CZ42993A3

CZ42993A3 - Vaccine

Info

Publication number: CZ42993A3
Application number: CS93429A
Authority: CZ
Inventors: Christopher L Penney; Francis Michon; Harold J Jennings
Original assignee: North Amarican Vaccine
Priority date: 1990-09-17
Filing date: 1991-09-12
Publication date: 1994-04-13
Also published as: EP0549617B1; HU9300746D0; NO930938D0; CS283991A3; HRP920874A2; IE913261A1; GR3020117T3; YU153291A; NZ239643A; MX9101077A; WO1992004915A1; OA09776A; US5773007A; DE69118389D1; NO930938L; IS3753A7; FI931169A; CN1060408A; AU8441991A; JPH06500772A

Description

Oblast vynálezu

Vynález se týká vakcíny se zlepšenou imunogenitou, zejména vakcíny, obsahující bakteriální polysacharid, kovalentně vázaný na bílkovinný nosič v kombinaci s alkylovou sloučninou s dlouhým řetězcem. Nosič a dlouhý alkylový řetezec mají ve vakcině pomocný účinek.

Dosavadní stav techniky

Je dobře známo, že vakcíny jsou důležitou součástí profylaxe infekčních onemocnění. Je možno je získat tak, že se hostitelský živočich vystaví účinku cizorodého materiálu, který aktivuje imunologický systém hostitele, čímž vzniká imunita proti tomuto materiálu, aniž by vznikalo riziko onemocnění. V současné době se běžně používá a dodává přibližně 20 různých vakcin. Většina těchto vakcin se získává detoxikací organismu, který onemocnění způsobuje, nebo detoxikací části tohoto organismu nebo izolací specifické netoxické části tohoto organismu. Známým příkladem posledního z uvedených postupů je izolace kapsulárních polysacharidů meningokoků a pneumokoků, které jsou základem pro vakcinu proti zánětu mozkových blan a zánětu plic. Avšak vakciny na bázi polysacharidů nejsou dobrými imunogenními látkami vzhledem k tomu, že při jejich použití nevzniká dostatečné množství ochranných protilátek u jednotlivců s nedostatečně vyvinutým nebo porušeným imunním systémem. V případě nedostatečného vývoje jde především o malé děti a ve druhém o starší lidi nebo o ty, kteří trpí chorobami imunologického systému. Mimoto imunologická odpověčí, k níž dochází, je nezávislá na T-buňkách a tím také nedochází ke zvýšené tvorbě protilátek po podání další injekce téhož materiálu. Závislost na T-buňkách je důležitá pro indukci vzniku protilátek typu IgG a buněk, které vytvářejí pamět na již podaný materiál. Pouze v tomto případě totiž se po opakovaných injekcích vakciny vytvářejí protilátky typu IgM i IgG. mimoto se velikost tvorby protilátek zvyšuje po každé injekci vakciny v případě, že je odpověd závislá na T-buňkách. Imunologie polysacnaridových vakcin byla shrnuta v publikaci Jennings a další, The Polysaccharides,.vyd.

G. O. Aspinall, sv. 1, 291 - 329, 1982.

Konjugace nebo kovalentní vazba polysacharidů na příslušný bílkovinný nosič může zlepšit imunologickou funkci v tom smyslu, že dojde k odpovědi, závislé na T-buňkách a tím i k paměti na dříve podaný materiál. V prosinci 1987 byla povolena první vakcina tohoto typu v USA pro použití u člověka. Tato vakcina byla tvořena kapsulárním polysacharidera H. influenzae b, kovalentně vázaným na toxoia záškrtového bacilu jako na bílkovinný nosič. Tato vkacina byla použita u dětí ve stáří 18 měsíců jako polysacharidová vakcina s omezeným účinkem v tomto věku. Další vakcina s· obsahem téhož polysacharidů z H. influenzae b byla připravena odlišným způsobem a byla rovněž v USA povolena v současné době.

Polysacharidové vakciny a vakciny na bázi konjugátů polysacharidů a bílkovin jsou čistšími a z tohoto důvodu bezpečnějšími vakcinami než klasické vakciny na bázi bakterií nebo virů, protože tento typ vakciny je často znečištěn toxickými vedlejšími produkty, přesto že bakterie nebo virus byly biochemicky detoxikovány působením chemických látek, působením tepla nebo genetickým zeslabenímAvšak vzhledem k tomu, že vakcina s obsahem polysacharidů nebo s obsahem konjugátu polysacharidů a bílkoviny je čistší, často to znamená, že byly odstraněny také přírodní látky, stimulující imunologický systém, takže tyto nové vakciny jej již stimulují nedostatečně. Z přírodních imunostimulač3 nich látek je možno uvést některé bakteriální složky, například lipopolysacharidy, lipoproteiny a muramyldipeptid, všechny tyto látky jsou však toxické. Mimoto může mít i bílkovinný nosič určitý stupeň toxicity, takže je žádoucí užít co nejmenší množství tohoto nosiče.

Například záškrtový toxoid a příbuzná molekula CRM 197, jsou běžně užívané molekuly jako nosiče pro vakciny typu konjugátů pro použití u člověka. Dospělí však mohou vyvíjet místní nebo obecnou přecitlivělost na tyto nosné molekuly. Aby bylo možno tyto účinky zlepšit, podávají se spolu s vakcinami pomocné prostředky, které podporují vyšší tvorbu protilátek. Tyto pomocné složky často nabízejí také možnost ovlivnit typ protilátky, produkovaný jako odpovšá na podání vakciny. Například přesto, že po imunisaci vakcinou na bázi konjugátu polysacharidu a bílkoviny dochází k serokonversi a následné přeměně produkce protilátky IgG, u myši se vytvoří jako odpověa především protilátka typu IgGl. Vzestup produkce protilátky typu IgG2a by však byl příznivý vzhledem k tomu, že jde u myší o nejúčinnější protilátku vzhledem k aktivaci komplementu. Tato cesta může zajistit důležitý obranný mechanismus proti celé řadě bakteriálních infekcí.

Pokud jde o pomocné prostředky pro běžné použití, pouze soli hliníku a vápníku se v současné době běžně dodávají a používají jako pomocné prostředky. Avšak soli hliníku a vápníku nejsou silnými pomocnými prostředky. Vápenaté soli mají pouze omezené použití. Hlinité soli mají sice širší použití u různých vakcin, avšak v případě vakcin na bázi konjugátů polysacharidu a bílkoviny bylo při použití hlinitých solí dosaženo jen malého úspěchu. Byly podány zprávy o tom, že hydroxid hlinitý dokonce působí inhibici tvorby protilátek při použití spolu s vakcinou na bázi konjugátu polysacharidu H. influenzae b a tetanového toxoidu, jak byly popsány v publikaci B. Robbins a další, J. Pediatrics,

112, 695 - 702, 1988, J. B. Robbins a další rovněž popisují totéž potlačení tvorby protilátek v případě použití hydroxidu hlinitého spolu s vakcinou na bázi polysacharidu ze S. typni a toxinu cholery ve formě konjugátu, jak bylo popsáno v J. Experimental Medicine, 166, 1510 - 1524, 1987. Mimoto mohou vyvolat hlinité soli přechodnou nebo chronickou tvorbu místních granulomů v místě injekce. L. H. Collie v časopise Lancet, 1354 - 1367, 1987 uvádí, že výskyt a závadnost reakcí na vakcinu, obsahující toxoid tetanu závisí na přítomnosti hliníku jakopomocné látky. Příprava pomocných látek s obsahem hliníku není vždy reprodukovatelná. Mimoto může i samotný hliník podporovat tvorbu protilátek typu IgE, které jsou zodpovědné za vznik okamžitých hypersensitivních reakcí, jak bylo popsáno v publikaci T. Matuhasi a další, J. Infections Disease, 146, 192, 1982.

