTA的PBS液；其中规格1:250胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶)消化传代，以含质量分数90％DMEM液、10％牛血清、青霉素钠和链霉素各100单位/ml，pH调整为7.4的细胞生长液继续培养，培养温度为37℃，形成良好单层F81细胞，用于继续传代或传代后接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养。
2、生产用种毒的繁殖
在F81细胞培养2天形成单层后，倒掉细胞生长液，经EDTA-胰酶细胞分散液消化，用步骤1中生长液将分散液混匀，以1:2比例分装后培养4～6小时，接种犬细小病毒，犬细小病毒的接种量与细胞生长液的体积比为1:50，将细胞液与病毒液混匀充分浸没细胞，置于37℃、体积百分含量为5％的二氧化碳培养箱中培养，逐日观察，当80％～85％细胞出现病变时，收获病毒置于-20℃冰箱中，反复冻融细胞三次，使病毒从细胞中充分释放出来，然后分装液体，置-70℃或液氮保存备用，此病毒液作为生产用种毒；
3、F81细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养
向无菌检验合格的、含有微载体的生物反应器中加入总培养体积的2/3体积的细胞生长液，取步骤1中已形成良好单层F81细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按5×105个细胞/ml～5×106个细胞/ml的细胞密度接种于生物反应器中，生物反应器设定培养温度37℃、PH7.4、溶氧量50％、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，其中生物反应器容积为75L；微载体为Cytodex系列微载体，Cytodex系列微载体包括Cytodex1、Cytodex2、Cytodex3。微载体在使用前，需清洗、灭菌，具体步骤为：1)称量Cytodex微载体500g、使用20LPBS液浸泡过夜；2)用10LPBS液清洗3遍；3)加入10LPBS液浸泡微载体，121℃蒸汽灭菌三十分钟；微载体加入反应器中，用DMEM清洗微载体。
4、抗原病毒液的繁殖
培养后第三日观察微载体上细胞基本长满，经EDTA-胰酶细胞分散液消化，用步骤1中生长液将分散液混匀，且细胞计数结果达到5×106个细胞/ml～5×107个细胞/ml时继续培养4～6小时，待细胞已经吸附到微载体上进行接毒操作，所接入种毒为步骤2中的生产用种毒，病毒培养液配方为：重量分数为90％DMEM液、10％牛血清，青霉素钠链霉素各100单位/ml，pH为7.4；接种量为0.02MOI；生物反应器设定参数为培养温度37℃、pH7.4、溶氧50％、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况。
5、病毒液的收获
待微载体上细胞基本全部脱落，且DO值呈明显上升趋势，将反应器内液体连同微载体一起收获，置-20℃反复冻融两次，然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，即制得病毒液。
实施例2
一种犬细小病毒增殖方法，该方法以F81细胞作为宿主细胞增殖犬细小病毒，同时以激流式生物反应器作为细胞培养装置。
具体是先以激流式生物反应器培养F81细胞，而后再向细胞培养液中接种犬细小病毒，增殖细小病毒。
所述培养F81细胞，是在激流式生物反应器中采用微载体悬浮培养的方式培养F81细胞。
该方法具体包括以下步骤：
1)向激流式生物反应器中加入细胞培养液，以0.1×106个细胞/mL培养液的比例接种F81细胞培养，所述反应器中具有微载体；
2)当细胞密度达到1×106个细胞/mL培养液时，继续培养细胞4h，而后以0.01MOI的接种量向培养液中接入犬细小病毒，再继续培养细胞；
3)当微载体上细胞全部脱落后，取培养液固液分离，收集上清即得到犬细小病毒液。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)中细胞培养液的加入量为激流式生物反应器最大装液量的1/2。
步骤1)中用于接种的F81细胞，是经EDTA-胰酶细胞分散液消化得到F81细胞悬液。
所述细胞培养液包括以下成分：85％(w/w)的DMEM液，青霉素钠80单位/ml，链霉素80单位/ml，余量为牛血清；所述培养基pH为7。
步骤1)中对细胞的培养或步骤2)中接种犬细小病毒后对细胞的培养，满足以下培养条件：培养温度35℃，培养液pH7，培养液溶氧45％，搅拌速度50rpm。
实施例3
一种犬细小病毒增殖方法，该方法以F81细胞作为宿主细胞增殖犬细小病毒，同时以激流式生物反应器作为细胞培养装置。
具体是先以激流式生物反应器培养F81细胞，而后再向细胞培养液中接种犬细小病毒，增殖细小病毒。
所述培养F81细胞，是在激流式生物反应器中采用微载体悬浮培养的方式培养F81细胞。
该方法具体包括以下步骤：
1)向激流式生物反应器中加入细胞培养液，以1×106个细胞/mL培养液的比例接种F81细胞培养，所述反应器中具有微载体；
2)当细胞密度达到10×106个细胞/mL培养液时，继续培养细胞6h，而后以0.03MOI的接种量向培养液中接入犬细小病毒，再继续培养细胞；
