CN115806942B

CN115806942B - 猫杯状病毒培养方法及病毒液

Info

Publication number: CN115806942B
Application number: CN202310065544.5A
Authority: CN
Inventors: 朱旭; 郝鹏; 张燕红; 王艳杰; 张海宝; 韩冬; 李晓燕; 孟书丽; 赵嘉楠; 赵飞飞
Original assignee: Jinyubaoling Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Jinyubaoling Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2023-02-06
Filing date: 2023-02-06
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2043-02-06
Also published as: CN115806942A

Abstract

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种猫杯状病毒培养方法及病毒液。所述猫杯状病毒培养方法使用微载体培养宿主细胞，接毒，继续培养，得到病毒液；所述宿主细胞悬液的细胞密度为1.8×10⁶cells/mL‑2.2×10⁶cells/mL；所述微载体在所述宿主细胞悬液中的加入量为2.5‑3.5g/L；所述微载体以交联葡聚糖为基质，密度为1.01‑1.05g/ml，颗粒大小为185‑195μm，表面积≥4200cm²。本发明所述方法制备得到的猫杯状病毒液滴度≥10^10.5TCID₅₀。

Description

猫杯状病毒培养方法及病毒液

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种猫杯状病毒培养方法及病毒液。

背景技术

猫杯状病毒（Feline calicivirus, FCV）是一种导致猫传染性鼻结膜炎的病毒，会导致猫的轻度至重度呼吸道感染和口腔疾病。猫感染FCV后，会出现精神沉郁，打喷嚏，口、鼻、眼分泌物增多和角膜炎等症状。FCV具有高度传染性，发生率较高。由FCV引起的幼猫死亡率高达30%。目前认为，FCV呈世界性分布，并可能感染所有猫科动物，我国猫群中亦存在FCV抗体。

针对FCV病毒，免疫疫苗是最好的选择。国外预防FCV主要使用灭活疫苗和弱毒疫苗。在疫苗制备过程中，抗原培养是最重要的一环。找到一种安全、有效、产量高的培养FCV的方法，对FCV疫苗的研发和制备具有关键作用。如何实现猫杯状病毒的大规模扩增，有效降低生产成本，进一步提高产品质量是目前本领域的研究难点。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的问题，本发明首先提供了一种猫杯状病毒培养方法，使用微载体培养宿主细胞，接毒，继续培养，得到病毒液。

在本发明中，所述宿主细胞包括F81细胞和/或CRFK细胞，优选包括F81细胞。

本发明中，使用微载体培养宿主细胞的方法包括：在宿主细胞悬液中加入微载体；所述宿主细胞悬液的细胞密度为1.8×10⁶cells/mL-2.2×10⁶cells/mL；优选为2×10⁶cells/mL；所述微载体在所述宿主细胞悬液中的加入量为2.5-3.5g/L，优选为3g/L；所述微载体以交联葡聚糖为基质，密度为1.01-1.05g/ml；颗粒大小为185-195μm；表面积≥4200cm²；优选地，所述微载体型号选择Cytodex-1型，Cytodex-1型微载体是以交联葡聚糖为基质，表面带正电荷；微载体密度为1.03g/mL；颗粒大小190μm；表面积4400cm²。

本发明研究了不同规格微载体的培养效果，发现以交联葡聚糖为基质，密度为1.01-1.05g/ml；颗粒大小为185-195μm；表面积≥4200cm²的微载体更适于猫杯状病毒的培养。在本发明所述宿主细胞密度和微载体添加浓度条件下，利用所述微载体培养宿主细胞的效果良好，得到的猫杯状病毒滴度更高，可达到10.5 LogTCID₅₀/mL。其他规格的微载体和猫杯状病毒培养的适配度相对较差，宿主细胞脱落现象严重，且宿主细胞培养活性不高，培养后细胞密度低，得到的猫杯状病毒滴度显著降低。

在本发明更具体的优选实施方式中，所述微载体型号选择Cytodex-1型。和其他型号的微载体相比，Cytodex-1型微载体的相对表面积更大，每毫升培养液可得到数百万细胞。较贴壁培养可以更快速的放大产量。且微载体培养细胞在培养液上可以延续贴壁培养阶段的基础培养基，相较于全悬浮培养，省去了筛选优化培养基的工序，使成本更少，且有助于加快研发速度。

