CN1060408A - 改进的疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

由长链烷基化合物作为免疫佐剂与细菌多糖蛋 白结合物组合构成的改进的疫苗组合物，本发明的组 合物用于活化免疫系统以赋予宿主以免疫力，以预防 的方式对抗免疫原。

Description

本发明涉及具有改进的免疫原性的疫苗组合物。更具体地说，本发明的组合物包括与一蛋白质载体共价连接的细菌多糖和一长链烷基化合物相结合。该载体和烷基化合物的功能是佐剂。
皆知，疫苗在疾病的预防上是很重要的。疫苗的作用是使宿主动物暴露于为活化免疫系统所设计的外来物质，以赋于宿主对该物质的免疫力而不致使宿主有罹病的危险。现今大约有20种疫苗已开发成商品。大多数这些疫苗是通过对引起机体或机体一部分致病的减毒作用，或通过对机体的特异性无毒部分的分离作用而制成的。后者的一个熟知实例是把脑膜炎和肺炎球菌的莢膜多糖分离出，作为细菌性脑膜炎和肺炎疫苗的基础。然而多糖疫苗是较差的免疫原，它对发育不好或受损伤的免疫系统的个体产生不了适当量的保护性抗体。免疫系统不完备的人群包括儿童，成人或有自体免疫疾病的人。而且，免疫应答的出现是不依赖于T细胞或是非记忆性的，这意味着个体接受了增强剂量的注射后，随着血清转化现象，不能呈现增强的免疫应答。T细胞的依赖性对于免疫球蛋白抗体和记忆细胞的诱导是必要的。由于血清转化，在反覆注射疫苗时，IgM和IgG抗体都会生成。而且当应答是T细胞依赖性时，抗体应答的幅度随着疫苗注射的次数而增加。多糖疫苗的免疫学由Jennings等在“多糖”（编者：G.O.Aspinall）卷1，291-329（1982）作了综述。
多糖结合于或共价键合于适当的蛋白质载体上，会由于发生了依赖于T细胞或记忆应答，而改善了免疫功能。在1987年12月美国批准了第一个人用的结合疫苗。它是由流感嗜血菌b的莢膜多糖共价结合于白喉类毒素的载体蛋白所构成。批准用于18个月的儿童，因为发售的多糖疫苗对此年龄段效果差。最近美国又批准另一个流感嗜血菌b的结合疫苗，是用不同的结合化学方法制成的。
多糖和多糖-蛋白结合物是比较纯净的疫苗，因而与经典的全菌或病毒疫苗相比，比较安全。虽然整体细菌或病毒经化学剂、加热或遗传减毒处理已被生化减毒，但常常仍混杂有毒的副产物。然而，由于多糖和多糖-蛋白结合物的纯度增加，这常常意味着除去了天然的免疫刺激剂，因而这些新疫苗常常不是最理想的免疫原。天然的免疫刺激剂包括有细菌成分，例如脂质多糖，脂蛋白和胞壁酰二肽;这些都有毒性。此外，蛋白载体也可有某种程度的毒性，因此尽可能使用最小的量。例如白喉类毒素及相关的分子CRM197，通常用作人用结合性疫苗的载体分子。然而成人对这些载体分子会出现局部或全身性过敏。为了抵销这些作用，将佐剂与疫苗结合以增强抗体的形成，佐剂也可能对应答疫苗所产生的抗体的类型发生影响。例如，在用多糖-蛋白结合性疫苗进行免疫时，虽然会发生血清转化并随后产生了IgG抗体，但在小鼠的初步免疫应答是IgG1。增加IgG2a抗体的产生会是有益的，因为后者对于补体的活化作用而言，是最有效的小鼠抗体。补体路径对许多细菌感染提供了一个重要的防御机制。
至于商用的佐剂，现今只用铝盐和钙盐。但铝和钙盐不是强力的佐剂。钙盐只有有限的应用，而铝盐对于其它疫苗有较广泛的应用，但对于多糖-蛋白结合型疫苗则几乎没有成功的报导。事实上，已报导氢氧化铝可抑制对流感嗜血菌b多糖-破伤风类毒素结合型疫苗的抗体应答;J.B.Robbins等，J.Pediatrics，112，695-702（1988）。J.B.Robbins等还观察到氢氧化铝对伤寒沙门氏菌多糖-霍乱毒素结合型疫苗的抗体应答有同样的抑制作用;J.Experimental  Medicine，166，1510-1524（1987）。而且铝盐还会在注射部位引起暂时性的或慢性的局部肉芽肿;L.H.Collier在Lancet，1354-1367（1987）谈到，对破伤风类毒素疫苗反应的发生率和严重程度取决于铝盐佐剂的是否存在。铝佐剂的制备并非总是可重复的。而且铝可以单独刺激IgE抗体的产生，后者与调控直接过敏反应有关。这已被T.Matuhasi等在J.Infectious  Disease，146，192（1982）中作了叙述。
近年来用有机化合物作为佐剂已为人们注意。只有为数不多的有机化合物其佐剂的功能与市售的铝盐的作用相似;即随着缓慢释放媒介物或抗原（疫苗）库，从而抗原的释放在注射部位有一个比较长的时间。