V posledních letech byla pozornost zaměřena na použití organických látek jako pomocných činidel. Jen několik organických sloučenin může působit podobně jako běžné hlinité soli, to znamená jako nosič, pomalu uvolňující antigen, z nějž se antigen uvolní v průběhu dlouhého časového období v místě injekce.

Příkladem takovch organických sloučenin jsou organická smášedla a emulgátory, například Pluronics a Tetronics, jde o neiontové sledové kopolymery polyoxyethylenu a polyoxypropylenu (BASF Corporation). Takový mechanismus se pomalým uvolněním účinné látky je běžně uznáván pro použití u člověka jako velmi vhodný vzhledem k tomu, že vylučuje možnost příliš velké stimulace imunologického systému. Příliš velká stimulace tohoto systému můýe totiž vést k autoimunologické odpovědi, tak jak k ní dochází při použití velmi silné látky, stimulující tento systém, jako je například Freundovo pomocné činidlo. Pomalé uvolnění je tedy velmi výhodné.

I když bylo prokázáno, že většina organických pomocných látek dostatečně stimuluje imunologický systém, jsou tyto účinné látky obvykle toxické a tím nepřijatelné pro použití u lidí. Příkladem těchto známých silných imunostimulačních látek mohou být úplně Freundovo pomocné činidlo a muramyl dipeptid. Obě tyto látky jsou omezeny na použití u pokusných zvířat vzhledem ke své toxicitě. Mnoho organických pomocných látek s účinkem, podobným účinku hlinitých solí je ještě toxičtějších než tyto hlinité soli. Uvádí se, že například aminy s dlouhým alkylovým řetězcem, popsané v publikaci D. Gall, Immunology, 11, 369 - 386, 1966 jsou toxické látky, které obvykle porušují strukturu buněčné membrány.

Je známo, že také oktadecylester aminokyseliny tyrosinu je pomocnou látkou. Tento ester má jen malé imunostimulační vlastnosti, avšak je možno jej použít jako organický ekvivalent hlinitých solí, to znamená jako nosiče pro pomalé uvolnění vakciny. Je tedy možno vytvořit komplex antigenů s oktadecyltyrosinem, který bude pomalu uvolněn nebo desorbován z nerozpustného pomocného prostředku v průběhu času. Tvorba komplexu mezi antigenem a pomocným prostředkem probíhá přes celou řadu slabých, nekovalentních sil, například ve formě hydrofohních interakcí a vodíkových vazeb.

Tento jev byl popsán v US patentových spisech č.

428 932, Overell a č. 4 258 029, Moloney a další. Overell uvádí, že oktadecyltyrosin je možno použít jako pomocnou látku při desensitizaci u různých alergií tak, že se vytvoří jeho komplex s alergeny, například s pylem ze žita nebo různých travin. Moloney a další uvádějí, že oktadecyl tyrosin je možno použít jako pomocné činidlo pro vakciny v případě tvorby jeho komplexu s toxoidem titanu a virem poliomyelitidy typu I, II a III po inaktivaci formalinem. Tentýž jev byl také popsán v publikaci A. Nixon-George a další, J. Immunology, 144, 4798 - 4802, 1990, kas se uvádí, žs oktadecyl tyrosin a další oktadecylestery aromatických aminokyselin působí jako pomocné látky pro vakcinu proti hepatitidě B po tvorbě komplexu s rekombinantním povrchovým antigenem viru hepatitidy B.

Je tedy zřejmé, že by bylo zapotřebí vyvinout netoxické vakciny se zlepšenou imunogenitou na bázi konjugátů netoxických bakteriálních polysacharidů a bílkovin.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří vakcina, obsahující konjugát netcxického bakteriálního polysacharidů a bílkoviny spolu s pomocným činidlem s netoxickým dlouhým alkylovým řetězcem. Toto pomocné činidlo s netoxickým dlouhým alkylovým řetězcem se použije v množství, dostatečném ke zvýšení imunogenity konjugátu polysacharidů a bílkoviny.

Podstatu vynálezu tvoří rovněž způsob vyvolání imunologické odpovědi u teplokrevnýcn živočichů, včetně člověka. K vyvolání imunologické odpovědi se živočichu podá účinné množství vakciny podle vynálezu.

Bylo neočekávaně zjištěno, že netoxické sloučeniny s dlouhým alkylovým řetězcem, zejména estery aminokyselin nebo peptidů, mohou tvořit komplexy s vakcinami na bázi polysacharidů a bílkovin ve formě konjugátů. V důsledku této tvorby komplexů působí sloučeniny s dlouhým alkylovým řetězcem jako nosiče pro pomalé uvolnění účinné látky. To znamená, že sloučeniny s dlouhým alkylovým řetězcem uvolní vakcinu typu konjugátu v hostiteli v průběhu delšího časového období. To má za následek zvýšenou tvorbu protilátek ve srovnání s množstvím protilátek, které se vytvoří pouze po podá7 ní vakciny typu konjugátu. Jak již bylo uvedeno, jde o tentýž pomocný mechanismus, který byl pozorován v případě hlinitých solí a vakcin běžného typu bez obsahu konjugátu. Jak již bylo rovněž uvedeno, jsou hlinité soli jako pomocné látky v případě vakcin na bázi konjugátu bakteriálního polysacharidu a bílkovin obvykle neúčinné. Bylo by proto možno očekávat, že sloučeniny s dlouhým alkylovým řetězcem vzhledem k témuž mechanismu pomocného účinku budou v případě vakcin ve formě konjugátu 'rovněž neúčinné. Je proto velmi překvapující, že tyto netoxické látky s dlouhým alkylovým řetězcem zlepšují imunogenitu vakcin na bázi konjugátů

Bylo rovněž zjištěno, že přítomnost netoxické sloučeniny s dlouhým alkylovým řetězcem jako pomocné látky, typicky alkylaminokyseliny nebo peptidového esteru s dlouhým řetězcem ovlivní také isotyp protilátky, která se vytvoří jako odpověd na podání této vakciny. Jde o zvýšení poměru IgG2a vzhledem k IgGl, k tomuto zvýšení dochází za současného zvýšení tvorby obou těchto protilátek při podání vakciny typu konjugátu spolu s pomocnou látkou s dlouhým alkylovým řetězcem ve srovnání s případem, kdy se tato pomocná látka nepoddá. Zvýšení tohoto poměru je velmi příznivé vzhle dem k tomu, že protilátka IgG2a je u myši nejúčinnější protilátkou, pokud jde o aktivaci komplementu a o mechanismus buněčné cytotoxicity v závislosti na prodělávce a také vzhle dem k ochraně proti nádorům a parasitům.

