CN108883192A - 新型多糖-蛋白质结合物及其获取工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型多糖‑蛋白质结合物及其获取工艺。更特别地，本发明涉及利用氨基甲酸酯化学反应生成的多糖‑蛋白质结合物，其能够用于单价疫苗或多价联合疫苗的生产，以及作为诊断工具使用。更具体地，本发明涉及利用氨基甲酸酯化学反应生成的脑膜炎奈瑟菌X、A、C、Y和W135群多糖‑载体蛋白质结合物及其获取工艺。

Description

新型多糖-蛋白质结合物及其获取工艺
发明领域
本发明涉及新型多糖-蛋白质结合物及其获取工艺。更特别地，本发明涉及利用氨基甲酸酯化学反应生成的多糖-蛋白质结合物，其能够用于单价疫苗或多价联合疫苗的生产，以及作为诊断工具使用。更具体地，本发明涉及利用氨基甲酸酯化学反应生成的脑膜炎奈瑟菌X、A、C、Y和W135群多糖-载体蛋白质结合物及其获取工艺。
发明背景
脑膜炎奈瑟菌(脑膜炎球菌)是一种需氧革兰氏阴性菌，其在血清学上主要分为13个血清群：A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y和Z。该分组体系基于生物体的荚膜多糖。世界卫生组织的官方网站提到，脑膜炎奈瑟菌是世界上导致细菌性脑膜炎的最常见病因之一，也是唯一能够爆发大规模流行性脑膜炎的细菌。已经有报告显示出，暴发性流行病的发病率高达每10万居民1000例，特别是在撒哈拉以南非洲地区。
脑膜炎奈瑟菌的传播途径有气溶胶或者与患者或健康人群携带者的呼吸道分泌物进行直接接触。通常情况下，地方性疾病主要发生于儿童和青少年群体，其中3-12个月婴儿的罹患率最高。而在流行病中，则可能会更多地涉及到大龄儿童和年轻人。然而，脑膜炎球菌疾病的快速进展经常会导致患者在发病后的1-2天内死亡。接种疫苗可以预防脑膜炎奈瑟菌感染。
b型流感嗜血杆菌是一种革兰氏阴性菌，其能够引发脑膜炎和急性呼吸道感染，儿童为主要易感群体。世界卫生组织的官方网站提到，无论是在发达国家还是在发展中国家，其均是引发幼儿非流行性脑膜炎的重要病因，并且其经常与严重的神经性尖叫有关，即使是立即给予抗生素也是如此。
流感嗜血杆菌感染通过已感染(但不一定有症状)人群的飞沫进行传播。可以通过接种疫苗预防b型流感嗜血杆菌。
大多数脑膜炎球菌疾病由6个血清群(即A、B、C、Y、W135和X)引发。在历史上，脑膜炎带中出现的大多数病例由A群脑膜炎球菌所引起。C群脑膜炎球菌造成了20世纪80年代脑膜炎地带中的疾病爆发，并且尼日尔在2015年也经历了一次新的疾病爆发，而W(以前称为W-135)群自2000以来已成为流行性脑膜炎的一个病因。Y群在非洲的流行程度最低，然而其在南美洲的脑膜炎病例中较为明显。根据美国国家生物技术信息中心的一本出版物，虽然X群脑膜炎球菌在以前一直被视为是引发零星脑膜炎的罕见病因，但是尼日尔、乌干达、肯尼亚、多哥和布基纳法索在2006-2010年间爆发了X群脑膜炎，其中在所报告的6732份病例中有至少1300份X群脑膜炎病例。
根据美国国家生物技术信息中心的另一本出版物，在2006-2009年间，多哥国内的X群脑膜炎球菌占已确认的702份细菌性脑膜炎病例的16％。科扎地区在2007年3月经历了X群脑膜炎球菌爆发，其中X群脑膜炎球菌的季节性累积发病率为33/100,000。在2007-2010年间，布基纳法索国内的X群脑膜炎球菌占已确认的778份细菌性脑膜炎病例的7％，从2009到2010年间还在增长(分别为所有已确认病例的4％至35％)。在2010年，X群脑膜炎球菌疫情出现在布基纳法索的北部和中部地区；在3月-4月间，X群脑膜炎球菌的最高地区性累积发病率估计为130/100,000。
基于上述事实，五价ACYWX多糖-蛋白质结合物疫苗针对除B群以外的脑膜炎球菌疾病具有更宽的覆盖率。免疫是控制脑膜炎球菌疾病的唯一合理方法。目前，虽然包括A、C、Y和W135群多糖结合物在内的各种单价或多价疫苗已获准上市销售，但是尚不存在针对X群脑膜炎球菌的获批疫苗。在公共卫生需要的情况下，X群多糖蛋白质结合物将会是多价脑膜炎球菌结合疫苗开发中的新开发对象。
几项研究显示，糖部分的尺寸能够影响结合疫苗的免疫原性。针对葡聚糖-蛋白质结合物免疫原性的初步研究发现，低分子量的葡聚糖能够与鸡血清白蛋白结合，诱导小鼠体内产生强烈的抗葡聚糖反应，而增加葡聚糖尺寸则会导致免疫原性降低。Laferriere等人发现，在小鼠体内，糖链长度对肺炎球菌结合疫苗免疫原性的影响很小。这些研究显示出，糖链长度和结合疫苗免疫原性之间没有明显的相关性。但是，Rana等人发现，确定最适宜的糖链长度对于开发免疫原性b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗很重要。
几个参考文献对多糖和CDI之间的反应进行了说明。羰基二咪唑是一种特别优选的试剂，其与羟基反应形成多糖的咪唑基氨基甲酸乙酯和芳基氯甲酸酯(包括例如硝基苯基-氯甲酸酯)，从而生成多糖的混合碳酸盐。所产生的活化后的多糖在各种情形下都很容易受到胺等亲核试剂的影响，并因此分别转化为氨基甲酸乙酯。
