HUT64237A

HUT64237A - Improved vaccina preparatives

Info

Publication number: HUT64237A
Application number: HU9300746A
Authority: HU
Inventors: Christopher L Penny; Francis Michon; Harold J Jennings
Original assignee: North American Vaccine Inc
Priority date: 1990-09-17
Filing date: 1991-09-12
Publication date: 1993-12-28
Also published as: HRP920874A2; FI931169A; ZA917356B; YU153291A; AU8441991A; EP0549617A1; CN1060408A; WO1992004915A1; BR9106853A; MX9101077A; CS283991A3; IS3753A7; EP0549617B1; IE913261A1; NO930938L; CA2090673A1; JPH06500772A; CZ42993A3; DE69118389T2; DK0549617T3

Description

A találmány javított immunogén tulajdonságú vakcina készítményekre vonatkozik. Közelebbről, a találmány szerinti készítmények protein hordozóhoz kovalensen kötött bakteriális poliszacharidot tartalmaznak, egy hosszú szénláncú alkil-vegyülettel kombinációban. Mind a hordozó, mind az alkil-vegyület adjuvánsként funkcionál.

Ismeretes, hogy a betegségek megelőzésében a vakcináknak nagy jelentőségük van. A vakcinák úgy működnek, hogy a gazdaszervezetet egy idegen anyag hatásának teszik ki, amelyet úgy választanak meg, hogy az immunrendszert aktiválva a gazdának az anyag ellen immunitást biztosítson, anélkül, hogy a gazdát a fertőzés veszélyének kitennék. Jelenleg mintegy 20 vakcina van kereskedelmi forgalomban. Ezen vakcinák többségét a kórokozó organizmus vagy annak egy része detoxifikálásával, vagy az organizmus egy specifikus, nem-toxikus részének izolálásával állítják elő. Az utóbbira jól ismert példa a meningococcus és pneumococcus baktériumok tok-poliszacharidjának izolálása a bakteriális meningitis és pneumonia elleni vakcina alapanyagának előállítására. Azonban a poliszacharid-vakcinák gyenge immunogének, amelyek hatására nem termelődik megfelelő mennyiségű védő hatású antitest a gyengén fejlett vagy hibás immunrendszerrel rendelkező egyedekben. Az utóbbiak közé tartoznak a gyerekek, az idősek és az autoimmun betegségben szenvedők. Ezenkívül a keletkezett immunválasz T-dependens vagy nem memória-rezidens, ami azt jelenti, hogy az egyedben emlékeztető injekció hatására nem fog kifejlődni megnövekedett antitest-válasz szerokonverzióval. A T-sejt dependencia az IgG

- 3 ·· ·· • · · · • · · • · · ···· ·· • · · · ···· ···· • ··· ··· • ··· antitestek és a memóriasejtek indukciója szempontjából szükséges. így szerokonverzióval mind IgM, mind IgG antitestek képződnek ismételt vakcina-injekciók hatására. Ezenkívül az antitest-válasz nagysága minden egyes vakcina-injekcióval növekedik, ha a válasz T-dependens. A poliszacharid-vakcinák immunológiáját Jenning és munkatársai foglalták össze [The Polysaccharides, szerk. G.O. Aspinall, 1. kötet, 291-329. oldal (1982)].

A poliszacharid megfelelő protein-hordozóval való konjugálása vagy kovalens kötése annyiban javítja az immunfunkciót, hogy T-dependens vagy memória-rezidens válasz alakul ki. 1987 decemberében engedélyezték az első konjugált vakcinát humán alkalmazásra az Amerikai Egyesült Államokban. Ez H. influenzáé b tok-poliszacharidot tartalmazott diftéria toxoid hordozó proteinnel kovalensen konjugálva. A vakcinát 18 hónapos gyermekek számára engedélyezték, mivel a kereskedelmi forgalomban lévő poliszacharid vakcina hatékonysága ebben az életkorban korlátozott volt. Az Amerikai Egyesült Államokban nemrégen engedélyeztek egy másik H. influenzáé b konjugált vakcinát is, amelyben a konjugáció kémiája eltérő.

A poliszacharid és poliszacharid-protein konjugált vakcinák tisztábbak és ezért biztonságosabbak, mint a klaszszikus teljes baktérium vagy vírus vakcinák, amely utóbbiak gyakran toxikus melléktermékekkel szennyezettek, még akkor is, ha a teljes baktériumot vagy vírust vegyszerekkel, hővel vagy genetikus gyengítéssel biokémiailag detoxifikálták. Azonban a poliszacharidok és poliszacharid-protein konjugátumok nagyobb tisztasága miatt - ami gyakran azt jelenti, hogy «··· ··· ··· • · · · · · • · · · · · · • · · ···· ···· •··· ·· · · a természetes immunstimulánsokat eltávolították - ezen új vakcinák immunogén tulajdonsága gyakran nem optimális. A természetes immunstimulánsok közé tartoznak a bakteriális komponensek, például lipopoliszacharid, lipoprotein és muramil-dipeptid; ezek mindegyike toxikus. Ezenkívül a protein-hordozó is toxikus lehet bizonyos mértékben, ezért a lehető legkisebb mennyiségben kell alkalmazni. Például a diftéria toxoidot és az azzal rokon CRM 197 molekulát ismert módon hordozó molekulaként alkalmazzák humán célokra használt konjugált vakcinák előállítására. A felnőttek azonban lokális vagy generális túlérzékenységi reakciót mutathatnak ezekkel a hordozó molekulákkal szemben. A fenti hatások elkerülésére a vakcinákat adjuvánsokkal kombinálva alkalmazzák fokozott antitest-képződés kiváltása céljából. Az adjuvánsok a vakcinára válaszként képződő antitest típusának befolyásolására is lehetőséget nyújtanak. így például annak ellenére, hogy egy poliszacharid-protein konjugátum vakcinával végzett immunizálás hatására szerokonverzió, majd IgG antitest képződés megy végbe, a válasz elsődlegesen IgGl lesz egérben.

Az IgG2a antitest képződésének fokozása előnyös lenne, mivel az utóbbi a leghatékonyabb egér antitest a komplement aktiválását tekintve. A komplement útvonal jelentős védelmi mechanizmust biztosít sok bakteriális fertőzés ellen.

A forgalmazható adjuvánsokat tekintve jelenleg csak alumínium- és kalcium-sókat alkalmaznak adjuvánsként. Azonban az alumínium- és kalcium-sók nem erős adjuvánsok. A kalcium-sókat csak korlátozott mértékben alkalmazzák. Noha az alumínium-sók alkalmazása szélesebb körű az egyéb vakcinák- 5 bán, a poliszacharid-protein konjugátum vakcinákban való alkalmazásuk kevésbé sikeres. Ténylegesen kimutatták, hogy az alumínium-hidroxid gátolja a H. influenzáé b poliszacharid-tetanusz toxoid konjugátum vakcinára adott antitest-választ [J.B. Robbins és munkatársai, J. Pediatrics 112, 695702 (1988)]. J.B. Robbins és munkatársai az antitest-válasz hasonló gátlását tapasztalták S. typhi poliszacharid-kolera toxin konjugátum vakcina és alumínium-hidroxid esetén is [J. Experimental Medicine 166, 1510-1524 (1987)]. Ezenkívül az alumínium-sók hatására átmeneti vagy krónikus helyi granulómák is keletkezhetnek az injekció beadásának helyén; L.H. Collier [Láncét 1354-1367 (1987)] azt állítja, hogy a tetanusz toxoid vakcinákkal szembeni reakciók gyakorisága és súlyossága az alumínium adjuváns jelenlététől függ. Az alumínium adjuváns preparátumok nem mindig reprodukálhatók. Ezenkívül maga az alumínium is képes stimulálni az azonnali túlérzékenységi reakciók mediálásáért felelős IgE antitestek keletkezését [T. Matuhasi és munkatársai, J. Infectious Disease 146, 192 (1982)].