在本发明中，所述接毒的时间优选为使用微载体培养宿主细胞的42-54h，更优选为使用微载体培养宿主细胞的47-49h，更优选为使用微载体培养宿主细胞的48h。经验证，本发明提供的猫杯状病毒培养方法，在微载体培养宿主细胞48h时进行接毒，收获的病毒液毒价高达10.5 LogTCID₅₀/mL。

在本发明中，所述接毒时，宿主细胞的密度优选为2.8×10⁶cells/mL-3.2×10⁶cells/mL，更优选为3×10⁶cells/mL。

在本发明中，所述接毒的MOI值优选为0.08-0.15，更优选为0.1。按本发明所述MOI值接入细胞，能实现较快的病毒侵染速率，同时有助于获得较高的毒价。

在本发明中，所述接毒后，继续培养的时间优选为30-36h，更优选为30h。经验证，本发明提供的猫杯状病毒培养方法，在接毒后30h即可收获病毒液，病毒液培养时间较短，且收获的病毒液毒价高达11.0 LogTCID₅₀/mL。

在本发明中，继续培养后的宿主细胞脱落比例优选为45%-55%，更优选为50%。

在本发明中，继续培养后的宿主细胞活力优选≤50%。经验证，本发明提供的猫杯状病毒培养方法，在宿主细胞活力≤50%时收获病毒液，毒价可高达11.5 LogTCID₅₀/mL。

本发明优选使用生物反应器进行培养。在本发明中，所述生物反应器的溶氧量优选为35%-45%，更优选为40%；转速优选为20-80rpm，更优选为50rpm；温度优选为30-41℃，更优选为36-39℃，更优选为37℃。

在本发明中，所述微载体可以是首次使用的微载体，也可以是重复使用1-2次的微载体。经验证，本发明提供的猫杯状病毒培养方法能重复使用微载体，且重复使用1-2次的微载体空球率低于10%。重复使用微载体能有效降低猫杯状病毒的培养成本。

本发明还提供了一种病毒液，由所述猫杯状病毒培养方法制备得到。

有益效果

本发明提供了一种猫杯状病毒培养方法，利用微载体培养猫杯状病毒，能显著提高猫杯状病毒滴度。经实验验证，本发明所述方法制备得到的猫杯状病毒滴度≥10^10.5TCID₅₀。

本发明提供的猫杯状病毒培养方法具有生产工艺稳定，重复性好的优点，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。本发明中，所用原料、仪器等均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。本发明中所用的原料均可在国内产品市场方便买到。

实施例1 F81细胞培养

1、材料

①F81细胞（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存；冻存批号：F81- AC21001D-F16）。

②胰蛋白酶。

③DMEM培养基，购自Gibco公司。

④新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。

⑤细胞培养瓶(型号为T25、T75、T225)，购自赛默飞世尔科技公司。

⑥Cytodex-1型微载体，购自GE公司。

⑦细胞摇瓶(型号为250mL)，购自赛默飞世尔科技公司。

2、种细胞传代

将一支F81细胞从液氮中取出，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液，置于T25培养瓶中培养；培养72h，待细胞铺满细胞培养瓶底面时，使用胰蛋白酶进行消化，按1:3比例传代，置于T75培养瓶中培养；依照上述步骤逐级扩大，直至F81细胞在T225培养瓶中稳定培养。

3、微载体培养F81细胞

选取在T225细胞培养瓶中长满单层的细胞2瓶，使用胰蛋白酶进行消化，将2瓶消化后的细胞悬液混合，使用细胞营养液（DMEM+10%NBS）定容至100mL后进行细胞计数（密度2×10⁶cells/mL；且活力>95%），之后将100mL细胞悬液置于250mL摇瓶中。摇瓶中加入0.3g预培养的Cytodex-1微载体，置于37℃，5%二氧化碳摇床中培养。每隔24h取样计数，并将样品在倒置显微镜下观察。

4、结果

参见表1。如表1所示：细胞在Cytodex-1微载体中培养的生长速度良好。

表1：Cytodex-1型微载体对F81细胞的培养情况

实施例2 接毒培养

1、材料

②胰蛋白酶。

③DMEM培养基，购自Gibco公司。

④新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。

⑤Cytodex-1型微载体。

⑥FCV种毒（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存。批号：FCV-V22012-F12），毒价10^9.5TCID₅₀/mL。

