SK18693A3 - Improved vaccine compositions - Google Patents

Description

Oblasť vynálezu

Vynález sa týka vakcíny so zlepšenou imunogenixou, najmä vakcíny, obsahujúcej bakteriálny polysacharid, kovalentne viazaný na bielkovinový nosič v kombinácii s alkylovou zlúčeninou s dlhým .reťazcom. Nosič a dlhý alkylový reťazec majú vo vakcíne pomocný účinok.

Doterajší stav 'techniky

Je dobre známe, že vakcíny sú dôležitou súčasťou

profylaxie infekčných onemocnení. Možno ich získať tak, že sa hostiteľský živočích vystaví účinku cudzorodého materiálu, ktorý aktivuje imunologický systém hostiteľa, čím vzniká imunita proti tomuto materiálu bez toho, aby vznikalo riziko onemocnenia. V súčasnom období sa bežne používa a dodáva približne 20 rôznych vakcín. Väčšina týchto vakcín sa získava detoxikáciou organizmu, ktorý onemocnenie spôsobuje alebo detoxikáciou časti tohto organizmu alebo izoláciou špecifickej netoxickej časti tohto organizmu. Známym príkladom posledného z uvedených postupov je izolácia kapsulárnych polysacharidov men.ingokokov a pneumokokov, ktoré sú. základom pre vakcínu proti zápalu mozgových blán a zápalu pľúc. Avšak vakcíny na báze polysacharidov nie sú dobrými imunogénnyini látkami vzhľadom k tomu, že pri ich použití nevzniká dostatočné množstvo ochranných protilátok u jednotlivcov s nedostatočne vyvinutým alebo porušeným imúnnym systémom. V prípade nedostatočného vývoja ide predovšetkým o malé deti a v druhom o starších ľudí alebo o tých, ktorý trpia chorobami .imunologického systému. Okrem toho imunologická odpoveď, ku ktorej dochádza, je nezávislé!, na T-bunkách a tým tiež nedochádza k zvýšenej tvorbe protilátok po podaní ďalšej injekcie toho istého materiálu. Závislosť na T-bunkách je dôležitá pre indukciu. vzniku protilátok typu IgG a buniek, ktoré vytvárajú * ⁴pamäť na už podaný materiál. Iba v tomto prípade sa po opakobaných injekciách vakcíny vytvárajú protilátky typu IgM a IgG. Okrem toho sa velkosť tvorby protilátok zvyšuje po každej injekcii vakcíny v prípade, že je odpoveď závislá na T-bunkách. Imunológia polysacharidových vakcín bola zhrnutá v publikácii Jennings a ďalší, The Polysaccharides, vyd. G.O. Aspinall, zv.l, 291 - 329, 1982.

Konjugácia alebo kovalentná väzba polysacharidov na príslušný bielkovinový nosič môže zlepšiť imunologickú fun~ kciu v tom zmysle, že dôjde k odpovedi, závislej na T-bunkách

a. tým aj k pamäti na skôr podaný materiál. V decembri 1987 j/· bola povolená prvá vakcína tohto typu v USA na použitie u ľudí. Táto vakcína bola tvorená kapsulárnym polysacharidom H. influenzy b, kovalentne viazaným na toxoid záškrtového bacilu ako na bielkovinový nosič. Táto vakcína bola použitá u detí vo veku 18 mesiacov ako polysacharidová vakcína s obmedzeným účinkom v tomto veku. Ďalšia vakcína s obsahom toho istého polysacharidu H. influenzy b bola pripravená odlišným spôsobom a je v súčasnom období povolená v USA.

Polysacharidové vakcíny a vakcíny na báze konjugátov polysacharidov a bielkovín sú čistejšie a z toho dôvodu bezpečnejšie vakcíny než klasické vakcíny na báze baktérii alebo vírov, pretože tento typ vakcíny je často znečistený toxickými vedľajšími produktmi napriek tomu, že baktérie alebo vírusy boli biochemický detoxikované pôsobením chemických látok, pôsobením tepla alebo genetickým zoslabením. Avšak vzhľadom k tomu, že vakcína s obsahom polysacharidu alebo s obsahom konjugátu polysacharidu a bielkoviny je čistejšia, často to znamená, že boli odstránené tiež prírodné látky stimulujúce imunologický systém, takže tieto nové vakcíny už nestimulujú dostatočne. Z prírodných imunostimulačných látok je možné uviesť niektoré bakteriálne zložky, napríklad lipopolysacharidy, lipoproteíny a muramyldipeptid, všetky tieto látky sú však toxické. Okrem toho aj bielkovinový nosič môže mať učitý stupeň toxicity, takže je žiadúce používať čo najmenšie množstvo tohto nosiča. Napríklad záškrtový toxoid a príbuzná molekula CRM 197, sú bežne používané molekuly ako nosiče pre vakcínu typu konjugátov na použitie u ľudí. Dospelí však môžu mať miestnu alebo všeobecnú precitlivelosť na tieto nosné molekuly. Aby bolo možné tieto účinky zlepšiť, spolu s vakcínami sa podávajú pomocné prostriedky, ktoré podporujú vyššiu tvorbu protilátok. Tieto pomocné zložky často tiež ponúkajú možnosť ovplyvniť typ protilátky, produkovaný ako odpoveď na podanie vakcíny. Napríklad napriek tomu, že po imunizácii vakcínou na báze konjugátov polysacharidov a bielkoviny dochádza ku serokonverzii a následnej premene produkcie protilátky IgG, u myší sa vytvorí ako odpoveď najmä protilátka typu IgGl. Vzostup produkcie protilátky typu IgG2a by bol priaznivý, pretože u myší ide o najúčinnejšiu protilátku, vzhľadom a aktivácii komplementu. Táto cesta môže zabezpečiť dôležitý obranný mechanizmus proti celému radu bakteriálnych infekcií.

Pokiaľ ide o pomocné prostriedky na bežné použitie, v súčasnom období sa bežne dodávajú a používajú iba soli hliníka a vápnika ako pomocné prostriedky. Soli hliníka a vápnika však nie sú silnými pomocnými prostriedkami. Vápenaté soli majú iba obmedzené použitie. Hlinité soli majú síce širšie použitie u rôznych vakcín, ale v prípade vakcín na báze konjugátov polysacharidov a bielkovín boli pri použití hlinitých solí dosiahnuté len malé úspechy. Sú dokonca správy o tom, že hydroxid hlinitý spôsobuje inhibíciu tvorby protilátok pri použití spolu s vakcínou na báze konjugátu polysacharidu H. influenzy b a tetanového toxoidu, ako bolo opísané v publikácii B. Robbins a ďalší, J. Pediatrics, 112,

695 - 702, 1988, J. B. Robbins a ďalší taktiež popisujú to isté potláčanie tvorby protilátok v prípade použitia hydroxidu hlinitého spolu s vakcínou na báze polysacharidu z S.typhi a toxínu cholery vo forme konjugátu ako bolo opísané v J. Experimental Medicíne, 166, 1510 - 1524, 1987. Hlinité soli okrem toho môžu vyvolať prechodnú alebo chronickú tvorbu miestnych granulómov na mieste injekcie. L.H. Collier v časopise Lancet, 1354 - 1367, 1987 uvádza, že výskyt a nevyhovujúca reakcia na vakcínu, prítomnosti hliníka ako látok s obsahom hliníka obsahujúcu toxoid tetanu, závisí od pomocnej látky. Príprava pomocných nie je vždy reprodukovateľná. Okrem toho môže i samotný hliník podporovať tvorbu protilátok typu IgE, ktoré sú zodpovedné za vznik okamžitých hypersenzitívnych reakcií, ako bolo opísané v publikácii T. Matuhasi a ďalší, J. Infections Disease, 146, 192, 1982.