Az utóbbi években a figyelem a szerves vegyületek adjuvánskénti alkalmazására összpontosult. Csak néhány szerves vegyület funkcionál a kereskedelmi forgalomban lévő alumínium-sókhoz hasonló módon, azaz mint lassú felszabadulást biztosító hordozóanyag vagy antigén (vakcina) depó, amikoris az antigén az injektálás helyén viszonylag hosszú idő alatt válik szabaddá.

A fenti szerves vegyületek közé tartoznak például a szerves felületaktív szerek és emulgeátorok, mint például a ·· ·· · 9 ···« • · · · · · · • · · ···· ···· · ······ · « ·· ·

- 6 Pluronics és a Tetronics, amelyek a poli(oxi-etilén) és poli(oxi-propilén) nemionos blokk-kopolimerjei (gyártja a BASF Corporation). Az ilyen lassú felszabadulási mechanizmussal működő adjuvánsok humán alkalmazása régóta elfogadott, mivel csökkentik az immunrendszer túlstimulálásának lehetőségét. Az immunrendszer túlstimulálása autoimmun-válaszhoz vezethet, ami egy erős immunstimuláns, például a Freund-féle adjuváns alkalmazása esetén előfordulhat. Ezért a lassú felszabadulást biztosító mechanizmus előnyös.

Noha a szerves adjuvánsok többsége erős immunstimulánsnak bizonyult, az ilyen nagy aktivitású adjuvánsok gyakran toxikusak, és ezért humán alkalmazásra nem fogadhatók el. Az erős immunstimuláns hatású ismert szerves adjuvánsok közé tartozik például a Freund-féle komplett adjuváns és a muramil-dipeptid. Mindkét fenti vegyület csak állatkísérletekben alkalmazható, toxicitási megfontolások miatt. Az alumínium-sókat utánzó szerves adjuvánsok többsége toxikusabb, mint az alumínium-sók. így például a D. Gall által ismertetett hosszú szénláncú alkil-aminok toxikus vegyületek, amelyek általában a sejtmembrán szerkezetét roncsolják [Immunology 11, 369-386 (1966)].

Ismert, hogy a tirozin oktadecil-észtere adjuváns. Minimális immunstimuláns aktivitással rendelkezik, de - ahelyett, hogy az alumínium adjuvánsok szerves ekvivalenseként funkcionálna - lassú felszabadulást biztosító hordozóként működik. Ez azt jelenti, hogy az antigének az oktadecil-tirozinnal komplexet képeznek, majd az oldhatatlan adjuvánsról azután lassan felszabadulnak vagy deszorbeálódnak.

·· ·· ♦ · ···· • · · · * · · • · · ··«· ···· · ···< ·♦ « · ···

- 7 Az antigén és az adjuváns közötti komplexálódást számos gyenge, nem-kovalens erő, például hidrofób kölcsönhatások és hidrogén-hidak biztosítják.

A fenti jelenséget Overell a 4,428,932 és Moloney a 4,258,029 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismerteti. Overell leírta, hogy az oktadecil-tirozin adjuvánsként funkcionál az allergia deszenzitizációs terápiájában, ha allergénekkel, például rozs, fű vagy pollen extraktummal komplexáljak. Moloney és munkatársai leírták, hogy az oktadecil-tirozin adjuvánsként működik, ha tetanusz toxoiddal és formaiinnal inaktivált I-es, ΙΙ-es vagy III-as típusú poliomyelitis vírussal komplexálják. Ezt a jelenséget A. Nixon-George és munkatársai is ismertették [J. Immunoi. 144, 4798-4802 (1990)], akik szerint az oktadecil-tirozin és az egyéb aromás aminosavak oktadecil-észterei adjuvánsként funkcionálnak egy kifejlesztés alatt álló, hepatitis B elleni vakcinában, rekombináns hepatitis B felületi antigénnel komplexálva.

A fentieknek megfelelően tehát szükség van olyan nem toxikus, bakteriális poliszacharid-protein konjugátum vakcina - adjuváns készítmények kifejlesztésére, amelyek jobb immunogén tulajdonságokkal rendelkeznek.

A találmány szerinti javított vakcina készítmények nem-toxikus, bakteriális poliszacharid-protein konjugátum vakcinát és nem-toxikus, hosszú szénláncú alkil-adjuvánst tartalmaznak.

A találmány egyrészt vakcina készítményre vonatkozik, amely egy nem-toxikus, bakteriális poliszacharid-prote• ·«· • * ··«·»···· · ···· ·· · · ···

- 8 in konjugátumot és adjuvánsként egy nem-toxikus, hosszú szénláncú alkil-vegyületet tartalmaz olyan mennyiségben, amely képes a poliszacharid-protein konjugátum immunogén tulajdonságát felerősíteni.

A találmány további tárgya eljárás immunválasz kiváltására melegvérű állatokban, beleértve az embert is, oly módon, hogy a gazdaállatnak a találmány szerinti vakcina készítményt adagoljuk hatásos mennyiségben.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy bizonyos nemtoxikus, hosszú szénláncú alkil-vegyületek, közelebbről az aminosavak vagy peptidek észterei képesek komplexálódni poliszacharid-protein konjugátum vakcinákkal. A fenti komplexálódás következtében a hosszú szénláncú alkil-vegyületek lassú felszabadulást biztosító hordozóként funkcionálnak, azaz a hosszú szénláncú alkil-vegyületekből hosszabb idő alatt szabadul fel a konjugátum vakcina a gazdaállatban. Ez megnövekedett antitest-választ eredményez, ahhoz képest, amit a konjugátum vakcina önmaga idéz elő. Mint fentebb említettük, a fenti adjuváns mechanizmus azonos az alumínium—sók és nem konjugátum vakcinák esetén tapasztalttal. Azonban azt is említettük, hogy az alumínium-sók többsége adjuvánsként hatástalan a bakteriális poliszacharid-protein konjugátum vakcinákban. így nem volt várható, hogy a találmány szerinti hosszú szénláncú alkil-vegyületek ugyanolyan adjuváns mechanizmussal adjuvánsként funkcionálnak konjugátum vakcinákban. Ezért még inkább meglepő, hogy a nem-toxikus hosszú szénláncú alkil-vegyületek hatására javul a konjugátum vakcinák immunogenitása.

·· ·♦ « · ··«· • · « a · « 4 • · · a··· ···· * *· ··»· ·· e · ·»«

- 9 A találmány értelmében azt is tapasztaltuk, hogy a nem-toxikus hosszú szénláncú alkil-vegyületek, mégpedig az aminosavak vagy peptidek hosszú szénláncú alkil-észterei adjuvánskénti jelenléte befolyásolja a konjugátum vakcinára válaszként képződött antitest izotípusát. Közelebbről, az IgG2a antitest IgGl antitesthez viszonyított aránya nagyobb az adjuváns nélkül megfigyelhető arányhoz viszonyítva, mégpedig úgy, hogy mindkét antitest-izotípus koncentrációja magasabb lesz, ha a konjugátum vakcinákat a találmány szerinti hosszú szénláncú alkil-adjuvánsokkal együtt alkalmazzuk. Az arány növekedése előnyös, mivel az IgG2a antitest igen jelentős, tekintve, hogy ez a leghatásosabb egér antitest a komplement aktiválása, az antitest-dependens celluláris citotoxicitási mechanizmus, és a tumorok és paraziták elleni védelem szempontjából.