Pomocný účinek sloučenin s dlouhým alkylovým řetězcem ve smyslu zvýšení a modulace, tj. změny isotypu protilátky je rovněž překvapující s ohledem na úlohu nosné bílkoviny. Znamená to, že nosič ve vakcině typu konjugátu může zvýšit a pozměnit vznik protilátky.

Znamená to rovněž, že sloučeniny s dlouhým alkylovým řetězcem jsou na rozdíl od hlinitých sloučenin schopné zvýšit funkci nosiče.

Netoxickou sloučeninou s dlouhým alkylovým řetězcem je s výhodou kladně nabitý ester aminokyseliny nebo peptidu, zvláště ester alkylalkoholu s obsahem 14 až 20 atomů uhlíku s aminokyselinou, dipeptidem nebo tripeptidem.

Bakteriální polysacharid ve formě konjugátu s bílkovinou, tak /jak se používá v prostředcích podle vynálezu je schopný vyvolat imunologickou odpověa u hostitele. Pod pojmem bakteriální se v tomto smyslu rozumí kapsulární nebo-li oba: lově polysacharidy, dále lipopolysacharidy a další subkapsulární, povrchové polysacharidy. V současné době jsou pro použití v účinných vakcínách s obsahem uvedených konjugátů zvláště vhodné kapsulární polysacharidy z pathogenních bakterií. Příkladem těchto kapsulárních polysacharidů mohou být sloučeniny, které byly izolovány z Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Salmonella typhi, Escherichia coli a Staphylococcus aureus. Příkladem použitelných lipopolysacharidů mohou být látky, které byly izolovány z Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi a Pseudomonas aeruginosa. Příkladem dalších subkapsulárních polysacharidů jsou běžné polysacharidové antigeny (c-látky), izolované ze streptokoků skupiny A, B a C a běžný polysacharidový antigen (c-látka) ze Streptococcus pneumoniae.

V příkladové části budou popsány pokusy s konjugáty, obsahujícími polysacharidy s podstatně odlišnou chemickou strukturou, zejména polysacharid z meningokaků skupiny A, jde o homopolymer N-acetylmannosamin-6-fosfátu, dále z meningokoků skupiny B, jde o homopolymer 2 -7 8-vázané kyseliny N-butanoylneuraminové a z meningokoků skupiny C, jde o homopolymer 2 9-vázané kyseliny N-acetylneuraminové. Vynález však není na tyto látky omezen a vztahuje se rovněž na další bakteriální polysacharidy, jak bude dále popsáno a také doloženo příkladovou částí.

Bakteriální polysacharidy, užité v konjugátech podle vynálezu je možno snadno připravit běžnými izolačními postupy .

Nosné molekuly, s nimiž tvoří bakteriální polysacharidy konjugátu nebo na něj jsou kovalentně vázány jsou bílkoviny. Výxhodnými nosiči pro použití u živočichů jsou sérový albumin skotu a specifický Heraocyanin (Keynole Lirapet Hemocyanin). Bálkovinné nosiče, vhodné pro použití u člověka zahrnují toxoid tetanu, toxoid záškrtu, acellulární vkacinu proti pertussi, tj. LPF-toxoid, materiály, působící zkříženou reakci, CRM, které jsou antigenně podobné bakteriál ním toxinům, avšak jsou netoxické vzhledem k provedené mutaci, výhodný je zejména CRM 197, jehož výroba se popisuje v publikaci Pappenheimer a další, Immunochemistry, 9, 891-906, 1972, použít je však mošno také další bakteriální bílkoviny, například bílkovinu vnější memrány meníngokoků. Je výhodné, aby byla použita nosná bílkovina, která má sama o sobě imunogenní vlastnosti.

Polysacharid může být na nosič kovalentně vázán jakýmkoliv známým způsobem. Je mošno užít symetrický vazný řetězec, například dihydrazia kyseliny adipové, popsaný v publikaci J. B. Robbins a další, J. Experimental Medicine, 152, 361 - 376, 1980, nebo heterobifunkční vazný řetězec, například N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionát, popsaný v publikaci J. B. Robbins a další, Infection and Immunity,

56, 2292 - 2298, 1988, nejvýhodnější je však nepoužít žádný vazný řetězec, nýbrž navázat polysacharid přímo na bílkovinný nosič reduktivní aminací, tak jak byla popsána v publikaci H. J. Jennings a další, J.Immunology, 127, 1011-1019, 1981

Velikost bakteriálního polysacharidu, uváděná jako střední molekulová hmotnost je variabilní a závisí na bakterii, z níž je materiál izolován a také na způsobu vazby polysacharidu na nosič. Molekulová hmotnost může být nízká, například 1000 nebo vyšší, někdy i vyšší než 1 OOO 000. Při použití reduktivní aminace se molekulová hmotnost polysacharidů obvykle pohybuje v rozmezí 5000 až 500 000, například 300 000 až 500 000 nebo například 5000 až 50 000.

Sloučeniny s dlouhým alkylovým řetězcem a jakákoliv jiná látka, která může vzniknout při metabolismu této látky v hostitelnském organismu by měla být netoxické. Je dobře známo, že nasycené alifatické alkoholy s dlouhým řetěcem jsou přirozeně se vyskytující netoxické látky. Jako příklad je možno uvést oktadekanol, který je pro člověka zcela netoxický, jak je zřejmé z hodnoty LD^g při perorálním podání, která je vyšší než 15 g/kg, jak bylo uvedeno v publikaci Gosselin, Clinical Toxicology of Commercial Products ,

4. vydání, 1976. Bylo prokázáno, že oktadecyltyrosin je pro živočichy netoxický stejně jako většina přírodně se vyskytujících aminokyselin, jak bylo popsáno v publikaci C. L. Penney a další, Vaccine, 4, 99 -104, 1986. Je tedy možno očekávat, že oktadecyltyrosin a také estery jiných alkoholů s aminokyselinami nebudou pro člověka toxické.

Pomocná látka by měla mít schopnost vytvářet mikročástice s rozměrem 150 mikrometrů až 1 mm, s výhodou 250 mikrometrů ve vodném prostředí, čímž vzniká suspenze, která má homogenní konsistenci. Mimoto by měly tyto mikročástice umožnit absorpci výsledné vakciny s obsahem konjugátu a tak umožnit pomalé uvolnění konjugátu v organismu hostitele.

Ve výhodném provedení vynálezu je pomocnou sloučeninou s dlouhým alkylovým řetězcem sloučenina obecného vzorce

C znamená atom vodíku, zbytek aminokyseliny nebo zbytek peptidu o až 10 zbytcích aminokyselin, to znamená až dekapeptid,

D znamená atom vodíku nebo zbytek kyseliny, přijatelné z farmaceutického hlediska, například kyse, líny chlorovodíkové, bromovodíkové, fosforečné, sírové, vinné, mléčné nebo octové,

Ξ znamená 4-hydroxybenzyl, benzyl, 4-hydroxyfenyl, fenyl, 4-aminobutyl, isopropyl, methyl, atom vodíku nebo zbytek přírodně se vyskytující aminokyseliny,

A znamená skupinu (C^^n' ^atora kyslíku nebo CH₂O a

B znamená skupinu (CH₂)_n nebo atom kyslíku, n znamená celé číslo 0 až 4 a

R znamená alkylový zbytek o 12 až 20 atomech uhlíku, za předpokladu , že A a B neznamenají současně skupinu (CH_n) nebo atom kyslíku.

n -¹ výhodou znamená C atom vodíku, aminokyselinu, dipeptid nebo tripeptid. V případě, že jde o aminokyselinu může být řetězec aminokyseliny v pomocné sloučenině například tyrosylglycin, glycylglycin, glycyltytosin nebo fenyl alanylglycin.