V posledných rokoch pozornosť bola zameraná na použitie organických látok ako pomocných činidiel. Len niekoľko organických zlúčenín môže pôsobiť podobne ako bežné hlinité soli, to znamená ako nosič pomaly uvoľňujúci antigén, ktorý sa uvoľňuje v priebehu dlhého časového obdobia v mieste inj ekcie.

Príkladom takýchto organických zlúčenín sú organické zmáčadlá a emulgátory, napríklad Pluronics a Tetronics, ide o neiónové zlúčeniny sledové kopolyméry polyoxyetylénu a polyoxypropylénu (BASF Corporation). Takýto mechanizmus s pomalým uvoľňovaním účinnej látky je bežne uznávaný pri použití u ľudí ako veľmi vhodný vzhľadom k tomu, že vylučuje možnosť príliš veľkej stimulácie imunologického systému. Príliš veľká stimulácia tohto systému môže totiž viesť k autoimunologickej odpovedi, tak ako k nej prichádza pri použití veľmi silnej látky, stimulujúcej tento systém, ako je napríklad Freundovo pomocné činidlo. Pomalé uvoľnenie je teda veľmi výhodné.

Aj keď bolo dokázané, že väčšina organických pomocných látok dostatočne stimuluje imunologický systém, sú tieto účinné látky zvyčajne toxické a tým neprijateľné pre použitie u ľudí.. Príkladom týchto známych silných imunostimulačných látok môžu byť Freundovo pomocné činidlo a muramyl dipeptid. Obidve tieto látky sú obmedzené na použitie u pokusných zvierat vzhľadom k ich toxicite. Mnohé organické pomocné látky s účinkom podobným účinku hlinitých solí sú ešte toxickejšie ako tieto hlinité soli. Uvádza sa, že napríklad amíny s dlhým alkylovým reťazcom, opísané v publikácii D. Gali, Immunology, 11, 369 - 386, 1966 sú toxické látky, ktoré zvyčajne porušujú štruktúru bunečnej membrány.

Je známe, že tiež oktadecylester aminokyseliny tyrozínu je pomocnou látkou. Tento ester má iba malé imunostimulačné vlastnosti, avšak možno ho použiť ako organický ekvivalent hlinitých soli, to znamená ako nosič pre pomalé uvoľňovanie vakcíny. Je teda možné vytvorenie komplexu antigénu s oktadecyltyrozínom, ktorý bude pomaly uvoľňovaný alebo desorbovaný z nerozpustného pomocného prostriedku v priebehu času. Tvorba komplexu medzi antigénom a pomocným prostriedkom prebieha cez celý rad slabých, nekovalentných síl, napríklad vo forme hydrofóbnych interakcií a vodíkových väzieb.

Tento jav bol opísaný v patentových spisoch US č.

428 932, Overell a č. 4 258 029, Moloney a ďalší. Overell uvádza, že oktadecyltyrozín je možné použiť ako pomocnú látku pri desensitizácii pri rôznych alergiách tak, že sa vytvorí jeho komplex s alergénmi, napríklad s peľom z ražu alebo rôznych travín. Moloney a ďalší uvádzajú, že oktadecyltyrozín je možné použiť ako pomocné činidlo pre vakcíny v prípade tvorby jeho komplexu s toxoidom titánu a vírusom poliomyelitídy typu I, II a III po inaktivácii formalínom. Ten istý jav bol tiež opísaný v publikácii A. Nixon-George a ďalší, J. Immuno logy, 144, 4798 - 4802, 1990, kde sa uvádza, že oktadecyltyrozín a ďalšie oktadecylestery aromatických aminokyselín pôsobia ako pomocné látky pre vakcínu proti hepatitíde B po tvorbe komplexu s rekombinantným povrchovým antigénom vírusu hepatitídy B.

Je zrejmé, že by bolo potrebné vyvinúť netoxické vakcíny s lepšou imunogenitou na báze konjugátov netoxických bakteriálnych polysacharidov a bielkovín.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je vakcína, obsahujúca konjugát netoxického bakteriálneho polysacharidu a bielkoviny spolu s pomocným činidlom s netoxickým dlhým alkylovýra reťazcom. Toto pomocné činidlo s netoxickým dlhým alkylovým reťazcom sa použije v množstve, dostatočnom na zvýšenie imunogenity konjugátu polysacharidu a bielkoviny.

Podstatou vynálezu je tiež spôsob vyvolania imunologickej odpovede u teplokrvných živočíchov, vrátane človeka. Na vyvolanie imunologickej odpovede sa živočíchovi podá účinné množstvo vakcíny podľa vynálezu.

Neočakávane bolo zistené, že netoxické zlúčeniny s dlhým alkylovým reťazcom, najmä estery aminokyselín alebo peptidov, môžu tvoriť komplexy s vakcínami na báze polysacharidov a bielkovín vo forme konjugátov. Dôsledkom tvorby týchto komplexov pôsobia zlúčeniny s dlhým alkylovým reťazcom ako nosiče pomalého uvoľňovania účinnej látky. To znamená, že zlúčeniny s dlhým alkylovým reťazcom uvoľňujú vakcínu typu konjugátu v hostiteľovi v priebehu dlhšieho časového obdobia. To má za následok zvýšenú tvorbu protilátok v porovnaní s množstvom protilátok, ktoré sa vytvoria iba po podaní vakcíny typu konjugátu. Ako už bolo uvedené ide o ten istý pomocný mechanizmus, ktorý bol pozorovaný v prípade hlinitých solí a vakcín bežného typu bez obsahu konjugátu. Ako už bolo uvedené, hlinité soli sú ako pomocné látky v prípade vakcín na báze konjugátu bakteriálneho polysacharidu a bielkovín zvyčajne neúčinné. Dalo by sa preto očakávať, že zlúčeniny s dlhým alkylovým reťazcom vzhľadom k tomu istému mechanizmu pomocného účinku budú v prípade vakcín vo forme konjugátov rovnako neúčinné. Je preto veľmi prekvapujúce, že tieto netoxické látky s dlhým alkylovým reťazcom zlepšujú imunogenitu vakcín na báze konjugátov.

Bolo tiež zistené, že prítomnosť netoxickej zlúčeniny s dlhým alkylovým reťazcom ako pomocnej látky, typicky alkylaminokyseliny alebo peptidového esteru s dlhým reťazcom taktiež ovplyvní izotop protilátky, ktorá sa vytvorí ako odpoveď na podanie tejto vakcíny. Ide o zvýšenie pomeru IgG2a vzhľadom k IgGl, k tomuto zvýšeniu dochádzeí za súčasného zvýšenia tvorby obidvoch týchto protilátok pri podaní vakcíny typu konjugátu spolu s pomocnou látkou s dlhým alkylovým reťazcom v porovnaní s prípadom, keď sa táto pomocná látka nepodá. Zvýšenie tohto pomeru je veľmi priaznivé vzhľadom k tomu, že protilátka IgG2a je u myší najúčinnejšou protilátkou, pokiaľ ide o aktiváciu komplementu a o mechanizmus bunečnej cytotoxicity v závislosti na priebehu choroby a tiež vzhľadom k ochrane proti nádorom a parazitom.

Pomocný účinok zlúčenín s dlhým alkylovým reťazcom v zmysle zvýšenia a modulácie, t.j. zmeny izotypu protilátky je tiež prekvapujúci s ohľadom na úlohu nosnej bielkoviny. Znamená to, že nosič vo vakcíne typu konjugátu môže zvýšiť a pozmeniť vznik protilátky.