A hosszú szénláncú alkil-vegyületek adjuváns hatása az antitest-válasz fokozását és módosítását (azaz az izotípus megváltoztatását) tekintve szintén meglepő, ha a hordozó protein szerepét tekintjük, mivel a konjugátum vakcinában a hordozó protein feladata az antitest-válasz fokozása és módosítása .

Ezért az alumínium adjuvánstól eltérően a hosszú szénláncú alkil-vegyület is javítja a hordozó funkciót.

A hosszú szénláncú alkil-vegyület előnyösen egy aminosav vagy peptid pozitív töltésű észtere, közelebbről, egy aminosav, egy dipeptid vagy egy tripeptid 14-20 szénatomos alkohollal képzett észtere.

A találmány szerinti készítményekben alkalmazott ·· bakteriális poliszacharid-protein konjugátum képes a gazdában immunválasz kiváltására. A leírásban bakteriális poliszacharid alatt tok-poliszacharidokat, lipopoliszacharidokat és egyéb, tokon kívüli (felületi) poliszacharidokat értünk. Közelebbről, jelenleg a patogén baktériumokból származó tokpoliszacharidok használhatók leginkább hatásos konjugátum vakcinák előállítására. A fenti tok-poliszacharidok közé tartoznak például a Haemophilus influenzae-ból, a Neisseria meningitidisből, a Streptococcus pneumoniae-ből, a Streptococcus agalactiae-ből, a Salmonella typhiből, az Escherichia coliból és a Staphylococcus aureusból izoláltak. A lipopoliszacharidokra példaként említjük a Neisseria meningitidisből, az Escherichia coliból, a Salmonella typhiből és a Pseudomonas aeruginosaból izoláltakat. Az egyéb, tokon kívüli poliszacharidok közé tartozik az A, B és C csoportba tartozó streptococcusok közönséges poliszacharid antigénje (c-anyag) és a Streptococcus pneumoniae közönséges poliszacharid antigénje (c-anyag).

Az alábbi példákban ismertetjük a jelentősen eltérő kémiai szerkezetű poliszacharidokat tartalmazó konjugátumokkal, mégpedig az A csoportba tartozó meningococcus poliszachariddal (N-acetil-mannózamin-6~foszfát homopolimerje) , a B csoportba tartozó meningococcus poliszachariddal (2->8) kötésű N-butanoil-neuraminsav homopolimerje] és a C csoportba tartozó meningococcus poliszachariddal (2->9) kötésű N-acetil-neuraminsav homopolimerje] végzett kísérleteket. Magától értetődő azonban, hogy találmányunkat nem kívánjuk a példaszerűen bemutatott Meningococcus konjugátumokra korlátozni, oltalmi körünk az egyéb, fent ismertetett bakteriális poliszacharidokat tartalmazó konjugátumokat is magában foglalja.

A találmány szerinti konjugátumokban alkalmazott bakteriális poliszacharidok szokásos izolálási eljárásokkal egyszerűen előállíthatok.

A hordozó molekulák - amelyekhez a bakteriális poliszacharidokat konjugáljuk vagy kovalensen kötjük - proteinek. Állatokban való alkalmazásra hordozóként előnyösen marha szérumalbumint és fúrócsiga hemocianint alkalmazunk. Humán alkalmazásra hordozóként megfelelnek a tetanusz toxoid, diftéria toxoid, acelluláris pertussis vakcina (LPF toxoid) , térhálósított anyagok (CRM-ek) - amelyek antigén szempontból hasonlóak a bakteriális toxinokhoz, de mutáció útján nem toxikusak, a fenti anyagok egyik előnyös képviselője a CRM 197, amelyet Peppenheimer és munkatársai eljárása szerint állíthatunk elő [Immunochemistry 9, 891-906 (1972)] -, és az egyéb bakteriális protein hordozók, például a meningococcus külső membrán protein. Előnyösen maga a hordozó protein is immunogén.

A poliszacharidot bármely ismert eljárással kovalensen kapcsolhatjuk a hordozóhoz. A találmány értelmében alkalmazhatunk szimmetrikus linkereket - például adipinsav-dihidrazidot [J.B. Robbins és munkatársai, J. Experimental Medicine 152, 361-376 (1980)] - vagy heterobifunkcionális linkereket - például N-szukcinimidil-3-(2-piridil-ditio)-propionátot [J.B. Robbins és munkatársai, Infection and Immunity 56, 2292-2298 (1988)] előnyösen azonban nem alkalmazunk linkért, hanem a poliszacharidot közvetlenül kötjük a prote·· »··. t · ···· • · · · · · V • · · « · * · ... .:.. ·..· ··:· ··;· ...·

- 12 in hordozóhoz, reduktív aminálási eljárással [H.J. Jennings és munkatársai, J. Immunology 127, 1011-1019 (1981)].

A bakteriális poliszacharid mérete - amelyet átlagos móltömegként adunk meg - változó, és attól függ, hogy milyen baktériumból származik, valamint attól, hogy a poliszacharidot milyen eljárással kapcsoljuk a hordozóhoz. Ennek megfelelően móltömege 1000 (10³) dalton és >10⁶ dalton között változtatható. Ha a kapcsolást reduktív aminálással végezzük, a poliszacharid móltömege rendszerint 5000 és 500000 dalton közötti, például 300000-500000 dalton, vagy például 5000-50000 dalton.

Az adjuváns hosszú szénláncú alkil-vegyületnek vagy bármely egyéb vegyületnek, amely abból metabolizmus során keletkezik a gazdában - nem szabad toxikusnak lennie. Ismert, hogy a természetben előforduló hosszú szénláncú zsíralkoholok nem toxikus anyagok. Például az oktadekanolt emberre nézve teljesen atoxikusnak találták, orális LD5Q értéke nagyobb, mint 15 g/kg [Gosselin: Clinical Toxicology of Commercial Products, 4. kiadás (1976)]. Az oktadeciltirozint állatokban atoxikusnak találták, és a természetes aminosavak többsége is atoxikus [C.L. Penney és munkatársai, Vaccine 4, 99-104 (1986)]. Ezért várható volt, hogy az oktadecil-tirozin és az egyéb aminosavak alkoholokkal alkotott észterei sem lesznek toxikusak az emberre.

Az adjuvánsnak vizes közegben mikrorészecskék kialakítására alkalmasnak kell lennie, amelyek mérete mintegy 150 gm - 1 mm (18 mesh - 100 mesh, előnyösen mintegy 250 gm vagy 60 mesh), hogy egységes konzisztenciájú szuszpenzió kelet·· ·· · · ···· • · · · · « · • · · · φ ν · • ♦ · ·«·· «··· · ··*· ·· · · ··« kézzen. Ezenkívül az adjuváns részecskéknek a konjugátum vakcina abszorpcióját is lehetővé kell tenniük, hogy a gazdában a konjugátum lassú felszabadulása biztosítva legyen.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint az adjuváns egy (I) általános képletű vegyület, a képletben

C jelentése hidrogénatom, aminosav-maradék vagy legfeljebb 10 aminosav-maradékot tartalmazó peptid-maradék (azaz legfeljebb dekapeptid-maradék),

D jelentése hidrogénatom vagy egy gyógyászatilag elfogadható sav, például hidrogén-klorid, hidrogén-bromid, foszforsav, kénsav, borkősav, tejsav vagy ecetsav,

E jelentése 4-hidroxi-benzil-, benzil-, 4-hidroxi-fenil-, fenil-, 4-amino-butil-, izopropil- vagy metilcsoport, vagy hidrogénatom, vagy egyéb, természetes aminosavakban előforduló maradék,

A jelentése -(CH2)_n ^-/ oxigénatom vagy -CH2O-, és

B jelentése ^-(CH2)_n“ vagy oxigénatom, ahol n értéke 0-4, azzal a megkötéssel, hogy A és B jelentése eltérő -(CH2)n“ vagy oxigénatom esetén, és

R jelentése 12-20 szénatomos alkilcsoport.