V případě, že C znamená dipeptid, může být řetězcem aminokyselin v pomocné látce například tyrosylglycylglycin nebo tyrcsylalanylglycin. V případě, že některý ze zbytků aminokyselin je chirální, je možno použít D-enanciomer, L-enanciomer nebo jejich směs. Ve zvláště výhodném provedení obsahuje pomocná látka alfa-aminokyseliny.

Ve výhodném provedení znamená E 4-hydroxybenzyl, benzyl, 4-hydroxyfenyl, fenyl nebo atom vodíku, nejvýhodnějším významem pro E je 4-hydroxybenzyl.

V případě, že A znamená skupinu C^O a B znamená skupinu (CH„) , jsou výslednými látkami N-aminoacylethanolamin-O-stearátu. V případě, že A znamená skupinu CÍ^O a B znamená atom kyslíku, jde o karbonáty.

Ve výhodném provedení je pomocná látka nydrochlorid esteru aminokyseliny, v němž C znamená atom vodíku, D znamená kyselinu chlorovodíkovou, A znamená (CH„) , kde n zna^J 2 n mená celé číslo 0 až 4 a 3 znamená atom kyslíku.

V nejvýhodnějším provedení je pomocnou látkou oktadecyltyrosinhydrochlorid, v němž C znamená atom vodíku,

D je kyselina chlorovodíková, E znamená 4-hydroxybenzyl,

R znamená oktadecyl, A znamená (^c^2^n^{ř Ω znamena} θ ^a

B znamená atom kyslíku.

Obecně je možno uvést, že v případě, že význam C je odlišný od atomu vodíku, obsahuje kostra pomocné látky v podstatě peptidové vezby, to znamená, že karboxylát jedné aminokyseliny je přímo vázán na aminoskupinu druhého sousedního zbytku aminokyseliny. Peptidová vazba může také být thioamidová vazba.

Pomocnou látku je možno připravit jakýmkoliv vhodným způsobem. Například aminoesterovou část pomocné látky je možno syntetizovat jakýmkoliv z celé řady běžně užívaných postupů, tak jak byly popsány v publikaci M. 3odansky a další, Peptide Synthesis, 2. vydání,Wiley, New York a R. W. Roeske, Peptides, N. Y. 3, 102, 1981. Zvláště výhodným postupem je esterifikace, katalyzovaná kyselinou methansulfonovou, která byla popsána v publikaci C. Penney a další, J. Organic. Chemistry, 50, 1457 - 1459, 1985.

V případě, že pomocnou látkou je di- nebo tripeptid, je možno peptidové vazby vytvořit jakýmkoliv způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Peptide Synthesis. Mimo to je tyto vazby možno vytvořit v pevné fázi nebo v roztoku. Existuje řada postupů a reakčních činidel, které jsou vhodné pro vytvoření amidových, thioamidových nebo thioesterových vazeb.

V průběhu přípravy pomocné látky může být žádoucí dočasně chránit reaktivní funkční skupiny. Například aminy je možno chránit skupinami typu urethanu, alkoholy pomocí terč.butylové nebo benzylové skupiny a karboxylové kyseliny tvorbou esterů. Vhodné postupy pro zavedení ochranných skupin a jejich opětné odstranění jsou rovněž uvedeny ve svrchu uvedené publikaci Peptide Synthesis.

Pomocnou látku je možno čistit jakýmkoliv ze svrchu uvedených postupů. Výhodným postupem je chromatografie na silikagelu, zvláště rychlá chromatografie, popsaná v publikaci W. Clark Still a další, J. Organic Chemistry, 43,

2923 - 2925, 1978. Je však možno užít také další chroraatografické postupy, včetně HPLC. K čištění je možno užít také krystalizace. V některých případech však není zapotřebí žádného čištění vzhledem k tomu, že se produkt získá přímo v analytické čistotě.

Vakciny podle vynálezu je možno připravit tak, že se pomocná látka fyzikálně smísí s konjugátem polysacharidu a nosné bílkoviny za sterilních podmínek známým způsobem, čímž se získá výsledný prostředek. Tvorba komplexu kcnjugátu polysacharidu a nosné bílkoviny s pomocnou látkou je usnadněna existencí mírného negativního náboje na konjugátu, který je tak přitahován elektrostaticky k positivnímu náboji, nacházejícímu se na pomocné látce s dlouhým alkylovým řetězcem.

Množství pomocné látky a konjugátu polysacharidu a nesně bílkoviny, jehož je zapotřebí k vyvolání imunologické odpovědi u člověka je ve vzájemném vztahu, jde obvykle c rozmezí, běžně užívané ve vakcínách. Například při použití vyššího množství pomocné látky může být použito poněkud nižší množství konjugátu a obráceně. Výhodné množství pomocné látky je 0,01 až 5 mg/ml prostředku, například 0,05 až 3 mg/ml, s výhodou 0,5 až 1,0 mg/ml. Výhodné množství konjugátu je 1 až 100, s výhodou 5 až 40 mikrogramů/ml.

Dávka bude záviset na hostiteli a na jeho hmotnosti, věku a podobně.

Vakcíny podle vynálezu je možno získat při použití postupů, obdobných těm, které jsou užívány při výrobě dalších farmaceutických prostředků, které obsahují polypeptidy. Je tedy možno pomocnou látku a konjugát skladovat v lyofilizované formě s rekonstitucí ve fyziologicky přijatelném prostředí na suspenzi těsně před podáním. Pomocnou látku a konjugát je také možno skladovat přímo v nosném prostředí. Výhodným prostředím jsou sterilní roztoky, zejména sterilní pufry, například fyziologický roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrem. Je možno užít jakýkoliv postup pro smísení pomocné látky a konjugátu v nosném prostředí tak, aby bylo dosaženo zlepšené imunologické účinnosti ve srovnání s použitím jednotlvých složek.

Nosné prostředí může obsahovat konzervační látky nebo jiné známé přísady, které mohou zlepšit skladovatelnost výsledného prostředku nebo jeho účinnost. Výhodným konzervačním prostředkem je například thimerosal.

Objem jednotlivé dávky vakcíny podle vynálezu se může měnit, avšak obvykle se užívá obdobného objemu jako u běžných vakcín. Objem jednotlivé dávky se obvykle pohybuje v rozmezí 0,1 až 1,5 ml, s výhodou 0,2 až 0,5 ml při svrchu uvedených koncentracích konjugátu a pomocné látky.

Vakcíny podle vynálezu je možno podávat jakýmkoliv vhodným způsobem. Výhodnými postupy pro podání je podání podkožní, nitrosvalové, nitrokožní nebo podání nosní sliznicí. Je také možno směs uvolnit z implantátu/ biologicky postupného. Může být užito jednoho podání nebo opakovaného podání po několika dnech nebo týdnech.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady/ které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

V tomto příkladu se popisuje izolace/ příprava a konjugace polysacharidů z meningokoků skupiny A a C.