Taktiež to znamená, že zlúčeniny s dlhým alkylovým reťazcom sú na rozdiel od hlinitých zlúčenín schopné zvýšiť funkciu nosiča.

Netoxickou zlúčeninou s dlhým alkylovým reťazcom je s výhodou kladne nabitý ester aminokyseliny alebo peptidu, najmä ester alkylalkoholu s obsahom 14 až 20 atómov uhlíka s aminokyselinou, dipeptidom alebo tripeptidom.

Bakteriálny polysacharid vo forme konjugátu s bielkovinou, tak ako sa používa v prostriedkoch podlá vynálezu, je schopný vyvolať imunologickú odpoveď u hostiteľa. Pod pojmom bakteriálny sa v tomto zmysle rozumie kapsulárny alebo obalové polysacharidy, ďalej lipopolysacharidy a ďalšie subkapkapsulárne, povrchové polysacharidy. V súčasnom období sú na použitie v účinných vakcínach s obsahom uvedených konjugátov najmä vhodné kapsulárne polysacharidy z patogénnych baktérií. Príkladom týchto kapsulárnych polysacharidov môžu byť zlúčeniny, ktoré boli izolované z Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniaeStreptococcus agalactiae, Salmonella typhi, Escherichia coli a Staphylococcus aureus. Príkladom použiteľných lipopolysacharidov môžu byť látky, ktoré boli izolované z Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi a Pseudomonas aeruginosa. Príkladom ďalších subkapsulárnych polysacharidov sú bežne polysacharidové antigény (c-látky), izolované z streptokokov skupiny A, B a C a bežný polysacharidový antigén (c-látkka) z Streptococcus pneumoniae.

V príkladovej časti budú opísané pokusy s konjugátmi obsahujúcimi polysacharidy s podstatne odlišnou chemickou štruktúrou, najmä polysacharid z meningokokov skupiny A, ide o momopolymér N-accetylmannosamin-6-fosfátu, ďalej z meningokokov skupiny B, ide o homopolymér 2 - 8-viažanej kyseliny N-butanoylneuraminovej a z meningokokov skupiny C, ide o homopolymér 2 - 9-viazanej kyseliny N-acetylneuraminovej. Vynález sa však neobmedzuje iba na tieto látky, ale vzťahuje sa tiež na ďalšie bakteriálne polysacharidy, ako bude ďalej opísané a tiež doložené príkladovou časťou.

Bakteriálne polysacharidy, použité v konjugátoch podlá vynálezu je možné ľahko pripraviť bežnými izolačnými postupmi .

Nosné molekuly,s ktorými tvoria bakteriálne polysacharidy konjugáty alebo sú na ne kovalentne viazané sú bielkoviny. Výhodnými nosičmi na použitie u živočíchov sú sérový albumín dobytka a špecifický Hemocyanin (Keyhole Limpet Hemocyanin). Bielkovinové nosiče,vhodné na použitie u ľudí zahrňujú toxoid tetanu, toxoid záškrtu, acellulárnu vakcínu proti pertussi, t. j·. LPF-toxoid, materiály spôsobujúce skríženú reakciu, CRM, ktoré sú antigénne podobné bakteriálnym toxínom, avšak sú netoxické vzhľadom k vykonanej mutácii, výhodný je najmä CRM 197, jeho výroba sa opisuje v publikácii Pappenheimer a ďalší, Immunochemistry, 9, 891 - 906, 1972, je však tiež možné použiť ďalšie bakteriálne bielkoviny, napríklad bielkovinu vonkajšej membrány meningokokov. Je výhodné, aby bola použitá nosná bielkovina, ktorá sama o sebe má imunogénne vlastnosti.

Polysacharid môže byť na nosič kovalentne viazaný akýmkoľvek známym spôsobom. Je možné použiť symetricky viazaný reťazec, napríklad dihydrazid kyseliny adipovej, opísaný v publikácii J.B. Robbins a ďalší, J. Experimental Medicíne, 152, 361 - 376, 1980, alebo heterobifukčný väzný reťazec, napríklad N-sukcinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionát opísaný v publikácii J.B. Robbins a ďalší, Infection and Immunity, 56, 2292 - 2298, 1988, najvýhodnejšie je však nepoužiť žiadny väzný reťazec, ale naviazať polysacharid priamo na bielkovinový nosič reduktívnou amináciou, tak ako bola opísaná v publikácii H.J. Jennings a ďalší, J.Immunology, 127, 1011-1019, 1981.

Veľkosť bakteriálneho polysacharidu, uvádzaná ako stredná molekulová hmotnosť je variabilná a závisí na baktérii, z ktorej je materiál izolovaný a tiež na spôsobe väzby polysacharidu na nosič. Molekulová hmotnosť môže byť nízka, napríklad 1000 alebo vyššia, niekedy aj vyššia ako 1 000 000. Pri použití reduktívnej aminácie sa molekulová hmotnosť polysacharidu zvyčajne pohybuje v rozsahu 5 000 až 500 000, napríklad 300 000 až 500 000, alebo napríklad 5 000 až 50 000.

Zlúčeniny s dlhým alkylovým reťazcom a akákoľvek iná látka, ktorá môže vzniknúť pri metabolizme tejto látky v hostiteľskom organizme by mali byť netoxické. Je dobre známe, že nasýtené alifatické alkoholy s dlhým reťazcom sú prirodzene sa vyskytujúce netoxické látky. Ako príklad je možné uviesť oktadekanol, ktorý je pre človeka úplne netoxický, ako je zrejmé z hodnoty LD^q pri perorálnom podaní, ktorá j é vyššia ako 15 g/kg, ako bolo uvedené v publikácii Gosselin, Clinical Toxicology of Commercial Products, 4.vydanie, 1976. Bolo dokázané, že oktadecyltyrozín je pre živočíchy rovnako netoxický ako väčšina prírodné sa vyskytujúcich aminokyselín, ako bolo opísané v publikácii C.L. Penney a ďalší, Vaccine, 4, 99 - 104, 1986. Možno očakávať, že oktadecyltyrozín a tiež estery iných alkoholov s aminokyselinami nebudú pre človeka toxitíké.

Pomocná látka by mala mať schopnosť vytvárať mikročastice s rozmerom 150 mikrometrov až 1 mm, s výhodou 250 mikrometrov, vo vodnom prostredí, čím vzniká suspenzia, ktorá má homogénnu konzistenciu. Okrem toho by tieto mikročastice mali umožniť absorpciu výslednej vakcíny s obsahom konjugátu a tak umožniť pomalé uvoľnenie konjugátu v organizme hostiteľa.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je pomocnou zlúčeninou s dlhým alkylovým reťazcom zlúčenina všeobecného vzorca

kde

C znamená atóm vodíka, zbytok aminokyseliny alebo zbytok peptidu s až 10 zvyškami aminokyselín, to znamená až dekapeptid

D znamená atóm vodíka alebo zbytok kyseliny prijateľnej z farmaceutického hľadiska, napríklad chlorovodíkovej, brómovodíkovej, fosforečnej, sírovej, vínnej, mliečnej alebo octovej kyseliny,

E znamená 4-hydroxybenzyl, benzyl, 4-hydroxyfenyl,fenyl,

4-aminobutyl, izopropyl, metyl, atóm vodíka alebo zvyšok prírodné sa vyskytujúcej aminokyseliny,

A znamená skupinu (CH2)_n, atóm kyslíka alebo CH₂0 a

B znamená skupinu (CH₂)_n alebo atóm kyslíka, n znamená celé číslo 0 až 4 a

R znamená alkylový zvyšok s 12 až 20 atómami uhlíka, za predpokladu, že A a B neznamenajú súčasne skupinu (CH₂)_n alebo atóm kyslíka

S výhodou znamená C atóm vodíka, aminokyselinu, dipeptid alebo tripeptid. V prípade, že ide o aminokyselinu, môže byť reťazec aminokyseliny v pomocnej zlúčenine napríklad tyrozylglicín, glycylglycín, glycyltytozín alebo fenylalanylglycín.