对于任何结合化学反应，多糖结构都起着非常重要的作用。任一多糖与载体蛋白的结合化学反应的选择取决于该多糖上的可用官能团。尽管一些多糖包含可方便用于结合的化学基团(例如胺、羧基或醛)，但是许多多糖在与蛋白进行结合之前需要活化和衍生化。正如文献中所显而易见的那样，无论是否有连接子，都可以制造多糖蛋白结合疫苗，其中，连接子可以是多糖的一部分或可以附着到载体蛋白上。
现有技术水平公开了包括A、B、C、W和Y群脑膜炎奈瑟菌在内的各种血清群的治疗疫苗，例如美国专利申请号US2015/0044253，其公开了免疫原性组合物，包括从b型流感嗜血杆菌(Hib)获得的糖片段以及与载体蛋白结合的A、B、C、W、Y群脑膜炎奈瑟菌。但是在US2015/0044253中，氨基甲酸酯连接子直接与载体蛋白的氨基连接，导致结合效率很低。
WO2004/019992还公开了改性荚膜糖，以及由还原胺化反应获得的A群脑膜炎奈瑟菌糖蛋白质结合物。但是，本专利申请仅对A群进行了讨论。
还有一些与X群脑膜炎奈瑟菌有关的发明，例如WO2013/174832，其公开了由还原胺化结合化学反应获得的X群脑膜炎奈瑟菌结合物。
现有技术水平中的主要缺点在于，使用氨基甲酸酯化学反应的现有技术都没有公开多糖溶解于有机溶剂有利于结合工艺。目前可用的结合物都存在着稳定性问题。更具体地，还无法获得稳定且在商业上可行的X群脑膜炎奈瑟菌结合物。
发明目的
为了避免现有技术水平所存在的缺点，本发明的主要目的是提供新型多糖-蛋白质结合物。
本发明的另一个目的是提供能够用于制备新型结合疫苗的稳定多糖-蛋白质结合物。
本发明的另一个目的是提供X群脑膜炎奈瑟菌多糖-载体蛋白质结合物，以便扩大当前获批疫苗预防的脑膜炎球菌疾病发病率的覆盖面。
本发明的另一个目的是提供一种获取所述新型多糖-蛋白质结合物的工艺。
本发明的另一个目的是提供一种利用氨基甲酸酯化学反应获得所述新型多糖-蛋白质结合物的工艺。
本发明的另一个目的是提供一种多糖快速溶解于非水性非质子溶剂的工艺。
本发明的另一个目的是在更宽的pH范围内进行结合反应。
本发明的另一个目的是在很短时间内高产量完成结合。
本发明的另一个目的是获得能够用于疫苗并作为诊断工具的新型高免疫原性多糖-蛋白质结合物。
发明内容
因此，本发明提供新型多糖(PS)-蛋白质结合物及其获取工艺。更特别地，本发明涉及通过氨基甲酸酯化学反应获得能够用于制备新型结合疫苗的多糖-蛋白质结合物。更具体地，本发明涉及利用氨基甲酸酯化学反应的X、A、C、Y和W135群脑膜炎奈瑟菌多糖-载体蛋白质结合物及其获取工艺。
本发明涉及结合工艺，其中，荚膜多糖降解至适合与载体蛋白进行结合的更小尺寸，以便获得具有较高抗原性的结合物。
载体蛋白选自TT(破伤风类毒素)、DT(白喉类毒素)、CRM197(DT无毒突变体)、OMPV(外膜蛋白囊泡)或其他合适的载体蛋白。多糖片段从革兰氏阴性菌群获得，所述革兰氏阴性菌群包括但不限于b型流感嗜血杆菌(Hib)、脑膜炎奈瑟菌(Men)和肺炎链球菌。
脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖的结合工艺，优选对A、C、Y、W或X群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖进行降解。采用现有技术中的几项技术实现降解。在实验室规模下，优选采用探针声波降解法和/或超声波降解法进行降解；在更大规模下，优选使用微射流机进行降解。天然脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖降解至分配系数为0.38+0.06kD的尺寸范围内，尺寸由凝胶渗透色谱法(GPC)-高效液相色谱法(HPLC)进行测定。
在降解过程之后，所述降解后的多糖溶解于强电解质盐中进行反离子交换，其中，所述强电解质盐包括但不限于卤化锂、氯化锂和水合季铵卤化物。对溶液进行60±30分钟的恰当混合。利用旋转蒸发等任一干燥技术，除去所得荚膜多糖中的水分。然后使干燥后的荚膜多糖溶解于非水性非质子溶剂中，其中，所述非水性非质子溶剂包括但不限于无水二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基乙酰胺。使非水性非质子溶剂中的所述降解和干燥后的荚膜多糖与5-50摩尔过量浓度的无水活化剂进行反应，其中，所述无水活化剂包括但不限于N,N'-羰基二咪唑(CDI)、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)或N,N'-二琥珀酰亚胺基草酸酯(DSO)；然后在4-二甲氨基吡啶(DMAP)或吡啶存在的情况下，使混合物保持一段预定时间，以便完成反应。
