CS283991A3 - Vaccine - Google Patents

Description

1

Zlepšené vakcínové prostředky

Oblast techniky

Tento vynález se: týká vakcínových prostředků, které jí zlepšenou imunogenicitu. Podrobněji, tyto prostředky podle·vynálezu· obsahuji bakteriální polysaeharid kovalentně nať^S&nv? - λobdný na proteinový nosič v kombinaci s alkylovou sloučeninou: J·*·—— ' ' a alkylovou skupinou s dlouhým řetězcem. Jak nosič tak al-kylová sloučenina fungují jako adjuvant (pomocné činidlo)

Dosavadní stav techniky 16 X 6 0 eso o S 8 í í) p o

Je dobře: známo, že vakcíny jsou důležité při profylaxi nemocí. Vakcíny působí tak, že se hostitelský živočich vyj-_í'3 j staví působení cizího materiálu, který je určen pro aktivaci .imunního systému tak:,, aby se hostiteli udělila imunita na tento materiál, aniž by. .byl hostitel vystaven risiku onemoc-nění. V současné době je pro komerční použití vyvinuto asidvacet vakcín. Většina z těchto vakcín se připravuje detoxika -cl organismu způsobujícího onemocnění nebo části tohoto orga-nismu a nebo isoiací specifické netoxické části organismu.

Dobře známýw příkladého druhého ze shora uvedených je isolacekapsulárního polysacharidu z meningokokových a pneumokokovýchbakterií na základě vakcín pro bakteriální meningitidu a pneu- monii (zánět plic). Polysacharidové vakcíny jsou však slabýmiimunogeny, které neposkytují adekvátní množství ochrannýchprotilátek u jednotlivců se špatně vyvinutými nebo sníženýmiimunitními systémy, Mezi druhou uvedenou skupinu patří maléděti, větší děti a ti, kteří mají autoimunní choroby. Imunníodpověčf, která se pak. vyskytuje, závisí na T-buňkách nebo nanepaměťových buňkách, což znamená, že tento jednotlivec nebudevykazovat zvýšenou protilátkovou odpověň (se serokonversí) podruhé injekci ( při přeočkování). Závislost na T-buňkách jenutná pro Indukci IgG protilátek a paměťových buněk. Po se-rokonvers^se tedy po opakovaných injekcích vakcínou tvoří jakIgM tak IgG protiáltky. Velikost protilátkové odpovědi se dále

i.VďíŤMM zvyšuje s každou injekcí vakcíny, jestliže odpověď je závislána T-buňkách. 0 imunologii polysacharidových vakcín je souhrn-ně pojednáno v práci Jenningse a spal·.: "The Polysaccharides”,red. G. 0. Aspinall, díl 1, 291 až 329 (1982). ·<

Konjugace nebo kovalentní vazba polysacharidu s přísluš-ným proteinovým nosičem zlepšuje imunní funkci v tom, že dojde. k odpovědi závislé na T-buňkách nebo k odpovědi paměťových bu-něk. V prosinci 1987 bylo ve Spojených státech schváleno pou-žívání první kon^ugované vakcíny u lidí. Tato vakcína sestáváz kapsulárního polysacharidu H« influenza b kovalentně navá-zaného na nosný protein toxoidu diftérie (záškrtu). Souhlasbyl udělen pro děti ve stáří 18 měsíců neboť komerční poly- sacharidová vakcína má v tomto věku omezenou účinnost. Jinákonjugovaná vakcína H. influenza b, která byla připravenachemicky různými konjugacemi, byla nedávno schválena propoužívání ve Spojených státech.

Polysacharid a konjugáty polysacharid - protein jsoučistšími a tudíž bezpečnějšími vakcínami než klasické celébakteriální nebo vijfyé vakcíny. To znamená, že klasické vak-cíny jsou často' znečištěny toxickými vedlejšími produkty ikdyž celá bakterie nebo virus byl chemicky detoxikován působě em ním chemikálií, tepla nebo genetickým zeslabením,Avšak vzhledke zvýšeni čistoty polysacharidů a konjugátů polysacharid-protein, které často znamená, že byly odstraněny přírodní imuno-stimulanty, tyto nové vakcíny často nejsou optimálně imunogenní. Mezi přírodní imunostimulanty patří bakteriální složky,jako jsou napříkladl lipopolysacharid, lipoprotein a muramyl-dipeptid. Všechny tyto složk^jsou toxické. Také proteinovýnosič může vykazovat jistý stupeň toxicity. Z toho plyne, že je žádoucí používat co nejmenší množství. Například toxoidďifterie a podobná molekula CRM197 jsouobvykle používanýminosnými molekulami konjugovaných vakcín pro použití u lidí.Dospělí však mohou vykazovat lokální hypersensitivní reakcena tyto nosné molekuly. Pro kompensaci těchto účinků se spolu - 3 - s vakcínami používají adjuvanty (pomocná činidla), aby se' vy-volala zvýšená tvorba protilátek. Pomocná činidla nabízejítaké možnost ovlivňování typu protilátky, která se produkujejako odpověcf na vakcínu. Například i když ρσ imunizaci, konju-govanou vakcínou polysacharid-protein dojde k serokonversia následné produkci IgG protilátky, odpovědí u myší bude pri-márně IgGl. Zvýšená produkce IgG2a protilátky by byla prospěš-ná, jelikož tato protilátka je nejučinnější myší protilátkouvzhledem k aktivaci komplementu. Tato cesta poskytuje důle-žitý obranný mechanismus proti bakteriálním infekcím.

Pokud jde. o pomocná činidla pro komerční používání, v.dnešní době se. jako pomocná činidla používají pouze hlinité avápenaté soli. Avšak hlinité a vápenaté soli nejsou silnýmipomocnými činidly. 0 vápenatých solích bylo zjištěno, že majípouze omezené použití. I když hlinité soli jsou rozšířenějšípři. používaní s jinými vakcínami, o konjugovaných v.akcínáchpolysacharid-protein se uvádí, že se: používají s; malým úspěchem.V literatuře^ se: uvádí, že hydroxid hlinitý vykazuje protilát-ko vou odpověď na konjugovanou, vakcínu polysacharid H., influ-enza b -toxóid tetanu (viz: J. B. Robbins a spol.: J. Pedi-atrics 112, 695 až 702 (1988).). J. B. Robbins a další pozoro~váli také stejné potlačování protilátkové odpovědi u hydroxiduhlinitého a konjugované vakcíny polysacharid S. T.yphi - toxincholery (J. Exp. Med. 166. 1510 až 1524 (1987).). Hlinité solimohou vyvolávat'také přechodné nebo chronické lokální granu-lomy v místě injekce: L. H. Collier v Lancet, 1354 až 1367(1987)j který uvádí, že nástup a síla reakcí vakcíny toxoidutetanu závisí na přítomnosti hlinitého pomocného činidla.Příprava hlinitých pomocných činidel není vždy rep^dukova-telná. Navíc hlinité soli samotné stimulují IgE produkci pro-tilátek, které jsou zodpovědné za zprostředkování hypersensi-tivních reakcí. Tento jev byl popsán T. BTatuhasim a spol.: J. Infectious Disease 146. 192 (1982). V posledních letech byla pozornost soustředěna na použí-vání organických sloučenin jako pomocných činidel. Pouze ně- «Ν» kolik organických sloučenin funguje podobným způsobem jakokomerčně přijatelné hlinité soli, tj. jako pomalu uvolňující :vehikulum (rozpouštědlo) nebo depot antigenu (vakcíny) přičemž antigen se v místě injekce uvolňuje po relativně dlou-hou dobu. Příklady takových organických sloučenin jsou organickápovrchově aktivní činidla a emulgační činidla, jako je napříkladPluronics a Tetronics, což jsou neiontové blokové kopolymerypolyoxyethylenu a polyoxypropylenu produkované firmou BASFCorporation. Takový pomalu uvolňující mechanismus působenípomocných činidel je již dlouho přijímán pro používání u Člo-věka, nebo£ snižuje možnost přestimulování imunního systému. Přestimulování imunního systému může vést k autoimunní odpo-vědi, jako je například reakce, ke které by mohlo dojít, připoužití silných imunostimulačních činidel, například Freundovaadjuvantu.. Výhodným mechanismem je tedypomalé uvolňování. I když o většině organických činidel používaných jakopomocná činidla bylo prokázáno, že jsou silnými, imuno stimulač-ními činidly, taková vysoce aktivní pomocná činidla majítendenci být toxická a tedy pro použití u člověka nepřijatelná.Mezi příklady známých pomocných organických činidel, kterájsou silnými imuno stimulačními činidly, patří Freundovo u-plné pomocné činidlo a muramyldipeptid. Obě tyto sloučeninyjsou zakázány pro používání ve výzkumu živočichů, neboí jsoupovažovány za toxické. Mnohá organická pomocná činidla, kteránapodobují hlinité soli, jsou toxičtější než hlinité soli.Například o alkylaminech s dlouhým řetězcem, které jsou po-psány D. Galiem v Immunology 11, 369 až 368 (1966), bylov. literatuře uvedeno, že jsou to toxické sloučeniny, kteréjsou obvykle ničivé pro strukturu buněčné membrány.

