WO2017036138A1 - A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺 - Google Patents
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- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
Definitions
- the present invention relates to a crude polysaccharide purification process, and in particular to a process for purifying a crude polysaccharide of a group A meningococcal capsule.
- ECM epidemic cerebrospinal meningitis
- Neisseria mening gitidis is an acute respiratory infection caused by Neisseria mening gitidis.
- the susceptible population is mainly children, with the highest rate of fulminant deaths, up to 40 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 60 ⁇ 3 ⁇ 4.
- the incidence rate in every continent in the world is between 1/100,000 and 10/10 million, and the total case fatality rate is 5% ⁇ 15 ⁇ 3 ⁇ 4.
- Up to 20% of meningitis patients have neurological sequelae, including mental impairment and deafness.
- Serological classification according to the capsular polysaccharide type can be divided into 13 serotypes, of which group A, group B, and group C account for about 90% of the epidemic group.
- Group A meningococcal is a major epidemic of the major pathogenic serogroups, especially in the so-called African “Brain Brain Epidemic Belt”, which is a major epidemic every 7-14 years.
- the most effective way to prevent epidemic cerebrospinal meningitis is to vaccinate.
- the meningococcal polysaccharide vaccine currently included in the national immunization program includes group A meningococcal polysaccharide vaccine, group A group C meningococcal polysaccharide vaccine.
- the production process of the group A group C meningococcal polysaccharide vaccine is to extract the crude polysaccharide from the meningococcal capsule, the crude polysaccharide is purified to obtain the refined sugar, and the refined sugar is activated and derivatized to form the polysaccharide-ADH derivative.
- the organism, and thus effectively, is a group A group C meningococcal polysaccharide vaccine.
- the object of the present invention is to solve the problem that the purification efficiency of the crude polysaccharide in the prior art is not high and the acquisition rate of the refined sugar is low, and a purification process of the group A meningococcal capsular crude polysaccharide which solves the above problems is provided.
- a group of meningococcal capsular crude polysaccharide purification process comprising the following steps:
- the concentration of the saturated neutral sodium acetate solution in the step (1) is 10%; the ratio of the mixture of the cold phenol and the polysaccharide and the saturated neutral sodium acetate solution is 1:1.
- the ultrafiltrate used in the ultrafiltration membrane filtration of the step (2) consists of a sodium chloride solution having a concentration of 0.05 mol/L.
- the final concentration of NaCl in the step (3) is 0.3 mol/L, and the final concentration of ethanol is 75%.
- the concentration of the NaCl solution added to the polysaccharide solution in the step (3) is 4 mol/L, and the concentration of the ethanol added is 95%.
- the drying in the step (4) is freeze-dried.
- the method of the present invention optimizes the proportion and concentration of each chemical substance added to the reaction hydrazine, and effectively improves the purity and recovery rate of the refined sugar.
- the purity of the refined sugar of the present invention is over 95%.
- a group of meningococcal capsular crude polysaccharide purification process comprising the following steps:
- step (1) the crude polysaccharide is dissolved in 8% saturated neutral sodium acetate solution, and then the volume ratio is 1:1.
- the ratio of .2 is added to the cold phenol solution, vortexed and mixed, and the supernatant is collected by centrifugation, and extracted 1 to 3 times to make the supernatant clear;
- the concentration of the NaCl solution in the step (3) is 2 mol / L, until the final concentration of NaCl is 0.4 mol / L, and then added The final concentration of 95% ethanol to ethanol was 70%, and the mixture was thoroughly mixed and allowed to stand at 2 to 8 ° C overnight.
- step (1) the crude polysaccharide is dissolved in a 15% saturated neutral sodium acetate solution, and then the volume ratio is 1:
- the concentration of the NaCl solution in the step (3) is 3 mol / L, until the final concentration of NaCl is 0.5 mol / L, and then 95% ethanol is added to the final concentration of ethanol is 60%, fully mixed after 2 to 8 ° C Allow to stand overnight.