这类有机化合物的实例是有机表面活性剂和乳化剂，例如普卢兰尼克和特窗尼克，它们是非离子型的聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物，BASF公司出品。这样一种辅佐剂的慢释放机理早已作为人用，因为它会减低过度刺激免疫系统的可能性。对免疫系统的过度刺激会导致自体免疫反应，如在用强力的免疫刺激剂例如弗洛因德佐剂时所发生的那样。因而该慢释放机理是优选的机理。
由于大多数有机佐剂表明是强力的免疫刺激剂，这样高活性的佐剂会引起毒性，因而不能人用。作为强力免疫刺激剂的已知的有机佐剂是弗洛因德完全佐剂和胞壁酰二肽。这两个化合物都只限用于动物试验，系因毒性的考虑。许多模拟铝盐的有机佐剂比铝盐的毒性更大。例如D.Gall在Lmmunology，11，369-386（1966）中叙述的长链烷基胺，报导是毒性化合物，一般对细胞模结构有破坏作用。
酪氨酸的十八烷醇酯已知是个佐剂。它有最低限度的免疫刺激性，但其功能是相当于铝佐剂的有机佐剂-慢释放的媒介物。即抗原会与酪氨酸十八烷醇酯发生复合，随着时间会从不溶解的佐剂上缓慢地释放或解吸附。抗原与佐剂之间的复合作用是通过各种弱的非共价键力发生的，例如疏水相互作用和氢键。
这个现象见于Ouerell的美国专利4428932和Moloney等的美国专利4258029。Overell揭示了酪氨酸十八烷醇酯与过敏原如大麦、草和花粉提取液复合后，它的功能是作为脱过敏治疗的佐剂。Moloney等也指出，酪氨酸十八烷醇酯与破伤风类毒素和用福尔马林灭活的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型脊髓灰质炎病毒形成复合后，其作用是疫苗的佐剂。这个现象又为A.Nixon-George等在J.Immunol-ogy，144，4798-4802（1990）中阐述，他们揭示酪氨酸十八烷醇酯和其它芳香族氨基酸的十八烷醇酯在与重组的肝炎B表面抗原复合后，它们的功能是肝炎B的候选疫苗的佐剂。
因此，需要发展无毒的细菌多糖蛋白结合型疫苗-佐剂组合物，这种组合物具有改良的免疫原性。
本发明重点是改良的疫苗组合物，其特征是，含无毒的细菌多糖-蛋白结合型疫苗和无毒的长链烷基佐剂。因此，根据本发明的一个方面，它提供了一种疫苗组合物，是由一个无毒的细菌多糖蛋白结合物和一个无毒的长链烷基化合物的佐剂所组成，该长链烷基化合物的有效含量可将多糖-蛋白结合物的免疫原性放大。
本发明的另一方面是提供了一种能引起包括人在内的温血动物的免疫应答的方法，其特征是给宿主动物以有效量的本发明的疫苗组合物。
本发明意外地发现，无毒的长链烷基化合物，特别是氨基酸或肽的酯类，可复合于多糖-蛋白结合型疫苗。由于这个复合作用，该长链烷基化合物的功能是缓慢释放的载体。即该长链烷基化合物在一较长的时间内将结合型疫苗释放到宿主动物体中。这与单用结合型疫苗相比，产生了增强的抗体应答。如前所述，辅佐性的这种机理与用铝盐和非结合型疫苗所观察到的机理是一样的。但也如前所述，铝盐对于细菌多糖-蛋白结合型疫苗而言，大部分都是无效的佐剂。因此不会预期本发明的长链烷基化合物借助同样的辅佐性机理，其作用是结合型疫苗的佐剂。甚至更令人惊奇的是无毒的长链烷基化合物的作用是改善该结合型疫苗的免疫原性。
本发明也发现作为佐剂的无毒性长链烷基化合物，特别是氨基酸或肽的长链烷基酯的存在，会影响对结合型疫苗应答时产生的抗体的同型。特异的是IgG2a抗体对IgG1抗体的比例较高是在于这两个抗体的同型水平会由于使用了本发明的长链烷基佐剂和结合型疫苗而增加，这与没有佐剂存在时所观察到的比值正相反。这种比值的增加是有益的作用，因为IgG2a抗体作为最有效的小鼠抗体是很重要的。该IgG2a对于补体和依赖于抗体的细胞毒机理的活化作用和保护机体免受肿瘤和病原体侵害都是重要的。
长链烷基化合物的佐剂效果，就增加和调节（即同型变化）抗体的应答而言，也是令人惊奇的，这是从载体蛋白的作用意义上讲的。即在结合型疫苗中的载体功能是增加和调节抗体的应答。
因此，长链烷基化合物与铝佐剂不同，它增强了载体的功能。
无毒的长链烷基化合物最好是有正电荷的氨基酸或肽的酯，尤其是氨基酸，二肽或三肽与含14～20碳原子的烷醇形成的酯。
用于本发明组合物中的细菌多糖蛋白结合物能够诱发宿主的免疫应答。正如在这里所使用的那样，“细菌”一词包括莢膜多糖，脂质多糖和其它莢膜下的（表面）多糖。特别是致病菌的莢膜多糖对制备有效的结合型疫苗，是现今最有用的。这类莢膜多糖的实例包括从流感嗜血菌，脑膜炎奈氏球菌，肺炎链球菌，无乳链球菌，伤寒沙门氏菌，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分离得到的脂质多糖提取自脑膜炎奈氏球菌，大肠杆菌，伤寒沙门氏菌和铜绿假单胞菌。其它莢膜下多糖是链球菌A、B和C族的普通多糖抗原（C-物质）和肺炎链球菌的普通多糖抗原（C-物质）。