C jelentése előnyösen hidrogénatom vagy egy aminosav-maradék, dipeptid-maradék vagy tripeptid-maradék. Ha C aminosavat jelent, az adjuváns aminosav-szekvenciája például tirozil-glicin, glicil-glicin, glicil-tirozin vagy fenilalanil-glicin lehet.

Ha C jelentése dipeptid, az adjuváns aminosav-szekvenciája például tirozil-glicil-glicin vagy tirozil-alanil14 ·**· .**· · Ϊ J··· . · : í.:. ···.

···· ·· · « ··.

—glicin lehet. Ha az aminosav-maradék királis, a D-enantiomer, az L-enantiomer és ezek elegyei is alkalmazhatók. Különösen előnyösen, ha az adjuváns egy α-aminosavat tartalmaz .

E jelentése különösen előnyösen 4-hidroxi-benzil-, benzil-, 4-hidroxi-fenil- vagy fenilcsoport, vagy hidrogénatom. E legelőnyösebb jelentése 4-hidroxi-benzil-csoport.

Ha A jelentése -CH₂O- és B jelentése -(CH₂)_n-, ^{a ve}“ gyületek N-(amino-acil)-etanolamin-O-sztearátok. Ha A jelentése -CH₂O- és B jelentése oxigénatom, a vegyületek karbonátok.

Még előnyösebb, ha az adjuváns egy aminosav-észter—hidrogén-klorid, ahol C jelentése hidrogénatom, D jelentése hidrogén-klorid, A jelentése -(CH₂)_n-, n értéke 0-4, és B jelentése oxigénatom.

Legelőnyösebb, ha az adjuváns oktadecil-tirozin—hidrogén-klorid, ahol C jelentése hidrogénatom, D jelentése hidrogén-klorid, E jelentése 4-hidroxi-benzil-csoport, és R jelentése oktadecilcsoport, A jelentése -(CH₂)_n-, n értéke 0, és B jelentése oxigénatom.

Általában ha C jelentése hidrogénatomtól eltérő, az adjuváns szénlánca lényegében peptid-kötéseket tartalmaz, azaz az egyik aminosav-maradék karboxilátja közvetlenül kapcsolódik a szomszédos aminosav-maradék aminocsoportjához, fej-láb illeszkedéssel. A peptid-kötés azonban tioamid-kötés is lehet.

Az adjuvánst ismert eljárásokkal állíthatjuk elő. Az adjuváns aminosav-észter részét például számos ismert eljá• · ········· · ···· ·· · · ···

- 15 rással szintetizálhatjuk [lásd például M. Bodansky és munkatársai: Peptide Synthesis, 2. kiadás, Wiley, New York (1976); és R.W. Roeske, Peptides (N.Y.), 3, 102 (1981)]. Különösen előnyös eljárás a C. Penney és munkatársai által ismertetett metánszulfonsawal katalizált észterezés [J. Organic Chemistry 50, 1457-1459 (1985)].

Ha az adjuváns egy di- vagy tripeptid, a peptidkötéseket ismert eljárásokkal alakíthatjuk ki (például a fent idézett Peptide Synthesis c. könyvben leírtak szerint) . Ezenkívül a peptid-kötéseket szilárd vagy oldat fázisú eljárásokkal alakíthatjuk ki. Számos eljárás ismert amid-, tioamid- vagy tioészter-kötések kialakítására.

Az adjuváns előállítása során szükség lehet a reakcióképes funkciós csoportok átmeneti védésére. Az aminokat például uretán-típusú csoportokkal, az alkoholokat terc-butil- vagy benzilcsoportokkal, a savakat észtercsoportokkal védhetjük. A védőcsoportok felvitelének és eltávolításának körülményeit például a fent idézett Peptide Synthesis c. könyvben ismertetik.

Az adjuváns tisztítását bármely ismert eljárással végezhetjük. A tisztítást előnyösen szilikagélen, kromatográfiás eljárással végezzük, különösen előnyösen gyorskromatográfiás eljárást [W. Clark Still és munkatársai, J. Organic Chemistry 43., 2923-2925 (1978) ] alkalmazunk. Használhatunk azonban egyéb kromatográfiás eljárásokat, például HPLC-t is az adjuváns tisztítására. Az adjuvánst kristályosítással is tisztíthatjuk. Bizonyos esetekben egyáltalán nincs szükség tisztításra, mivel a szintézis közvetlenül • · analitikai tisztaságú termékeket eredményez.

A találmány szerinti vakcina készítményeket úgy állítjuk elő, hogy az adjuvánst a poliszacharid-hordozó protein konjugátummal megfelelő steril körülmények között fizikailag elegyítjük. A poliszacharid-hordozó protein konjugátum és az adjuváns komplexálását elősegíti a konjugátum nettó negatív töltése, amelyet elektrosztatikusán vonz az adjuváns hosszú szénláncú alkil-vegyületben jelenlévő pozitív töltés.

Az emberben immunválasz kiváltásához szükséges poliszacharid-hordozó protein konjugátum és adjuváns mennyisége egymástól kölcsönösen függ, de a hagyományos vakcinákban általában alkalmazott tartományon belül van. így például az adjuváns növekvő mennyiségeinek alkalmazása a konjugátum csökkenő mennyiségeinek alkalmazásával járhat, és fordítva. Az adjuváns mennyisége előnyösen 0,01 - 5 g/ml készítmény, például 0,05 mg/ml - 3 mg/ml, előnyösen 0,5 - 1,0 mg/ml. A konjugátum mennyisége előnyösen 1 - 100 Mg/ml, még előnyösebben 5-40 Mg/ml. A dózis a vakcinát kapó gazdától, valamint különféle faktoroktól, például a gazda méretétől, testtömegétől és korától függően változik.

A találmány szerinti vakcina készítményeket az egyéb polipeptid gyógyászati készítmények formálására alkalmazott eljárásokhoz hasonlóan állíthatjuk elő. Ennek megfelelően az adjuvánst és a konjugátumot liofilezett formában tárolhatjuk, és a beadás előtt fiziológiásán elfogadható hordozóanyaggal szuszpenzióvá rekonstituálhatjuk. Az adjuváns és a konjugátum azonban a hordozóanyagban is tárolható. Előnyös • · ·· · · ···· • · · · · · · • · ··· ·· ··· • · ········· · • · · · ·· · · ···

- 17 hordozóanyagok a steril oldatok, különösen a steril pufferoldatok, mint például a foszfáttal pufferolt sóoldat. Az adjuváns és a konjugátum kombinálására a hordozóanyagban bármely eljárás alkalmas, ha azzal a készítmény immunológiai hatékonysága az egyes komponensekhez viszonyítva növelhető.

A hordozóanyag tartalmazhat konzerválószereket vagy egyéb ismert adalékanyagokat is a tárolási stabilitás vagy az elegy hatékonysága javítására. Konzerválószerként például timerozalt alkalmazhatunk.