通过使多糖沉淀在过量低极性溶剂中，对所得的活性荚膜多糖进行纯化，其中，低极性溶剂包括但不限于乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸正丁酯或其不同比例的混合物。然后使沉淀的多糖溶解于缓冲盐水中，得到纯化的活性荚膜多糖。
使如此得到的纯化的活性荚膜多糖溶解于具有活性载体蛋白的含水缓冲液中。所述活性载体蛋白可以是标记的碳酰肼、标记的己二酸二酰肼或标记的肼。
使纯化的活性荚膜多糖和活性载体蛋白的溶液在室温下混合预定时间段，优选在不同的pH范围内混合15±5小时，其中，pH范围取决于所述多糖是羰基二咪唑活化、二琥珀酰亚胺基碳酸酯活化还是二琥珀酰亚胺基草酸酯活化。对于羰基二咪唑活化的多糖，pH范围为8-10，对于二琥珀酰亚胺基碳酸酯或二琥珀酰亚胺基草酸酯活化的多糖，pH范围为6-9。在此反应期间，蛋白上酰肼部分的胺和活化后的多糖上氨基甲酸酯或碳酸盐部分的含–N-芳香族残基进行反应，形成具有稳定的氨基甲酸酯键–O-(C＝O)-N-的多糖–蛋白质结合物。因此，生成分子式为PS-L1-L2-CR的最终结合物，其中，PS为多糖，L1为氨基甲酸酯键，L2为酰肼键，CR为载体蛋白。纯化结合物利用纯化工艺获得，其中，纯化工艺包括但不限于超滤、硫酸铵沉淀和凝胶渗透色谱法。
本发明还公开了将一个连接子(优选氨基甲酸酯)附着到多糖，并且将第二连接子(优选肼)附着到载体蛋白，然后使具有不同连接子的活化后的多糖和活性蛋白进行反应，生成结合物。
本发明的改进结合工艺能够在更短时间内完成，并且在较宽的pH工作范围内产生具有更稳定共价键的结合物。本发明的新型多糖-蛋白质结合物更加稳定，产量高，并且具有高免疫原性。
本发明还公开了多糖溶解于非水性非质子溶剂的方法，其有利于多糖和氨基甲酸酯形成剂之间的结合反应，以便在更短时间内完成结合工艺。
本发明改进工艺的最重要结果是提供能够用于疫苗或作为诊断工具的新型多糖-蛋白质结合物。所述新型多糖-蛋白质结合物能够诱发特异性和同源性免疫反应，因此在单价疫苗或多价联合疫苗的生产以及作为诊断工具使用中具有益处。
附图说明
图1描述了碳二亚胺(EDC)交联反应流程图(R-NH2为肼(H2N-NH2)或己二酸二酰肼(ADH)(NH2NHCO(CH2)4CONHNH2))。
图2描述了X群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖的单体单元——化学结构。
图3描述了显示有TSKgel PWXL5000–PWXL4000色谱柱上洗脱体积的HPLC-SEC曲线，流速为1ml/min，显示的信息有空隙体积、总体积和样品洗脱体积。
图4描述了天然X群脑膜炎奈瑟菌多糖和一定大小的多糖之间的HPLC-SEC曲线对比。
图5描述了肼衍生化后的破伤风类毒素和天然破伤风类毒素之间的HPLC-SEC曲线对比。
图6描述了显示有葡聚糖凝胶G-25上酰肼衍生化后的破伤风类毒素的纯化情况的色谱图。
图7描述了完整的氨基甲酸酯结合流程图。
图8描述了肼衍生化后的破伤风类毒素和原始X群脑膜炎奈瑟菌结合物之间的HPLC-SEC曲线对比。
具体实施方式
利用图表和实例对本发明进行的详细说明
本发明提供新型多糖-蛋白质结合物及其获取工艺。更特别地，本发明涉及利用氨基甲酸酯化学反应获得化学稳定的多糖–蛋白质结合物。多糖片段从革兰氏阴性菌群获得，其中，革兰氏阴性菌群包括但不限于b型流感嗜血杆菌(Hib)、脑膜炎奈瑟菌(Men)、肺炎链球菌、优选A、C、Y和W群脑膜炎奈瑟菌，更优选X群脑膜炎奈瑟菌。本发明还涉及获得能够单独或组合用于疫苗或者作为诊断工具的新型高免疫原性多糖-蛋白质结合物。
本发明涉及结合工艺，其中，所述荚膜多糖降解至适合与载体蛋白进行结合的更小尺寸，以便获得具有较高抗原性的结合物。
本发明提供利用CDI实现羟基活化的结合工艺，并借助氨基甲酸酯化学反应形成多糖-蛋白质结合物。
载体蛋白选自TT(破伤风类毒素)、DT(白喉类毒素)、CRM197(DT无毒突变体)、OMPV(外膜蛋白囊泡)或其他合适的载体蛋白。
采用现有技术中的几项技术降解所述荚膜多糖。在实验室规模下，优选采用探针声波降解法和/或超声波降解法进行降解；在更大规模下，优选使用微射流机进行降解。天然脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖降解至分配系数为0.38+0.06kD的尺寸范围内。多糖的尺寸由凝胶渗透色谱法(GPC)-高效液相色谱法(HPLC)进行测定。