后面的实例叙述了用结合物做的实验，结合物包括有化学结构显著不同的多糖，即脑膜炎球菌A族多糖（N-乙酰甘露糖胺6-磷酸酯的均聚物），脑膜炎球菌B族（（2→8）联结的N-丁酰神经氨酸的均聚物）和脑膜炎球菌C族（（2→9）联结的N-乙酰神经氨酸的均聚物），应理解到本发明并不止限于实施例中的脑膜炎球菌结合物，也适用于含有其它细菌多糖的结合物，如同上面限定和举例说明的那样。
本发明的结合物中所用的细菌多糖很容易用常规的分离技术制备。
与细菌多糖结合或共价联结的载体分子是蛋白质。动物用的优选的载体是牛血清白蛋白和钥孔
Figure 911089993_IMG2
血蓝素。适于人用的蛋白载体包括有破伤风类毒素，白喉类毒素，无细胞百日咳疫苗（LPF类毒素），交叉反应物质（CRM′s），它们的抗原性类似于细菌毒素，但借助突变作用变为无毒性，最好的是根据Pappenheimer等于Immunochemistry，9，891-906（1972）中所述制得的CRM197，人用蛋白载体还有其它细菌蛋白载体，例如脑膜炎球菌外膜蛋白。载体蛋白最好本身就是免疫原。
多糖可借助已知的方便方法与载体共价偶联。虽然使用对称的联结剂例如己二酸二酰肼，如J.B.Robbins等在J.Experimental  Medicine，152，361-376，（1980）中所述，或用异二功能的联结剂，如N-琥珀酰亚胺基3-（2-吡啶二硫丙酸酯，如J.B.Robbins等在Infection  and  Immunity，56，2292-2298（1988）中所述，都是在本发明的范围之内，但最好是避免使用任何种联结剂，而代之以还原胺化作用直接把多糖偶联在蛋白载体上，如同H.J.Jennings等在J.Immunology，127，1011-1019（1981）中所述。
细菌多糖的大小用平均分子量表示，其大小是可以变动的，并取决于获取的细菌和多糖与载体的偶联方法。因而它可以小到1000道尔顿（103）或高于106。用还原胺化的偶联方法得到的多糖分子量通常在5000-500000的范围内，例如300000到500000或例如5000-50000道尔顿。
长链烷基佐剂及其在宿主的代谢作用中产生的所有化合物应当是无毒的。皆知，长链脂肪醇是天然存在的无毒物质。作为一个实例，十八烷醇对人是完全无毒的，如同口服LD50所提示的，LD50大于15g/Kg，见Gosselin的“商用产品的临床毒理学”，第4版，1976。酪氨酸十八烷醇酯对动物是无毒的，并且大多数天然存在的氨基酸是无毒的;C.L.Penney等，Vaccine，4，99-104（1986），因而可以预料酪氨酸十八烷醇酯和其它氨基酸和其它醇的酯对人都无毒性。
佐剂在水性介质中应能形成大小为大约150μm-1mm（18目-100目，最好是大约250μm，或60目）的微粒，因而生成均匀稠度的悬浮液。而且，佐剂微粒应可以吸附结合型疫苗，从而得以缓慢地向宿主中释放结合物。
在本发明的优选的具体实例中，佐剂是下式的化合物
Figure 911089993_IMG3
式中C是氢原子，氨基酸残基或氨基酸数目多达10个的多肽残基（即十肽）;D是氢原子或药用酸，例如盐酸，溴氢酸，磷酸，硫酸，酒石酸，乳酸或乙酸。E是4-羟苄基，苄基，4-羟苯基，苯基，4-氨基丁基，异丙基，甲基，氢或天然存在的其它氨基酸残基;A是（CH2）n，氧或CH2O，B是（CH2）n或氧，其中n为0～4，但若是（CH2）n或氧时A≠B;R是一个含12～20个碳原子的烷基。
较好的佐剂是：C或者可为氢、氨基酸、二肽或三肽。若C是一氨基酸，则该佐剂的氨基酸次序可从下述中选择，例如酪氨酰甘氨酸，甘氨酰甘氨酸，甘氨酰酪氨酸和苯丙氨酰甘氨酸。
若C为一个二肽，则该佐剂的氨基酸次序可从下述中选择，例如酪氨酰甘氨酰甘氨酸或酪氨酰丙氨酰甘氨酸。若氨基酸残基是手性的，可用D-光学异构体，或L-光学异构体，或其混合物。特别优选的是佐剂含有α-氨基酸。
E特别优选自：4-羟基苄基，苄基，4-羟基苯基，苯基和氢。E最好的是4-羟基苄基。
当A是CH2O，B是（CH2）n时，化合物为N-氨基酰基乙醇胺-O-硬脂酸酯。当A是CH2O，B是氧时，化合物为碳酸酯。
更为优选的是，该佐剂是氨基酸酯的盐酸盐，其中C是氢，D是盐酸，A是（CH2）n（n为0～4），B是氧。
