CN104031901B - 一种纯化尿激酶的方法 - Google Patents

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Abstract

一种纯化尿激酶的方法。本发明将尿激酶粗品中2个主要分子量区域的蛋白分开处理，通过调节pH值等手段进一步去除粗品中的杂质、热源和细胞内毒素，得到了尿激酶精品。

Description

一种纯化尿激酶的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及从尿激酶粗品中进一步纯化尿激酶的方法。
背景技术
尿激酶是一种碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存在于人体及哺乳动物的尿液中，血液凝固时人体的正常机能，但是在某些病理状态下，由血管内形成血栓堵塞血液流通时，就会造成严重后果。尿激酶是溶血栓药物，但它本身并不直接用于血块本身，而是首先激活体内的纤溶酶原，成为有活性的纤溶酶，纤溶酶作用于纤维蛋白酶凝块，使其分解成可溶性多碳。
尿激酶有多种分子量形式，高分子量的尿激酶溶解血栓临床效果要比低分子量的约高一倍，因此，国际上把尿激酶的分子量作为质量标准的检查项目之一，为减少低分子量的产生，生产过程中pH值不宜过低。
《中国药典》2005版和2010版，明确规定“本品在生产过程中需经60℃加热10小时，以使病毒灭活”；且质量标准要求尿激酶的细菌内毒素小于1.OEU/万单位。
目前，国内不少专家针对尿激酶的制备工艺进行了深入的试验研究，如一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用(杨华英等专利号CN101693748A)、一种尿激酶制备方法(张志武等专利号CN101701215A)等，都结合使用离子交换层析法、凝胶分子筛法、免疫亲和层析、对氨基苯甲脒-Sepharose亲和层析技术，纯化精制得到尿激酶。使产品的比活、高分子尿激酶相对含量以及尿激酶生物活性的回收率不断提高。但是这些技术大多将细菌内毒素和纯化工艺分离，增加了工艺步骤和生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供了一种能够从尿激酶粗品中纯化尿激酶，同时去除病毒及热原的尿激酶制备方法。
本发明的技术方案是：将尿激酶粗品经溶解超滤、超滤的上层液和下层液分别处理后混合，经过乙醇沉淀得到尿激酶精品，包括如下步骤：
(1)粗品提取：取尿激酶粗品，加正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液进行溶解，尿激酶粗品与pH6.0正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液的比例为：1g∶2-6ml；搅拌；过滤，将滤饼再加正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液进行溶解，滤饼与正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液按的比例为：1g∶2～5ml；搅拌，过滤；合并两次的滤液，调节滤液pH至6.0；
正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液的配制：将180g正丁酸铵溶解于1000ml70％乙醇溶液中，得18％正丁酸铵/乙醇溶液；将18％正丁酸铵/乙醇溶液与pH值6.0的磷酸缓冲溶液等体积混合，即得。
(2)30，000道尔顿超滤膜预处理：用碱处理，1mol/1的氢氧化钠溶液循环35分钟，静置15小时，用pH6.0磷酸缓冲液洗净。
20，000道尔顿超滤膜预处理：用碱处理，1mol/l的氢氧化钠溶液循环35分钟，静置15小时，用pH6.0磷酸缓冲液洗净。
(3)超滤：将粗提液用30，000道尔顿超滤膜进行超滤，超滤至原体积的1/5至1/20，分别收集浓缩液和滤液。
(4)浓缩液处理：浓缩液加苯甲酸钠2％溶液至原体积后，继续超滤至原体积的1/5至1/15。收集浓缩液，然后缓慢加入0.1～0.3mol/L磷酸钠溶液，搅拌，最后加入0.1～0.5mol/L硫酸铜溶液，调节pH值至5.0-5.5，用乙醇进行沉淀。沉淀用pH7.0磷酸缓冲液溶解，加入缓冲液的比例为1g∶10ml，搅拌，调节pH值至5.0-5.5，用乙醇进行沉淀。
(5)滤液处理：滤液，然后缓慢加入0.1～0.3mol/L磷酸钠溶液，搅拌，最后加入0.1～0.5mol/L醋酸钙溶液，用氨水调节pH值至10.0-10.5，用乙醇进行沉淀。沉淀用水溶解，加入水的比例为1g∶10ml，搅拌，调节pH值至10.0-10.5，用乙醇进行沉淀。
(6)浓缩液沉淀和滤液沉淀：将步骤(4)和(5)的沉淀溶于pH6.0磷酸缓冲液，用20，000道尔顿超滤膜过滤，至原体积的1/5至1/20；加水至原体积后，继续超滤至原体积的1/5，反复2-3次，浓缩液加入乙醇进行沉淀，浓缩液与加入乙醇的体积比为：1∶4～6，离心。再用乙醇洗涤沉淀物，离心，反复2～4次；然后沉淀物干燥，得尿激酶精品。
本发明将尿激酶粗品溶解于混合溶剂中，再沉淀使得粗品中的杂质被清除；并且创造性的将尿激酶中2个主要分子量区域的蛋白分开处理，通过调节pH值等手段进一步去除粗品中的杂质、热源和细胞内毒素，得到了尿激酶精品。高分子尿激酶成分的单独纯化手段，提高了纯化的效率，得到高分子尿激酶相对含量高的精制产品。本发明的处理手段也有效的提高了产品的回收率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明的技术方案是：将尿激酶粗品经溶解超滤、超滤的上层液和下层液分别处理后混合，经过乙醇沉淀得到尿激酶精品，包括如下步骤：
(1)粗品提取：取尿激酶粗品400g，加正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液进行溶解，尿激酶粗品与正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液的比例为：1g∶5ml；搅拌；过滤，将滤饼再加磷酸缓冲液进行溶解，滤饼与正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液按的比例为：1g∶4ml；搅拌，过滤；合并两次的滤液，调节滤液pH至6.0；
正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液的配制：将180g正丁酸铵溶解于1000ml70％乙醇溶液中，得18％正丁酸铵/乙醇溶液；将18％正丁酸铵/乙醇溶液与pH值6.0的磷酸缓冲溶液等体积混合，即得。
(2)30，000道尔顿超滤膜预处理：用碱处理，1mol/1的氢氧化钠溶液循环35分钟，静置15小时，用pH6.0磷酸缓冲液洗净。
20，000道尔顿超滤膜预处理：用碱处理，1mol/l的氢氧化钠溶液循环35分钟，静置15小时，用pH6.0磷酸缓冲液洗净。
(3)超滤：将粗提液用超滤膜进行超滤，超滤至原体积的1/5，分别收集浓缩液和滤液。
(4)浓缩液处理：浓缩液加苯甲酸钠2％溶液至原体积后，继续超滤至原体积的1/5。收集浓缩液，然后缓慢加入0.25mol/L磷酸钠溶液，搅拌，最后加入0.3mol/L醋酸钙溶液，调节pH值至5.0-5.5，用乙醇进行沉淀。沉淀用pH7.0磷酸缓冲液溶解，加入缓冲液的比例为1g∶10ml，搅拌，调节pH值至5.0-5.5，用乙醇进行沉淀。
滤液处理：滤液，然后缓慢加入0.25mol/L磷酸钠溶液，搅拌，最后加入0.3mol/L醋酸钙溶液，用氨水调节pH值至10.0-10.5，用乙醇进行沉淀。沉淀用水溶解，加入水的比例为1g∶10ml，搅拌，调节pH值至10.0-10.5，用乙醇进行沉淀。
浓缩液沉淀和滤液沉淀：将步骤(4)和(5)的沉淀溶于pH6.0磷酸缓冲液，用20，000道尔顿超滤膜过滤，至原体积的1/5；加水至原体积后，继续超滤至原体积的1/5，反复2次，浓缩液加入乙醇进行沉淀，浓缩液与加入乙醇的体积比为：1∶4.5，离心。再用乙醇洗涤沉淀物，离心，反复3次；然后沉淀物干燥，得尿激酶精品。
400g尿激酶粗品的总效价为0.170亿单位，尿激酶精品中高分子尿激酶相对含量98.5％，活性回收率80％。