在降解过程之后，所述降解后的多糖溶解于强电解质盐溶液中进行反离子交换，其中，所述强电解质盐包括但不限于卤化锂、氯化锂和水合季铵卤化物。对溶液进行60±30分钟的恰当混合。利用旋转蒸发等任一干燥技术，除去所得荚膜多糖中的水分。然后使干燥后的荚膜多糖溶解于非水性非质子溶剂中，其中，所述非水性非质子溶剂包括但不限于无水二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基乙酰胺。使非水性非质子溶剂中的所述降解和干燥后的荚膜多糖与5-50摩尔过量浓度的无水活化剂进行反应，其中，所述无水活化剂包括但不限于N,N'-羰基二咪唑(CDI)、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)或N,N'-二琥珀酰亚胺基草酸酯(DSO)；然后在4-二甲氨基吡啶(DMAP)或吡啶存在的情况下，使混合物保持一段预定时间，以便完成反应。脑膜炎奈瑟菌多糖的重复单元中具有自由羟基，其在和羰基二咪唑(CDI)反应时会形成中间体咪唑基氨基甲酸酯和咪唑副产物。
通过使多糖沉淀在过量低极性溶剂中，对所得的活性荚膜多糖进行纯化，其中，所述低极性溶剂包括但不限于乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸正丁酯或其不同比例的混合物。然后使沉淀的多糖溶解于缓冲盐水中，得到纯化的活性荚膜多糖。
在肼或ADH存在下，使载体蛋白和水溶性碳二亚胺EDC(N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐)反应以生成具有延长的末端酰肼基团的稳定酰亚胺键。EDC与可用的羧酸基团反应形成高反应活性的中间体O-酰基异脲。该活性酯可以进一步与如酰肼等亲核试剂反应以得到稳定的最终产物(图1)。EDC交联流程图中R-NH2是肼或ADH。
羰基与酰肼和胺在pH＝5-7的范围内进行反应。EDC的水解在结合期间属于竞争性反应，其取决于温度、pH值和缓冲液组成。4-吗啉乙磺酸(MES)是一种有效的碳二亚胺反应缓冲液。虽然磷酸盐缓冲液会降低EDC的反应效率，但是增加EDC的量可以弥补所降低的效率。三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸和乙酸盐缓冲液不能作为结合缓冲液。
标记破伤风类毒素上的酰肼采用三硝基苯磺酸法进行测定；蛋白浓度采用Lowry法进行测定。将产生的酰肼摩尔数除以蛋白摩尔数，从而计算得到衍生化程度。
使如此得到的纯化活性荚膜多糖溶解于具有活性载体蛋白的含水缓冲液中。活性载体蛋白可以是标记的碳酰肼、标记的己二酸二酰肼或标记的肼。
使纯化活性荚膜多糖和活性载体蛋白的溶液在室温和不同的pH范围内混合15±5小时，其中，pH范围取决于所述多糖是羰基二咪唑活化、二琥珀酰亚胺基碳酸酯活化还是二琥珀酰亚胺基草酸酯活化。对于羰基二咪唑活化的多糖，pH范围为8-10，对于二琥珀酰亚胺基碳酸酯或二琥珀酰亚胺基草酸酯活化后的多糖，pH范围为6-9。在此反应期间，蛋白上酰肼部分的胺和活性多糖上氨基甲酸酯或碳酸盐部分的含–N-芳香族残基进行反应，形成具有稳定的氨基甲酸酯键–O-(C＝O)-N-的多糖–蛋白质结合物。因此，生成分子式为PS-L1-L2-CR的最终结合物，其中，PS为多糖，L1为氨基甲酸酯键，L2为酰肼键，CR为载体蛋白。纯化结合物利用纯化工艺获得，其中，纯化工艺包括但不限于超滤、硫酸铵沉淀和凝胶渗透色谱法。
利用氨基甲酸酯化学反应制备的结合物已经过多糖/蛋白比率、结合物中游离多糖含量和分子尺寸分布的测定试验。在本发明中，进行了各种优化试验，获得的多糖/蛋白比率在0.30至1.0之间，结合产量达到了60％，平均产量为30±5％。
在一个优选实施例中，由细菌发酵得到的脑膜炎奈瑟菌多糖利用下游纯化工艺进行纯化，并且在纯化之后对其所有关键质量参数进行分析。脑膜炎奈瑟菌多糖的化学结构包括具有自由羟基的重复单元，例如，X群脑膜炎奈瑟菌多糖(图2)包括具有磷酸盐骨架和3-位N-乙酰化的重复单元。4-位和7-位羟基作为反应官能团，与诱导N,N'-羰基二咪唑等化学品的氨基甲酸酯进行结合。单体重复单位称为单糖，并且单糖单元之间的共价键所形成的长链组成多糖。单糖类型对特定血清群具有特异性(表1)。
表1：不同脑膜炎奈瑟菌血清群的荚膜多糖化学结构
血清群 重复单元
X →4)-D-GlcpNAc-α-(1→OPO3→
A →6)-D-ManpNAc(3/4OAc)-α-(1→OPO3→
C →9)-D-Neup5Ac(7/8OAc)-α-(2→
Y →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→
W →4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→
根据采用普鲁兰多糖标准由SEC-HPLC测定的结果，天然脑膜炎奈瑟菌多糖的尺寸范围的分配系数为0.38+0.06kD。本发明的氨基甲酸酯化学反应和多糖结构有助于形成稳定的多糖-蛋白质结合物，所述结合物能够单独或组合作为候选疫苗使用。
已通过各种理化方法对降解后的多糖的含量进行了测定，例如，针对X群和A群脑膜炎奈瑟菌的磷测定方法；并且发现，降解后的多糖的含量与初始多糖含量相近。
进行了不同试验，以对分配系数进行优化，从而得到其最适宜的范围为0.38±0.06kD。使用了可变条件，条件会因不同批次而存在差异，其取决于各个多糖的初始分子尺寸和结构。