最优选的是，该佐剂为酪氨酰十八碳醇酯盐酸盐，其中C是氢，D是盐酸，E是4-羟基苄基，R是十八碳烷基，A是（CH2）n，n为零，B是氧。
当C不是氢时，佐剂的骨架通常主要是肽键构成，即一个氨基酸残基的羧基直接联结于相邻残基的氨基上，头-尾相联。肽链还可以是硫代酰胺。
佐剂可用任何方便的方法制取。例如佐剂的氨基酯部分可用许多种已确定的方法之一合成，如同M.Bodansky等在“肽合成”第二版，Wiley，纽约，1976和R.W.Roeske，Peptides（N.Y.）3，102（1981）中所述。特别优选的方法是用甲烷磺酸催化的酯化法，C.Penney等叙述于J.Organic  Chemistry，50，1457-1459（1985）。
当佐剂是二肽或三肽时，肽键的生成可用上述的“肽合成”一书中所述的任何种方法实现。此外，肽键的生成可按固相或液相法实行。有许多种方案和试剂可用来生成酰胺、硫代酰胺或硫酯键。
在制备佐剂时，希望要暂时保护有反应活性的功能基。例如，胺类可用氨基甲酸酯型基团保护，醇类用叔丁基或苄基保护，酸用酯基保护。在上述的“肽合成”一书中叙述了适宜的保护-去保护条件和方案。
佐剂可用前述的任何种技术进行精制。优选的方法是硅胶层析，特别是快速层析方法，如W.Clark  Still等在J.Organic  Chemistry，43，2923-2925（1978）中所述。然而，其它包括有HPLC的层析方法也可用于纯化佐剂。结晶法也可用于纯化佐剂。在某些情况下，由于合成中直接得到了分析纯的产物而无需精制。
本发明的疫苗组合物可按已知的方法，在适宜的灭菌条件下将佐剂与多糖-载体蛋白结合物经物理混合来制备，生成辅佐化的组合物，多糖-载体蛋白结合物与佐剂的复合化是由于在结合物中存在净负电荷而加速，该负电荷与佐剂的长链烷基化合物上的正电荷发生静电吸引作用。
为诱发人的免疫应答所需的佐剂量和多糖-载体蛋白结合物的量是相互关联的，但常规疫苗通常所用的量有一定范围。例如，增加了佐剂的用量可建议减少结合物的用量，反之亦然。佐剂在组合物中的优选量为0.01～5mg/ml，例如为0.05mg/ml～3mg/ml，最好是0.5～1.0mg/ml。结合物的优选量大约在1～100微克/ml之间，最好是大约5～40微克/ml。剂量取决于接受疫苗的宿主的状况，诸如个体大小，重量和年龄等因素。
本发明的疫苗组合物可用类似于其它药用多肽组合物的方法制成制剂。因而，佐剂和结合物可以冷冻干燥的形式贮存，在使用前加入生理可接受的辅料生成悬浮液。佐剂和结合物也可存贮于辅剂之中。优选的辅剂为灭菌溶液，特别是灭菌缓冲溶液，例如磷酸缓冲生理盐水。与单个组分相比，只要组合物的免疫效果得到改善，任何种合并佐剂和结合物于辅剂中的方法都是适宜的。
辅剂中可含有防腐剂或其它已知的添加剂，以用于改善贮存的稳定性或混合物的效力。适宜的防腐剂包括例如乙基汞硫代水杨酸钠。
本发明疫苗的单个剂型的体积可以有所变化，但一般是在常规疫苗所用体积的范围内。单个剂型的体积优选为大约0.1ml到1.5ml之间，较好的是大约0.2ml到0.5ml之间，结合物和佐剂的浓度如前所述。
本发明疫苗组合物可用任何种方便的方式用药，优选的用药方法包括有皮下、肌肉、皮内注射或鼻腔给药，还可以用生物可扩散的植入剂释放该混合物，可以一次用药，也可以在数天或数周内多次用药。
以下实例说明本发明内容，但并不只限于此。
实施例1
下面叙述脑膜炎球菌A族和C族多糖的分离，制备和结合。
多糖获自于脑膜炎奈氏球菌A族604A株和C族2241C株的培养提取液。这些菌株获自安大略，渥太华疾病控制实验室中心的培养菌库，用Kenny等在Bull.W.H.O.37，569（1937）中所述的化学培养基中生长。发酵桶中生长15小时后，加入福尔马林使终浓度为0.75%以杀死细菌。连续离心法除去细菌，上清液分离多糖，基本按Bundle等在J.Biol.Chem.249，4797-4801（1974）中所述方法精制，只是将粗多糖溶液与热的（50°～60℃）90%酚搅拌来提取蛋白质，而不是用冷的（4℃）酚，这种改进保证了生产和分离高分子量的多糖。
A族多糖的解聚
天然的脑膜炎球菌A族多糖（平均分子量30000;150mg）溶于20ml乙酸钠缓冲液（100mM;pH5.0）于70℃加热。解聚作用用FPLC（Pharmacia）控制于Superose12凝胶压挤柱，直到获得所需的分子量（M.W.12000）。该物质于4℃用蒸溜水透析，冻干，得到13.5mg无定形固体。
解聚的A族多糖的还原