⑦细胞摇瓶(型号为250mL)。

2、接毒

①配制F81细胞悬液200mL，密度：2×10⁶cells/mL；活力>95%。

②F81细胞悬液混匀后置于2个250mL摇瓶（编号1#，2#）中，每个摇瓶100mL。

③Cytodex-1型微载体分别加入2个摇瓶中，每个摇瓶添加量为0.3g。

④组别设置：

1#摇瓶在加入微载体后48h接毒（接毒0.1mL）;

2#摇瓶作为细胞对照，不接毒。

3、收获

接毒后每隔12h取样观察细胞状态，待细胞从微球上脱落50%时收获。

4、结果

参见表2。如表2所示：在微载体培养F81细胞48h后接毒，收获时间短且接毒毒价达到10.5 LogTCID₅₀/mL。

表2：加入微载体后培养48h后接毒的收获情况

实施例3 接毒培养

1、材料

②胰蛋白酶。

③DMEM培养基，购自Gibco公司。

④新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。

⑤Cytodex-1型微载体。

⑦细胞摇瓶(型号为250mL)。

2、接毒

①配制F81细胞悬液200mL，密度：2×10⁶cells/mL；活力>95%。

④组别设置：

1#摇瓶在加入微载体48h接毒（接毒MOI值0.1）;

2#摇瓶作为细胞对照，不接毒。

3、收获

4、结果

参见表3。如表3所示：接毒MOI值为0.1时，接毒毒价可达到11.0 LogTCID₅₀/mL。

表3：接毒MOI值为0.1时，接毒的收获情况

实施例4 接毒培养

1、材料

②胰蛋白酶。

③DMEM培养基，购自Gibco公司。

④新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。

⑤Cytodex-1型微载体。

⑦细胞摇瓶(型号为250mL)。

2、接毒

①配制F81细胞悬液200mL，密度：2×10⁶cells/mL；活力>95%。编号为1#、2#。

②F81细胞悬液混匀后置于2个250mL摇瓶中，每个摇瓶100mL。

③Cytodex-1型微载体分别加入2个摇瓶中，每个摇瓶0.3g。

④组别设置：

1#摇瓶在加入微载体48h接毒（接毒MOI值0.1）。

2#摇瓶作为细胞对照，不接毒。

3、收获

接毒后每隔6h从1#摇瓶中取样，样品计数、显微镜下观察、留样放置于-70℃冻存待取样结束后测毒。

4、结果

不同收获时间对培养情况的影响结果参见表4。如表4所示：接毒后30h，细胞从微球上脱落50%时，毒价最高。

表4：接毒培养后，不同收获时间的培养情况

实施例5 微载体培养FCV反应器扩大培养

1、材料

②胰蛋白酶。

③DMEM培养基，购自Gibco公司。

④新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。

⑤Cytodex-1型微载体。

⑦3L生物反应器。

2、接毒

①配制F81细胞悬液1L，密度：2×10⁶cells/mL；活力>95%。

②F81细胞悬液混匀后置于生物反应器中。

③生物反应器加入Cytodex-1型微载体3g。

④生物反应器培养微载体F81细胞48h后（密度达到3×10⁶cells/mL）接毒（接毒MOI值0.1）。

3、生物反应器参数设置

①溶氧：40%。

②转速：50rpm。

③温度：37℃。

4、结果

接毒后30h，细胞从微球上脱落50%时收获。重复三批试验，结果参见表5。由表5可知：接毒后30h，细胞从微载体上脱落比例为50%时收获，毒价高于11.0 LogTCID₅₀/mL。细胞活力为50%以下时收获，毒价可达到11.5 LogTCID₅₀/mL。

表5：反应器培养结果

实施例6 微载体回收与重复使用验证

将实施例5中使用反应器验证FCV培养条件的微载体用强酸溶液洗涤，洗涤后的微载体重复培养F81细胞，与新微载体培养F81细胞进行对比，比较回收效果。

结果参见表6。如表6所示：微载体重复使用两次与新微载体无明显差别。

表6：微载体回收使用情况

对比例1

本对比例提供了另一种F81细胞培养方法；与实施例1相比，区别点仅在于：培养用微载体使用Cytodex-3型（以交联葡聚糖为基质，表面带正电荷；微载体密度为1.04g/mL；颗粒大小175μm；表面积2700cm²），购自Gibco公司。