V prípade, že C znamená dipeptid môže byť reťazcom aminokyselín v pomocnej látke napríklad tyrozylglycylglycín alebo tyrozylalanylglycín, V prípade, že niektorý zo zbytkov amonokyselín je chirálny, je možné použiť D-enanciomér, L-enanciomér alebo ich zmes. V zvlášť výhodnom uskutočnení obsahuje pomocná látka alfa-aminokyseliny.

V výhodnom uskutočnení znamená E 4-hydroxybenzyl, benzyl, 4-hydroxyfenyl, fenyl alebo atóm vodíka, najvýhodnejším významom pre E je 4-hýdroxybenzyl.

V prípade, ža A znamená slupinu CH2O a B znamená skupinu (CH2)_n, sú výslednými látkami N-aminoacyletanolamin-O-stearáty. V prípade, že A znamená skupinu CH2O a B znamená atóm kyslíka, ide o karbonáty.

V výhodnom uskutočnení je pomocná látka hydrochlorid esteru aminokyseliny, v ktorom C znamená atóm vodíka, D znamená kyselinu chlorovodíkovú, A znamená (CH2)_n, kde n znamená celé číslo 0 až 4 a B znamená atóm kyslíka.

V najvýhodnejšom uskutočnení je pomocnou látkou oktadecyltyrozínhydrochlorid, v ktorom C znamená atóm vodíka, D je kyselina chlorovodíková, E znamená 4-hydroxybenzyl, R znamená oktadecyl, A znamená (CH2)_n, kde n znamená 0 a B znamená atóm kyslíka.

Všeobecne je možné uviesť, že v prípade, že význam C je odlišný od atómu vodíka, obsahuje kostra pomocnej látky v podstate peptidové väzby, to znamená, že karboxylát jednej aminokyseliny je priamo viazaný na aminoskupinu druhého susedného zvyšku aminokyseliny. Peptidová väzba môže tiež byť tioamidová.väzba.

Pomocnú látku možno pripraviť akýmkoľvek vhodným spôsobom. Napríklad aminoesterovú časť pomocnej látky je možno syntetizovať akýmkoľvek z celého radu používaných spôsobov, tak ako boli opísané v publikácii M. Bodansky a ďalší, Peptide Synthesis, 2.vydanie, Viley, New York a R.V. Roeske, Peptides, N.Y. 3, 102, 1981. Zvlášť výhodným postupom je esterifikácia, katalyzovaná metánsulfonovou kyselinou, ktorá bola opísaná v publikácii C. Penney a ďalší, J. Organic. Chemistry, 50, 14557 - 1459, 1985.

V prípade, že pomocnou látkou je di- alebo tripeptid, je možné peptidové väzby vytvoriť akýmkoľvek spôsobom, opísaným v hore uvedenej publikácii Peptide Synthesis. Okrem toho je možné tieto väzby vytvoriť v pevnej fáze alebo v roztoku. Existuje rad postupov alebo reakčných činidiel, ktoré sú vhodné pre vytvorenie amidových, tioamidových alebo tioesterových väzieb.

V priebehu prípravy pomocnej látky môže byť žiadúce dočasne chrániť reaktívne funkčné skupiny. Napríklad amíny je možné chrániť skupinami typu uretanu, alkoholy pomocou terc, butylovej alebo benzylovej skupiny a karboxylové kyseliny tvorbou esterov. Vhodné postupy na zavedenie ochraných skupín a ich opätovné odstránenie sú tiež uvedené v hore uvedenej publikácii Peptide Sythesis.

Pomocnú látku je možné čistiť akýmkoľvek vyššie uvedeným postupom. Výhodným postupom je chromatografia na silikágeli, najmä rýchla chromatografia opísaná v publikácii V. Clark Still a ďalší, J. Organic Chemistry, 43, 2923 - 2925,

1978. Je však možné použiť tiež ďalšie chromatografické postupy, vrátane HPLC. Čistenie možno tiež vykonať pomocou kryštalizácie. V niektorých prípadoch však nie je potrebné žiadne čistenie, vzhľadom k tomu, že sa produkt získa v analytickej čistote.

Vakcíny podľa vynálezu je možné pripraviť tak, že sa pomocná látka fyzikálne zmieša s konjugátom polysacharidu a nosnej bielkoviny za sterilných podmienok známym spôsobom, čím sa získa výsledný prostriedok. Tvorba komplexu konjugátu polysacharidu a nosnej bielkoviny s pomocnou látkou je uľahčená existenciou mierneho negatívneho náboja na konjugáte, ktorý je tak priťahovaný elektrostaticky k pozitívnemu náboju, nachádzajúcemu sa na pomocnej látke s dlhým alkylovým reťazcom.

Množstvo pomocnej látky a konjugátu polysacharidu a nosnej bielkoviny, ktoré je potrebné k vyvolaniu imunologickej odpovede u človeka je vo vzájomnom vzťahu, ide zvyčajne o rozsah bežne používaný vo vakcínach. Napríklad pri použití vyššieho množstva pomocnej látky môže byť použité trochu nižšie množstvo konjugátu a naopak. Výhodné množstvo pomocnej látky je 0,01 až 5 mg/ml prostriedku, napríklad 0,05 až 1,0 mg/ml. Výhodné množstvo konjugátu je 1 až 100, s výhodou 5 až 40 mikrogramov/ml. Dávka bude závisieť od hostiteľa a jeho hmotnosti, veku a podobne.

Vakcíny podľa vynálezu je možné získať použitím postupov podobných tým, ktoré sú využívané pri výrobe ďalších farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú polypeptidy. Pomocnú látku a konjugát je možné skladovať v lyofilizovanej forme s rekonstitúciou v fyziologicky prijateľnom prostredí na suspenzii tesne pred podaním. Pomocnú látku a konjugát je tiež možné skladovať priamo v nosnom prostredí. Výhodným prostredím sú sterilné roztoky, najmä sterilné pufry, napríklad fyziolofický roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrom. Je možné použiť akýkoľvek postup na zmiešanie pomocnej látky a konjugátu v nosnom prostredí tak, aby sa dosiahlo zlepšenia imunologickej účinnosti v porovnaní s použitím jednotlivých zložiek.

Nosné prostredie môže obsahovať konzervačné látky alebo iné známe prísady, ktoré môžu zlepšiť skladovateľnosť výsledného prostriedku alebo jeho účinnosť. Výhodným konzervačným prostriedkom je napríklad thimerosal.

Objem jednotlivej dávky vakcíny podľa vynálezu sa môže meniť, avšak obyčajne sa používa rovnaký objem ako u bežných vakcín. Objem jednotlivej dávky sa obyčajne pohybuje v rozsahu 0,1 až 1,5 ml, s výhodou 0,2 až 0,5 ml pri hore uvedených koncentráciách konjugátu a pomocnej látky.

Vakcíny podľa vynálezu je možné podávať akýmkoľvek vhodným spôsobom. Výhodnými postupmi podania je podanie podkožné, nitrosvalové, nitrokožné alebo podanie nosnou sliznicou. Zmes je tiež možné uvoľniť z implantátu, biologicky postupného. Môže byť užité jedno podanie alebo opakované podanie po niekoľkých dňoch alebo týždňoch.

Praktické uskutočnenie vynálezu bude osvetlené nasledujúcimi príkladmi, ktoré však neobmedzujú rozsah vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príikad 1

V tomto príklade sa opisuje izolácia, príprava a konjugácia polysacharidov z meningokokov skupiny A a C.