解聚的A族多糖100mg溶解于3ml  tris（HCI）缓冲液（200mM;pH7.2）冷却到0℃。在3小时内将5×2.5mg等分的硼氢化钠加到搅拌的溶液中。加入100mM乙酸使溶液的pH保持在7.5～7.8，再加入1M乙酸使溶液的pH降至5.5以将所有残存的硼氢化物破坏掉，然后加入100mM氢氧化钠使pH升至7.5。该溶液于Bio-Gel  P6DG（Bio-Rad）柱（1.6×100Cm）上脱盐，水洗脱、收集空隙容积峰，冻干，得11.7mg还原产物。
GAMP的活化和分级
解聚并还原后的A族多糖110mg溶解于50mM，2ml高碘酸钠溶液中，室温下于暗处保持1小时。然后加入50μl乙二醇，溶液室温放置1小时，用Bio-Gel P6DG（1.6×100Cm）（Bio-Rad）柱将溶液脱盐，用水洗脱，收集空隙容积峰，冻干，得108mg氧化产物。产物在Bio-Gel A0.5柱上分级（1.6×100Cm，200-400目，于PBS Bio-Rad上）。收集柱上洗脱的KD0.5～KD0.6（平均分子量10000-15000）组分，该组分是用FPLC（Pharmacia）在Superose 12（HR 10/30;Pharmacia）柱上测定的，收集的组分透析后冻干。
C族多糖的氧化和解聚
天然的脑膜炎球菌C族多糖200mg溶于20ml水，再加入2ml  100mM高碘酸钠溶液（200μM）。如A族多糖中所述的用FPLC分析法监测解聚反应，当得到所希望的平均分子量范围时，加入100ml乙二醇以终止反应，溶液室温放置1小时，透析后冻干。
GCMP氧化组分的分级
氧化GCMP用凝胶过滤法Bio-Gel A0.5柱于PBS（1.6×100Cm;200～400目）（Bio-Rad）中分级。柱上洗脱的KD0.5～KD0.6（平均分子量10000～15000）组分经FPLC测定（如上述）加以收集，透析后冻干，这样收集的GCMP组分的两个端基都是醛基。
多糖结合物
A族或C族多糖的氧化组分90mg溶解于100mMNaHCO3（pH8.1）缓冲液2ml中，将破伤风类毒素单体30mg加到此溶液中。加入60mg氰代硼氢化钠（Aldrich，Milwaukee，WI）后，溶液于37℃保温4天，然后将该反应混合物直接用于Bio-Gel A（0.5）（200～400目;1.6×100Cm）（Bio-Rad）柱于PBS中洗脱，含有该组合物的组分对蒸馏水透析，冻干。该结合物含多糖和破伤风类毒素的摩尔比分别为2-3∶1。
实施例2
下面叙述N-丙酰基和N-丁酰基B族脑膜炎球菌多糖的制备和结合。
丙酸酐、丁酸酐和多聚乙酰神经氨酸获自Sigma化学公司，圣路易城，MO.因为多聚乙酰神经氨酸在结构上与B族脑膜炎球菌多糖（GBMP）相同，以下也称它为GBMP。破伤风类毒素获自Armand-Frappier研究所，Laval，魁北克，所有用于结合作用的破伤风类毒素单体，是将上述制剂流经Bio-Gel（商标名）A0.5（200-400目）柱（1.6×90Cm）（Bio-Rad，Richmond，CA），用0.01M磷酸缓冲的生理盐水（PBS）（pH7.4）平衡和洗脱。
GBMP的N-脱乙酰化
1.0g GBMP钠盐溶于5ml 2M NaOH中，加入150mgNaBH4后，溶液于110℃加热6小时（于60ml容积的有聚四氟乙烯螺盖的容器中）。该法基本是按J.Immunol，134，2651（1985）和US专利4727136中所述进行，两文的作者都是Harold J.Jennings等。冷却后的稀释溶液于4℃下对蒸馏水作彻底的透析，冻干。得到了N-脱乙酰化GBMP这一事实是由其1H-NMR谱中无甲基乙酰胺基信号（单峰，δ2.07）而确定的。
GBMP的N-酰化
N-脱乙酰化的GBMP1.0g溶于50ml5%NaHCO3水溶液中。等分成两份，每份（10ml），各加入丙酸酐或丁酸酐。这些试剂是在室温下于3小时内分3×0.5ml等分加入，并加0.5N NaOH使溶液一直维持在pH8.0。每加入一份酸酐，同时加入0.5ml甲醇以增加它们的溶解度。溶液最后于4℃搅拌16小时，在40℃下对蒸馏水作彻底透析，冻干。各N-丙酰化-和N-丁酰化的GBMP的收率超过90%，两种情况下基本上完全N-酰化了，其证明是N-脱乙酰基GBMP的1H-NMR谱的消失。
N-酰化的GAMP的活化
用高碘酸氧化法将末端醛基引入到N-酰化的GBMP中，上述得到的N-酰化GBMP于室温暗处用10ml0.1M偏高碘酸钠水溶液氧化2小时，加入1ml乙二醇以破坏过量的高碘酸盐，然后于4℃将溶液作彻底透析，冻干。N-脱乙酰化的方法（除不用GBMP外）用硼氢化钠还原，将各N-酰化的GBMP的末端还原的唾液酸残基转变成开链的多元醇，这类的残基对高磺酸盐是敏感的（见J.Immunol，127，1011（1981）和US专利4356170，作者Harold  J.Jennings等），因而将醛基引入到N-酰化的GBMP的两个末端上。