A találmány szerinti vakcina egyszeri dózisának térfogata változó lehet, általában a hagyományos vakcinákban szokásosan alkalmazott tartományon belül van. Az egyszeri dózis térfogata előnyösen mintegy 0,1 - 1,5 ml, még előnyösebben mintegy 0,2 - 0,5 ml a konjugátum és adjuváns fent említett koncentrációi esetén.

A találmány szerinti vakcina készítményeket hagyományos módon adagolhatjuk. Az adagolást előnyösen szubkután módon, intramuszkulárisan, intradermálisan vagy nazálisán végezzük. Az elegy egy biodiffundáló implantátűmből is felszabadulhat. Az adagolás történhet egyetlen alkalommal, de adagolhatjuk a találmány szerinti készítményeket néhány napon vagy héten keresztül is, sorozatban.

A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk ismertetni.

1. példa

A és C csoportba tartozó meningococcus poliszacharidok izolálása, preparálása és konjugálása

A poliszacharidokat az A csoport esetén a N. menin• · • · · · ··*· ···· gitidis 604 A törzs, a C csoport esetén a 2241 törzs tenyészetének extraktumából állítjuk elő. A fenti törzseket a Laboratory Center fór Disease Control (Ottawa, Ontario, Kanada) törzstenyészetéből szereztük be, és kémiailag meghatározott összetételű tápközegen tenyésztettük Kenny és munkatársai [Bull. W.H.O. 37, 569 (1957)] módszere szerint. 15 órás fermentálás után a baktériumokat 0,75 % végkoncentrációban formaiin hozzáadásával elöljük. A baktériumokat folyamatos centrifugálással eltávolítjuk és a poliszacharidokat a felülúszóból Bundle és munkatársai [J. Bioi. Chem. 249, 4797-4801 (1974)] módszere szerint izoláljuk és tisztítjuk, azzal az eltéréssel, hogy a proteint úgy extraháljuk, hogy a nyers poliszacharid oldatát hideg (4 °C-os) 90 %-os fenollal keverjük meleg (50-60 °C-os) fenol helyett. Ezzel a módosítással a poliszacharidot nagy móltömegű formában tudjuk izolálni.

A csoportba tartozó poliszacharid depolimerizálása

150 mg A csoportba tartozó, natív meningococcus poliszacharidot (átlagos móltömege 30000) 10 ml 100 mmol/1 koncentrációjú nátrium-acetát pufferben (pH 5,0) oldunk, és az oldatot 70 °C-ra melegítjük. A depolimerizáció lefolyását FPLC-vel (Pharmacia) követjük, Superose 12 gél-kizárásos kromatográfiás oszlopon, a kívánt móltömeg (12000 dalton) eléréséig. Az anyagot 4 °C-on desztillált vízzel szemben dializáljuk, majd liofilizáljuk. 13,5 mg amorf, szilárd anyagot kapunk.

A csoportba tartozó depóiimerizált poliszacharid redukálása • · · · • · · ·

100 mg A csoportba tartozó depolimerizált poliszacharidot 3 ml 200 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl pufferben (pH 7,2) oldunk, és az oldatot 0 °C-ra hútjük. A kevert oldathoz 3 óra alatt 5 x 2,5 mg nátrium-bór-hidridet adunk. Az oldat pH-ját 100 mol/1 koncentrációjú ecetsav hozzáadásával

7,5 - 7,8 értéken tartjuk. Az oldat pH-ját ezután 1 mol/1 koncentrációjú ecetsavval 5,5-re állítva elbontjuk a maradék bór-hidridet, majd a pH-t 100 mmol/1 koncentrációjú nátrium—hidroxid-oldattal 7,5-re állítjuk. Az oldatot Bio-Gel P6DG (Bio-Rad) oszlopon (1,6 x 100 cm) sómentesítjük és vízzel eluáljuk. A hézagtérfogat csúcsot összegyűjtjük és liofilizáljuk. 11,7 mg redukált terméket kapunk.

GAMP aktiválása és méret szerinti szétválasztása

110 mg A csoportba tartozó depolimerizált és redukált poliszacharidot 2 ml 50 mmol/1 koncentrációjú nátrium—perjodát-oldatban oldunk, és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül sötétben tároljuk. Ezután hozzáadunk 50 μΐ etilénglikolt, és az oldatot szobahőmérsékleten 1 órán keresztül állni hagyjuk. Az oldatot ezután Bio-Gel P6DG (Bio-Rad) oszlopon (1,6 x 100 cm) sómentesítjük és vízzel eluáljuk. A hézagtérfogat csúcsot összegyűjtjük és liofilizáljuk. 108 mg oxidált terméket kapunk. Az anyagot Bio-Gel A 0.5 oszlopon (1,6 x 100 cm; 100-400 mesh, Bio-Rad) PBS-ben méret szerint frakcionáljuk. A K_D 0,5 és 0,6 között eluálódó frakciókat [átlagos móltömeg 10000-15000, Superose 12 (HR 10/30; Pharmacia) oszlopon FPLC-vel (Pharmacia) meghatározva] összegyűjtjük, dializáljuk és liofilizáljuk.

·· ·· · · ···· • · · · · « ·

C csoportba tartozó poliszacharid oxidálása és depolimerizálása

200 mg C csoportba tartozó, natív meningococcus poliszacharidot 20 ml vízben oldunk, amelyhez 2 ml 100 mmol/1 koncentrációjú nátrium-perjodát-oldatot (200 μπιοί) adunk. A depolimerizációs reakció lefolyását FPLC analízissel követjük, az A csoportba tartozó poliszacharidra leírtak szerint. A kívánt átlagos móltömeg-tartomány elérésekor a reakciót 100 μΐ etilénglikol hozzáadásával leállítjuk, és az oldatot szobahőmérsékleten 1 órán keresztül állni hagyjuk, majd dializáljuk és liofilizáljuk.

A GCMP oxidált fragmenseinek méret szerinti szétválasztása

Az oxidált GCMP méret szerinti szétválasztását gélszűréssel végezzük, Bio-Gel A 0.5 oszlop (1,6 x 100 cm; 100400 mesh; Bio-Rad) alkalmazásával, PBS-ben. A Kq 0,5 és 0,6 között eluálódó frakciókat (átlagos móltömeg 10000-15000 a fentiek szerint FPLC-vel meghatározva) összegyűjtjük, dializáljuk és liofilizáljuk. Az így kapott GCMP fragmensek mindkét végükön aldehid funkciós csoportot tartalmaznak.

Poliszacharid konjugátumok előállítása

Az A vagy C csoportba tartozó poliszacharidok oxidált fragmenseiből 90 mg-ot 2 ml 100 mmol/1 koncentrációjú nátrium-hidrogén-karbonát pufferben (pH 8,1) oldunk, és az oldathoz 30 mg tetanusz toxoid monomert adunk. 60 mg nátrium-ciano-bór-hidrid (Aldrich, Milwaukee) hozzáadása után az oldatot 37 °C~on 4 napon keresztül inkubáljuk. A reakcióelegyet ezután közvetlenül Bio-Gel A 0.5 oszlopra (200-400 • · ···· • · · · · · · • · ··· ·· ··· • · · ···· ···· · ···· ·· · « ···

- 21 mesh; 1,6x100 cm, Bio-Rad) visszük, PBS-ben. A konjugátumot tartalmazó frakciókat desztillált vízzel szemben dializáljuk és liofilizáljuk. A konjugátumban a poliszacharid mólaránya a tetanusz toxoidhoz viszonyítva 2-3 : 1.