在一个优选实施例中，X群脑膜炎奈瑟菌多糖降解至适合与载体蛋白进行结合的更小尺寸，以便获得具有较高抗原性的结合物。将破伤风类毒素(TT)作为载体蛋白。使所述降解后的X群脑膜炎奈瑟菌多糖溶解于氯化锂中。对溶液进行60±30分钟的恰当混合。利用旋转蒸发等任一干燥技术，除去所得荚膜多糖中的水分。然后使降解和干燥后的荚膜多糖溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)中。使非水性非质子溶剂中的所述干燥后的荚膜多糖与5-50摩尔过量(优选30摩尔过量)浓度的活化剂N,N'-羰基二咪唑(CDI)进行反应，使混合物保持混合2-3小时，以便完成反应。使反应混合物的pH值保持在7-10，优选pH值保持在9.0。通过使多糖沉淀在过量低极性溶剂乙酸乙酯中，对所得的活性X群脑膜炎奈瑟菌多糖进行纯化，然后使沉淀的多糖溶解于缓冲盐水中，从而得到纯化的活性荚膜多糖。
在另一个优选实施例中，连接子为肼或其衍生物，其附着在载体蛋白上。将一定大小的活化后的多糖和衍生化后的载体蛋白在pH为7.0～10.0的缓冲液(优选为0.1M碳酸钠，01M氯化钠，pH值为9.0)中以重量比0.5:1至1:0.5比例混合，优选以重量比为1:1比例混合。在此反应期间，蛋白上酰肼部分的胺和活化后的多糖上氨基甲酸酯或碳酸盐部分的含–N-芳香族残基进行反应，形成具有非常稳定的氨基甲酸酯键–O-(C＝O)-N-的多糖–蛋白质结合物。利用已知技术对所述结合物进行纯化，然后对其总多糖含量、蛋白含量、游离多糖、多糖-蛋白比率和结合产量进行分析。将纯化结合物储存在2-8℃下。
暴露在37℃的高温条件下时，本发明的结合物是稳定的。血清杀菌试验(SBA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等各种免疫原性试验显示出，本发明的脑膜炎奈瑟菌结合物具有高抗原性和高免疫原性。
非限制性实例
实例1：确定X群脑膜炎奈瑟菌多糖的尺寸
取200mg X群脑膜炎奈瑟菌多糖，将其放入冰浴中的玻璃烧杯内，浓度为10mg/ml。以振幅为20％运行超声波破碎仪3小时。通过采用HP-GPC(表2)并使用折射率(RI)检测器，以分配系数(Kd)计，测定了降解后的多糖的尺寸。在TSK gel G5000 PWXL+G4000 PWXL色谱柱上，在恒溶剂模式下对pH值为7.2的0.1M NaNO3中的样品进行连续洗脱。以保留时间计，测定了洗脱体积。根据高分子量葡聚糖注入保留时间计算色谱柱的空隙体积(Vo)，并且根据叠氮化钠注入保留时间确定色谱柱的总体积(Vt)。根据公式Kd＝(Ve-Vo/Vt-Vo)计算出Kd。Ve为样品洗脱体积(图3)的保留时间(RT)。使用折射率检测器所记录的数据显示色谱峰向右侧进行了移动，这显示出天然多糖存在解聚现象(图4)。
表2：显示有TSK gel G5000 PWXL+G4000 PWXL色谱柱上X群脑膜炎球菌多糖尺寸分配的结果，采用HP-SEC
实例2：利用羰基二咪唑对多糖进行活化
将200mg一定大小的多糖和氯化锂进行混合，在保留时间处缓慢搅拌1小时，之后在40℃下利用旋转蒸发进行干燥。然后再溶解在15ml的干二甲基亚砜中，并保持混合2小时。然后添加30X摩尔羰基二咪唑(CDI)到多糖中。通过添加三乙胺(TEA)，将pH值调整至9.0。在保留时间处缓慢搅拌2小时，并在冰中冷却样品，以停止反应。添加乙酸乙酯，并移除顶部的上清液。再次添加乙酸乙酯，并移除顶部的上清液。在高真空中干燥30分钟。
实例3：破伤风类毒素的活化
使用50kDa截留分子量(MWCO)的离心过滤器对250mg破伤风类毒素进行浓缩，最终得到10ml。将从5M或2.5mg己二酸二酰肼得到的2.75ml一水合肼(相当于破伤风类毒素重量的10倍)添加到10ml反应缓冲液中，也就是将包含0.2M氯化钠、pH值为5.75的0.15M 4-吗啉乙磺酸缓冲液添加到上述破伤风类毒素中。1ml反应缓冲液中的等量EDAC(250mg)加入到该混合物中，以制得约30mM最终浓度。将反应混合物的pH值调整为5.85，并且将反应混合物的最终体积调整为25ml。反应混合物中的破伤风类毒素浓度为10mg/ml。在冰浴中缓慢搅拌反应混合物1.0小时。对衍生化后的破伤风类毒素进行进一步纯化，并对活化程度和SEC-HPLC进行分析，以便对峰值曲线进行监测。图5为肼活化的破伤风类毒素和天然破伤风类毒素之间的HPLC-SEC曲线对比，其中，色谱柱上的样品在恒溶剂模式下运行，并且使用光电二极管阵列(PDA)检测器记录数据。
实例4：活性破伤风类毒素的纯化