各种N-酰化的GBMP的分级
用凝胶过滤法，Ultrogel（商名）AcA 44（圆柱直径60-140μm）柱（IBF生物技术公司，Savage，MD），PBS为洗脱剂，得所希望的平均分子量的氧化的N-酰化的GBMP物质。于KD0.5～KD0.7（经FLPC测定，见下）由柱中洗脱的组分收集后透析并冻干。KD0.2～KD0.4范围的组分相当于平均分子量为30000～40000道尔顿，也加以收集和结合，因此，在KD范围为0.2～0.7的洗脱的N-酰化物质是特别重要的。
多糖结合物
被氧化的组份100mg溶解于2ml0.1M碳酸氢钠缓冲溶液（pH8.1）中，向其中加入20mg破伤风类毒素。最后，在加入氰代硼氢化钠40mg后，于室温下缓缓搅拌溶液，该结合过程用FPLC跟踪，用含有Superose（商名）12 HR10/30（Pharmacia）的凝胶柱以1ml/分钟的速度，pH7.2的PBS缓冲液洗脱，蛋白质和N-酰化的GAMP都在214nm处监测。该组分的KD值为0.6，破伤风类毒素KD为0.39，在多数情况下，结合作用在2天内完成，但再放置使总反应时间为4天。潜存的未被反应的醛基最后用20mg硼氢化钠还原后，再进行凝胶过滤。
多糖破伤风类毒素结合物与多糖组分分开是用凝胶过滤法Bio-Gel  A柱，PBS洗脱。将含有结合物的洗脱液对蒸馏水透析，冻干。N-酰化的GBMP破伤风类毒素结合物含有唾液酸12～30%，特别是12～20%，测定法用间苯二酚法，Svennerholm，L.，叙述于Biochem.Biophys.Acta24，604（1957），题目是唾液酸的定量测定，Ⅱ间苯二酚-盐酸比色测定法。结果提示，结合物中多糖与破伤风类毒素的摩尔比为2-3∶1。
实施例3
下面叙述多糖-蛋白载体结合物与长链烷基氨基酸或肽酯佐剂复合的一般方法。
长链烷基酯佐剂粉碎后过筛，称取适宜量放入瓶内，加入磷酸缓冲食盐液后使悬浮液（10mM磷酸盐，pH7.4），浓度为1～2mg/ml。充分混合该悬浮液，加入等体积和有同样缓冲液的结合物，于4℃缓缓振摇总混合液16小时，复合作用结束时，若希望测定与佐剂复合的结合物的量时，可将悬浮液离心，上清液中的结合物浓度（蛋白载体浓度）用Lowry等在J.Biological  Chemistry，193，265～275（1951）所述的方法测定，得出未结合的结合物量。一般地讲，结合型的结合物达到30～90%表示有较好的佐剂-多糖结合物的复合，结合型的和未结合的结合物都用来进行免疫实验。
实施例4
本实施例说明了一些长链（18个碳原子）酯对脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合型疫苗的辅佐作用。
雌性CF1小白鼠，8-10周龄，每只小鼠在0日，14日，28日腹腔注射大约15μg结合物（多糖近3μg）。在第39天用心脏穿刺法使小鼠放血，在有佐剂存在下或作为对照的无佐剂存在下，每次注射的总体积都是0.2ml。
用如上所述的还原氨化偶联法使脑膜炎球菌多糖和类毒素载体结合，化学改良的脑膜炎球菌B多糖的制备如上所述。
在血清中抗体的浓度用酶免疫测定法测定，方法如下：96池的聚苯乙烯板（Corning）用适宜的莢膜多糖-牛血清白蛋白结合物的磷酸缓冲生理食盐水溶液（10mM磷酸盐，pH7.4）敷于小池中，每个池中的浓度为1μg，37℃下保持1小时。然后用0.1%牛血清白蛋白在磷酸缓冲生理盐水的溶液于37℃封闭该板一小时，封闭后空板用含有0.05%的吐温20洗涤剂（PBST）的磷酸缓冲生理盐水洗涤四次。空池中加入用于分析的样品，室温下保温1小时。用PBST洗5次后，每个小池中加入标记有过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG（H+L）结合物，在PBST中为1/200，测定板在室温下保温半小时。再用PBST洗5次后，每个池内加入四甲基联苯胺，室温下保温10分钟，用1M磷酸使酶催化的反应停止，之后在450nm下用板计数器（Biotek）读出每个池的吸光度，抗体的滴度是样品的吸光度为1.0时稀释度的倒数，滴度用相对于没有佐剂的对照的比值来表示，结果列于表1。
表1
在长链（C18）酯存在下对脑膜炎球菌结合型疫苗的抗体应答，滴度是用在没有佐剂（对照;结合型疫苗于缓冲的生理食盐水液中）时抗体应答的比例来表示。
佐剂  脑膜炎球菌结合物
A.B.（丁酰）C.