2. példa

B csoportba tartozó meningococcus poliszacharidok N-propionil- és N-butanoil-származékainak előállítása ás konjugálása

A propionsav- és vajsavanhidridet, valamint a kolominsavat a Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO) gyártotta. Mivel a kolominsav szerkezetileg azonos a B csoportba tartozó meningococcus poliszachariddal (GBMP), a továbbiakban GBMP-nek nevezzük. A tetanusz toxoidot az Institut ArmandFrappier-től (Laval, Quebec) szereztük be, és annak monomer formáját - amelyet az összes kapcsolásban alkalmaztunk - a fenti preparátum Bio-Gel A 0.5 oszlopon (200-400 mesh, l,6x 90 cm, Bio-Rad, Richmond, CA) való átvezetésével kaptuk, az oszlopot 0,01 mol/1 koncentrációjú foszfáttal pufférőit fiziológiás sóoldattal (PBS) (pH 7,4) ekvilibráltuk és eluáltuk.

GBMP N-dezacetilezése

1,0 g GMBP-nátriumsót 5 ml 2 mol/1 koncentrációjú nátrium-hidroxid-oldatban oldunk, majd 150 mg nátrium-bór-hidrid hozzáadása után az oldatot 110 °C-on 6 órán keresztül melegítjük 60 ml-es csavaros kupakos Teflon^R edényben, J. Jennings és munkatársai [J. Immunoi. 134, 2651 (1985) ; és 4,727,136 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] módszere szerint. A lehűtött és hígított oldatot ezu····

- 22 tán 4 °C-on desztillált vízzel szemben alaposan dializáljuk, majd liofilizáljuk. Az N-dezacetilezett GBMP keletkezését a termék ÍH-NMR spektrumában a metil-acetamido jel (singulett 6 2,07-nél) hiánya bizonyítja.

GBMP N-acilezése

1,0 g N-dezacetilezett GBMP-t 50 ml 5 %-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban oldunk. A kapott oldat két 10 ml-es alikvotjához propionsavanhidridet, illetve vajsavanhidridet adunk. A fenti reaktánsokat 3 x 5 ml alikvotokban adagoljuk 3 óra alatt szobahőmérsékleten, miközben a reakcióelegy pH-ját 0,5 n nátrium-hidroxid-oldattal 8,0 értéken tartjuk. A savanhidridek minden beadagolásával egyidejűleg 0,5 ml metanolt is adunk a reakcióelegyhez, az oldhatóság növelése céljából. Végül a reakcióelegyet 4 °C-on 16 órán keresztül keverjük, majd 40 °C-on desztillált vízzel szemben alaposan dializáljuk, és liofilizáljuk. Az N-propionilezett, illetve N-butanoilezett GBMP-t 90 %-nál nagyobb hozammal kapjuk. A teljes N-acilezést mindkét esetben a megfelelő ÍH-NMR spektrumból az N-dezacetilett GBMP jelének eltűnése bizonyítja.

N-acilezett GBMP aktiválása

Az N-acilezett GBMP-ben perjodátos oxidálással alakítjuk ki a terminális aldehidcsoportokat. A fentiek szerint előállított N-acilezett GBMP-ket 10 ml 0,1 mol/1 koncentrációjú vizes nátrium-perjódat oldattal szobahőmérsékleten, 2 órán keresztül, sötétben oxidáljuk. A perjódát feleslegét 1 ml etilénglikol hozzáadásával elbontjuk, az oldatot 4 °C-on alaposan dializáljuk, majd liofilizáljuk. A nátrium-bór-hid ····

- 23 rid alkalmazásával végzett N-dezacetilezési eljárásban (a GBMP kivételével) az egyes N-acilezett GBMP-k terminális redukáló sziálsav-maradékát nyílt láncú poliol-maradékká alakítjuk. Az ilyen típusú maradék perjodátra érzékeny [lásd Harold J. Jennings és munkatársai, J. Immunoi. 127, 1011 (1981); és 4,356,170 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], ami az N-acilezett GBMP-k mindkét végén aldehidcsoport kialakulását eredményezi.

Különböző N-acilezett GBMP-k méret szerinti szétválasztása

A kívánt átlagos móltömegű oxidált N-acilezett GBMP előállítását gélszűréssel végezzük, Ultrogel^R AcA 44 (részecskeátmérő 60-140 μη) oszlop (IBF Biotechnics, Savage, MD) alkalmazásával, eluensként PBS-t használunk. A Kq 0,5 és 0,7 között eluálódó frakciókat (az alábbiak szerint FPLC-vel meghatározva) összegyűjtjük, dializáljuk és liofilizáljuk. A Kp 0,2 és 0,4 közötti frakciókat (amelyek 30000-40000 átlagos móltömegű fragmenseknek felelnek meg) szintén összegyűjtjük és konjugáljuk. Ennek megfelelően a Kg 0,2 és 0,7 között eluálódó N-acilezett anyag a különösen fontos.

Poliszacharid konjugátumok előállítása

100 mg oxidált fragmenst 2 ml 0,1 mol/1 koncentrációjú nátrium-hidrogén-karbonát pufferben (pH 8,1) oldunk, és az oldathoz 20 mg tetanusz toxoidot adunk. Végül 40 mg nátrium-ciano-bór-hidrid hozzáadása után az oldatot szobahőmérsékleten óvatosan keverjük. A konjugálás lefolyását FPLCvel követjük, Superose^R HR10/30-at (Pharmacia) tartalmazó gélszűrő oszlop alkalmazásával, 1 ml/perc sebességgel izo···· • · · ···· ···· · ···· ·· * · ···

- 24 kratikusan futtatva PBS pufferrel (pH 7,2). Mind a proteint, mind az N-acilezett GBMP fragmenseket 214 nm-en detektáljuk. A fragmensek Kq értéke 0,6, a tetanusz toxoid Kq értéke 0,39. Az esetek többségében a kapcsolás 2 nap alatt teljesen végbemegy, de a teljes reakcióidő 4 nap volt. Az esetleg el nem reagált aldehidcsoportokat végül 2 0 mg nátrium-bór-hidriddel redukáljuk a gélszűrés előtt.

A poliszacharid-tetanusz toxoid konjugátumokat a poliszacharid fragmensektől gélszűréssel választjuk szét, BioGel A oszlopon, eluensként PBS-t alkalmazva. A konjugátumot tartalmazó eluenst desztillált vízzel szemben dializáljuk és liofilizáljuk. Az N-acilezett GBMP-tetanusz toxoid konjugátum 12-30 %, jellegzetesen 12-20 % sziálsavat tartalmaz, rezorcinos módszerrel [Svennerholm L., Quantitative Estimation ofSialic Acids, II A Colorimetric Resorcinol-Hydrochloric Acid Method, Biochim. Biophys. Acta 24, 604 (1957)] végzett meghatározás szerint. Ez azt jelenti, hogy a konjugátumban a poliszacharid mólaránya a tetanusz toxoidhoz viszonyítva 2-3 : 1.

3. példa

Általános eljárás poliszacharid-hordozó protein konjugátumok komplexálására aminosavak vagy peptídek hosszú szénláncú alkil-észtereivel, mint adjuvánsokkal

A hosszú szénláncú alkil-észter adjuvánst aprítjuk és szitáljuk, majd megfelelő mennyiséget kémcsőbe mérünk úgy, hogy a foszfáttal pufferolt sóoldat (10 mmol/1 foszfát, pH 7,4) hozzáadása után a szuszpenzió koncentrációja 1-2 mg ····

- 25 vegyület/ml. A szuszpenziót alaposan összekeverjük, majd azonos pufferben azonos térfogatú konjugátumot aduk hozzá, és az elegyet 4 °C-on 16 órán keresztül finoman rázzuk. A komplexálás befejeztével - ha meg akarjuk határozni az adjuvánssal komplexálódott konjugátum mennyiségét - a szuszpenziót centrifugáljuk és Lowry és munkatársai módszere szerint [J. Biological Chemistry 193, 265-275 (1951)] meghatározzuk a felülúszóban a konjugátum koncentrációját, ami a nem kötött konjugátum mennyiségét jelenti. Általában 30-90 % kötött konjugátum jó adjuváns-poliszacharid konjugátum komplexet jelent. Az immunizálási kísérleteket mind a kötött, mind a nem kötött konjugátummal elvégezzük.