Je známo, že pomocným činidlem je oktadecylester aminoky- seliny tyrosin., Má minimální imunostimulační vlastnosti, ale; místo toho funguje jako organický ekvivalent k hlinitým činid- lům pomalu uvolňovaným vehikulem. To znamená, že antigeny bu- dou tvořit komplex s oktadecyltyrosinem, budou pomalu uvolňo- A ji'.' ’ . /' /-,/-. s·.' .. Μ» Μ vány nebo pomalu desorbovány z nerozpustného pomocného činidla.Ke komplexaci mezi antigenem a adjuvantem dochází prostřednic-tvím slabých nekovalentních sil, jako jsou například hydrofob-ní interakce a vodíková vazba.

Tento jev je.popsán v USA patentu č. 4 428 932 (Overell)a USA patentu 4 258 029 (Moloney). Overell popisuje, že aktade-cyltyrosin funguje jako pomocné činidlo při desensibilizačníterapii alergie, kdy tvoří komplex s alergeny, jako je napří-klad extrakt z rýže, trav a pylů. Moloney a další ukazují,že oktadecyltyrosin funguje jako pomocné činidlo pro vakcíny,jestliže tvoří komplexy s toxoidem tetanu a s formalinem in-aktivovaným virem polyomyelitidy (dětské obrny) typu I, II a III. Tento jev dále popisuje A.Nixon-George a. spol.: J. Immu-nology 144. 4798 až 4802 (1990), který objevil, že oktadecyl-tyrosin a jiné oktadecylestery aromatických aminokyselin fun-gují jako pomocné činidlo případné vakcíny hepatitidy B pokomplexaci rekombinantnim povrchovým antigenem hepatitidy B.

Existuje tedy potřeba vyvinout netoxické prostředky kon-jugované vakcíny s pólysacharidem, proteinem a adjuvantem(pomocným činidlem), které mají zlepšenou imunogenicitu.

Podstata vynálezu

Tento vynález se) týká zlepšených vakcínových prostředkůobsahujících netoxickou konjugovanou vakcínu bakteriální pó-ly sacharid - protein a netoxické pomocné Činidlo s dlouhýmalkylovým řetězcem. Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu setedy získává vakcínový prostředek, vyznačující se tím, žeobsahuje netoxlcký konjugát bakteriálníhoroolysacharidu s pro-teinem a pomocné činidlo, kterým je netoxická sloučenina sdlouhým: alkylovým řetězcem, které je přítomno v takovém, množ-ství, jež je účinné pro amplifikaci imunogenicity konjugátupolysacharid - protein.

Podle jiného aspektu tohoto vynálezu se získává způsobvyvolávání imunitní odpovědi u teplokrevných živočichů, včetnělidí, vyznačující se tím, že se hostitelskému živočichovi - 6 - podává efektivní množství vakcínového prostředku podle tohotovynálezu. Překvapivě bylo zjištěno, že netoxické sloučeniny s dlou-hým alkylovým řetězcem, zvláště estery aminokyselin, nebo pep-tidů, mohou tvořit komplex: s konjugovanými. vakcínami poly-sacharid - protein. Důsledkem tvorby-tohoto komplexu je, žesloučeniny s dlouhým alkylovým řetězcem fungují jako pomaluuvolňující vehikulum. To znamená, že sloučeniny s dlouhým al-kylovým; řetězcem uvolňují konjugovanou vakcínu do hostitel-ského živočicha po prodlouženou dobu. Tyto výsledky vedou kezvýšené protilátkové odpovědi ve srovnání s odpovědí, ke kte-ré dochází při aplikaci konjugované vakcíny samotné. Jak byloshora uvedeno, tento mechanismus pomocných činidel je stejnýjako mechanismus, který byl pozorován u hlinitých solí a ne-konjugované vakcíny. Avšak jak také bylo shora uvedeno, hli-nité soli jsou z větší části neúčinnými pomocnými činidly prokonjugované vakcíny bakteriální polysacharid - protein. Ne-mělo by tedy být očekáváno, že by sloučeniny s dlouhým alkylorvým řetězcem podle tohoto vynálezu na základě stejného mecha-nismu pomocného činidla fungovaly jako pomocná činidla prokonjiibvané vakcíny. Je tedy dokonce ještě překvapivější, ženetoxické sloučeniny s dlouhým alkylovým řetězcem fungují tak,že zlepšují imunogenicitu konju^vaných vakcín.

Podle tohoto vynálezu bylo dále zjištěno, že přítomnostnetoxické sloučeniny s dlouhým alkylovým řetězcem jako pomoc-ného činidla, typicky aminokyseliny nebo esteru peptidu salkylovou skupinou s dlouhým řetězcem, ovlivňuje isotyp pro- !tilátky produkované jako odpověň na konjugovánou vakcínu.Konkrétně pak poměr IgG2a protilátky k IgGl protilátce je vyššív tom, že hladiny obou isotypů protilátek jsou zvýšeny, jestli-že se adjuvanty s dlouhým alkylovým řetězem používají s kon-jugovanými vakcínami podle tohoto vynálezu, na rozdíl odpoměru, který byl pozorován, jestliže nebylo přítomno žádnédoplňkové činidlo. Tento poměr je příznivý, neboí IgG2a proti-látka je důležitá, jelikož je nejúčinnější myší protilátkouvzhledem k aktivaci komplementu, mechanismům buněčné cytoto- - 7 » a xicity závisle na protilátkách a ochraně před nádory parašity. Účinek doplňkových činidel s dlouhým alkylovým řetězcemv pojmech zvýšení modulace (tj. isotypové změny) protilátkovéodpovědi je také překvapující v termínech úlohy nosného pro-teinu. To znamená, že funkcí nosiče v konjugované vakcíně jezvýšit a modulovat protilátkovou odpověÚ.

Na rozdíl od hlinitých pomocných činidel sloučenina sdlouhým alkylovým řetězcem zvyšuje funkci nosiče.

Netoxická sloučenina s dlouhým alkylovým řetězcem znamenás výhodou positivně nabitý ester aminokyseliny nebo peptidu,zvláště ester alkylalkoholu se 14 až 20 atomy uhlíku s amino-kyselinou,. dipeptidem nebo tripeptidem.