对照（PBS）  1.0  1.0  1.0
酪氨酸十八烷醇酯
0.5mg/ml  3.5  1.3  1.9
1.0mg/ml  3.7  1.9  3.2
酪氨酰甘氨酸十八烷醇酯
0.5mg/ml  3.0  1.8  1.9
N-甘氨酰乙醇胺O-硬脂酸酯
0.5mg/ml  1.0  1.5  1.0
赖氨酸十八烷醇酯
1.0mg/ml  N.D.  1.3  1.8
Forphenicine十八烷醇酯
1.0mg/ml  N.D.  1.9  1.8
N.D.＝未测定
表1的结果表明，长链酯确实对细菌多糖-破伤风类毒素结合物表面有辅佐作用，该辅佐作用取决于酯的类型和存在的细菌多糖的类型。这是个特异现象，通过比较酪氨酸十八烷醇酯和N-甘氨酰乙醇胺O-硬酯酸酯脑膜炎球菌A和C结合物的不同可以看出。
实施例5
本实施例说明由无佐剂到有佐剂作用时，脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合型疫苗所引起的同型的变化。
白色CF1小鼠免疫后，按实施例4所述得到的血清，适宜的脑膜炎球菌多糖-牛血清白蛋白结合物的磷酸缓冲生理食盐水溶液（10mM磷酸盐，pH7.4）敷于有96小池的聚乙烯苯板（Corning）上，方法如实施例4所述。于37℃下封闭该板1小时，然后用2.5%脱脂牛奶的磷酸缓冲生理盐水溶液于室温下封闭半小时。
用PBST洗涤四次后，加入用于分析同型的样品，于室温下保温1小时，用PBST洗五次后，每个小池内加入家兔抗小鼠亚类特异探针（Bio-Rad  Laboratories），Mouse  Typer亚同型板条，并于室温下将试验板保温1小时。再用PBST洗涤五次后，加入标记有过氧化酶的山羊抗家兔（IgG（H+L））结合物的PBST1/3000液，室温下保温此板半小时。再用PBST洗涤五次后，小池中加入四甲基联苯胺室温下保温6分钟，加入1M磷酸使反应停止。在450nm下用板计数器（Biotek）读出每个池的吸光度。抗体的滴度是样品的稀释度乘以吸光度的倒数，滴度用相对于对照（无佐剂）的比值来表示，结果列于表2。
表2
抗脑膜炎球菌A和C结合物应答的同型变化。滴度是在没有佐剂存在时（对照;结合型疫苗的缓冲生理食盐水溶液）抗体应答的比值，佐剂浓度为0.5mg/ml。
佐剂  免疫球蛋白（脑膜炎球菌A）
IgG1  IgG2a  IgG2b  IgG3  IgM
对照（PBS）  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0
酪氨酸十八烷醇酯  2.6  5.7  4.3  4.4  3.4
酪氨酰甘氨酸十八烷醇酯  1.6  3.9  3.6  2.6  1.6
N-甘氨酰乙醇胺  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0
O-硬脂酸酯
佐剂  免疫球蛋白（脑膜炎球菌C）
IgG1  IgG2a  IgG2  IgG3  IgM
对照（PBS）  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0
酪氨酸十八烷醇酯  2.1  5.2  2.3  4.3  1.7
酪氨酰甘氨酸十八烷醇酯  2.1  2.9  1.9  2.9  1.7
N-甘氨酰乙醇胺  1.0  1.0  1.0  1.0  1.0
O-硬脂酸酯
表2结果表明，长链酯确实以有利的方式影响同型的分布。这可由在酪氨酸十八烷醇酯存在下检验IgG2a/IgG1的比值看出（对于抗脑膜炎球菌A的比值为2.2;抗脑膜炎球菌C的比值为2.5）。
实施例6
本实施例说明，在长链酯佐剂的存在下，增加的抗体应答转变成积极的生物效应;保护机体免受活的致病细菌的侵袭。
按实施例4所述免疫白色CF1小鼠。40日龄小鼠腹腔注入大约2000个脑膜炎奈氏球菌B，血清型2b，80165株。5小时后，小鼠放血，测定剩存的活菌数作为“克隆形成单位”（CFU/ml）。N-丙酰基和N-丁酰基脑膜炎球菌B多糖的制备是按前述的方法将N-脱乙酰化多糖与相应的酸酐反应而得，结果列于表3。
表3
N-丙酰（NPr）和N-丁酰基（NBu）改良的脑膜炎球菌B多糖-破伤风类毒素（TT）结合物与酪氨酰甘氨酸十八烷醇酯佐剂对小鼠的有效保护作用。佐剂浓度为075mg/ml。