Polysacharidy sa získavajú z extraktu kultúry N.meningitidis, kmeň 604 A v prípade skupiny A a kmeň 2241C v prípade skupiny C. Tieto kmene boli získané zo zbierky kultúr Laboratory Center for Dísease Control, Ottawa, Ontario a boli pestované v chemicky definovanom prostredí podľa publikácie Kenny a ďalší, Bull,, V.H.O. 37:569, 1957. Po 15 hodinách rastu vo fermentore boli baktérie usmrtené pridaním formaldehydu do konečnej koncentrácie 0,75 %. Baktérie boli oddelené kontinuálnym odstredenim a polysacharidy boli izolované zo supernatantu a čistené podlá publikácie Bundle a ďalší, J.Biol. Chem., 249:4797 - 4801, 1974 až na to, že bielkovina bola extrahovaná miešaním roztoku surového polysacharidu s studeným 90% fenolom o teplote 4θ C namiesto s horúcim fenolom o teplote 50 až 60θ C. Táto modifikácia môže zabezpečiť produkciu a izoláciu polysacharidu s vysokou molekulovou hmotnosťou.

Depolymerácia polysacharidu skupiny A

Natívny polysacharid zo skupiny meningokokov A so strednou molekulovou hmotnosťou 30 000 bol v množstve 150 g rozpustený v 20 ml 100 mM pufru s octanom sodným o pH 5,0 a zohriaty na teplotu 70θ C. Depolymerácia bola pozorovaná pomocou FPLC (Pharmacia) na kolóne s gélom Superose 12 až do dosiahnutia požadovanej molekulovej hmotnosti 12 000. Potom bol materiál dialyzovaný proti destilovanej vode pri teplote 4θ C a lyofilizovaný, čím bolo získané 13,5 mg amorfnej tuhej látky.

Redukcia depolymerovaného polysacharidu skupiny A

100 mg depolymerovaného polysacharidu skupiny A sa rozpusti v 3 ml 200 mM tris-pufru s chlorovodíkovou kyselinou o pH 7,2 a roztok sa ochladí na 0° C. Potom sa v priebehu 3 hodín pridá k roztoku počas miešania 5 x 2,5 mg bórohydridu sodného, pH roztoku sa v priebehu pridávania udržuje na 7,5 až 7,8 pridávaním 100 mM kyseliny octovej. Potom sa pH roztoku zníži na 5,5 pridaním 1 M kyseliny octovej na rozrušenie akéhokoľvek zvyšku bórohydridu a potom sa opäť zvýši na 7,5 pridaním 100 mM hydroxidu sodného. Roztok sa zbaví solí na kolóne Bio-Gel P6G (Bio-Rad) s rozmermi 1,6 x 100 cm a kolóna sa premýva vodou. Príslušný vrchol sa odoberie a lyofilizuje, čím sa získa 11,7 mg redukovaného produktu.

- 17 - f *

Aktivácia a delenie GAMP podlá molekulovej hmotnosti tmr

110 mg depolymerovaného a redukovaného polysacharidu skupiny A sa rozpusti v 2 ml 50 mM j odist-.anu sodného a udržuje 1 hodinu v tme pri teplote miestnosti. Potom sa pridá 50 mikrolitrov etylénglykolu a roztok sa nechá 1 hodinu stáť pri teplote miestnosti. Potom sa roztok zbaví solí použití kolóny Bio-Gel P6DG (Bio-Rad) s rozmerom 1,6 x 100 crn vo vode. Príslušný vrchol sa zhromažďuje a lyofilozuje, čím sa získa 108 mg oxidovaného produktu. Tento materiál sa delí na kolóne Bio-Gel A 0,5 s rozmerom 1,6 x 100 cm, 200 až 400 mesh v PBS (Bio-Rad). Frakcie, vymývané zo stĺpca pri Kp 0,5 až 0,6, molekulová hmotnosť 10 OOOaž 15 000 podľa merania FPLC (Pharmacia) na kolone Superose 12 (HR 10/30, Pharrnacia) sa spoja, dialyzujú a lyofilizujú.

Oxidácia a depolymerácia polysacharidu skupiny C

200 mg natívneho polysacharidu meningokokov skupiny C sa rozpusti v 20 ml vody a pridá sa 2 ml 100 mM jodistanu sodného, celkom 200 mikromólov tejto látky. Depolymeračná reakcia sa sleduje analýzou FPLC rovnako ako v prípade polysacharidu skupiny A. Len čo sa dosiahne požadovaného rozsahu molekulovej hmotnosti, reakcia sa zastaví pridaním 100 mikrolitrov etylénglykolu a roztok sa nechá stáť 1 hodinu pri teplote miestnosti a potom sa dialyzuje a získaný produkt sa lyofilizuje.

Delenie oxidovaných fragmentov GCMP podľa molekulovej hmotnosti

Oxidovaný GCMP sa podrobí filtrácii na géle pri použití kolóny Bio-Gel A s rozmerom 1,6 x 100 cm, 200 až 400 mesh v PBS (Bio-Rad). Frakcie, ktoré sa z kolóny vymývajú pri Kp 0,5 až 0,6 so strednou molekulovou hmotnosťou 10 000 až až 15 000 podľa merania FPLC hore opísaným spôsobom sa spoja, dialyzujú a produky sa lyofilizuje. Takto získané fragmenty GCMP obsahujú aldehydové skupiny na obidvoch koncoch.

Konjugáty polysacharidov mg oxidovaných fragmentov polysachsiridov skupiny A alebo C sa rozpustí v 2 ml 100 mM hydrogenuhličitanu sodného o pH 8,1a k roztoku sa pridá 30 mg monoméru tetanového toxoidu. Potom sa pridá ešte 60 mg kyanbórohydridu sodíka (Aldrich, Milwaukee, VI) a roztoky sa inkubujú 4 dni pri teplote 37θ C. Potom sa reakčné zmesi priamo nanesú na kolónu Bio-Gel A 0,5 s rozmerom 1,6 x 100 cm, 200 až 400 mesh v PBS (Bio-Rad). Frakcie s obsahom konjugátov sa dialyzujú proti destilovanej vode a produkt sa lyofilizuje. Molárny pomer polysacharidu k tetanovému toxoidu v konjugáte bol 2-3:1.

Príklad 2

Tento príklad opisuje prípravu a konjugáciu N-propionyl- a N-butanoyl polysacharidov meningokokov skupiny B.

Anhydridy kyseliny propionovej a butanovej spolu s kyselinou kolominovou boli získané od Sigma Chemicals Company, St.Louis, MO. Vzhľadom k tomu, že kyselina kolominová je štruktúrne rovnaká s polysacharidom meningokokov skupiny B, GBMP, bude ďalej uvádzaná ako GBMP. Tetanový toxoid bol získaný od Inštitút Armand-Frappier, Laval, Quebec, a jeho monomérna forma bola použitá pri všetkých konjugáciach, bola získaná priechodom zvrchu získanej látky kolónou Bio-Gel A 0,5 s 200 až 400 mesh s rozmerom 1,6 x 90 cm (Bio-Rad, Richmond, CA), naplnený a' premývaný 0,01 M fyziologického roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrom, PBS, pH 7,4.