Konjugát bakteriálního polysacharidu s proteinem, kterýse používá v prostředcích podle tohoto vynálezu, je schopnývyvolávat imunitní odpověň v hostiteli. Pojem "bakteriální"tak, jak je zde používán, znamená kapsulární pólysacharidy,lipopolysacharidy a jiné subkapsulární (povrchové) polysacha-ridy. Kapsulární polysacharidy z pathogenních bakterií jsou vdnešní době nejužitečnější pro přípravu účinných konjugovánýchvakcín. Příklady takových kapsulárních polysacharidů jsou kap-sulární polysacharidy isolované z Haemophilus. influenzae,Neissetia meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococ-eus agalactiae, Salmonella tyjhi^ Escherichia coli a Staphy-lococcus aureus. Mezi příklady^olysacharidů patří ty lipopo-lysacharidy, které jsou isolovány z Neisseria meningitidis,Escherichia coli, Salmonella typhi a Pseudomonas aeruginosa.Mezi příkladjjdalších subkapsulárních polysacharidů patří o-bvyklý pólysacharidový'antigen (látka c) Streptococci skupinyA, B a C a obvyklý polysaeharidový antigen (látka c) Strepto-coccus pneumoniae. Příklady, které následují, popisují pokusy s konjugátyobsahujícími polysacharidy významně rozdílné chemické struk-tury, jmenovitě meningokokový polysacharid skupiny A (homopo-lymer N-ace.tyl-mannosamin-i6-fosfátu), meningokokový polysacha- - 8 - charid skupiny B (homopolymer (2—» 8) navázané N-butanoyl-neuraminové kyseliny) a polysaeharid skupiny C (homopolymer(2—*9) navázané N-aeetylneuraminové kyseliny). Tomu je třebarozumět tak, že tento vynález není omezen na meningokokovéderiváty uvedené zde jako příklady a lze ho aplikovat nakonjugáty obsahující jiné bakteriální polysacharidy než shorauvedené a než ty, jejichž příklady byly shora uvedeny.

Bakteriální polysacharidy používané v konjugátech podletohoto vynálezu, se mohou snadno připravovat konvenčními iso-lačními technikami.

Nosné molekuly, se; kterými jsou bakteriální polysacharidykonjugovány, nebo ty, s nimiž jsou kovalentně svázány,jsou proteiny» Výhodnými nosiči pro použití u živočichů jsou >hovězí serumalbumin a "Keyhole Limpet Hemocyanin" ·. Mezi pří-klady vhodných nových proteinů patří toxoid tetanu, toxoiddifterie (záškrtu), nebuněčná vakcína černého kašle (LPF to-xoid), zkříženě resistentní/reaktivní materiály (CRM), které :jsou antigenně podobné bakteriálním toxinům, ale které nejsoutoxické mutací, s výhodou CRM 197 získaný podle Pappenheimeraa spol·.: Immunochemistry j), 891 až 906 (1972), a další bak-teriální proteinové nosiče, například meningokokový proteinvnější membrány. Nosný protein samotný je s výhodou imunogeneit.

Pdysacharid může být s nosičem kovalentně kondenzovánjakýmkoliv vhodným způsobem známým odborníkům. I když použitísymetrického linkeru, jako je například dihydrazid kyselinyadipové, jak je popsán J. B. Robbinsonem a spol»: J. Exper..Med. 152. 361 až 376 (1980), nebo heterobifunkčního linkeru,jako je například N-sukcinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionát,který popisuje J. B. Robbins a spol·.: Infection and Immunity56'.- 2292 až 2298 (1988), jsou v rozsahu tohoto vynálezu, jevýhodné vyhnout se použiti jakéhokoliv linkeru a místo tohokondenzovat polysaeharid přímo s proteinovým: nosičem reduktivmíaminací, jak to popisuje H. J. Jennings a spol·: J. Immunology127. 1011 až 1019 (1981).

Velikost bakteriálního polysacharidu, definovaná průměrnou molekulovou hmotou,je proměnlivá a závisí na bakterii, od nížje protein odvozen, a na způsobu kondenzace: polysacharidu snosičem. Velikost polysacharidu může být tedy například

zaci reduktivní aminací je molekulová hmota polysachariduobvykle v rozmezí 5 000 až 500 000, například 300 000 až500 000, nebo například 5 000 až 50 000.

Pomocné činidlo s alkylovou skupinou s dlouhým řetězcem,stejně tak jako jakékoliv jiné sloučeniny, které pocházejíz jejího metabolismu, by neměly být toxické.. Je velmi dobřeznámo, že mastné alkoholy s dlouhým řetězcem jsou přirozeně sevyskytující netoxické sloučeniny. Jako příklad, lze. uvést ok-tadekanol, o kterém bylo zjištěno, že je naprosto netoxickýpro lidi, jak ukazuje orální která je větší než 15g/kg (viz: Gosselin "Clinical Toxicology of Commer.cial Products”,čtvrté vydání, 1976.). O oktadecyltyrosinu bylo zjištěho, žepro živočichy je netoxický. většina přirozeně se vyskytujícíchaminokyselin není toxická (C. L. Penney a spol.: Vaccine 4, 99 až 104 (1986).). Bylo by tedy možno očekávat, že oktadecyl-tyrosin as estery jiných alkoholů s aminokyselinami by nemělyvykazovat u lidí jakoukoliv toxicitu.

Pomocné činidlo by mělo být schopno tvořit mikročásticeo velikosti mezi asi 150 mikrometry a 1 mm, s výhodou asi250 mikrometrů, ve vodném prostředí. Tím se získá suspensestejnoměrné konsistence. Navíc by měly mikročástice umožňovatabsorbci konjugované vakcíny a tím umožňovat pomalé uvolňová-ní konjugátu do. .hostitele.

Ve výhodném uspořádání podle tohoto vynálezu se jakopomocné činidlo používá sloučenina obecného vzorce

S O

B - R v němž C znamená atom vodíku, zbytek aminokyseliny nebo zbytekpeptidu s až deseti zbytky aminokyselin (tj. až dekapeptid), - 10 - D znamená atom vodíku nebo farmaceuticky přijatelnou kyselinu,jako je například kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodí-ková, kyselina fosforečná, kyselina sírová, kyselina vinná,kyselina mléčná nebo kyselina octová, E znamená 4-hydřoxyben-zyl vou skupinu, benzylovou skupinu, 4-hydroxyfenylovou sku-pinu, fenylovou skupinu, 4-aminobut,ylovou skupinu, isopropy-lovou skupinu, methylovou skupinu, atom: vodíku nebo jiný zby-tek přirozeně se vyskytující aminokyseliny, A znamená skupinuobecného vzorce (Cf^n , atom kyslíku nebo skupinu CH^O, Bznamená skupinu obecného vzorce nebo atom kyslíku, kde n znamená číslo od nuly do čtyř, ale A neznamená B v tompřípadě, kdy znamená nebo atom kyslíku, a R znamená alkylovou skupinu s dvanácti až dvaceti atomy uhlíku,, C může s výhodou znamenat bucf atom vodíku, aminokyselinu,dipeptid nebo tripeptid. Jestliže C znamená aminokyselinu,pak sekvence aminokyseliny může být vybrána ze skupiny sestá-vající například: z tyrosylglycinu, glycylglycinu, glycylty-rosinu a fenylalanylglycinu.

Jestliže C znamená dipeptid, aminokyselinová sekvencepomocného činidla může být vybrána ze skupiny sestávající zn8příklad tyrosyl-glycyl-glycinu nebo tyrosyl-alanylglycinu.Jestliže je aminokyselinová sekvence chirální, lze použítD-enanciomery, L-enanciomery nebo jejich směsi. Je zvláště vý-hodné, jestliže doplňkové činidlo obsahuje alfa-aminokyselinu.