4. példa

Különféle hosszú szénláncú (18 szénatomos) észterek adjuváns hatása meningococcus poliszacharid-tetanusz toxoid konjugátum vakcinákban

8-10 hetes nőstény fehér CF1 egereket mintegy 15 Mg konjugátum (közelítőleg 3 μ-g poliszacharid)/egér intraperitoneális injektálásával immunizálunk a 0., 14. és 24. napon. Az egereket a 39. napon szív-punkturával elvéreztetjük. Az injekciók ossz térfogata minden esetben 0,2 ml, akár tartalmaz adjuvánst, akár nem (a kontroll egerek esetében).

A meningococcus poliszacharidokat a toxoid hordozóval a fent ismertetett reduktív aminálási kapcsolási eljárással konjugáltuk. A kémiailag módosított meningococcus B poliszacharidot a fentiek szerint állítottuk elő. Az antitest koncentrációját a szérumban enzim immunvizsgálattal határoztuk meg az alábbiak szerint.

·· · ··«·

- 26 A 96-rezervoáros polisztirol lemezeket (Corning) a megfelelő tok-poliszacharid-marha szérumalbumin konjugátummal vonjuk be foszfáttal pufférőit sóoldatban (10 mmol/1 foszfát, pH 7,4), 1 Mg/rezervoár koncentrációban, 37 °C-on 1 órán keresztül tartó kezeléssel. A lemezeket ezután 1 órán keresztül 37 ’C-on 0,1 % marha szérumalbumint tartalmazó, foszfáttal pufferolt sóoldattal blokkoljuk. A blokkolás után a lemezeket kiürítjük, és négyszer mossuk 0,05 % Tween 20 detergenst tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBST—vei). Az üres rezervoárokba mérjük a vizsgálandó mintá(ka)t, és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk. PBST-vel végzett 5 mosás után minden egyes rezervoárba peroxidázzal jelzett kecke antiegér IgG (H+L) konjugátumot (1/200 hígítás PBST-vel) mérünk, és a lemezeket 1,5 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. PBST-vel végzett újabb 5 mosás után a lemezeket szobahőmérsékleten 10 percen keresztül inkubáljuk. Az enzim-katalizálta reakciót 1 mol/1 foszforsav hozzáadásával leállítjuk, majd az egyes rezervoárokban lemez leolvasó (Biotek) segítségével mérjük az abszorpciót 450 nm-en. Az antitest titer azon minta hígításának reciproka, amelynek abszorpciója 1,0. A titereket a kontrolihoz (adjuváns nélkül) viszonyított arányként adjuk meg. Az eredményeket az 1. táblázat tartalmazza.

·· «· · · ···· • · · · · « · • · · ···· ···· *·*· ···· ·· · · ···

1. táblázat: Meningococcus konjugátum vakcinákra adott antitest-válasz hosszú szénláncú (18 szénatomos) észterek jelenlétében. A titereket az adjuváns távollétében (kontroll: konjugátum vakcina pufferolt sóoldatban) mért antitest—válaszhoz viszonyított arányként adjuk meg

Adjuváns	Meningococcus konjugátum
A	B(butanoil)	C
Kontroll (PBS)	1,0	1,0	1,0
Oktadecil-tirozin
0,5 mg/ml	3,5	1,3	1,9
1,0 mg/ml	3,7	1,9	3,2
Oktadecil-tirozil-glicin
0,5 mg/ml	3,0	1,8	1,9

N-glicil-etanolamin-O-sztearát

0,5 mg/ml	1,0	1,5	1,0
Oktadecil-lizin
1,0 mg/ml	n.v.	1,3	1,8
Oktadecil-forfenicin
1,0 mg/ml	n.v.	1,9	1,

n.v.: nem vizsgált

Az 1. táblázat eredményei azt mutatják, hogy a hoszszú szénláncú alkil-észterek adjuváns hatást fejtenek ki bakteriális poliszacharid-tetanusz toxoid konjugátumokra, amely hatás az észter típusától és a bakteriális poliszacha···· ·· ·« · 4» • · · · · « · • * · · « 9 9 ··· • · · ···· ···· » ···· ·· · « »·«

- 28 rid típusától függ. Ez egy specifikus jelenség, amely az oktadecil-tirozin és az N-glicil-etanolamin-O-sztearát meningococcus A és C konjugátumokra kifejtett hatásán látszik.

5. példa

Ebben a példában az izotípus változását mutatjuk be, amely akkor jelentkezik, amikor egy adjuváns nélküli vakcináról egy adjuvánst tartalmazó meningococcus poliszacharid—tetanusz toxoid konjugátum vakcinára térünk át.

A fehér CF1 egerek immunizálását és a szérum kinyerését a 4. példában leírtak szerint végezzük. A 96-rezervoáros polisztirol lemezeket (Corning) a 4. példában leírtak szerint bevonjuk a megfelelő meningococcus poliszacharid—marha szérumalbumin konjugátummal, foszfáttal pufferőit sóoldatban (10 mmol/1 foszfát, pH 7,4). A lemezeket 37 °C-on 1 órán keresztül, majd 1,5 órán keresztül szobahőmérsékleten

2,5 % lefölözött tejet tartalmazó foszfáttal pufférőit sóoldattal blokkoljuk.

PBST-vel végzett négy mosás után az izotípus szempontjából vizsgálandó mintá(ka)t hozzáadjuk, és szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk. PBST-vel végzett öt mosás után minden egyes rezervoárba nyúl antiegér alosztály specifikus próbát (Bio-Rad Laboratories, Mouse Typer subisotyping panel) mérünk, és a lemezeket szobahőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk. PBST-vel végzett újabb öt mosás után hozzáadjuk a peroxidázzal jelzett kecske antinyúl konjugátumot [IgG (H+L), 1/3000 hígítás PBST-ben], és a lemezeket 1,5 órán keresztül inkubáljuk. PBST-vel végzett újabb öt mosás után a rezervoárokba tetrametil-benzidint adunk, és a ·· «· · * ···· • · · · · 0 · • · · · · · · ··· • · · ···· ···» · ···· ·· · « ··«

- 29 lemezeket szobahőmérsékleten 6 percen keresztül inkubáljuk, majd a reakciótl mol/1 koncentrációjú foszforsav hozzáadásával leállítjuk. Az egyes rezervoárokban lemez leolvasó (Biotek) segítségével 450 nm-en mérjük az abszorpciót. Az antitest titereket úgy számítjuk ki, hogy a minta hígításának reciprokát szorozzuk az abszorpcióval. A titereket a kontrolihoz (adjuváns nélkül) viszonyított arányként adjuk meg. Az eredményeket a 2. táblázatban ismertetjük.