对比例1使用Cytodex-3型微载体对F81细胞的培养情况参见表7。

表7：Cytodex-3型微载体对F81细胞的培养情况

对比例2

本对比例提供了另一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：摇瓶在加入微载体后直接接毒。

对比例3

本对比例提供了另一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：摇瓶在加入微载体后12h接毒。

对比例4

本对比例提供了另一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：摇瓶在加入微载体后24h接毒。

对比例2-4的接毒收获情况参见表8。

表8：对比例2-4的接毒后收获情况

对比例5

本对比例提供了另一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：摇瓶同样是在加入微载体48h接毒，但接毒的MOI值为0.05。

对比例6

本对比例提供了另一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：摇瓶同样是在加入微载体48h接毒，但接毒的MOI值为0.3。

对比例7

本对比例提供了另一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：摇瓶同样是在加入微载体48h接毒，但接毒的MOI值为0.5。

对比例5-7的接毒收获情况参见表9。

表9：对比例5-7的接毒后收获情况

对比例8

本对比例提供了一种贴壁培养FCV方法，具体如下：

1、材料

②胰蛋白酶。

③DMEM培养基，购自Gibco公司。

④新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。

⑤FCV种毒（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存。批号：FCV-V22012-F12），毒价10^9.5TCID₅₀/mL。

⑥细胞培养瓶(型号为T225)，购自赛默飞世尔科技公司。

2、接毒

使用T225细胞培养瓶培养FCV：配制F81细胞悬液100mL，密度：2×10⁶cells/mL；活力>95%。F81细胞悬液混匀后置于T225细胞培养瓶中。T225细胞培养瓶培养F81细胞48h后接毒（接毒MOI值0.1）。培养收获后，测定TCID₅₀。

3、结果

同实施例5微载体培养情况进行比对，结果参见表10。如表10所示：本发明实施例5利用微载体培养FCV抗原，其毒价较对比例8的贴壁培养高出2个滴度。

表10：微载体培养与贴壁培养毒价对比情况

对比例9

本对比例提供了一种使用Cytodex-1型微载体培养CRFK细胞的方法；与实施例1相比，区别点仅在于：使用CRFK细胞作为宿主细胞。

1、材料

①CRFK细胞（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存；冻存批号：CRFK- AC21003D-F23）。

②胰蛋白酶。

③DMEM培养基，购自Gibco公司。

④新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。

⑥Cytodex-1型微载体，购自GE公司。

⑦细胞摇瓶(型号为250mL)，购自赛默飞世尔科技公司。

2、种细胞传代

将一支CRFK细胞从液氮中取出，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液，置于T25培养瓶中培养；培养72h，待细胞铺满细胞培养瓶底面时，使用胰蛋白酶进行消化，按1:3比例传代，置于T75培养瓶中培养；依照上述步骤逐级扩大，直至F81细胞在T225培养瓶中稳定培养。

3、微载体培养CRFK细胞

4、结果

参见表11。如表11所示：CRFK细胞在Cytodex-1微载体中培养的细胞脱落比例较高，且生长速度显著低于实施例1中F81细胞的生长速度。CRFK细胞培养48h后的细胞密度仅为3.3×10⁶cells/mL，不适于后续的接毒培养。

表11：Cytodex-1型微载体对CRFK细胞的培养情况

对比例10

本对比例提供了一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：使用CRFK细胞作为宿主细胞。

1、材料

②胰蛋白酶。

③DMEM培养基，购自Gibco公司。

④新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。

⑤Cytodex-1型微载体。

⑦细胞摇瓶(型号为250mL)。

2、接毒

①配制CRFK细胞悬液200mL，密度：2×10⁶cells/mL；活力>95%。

②CRFK细胞悬液混匀后置于2个250mL摇瓶（编号1#，2#）中，每个摇瓶100mL。

④组别设置：

1#摇瓶在加入微载体后48h接毒（接毒0.1mL）;