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Abstract
本发明公开的是A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺，解决了现有技术中粗多糖的纯化效率不高、精糖的获取率较低的问题。本发明包括以下步骤：（1）将粗多糖溶解于8%～12%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按体积比为1:0.8～1.2的比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，并抽提1～3次使上清液澄清；（2）收集上清液，用超滤膜包进行超滤；（3）在超滤后的多糖溶液中加入NaCl溶液，直至NaCl终浓度为0.2～0.4mol/L，再加入乙醇至乙醇体积终浓度为70～78%，充分混匀后2～8℃静置过夜；（4）离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。本发明具有回收率高、纯度高等优点。
Description
发明名称: A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺 技术领域
[0001] 本发明涉及一种粗多糖纯化工艺， 具体涉及的是 A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯 化工艺。
背景技术
[0002] 流行性脑脊髓膜炎 (简称流脑， 下同)是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌 (Neisseriamenin gitidis)引起的急性呼吸道传染病。 一百多年来， 一直在世界各地流行或散在发生 ， 感染病原菌后可引起败血症、 脑膜炎。 易感人群主要为儿童， 以暴发型病死 率最高， 可达 40<¾〜60<¾。 当今世界各大洲发病率在 1/10万〜 10/10万， 总病死率 在 5%〜15<¾， 高达 20%的脑膜炎患者会有神经系统后遗症， 包括智力受损和耳 聋等。 根据荚膜多糖型别进行血清学分类可分 13个血清型， 其中 A群、 B群、 C 群约占流行菌群的 90%。 A群脑膜炎球菌是较大流行的主要致病血清群， 特别是 在所谓的非洲 "流脑流行带"， 每隔 7-14年就会出现一次较大流行。
[0003] 我国于 1938年、 1949年、 1959年、 1967年和 1977年曾发生过 5次全国性流脑流 行； 其中以 1967年春季流行最为严重， 发病率高达 403/10万， 病死率为 5.49<¾。 我国过去 90%以上的病例是 A群病菌致病， 现在 B群或 C群病菌有吋亦弓 I起流脑暴 发。 2003年幵始， C群流脑的发病率明显上升。 目前 A群和 C群共占所有血清群 的 50%以上， 且 C群仍有进一步增高的趋势。 因此， 目前我国预防流脑工作的重 点是以预防 A群和 C群为主。
[0004] 目前预防流行性脑脊髓膜炎最有效的方法是接种疫苗。 研究表明， A群 C群脑 膜炎球菌的荚膜多糖具有良好的免疫原性， 提取荚膜多糖可直接制备成疫苗， 经注射免疫后的人群可以获得免疫保护。 我国从 2007年起已将流脑疫苗纳入国 家免疫规划， 在全国范围对适齢儿童普及接种。 目前纳入国家免疫计划的流脑 多糖疫苗包括 A群脑膜炎球菌多糖疫苗， A群 C群脑膜炎球菌多糖疫苗。
[0005] 目前， A群 C群脑膜炎球菌多糖疫苗的生产工艺均是从脑膜炎球菌荚膜中提取 出粗多糖， 粗多糖经过纯化后获得精糖， 精糖经过活化和衍生制成多糖 -ADH衍
生物， 进而有效制成 A群 C群脑膜炎球菌多糖疫苗。
[0006] 在粗多糖经过纯化后获得精糖的生产过程中， 由于粗多糖中含有多种杂质， 如 ： 苯酚、 核酸及蛋白质等物质， 导致现有技术中粗多糖的纯化的效率不高， 精 糖的获取率较低。
技术问题
[0007] 本发明的目的在于解决现有技术中粗多糖的纯化的效率不高， 精糖的获取率较 低的问题， 提供一种解决上述问题的 A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺。
问题的解决方案
技术解决方案
[0008] 为解决上述缺点， 本发明的技术方案如下：
[0009] A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺， 包括以下步骤：
[0010] (1) 将粗制多糖溶解于 8%〜12%饱和中性醋酸钠溶液中， 然后按体积比为 1:0.
8〜1.2的比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清液， 并抽提 1〜3次使上清 液澄清；
[0011] (2) 收集上清液， 用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸；
[0012] (3) 在超滤后的多糖溶液中加入 NaCl溶液， 直至 NaCl终浓度为 0.2〜0.4mol/L
， 然后加入乙醇至乙醇体积终浓度为 70〜78%， 充分混匀后 2〜8°C静置过夜； [0013] (4) 离心收集沉淀， 然后依次用无水乙醇、 丙酮各洗涤两次， 干燥后即为精 糖。
[0014] 进一步， 所述步骤 （1) 中饱和中性醋酸钠溶液的浓度为 10%; 冷酚与多糖和 饱和中性醋酸钠溶液的混合液比例为 1:1。
[0015] 优选地， 所述步骤 （2) 中超滤膜包过滤吋所用超滤液由浓度为 0.05mol/L的氯 化钠溶液组成。
[0016] 作为最优地设置方式， 所述步骤 （3) 中 NaCl终浓度为 0.3mol/L， 乙醇体积终 浓度为 75%。
[0017] 更进一步地， 所述步骤 （3) 中 NaCl溶液加入多糖溶液吋的浓度为 4mol/L， 所 述乙醇加入使的浓度为 95%。
[0018] 为了使提取出的精糖达到更好地质量， 所述步骤 （4) 中的干燥采用冷冻干燥