Polysacharidy se získají z extraktu kultury N. meningitidis, kmen 604 A v případě skupiny A a kmen 2241C v případě skupiny C. Tyto kmeny byly získány ze sbírky kul tur Laborat.ory Center for Disease Control/ Ottawa, Ontario a byly pěstovány v chemicky definovaném prostředí podle pu blikače Kenny a další, Bull, W.H.O. 37:569, 1957. Po 15 ho dinách růstu ve fermentoru byly bakterie usmrceny přidáním formaldehydu do konečné koncentrace 0,75 %. Bakterie byly odděleny kontinuálním odstředěním a polysacharidy byly izolovány ze supernatantu a čištěny podle publikace Bundle a další, J. Biol. Chem., 249:4797 - 4801, 1974 až na to, že bílkovina byla extrahována mícháním roztoku surového polysacharidů s chladným 20% fenolem o teplotě 4°C místo s horkým fenolem s teplotou 50 až 60 °C. Tato modifikace může zajistit produkci a izolaci polysacharidů s vysokou molekulovou hmotností.

Depolymerace polysacharidů skupiny A

Nativní polysacharid ze skupiny meningokoků A se střední molekulovou hmotností 30 000 byl v množství 150 g rozpuštěn ve 20 ml 100 mM pufrus octanem sodným o pH 5,0 a zahřát na teplotu 70 °C. Depolymerace byla sledována pomocí FPLC (Pharmacia) na sloupci s gelem Superose 12 až do dosažení požadované molekulové hmotnosti 12 000. Pak byl materiál dialyzován proti destilované vodě při teplotě 4 °C a lyofilizován, čímž bylo získáno 13,5 mg amorfní pevné látky

Redukce depolymercvaného polysacharidů skupiny A

100 mg depolymerovaného polysacharidů skupiny A se rozpustí ve 3 ml 200 mM tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 7,2 a roztok se zchladí na 0 °C. Pak se v průběhu 3 hodin přidá k roztoku za míchání 5 x 2,5 mg borohydridu sodného, pH roztoku se v průběhu přidávání udržuje na 7,5 až 7,8 přidáváním 100 mM kyseliny octové. Pak se pH roztoku sníží na 5,5 přidáním 1M kyseliny octové k rozrušení jakéhokoliv zbytku borohydridu a pak se opět zvýší na 7,5 přidáním 100 mM hydroxidu sodného. Roztok se zbaví solí na sloupci Bio-Gel P6DG (Bio-Rad) s rozměry 1,6 x 100 cm a sloupec se promývá vodou. Příslušný vrchol se odebere a lyofilizuje, čímž se získá 11,7 mg redukovaného produktu.

Aktivace a dělení GAMP podle molekulové hmotnosti

110 mg depolymerovaného a redukovaného polysacharidu skupiny A se rozpustí ve 2 ml 50 mM jodistanu sodného a udržuje 1 hodinu ve tmě při teplotě místnosti. Pak se přidá 50 mikrolitrů ethylenglykolu a roztok se nechá 1 hodinu stát při teplotě místnosti. Pak se roztok zbaví solí při použití sloupce Bio-gel P6DG (Bio-Rad) s rozměrem 1,6 x 100 cm ve vodě. Příslušný vrchol se shromáždí a lyofilizuje, čímž se získá 108 mg oxidovaného produktu. Tento materiál se dělí na sloupci Βίο-Gel A 0,5 s rozměre/n 1,6 x 100 cm, 200 az 400 mesh v PBS (Bio-Rad). Frakce, vymývané ze sloupce při Kp 0,5 až 0,6, molekulová hmotnost 10 000 až 15 000 podle měření FPLC (Pharmacia) na sloupci Superose 12 (HR 10/30, Pharmacia) se spojí, dialyzují a lyofilizují.

Oxidace a depolymerace polysacharidu skupiny C

200 mg nativního polysacharidu meningokoků skupiny C se rozpustí ve 20 ml vody a přidá se 2 ml 100 mM jodistanu sodného, celkem 200 mikromol této látky. Depolymerační reakce se sleduje analýzou FPLC stejně jako v případě polysacharidu skupiny A. Jakmile se dosáhne požadovaného rozmezí molekulové hmotnosti, zastaví se reakce přidáním 100 mikrolitrů ethylenglykolu a roztok se nechá stát 1 hodinu při teplotě místnosti a pak se dialyzuje a získaný produkt se lyofilizuje.

Dělení oxidavaných fragmentů GCMP podle molekulové hmotnosti

Oxidovaný GCMP se podrobí filtraci na gelu při použití sloupce Bio-Gel A 0,5 s rozměrem 1,6 x 100 cm,

200 až 400 mesh v PBS (Cio-Rad). Frakce, které se ze sloupce vymývají při 0,5 až 0,6 se střední molekulovou hmot18 ností 10 000 až 15 000 podle měření FPLC svrchu popsaným způsobem se spojí, aialyzují a produkt se lyofilizuje.

Takto získané fragmenty GCMP obsahují aldehydové skupiny na obou koncích.

Konjugáty polysacharidů mg oxidovaných fragmentů polysacharidů skupiny A nebo C se rozpustí ve 2 ml 100 mM hydrogenuhličitanu sodného o pH 8,1 a k roztoku se přidá 30 mg monomeru tetanového toxoidu. Pak se přidá ještě 60 mg kyanborohydrodu sodíku (Aldrich, Milwaukee, WI, ) a roztoky se inkubují 4 dny při teplotě 37 °C. Pak se reakční směsi přímo nanesou na sloupce Bio-Gel A 0,5 s rozměrem 1,6 x 100 cm, 200 až 400 mesh v PBS (Bio-Rad). Frakce s obsahem konjugátů se dialyzují proti destilované vodě a produkt se lyofilizuje. Molární poměr polysacharidu k tetanovému toxoidu v konjugátu byl 2-3 : 1.

Příklad 2

Tento případ popisuje přípravu a konjugaci N-propionyl- a N-butanoyl polysacharidů meningokoků skupiny B.

Anhydridy kyseliny propionové a butanové spolu s kyselinou kolominovou byly získány od Sigma Chemicals Company, St. Louis, MO. Vzhledem k tomu, že kyselina kolominová je strukturně totožná s pólysacharidem meningokoků skupiny B, GBMP, bude dále uváděna jako GBMP. Tetanový toxoid byl získán od Institut Armand-Frappier, Laval, Quebec, a jeho monomem! forma, která byla užita při všech konjugacích, byla získána průchodem svrchu získané látky sloupce Bio-Gel A 0,5 o 200 až 400 mesh s rozměrem 1,6 x 90 cm (Bio-Rad, Richmona, CA), naplněný a promývaný 0,01 M fyziologického roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem, PBS, pH 7,4.

N-deacetylace GBMP

1,0 g sodné soli GBMP se rozpustí v 5 ml 2M hydroxidu sodného a po přidání 150 mg NaBH._t se roztok zahřívá 6 hodin na teplotu 110 °C v nádobě s objemem 60 ml s teflonovým povlakem, opatřené šroubovacím uzívěrem.