3)当微载体上细胞全部脱落后，取培养液固液分离，收集上清即得到犬细小病毒液。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)中细胞培养液的加入量为激流式生物反应器最大装液量的3/4。
步骤1)中用于接种的F81细胞，是经EDTA-胰酶细胞分散液消化得到F81细胞悬液。
所述细胞培养液包括以下成分：90％(w/w)的DMEM液，青霉素钠120单位/ml，链霉素120单位/ml，余量为牛血清；所述培养基pH为7.8。
步骤1)中对细胞的培养或步骤2)中接种犬细小病毒后对细胞的培养，满足以下培养条件：培养温度39℃，培养液pH7.8，培养液溶氧55％，搅拌速度70rpm。
实施例4
一种犬细小病毒增殖方法，该方法以F81细胞作为宿主细胞增殖犬细小病毒，同时以激流式生物反应器作为细胞培养装置。
具体是先以激流式生物反应器培养F81细胞，而后再向细胞培养液中接种犬细小病毒，增殖细小病毒。
所述培养F81细胞，是在激流式生物反应器中采用微载体悬浮培养的方式培养F81细胞。
该方法包括以下步骤：
1)向激流式生物反应器中加入细胞培养液，以0.5×106个细胞/mL培养液的比例接种F81细胞培养，所述反应器中具有微载体；
2)当细胞密度达到7×106个细胞/mL培养液时以0.015MOI的接种量向培养液中接入犬细小病毒，继续培养细胞；
3)取培养液固液分离，收集上清即得到犬细小病毒液。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤1)中细胞培养液的加入量为激流式生物反应器最大装液量的2/3。
所述细胞培养液包括以下成分：88％(w/w)的DMEM液，青霉素钠100单位/ml，链霉素100单位/ml，余量为牛血清；所述培养基pH为7.2。
步骤1)中对细胞的培养或步骤2)中接种犬细小病毒后对细胞的培养，满足以下培养条件：培养温度36℃，培养液pH7.6，培养液溶氧48％，搅拌速度55rpm。
实施例5
一种犬细小病毒增殖方法，该方法以F81细胞作为宿主细胞增殖犬细小病毒，同时以激流式生物反应器作为细胞培养装置。
具体是先以激流式生物反应器培养F81细胞，而后再向细胞培养液中接种犬细小病毒，增殖细小病毒。
所述培养F81细胞，是在激流式生物反应器中采用微载体悬浮培养的方式培养F81细胞。
实施例6
一种犬细小病毒增殖方法，该方法以F81细胞作为宿主细胞增殖犬细小病毒，同时以激流式生物反应器作为细胞培养装置。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种犬细小病毒增殖方法，其特征在于该方法以F81细胞作为宿主细胞增殖犬细小病毒，同时以激流式生物反应器作为细胞培养装置。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法是先以激流式生物反应器培养F81细胞，而后再向细胞培养液中接种犬细小病毒，增殖细小病毒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述培养F81细胞，是在激流式生物反应器中采用微载体悬浮培养的方式培养F81细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)向激流式生物反应器中加入细胞培养液，以(0.1～1)×106个细胞/mL培养液的比例接种F81细胞培养，所述反应器中具有微载体；
2)当细胞密度达到(1～10)×106个细胞/mL培养液时以0.01～0.03MOI的接种量向培养液中接入犬细小病毒，继续培养细胞；
3)取培养液固液分离，收集上清即得到犬细小病毒液。
5.根据权利要4所述的方法，其特征在于步骤1)中细胞培养液的加入量为激流式生物反应器最大装液量的1/2～3/4。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤1)中用于接种的F81细胞，是经EDTA-胰酶细胞分散液消化得到F81细胞悬液。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤2)中当细胞密度达到(1～10)×106个细胞/mL培养液时，继续培养细胞4～6h，而后以0.01～0.03MOI的接种量向培养液中接入犬细小病毒，再继续培养细胞。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤3)中当微载体上细胞全部脱落后，取培养液固液分离，收集上清即得到犬细小病毒液。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述细胞培养液包括以下成分：85～90％(w/w)的DMEM液，青霉素钠80～120单位/ml，链霉素80～120单位/ml，余量为牛血清；所述培养基pH为7～7.8。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤1)中对细胞的培养或步骤2)中接种犬细小病毒后对细胞的培养，满足以下培养条件：培养温度35～39℃，培养液pH7～7.8，培养液溶氧45～55％，搅拌速度50～70rpm。
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