N-deacetylácia GBMP

1,0 g sodnej soli GBMP sa rozpustí v 5 ml 2M hydroxidu sodného a po pridaní 150 mg NaBH^ sa roztok zahrieva 6 hodín na teplotu 110θ C v nádobe s objemom 60 ml s teflónovýn povlakom a skrutkovacím uzáverom. Postup bol opísaný v J. Immunol., 134, 2651, 1985 a v patentovom spise č.4 727 136, autori obidvoch publikácií sú Harold J. Jennings a ďalší. Ochladený a zriedený roztok sa potom dôkladne dialyzuje proti destilovanej vode pri teplote 4θ C a potom sa lyofilizuje. Skutočnosť, že sa získa N-deacetyl GBMP sa preukáže neprítomnosťou signálu pre metylacetamidoskupinu, singletu pri 2,07 v ^H-NMR spektre N-deacetylovaného GBMP.

N-acylácia GBMP

1,0 g N-deacetylovaného GBMP sa rozpustí v 50 ml 5 % vodného hydrouhličitanu sodného. K dvom podielom tohto roztoku po 10 ml sa pridá buď anhydrid kyseliny propionovej alebo butánovej. Tieto reakčné činidlá sa pridávajú v priebehu 3 hodín po podieloch 3 x 0,5 ml pri teplote miestnosti a pH roztoku sa udržuje na 8,0 pridávaním 0,5 N hydroxidu sodného. Súčasne s každým pridaním anhydridu sa tiež pridá 0,5 ml metanolu z dôvodu zvýšenia rozpustnosti. Nakoniec sa roztoky miešajú 16 hodín pri teplote 4θ C, dôkladne sa dialyzujú proti destilovanej vode pri teplote 40θ C a lyofilizujú. N-propionylovaný a N-butanoylovaný GBMP sa získa vo výťažku vyššom ako 90 %. V každom z prípadov je možné potvrdiť v podstate úplnú N-acyláciu tým, že v ^H-NMR spektre získaných produktov zmizne signál N-deacetylovaného GBMP.

Aktivácia N-acylovaného GBMP

Terminálne aldehydové skupiny sa do N-acylovaného GBMP zavedú oxidáciou jodistanom. N-acylovaný GBMP, získaný hore uvedeným spôsobom sa oxiduje 10 ml 0,1 M vodného roztoku metaj odistanu sodného 2 hodiny pri teplote miestnosti a v tme. Nadbytok jodistanu sa rozruší pridaním 1 ml etylénglykolu a roztok sa potom dôkladne dialyzuje pri teplote 4θ C. Takto získaný produkt sa lyofilizuje. Použitie bórohydridu sodíka pri N-deacetylácii s výnimkou GBMP má za následok transformáciu terminálnych zvyškov kyseliny sialovej v každom z N-acylovaných GBMP za vzniku polyolových zvyškov s otvoreným reťazcom. Tento typ zvyškov je citlivý na pôsobenie jodistanu, ako bolo opísané v Harold J. Jennings a ďalší, J. Immunol., 127, 1011, 1081 a patentovom spise US č. 4 356 170, takže dochádza k vzniku aldehydových skupín na obidvoch koncoch N-acylovaného GBMP.

Delenie rôznych N-acylovaných GBMP podľa molekulovej hmotnosti.

Na získanie oxidovaného N-acylovaného GBMP s požadovastrednou molekulovou hmotnosťou bola použitá filtrácia na géle s použitím kolóny Ultrogel AcA 44 s priemerom častíc 60 až 140 mikrometrov (IBF Biotechnics, Savage, MD) pri použití PBS ako elučného činidla. Frakcie, vymývané z kolóny pri Kp 0,5 až 0,7 podľa merania pomocou FPLC, boli spojené, dialyzované a lyofilizované. Materiál v rozsahu Kp 0,2 až 0,4 odpovedajúci molekulovej hmotnosti 30 000 až 40 000 bol taktiež odobraný a podrobený konjugáci. N-acylovaný materiál, k vymývaniu ktorého dochádza v oblasti Kp 0,2 až 0,7, je pre vynález mimoriadne výhodný.

Konjugáty polysacharidov

100 mg oxidovaných fragmentov sa rozpustí v 2 ml 0,1 M hydrouhličitanu sodného o pH 8,1 a do roztoku sa pridá 20 mg tetanového toxoidu. Ppridá sa 40 mg kyanobórohydridu sodíka a roztok sa opatrne mieša pri teplote miestnosti a priebeh konjugácie sa sleduje pomocou FPĹC použitím kolóny na filtráciu na géle s obsahom Superose 12 HR1O/3O (Pharmacia), pri izokratickom prietoku 1 ml/min. v PBS o pH 7,2, bielkovina ako aj N-acylované fragmenty GBMP sa sledujú pri 214 nm. Kp fragmentov je 0,6 a K_D tetanového toxoidu je 0,39. Vo väčšine prípadov bola konjugácia ukončená po dvoch dňoch, ale používaný celkový reakčný čas bol 4 dni. Potenciálne ňezreagované aldehydové skupiny boli nakoniec pred filtráciou na géle redukované pridaním 20 mg bórohydridu sodíka.

Konjugát polysacharidu a tetanového toxoidu bol odele- . ný od polysacharidových fragmentov filtráciou na géle použitím kolóny Bio-Gel A a PBS ako elučného činidla. Eluát s obsahom konjugátu bol dialyzovaný proti destilovanej vode a získaný materiá bol lyofilizovaný. Konjugáty N-acylovaného GBMP a tetanového toxoidu obsahoval typicky 12 až 20 % kyseliny sialovej stanovením rezorcinolovou metódou podľa publikácie Svennrholm L., Quantiative Estimation of Sialic Acids, II A Colorimetric Recorcinol-Hydrochloric Acid Method, Biochim. Biophys. Acta 24, 604, 1957. Tým je dokázané,že molárny pomer polysacharidu a tetanového toxoidu v konjugáte je 2 až 3 : 1.

Príklad 3

Tento príklad opisuje všeobecný postup tvorby komplexu konjugátu polysacharidu a bielkoviny s pomocnou látkou typu aminokyseliny alebo esteru peptidu s dlhým alkylovým reťazcom .

Pomocná látka typu alkylesteru s dlhým reťazcom sa rozdrví a preosej e,príslušné množstvo sa odváži do fľaštičky, tak aby koncentrácia suspenzie po pridaní roztoku chloridu sodného s 10 mM fosfátového pufru o pH 7,4 bola 1 až 2 mg zlúčeniny/ml. Suspenzia sa dôkladne premieša a potom sa pridá rovnaké objemové množstvo konjugátu v tom istom pufre,výsledná zmes sa opatrne pretrepáva 16 hodín pri teplote 4° C. Po vytvorení komplexu je žiadúce zistiť množstvo konjugátu tvoriaceho komplex s pomocnou látkou. Z toho dôvodu sa suspenzia odstredí a koncentrácia konjugátu v supernatante sa stanoví podľa publikácie Lowry a ďalší, J. Biological Chemistry, 193, ₄ 269 - 275, 1951, čím sa získa množstvo neviazeíného konjugátu.

V prípade, že je viazané 30 až 90 % konjugátu, ide o dobrú tvorbu komplexu medzi pomocnou látkou a konjugátom. Pri imunizačných pokusoch bol použitý tak viazaný, ako aj neviazaný konj ugát.

Príklad 4

V tomto príklade je dokázaný pomocný účinok niekoľkých esterov s dlhším reťazcom s 18 uhlíkovými atómami na vakcínu obsahujúcu polysacharid z meningokokov a tetanový toxoid.

M

.. Biele myši samice kmeňa CF1 vo veku 8 až 10 týždňov boli imunizované pomocou intraperitoneálnej injekcie obsahujúcej asi 15 mikrogramov konjugátu na jedno pokusné zviera, t. j. približne 3 mikrogramy polysacharidu v dňoch 0, 14 a 28.