Postup byl popsán v J. Immunol., 134, 2651, 1985 a v US patentovém spisu č. 4 727 136, autoři obou publikací jsou Harold J. Jennings a další. Zchlazený a zředěný roztok se pak pečlivě dialyzuje proti destilované vodě při teplotě 4 °C a pak se lyofilizuje. Skutečnost, že se získá N-deacetylovaný GBí-lP se prokáže nepřítomností signálu pro methylacetamidoskupinu, singletu při 2,07 v·^H-NMR spektru N-deacetylovaného GBMP.

N-acylace GBMP

1,0 g N-deacetylovaného GBMP se rozpustí v 50 ml 5% vodného nydrogenuhličitanu sodného. Ke dvěma podílům tohoto roztoku po 10 ml se přidá buč annydrid kyseliny propionové nebo butanové. Tato reakční činidla se přidávají v průběhu 3 hodin po podílech 3 x 0,5 ml při teplotě místnosti a pH roztoku se udržuje na 8,0 přidáváním 0,5N hydroxidu sodného. Současně s každým přidáním anhydridu se přidá také 0,5 ml methanolu ke zvýšení rozpustnosti. Nakonec se roztoky míchají 16 hodin při teplotě 4 °C, důkladně se dialyzují . proti destilované vodě při teplotě 40 °C a lyofilizují. N-propionylovaný a N-butanoylovaný GBMP se získá ve výtěžku vyšším než 90 %. V každém z případů je možno potvrdit v podstatě úplnou N-acylaci tím, že v ^H-NMR spektru získaných produktů vymizí signál pro N-deacetylovaný GBMP.

Aktivace N-acylovaného GBMP

Terminální aldehydové skupiny se do N-acylovaného GBMP zavedou oxidací jodistanem. N-acylovaný GBMP, získaný svrchu uvedeným způsobem se oxiduje v 10 ml 0,1 M vodného roztoku methajodistanu sodného 2 hodiny při teplotě místnosti ve tmě. Přebytek jodistanu se pak rozruší při dáním 1 ml ethylenglykolu a roztok se pak důkladně dialyzuje pri teplotě 4 Ca takto získaný produkt se lyofilizuje. Použití borohydridu sodíku při N-deacetylaci s výjimkou GBMP má za následek transformaci terminálních zbytků kyseliny sialové v každém z N-acylovaných GBMP za vzniku polyolových zbytků s otevřeným řetězcem. Tento typ zbytků je citlivý na působení jodistanu, jak bylo popsáno v Harold J. Jennings a další, J. Immunol., 127, 1011, 1081 a US patentový spis č. 4 356 170, takže dochází ke vzniku aldehydových skupin na obou zakončeních N-acylovaného GBMP.

Dělení různých N-acylovaných GBMP podle molekulové hmotnosti

K získání oxidovaného N-acylovaného GBMP s požadovanou střední molekulovou hmotností byla užita filtrace na gelu při použití sloupce Ultrogel AcA 44 s průměrem částic 60 až 140 mikrometrů (IBF Biotechnics, Savage, MD) při použití PBS jako elučního činidla. Frakce, vymývané ze sloupce při 0,5 až 0,7 podle měření pomocí FPLC byly spojeny, dialyzovány a lyofilizovány. Materiál v rozmezí Κ_β 0,2 až 0,4, odpovídající molekulové hmotnosti 30 000 až 40 000 byl rovněž odebrán a podroben konjugaci. N-acylovaný materiál, k jehož vymytí dochází v oblasti Κ_β o,2 až 0,7 je pro účely vynálezu zvláště vhodný.

Konjugáty polysacharidu

100 mg oxidovaných fragmentů se rozpustí ve 2 ml 0,1 M hydrogenuhličitanu sodného o pH 8,1 a k roztoku se přidá 20 mg tetanového toxoidu. Přidá se 40 mg kyanoborohydridu sodíku a roztok se opatrně míchá při teplotě místnosti a průběh konjugace se sleduje pomocí FPLC při použití sloupce pro filtraci na gelu s obsahem Superose 12 HR1O/3O (Pharmacia), při isokratickém průtoku 1 ml/min v PSS o pií 7,2, jak bílkovina, tak N-acylované fragmenty G3MP se sledují při 214 nm. Κθ fragmentů je 0,6 a X^ tetanového toxoidu 0,39. Ve většině případů byla konjugace dovršena ve dvou dnech, bylo však užíváno celkové reakční doby 4 dny. Potenciální nezreagované aldehydové skupiny byly nakonec před filtrací na gelu redukovány přidáním 20 mg boronydridu sodíku

Konjugát polysacharidu a tetanového toxoidu byl oddělen od polysacharidových fragmentů filtrací na gelu při použití sloupce Bio-Gel A a PBS jako elučního činidla. Eluát s obsahem konjugátu byl dialyzován proti destilované vodě a získaný materiál byl lyofilizován. Konjugáty N-acylovaného GBMP a tetanového toxoidu obsahovaly 12 až 30, typicky 12 až 20 % kyseliny sialové při stanovení resorcinolovou metodou podle publikace Svennerholm,L., Quantitative Estimation of Sialic Acids, II A Colorimetric Recorcincl-Hydrochloric Acid Method, Biochám. Biophys. Acta 24, 604, 1957. Tím je prokázáno, že molární poměr polysacharidu a tetanového toxoidu v konjugátu je 2 až 3 : 1.

Příklad 3

Tento příklad popisuje obecný postup tvorby komplexu konjugátu polysacharidu a bílkoviny s pomocnou látkou typu aminokyseliny nebo esteru peptidu s dlouhým alkylovým řetězcem.

Pomocná látka typu alkylesteru s dlouhým řetězcem se rozdrtí a nechá projít sítem a příslušné množství se naváží do lahvičky tak, aby koncentrace suspenze po přidání roztoku chloridu sodného s 10 mfí fosfátového pufru o pH 7,4 byla 1 až 2 mg sloučeniny/ml. Suspenze se důkladně promísí a pak se přidá stejné objemové množství konjugátu v tomtéž pufru a výsledná směs se opatrně protře páva 16 hodin při teplotě 4 °C. Po vytvoření komplexu je žádoucí zjistit množství konjugátu, tvořící komplex s pomocnou látkou. Suspenze se proto odstředí a koncentrace konjugátu v supernatantu se stanoví podle publikace Lowry a další, J. Biological Chemistry, 193, 265- 275, 1951, čímž se získá množství nenavázaného konjugátu. V případě, že je vázáno 30 až 90 % konjugátu, jde o dobrou tvorbu komplexu mezi pomocnou látkou a konjugátem. Při imunisačních pokusech byl užit jak vázaný, tak nenavázaný konjugát.

Příklad 4

V tomto příkladu je prokázán pomocný účinek několika esterů s delším řetězcem s 18 uhlíkovými atomy pro vakcinu obsahující polysacharid z meningokoků a tetanový toxoid.

Bílé myší samice kmene CF1 ve stáří S až 10 týdnů byly imunisovány pomocí intraperitoneální injekce, obsahující přibližně 15 mikrogramů konjugátu na jedno pokusné zvíře, tj. přibližně 3 mikrogramy polysacharidů ve dnech 0, 14 a 28. Myším byla odebrána krev ve dni 39 srdeční punkcí. Celkový objem imunisační injekce byl vždy 0,2 ml v případě přítomnosti pomocné látky i při její nepřítomnosti u kontrolních myší.