纯化是工艺和破伤风类毒素活化中的其中一个最重要的步骤。我们务必要尽可能地除去任何未反应的肼或己二酸二酰肼。采用葡聚糖凝胶G-25脱盐方法进行纯化。脱去葡聚糖凝胶G-25柱上的反应混合物的盐分(使用的缓冲液为包含75mM氯化钠、pH值为7.5的50mM磷酸盐缓冲液)，以便对衍生化后的蛋白进行纯化。利用包含75mM氯化钠、pH值为7.5的50mM磷酸盐缓冲液实现色谱柱的平衡，然后进行样品装载，并在110cm/h的流速下进行洗脱。将收集的每10ml洗脱部分和与紫外线280nM处的色谱峰相对应的部分(图6)进行混合且利用50kDa截留分子量的Amikon膜对其进行浓缩。对具有破伤风类毒素的所选部分进行浓缩，使得其中的破伤风类毒素浓度大约为30-50mg/ml(考虑到活性破伤风类毒素在脱盐后的回收率大约为75％)。对于最终的活性破伤风类毒素，采用Lowry法对蛋白浓度进行分析，并且采用三硝基苯磺酸法对酰肼标记进行分析。两个值用于计算破伤风类毒素的活化程度(DOA)。使用PWXL5000–PWXL4000色谱柱和HPLC，在1mg/ml浓度下运行活性破伤风类毒素，以便检查峰形的完整性。
本发明所述工艺利用不同的活化剂(优选是羰基二咪唑)活化不同多糖(优选X群脑膜炎奈瑟菌多糖)的羟基，使得多糖与载体蛋白反应，形成稳定的多糖-破伤风类毒素结合物(图7)。
实例5：活性X群脑膜炎奈瑟菌和衍生化后的破伤风类毒素的结合反应
在包含0.1M碳酸钠、0.1M氯化钠、pH值为9.0的3ml缓冲溶液中，直接向X群脑膜炎奈瑟菌多糖中加入衍生化后的破伤风类毒素，并且使pH值保持在9.0。使活化后的多糖和衍生化后的破伤风类毒素按1:1的重量比例混合，以进行结合反应。虽然只在3个小时内就确认了有结合物形成，但是粗结合混合物在室温下保持了一整夜的混合。然后使用5-10摩尔过量含胺试剂(例如甘氨酸)停止反应。
利用SEC-HPLC分析对结合过程进行监测，活性破伤风类毒素的保留时间发生了变化，并且色谱峰向左侧进行移动。结合物的HPLC-SEC曲线显示出，结合反应在3至4个小时内达到最大反应程度。天然和活性破伤风类毒素以及结合物的SEC-HPLC曲线显示出，在活化之后，活性破伤风类毒素的尺寸与天然破伤风类毒素相比未发生变化，从而显示出只发生了很少的聚合或没有发生聚合。色谱柱上的样品在恒溶剂模式下运行，流速为1.0ml/min，使用0.1M硝酸钠缓冲液(pH值为7.2)，并且使用光电二极管阵列(PDA)检测器记录数据。在结合之后，高分子量峰出现在活性破伤风类毒素峰的左侧，显示出形成了多糖-破伤风类毒素结合物(图8)。
实例6：利用硫酸铵沉淀除去粗结合物中未反应(游离)的多糖
此外，利用蛋白沉淀法对粗结合物进行纯化，以便除去游离或未反应的多糖。在进行纯化时，缓慢向反应混合物中添加固体硫酸铵，直到结合物从溶液中沉淀出来。利用离心法分离沉淀物，离心加速度为5000xg，时间为45分钟。除去上清液，使沉淀物再溶解于30ml包含100mM氯化钠、pH值为6.5的50mM 4-吗啉乙磺酸缓冲液中。
实例7：利用切向流过滤(TFF)对多糖-蛋白质结合物进行纯化
在硫酸铵纯化之后，利用Pall 300kDa截留分子量的膜包对结合物样品进行进一步纯化。这一步旨在确保除去结合物中可能存在的任何游离蛋白，并且使游离多糖与结合多糖进一步分离。利用20X体积的4-吗啉乙磺酸缓冲液(pH值为6.5)对结合物进行渗滤处理，其最终浓缩后的体积为35ml。
因此，确保了在4个不同步骤处除去在整个结合工艺中使用的残留试剂，第1步针对多糖：在活化后的多糖沉淀步骤时，第2步针对载体蛋白：在GPC纯化步骤，第3步针对整个结合工艺：采用硫酸铵沉淀，第4步：利用300kDa渗滤步骤。最后使用0.2μ过滤器进行进一步过滤，并储存在2-8℃下。
实例8：X群脑膜炎奈瑟菌-破伤风类毒素结合物的表征
通过对X群脑膜炎奈瑟菌-破伤风类毒素结合物的磷测定，分析纯化结合物的总多糖含量。利用Lowry法测定蛋白含量。采用脱氧胆酸钠沉淀法测定游离多糖，并且利用各自的比色测定对上清液进行分析。在进一步用于制剂之前，进行不同的测定，以便测定各种残留物的含量。将纯化结合物储存在2-8℃下。
表3为本发明所述的结合物的各质量参数分析结果，其中，多糖/蛋白比率在0.3-0.7(重量比)范围内。不同结合物的游离多糖含量也不相同，不过所有游离多糖在纯化的结合物中均小于10％。不同结合物的结合产量也不相同，其在18％至43％范围内。在本发明中，尝试了20mg至230mg范围内的不同结合规模。
表3：不同X群脑膜炎奈瑟菌-破伤风类毒素结合物批次的表征
实例9：利用氨基甲酸酯化学反应获得的A、C、Y和W群脑膜炎奈瑟菌结合物的表征
我们采用与X群脑膜炎奈瑟菌类似的方式，使用本发明制备了A、C、Y和W群脑膜炎奈瑟菌结合物。表4为所有结合物各质量参数的表征，并给出了预期结果。
表4：不同脑膜炎奈瑟菌-破伤风类毒素结合物的表征
实例10：X群脑膜炎奈瑟菌-破伤风类毒素结合物的稳定性
使本发明的结合物暴露在37℃的高温条件下28天。在第7、14、21和28天取出样品，监测所产生的游离多糖。利用本实施例中定义的氨基甲酸酯化学反应所制备的X群脑膜炎奈瑟菌结合物的稳定性证明了该工艺适用于生产极其稳定的结合物(表5)。
表5：利用本发明的化学反应制备的X群脑膜炎奈瑟菌-破伤风类毒素结合物批次的稳定性数据