Claims (1)

1.一种能够从尿激酶粗品中纯化尿激酶，同时去除病毒及热原的尿激酶制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:
(1)粗品提取：取尿激酶粗品，加正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液进行溶解，尿激酶粗品与pH6.0正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液的比例为：lg:2-6ml；搅拌；过滤，将滤饼再加正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液进行溶解，滤饼与正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液按的比例为：1g:2～5ml；搅拌，过滤；合并两次的滤液，调节滤液pH至6.0；
正丁酸铵/乙醇/磷酸盐溶液的配制:将180g正丁酸铵溶解于1000ml 70％乙醇溶液中，得18％正丁酸铵/乙醇溶液；将18％正丁酸铵/乙醇溶液与pH值6.0的磷酸缓冲溶液等体积混合，即得；
(2)30,000道尔顿超滤膜预处理：用碱处理，1mol/l的氢氧化钠溶液循环35分钟，静置15小时，用pH6.0磷酸缓冲液洗净；
20,000道尔顿超滤膜预处理：用碱处理，l mol/1的氢氧化钠溶液循环35分钟，静置15小时，用pH6.0磷酸缓冲液洗净；
(3)超滤：将粗提液用30,000道尔顿超滤膜进行超滤，超滤至原体积的1/5至1/20，分别收集浓缩液和滤液；
(4)浓缩液处理：浓缩液加苯甲酸钠2％溶液至原体积后，继续超滤至原体积的1/5至1/15，收集浓缩液，然后缓慢加入0.1～0.3mol/L磷酸钠溶液，搅拌，最后加入0.1～0.5mol/L硫酸铜溶液，调节pH值至5.0-5.5，用乙醇进行沉淀，沉淀用pH7.0磷酸缓冲液溶解，加入缓冲液的比例为1g:10ml，搅拌，调节pH值至5.0-5.5，用乙醇进行沉淀；
(5)滤液处理:滤液，然后缓慢加入0.1～0.3mol/L磷酸钠溶液，搅拌，最后加入0.1～.0.5mol/L醋酸钙溶液，用氨水调节pH值至10.0-10.5，用乙醇进行沉淀，沉淀用水溶解，加入水的比例为1g:10ml，搅拌，调节pH值至10.0-10.5，用乙醇进行沉淀；
(6)浓缩液沉淀和滤液沉淀:将步骤(4)和(5)的沉淀溶于pH6.0磷酸缓冲液，用20,000道尔顿超滤膜过滤，至原体积的1/5至1/20；加水至原体积后，继续超滤至原体积的1/5，反复2-3次，浓缩液加入乙醇进行沉淀，浓缩液与加入乙醇的体积比为:1:4～6，离心，再用乙醇洗涤沉淀物，离心，反复2～4次；然后沉淀物干燥，得尿激酶精品。
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