Polysacharidy z meningokoků byly konjugovány na toxoid jako na nosič reduktivní aminací, jak již bylo' svrchu uvedeno. Polysacharid meningokoků skupiny B, chemicky modifikovaný, byl připraven rovněž svrchu uvedeným způsobem.

Koncentrace protilátek v krevním seru byla stanovena enzymatickou imunologickou zkouškou následujícím způsobem: polystyrénové desky s 96 vyhloubeními (Corning) byly opatřeny ovlakem konjugátu příslušného kapsulárního polysacharidu a sérového albuminu skotu v roztoku chloridu sodného s 10 mM fosfátového pufru o pH 7,4 v koncentraci 1 mikrogram/vyhloubení, inkubace trvala 1 hodinu při teplotě 37°C. Pak byly desky blokovány 1 hodinu při teplotě 37 °C působením 0,1% sérového albuminu skotu v tomtéž pufru. Pak byly plotny slity a čtyřikrát omyty roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem a s obsahem O/.05 % smáčedla Tvzeen 20 (PBST) Prázdná vyhloubení byla vyplněna zkoumaným vzorkem, který byl inkubován 1 hodinu při teplotě místnosti. Po pětinásobném promytí P3ST byl do každého vyhloubení přidán konjugát kozí protilátky IgG (H + L) proti myší tkáni, značený peroxidázou v ředění 1/200 v PBST a desky byly inkubovány půl hodiny při teplotě místnosti. Po.dalším pětinásobném promytí PBSR byl do každého vyhloubení přidán tetramethylbenziain a desky byly inkubovány 10 minut při teplotě místnosti. Enzymaticky katalyzovaná reakce byla zastavena 1M kyselinou fosforečnou a pak byla odečtena v každém vyhloubení absorbance při 450 nm odečítacím zařízením (Biotek). Titr protilátky je převrácená hodnota ředění vzorku, při němž bylo dosaženo absorbance 1,0. Titr se vyjadřuje jako poměr vzhledem ke kontrole bez pomocné látky. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1, v níž se uvádí odpověó. ve formě protilátek po podání vakcíny s konjugátem polysacharidu meningokoků v přítomnosti esterů s 18 atomy uhlíku.

Titr je uveden jako poměr množství protilátky k protilátce v nepřítomnosti pomocné látky (kontrola s vakcínou typu konjugátu v chloridu sodném s pufrem).

Tabulka 1

pomocná látka	konjugát z π	leningi p
71 m.	3
kontrola (PBS)	1,0	1,0	1,0
oktadecyltyrosin 0,5 mg/ml	3,5	1,3	1,9
1,0 mg/ml	3,7	1,9	3,2
oktadecyltyrosvlglycin 0,5 mg/ml	3,0	1,8	1,9
N-glycylethanolamin-O-stearát 0,5 mg/ml	1,0	1,5	1,0
oktadecyllysin 1,0 mg/ml	N.D.	1,3	1,8
oktadecylforphenicin 1,0 mg/ml	H. D.	1,9	1,8

N.D. = nebylo stanoveno ^X = butanoyl.

Výsledky, uvedené v tabulce 1 prokazují, že estery s dlouhým řetězcem mají pomocný účinek při podávání konjugátu bakteriálního polysacharidu a tetanového toxoidu. Tento účinek je závislý na typu použitého esteru a také na typu bakteriálního polysacharidu. Jde o specifický fenomen, jak je možno prokázat srovnáním účinku oktadecyltyrosinu a N-glycylethanolamin-O-stearátu v konjugátu materiálu z meningokoků skupiny A a C.

Příklad 5

V tomto příkladu ja prokázána změna isotypu, k níž dochází při přechodu z vakcíny bez pomocného činidla k vakcíně s pomocným činidlem a konjugátem polysacharidů z meningokoků a tetanového toxoidu.

Imunisace bílých myší kmene CFl byla provedena a sérum bylo získáno způsobem podle příkladu 4. Polystyrénové desky s S6 vyhloubeními (Corning) byly povlečeny konjugátem příslušného polysacharidů z meningokoků a sérového albuminu skotu v roztoku chloridu sodného s 10 mM fosfátovým pufrem o pH 7/4, tak jak bylo popsáno v příkladu 4. Desky byly blokovány 1 hodinu při teplotě 37 °C a pak půl hodiny při teplotě místnosti 2,5% odstředěným mlékem v roztoku chlo ridu sodného s fosfátovým pufrem.

Po čtyřnásobném promytí PBST byly přidány vzorky pro analýzu isotypu a desky byly ponechány 1 hodinu při teplotě místnosti. Po pětinásobném promytí PBST byla do každého vyhloubení přidána specifická sonda králičích protilátek proti myší tkáni (Bio-Pad Laboratories), a desky byly inkubovány ještě 1 hodinu při teplotě místnosti. Po dalším pětinásobném promytí PBST byl přidán peroxidásou značený konjugát kozí protilátky proti králičí tkáni IgG (H + L), 1/3000 v PBST a desky byly ještě půl hodiny inkubovány při teplotě místnosti. Po dalším pětinásobném promytí PBST byl do vyhloubení přidán tetramethylbenzidin a desky byly inkubovány 6 minut při teplotě místnosti, načež byla reakce zastavena přidáním 1M kyseliny fosforečné. Absorbance při 450 nia byla v každém vyhloubení odečtena pomocí odečítacího zařízení (Biotek). Titr protilátek je převrácená hodnota ředění vzorku, násobená absorbancí. Titry jsou vyjádřenyvjako poměry k hodnotě, získané pro kontroly bez pomocné látky. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 2.

V tabulce 2 se uvádí variace isotypu v odpovědi na xonjugáry materiálu z meningokoků A a C. Titry jsou uvedeny jako poměr množství vytvořené protilátky v přítomnosti a v nepřítomnosti pomocné látky u kontrol, které obsahují pouze vakcínu ve formě konjugátu v chloridu sodném 3 obsahem titru. Koncentrace pomocné látky byla 0,5 mg/ml.

Tabulka 2

pomocná látka	imunoglobulin	(meningokoky	A) Igll
IgGl	rgG2a	IgG2b	IgG3
kontrola (PBS)	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
oktadecyltyrosin	2,6	5,7	4,3	4,4	3,4
oktadecyltyrosylglycin	1,6	3,9	3,6	2,6	1,6
N-glycylethanolamin- -O-stearát	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0
pomocná látka	imunoglobulin	(meningokoky	c)
	IgGl	IgG2a	IgG2b	IgG3	IgM
kontrola (PBS)	1,0	1,0	1,0	1,0	170
oktadecyltyrosin	2,1	5,2	2,3	4,3	1,7
oktadecyltyrosylglycin	2,1	2,9,	1,9	2,9	1,7
N-glycylethanoamin- -O-stearát	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0

Výsledky v tabulce 2 prokazují, že estery s dlouhým řetězcem mají vliv na distribuci isotypu, a to v příznivém smyslu. To je zřejmé také při vyjádření poměru isotypů IgG2a/IgGl, tento poměr je 2,2 pro skupinu A a 2,5 pro skupinu C v přítomnosti oktadecyltyrosinu jako pomocné látky.

Příklad 5

V tomto příkladu se prokazuje, že zvýšená odpověS protilátek na přítomnost pomocné látky typu esteru s dlouhým řetězcem má kladný biologický účinek, to znamená, že chrání proti infekci živými pathogenními bakteriemi.