实例11：X群脑膜炎奈瑟菌结合物的免疫原性
使用在生理盐水中配制的两种不同批次的X群脑膜炎奈瑟菌结合多糖抗原(1μg剂量水平)，在第0天、14天和28天对各组8只5-9周的雌性BALB/c小鼠实施免疫(表6)。采用经皮下注射200μl疫苗稀释液的方式进行所有免疫。单独使用生理盐水作为阴性对照组。在2次和3次剂量后的7-14天采集血清。利用酶联免疫吸附试验估计2次和3次剂量后的抗多糖特异性IgG抗体滴定度。
X群脑膜炎奈瑟菌结合物在2次加强剂量后达到了最大IgG滴定度。可以观察到，与阴性对照组相比，X群脑膜炎奈瑟菌在3次剂量之后的滴定度增加值大约为X群脑膜炎奈瑟菌结合物批次1的100倍和X群脑膜炎奈瑟菌结合物批次2的150倍(表6)。
表6：使用1μg抗原在第0天、14天和28天实施免疫之后，小鼠模型内的X群脑膜炎奈瑟菌-破伤风类毒素制剂在2次和3次剂量(3次剂量之后的置信区间为+,-95％)之后的IgG滴定度几何平均值，采用酶联免疫吸附试验
实例12：针对X群脑膜炎奈瑟菌结合物的血清杀菌试验(SBA)
将属于同一组小鼠的血清样品中提取的等体积血清混合在一起，制成血清池组，并进行血清杀菌试验。试验按如下步骤进行：
对X群脑膜炎奈瑟菌目标菌株进行划线，以使单菌落隔离并在37℃下进行过夜培养，其中，绵羊血琼脂平板上含有5％CO2。将细胞平铺到另一块绵羊血琼脂平板的整个表面上进行菌株的传代培养，然后在37℃、5％CO2的环境下使菌株进行新的生长。细菌重悬于～5ml杀菌试验缓冲液中。对悬浮液OD650进行调整，使其等效为约1x105cfu/ml菌落数。对血清连续稀释2倍，并将试验缓冲液加到对照孔中。将10μl细菌工作溶液加到各个孔中。将10μl热灭活(保持在56℃下30分钟)补体加到所有无活性补体对照孔中，并将10μl所述灭活补体加到含血清的孔和活性补体对照孔中。晃动平板，并将平板在37℃下培养1小时。
在培养之后，从各孔中滴10μL到倾斜的血琼脂平板上。在37℃、5％CO2的环境下对所有琼脂平板进行过夜培养。数出平板上各个位置处的菌落数量。显示出能够杀死≥50％细菌(与补体对照组相比)的最高血清稀释被视为该血清样品的血清杀菌试验滴定度。
血清杀菌试验数据显示出，在3次剂量之后，赋形剂免疫反应可以忽略，而与赋形剂对照组相比，试验中的两个X群脑膜炎奈瑟菌结合物批次均表现出了显著的高血清杀菌试验滴定度，这显示出疫苗在小鼠模型体内是有效的(表7)。
表7：使用1μg抗原在第0天、14天和28天实施免疫之后，小鼠模型内的X群脑膜炎奈瑟菌-破伤风类毒素制剂在2次和3次剂量(3次剂量之后的置信区间为+,-95％)之后的IgG滴定度几何平均值，采用血清杀菌试验

Claims (26)

1.具有高免疫原性的新型多糖-蛋白质结合物，其中，所述多糖-蛋白质结合物包括：
-至少一种从革兰氏阴性菌群得到的多糖，所述革兰氏阴性菌群包括但不限于b型流感嗜血杆菌(Hib)、脑膜炎奈瑟菌(Men)和肺炎链球菌；以及
-至少一种载体蛋白，其中：
-所述多糖-蛋白质结合物具有稳定的氨基甲酸酯键-O-(C＝O)-N-，
-所述结合物的分子式为PS-L1-L2-CR，其中，PS为多糖，L1为氨基甲酸酯键，L2为酰肼键，CR为载体蛋白。
2.根据权利要求1所述的新型多糖-蛋白质结合物，其中，所述多糖优选脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖，更优选A、C、Y、W或X血清群的脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖。
3.根据权利要求2所述的新型多糖-蛋白质结合物，其中，所述多糖为X血清群的脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖。
4.根据权利要求1所述的新型多糖-蛋白质结合物，其中，所述载体蛋白选自但不限于TT(破伤风类毒素)、DT(白喉类毒素)、CRM197(DT无毒突变体)和OMPV(外膜蛋白囊泡)。
5.根据权利要求1所述的新型多糖-蛋白质结合物，其中，所述结合物稳定，并且能够单独或组合作为候选疫苗使用。
6.根据权利要求1所述的新型多糖-蛋白质结合物，其中，所述结合物在室温下是稳定的。
7.根据权利要求1所述的新型多糖-蛋白质结合物，其中，所述结合物在37℃下储存28天之后，其游离多糖增加量少于10.5％。
8.根据权利要求1所述的新型多糖-蛋白质结合物，其中，与阴性对照组相比，在三次剂量之后，所述结合物的所述高免疫原性滴定度增加值在100倍至150倍之间。
9.根据权利要求1所述的新型多糖-蛋白质结合物，其中，所述结合物显示出，与赋形剂对照组相比，两次剂量之后的血清杀菌试验滴定度在32倍至128倍之间，并且三次剂量之后的血清杀菌试验滴定度在118倍至198倍之间。
10.一种获取具有高免疫原性的新型多糖-蛋白质结合物的工艺，所述工艺包括下列步骤：
(a)将所述至少一种荚膜多糖降解到最适宜的尺寸范围，