Je zvláště výhodné, jestliže E je vybrána ze skupiny se-stávající ze 4-hydroxybenzylové skupiny, benzylové skupiny, 4-hydroxyfenylové skupiny, fenylové skupiny a atomu vodíku.Nejvýhodnější je, jestliže E znamená 4-hydroxybenzylovou sku-pinu.

Jestliže A znamená skupinu CE^O a B znamená skupinu(CEL·,)^ "tyto sloučeninyžnamenají N-aminoacylethanolamino-O-stearany. Jestliže A znamená skupinu CH^O a B znamená atomkyslíku, pak tyto sloučeniny znamenají estery kyseliny uhli-čité .

11 -

Jako pomocné činidlo sé výhodněji používá hydrochloridesteru aminokyseliny, kde C znamená atom vodíku, D znamenákyselinu chlorovodíkovou, A znamená skupinu obecného vzorce(Cí^Jn» kde n znamená číslo od nuly do čtyř, a B znamená atomkyslíku.

Nejvýhodněji se jako pomocné činidlo používá hydrochloridoktadecyltyrosinu, v němž C znamená atom vodíku, D znamenákyselinu chlorovodíkovou, E znamená 4-hydřoxybenzylovou sku-pinu, R znamená oktadecylovou skupinu, A znamená skupinuobecného vzorce (0¾)^ kde n znamená číslo nula, B- zname-ná atom kyslíku.

Jestliže C neznamená atom vodíku, potom základ pomocnéhočinidla obsahuje v. podstatě peptidové vazby, tjo karboxylováskupina jednoho aminokyselinového zbytku je přímo navázánana aminovou skupinu přilehlého aminokyselinového zbytku způ-sobem hlava-pata.- Peptidovou vazbou může být také thioamidovávazba.

Pomocné činidlo se může připravovat jakýmkoliv vhodnýmzpůsobem. Například: aminoesterová část pomocného činidla semůže syntetizovat kteroukoliv z četných známých metod,, jakje popisuje M. Bodansky a;- spol. v "Peptide Synthesis", druhévydání,. Wiley, New York 1976 a R. W„ Roeske v "Peptides”,

New York 1981, Jb 102. Zvláště výhodným způsobem je estéri-fikační postup katalyzovaný methansulfonovou kyselinou popsanýC. Penneyem a spol.: J. Organic Ohemistry 50. 1457 až 1459(1985).

Jestliže se jako doplňkové činidlo používá ďipeptiď neboťripeptid, mohou se peptidové vazby tvořit jakýmikoliv postu-py popsanými ve shora uvedené knize "Peptide Synthesis".Peptidové vazby sé mohou tvořit také podle postupů syntézyv* pevné fázi nebo v roztoku. Existuje mnoho postupů a reakčníchčinidel, která jsou použitelná pro tvorbu amidových, thioami-dových a thioesterových vazeb. - 12 Při přípravě pomocného činidla může být žádoucí dočasněchránit reaktivní funkční skupiny. Například aminy se mohouchránit jako skupiny urethanového typu, alkoholy terc*butylo-vou nebo benzylovou skupinou a kyseliny jako esterové skupi-ny. Vhodné podmínky pro chránění a odstraňování chránících sku-pin jsou popsány ve shora uvedené "Peptide Synthesis".

Pomocné činidlo může být vyčištěno jakýmikoliv shora po-psanými způsoby. Výhodnou technikou čištění je chromatografiena silikagelu, zvláště pak "flash" (rychlá) chromatografie,jak je to popsáno v práci W. Clark Still a spol.: J. OrganicChemistry 43. 2923 až 2925 (1978). Pro čištění pomocného či- ;nidla lze však použít také jejich chromatografických metodvčetně HPLC... Pro čištění pomocného činidla lze použít takékrystalizaci. V některých případech není potřebné žádné čištění,protože produkt o analytické čistotě se získává přímo syntézou.

Vakcínové prostředky podle tohoto vynálezu se připravují,fyzikálním smícháním pomocného činidla s konjugátem polysa-charid - nosný protein za vhodných sterilních podmínek známýmitechnikami pro přípravu prostředků s pomocným: činidlem. Kom-plexace konjugátu polysacharid - nosný peptid s pomocnýmčinidlem je usnadněna existencí negativního náboje na konjugá-tu, který je elektrostaticky přitahován k positivnímu nábojina sloučenině pomocného činidla s alkylovou skupinou s dlou-hým řetězcem.

Množství pomocného činidla a konjugátu polysacharid -- nosný protein, která jsou potřebná pro vyvolání imunitníodpovědi u lidí, navzájem spolu souvisí, ale jsou v rozmezíchobvykle používaných u konvenčních vakcín. Například to, že sěpoužijí zvýšená množství adjuvantu, může vést k použití sní-t-žených množství konjugátu a naopak. Výhodným množstvím pomocné-ho činidla je 0,01 až 5 mg/ml prostředku, například 0,05 mg/mlaž 3 mg/ml, s výhodou 0,5 až 1,0 mg/ml. Výhodnými množstvímikonjugátu je asi 1 až 100 mikrogramů na mililitr, s výhodou i5 až 40 mikrogramů na mililitr. Dávkování závisí na hostiteli - 13 - který dostává vakcínu, a dále na takových faktorech, jako jenapříklad velikost, hmotnost a věk hostitele.

Vakcínové prostředky podle tohoto vynálezu s:e mohou for-mulovat technikami podobnými těm, které se používají u jinýchfarmaceutických polypeptidových prostředků. Pomocné činidloa konjugát se mohou skladovat v lyofilizované formě a rekonstituovat se ve fysiologicky přijatelném vehikulu (rozpouštědle);tím se před podáváním vytvoří suspense. Pomocné činidlo akonjugát se také mohou sklač&amp;zat ve vehikulu. Výhodnými v.ehi-kuly jsou sterilní roztoky, zvláště sterilní pufrované roz-toky, jako je například fosfoe/rčnanem pufrovaný solný roztok.Vhodný je jakýkoliv způsob kombinování pomocného činidla akonjugátu ve vehikulu, který zlepšuje imunologické učiňmejednotlivých složek prostředku.

Vehikulum. může obsahovat ochranná činidla nebo jiné známépřísady, o nichž je známo, že zlepšují stabilitu obslu neboúčinnost směsi. Mezi vhodná ochranná činidla patří napříkladthimerosal.

Objem jednotlivé dávky vakcíny^odle tohoto vynálezu semůže měnit. Obvykle se však pohybuje v. mezích obecně používa-ných u konvenčních vakcín. Objem jednotlivé dávky se s výho-dou pohybuje mezi asi 0,1 ml a asi 1,5 ml, výhodněji meziasi 0,2 ml a asi 0,5 ml při shora uvedených koncentracíchkonjugátu a pomocného činidla.

Vakcínové prostředky podle tohoto vynálezu se mohou po-dávat konvenčními způsoby. Mezi výhodné způsoby^atří podávánísubkutánní, intramuskulární a intradermální nebo podávání no-sem. Směs se může uvolňovat také z biodifundovatelného im-plantátu. Lze používat způsob jediného podávání. L£e však po-užívat i způsob se sérií podávání po období několika dnů neboněkolika týdnů. - 14 - Příklady provedeni vynálezu

Tento vynález je ilustrován následujícími neomezujícímipříklady. Příklad 1 V tomto příkladu je popsána isolace, příprava a konjugacemeningokokových polysacharidů skupiny A a C.