Imunisace bílých myší kmene CF1 byla prováděna stejným způsobem jako v příkladu 4. V den 40 po intraperitoneální injekci bylo myším rovněž intraperitoneální injekcí podáno přibližně 2000 mikroorganismů N. meningitidis B, serotyp 2b, kmen 80165. Po 5 hodinách byla myším odebrána krev a byl stanoven počet zbývajících živých bakterií jako jednotek, schopných vytvořit kolonie, CFU/ml. N-propionyl- a N-butanoylpolysacharidy z meningokoků skupiny B byly připraveny reakcí de-N-acetylovaného polysacharidu s příslušným anhydridem kyseliny, jak bylo rovněž svrchu popsáno. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 3.

V tabulce 3 je uvedena ochrana myší při použití konjugátů tetanového toxoidu TT a N-propionyl, NPr- a N-butanoyl, N3u- modifikovaného polysacharidu z meningokoků skupiny B, jako pomocná látka byl užit oktadecyltyrosylglycin v koncentraci 0,75 mg/ml.

Tabulka 3

immunogen	CFU/ml	počet bakteremických myší
1) pomocná látka	3584	5/5
2) NPr-polysacharid	2664	5/5
3) NPr-polysacharid, konjugát s TT	640	4/5	•
4) NPr-polysacharid, konjugát s TT -ř- pomocná látka	0	0/5	>
5) NBu-polysacharid, konjugát s TT + pomocná látka	296	1/5
Výsledky, uvedené v tabulce 3 obsahující konjugát polysacharidu a je nejlepší ochranu. Je také zřejmé,	prokazují, že vakcína, pomocnou látku poskytu- že pomocná látka je sa-	•

ma o sobě zcela neúčinná.

Zastupuje:

Claims

1. Vakcína, obsahující konjugát bakteriálního polysacharidu a bílkoviny a účinné množství alespoň jedné pomocné látky obecného vzorce

D kde

C znamená atom vodíku, zbytek aminokyseliny nebo zbyfcek peptidu,

D znamená atom vodíku nebo kyselinu, přijatelnou z farmaceutického hlediska,

E znamená 4-hydroxybenzyl, benzyl, á*hydroxyfenyl, fenyl, 4-aminobutyl, isopropyl, methyl, atom vodíku nebo zbytek přírodně se vyskytující aminokyseliny,

A znamená skupinu (CI^)^ kde n znamená celé číslo 1 až 4, atom kyslíku nebo skupinu CH₂O,

B znamená skupinu (CH₂) , kde n má svrchu uvedený význam nebo atom kyslíku a

R znamená alkyl o 12 až 20 atomech uhlíku, za předpokladu, že A a B neznamenají současně skupinu (CH₂)_nve svrchu uvedeném významu nebo atom kyslíku.

2. Vakcína podle nároku 1, v níž pomocná látka obsahuje aminokyselinu v konfiguraci L.

3. Vakcína podle nároku 1 wníž. pomocná látka obsahuje aminokyselinu v konfiguraci D.

4. Vakcína podle nároku 1, v níž pomocná látka obsahuje směs aminokyselin v konfiguracích D a L.

5. Vakcína podle nároku 1, v níž E v pomocném prostředku se volí ze skupiny 4-hydroxybenzyl, benzyl, 4-hydroxyfenyl, fenyl nebo atom vodíku.

«

6. Vakcína podle nároku 5, v níž E v pomocné látce znamená 4-hydroxybenzyl.

7. Vakcína podle nároku 1, v níž C v pomocné látce znamená atom vodíku, zbytek aminokyseliny nebo zbytek peptidu, obsahujícího až 10 zbytjů aminokyselin.

8. Vakcína podle nároku 7, v níž v pomocné látce obsahuje peptidový zbytek dva nebo tři zbytky aminokyselin.

9. Vakcína podle nároku 7, v níž C v pomocné látce * znamená aminokyselinu a jde tedy o tyrosylglycin, glycvlglycin, giýcyltyrosin a fenvlalanylglycin. *

10. Vakcína podle nároku 8, v níž C v pomocné látce znamená dipeptid a jde tedy o tyrosylglycylglycin nebo tyrosylalanylglycin.

11. Vakcína podle nároku 1, v níž se kyselina, přijatelná z farmaceutického hlediska ve významu D v pomocné látce volí ze skupiny kyselina chlorovodíková, bromovodíková, fosforečná, sírová, vinná, mléčná nebo octová.

12. Vakcína podle nároku 1, v níž pomocná látka obsahuje alfa-aminokyselinu.

13. Vakcína podle nároku 1, v níž je bakteriální polysacharidpolypeptid vázán na biologický nosič.

14. Vakcína podle nároku 13, obsahující nosič ze skupiny tetanový toxoid, záškrtový toxoid, bezbuněčná vakcí na proti partussi LPF, zkříženě reagující materiál CRM nebo bakteriální bílkovina.

15. Vakcína podle nároku 14, v níž je jako nosič typu CRM obsažen CRM^g^.

16. Vakcína podle nároku 1, v níž se bakteriální polysacharid volí ze skupiny kapsulárnícn polysacharidů, lipopolysacharidů a subkapsulárních povrchových polysacharidů.

17. Vakcína podle nároku 16, v níž se kapsulární polysacharid izoluje ze skupiny mikroorganismů Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Salmonella typhi, Escnerichia coli, a Staphylococcus aureus.

18. Vakcína podle nároku 16, v níž je lipopolvsacharid izolován ze skupiny mikroorganismů Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi a Pseudomonas aeruginosa.

19. Vakcína podle nároku 1, v níž se subkapsulární polysacharid volí ze skupiny polysacharidového antigenu streptokoků ze skupiny A, B a C nebo z polysacharidového antigenu Streptococcus pneumoniae.

20. Vakcína podle nároku 1, obsahující jako pomocnou látku ester alkylalkoholu o 14 až 20 atomech uhlíku a amino kyselinu, dipeptid nebo tripeptid.

21. Vaxcína podle nároku 20, obsahující jako pomocnou látku oktadecyltyrosin.

22. Vakcina podle nároku 20, obsahující jako pomocnou látku oktadecyltyrosylglycin.

23,—Zpusoo-vyvolání Imunologické'odpovědi, ~v ý~ 1/¾ a·^ č u j i cis e ti m,._.že se podá therapeuticky^ účinné _ .množství -vakciny—podle—nár-oktr l·.' .

24. Způsob podle'nároku -23,-—v—y__z nač u j í cl ^s θ t i m, že sp_vakcínapoáá nitrosvalově, nitrokožně, podkožně—nebo nosní sliznicí.

25 . Způsob podle'nároku.. 23, v y~ž^~a~c/jrzjarí==o-éjs e tím, že podáním-vakcíny^se^v podstatě nezvýší hla<_; dijrá.·.protilátky IqE^avěakrevyší se poměř IgG2a k~~TgGl~/~

Z^:

2(^. Způsob výroby vakciny podle nároku 1, v y značující se tím, že se ke konjugátu bakteriálního polysacharidů a bílkoviny přidá pomocná látka podle nároku 1 v množství, dostatečném k výrobě imunologicky účinné vakciny.