方法。
发明的有益效果
有益效果
[0019] 本发明与现有技术相比， 具有以下优点及有益效果：
[0020] 本发明的方法优化了各化学物质加入反应吋的比例和浓度， 有效提高了精糖的 纯度和回收率， 本发明使精糖的纯度达到 95%以上。
本发明的实施方式
[0021] 下面结合实施例， 对本发明作进一步地详细说明， 但本发明的实施方式不限于 此。
[0022] 实施例 1
[0023] A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺， 包括以下步骤：
[0024] (1) 将粗制多糖溶解于 10%饱和中性醋酸钠溶液中， 然后按体积比为 1:1的比 例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清液， 并抽提 1〜3次使上清液澄清； [0025] (2) 收集上清液， 用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸； 本步骤中超滤膜 包过滤吋所用超滤液由浓度为 0.05mol/L的氯化钠溶液组成；
[0026] (3) 在超滤后的多糖溶液中加入 4mol/L的 NaCl溶液， 直至 NaCl终浓度为 0.3mo
1/L， 然后加入 95%乙醇至乙醇体积终浓度为 75%， 充分混匀后 2〜8°C静置过夜， 沉淀；
[0027] (4) 离心收集沉淀， 然后依次用无水乙醇、 丙酮各洗涤两次， 干燥后即为精 糖。
[0028] 实施例 2
[0029] 本实施例与实施例 1的区别仅仅在于， 本实施例中各化学物质加入反应吋的比 例和浓度不同， 具体设置如下：
[0030] 步骤 （1) 中将粗制多糖溶解于 8%饱和中性醋酸钠溶液中， 然后按体积比为 1:1
.2的比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清液， 并抽提 1〜3次使上清液澄 清；
[0031] 步骤 （3) 中 NaCl溶液浓度为 2mol/L的， 直至 NaCl终浓度为 0.4mol/L， 然后加
入 95%乙醇至乙醇体积终浓度为 70%， 充分混匀后 2〜8°C静置过夜。
[0032] 实施例 3
[0033] 本实施例与实施例 1的区别仅仅在于， 本实施例中各化学物质加入反应吋的比 例和浓度不同， 具体设置如下：
[0034] 步骤 （1) 中将粗制多糖溶解于 15%饱和中性醋酸钠溶液中， 然后按体积比为 1:
2的比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清液， 并抽提 1〜3次使上清液澄 清；
[0035] 步骤 （3) 中 NaCl溶液浓度为 3mol/L的， 直至 NaCl终浓度为 0.5mol/L， 然后加 入 95%乙醇至乙醇体积终浓度为 60%， 充分混匀后 2〜8°C静置过夜。
[0036] 对实施例 1〜3取样， 检测精糖的纯度和回收率， 其检测结果为： 实施例 1的纯 度为 99%， 回收率为 80%; 实施例 2的纯度为 97%， 回收率为 81%; 实施例 3的纯 度为 89%， 回收率为 70%。 通过上述检测结果可以看出， 采用本发明浓度的各试 剂进行提纯后， 该提纯的精糖的纯度可达 95%以上， 且回收率也更高。
[0037] 上述实施例仅为本发明的优选实施例， 并非对本发明保护范围的限制， 但凡采 用本发明的设计原理， 以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化， 均应 属于本发明的保护范围之内。
Claims
[权利要求 1] A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺， 其特征在于， 包括以下步骤：
(1) 将粗制多糖溶解于 8%〜12%饱和中性醋酸钠溶液中， 然后按体 积比为 1:0.8〜1.2的比例加入冷酚溶液， 振荡混匀后离心收集上清液
， 并抽提 1〜3次使上清液澄清；
(2) 收集上清液， 用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸；
(3) 在超滤后的多糖溶液中加入 NaCl溶液， 直至 NaCl终浓度为 0.2〜 0.4mol/L, 然后加入乙醇至乙醇体积终浓度为 70〜78%， 充分混匀后 2 〜8°C静置过夜；
(4) 离心收集沉淀， 然后依次用无水乙醇、 丙酮各洗涤两次， 干燥 后即为精糖。
2.根据权利要求 1所述的 A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺， 其特 征在于， 所述步骤 （1) 中饱和中性醋酸钠溶液的浓度为 10%; 冷酚 与多糖和饱和中性醋酸钠溶液的混合液比例为 1:1。
3.根据权利要求 1所述的 A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺， 其特 征在于， 所述步骤 （2) 中超滤膜包过滤吋所用超滤液由浓度为 0.05m ol/L的氯化钠溶液组成。
4.根据权利要求 1所述的 A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺， 其特 征在于， 所述步骤 （3) 中 NaCl终浓度为 0.3mol/L， 乙醇体积终浓度 为 75<¾。
5.根据权利要求 4所述的 A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺， 其特 征在于， 所述步骤 （3) 中 NaCl溶液加入多糖溶液吋的浓度为 4mol/L ， 所述乙醇加入使的浓度为 95%。
6.根据权利要求 1所述的 A群脑膜炎球菌荚膜粗多糖纯化工艺， 其特 征在于， 所述步骤 （4) 中的干燥采用冷冻干燥方法。
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