2#摇瓶作为细胞对照，不接毒。

3、收获

接毒后每隔12h取样观察细胞状态并将样品测TCID₅₀，待细胞从微球上脱落50%时收获。

4、结果

参见表12。如表12所示：在微载体培养CRFK细胞48h后接毒，接毒的毒价无提升。

表12：加入微载体后培养48h后接毒的收获情况

对比例11

本对比例提供了一种使用微载体培养FCV反应器扩大培养的方法；与实施例5相比，区别点仅在于在反应器扩大培养FCV接毒前通过沉降更换细胞培养液（DMEM+新生牛血清），使用细胞维持液（无血清DMEM）培养FCV。

1、材料

②胰蛋白酶。

③DMEM培养基，购自Gibco公司。

④新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。

⑤Cytodex-1型微载体。

⑦3L生物反应器。

2、接毒

①配制F81细胞悬液1L，密度：2×10⁶cells/mL；活力>95%。

②F81细胞悬液混匀后置于生物反应器中。

③生物反应器加入Cytodex-1型微载体3g。

④生物反应器培养微载体F81细胞48h后（密度达到3×10⁶cells/mL）后，停止反应器搅拌，并将反应器温度调整为8℃，待，微载体全部沉降完成后，将细胞营养液（DMEM+新生牛血清）置换为细胞维持液（无血清DMEM）。置换完成后，将生物反应器参数调整为溶氧：40%，转速：50rpm，温度：37℃。待细胞稳定重悬后接毒（接毒MOI值0.1）。

3、生物反应器参数设置

①溶氧：40%。

②转速：50rpm。

③温度：37℃。

4、结果

接毒后，待细胞从微球上脱落50%时收获（约30h）。重复三批试验，结果参见表13。由表13可知：接毒后，待细胞从微载体上脱落比例为50%时收获，毒价大于等于9.5LogTCID₅₀/mL，其中，当在细胞活力为50%以下收获时，毒价可达到10.0 LogTCID₅₀/mL。

同实施例5比对可以看出：换液培养FCV毒价低于不换液培养毒价。另外，换液培养还延长了培养时间，且在培养过程中换液易造成细胞的污染。

表13：反应器培养结果

综上，本发明通过微载体悬浮方式培养FCV抗原。微载体培养在提升抗原培养量的情况下提高了毒价。另外，本发明提供的利用微载体培养猫杯状病毒的方法，显著降低了培养成本。和贴壁培养方式比：本发明利用微载体培养，更容易放大。例如，培养3L抗原，用贴壁方式需要耗费近30个T225细胞培养瓶，而微载体只需要培养一次，耗费9g微载体即可实现（且微载体可以重复利用，T225细胞培养瓶不可重复利用）。和悬浮培养方式比：本发明利用微载体培养，只需要用最基础的培养基，而悬浮培养需要使用特定的培养基。悬浮培养中，筛选培养基是非常庞大的工程。本发明使用微载体培养，极大地减少了因筛选培养基导致的过高成本。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.猫杯状病毒培养方法，其特征在于，使用微载体培养宿主细胞，接毒，继续培养，得到病毒液；所述使用微载体培养宿主细胞的方法包括：在宿主细胞悬液中加入微载体；所述宿主细胞悬液的细胞密度为1.8×10⁶cells/mL-2.2×10⁶cells/mL；所述微载体在所述宿主细胞悬液中的加入量为2.5-3.5g/L；所述微载体以交联葡聚糖为基质，密度为1.01-1.05g/ml，颗粒大小为185-195μm，表面积≥4200cm²；

所述宿主细胞为F81细胞；

所述培养使用生物反应器进行；所述生物反应器的参数设置包括：溶氧量40%，转速50rpm，温度37℃；培养体系中添加的生长因子有且仅有新生牛血清；

所述接毒的时间为使用微载体培养宿主细胞的48h；所述接毒的MOI值为0.1；接毒时宿主细胞的密度为2.8×10⁶cells/mL-3.2×10⁶cells/mL；

所述接毒后，所述继续培养的时间为30h；当所述继续培养后的宿主细胞在微载体上的脱落比例为50%，且所述继续培养后的宿主细胞活力≤50%时，收获病毒液。

2.根据权利要求1所述猫杯状病毒培养方法，其特征在于，所述微载体为首次使用的微载体，或者重复使用1-2次的微载体。