Polysacharidy- se získávají z kultivačních extraktů N.meningitidis kmene 604A pro skupinu A a kmene 2241C pro sku-pinu C. Tyto kmeny se získají ze sbírky kolekcí Laboratorníhostřediska pro kontrolu chorob (Laboratory Center f.or DiseaseControl), Otawa, Ontario. Kultivují se v chemicky definovanémmediu, jak popisuje Kenny a spol.: Bull. W.H.O. 37. 569(1957). Po fermentac.i (patnáct hodin) se bakterie zabijí při-dáním formalínu na konečnou koncentraci 0,75 %· Kontinuálnímodstřelováním se odstraní bakterie. Polysacharidy se isolují :ze supernatantu. Vyčistí se v podstatě tak, jak to popisujeBundle a spol.: J. Biol. Chem, 249. 4797 až 4801 (1974) s tím,že protein se extrahuje mícháním roztoku surového polysacha-ridu se studeném (teplota 4 °C) 90% fenolem místo horkého(o teplotě 50 až 60 °C) fenolu. Tato modifikace zajišťuje,že se produkují a isolují polysqcharidy o vysoké molekulovéhmotě.

Depolymerace. polysacharidů skupiny'A se provádí tak, žese přírodní meningokokový pólysacharid skupiny A (průměrnámolekulová hmota 30 000, 150 mg) rozpustí ve 20 ml pufru oc-tanu sodného (100 ml, pH 5,0) a zahřívá se na 70 °C. Depoly-merace ae sleduje PPLC (Pharmacia) na extrusní koloně s ná-plní gelu Superose 12 ták dlouho, dokud se nezíská žádanámolekulová hmota (12 000). Tento materiál se dialysuje pro-ti destilované vodě při teplotě 4 °C. Lyofilizací se- získá 13,5 mg amorfní pevné látky. Při redukci depolymerovaného pčfysacharidu skupiny A sedepolymerovaný polysacharid skupiny A (100 mg) rozpustí ve - 15 - 3 ml tris (HC1) pufru (200 mM, pH 7,2) a ochladí se na 0 °C. K míchanému roztoku se během tří hodin přidá 2,5 mg hydrido-bpritanu sodného. Toto přidání se opakuje celkem pětkrát.Přidáváním kyseliny octové (100 mM) se: pH roztoku udržuje nahodnotě 7,5 až 7,8. Přidáním 1M kyseliny octové se pH roztokusníží na 5,5. Rozloží se tak zbývající hydridoboritan. Potomse přidáním 100 mM hydridoboritanu sodného zvýší pE na 7,5.Roztok, se odsolí na koloně s náplní Bio-Gel P6DG (Bio-Rad)(kolona o velikosti 1,6 x. 100 cm) a eluuje se vodou. Eluents maximea se sebere a lyofilizuje. Získá se tak 11,7 mg zredu-kovaného produktu.

Depolymerovaný a zredukovaný polysacharid skupiny A(110 mg) se rozpustí ve 2 ml roztoku jodistanu sodného (50 mM).Výsledný roztok se udržuje ve tmě jednu hodinu za teploty míst·nosti. Potom se přidá ethylenglykol (50 /Ul) a roztok se nechástát jednu hodinu za teploty místnosti. Tento roztok, se odsolína koloně (1,6 cm x 100 cm) s náplní Bio-Gel P6LG Bio-Rad vevodě. Eluent s maximem se sebere a lyofilizuje. Získá se tak108 mg oxidovaného produktu. Tento materiál se pak rozdělí po-dle velikosti na koloně Bio-Gel A 0.5 (1,6 x. 100 cm, v PBS Bio-Rad). Frakce, které se z kolony eluují z kolonypři Kp 0,5 až 0,6 (průměrná molekulová hmota 10 000 až15 000)' podle měření FPLC (Phamracia) na koloně Superose 12(HR 10/30, Pharmacia), se seberou, dialyzují a lyofilizují. Přírodní menéngokokový polysacharid skupiny C (200 mg)se: rozpustí ve 20 ml vody, ke které se přidá roztok (2 ml)jodistanu sodného (100 mM) (200 ^uM) ve vodě. Depolymeračníreakce byla sledována analýzou FPLC jak je to popsáno propolysacharid skupiny A. Když se dosáhne žádaného rozmezíprůměrné molekulové hmoty, reakce se zastaví přidáním ethy-lenglykolu (100 ^ul) a roztok, se nechá stát jednu hodinu zateploty místnosti. Potom se roztok dialyzuje a vysuší se vy-mrazením.

Oxidovaný GCMP se rozdělí podle velikosti gelovou filtrací na koloně (1,6 x 100 cm) s náplní Bio-Gel A 0.5 - 16 - v PBS (Bio-Rad). Frakce,, které se z kolony eluují při Kp 0,5^až 0,6 (průměrná molekulová hmota 10 000 až 15 000), jakbylo stanoveno měřením FPLC (shora popsaným), se spojí, dia-Jlyžují a lyofilizují. GCMP fragmenty obsahuji na obou koncíchaldehyd.

Oxidované fragmenty polysacharidů bučf A nebo C (90 mg)se rozpustí ve 100 mM hydrogenuhliětanu sodného (pH B,l) po-užitého jako pufr. (2 ml). K roztoku se přidá monomer toxoidutetanu (30 mg). Následuje přidání kyanhydrioboritanu sodného(Aldrich, Milwaukee, Wi., 60 mg). Roztoky se pak inkubujíčtyři dny při te^Lotě 37 °C. Reakční směsi se pak přímo apli-kují na kolony s náplní Bio-Gel A (0.5) (200 až 400 ml, 1,6 x 100 cm) (Bio-Rad) v PBS. Prvky, které obsahují konjugáty,se dialyzují proti destilované vodě a lyofilizují. V konju-gátech byl molární poměr polysacharidů k toxoidu tetanu2 až 3 : 1. Příklad 2 Následující příklad popisuje přípravu a konjugaci menin-gokokového polyasacharidu (N-propionyl- a N-butanoyl-) skupi-ny B.

Anhydridy kyseliny propionové a butanové byly společněs kyselinou kolominovou získány od firmy Sigma Chemicals Co.,St. Louis, Mo. Jelikož kyselina kolominová je strukturně iden-tická S- meningokokovým; polysachariďem skupiny B (GBMP), jena ní dále odkazováno jako na GBMP. Toxoid tetanu byl zísfenz Institutu Armand-Frappier, Laval, Quebec. Monomerní formatoxoidu tetanu byla získána pasážováním shora uvedeného pří-pravku kolonou (1,6 x 90 cm) s náplní Bio-Gel (obchodníznačka) A 0.5 ) (Bio-Rad, Richmond, Ka.), ekvi- librována a elúována 0,01M fosforečnanem pufřovaným fysiolo-;gickým solným roztokem (PBS) (pH 7,4)* N-Deacetylace GBMP se provádí následujícím způsobem: GBMP (sodná sůl, 1,0 g) se rozpustí v 5 ml 2M hydroxidu sodného. s - 17 - Přidá se tetrahyďridoboritan sodný (150 mg). Roztok se zahří-vá Šest hodin na 110 °C v teflonové nádobce (60 ml) se sru-bovým uzávěrem. Tento postup je v podstatě popsán Haroldem J.Jenningsem a spol. v J. Immunol. 134. 2651 (1985) a v USApatentu 4 727 136. Ochlazený zředěný roztok se pak vyčerpáva-jícím způsobem dialyzuje proti destilované vodě při teplotě4 °C á lyofilizuje se. Skutečnost, že byl získán N-deacetylo-vaný GBMP, se zjistí na základě nepřítomnosti methylacetamido-vého signálu (singlet při 2,07 ppm) v ^H' Nffi spektru N-deace-tylovaného GBMP.