Myšiam bola odobratá krv v 39. dni srdcovou punkciou.Celkový objem imunizačnej injekcie bol vždy 0,2 ml v prípade prítomnosti pomocnej látky, ako aj pri jej neprítomnosti u kontrolných myší.

Polysacharidy z meningokokov boli konjugované na toxoid ako na nosič reduktívnej animácie, ako už bolo hore uvedené. Polysacharid meningokokov skupiny B, chemicky modifikovaný, bol tiež pripravený hore uvedeným spôsobom.

Koncentrácia protilátok v krvnom sére bola stanovená enzymatickou imunologickou skúškou nasledujúcim spôsobom: na polystyrénové dosky s 96 vyhlneninami (Corning) bol nanesený povlak konjugátu príslušného kapsulárneho polysacharidu a sérového albumínu dobytka v roztoku chloridu sodného s 10 mM fosfátového pufru o pH 7,4 v koncentrácii 1 mikrogram/vyhĺbeninu, inkubácia trvala 1 hodinu pri teplote 37° C. Potom boli dosky blokované 1 hodinu pri teplote 37° C pôsobením 0,1% sérového albumínu dobytka v tom istom pufre. Následne boli platne zliate a štyrikrát umyté roztokom chloridu sodného s fosfátovým pufrom a s obsahom 0,05% zmáčadla Tween 20 (PBST). Prázdne vyhlbeniny boli vyplnené skúmanou vzorkou, ktorá bobola inkubovaná 1 hodinu pri teplote miestnosti. Po päťnásobnom premytí PBST bol do každej vyhlbeniny pridaný konjugát kozej protilátky IgG (H + L) proti myšiemu tkanivu, značený peroxidázou v riedení 1/200 v PBST a dosky boli inkubované pol hodiny pri teplote miestnosti. Po ďalšom päťnásobnom premytí PBSR bol do každej vyhlbeniny pridaný tetrametylbenzidín a dosky boli inkubované 10 minút pri teplote miestnosti. Enzymaticky katalyzovaná reakcia bola zastavená IM kyselinou fosforečnou a následne bola odčítaná v každej vyhlbenine absorbancia pri 450 nm odčítacím zariadením (Biotek). Titer protilátky je prevrátená hodnota riedenia vzorky, pri ktorom bola dosiahnutá absorbancia 1,0. Titer sa vyjadruje ako pomer vzhľadom ku kontrole bez pomocnej látky. Získané výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 1, v nej sa uvádza odpoveď vo forme protilátok po podaní vakcíny s konjugátom polysacharidu miningokokov v prítomnosti esterov s 18 atómami uhlíka. Titer je uvedený ako pomer množstva protilátky k protilátke v neprítomnosti pomocnej látky (kontrola s vakcínou typu konjugátu v chloride sodnom s pufrom).

TABUĽKA 1 pomocná látka konjugát z meningokokov

	A	B* x	C
kontrola (PBS)	1,0	1,0	1,0
oktadecyltyrozín 0,5 mg/ml	3,5	1,3	1,9
1,0 mg/ml	3,7	1,9	3,2
oktadecyltyrozylglycín 0,5 mg/ml	3,0	1,8	1,9
N-glycyletanolamin 0,5 mg/ml	1,0	1,5	1,0
oktadecyllyzín 1,0 mg/ml	N.D.	1,3	1,8
oktadecylforpenicín 1,0 mg/ml	N.D.	1,9	1,8

N.D = nebolo stanovené ^x = butanoyl.

Výsledky uvedené v tabuľke 1 dokazujú, že estery s dlhým reťazcom majú pomocný účinok pri podávaní konjugátu bakteriálneho polysacharidu a tetanového toxoidu.Tento účinok záleží od typu použitého esteru a tiež na type bakteriálneho polysacharidu. Ide o špecifický fenomén, ako je možné preukázať porovnaním účinku oktadecyltyrizínu a N-glycyletanolamin-O-stearátu v konjugáte z materiálu z meningokokov skupiny A a C.

Príklad 5

V tomto príklade je ukázaná zmena izotopu, ku ktorej dochádza pri prechode z vakcíny bez pomocného činidla k vakcíne s pomocným činidlom a konjugátom polysacharidu z meningokokov a tetanového toxoidu.

Imunizácia bielych myší kmeňa CF1 bola vykonaná a sérum bolo získané spôsobom podľa príkladu 4. Polystyrénové dosky s 96 vyhĺbeninami (Corning) boli potiahnuté konjugátom príslušného polyacharidu z meningokokov a sérového albumínu dobytka v roztoku chloridu sodného s 10 mM fosfátovým pufrom o pH 7,4 tak ako bolo opísané v príklade 4. Dosky boli blokované 1 hodinu pri teplote 37° C a potom pol hodiny pri teplote miestnosti 2,5% odstredeným mliekom v roztoku chloridu sodného s fodfátovým pufrom.

Po štvornásobnom premytí PBST boli pridané vzorky na analýzu izotopu a dosky boli ponechané 1 hodinu pri teplote miestnosti. Po päťnásobnom premytí PBST bola do každej vyhĺbeniny pridaná špecifická sonda králičích protilátok proti myšiemu tkanivu (Bio-Rad Laboratories) a dosky boli inkubované ešte 1 hodinu pri teplote miestnosti. Po ďalšom päťnásobnom premytí PBST bol pridaný peroxidázou značený konjugát protilátky proti králičiemu tkanivu IgG (H + L), 1/3000 v PBST a dosky boli ešte pol hodiny inkubované pri teplote miestnosti. Po ďalšom päťnásobnom premytí PBST bol do vyhĺbenín pridaný tetrametylbenzidín a dosky boli inkubované 6 minút pri teplote miestnosti a potom bola reakcia zastavená pridaním IM kyseliny fosforečnej. Absorbancia pri 450 nm bola v každej vyhĺbenine odčítaná pomocou odčítacieho zariadenia (Biotek). Titer protilátok je prevrátená hodnota riedenia vzorky, násobená absorbanciou. Titry sú vyjadrené ako pomery k hodnote získanej pre kontrolu bez pomocnej látky. Získané výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 2.

V tabuľke 2 sa uvádza variacia izotopu v odpovedi na konjugáty materiálu z meningokokov A a C. Titry sú uvedené ako pomer množstva vytvorenej protilátky v prítomnosti a v neprítomnosti pomocnej látky u kontrolných vzoriek, ktoré obsahujú iba vakcínu vo forme konjugátu v chloride sodnom s obsahom titru. Koncentrácia pomocnej látky bola 0,5 mg/ml.

TABUĽKA 2 pomocná látka imunoglobulin (meningokokov A)

	IgGl	IgG2a	IgG2b	IgG3	IgM
kontrola (PBS)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
oktadecyltyrozín	2,6	5,7	4,3	4,4	3,4
oktadecyltyrozylglycín	1,6	3,9	3,6	2,6	1,6
N-glycyletanolamin-
-0-stearát	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0

pomocná látka	imunoglobín	(meningokokov)
IgGl	IgG2a	IgG2b	IgG3	IgM
kontrola (PBS)	1,0	1,0	1,0	1,0 .	1,0
oktadecyltyrozín	2,1	5,2	2,3	4,3	1,7
oktadecyltyrozylglycín	2,1	2,9	1,9	2,9	1,7
N-glycyletanolamin-
-O-stearát	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0

Výsledky v tabuľke 2 ukazujú, že estery s dlhým reťazcom majú vplyv na distribúciu izotopu a to v priaznivom zmysle. Je to tiež zrejmé z vyjadrenia pomeru izotopov IgG2a/IgGl, tento pomer je 2,2 pre skupinu A a 2,5 pre skupinu C v prítomnosti oktadecyltyrozínu ako pomocnej látky.