免疫原  CFU/ml  菌血小鼠数
1）佐剂  3584  5/5
2）NPr多糖  2664  5/5
3）NPr多糖  640  4/5
TT结合物
4）NPr多糖  0  0/5
TT结合物+佐剂
5）NBu多糖  296  1/5
TT结合物+佐剂
表3结果表明，佐剂和多糖结合型疫苗有最好的保护作用，单独用佐剂无效。

Claims (26)

1、一种疫苗组合物，其特征是含有一个细菌多糖蛋白结合物和有效量的下式的至少一个佐剂
Figure 911089993_IMG1
式中
C选自氢、氨基酸残基和肽残基组成的基团组；
D选自氢和药用酸组成的基团组；
E选自4-羟基苄基，苄基、4-羟基苯基，苯基，4-氨基丁基，异丙基，甲基，氢和天然存在的氨基酸残基所组成的基团组；
A是(CH2)n，氧或CH2O，B是(CH2)n或氧，其中n是0～4，前提是A和B不能同时是(CH2)n和氧；
R是12～20个碳原子的烷基。
2、按照权利要求1的一种组合物，其特征是，该佐剂为具有L-构型的氨基酸。
3、按照权利要求1的一种组合物，其特征是，该佐剂为具有D-构型的氨基酸。
4、按照权利要求1的一种组合物，其特征是，该佐剂为D-和L-构型氨基酸混合物。
5、按照权利要求1的一种组合物，其特征是，E是选自4-羟基苄基，苄基，4-羟基苯基，苯基和氢组成的基团组。
6、按照权利要求5的一种组合物，其特征是，E为4-羟基苄基。
7、按照权利要求1的一种组合物，其特征是，C是选择氢、氨基酸残基和包括有多达10个氨基酸残基的肽残基所组成的基团组。
8、按照权利要求7的一种组合物，其特征是，该肽残基选自二肽和三肽。
9、按照权利要求7的一种组合物，其特征是，C是一氨基酸，并且选自酪氨酰甘氨酸，甘氨酰甘氨酸，甘氨酰酪氨酸和苯丙氨酰甘氨酸所组成的残基组。
10、按照权利要求8的一种组合物，其特征是，C是个二肽，并且选自酪氨酰甘氨酰甘氨酸和酪氨酰丙氨酰甘氨酸所组成的残基组。
11、按照权利要求1的一种组合物，其特征是，药用酸选自盐酸，氢溴酸，磷酸，硫酸，酒石酸，乳酸和乙酸所组成的一组酸。
12、按照权利要求1的一种组合物，其特征是，该佐剂包括一种α-氨基酸。
13、按照权利要求1的一种组合物，其特征是，该细菌多糖多肽偶联于生物载体上。
14、按照权利要求13的一种组合物，其特征是，该载体选自破伤风类毒素，无细胞百日咳疫苗（LPF），交叉反应物质（CRM）和细菌蛋白载体所组成的一组。
15、按照权利要求14的一种组合物，其特征是，该CRM是CRM197。
16、按照权利要求1的一种组合物，其特征是，该细菌多糖选自莢膜多糖，脂质多糖和莢膜下表面多糖所组成的一组。
17、按照权利要求16的一种组合物，其特征是，该莢膜多糖分离自流感嗜血菌，脑膜炎奈氏球菌，肺炎链球菌，无乳链球菌，伤寒沙门氏菌，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌所组成的菌组。
18、按照权利要求16的一种组合物，其特征是，该脂质多糖分离自脑膜炎奈氏球菌，大肠杆菌，伤寒沙门氏菌和铜绿假单胞菌组成的菌组。
19、按照权利要求1的一种组合物，其特征是，该莢膜下（表面）多糖选自A族、B族和C族链球菌的普通多糖抗原和肺炎链球菌的普通多糖抗原所组成的抗原组。
20、按照权利要求1的一种组合物，其特征是，该佐剂是一种含14～20个碳原子的烷基醇和一种氨基酸，二肽或三肽形成的酯。
21、按照权利要求20的一种组合物，其特征是，该佐剂是酪氨酸十八烷醇酯。
22、按照权利要求20的一种组合物，其特征是，该佐剂是酪氨酰甘氨酸十八烷醇酯。
23、一种诱导病人免疫应答的方法，其特征是，给该病人以有效治疗量的权利要求1的疫苗组合物。
24、按照权利要求23的一种方法，其特征是，该组合物的给药途径是肌肉，皮内和皮下注射，或经鼻腔给入。
25、按照权利要求23的一种方法，其特征是，该疫苗组合物给药后并不明显地增高IgE水平但确实可增加IgG2a对IgG1抗体的比值。
26、一种生成疫苗组合物的方法，其特征是，把权利要求1定义的细菌多糖蛋白结合物和佐剂，以足以能产生免疫上有效的疫苗组合物的用量，制成剂型。
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