Acetylace GBMP se provádí podle následujícího postupu.N-Deacetylováný GBMP (1,0 g) se rozpustí v 50 ml 5% vodnéhohydrogenuhličitanu sodného. K jednotlivým podílům (10 ml shorauvedeného roztoku) se přidá bučí anhydrid kyseliny propionovénebo anhydrid kyseliny butanové. Tato reakční činidla se při-dají třikrát po 0,5 ml během tří hodin za teploty místnosti,při čemž se pH roztoku udržuje na 8,0 přidáváním 0,5Nhydroxidu draselného. S každým přidáním anhyďridu se současněpřidá methanol (0,5 ml), aby se; zvýšila rozpustnost. Nakonecse roztoky ..míchají Šestnáct hodin při teplotě 4 °C, vyčerpá-vajícím způsobem se dialyzují proti destilované vodě při 4°Ca lyofilizují se. Ve všech případech byly N-propionylovanýa N-butanoylovaný GBMP získány ve výtěžcích převyšujících90 %. Ve všech případech byla v podstatě upíná N-acetylacepotvrzena zmizením signálu N-deacetylováného GBMP v NMRspektru. .

Aktivace N-acetylovaného GBMP se provádí tak, že seoxidací perjodistanem zavede koncová sapina - aldehydová naoba konce. N-Acatylovaný GBMP se oxiduje v O,1M vodném roz-toku jodistanu sodného (10 ml) dvě hodiny za teploty místnostive tmě. Nadbytek jodistanu se pak rozloží přidáním 1 ml ethy-lenglykolu. Tento roztok se vyčerpávajícím způsobem dialyzujepři teplotě 4 °C a lyofilizuje. Použití hydridoboritanu sodnéhopři N-deacetylačním postupu (vyjma u GBMP) vede k transformaciterminálních redukujících zbytků kyseliny sialové každéhoN-acetylovaného GBMP na otevřené zbytky polyolového řetězce. ‘Ά - 18 -

Tento typ zbytku je citlivý na oxidaci jodistanem (viz: J.Immunol* 127« 1011 (1981) a USA patent: č. 4 356 170 (Harold iJ.. Jennings a spol.), což vede: k zavedení aldehydových skupin,do N-acylováných GBMP na obou koncích. Různé N-acylované GBMP se dělí podle velikosti filtracína gelu na koloně (IBF Biotechnics, Savage, Md.) s náplní Ul-trogel (obchodní značka) AcA 44 (perličky o průměru 60 až 140/um) s: PBS jako elučním činidlem. Získají se tak žádané prů-měrné molekulové hmoty oxidovaného materiálu N-acylo^hoGBMP. Frakce, která se: eluují z kolony při Kp 0,5 až Kp 0,7,jak bylo změřeno FLPC (viz níže), se spojí, dialyzují a lyo-;filizují. Tento rozsah Kp 0,2 až 0,4, odpovídající fragmentůms: průměrnou molekulovou hmotou v rozmezí od 30 000 do 40 000,se také spojí a konjuguje.. Materiál., o který nám jde, je tedymateriál v rozmezí Kp od 0,2 do 0,7.

Oxidované ffagmenty se rozpustí (100 mg) v. O,1M pufru.

(2 ml) hydrogenuhličitanu sodného (pH 8,1). K tomuto roztokuše přidá toxoid tetanu (20 mg). Nakonec: se: po přidání kyan-hyďridoboritanu sodného (40 mg) roztok mírně míchá za teplo-ty místnosti. Průběh konjugace se sleduje FPLC gelovou filtra-cí na koloně se Superosou (obchodní značka) 12 HR10/30 fPhar-macia), prováděnou isokraticky rychlostí 1 ml/min v pufru PBS při pH 7,2. Jak protein tak N-acylované GBMP fragmenty bylysledovány při 214 nm. Tyto fragmenty měly Kp 0,6, toxoid tetanuměl Kp 0,39* Ve většině případů byly konjugace kompletníběhem dvou dnů, byly však nechány probíhat po dobu čtyř dnů.Potei?iální nezreagované alděhydové skupiny byly nakonec1zredukovány hydridoboritanem sodným (20 mg) před gelovou filtrací.

Konjugáty polysacharidu s toxoidem tetanu byly dělenyod polysacharidových fragmentů gelovou filtrací na koloněs: Bio-Gel A, eluce PBS. Eluát, který obsahoval konjugát, se.d?ialyzuje proti destilované vodě a lyofilizuje. Konjugáty N-acylovaný GBMP - toxoid tetanu obsahovaly od 12 do 30 typic-ky od 12 do 20 % sialové kyseliny, jak to bylo stanoveno zpŮ- 19 - sobem popsaným Svennerholmem L.: "Quantitative Estimation ofSialic Acids, II, A Colorimetric Resorcinol-Hydrochlorid ScidMethod”, Biochim. Bióphys. Acta 24. 604 (1957) (resorcinolovámetoda). To znamená, že v konjugátech byl molární poměr poly-sacharidu k toxoidu tetanu 2 až 3 : 1. Příklad 3 Následující příklad popisuje obecný způsob komplexacepomocného činidla (esteru peptidu nebo alkylaminové kyselinys alkylovou skupinou s dlouhým řetězcem) s konjugátem polysa-charid-proteinový nosič.

Pomocné činidlo (alkylester a alkylovou skupinou s dlou-hým řetězcem) se rozdrtí a proseje. Příslušné množství se od-váží do nádobky tak, aby koncentrace suspenze pa přidání sol-ného roztoku f^sforečnanového pufru (10 mísí fosforečnanu, pH7,4) byla 1 až 2 mg sloučeniny na ml. Suspenze se řádně pro-míchá, přidá se stejný objem konjugátu se stejném pufru avše se mírně třepe šestnáct hodin při 4 °C. Na konci komplexa-ce, jestliže je žádoucí změřit množství konjugátu komplexová-ného s pomocným činidlem, se suspenze odstřeluje a koncentracekonjugátu (proteinového nosiče) v supernatantu se atanoví způ-sobem Lowryho a spolčí J. Blokem. Chemistry 193. 265 až 275(1951)· Získá se, tak množství navázaného konjugátu. 30 % až90 % navázaného konjugátu obvykle znamená dobrý komplex pomoc-né činidlo - polysacharidový konjugát. Pro imunizační pokusybyl použit jak navázaný tak nenavázaný konjugát. Příklad 4

Tento příklad ukazuje možnost použití několika esterůS' dlouhým řetězcem (18 atomů uhlíku) s konjugovanými vakcínamimeningokokový polysácharid - toxoid tetanu. Bílé myší samičky CF1 ve stáří osm e/deset týdnů se imu-nizují intraperitoneální injekcí přibližně 15 mikrogramů - 20 - konjugátu na zvíře (přibližně 3 mikrogramy polysgcharidu) napočátku pokusu a dále pak 14« a 28. den. 39. den ae myši ne-ichají vykrvácet propíchnutím srdce. Celkový objem injekcebyl 0,2 ml a£ už v přítomnosti pomocného činidla nebo bez po-mocného činidla u kontrolních myší.

Meningokokové polysacharidy se konjugují s toxoidním no-sičem způsobem reduktivní aminové kondenzace, jak shora uve-deno. Chemicky modifikovaný meningokokový pólysacharid B sepřipraví jak shora uvedeno.