2. táblázat: Meningococcus A és C konjugátumra adott válasz izotípusának változása. A titereket az adjuváns távollétében (kontroll: konjugátum vakcina pufférőit sóoldatban) mért antitest-válaszhoz viszonyított arányként adjuk meg. Az adjuváns koncentrációja 0,5 mg/ml

Adjuváns Immunglobulin (meningococcus A-ra)

	IgGl	IgG2a	IgG2b	IgG3	IgM
Kontroll (PBST)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Oktadecil-tirozin	2,6	5,7	4,3	4,4	3,4
Oktadecil-tirozil-	1,6	3,9	3,6	2,6	1,6
-glicin
N-glicil-etanolamin-	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0

-O-sztearát

- 30 ····

2. táblázat (folytatás)

Adjuváns Immunglobulin (meningococcus C-re)

	IgGl	IgG2a	IgG2b	IgG3	IgM
Kontroll (PBST)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
Oktadecil-tirozin	2,1	5,2	2,3	4,3	1,7
Oktadecil-tirozil-	2,1	2,9	1,9	2,91	1,7
-glicin
N-glicil-etanolamin-	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
-O-sztearát
A 2. táblázat	eredményei azt	mutatják,	hogy a	hosszú

szénláncú észterek kedvezően befolyásolják az izotípus megoszlását. Ez az oktadecil-tirozin adjuváns jelenlétében kapott IgG2a/IgGl arányból látható (ami 2,2 anti-meningococcus A-ra, 2,5 anti-meningococcus C-re).

6. példa

Ebben a példában bemutatjuk, hogy a hosszú szénláncú észter adjuváns jelenlétében a fokozott antitest-válasz pozitív biológiai hatást eredményez: védelmet az élő patogén baktériumok általi fertőzéssel szemben.

A fehér CF1 egereket a 4. példában leírtak szerint immunizálunk. Az egereket a 40. napon mintegy 2·10³ 2b szerotípusú N. meningitidis B (80165 törzs) mikroorganizmussal fertőzzük intraperitoneálisan. 5 óra elteltével az egereket elvéreztetjük, és meghatározzuk az életben maradt baktériumok számát (telepképző egység, CFU/ml). Az N-propionil- és

N-butanoil-meningococcus B poliszacharidokat az N-dezacetilezett poliszacharid és a megfelelő savanhidrid reagáltatásával állítjuk elő a fent ismertetett módon. Az eredményeket a 3. táblázat tartalmazza.

3. táblázat: N-propionil- (NPr) és N-butanoil(NBu)-módosított meningococcus B poliszacharid-tetanusz toxoid (TT) konjugátumokkal és oktadecil-tirozil-glicin adjuvánssal kiváltott aktív védelem egérben. Az adjuváns koncentrációja 0,75 mg/ml

Immunogén CFU/ml Baktériummal fertőzött egerek száma

1)	Adjuváns	3584	5/5
2)	NPr poliszacharid	2664	5/5
3)	NPr poliszacharid-	640	4/5
	-TT konjugátum
4)	NPr poliszacharid-	0	0/5
	-TT konjugátum +
	+ adjuváns
5)	NBu poliszacharid-	296	1/5

-TT konjugátum + + adjuváns

A 3. táblázat eredményei azt mutatják, hogy az adjuváns és a poliszacharid konjugátum vakcina biztosítja a legjobb védelmet. Az adjuváns önmagában nem hatásos.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Vakcina készítmény, amely egy bakteriális poliszacharid-protein konjugátumot és legalább egy (I) általános képletű adjuvánst - a képletben

C jelentése hidrogénatom, aminosav-maradék vagy peptidmaradék,

D jelentése hidrogénatom vagy egy gyógyászatilag elfogadható sav,

E jelentése 4-hidroxi-benzil-, benzil-, 4-hidroxi-fenil-, fenil-, 4-amino-butil-, izopropil- vagy metilcsoport, hidrogénatom, vagy egy természetes aminosav maradéka,

A jelentése -(CH2)_n ^-» oxigénatom vagy -CH2O-, és

B jelentése -(CH2)_n ^_ vagy oxigénatom, ahol n értéke 0-4, azzal a megkötéssel, hogy A és B jelentése eltérő -(CH2)_n- és oxigénatom esetén, és

R jelentése 12-20 szénatomos alkilcsoport tartalmaz hatásos mennyiségben.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve , hogy az adjuváns egy L-konfigurációjú aminosavat tartalmaz.
3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve , hogy az adjuváns egy D-konfigurációjú aminosavat tartalmaz.
4. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve , hogy az adjuváns D- és L-konfigurációjú aminosav elegyét tartalmazza.

• ··· • · · · ····
5. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns (I) általános képletében E jelentése 4-hidroxi-benzil-, benzil-, 4-hidroxi-fenil- vagy fenilcsoport, vagy hidrogénatom.
6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy E jelentése 4-hidroxi-benzalcsoport .
7. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns (I) általános képletében C jelentése hidrogénatom, aminosav-maradék vagy legfeljebb 10 aminosav-maradékot tartalmazó peptid-maradék.
8. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptid-maradék dipeptid vagy tripeptid maradéka.
9. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy C jelentése aminosav-maradék, és az adjuváns aminosav-szekvenciája tirozil-glicin, glicil-glicin, glicil-tirozil vagy fenilalanil-glicin.
10. A 8. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy C jelentése dipeptid-maradék, és az adjuváns aminosav-szekvenciája tirozil-glicil-glicin vagy tirozil-alanil-glicin.
11. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a gyógyászatilag elfogadható sav hidrogén-klorid, hidrogén-bromid, foszforsav, kénsav, borkősav, tejsav vagy ecetsav.
12. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns egy a-aminosavat tartalmaz.
13. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a bakteriális poliszacharid polipeptid egy biológiai hordozóhoz van kötve.
14. A 13. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a hordozó tetanusz toxoid, diftéria toxoid, acelluláris pertussis vakcina (LPF), térhálósított anyag (CRM) vagy bakteriális protein hordozó.
15. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a CRM a CRM 197.
16. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a bakteriális poliszacharid egy tok-poliszacharid, egy lipopoliszacharid vagy egy tokon kívüli felületi poliszacharid.
17. A 16. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a tok-poliszacharid Haemophilus influenzae-ből, Neisseria meningitidisből, Streptococcus pneumonia-ból, Streptococcus agalactiae-ből, Salmonella typhiből, Escherichia coliból vagy Staphylococcus aureusból van izolálva.
18. A 16. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a lipopoliszacharid Neisseria meningitidisből, Escherichia coliból, Salmonella typhiből vagy Pseudomonas aeruginosa-ból van izolálva.
19. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a tokon kívüli (felületi) poliszacharid az A, B és C csoportba tartozó streptococcusok közönséges poliszacharid antigénje, vagy a Streptococcus pneumoniae közönséges poliszacharid antigénje.
20. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns egy 14-20 szénatomos alkanol és egy aminosav, dipeptid vagy tripeptid észtere.
21. A 20. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy adjuváns oktadecil-tirozin.
22. A 20. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy adjuváns oktadecil-tirozil-glicin.
23. Eljárás immunválasz kiváltására egy betegben, azzal jellemezve, hogy a betegnek az 1. igénypont szerinti vakcina készítmény gyógyászatilag hatásos mennyiségét adagoljuk.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményt intramuszkulárisan, intraderálisan, szubkután módon vagy nazálisán adagoljuk.
25. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vakcina készítmény hatására lényegesen nem emelkedik az IgE antitest koncentrációja és nem növekedik az IgG21/IgGl antitest arány.
26. Eljárás vakcina készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti bakteriális poliszacharid-protein konjugátumot és adjuvánst immunológiailag hatásos mennyiségben összekeverünk és a gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott módon vakcina készítménnyé formálunk.