(b)将步骤(a)中所述降解后的多糖溶解在强电解质盐中，并对所得混合物进行预定时间段的恰当混合，其中，所述预定时间段为30分钟至90分钟，
(c)利用已知技术除去步骤(b)中所得混合物的水分，从而获得干燥的多糖，所述已知技术包括但不限于冻干法、旋转蒸发法或真空干燥法，
(d)将步骤(c)所述干燥的多糖溶解在至少一种非水性非质子溶剂中，
(e)将步骤(d)所得溶液与预定浓度的至少一种无水活化剂进行反应，
(f)将步骤(e)所得混合物保持预定时间段，以便获得具有至少一个连接子的活性多糖，其中，所述预定时间段为2小时至3小时，
(g)利用已知方法净化步骤(f)中的所述活性多糖，所述已知方法包括但不限于硫酸铵沉淀法、渗滤法、尺寸排除色谱法和/或其组合，以及
(h)将步骤(g)中的所述净化后的活性多糖与具有至少一个嵌入连接子的至少一种活性载体蛋白在较宽的pH范围内进行预定时间段的反应，其中，所述预定时间段为2小时至20小时。
11.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，所述降解后的多糖的所述最适宜尺寸范围的分配系数为0.38+0.06kD。
12.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，所述非水性非质子溶剂选自，但不限于无水二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基乙酰胺。
13.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，所述至少一种无水活化剂为N,N'-羰基二咪唑(CDI)、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)或N,N'-二琥珀酰亚胺基草酸酯(DSO)。
14.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，所述至少一种活性载体蛋白选自但不限于TT(破伤风类毒素)、DT(白喉类毒素)、CRM197(DT无毒突变体)和OMPV(外膜蛋白囊泡)。
15.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，所述至少一种无水活化剂的预定浓度范围为5至50摩尔过量，优选为30摩尔过量。
16.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，所述较宽的pH范围为pH＝6至pH＝10。
17.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，所述多糖-蛋白质结合物具有稳定的氨基甲酸酯键-O-(C＝O)-N-。
18.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，所述工艺产生分子式为PS-L1-L2-CR的结合物，其中，PS为多糖，L1为氨基甲酸酯键，L2为酰肼键，CR为载体蛋白。
19.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，活性多糖上的所述至少一个连接子为氨基甲酸酯。
20.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，活性载体蛋白上的所述至少一个连接子为酰肼。
21.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，将所述降解活化后的多糖和所述活性载体蛋白在pH为7.0-10.0、优选pH为9.0的缓冲液中以重量比0.5:1至1:0.5比例混合，优选以重量比为1:1比例混合。
22.根据权利要求21所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，所述缓冲液选自但不限于碳酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液。
23.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，所述结合物中的多糖/蛋白比率范围为0.3至1.0(重量比)。
24.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，在净化后的结合物中，所述结合物含有少于10％的游离多糖。
25.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，由所述结合工艺获得的结合物产量达到60％。
26.根据权利要求10所述的获取新型多糖-蛋白质结合物的工艺，其中，由所述结合工艺获得的结合物平均产量为30±5％。
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