Koncentrace proti^tky v seru se stanoví enzymovou imuno-analýzou následujícím způsobem. Polystyrénové desky s 96 jam*kami (Corning) se potáhnou příslušným konjugátem kapsulárnípólysacharid - hovězí serumalbumin v pufru fosforečnanovéhosolného roztoku (10 mM fosforečnanu, pH 7,4) v koncentracijeden mikrogram na jamku na hodinu při 37 °C. Desky se. pakblokují jednu hodinu při tJlotě 37 °C 0,1% hovězím serumalbu-minem ve fosforečnanovém sojlném pufru. Po blokování se deskyvyprázdní a promyjí se čtyřikrát fosforečnanovým solným; pufřem,který obsahuje 0,05 % Tweenu 20 (detergent) (PBST). Do prázd-ných jamek se přidá vzorek (vzorky) pro analýzu. Tyto vzorkyse pak inkubují jednu hodinu za teploty místnosti. Po pětipromytích PBST se do každé jamky přidá peroxidasou značenýkozí protimyší IgG (H + L) konjugát, 1/200 v PBST. Desky seinkubují půl hodiny za teploty místnosti. Po dalších pětipromytích PBST se do každé jamky přidá tetraměthylbenzidin adesky se. inkubují deset minut za teploty místnosti. Enzymemkatalyzovaná reakce se zastaví 1M kyselinou fosforečnou. Po-tom se odečte absorbance při 450 nm pro každou jamku desko-vým čtecím zařízením (Ďiotek). Titr protilátky je v převrácenéhodnotě ke zředění vzórku, který má absorbanci 1,0. Tyto titryse vyjádří jako poměr vzhledem ke kontrole (bez pomocnéhočinidla). Výsledky jsou uvedeny v tabulce I. 21 -

Tabulka I

Protilátkové odpověď na meningofeokové konjugované vakcínyv přítomnosti esierů s dlouhým řetězcem (18 atomů uhlíku).Titry jsou uvedeny jako poměr k protilátkové odpovědi v ne-přítomnosti pomocného činidla (kontrola; konjugovaná vakcínav pufrovaném solném roztoku). pomocné činidlo meningokokový konjugát A. B. (butanoyl) C. kontrola (PBS)oktadecyl-tyrosin 1,0 1,0 1,0 0,5 mg/ml 3,5 1,3 1,9 1,0 mg/ml 3,7 1,9 3,2 oktadecyl-tyrosyl-glycin 0,5 mg/ml 3,0 1,8 1,9 N-glycylethanolamin-O-stearát 0,5 mg/ml 1,0 1,5 1,0 oktadecyl-lysin 1,0 mg/ml N.D. 1,3 1,8 oktaďecyl-fórře^in 1,0 mg/ml N.D. 1,9 1,8 N.D. znamená nestanoveno £: :: í Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce I, ukazují, žeestery s. dlouhým řetězcem vykazují značný adjuvantní efektna konjugáty bakteriálního póly sacharidu - fýooidu tetanu, i který závisí na typu esteru a na typu přítomného bakteriální- / ho polysacharidu. Toto je specifický jev. Tento jev lze vidět / například při srovnání oktadecyltyrosinu s N-glycylethanol-(amin-O-stearátem meningokokových konjugátů A a C. Příklad 5 ke ,

Tento příklad, demonstruje změnu v isotypu, které dochází - 22 - při přechodu od žádného pomocného činidla ke konjugovanévakcíně meningokokového polysacharidu s toxoidem tetanu spomocným činidlem. Bílé myši CF1 byly imunizovány a jejich sera byla získánastejným způsobem jako je to popsáno v. příkladu 4« Polystyréno-vé desky s 96 jamkami (Corning) byly potaženy příslušným: konju-gátem meningokokového polysacharidu s hovězím serumalbuminemve: f^oforečnanovém solném pufru (10 mM fosforečnanu, pH 7,4)jak shora popsáno v příkladu 4» Tyto desky se blokují jednuhodinu při teplotě 37 °C, potom půl hodiny za teploty míst-nosti s 2,5$ odstředěným mlékem ve fosforečnanovém solnémpufru.

Po čtyřech promytích PBST se přidají vzorky (přidá vzorek)pro analýzu isotypu. Inkubace se nechá probíhat jednu hodinuza teploty místnosti. Po pěti promytích se do každé jamkypřidá sonda specifická pro králičí myší podtřídu (Bio-RadLaboratories), Mouše Typer subisotypový panel, a desky se: in-kubují jednu hodinu za teploty místnosti. Po dalších pěti přo-mytích opět PBST se přidá peroxidasou značený kozí protikrá-ličí konjugát (LgG (ΙΓ + L) konjugát, 1/3000 v PBST) a deskyse inkubují půl hodiny za teploty místnosti.. Po dalších pětipromytích PBST se: do jamek přidá tetramethylbenzidin, deskyse: inkubují šest minut za teploty místnosti a reakce se zas-taví přidáním 1M kyseliny fosforečné. Deskovým: čtecím zaří-zením (Biotek) se pro každou jamku odečte absorbance při 45Qnanometrech. Titry protilátky jsou nepřímo úměrné zředěnívzorku násobenému absorbancí. Titry se vyjadřují jako rela-tivní poměr ke kontrole (bez pomocného činidla). Výsledkyjsou uvedeny v tabulce II.

Tabulka II

Isotypové variace odpovědi na antimeningokokový konjugát Aa C. Titry jsou uvedeny jako poměr protilátky v a bez příto-mnosti pomocného činidla (kontrola: konjugovaná vakcína v - 23 - pufrovaném solném roztoku)„ Koncentrace pomocných Šindelje 0,5 mg/ml. pomocné činidlo imunoglobulin (meningokokový. A) IgGl IgG2a 1^02 b IgG3 IgM kontrola (PBS) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 oktadecyltyrosin 2,6 5,7 4,3 4,4 3,4 oktydecyltyrosylglycinN-glycylethanolamin-0- 1,6 3,9 3,6 2,6 1,6 stearát 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 pomocné činidlo imunoglobulin (meningokokový ' C) IgGl IgG2a IgG2 IgG'3 IgM kontrola (PBS) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 oktyděoyltyrosin 2,1 5,2 2,3 4,3 1,7 oktaďecyltyrosylglyc inN-glycylethanolamin-0- 2,1 2,9 1,9 2,9 1,7 stearát 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce II, ukazuji, žeestery s. dlouhým řetězcem ovlivňují isotypovou distribucipříznivým způsobem. To lze vidět například na základě poměruIgG2a/IgGl (který je 2,2 ' pro antimeningokokový A a 2,5 pro antimeningokokový C) v přítomnosti oktadecyltyrosinujako pomocného činidla. Příklad 6

Tento příklad ukazuje, že zvýšená protilátková odpověňv přítomnosti pomocného činidla, kterým je ester s dlouhým *’ řetězcem, se přenáší do positivní^ biologických účinků;chrání proti napadení živými pathogenními bakteriemi. Bílé myši CF1 byly imunizovány stejným způsobem jako jeto popsáno v příkladu 4. Myším bylo 40. den podáno intraperi-toneální injekcí přibližně 2000 mikroorganismů N. meningiti- 24 - dy B, serotyp 2b, kmen 80165. Po pěti hodinách byla myšímodebrána krev a počet., živých bakterií byl stanoven jako"kolonie tvořící jednotky" (CFU/ml). Meningokokové polysacha-ridy (N^propionyl- a N-butane?!-) byly připraveny reakcí dě-N-acetylováných polysacharidů působením příslušných anhydri-dů shora popsaným způsobem. Výsledky jsou uvedeny v tabulce XII.