Príklad 6

V tomto príklade je ukázané, že zvýšená odpoveď protilátok na prítomnosť pomocnej látky typu esteru s dlhým reťazcom má kladný biologický účinok, to znamená, že chráni proti infekcii živými patogénnymi baktériami.

Imunizácia bielych myší kmeňa CF1 bola vykonávaná rovnakým spôsobom ako v príklade 4. V 40. deň po intraperítoneálnej injekcii bolo myšiam tiež intraperitoneálnou injekciou podané približne 2000 mikroorganizmov N.meningitidis B, serotyp 2b, kmeň 80165. Po piatich hodinách bola myšiam odobraná krv a bol stanovený počet ostávajúcich živých baktérií ako jednotiek schopných vytvoriť kolónie, CFU/ml. N-propionyl- a N-butanoylpolysacharidy s meningokokov skupiny B boli pripravené reakciou de-N-acetylovaného polysacharidu s príslušným anhydridom kyseliny, ako už bolo hore opísané. Získané výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 3.

V tabuľke 3 je uvedená ochrana myší použitím konjugátu tetanového toxoidu TT a N-propionyl, NPr- a N-butanoyl, NBu-modifikovaného polysacharidu z meningokokov skupiny B, ako pomocná látka bol použitý oktadecyltyrozylglycín v koncentrácii 0,75 mg/ml.

imunogén

CFU/ml počet bakteremických myší

	1)	pomocná látka	3584	5/5
	2)	NPr- polysacharid	2664	5/5
• 1	3)	NPr-polysacharid, konjugát s TT	640	4/5
í	4)	NP.r - polysacharid , konj ugát s TT + pomocná látka	0	0/5
	5)	NBu-polysacharid, konjugát s TT + pomocná látka	296	1/5

Výsledky uvedené v tabuľke 3 ukazujú, že vakcína obsahujúca konjugát polysacharidu a pomocnú látku poskytuje najlepšiu ochranu. Je tiež zrejmé, že samotná pomocná látka je úplne neúčinná.

Claims (2)

1. PATENTOVÉ n'á ROKY ίι .Ο·Β

   1. Vakcína obsaujúca konjugát bakteriálneho polysacharidu a bielkoviny a účinné množstvo aspoň jednej pomocnej látky všeobecného vzorca kde

   C znamená atóm vodíka, zvyšok aminokyseliny alebo zvyšok peptidu

   D znamená atóm vodíka alebo kyselinu prijateľnú z farmaceutického hľadiska, alebo octovej kyseliny,

   E znamená 4-hydroxybenzyl, benzyl, 4-hydroxyfenyl,fenyl,

   4-aminobutyl, izopropyl, metyl, atóm vodíka alebo zvytok prírodné sa vyskytujúcej aminokyseliny,

   A znamená skupinu (CH2)_n, kde n znamená celé číslo

   1 až 4, atóm kyslíka alebo skupinu CH2O,

   B znamená skupinu (CH2)_n, kde n má hore uvedený význam, alebo atóm kyslíka,

   R znamená alkyl s 12 až 20 atómami uhlíka, za predpokladu, že A a B neznamenajú súčasne skupinu (CH2)_n v hore uvedenom význame alebo atóm kyslíka.
2. 2. Vakcína podľa nároku 1, v ktorej pomocná látka obsahuje aminokyselinu v konfigurácii L.

   3. Vakcína podľa nároku 1, v ktorej pomocná látka obsahuje aminokyselinu v konfigurácii D. 4. Vakcína podľa nároku 1, v ktorej pomocná látka obsahuje zmes aminokyselín v konfiguráciách D a L. 5. Vakcína podľa nároku 1, v ktorej E v pomocnom prostriedku sa volí zo skupiny 4-hydroxybenzyl, benzyl, 4-hydroxyfenyl, fenyl alebo atóm kyslíka. íl .í 6. Vakcína podľa nároku 5, v ktorej E v pomocnej látke s m znamená 4-hydroxybenzyl. 7. Vakcína podľa nároku 1, v ktorej C v pomocnej látke znamená atóm vodíka, zvyšok aminokyseliny alebo zvyšok peptidu obsahujúceho až 10 zvyškov aminokyselín. 8. Vakcína podľa nároku 7, v ktorej v pomocnej látke peptidový zvyšok obsahuje dva alebo tri zvyšky aminokyselín. 9. Vakcína podľa nároku 7, v ktorej C v pomocnej látke znamená aminokyselinu a ide teda o tyrozylglicin, glycylglycín, glycyltyrozín a fenylalanylglycín. J 10. Vakcína podľa nároku 8, v ktorej C v pomocnej látke znamená dipeptid a ide teda o tyrozylglycylglycín alebo tyrozylalanylglycín. 11. Vakcína podľa nároku 1, v ktorej sa kyselina, prijateľná z farmaceutického hľadiska vo význame D v pomocnej látke volí zo skupiny kyselina chlorovodíková,, brómovodíková, fosforečná, sírová, vínna, mliečna alebo octová. 12. Vakcína podľa nároku 1, v ktorej pomocná látka obsahuje alfa-aminokyselinu.

   13. Vakcína podľa nároku 1, v ktorej je; bakteriálny polysacharidpolypeptid viazaný na biologický nosič,

   14. Vakcína podľa nároku 13, obsahujúca nosič zo skupiny tetanový toxoid, záškrtový toxoid, bezbunečná vakcína proti pertussi LPF, skrížené reagujúci materiál CRM alebo bakteriálna bielkovina.

   15. Vakcína podľa nároku 14, v ktorej je ako nosič typu CRM obsiahnutý CRM^gy.

   16. Vakcína podľa nároku 1, v ktorej sa bakteriálny polysacharid volí zo skupiny kapsulárnych polysacharidov, lipopolysacharidov a subkapsulárnych povrchových polysachridov.

   17. Vakcína podľa nároku 16, v ktorej sa kapsulárny polysacharid izoluje zo skupiny mikroorganizmov Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Salmonella typhi, Escherichia coli a Staphylococcus aureus.

   18. Vakcína podľa.nároku 16, v ktorej lipopolysacharid izolovaný zo skupiny mikroorganizmov Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi a Pseudomonas aeruginosa.

   19. Vakcína podľa nároku 1, v ktorej sa kapsulárny polysacharid volí zo skupiny polysacharidového antigénu streptokokov zo skupiny A,B a C alebo z polysacharidového antigénu Streptococcus pneumoniae.

   20. Vakcína podľa nároku 1, obsahujúca ako pomocnú látku ester alkylalkoholu s 14 až 20 atómami uhlíka a aminokyselinu, dipeptid alebo tripeptid.

   21. Vakcína podl'a nároku 20, obsahujúca ako pomocnú látku, oktadecyltyrozín.

   22. Vakcína podľa nároku 20, obsahujúca ako pomocnú látku oktadecyltyrozín.

   23. Spôsob vyvolania imunologickej odpovede, vyznačujúci sa tým, že sa podá terapeuticky účinné množstvo vakcíny podľa nároku 1 .

   ·' ' 24. Spôsob podľa nároku 23, vyznačuj ú c i sa t v m, že vakcína sa podáva nítr osvalovo, nitrokožne. podkožné alebo nosnou sliznicou.

   25. Spôsob podľa nároku 23, vyznačuj ú c i sa t ý m, že podaním vakcíny sa v podstate nezvýši hladina protilátky IgE, avšak zvýši sa pomer IgG2a k IgGl .

   26. Spôsob výroby vakcíny podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m, že sa ku. konjugátu bakteriálneho polysacharidu a bielkoviny pridá pomocná látka podľa nároku 1 v množstve dostatočnom na výrobu imunologický účinnej vakcíny.