Tabulka III

Aktivní ochrana myší konjugáty N-propionylovou šupinou (NPr)a N-butanoylovou skupinou (NBu) modifikovaného meningokokové-ho polysacharidů B s toxoidem tetanu (TT) s oktadecyltyrosyl-glycinem jako pomocným činidlem. Koncentrace pomocného činidlaje 0,75 mg/ml. imunogen CFU/ml počet myší sbakteriemi 1) pomocné činidlo 3584 5/5 2) NPr-polysacharid 2664 5/5 3) konjugát NPr-polysacharid-TT 640 4/5 4) konjugát NPr-polysacharid-TT + pomocné činidlo 0 0/5 5) konjugát NBu-polysacharid-TT + pomocné činidlo 296 1/5 Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce III, ukazují, Žepolysacharidov.á konjugovaná vakcína společně s pomocným či-nidlem poskytují nejlepší ochranu. Pomocné činidlo samotnénení líčinné.

Claims (25)

1. - 25 - PATENTOVÉ N / R O K Y

   1. Vakcínový prostředek, vyznačující se tím,že obsahuje konjugát bakteriálního polysacharidového pro-teinu a efektivní množství alespoň jednoho pomocného činidlaobecného vzorce ť ‘ f ° '"ΤλΪγθο* i JL 'λΖ3ΤΓ·,αΛ ‘ B - R , | a vy o '6 0 v němž C znamená skupinu, která je vybrána ze skupiny}sestá-vající z aminokyselinového zbytku, atomu vodíku a peptido^feP0 ?ho zbytku, j | D znamená skupinu, která je vybrána ze skupiny ses^ág^-g }? 0jící z atomu vodíku a farmaceuticky přijatelné kyseliny, *Γ*ϋ E znamená skupinu, která je vybrána ze skupiny sestává-*jící ze 4-hydroxybenzylové skupiny, benzylové skupiny, 4-hyďroxyfenylové skupiny, fenylové skupiny, 4-aminobutylovéskupiny, isopropylové skupiny, methylové skupiny, atomu vo-díku a zbytku přirozeně se vyskytující aminokyseliny, A znamená skupinu obecného vzorce (CHg)^ atom kyslíkunebo skupinu CI^O s 3 znamená skupinu (CH2)n nebo atom. kys-líku, kde n znamená číslo od nuly ďo čtyř, s tím, že A a Bneznamenají stejnou skupinu v případě (θΗ2)η a atomu kyslí-ku a R znamená alkylovou skupinu s dvanácti až dvaceti ato-my uhlíku·
2. 2. Prostředek podle bodu 1, vyznač u. j í c í s e t í mže se jako pomocné činidlo používá aminokyselina s L-konfi-gurac í·
3. 3. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se tímže se jako pomocné činidlo používá aminokyselina s D-konfigu- raci. - 26 4\· Prostředek podle bodu 1, vyznačující sett £ m. , že pomocné činidlo obsahuje aminokyselinu směsiD- a E-konfigurace. /
4. 5. Prostředek pd/£le bodu 1, v y znač u; j í c í se t í πτ , že E znamená skupinu, která je vybrána ze skupinysestávající ze 4-hydroxybenzylové skupiny,, benzylové sku-piny, 4-hydroxyfenylové skupiny,, fenylové skupiny a atomuvodíku.
5. 6. Prostředek podle bodu 5, vyznačující s etím, že E znamená 4-hydroxybenzylovou skupinu.
6. 7. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se t: í m , že C znamená skupinu, která je vybrána ze skupinysestávající z atomu vodíku, zbytku aminokyseliny a· zbytkupeptidu s. až deseti aminokyselinami.
7. 8. Prostředek podle bodu 7, v y z n a Sující s e t. í im , že peptidový zbytek je vybrán ze skupiny sestávajícíz dipeptidu a tripeptidu«
8. 9. Prostředek podle bodu 7, v y z n a. č u j í c í s etím, že O znamená aminokyselinu, která je vybrána zeskupiny sestávající z tyrosylglycinu, glycylglycinu, gly-cyltyrosinu a fenylalanylglycinu.
9. 10. Prostředek podle, bodu 8, vyznačující setím, že C znamená dipeptid, který je vybrán ze skupinysestávající z tyrosylglycylglycinu a tyrosylalanylglycinu,
10. 11. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že farmaceuticky přijatelná kyselina je vybránaze skupiny sestávající z kyseliny chlorovodíkové, kyse-liny bromovodíkové, kyseliny fosforečné, kys^iny sírové,kyseliny vinné, kyseliny mléčné a kyseliny octové. -27 -
11. 12. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se t í m: , že pomocné činidlo obsahuje alfa-aminoky s.elinu.
12. 13. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že bakteriální polysachariaový polypeptid jenavázán na biologický nosič.
13. 14. Prostředek podle bodu 13, vyznačující setím;, že nosič je vybrán ze skupiny sestávající ztoxoidu tetanu, toxoidu difterie (záškrtu), nebuněčné vak-cíny černého kašle (LPF), zkříženě reagujícího materiálu(CRM) a bakteriálního nosného proteinu.
14. 15. Prostředek podle bodu 14, v y z na č u jící set í m , že se jako CEM používá CRM^Oy.
15. 16. Prostředek podle bodu 1, vyznačující s etím;, že se jako bakteriální polysacharid používá bak-teriální polysacharid, který je vybrán ze skupiny sestá-vající z kapsulárního polysaeharidu, lipopolysacharidu asubka^piárního povrchového polysaeharidu.
16. 17. Prostředek podle bodu 16', vy z n a č u. j í c í se t í m , že kapsulární polysacharid je isolován ze skupinysestávající z Haemophilus? influenzae, Neisseria meningiti-dis, Streptococcus pneumonia, Streptococcus agalactiae,Salmonella typhi, Escherichia coli a; Staphylococcus aureus.
17. 18. Prostředek podle bodu 16, v y z n. a. č u. jí c í set í m; , že lipopolysacharid je isolován ze skupiny se-stávající z Neisseria meningitidis, Escherichia coli,Salmonella typhi a Pseudomonas aeruginosa.
18. 19. Prostředek podle bodu 1, v y z n a. č u j í c í se 1 tím , že subkapsulární (povrchový) polysacharid je vy-brán ze skupiny sestávající z obvyklého polysacharidovéhoantigenu skupiny A, B a C Streptococci a obvykléhopolysacharidového antigenu Streptococcus pneumoniae. - 28 -
19. 20. Prostředek podle bodu 1, vyznačující set. í' m. , že se jako pomocné činidlo používá ester alkyl-alkoholu se čtrnácti až dvaceti atomy uhlíku a aminokyseli-na,, dipeptid nebo tripeptid.
20. 21. Prostředek podle bodu 20, vyznačující set í m , že se jako pomocné činidlo používá oktadecylty-rosin.
21. 22. Prostředek podle bodu 20, vyznačující seti m , že se jako pomocné činidlo používá oktadecylty-rosylglycin.
22. 23. Způsob vyvolání imunitní odpovědi u pacienta, vyzna-čující se tím, že obsahuje stupeň podává-ní terapeuticky efektivního množství vakcínového prostřed-ku podle bodu 1 tomuto pacientovi.
23. 24. Způsob podle bodu 23, vyznačující se tím,že se prostředek podává intramuskulárně, intradermálně,subkutánně nebo nosem.
24. 25. Způsob podle bodu 23, v y z n a č u; j í c í s e t í m ,že podávání vakcínového prostředku podstatně nezvyšuje hla-dinu IgS protilátek a zvyšuje poměr IgG2a k IgGl protilát-kám.
25. 26. Způsob přípravy vakcínového prostředku, vyzná Č u -jící se t í m , že obsahuje stupeň formulacebakteriálního polysacharidového proteinového konjugátu apomocného činidla podle bodu 1 v množstvích postačujícíchpro přípravu imunologicky efektivního vakcínového prostřed-ku. Zastupuje: