JP2020525495A - 新規の多価多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物及びその製剤 - Google Patents
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Abstract
新規の多価多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤。製剤は、Neisseria meningitidis(髄膜炎菌)血清型A、C、Y、W及びXの莢膜多糖類(Men A、C、Y、W、X)であって、前記各多糖類が別々に破傷風トキソイド(TT)キャリアタンパク質にコンジュゲートされてMenA、C、Y、W、X−TTコンジュゲートを得る、液体または凍結乾燥または液体・凍結乾燥複合の5価製剤であり、製剤は、薬学上許容できる成分/賦形剤と一緒にアジュバントの有無にかかわらず、1以上の緩衝液を伴うものである。【選択図】なし
Description
本発明は新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は、薬学上許容できる成分/賦形剤と併せた破傷風トキソイド(TT)キャリアタンパク質にコンジュゲートしたNeisseria meningitidis(髄膜炎菌)血清型A、C、Y、W及びXの莢膜多糖類(MenA、C、Y、W、X)の5価コンジュゲートワクチン製剤に関する。本発明の5価コンジュゲートワクチン製剤は液体形態または凍結乾燥形態またはそれらの組み合わせである。
ワクチンの製造及び組成は複雑であり、厳しく規制されて個体の安全を確保し、有効性及び安定性を最大限高める。ワクチンはすべて、防御免疫反応を生成する有効成分を含有する。ワクチンはまた薬学上許容できる追加の成分も含有して製剤の安定性を高め、及び/または強力な防御免疫反応のための免疫原性を高める。
世界保健機関は、ワクチンで予防可能な疾患の罹患率が中程度から高いまたは頻繁な大流行がある国は定期的にワクチン接種を行うべきであると勧告している。疾患のリスクが低い国では、彼らは高リスク群が免疫されるべきであると勧告している。
髄膜炎菌性疾患は、細菌Neisseria meningitidisが原因で発生する急性の重篤な可能性がある病気である。N.meningitidis(髄膜炎菌)は主として13の血清型、A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y及びZに血清学的に分類されている好気性のグラム陰性細菌である。型分類はその生物の莢膜多糖類に基づく。
N.meningitidisは世界中で細菌性髄膜炎の最も一般的な原因の1つであり、髄膜炎の大流行を発生させることができる唯一の細菌であることがWHOの公式ウェブサイトで言及されている。100,000人の住民当たり1000症例までの発生率での大規模流行は、特にサハラ以南のアフリカで報告されている。
N.meningitidisは患者または健常ヒトキャリアの呼吸分泌物との噴霧接触または直接接触によって伝染する。流行性疾患は3〜12ヵ月齢の乳児での最高の発病率で主として小児や青年期の若者で発生するのに対して、病気の流行には年長児や若年成人がさらに含まれ得る。しかしながら、髄膜炎菌性疾患の急速な進行は発症後1〜2日以内での死亡を生じることが多く、N.meningitidisの感染はワクチン接種によって防ぐことができる。
免疫は髄膜炎疾患を制御する唯一の理に適ったアプローチである。N.meningitidisに対する最も効果的なワクチンは、活性がある多糖類への活性化されたタンパク質の共有結合によって形成される多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチンである。ネイティブ多糖類のほとんどは活性化がないとキャリアタンパク質に化学的に効率的に結合することができないので、多糖類はキャリアタンパク質への連結に先立って「活性化」プロセスとして知られる若干の化学的修飾を受ける。
多糖類をタンパク質に共有結合するのに採用されている多数のコンジュゲート反応がある。さらに一般に採用される方法のうちの3つには、
(1)反応の一方の成分におけるアルデヒド基またはケトン基が他方の成分におけるアミノ基またはヒドラジド基と反応し、そのように形成されたC=N二重結合がその後還元剤によってC−N単結合に還元される還元的アミノ化;
(2)多糖類を臭化シアン(CNBr)またはテトラフルオロホウ酸1−シアノ−4−ジメチルアミノピリジニウム(CDAP)によって活性化してヒドロキシル基にシアン酸基を導入し、それがタンパク質成分の付加の際にアミノ基またはヒドラジド基への共有結合を形成するシアニル化コンジュゲート;及び
(3)カルボジイミドがコンジュゲート反応の一方の成分におけるカルボキシル基を活性化し、活性化されたカルボキシル基が他方の成分におけるアミノ基またはヒドラジド基と反応するカルボジイミド反応
が挙げられる。また、これらの反応を用いてコンジュゲート反応に先立ってコンジュゲートの成分を活性化することも多い。
(1)反応の一方の成分におけるアルデヒド基またはケトン基が他方の成分におけるアミノ基またはヒドラジド基と反応し、そのように形成されたC=N二重結合がその後還元剤によってC−N単結合に還元される還元的アミノ化;
(2)多糖類を臭化シアン(CNBr)またはテトラフルオロホウ酸1−シアノ−4−ジメチルアミノピリジニウム(CDAP)によって活性化してヒドロキシル基にシアン酸基を導入し、それがタンパク質成分の付加の際にアミノ基またはヒドラジド基への共有結合を形成するシアニル化コンジュゲート;及び
(3)カルボジイミドがコンジュゲート反応の一方の成分におけるカルボキシル基を活性化し、活性化されたカルボキシル基が他方の成分におけるアミノ基またはヒドラジド基と反応するカルボジイミド反応
が挙げられる。また、これらの反応を用いてコンジュゲート反応に先立ってコンジュゲートの成分を活性化することも多い。
出版物の1つによれば、歴史的に血清型A(MenA)はサハラ以南のアフリカにおける流行性疾患の最も一般的な原因となっている。血清型B及びCは開発途上国における大半の症例に関与し、残りの症例は血清型W135及びYが原因となっている。血清型Cの症例はサハラ以南のアフリカでは最近観察されているが、その血清型はそこでは歴史的にさほど流行していなかった。血清型Xも近年少数の国で出現している。Xie,O.et al,“Emergence of serogroup X meningococcal disease in Africa:need for a vaccine”,Vaccine.2013,Jun.12;31(27):2852−6によれば、血清型Xの髄膜炎菌は散発性髄膜炎の稀な原因であると以前見なされていたが、2006〜2010年の間に血清型Xの髄膜炎の大流行がニジェール、ウガンダ、ケニヤ、トーゴ及びブルキナファソで発生し、後者は報告された6732症例のうち少なくとも1300症例が血清型Xの髄膜炎だった。
別のNCBIの出版物によれば、トーゴでは2006〜2009年の間に血清型Xの髄膜炎菌は確認された細菌性髄膜炎症例702のうちの16%を占めた。Kozah地方は2007年3月に血清型Xの髄膜炎菌の大流行を経験し、血清型Xの髄膜炎菌の季節的な累積発生率は33/100,000だった。ブルキナファソでは、2007〜2010年の間に血清型Xの髄膜炎菌は確認された細菌性髄膜炎症例778のうち7%を占め、2009年から2010年までで増加した(それぞれ確認された全症例の4%から35%に)。2010年では、血清型Xの髄膜炎菌の流行はブルキナファソの北部及び中央部の領域で発生し;血清型Xの髄膜炎菌の地方別の最高累積発生率は3月〜4月で130/100,000と推定された。
上記の事実に基づいて、ヒト神経細胞で見いだされた分子とのMenB莢膜多糖類の構造的類似性のゆえにコンジュゲートワクチンの可能性がわずかである血清型Bを除いて、5価の髄膜炎菌ACYWX多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチンが髄膜炎菌性疾患に対するさらに広い被域を提供することができた。現在、血清型A、C、Y及びW135の多糖類コンジュゲートを含む種々の1価または多価のワクチンが市場での販売のために認可されている。当該技術の現状は、キャリアタンパク質とコンジュゲートされたHaemophilus influenzae血清型B(Hib)、Neisseria meningitidis血清型A、B、C、W、Yから得られた糖類断片を含む免疫原性組成物を開示している米国特許出願番号US2015/0044253のようなN.meningitidis血清型A、B、C、W及びYを含む種々の血清型の予防のためのワクチンを開示している。しかしながら、US2015/0044253では、カルバミン酸リンカーがキャリアタンパク質のアミノ基に直接連結され、それは低いコンジュゲート効率を生じる。
インド特許出願281/MUM/2012は凍結乾燥した5価のN.meningitidis多糖類・タンパク質のコンジュゲート組成物を開示している。しかしながら、適用は特定のMenX株に制約され、複数のキャリアタンパク質を使用する。
PCT/EP2006/006188は、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた血清型A、C、W135及びYの少なくとも1つに由来する髄膜炎菌莢膜多糖類を含む免疫原性組成物を教示しているが、それは免疫原性組成物におけるMenXのコンジュゲートを教示していない。
利用できる多価髄膜炎菌コンジュゲートワクチンはコストが高く、複雑な処方を有する。従来技術のいずれも、コンジュゲート化学の最適化された組み合わせを用いた液体または凍結乾燥の形態またはその組み合わせでのMenXコンジュゲートを伴ったN.meningitidis多糖類・タンパク質コンジュゲート製剤を教示していない。
高い均質性、高い免疫原性、低いコストを有し、製剤化し、投与するのに簡単である髄膜炎菌コンジュゲートワクチンの緊急のニーズがある。
当該技術の現状における欠点を取り除くために、本発明の主な目的は新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、コンジュゲートがコンジュゲート化学の最適化された組み合わせを用いて製造される新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、組成物がそれぞれキャリアタンパク質としての破傷風トキソイドにコンジュゲートされた血清型ACYWX多糖類を含有する5価の髄膜炎菌ACYWX−TTの混合ワクチンの製造で使用することができる、新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン前記組成物を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、薬学上許容できる成分/賦形剤と共に多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含む多糖類・タンパク質のコンジュゲート組成物の新規のワクチン製剤を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、薬学上許容できる成分/賦形剤と共に5価の髄膜炎菌ACYWX−TT多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含む多糖類・タンパク質のコンジュゲート組成物の新規のワクチン製剤を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、前記5価の髄膜炎菌ACYWX−TT製剤が液体のまたは凍結乾燥したワクチン製剤であるまたは凍結乾燥された部分と液体部分の組み合わせとしての新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、組成物が最適化されたコンジュゲート化学を用いて調製されたコンジュゲートの新規の組み合わせを有する新規の5価の髄膜炎菌ACYWX多糖類・破傷風トキソイドキャリアタンパク質のコンジュゲートワクチンの前記組成物及び製剤を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ワクチン組成物及びワクチン製剤におけるコンジュゲートのそれぞれの最適投与量を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、高温で安定であり、高い免疫原性及び抗原性を示す5価のワクチン製剤を提供することである。
従って、本発明は新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物及びその製剤を提供する。さらに詳しくは、本発明はコンジュゲート化学を用いて製造される多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含むコンジュゲートワクチン製剤に関する。使用されるコンジュゲート化学には、カルバメート化学及び/またはシアニル化化学のうちの1以上が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の製剤は5価の髄膜炎菌混合ワクチンの製造に使用することができる。
本発明のコンジュゲートを調製するのに使用される多糖類は最適化された発酵プロセスを介して得られる。
多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物の新規のワクチン製剤は薬学上許容できる成分/賦形剤と共に多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含む。ワクチン組成物及びワクチン製剤におけるコンジュゲートはすべて同一のキャリアタンパク質を有する。本発明は5価のワクチン製剤を提供する。
本発明の新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤は5つの多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含む。多糖類は、Neisseria meningitidisに属するグラム陰性細菌の莢膜血清型A、C、Y、W及びXの多糖類から選択される。破傷風トキソイドはコンジュゲートすべてを調製することにおいてキャリアタンパク質として使用される。
莢膜多糖類はキャリアタンパク質とのコンジュゲートに好適な小さなサイズに分解されて高い抗原性及び高い免疫原性を持つコンジュゲートを得る。莢膜多糖類は、HPLC PWXL4000及び5000のカラムを連続して用いて分子サイズ分布について調べた場合、0.38±0.1Kdのサイズ範囲に分解される。莢膜多糖類は好ましくは0.38±0.06Kdのサイズ範囲にある。多糖類及びキャリアタンパク質は双方ともコンジュゲートの前に活性化される。ヒドラジンまたはアジピン酸ジヒドラジドをリンカーとして持つコンジュゲートが得られる。
サイズ指定して分解された莢膜多糖類(サイズ指定した莢膜多糖類)は破傷風トキソイドキャリアタンパク質とコンジュゲートされる。製剤は、1以上の血清型、さらに好ましくは血清型Xの多糖類について最適化されたカルバメート化学によって、及び1以上の血清型、好ましくは血清型A、C、Y及びWの多糖類のそれぞれについてシアニル化化学によって調製されるコンジュゲートを含有する。
薬学上許容できる賦形剤は、単独でのまた組み合わせでのアジュバント、緩衝液、保存剤、安定剤、界面活性剤であることができる。本発明の製剤は、保存剤の有無にかかわらず単回用量投薬計画または複数回用量投薬計画で液体である、または凍結乾燥される、または液体製剤と凍結乾燥製剤の組み合わせ(液体・凍結乾燥製剤)である。
本発明はまた、ワクチン組成物及びワクチン製剤にてコンジュゲートのそれぞれの最適な投与量も提供する。
本発明はまた、ワクチン組成物及びワクチン製剤にてコンジュゲートのそれぞれの最適な投与量も提供する。
従って、本発明は新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン組成物及びその製剤を提供する。さらに詳しくは、本発明はコンジュゲート化学を用いて製造される多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含むコンジュゲートワクチン組成物に関する。使用されるコンジュゲート化学には最適化されたカルバメート化学及びシアニル化化学の組み合わせが挙げられる。本発明の組成物は5価の混合ワクチンの製造に使用することができる。
本発明のコンジュゲートの製造に使用される多糖類は動物成分を含まない発酵プロセスを介して得られる。
本発明の新規のワクチン製剤は薬学上許容できる成分/賦形剤と共に多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含む。ワクチン組成物及びワクチン製剤におけるコンジュゲートはすべて同一のキャリアタンパク質を有する。本発明は5価のワクチン製剤を提供する。
本発明の新規の多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチンの組成物及び製剤は5つの個々の多糖類・タンパク質のコンジュゲートを含む。多糖類はグラム陰性細菌Neisseria meningitidisの血清型A、C、Y、W及びXの莢膜多糖類から選択される。コンジュゲートすべてを調製するのに使用されるキャリアタンパク質は破傷風トキソイド(TT)である。
莢膜多糖類をキャリアタンパク質とのコンジュゲートに好適な小さなサイズに分解して高い抗原性、高い免疫原性及び高い安定性を持つコンジュゲートを得る。莢膜多糖類は、HPLC PWXL4000及び5000のカラムを連続して用いて分子サイズ分布について調べた場合、0.38±0.1Kd、好ましくは0.38±0.06Kdのサイズ範囲に分解される。多糖類及びキャリアタンパク質はコンジュゲートの前に活性化される。多糖類とタンパク質の部分の間にリンカーアームを有するコンジュゲートが製造される。リンカーは多糖類もしくはキャリアタンパク質のいずれか、または多糖類及びキャリアタンパク質の双方に連結される。
本発明の新規の多価多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤は、それぞれ個々に破傷風トキソイドにコンジュゲートされた髄膜炎菌血清型A、C、Y、W、Xの多糖類(MenACYWX−TT)を含み、その際、血清型Xの多糖類は最適化されたカルバメート化学を用いて破傷風トキソイドにコンジュゲートされ、血清型A、C、Y及びWの多糖類は最適化されたシアニル化化学を用いてコンジュゲートされる。各前記コンジュゲートは0.3〜1.0の間のタンパク質の多糖類に対する比を有する。
本発明の新規の多価多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤は、アジュバントの有無にかかわらず、1以上の緩衝液及び1以上の薬学上許容できる賦形剤と混合されたそれぞれ個々に破傷風トキソイドにコンジュゲートされた髄膜炎菌血清型A、C、Y、W、Xの多糖類(MenACYWX−TT)を含む。
薬学上許容できる賦形剤は、単独でのまた組み合わせでのアジュバント、緩衝液、保存剤、安定剤、界面活性剤であることができる。本発明の製剤は、保存剤の有無にかかわらず単回用量投薬計画または複数回用量投薬計画で液体製剤である、または凍結乾燥製剤である、または液体・凍結乾燥の組み合わせである。本発明のワクチン製剤は高温で安定である。40%の遊離PSを最大目標と見なして、製剤は37±2℃の高温にて少なくとも21日間、25±2℃にて少なくとも3ヵ月間、及び5±3℃で少なくとも9ヵ月間安定性を示す。
最良の実施形態の1つでは、本発明の新規の5価液体多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤は、
を含む。
成分は室温にて0.5〜2時間撹拌することによって混合し、その後、バイアルに詰め、2〜8℃で保存する。
成分は室温にて0.5〜2時間撹拌することによって混合し、その後、バイアルに詰め、2〜8℃で保存する。
別の実施形態では、本発明の新規の5価液体多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤は、
を含む。
成分は室温にて0.5〜2時間撹拌することによって混合し、その後、バイアルに詰め、2〜8℃で保存する。
成分は室温にて0.5〜2時間撹拌することによって混合し、その後、バイアルに詰め、2〜8℃で保存する。
所望の浸透圧及び所望の安定性及び所望の免疫原性を提供するアジュバントを伴った製剤の最良の実施形態の1つは、
を含む。
成分は室温にて0.5〜2時間撹拌することによって混合し、その後、バイアルに詰め、2〜8℃で保存する。
成分は室温にて0.5〜2時間撹拌することによって混合し、その後、バイアルに詰め、2〜8℃で保存する。
所望の浸透圧及び所望の安定性及び所望の免疫原性を提供するアジュバントを含まない製剤の別の実施形態は、
を含む。
成分は室温にて0.5〜2時間撹拌することによって混合し、その後、バイアルに詰め、2〜8℃で保存する。
成分は室温にて0.5〜2時間撹拌することによって混合し、その後、バイアルに詰め、2〜8℃で保存する。
本発明の製剤はアジュバントの有無にかかわらず、浸透圧、安定性及び免疫原性について調べられている。遊離の多糖類の含量の上昇をチェックするために製剤は37±2℃の高温(VVM)に21日間曝露された。5価ワクチン製剤における遊離の多糖類の含量は、デオキシコール酸(DOC)沈殿及び濾過法によって分離され、パルス電流測定検出器を伴った高速アニオン交換クロマトグラフィー(HPAEC−PAD)法によって推定されている。
製剤は高温で安定である。40%の遊離のPSを最大目標と見なして、製剤は37±2℃の高温で少なくとも21日間、25±2℃で少なくとも3ヵ月間、5±3℃で少なくとも9ヵ月間安定性を示す。
本発明の製剤は液体形態または凍結乾燥形態またはそれらの組み合わせである。本発明はまた、ワクチン組成物及びワクチン製剤におけるコンジュゲートのそれぞれの最適な投与量も提供する。最適な用量は、アジュバントなしで、またはヒト用量当たりリン酸アルミニウムアジュバントの形態での500μgのAl+++を伴ってヒト用量当たり5〜10μgの血清型A及びXの多糖類及び5μgの血清型C、Y及びWの多糖類である。
実施例1:プラセボ液体製剤の調製
NaClを様々な緩衝液と混合して300±30mOsmol/kgの範囲での緩衝液の浸透圧を達成した。以下の表1のように製剤の浸透圧濃度を知るためにリン酸アルミニウムを様々な緩衝液及びNaClと共に混合することによって髄膜炎菌血清型(有効抗原)を含まないプラセボ製剤が調製されている:
上記製剤(プラセボ)は浸透圧及びpHについて分析されてNaClの好適な濃度を決定し、最終製剤における所望の浸透圧を達成している。製剤の浸透圧は表2で提供されている。
表2は、表1の製剤の浸透圧が240〜330mOsmol/kgの予想された限界よりも高いことを示唆しているということは、浸透圧を下げるためにNaClの濃度を下げることを示している。NaClのモル濃度を下げて製剤の所望の浸透圧を達成している。
NaClを様々な緩衝液と混合して300±30mOsmol/kgの範囲での緩衝液の浸透圧を達成した。以下の表1のように製剤の浸透圧濃度を知るためにリン酸アルミニウムを様々な緩衝液及びNaClと共に混合することによって髄膜炎菌血清型(有効抗原)を含まないプラセボ製剤が調製されている:
実施例2:NaCl濃度を下げることによるプラセボ液体製剤の調製
NaClの濃度を表1のNaCl濃度と比べて半分に、すなわち、100mMから50mMに低下させて以下の表2のような所望の範囲内での浸透圧指標を得ている。
50mMに近いNaClによって、製剤の浸透圧は、製剤の所望の浸透圧の範囲内である275mOsmol/kg〜282mOsmol/kgの範囲で実現した。
NaClの濃度を表1のNaCl濃度と比べて半分に、すなわち、100mMから50mMに低下させて以下の表2のような所望の範囲内での浸透圧指標を得ている。
実施例3:様々な賦形剤及び緩衝液の存在下で製品安定性を確立するための様々な5価髄膜炎菌液体製剤の調製
抗原をMES緩衝液、PBS緩衝液、Tris緩衝液、HEPES緩衝液のような緩衝液及びヒスチジンと混合することによって種々の5価髄膜炎菌ACYWX−TT製剤が調製されている。たとえば、グリシン、デキストロース、ヒスチジン、マンニトール及びポリソルベート80のような様々な賦形剤の組み合わせが、37±2℃の高い温度にさらした際の薬剤製品の安定性を評価するために試みられた。製剤は以下の表4のとおりに調製されている。
抗原をMES緩衝液、PBS緩衝液、Tris緩衝液、HEPES緩衝液のような緩衝液及びヒスチジンと混合することによって種々の5価髄膜炎菌ACYWX−TT製剤が調製されている。たとえば、グリシン、デキストロース、ヒスチジン、マンニトール及びポリソルベート80のような様々な賦形剤の組み合わせが、37±2℃の高い温度にさらした際の薬剤製品の安定性を評価するために試みられた。製剤は以下の表4のとおりに調製されている。
上記製剤を37±2℃の温度に14日間さらし、製品の安定性特性における緩衝液及び賦形剤の影響を評価した。髄膜炎菌コンジュゲート製剤について安定性を示すパラメーターは遊離PSの経時的な生成である。7日目及び14日目に試料を回収し、全PS及び遊離PSの%についてHPAEC−PAD(Dionex)法によって分析した。結果は以下の表5及び表6のように経時的に生成された遊離の多糖類についてまとめられている。
実施例4:リン酸アルミニウムを含まない様々な5価髄膜炎菌ACYWX−TT液体製剤の調製
リン酸アルミニウムを添加しないで5価髄膜炎菌製剤を調製している。製剤はすべてPBSにて調製した。以下のマトリクスを用いて様々な製剤を調製した。
上記製剤を浸透圧及びpHについて分析し、製剤の基本的な特徴を確認している。
上記の結果は、所望の浸透圧とpHの値に見合っている。
リン酸アルミニウムを添加しないで5価髄膜炎菌製剤を調製している。製剤はすべてPBSにて調製した。以下のマトリクスを用いて様々な製剤を調製した。
実施例5:高い用量のMenA及びMenXを伴った5価髄膜炎菌ACYWX−TT液体製剤の調製
5μg/0.5mLの用量でMenC、MenY、MenWの用量を保ちながら、血清型MenA及びMenXについて10μg/0.5mLの高い用量で製剤を調製した。
上記製剤を多糖類の含量、遊離の多糖類の%、浸透圧及びpHについて分析し、製剤の基本的な特徴を確認した。
5μg/0.5mLの用量でMenC、MenY、MenWの用量を保ちながら、血清型MenA及びMenXについて10μg/0.5mLの高い用量で製剤を調製した。
実施例6:様々な賦形剤及び緩衝液の存在下で製品の安定性を確立するための様々な凍結乾燥5価髄膜炎菌製剤の調製
抗原をMES緩衝液及びPBS緩衝液のような緩衝液と混合することによって種々の5価髄膜炎菌ACYWX−TT製剤を調製した。室温でのpH、浸透圧及び水分含量を評価し、凍結乾燥後の所望の水分含量を達成するために、たとえばスクロース、マルトース、アルギニン、ラクトース、ソルビトール、ヒスチジン、グリシンのような種々の賦形剤の組み合わせを試みた。
抗原をMES緩衝液及びPBS緩衝液のような緩衝液と混合することによって種々の5価髄膜炎菌ACYWX−TT製剤を調製した。室温でのpH、浸透圧及び水分含量を評価し、凍結乾燥後の所望の水分含量を達成するために、たとえばスクロース、マルトース、アルギニン、ラクトース、ソルビトール、ヒスチジン、グリシンのような種々の賦形剤の組み合わせを試みた。
所望の浸透圧及びpHは賦形剤(単独または組み合わせでの)の様々な組み合わせと共に10mMのリン酸ナトリウム緩衝液で達成されたが、その際、凍結乾燥後の水分含量は3%以下であり、ケーキの質は申し分ない(表12)。
実施例7:液体・凍結乾燥複合製剤
液体・凍結乾燥製剤では、凍結乾燥(lyo)部分は、MenA−TTコンジュゲート、MenC−TTコンジュゲートを単独で、または可変の組み合わせで、単独もしくは可変の組み合わせでのスクロース、マルトース、アルギニン、ラクトース、ソルビトール、ヒスチジン、グリシンから選択される賦形剤と共に含有する。希釈剤は、MenC−TT、MenY−TT、MenX−TT、MenW−TTを単独でまたは可変の組み合わせで含有する水、5〜20mMのリン酸で緩衝化した生理食塩水、500〜1500μgのA+++/mLとしてのリン酸アルミニウムから選択される。
実施例8:凍結乾燥サイクル(非限定例)
凍結、一次乾燥及び二次乾燥を介して5価製剤を凍結乾燥している。凍結乾燥サイクルを表13に示す。凍結乾燥サイクル−3が3%未満の水分含量と良質のケーキの安定な製剤が得られる最良の方式である。
凍結、一次乾燥及び二次乾燥を介して5価製剤を凍結乾燥している。凍結乾燥サイクルを表13に示す。凍結乾燥サイクル−3が3%未満の水分含量と良質のケーキの安定な製剤が得られる最良の方式である。
実施例9:ストレス条件、加速条件及びリアルタイム条件での5価髄膜炎菌ACYWX−TT液体製剤の安定性
ある期間にわたって種々の温度条件にさらした場合での5価髄膜炎菌ACYWX−TTコンジュゲートワクチンの安定性を調べる。特定の期間にわたる温度の影響を得るために試験を実施した。安定性試験は、3つの温度パラメーター、すなわち、5±3℃でのリアルタイム保存条件、25±2℃での高温、及び37±2℃でのストレス条件を用いて実施した。結果は図1〜3(図1a〜1e、2a〜2e、3a〜3e)に述べられている。
ある期間にわたって種々の温度条件にさらした場合での5価髄膜炎菌ACYWX−TTコンジュゲートワクチンの安定性を調べる。特定の期間にわたる温度の影響を得るために試験を実施した。安定性試験は、3つの温度パラメーター、すなわち、5±3℃でのリアルタイム保存条件、25±2℃での高温、及び37±2℃でのストレス条件を用いて実施した。結果は図1〜3(図1a〜1e、2a〜2e、3a〜3e)に述べられている。
a.5±3℃でのリアルタイム保存条件―推奨される保存温度(リアルタイム安定性試験)(図1a〜1e)。
b.25±2℃での高温―保存のために推奨されるものより高い(加速した安定性試験)(図2a〜2e)。
c.37±2℃でのストレス条件―極端な条件(ストレス安定性試験)(図3a〜3e)。
b.25±2℃での高温―保存のために推奨されるものより高い(加速した安定性試験)(図2a〜2e)。
c.37±2℃でのストレス条件―極端な条件(ストレス安定性試験)(図3a〜3e)。
試料をストレス条件下で21日の期間、加速条件下で6ヵ月間、及びリアルタイム保存条件で3年間(進行中の試験、9ヵ月までデータは利用可)、保存した。試料を計画通りに回収し、経時的な遊離PSの%含量のパラメーターを示す最良の安定性について分析した。
実施例10:液体5価髄膜炎菌ACYWX−TTコンジュゲートワクチン製剤によるマウス及びウサギの免疫
8匹のメスのマウス及び4匹のメスのウサギ(6〜9週齢)の群を、新規液体のアジュバント添加したまたは添加しない5価髄膜炎菌ACYWX−TTコンジュゲートワクチン、バルクコンジュゲートを含まない溶媒対照、またはライセンスを受けたACYWコンジュゲートワクチンのいずれかによって2週間間隔で免疫した。新規の液体5価髄膜炎菌ACYWX−TTコンジュゲートワクチンも製剤の安定性の評価のために37℃で7日間(VVM7)保存した後、マウスのモデルで使用した。免疫はすべてマウスでは皮下経路及びウサギでは筋肉内経路を介したワクチンの投与によって実施されている。各マウスは血清型当たり1μgの多糖類に等しい製剤で免疫したのに対して、各ウサギは意図される完全なヒト用量で免疫した。血清型に特異的な抗髄膜炎菌IgG抗体の力価は、間接ELISA、及び2回目と3回目の投与の後回収した血清における血清殺菌アッセイによる機能的抗体価によって推定した。新規の液体5価髄膜炎菌ACYWX−TTコンジュゲートワクチンについての2回目及び3回目の投与後の結果は、マウス及びウサギ双方のモデルにおける溶媒対照と比べて有意に高い免疫原性力価を、及び双方の動物モデルにおけるライセンスを受けたワクチンIgG及びSBAの力価に対して劣らない力価を示す(図4a〜4e、5a〜5e、6a〜6e)。さらに、新規の液体5価髄膜炎菌ACYWX−TTコンジュゲートワクチンは37℃に7日間されされたとき、免疫原性力価で低下を示さなかった(図6a〜6e)。
8匹のメスのマウス及び4匹のメスのウサギ(6〜9週齢)の群を、新規液体のアジュバント添加したまたは添加しない5価髄膜炎菌ACYWX−TTコンジュゲートワクチン、バルクコンジュゲートを含まない溶媒対照、またはライセンスを受けたACYWコンジュゲートワクチンのいずれかによって2週間間隔で免疫した。新規の液体5価髄膜炎菌ACYWX−TTコンジュゲートワクチンも製剤の安定性の評価のために37℃で7日間(VVM7)保存した後、マウスのモデルで使用した。免疫はすべてマウスでは皮下経路及びウサギでは筋肉内経路を介したワクチンの投与によって実施されている。各マウスは血清型当たり1μgの多糖類に等しい製剤で免疫したのに対して、各ウサギは意図される完全なヒト用量で免疫した。血清型に特異的な抗髄膜炎菌IgG抗体の力価は、間接ELISA、及び2回目と3回目の投与の後回収した血清における血清殺菌アッセイによる機能的抗体価によって推定した。新規の液体5価髄膜炎菌ACYWX−TTコンジュゲートワクチンについての2回目及び3回目の投与後の結果は、マウス及びウサギ双方のモデルにおける溶媒対照と比べて有意に高い免疫原性力価を、及び双方の動物モデルにおけるライセンスを受けたワクチンIgG及びSBAの力価に対して劣らない力価を示す(図4a〜4e、5a〜5e、6a〜6e)。さらに、新規の液体5価髄膜炎菌ACYWX−TTコンジュゲートワクチンは37℃に7日間されされたとき、免疫原性力価で低下を示さなかった(図6a〜6e)。
実施例11:間接ELISAによる抗髄膜炎菌多糖類血清型に特異的なIgG力価の測定
PBS緩衝液、pH7.3±0.1における5μg/mLのPSとm−HSAの混合物をウェル当たり100μL加えることによって96穴プレート(Nunc Maxisorp)を血清型特異的な標準の髄膜炎菌PSでコーティングした。プレートを4℃で一晩インキュベートし、次いでPBS緩衝液(PBSにおける0.1%のBrij35、pH7.3±0.1)で3回洗浄し、PBS緩衝液(PBSにおける0.1%のBrij35、pH7.3±0.1)における5%FBS溶液のウェル当たり200μLで37℃にて1時間ブロックした。各インキュベート工程にはPBS緩衝液による3回の洗浄が続いた。参照及び試験の血清試料をPBS緩衝液(PBSにおける0.1%のBrij35、5%FBS、pH7.3±0.1)で希釈し、コーティングし、ブロックしたプレートに移し(200μL)、2倍連続希釈した後、4℃で一晩インキュベートした。次いで、任意で希釈したペルオキシダーゼを結合した抗マウス/ウサギIgGをウェル当たり100μL加え、25℃で1時間放置した。発色のために基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン−H2O2をウェル当たり100μL加えた。25℃での発色の10分後、50μLの2MのH2SO4を加えることによって反応を止め、マイクロプレートリーダーにて450nmでODを読み取った。Combistatソフトウェアを用いて、各製剤についての抗MenC多糖類IgG濃度(ELISAの単位/mLという点で)を評価し、幾何平均濃度(IgG GMC)を図4〜6(図4a〜e、5a〜e、6a〜e)にて代表的な試験及び製剤の比較について示した。
PBS緩衝液、pH7.3±0.1における5μg/mLのPSとm−HSAの混合物をウェル当たり100μL加えることによって96穴プレート(Nunc Maxisorp)を血清型特異的な標準の髄膜炎菌PSでコーティングした。プレートを4℃で一晩インキュベートし、次いでPBS緩衝液(PBSにおける0.1%のBrij35、pH7.3±0.1)で3回洗浄し、PBS緩衝液(PBSにおける0.1%のBrij35、pH7.3±0.1)における5%FBS溶液のウェル当たり200μLで37℃にて1時間ブロックした。各インキュベート工程にはPBS緩衝液による3回の洗浄が続いた。参照及び試験の血清試料をPBS緩衝液(PBSにおける0.1%のBrij35、5%FBS、pH7.3±0.1)で希釈し、コーティングし、ブロックしたプレートに移し(200μL)、2倍連続希釈した後、4℃で一晩インキュベートした。次いで、任意で希釈したペルオキシダーゼを結合した抗マウス/ウサギIgGをウェル当たり100μL加え、25℃で1時間放置した。発色のために基質である3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン−H2O2をウェル当たり100μL加えた。25℃での発色の10分後、50μLの2MのH2SO4を加えることによって反応を止め、マイクロプレートリーダーにて450nmでODを読み取った。Combistatソフトウェアを用いて、各製剤についての抗MenC多糖類IgG濃度(ELISAの単位/mLという点で)を評価し、幾何平均濃度(IgG GMC)を図4〜6(図4a〜e、5a〜e、6a〜e)にて代表的な試験及び製剤の比較について示した。
実施例12:血清型特異的な機能的抗体価の測定についての血清殺菌アッセイ(SBA)
N. meningitidisの血清型特異的な細菌ストックをヒツジ血液寒天プレートにて37℃で5%CO2と共に一晩増殖させた。単離したコロニーを採取し、別のヒツジ血液寒天プレートの表面にて37℃で5%CO2と共にインキュベートした。第2のプレートからの増殖した細菌を各血清型について最適化したSBA緩衝液に浮遊させた。浮遊液の光学密度(OD650)を作業細菌ストックで調整してアッセイの終了時でスポット当たり60〜250のコロニー総数を達成した。品質管理(QC)血清及び試験血清の試料を56℃で30分間、熱非働化した。マイクロウェルプレートにて、2倍連続希釈した試験血清20μLを作業希釈での10μLの細菌及び10μLの幼若ウサギの補体(Pel−Freez)と共に混合した。陰性対照については、別々のウェルにて細菌を試験血清なしで活性がある幼若ウサギ補体と共に、及び試験血清と熱非働化幼若ウサギ補体と共にインキュベートした。アッセイプレートを軽くたたくことによってウェルの内容物を混合し、37℃で5%CO2と共に1時間プレートをインキュベートした。平板画線法によって各ウェルからの10μLの試料を血液寒天プレートに播いた。血液寒天プレートを37℃で5%CO2と共に一晩インキュベートし、コロニーを数えた。各活性がある補体対照と比べた、反応混合物との細菌のインキュベートの後のコロニー形成単位で≧50%の低下を示す最高の血清希釈をSBA力価と見なした。代表的な試験及び製剤の比較についての結果を図4〜6(図4a〜e、5a〜e、6a〜e)に提示する。
N. meningitidisの血清型特異的な細菌ストックをヒツジ血液寒天プレートにて37℃で5%CO2と共に一晩増殖させた。単離したコロニーを採取し、別のヒツジ血液寒天プレートの表面にて37℃で5%CO2と共にインキュベートした。第2のプレートからの増殖した細菌を各血清型について最適化したSBA緩衝液に浮遊させた。浮遊液の光学密度(OD650)を作業細菌ストックで調整してアッセイの終了時でスポット当たり60〜250のコロニー総数を達成した。品質管理(QC)血清及び試験血清の試料を56℃で30分間、熱非働化した。マイクロウェルプレートにて、2倍連続希釈した試験血清20μLを作業希釈での10μLの細菌及び10μLの幼若ウサギの補体(Pel−Freez)と共に混合した。陰性対照については、別々のウェルにて細菌を試験血清なしで活性がある幼若ウサギ補体と共に、及び試験血清と熱非働化幼若ウサギ補体と共にインキュベートした。アッセイプレートを軽くたたくことによってウェルの内容物を混合し、37℃で5%CO2と共に1時間プレートをインキュベートした。平板画線法によって各ウェルからの10μLの試料を血液寒天プレートに播いた。血液寒天プレートを37℃で5%CO2と共に一晩インキュベートし、コロニーを数えた。各活性がある補体対照と比べた、反応混合物との細菌のインキュベートの後のコロニー形成単位で≧50%の低下を示す最高の血清希釈をSBA力価と見なした。代表的な試験及び製剤の比較についての結果を図4〜6(図4a〜e、5a〜e、6a〜e)に提示する。
Claims (33)
- 新規の多価多糖類・タンパク質のコンジュゲートワクチン製剤であって、
前記製剤は、Neisseria meningitidis(髄膜炎菌)血清型A、C、Y、W及びXの莢膜多糖類(Men A、C、Y、W、X)であって、各前記多糖類が別々に破傷風トキソイド(TT)キャリアタンパク質にコンジュゲートされてMenA、C、Y、W、X−TTコンジュゲートを得てなる、液体のまたは凍結乾燥のまたは液体・凍結乾燥複合の5価の製剤であり、前記製剤は、薬学上許容できる成分/賦形剤と一緒にアジュバントの有無にかかわらず1以上の緩衝液を伴い、前記製剤は所望の浸透圧、所望のpH、高い安定性及び所望の免疫原性を提供する、新規のワクチン製剤。 - 前記液体ワクチン製剤が、以下の成分:
- 前記液体ワクチン製剤が、以下の成分:
- 前記液体製剤が、以下の成分:
- 前記液体製剤が、以下の成分:
- 前記凍結乾燥製剤が、以下の成分:
- 前記液体・凍結乾燥複合製剤が、以下の成分:
- 前記MenA、C、Y、W、X−TTコンジュゲートがコンジュゲート化学の最適化された組み合わせを用いて得られる請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記少なくとも1つのコンジュゲートを得るためのコンジュゲート化学がカルバメート化学である請求項8に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記カルバメート化学を用いた前記少なくとも1つのコンジュゲートが好ましくはMenX−TTコンジュゲートである請求項9に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記少なくとも1つのコンジュゲートを得るためのコンジュゲート化学がシアニル化化学である請求項8に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記シアニル化化学を用いた前記少なくとも1つのコンジュゲートが好ましくは、前記MenA、C、Y、W−TTコンジュゲートである請求項11に記載の新規ワクチン製剤。
- HPLC PWXL4000及び5000のカラムを連続して用いて分子サイズ分布を調べる場合、各前記莢膜多糖類が0.38±0.1Kdのサイズ範囲、好ましくは0.38±0.06Kdのサイズ範囲で分解されて高い抗原性、高い免疫原性及び高い安定性を持つコンジュゲートを得る請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記多糖類と前記キャリアタンパク質との間でリンカーアームを有する前記コンジュゲートが製造され、リンカーが前記多糖類または前記キャリアタンパク質のいずれか、または前記多糖類とキャリアタンパク質の双方に連結される請求項1及び8に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記リンカーがアジピン酸ジヒドラジドまたはヒドラジンから選択される請求項14に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記MenX−TTコンジュゲートがヒドラジンリンカーを有し、且つ前記MenA、C、Y、W−TTコンジュゲートがアジピン酸ジヒドラジドリンカーを有する請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 各前記コンジュゲートが0.3〜1.0の間のキャリアタンパク質の多糖類に対する比を有する請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記薬学上許容できる賦形剤が、単独でまたは組み合わせでアジュバント、緩衝液、保存剤、安定剤、界面活性剤から選択される請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記賦形剤が、単独でまたは可変の組み合わせでスクロース、マルトース、アルギニン、ラクトース、ソルビトール、ヒスチジン、グリシンから選択される請求項6に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記希釈剤が、単独でまたは可変の組み合わせで、水、5〜20mMのリン酸緩衝化生理食塩水、500〜1500μgのAl+++/mLとしてのリン酸アルミニウムから選択される請求項6に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記凍結乾燥(lyo)部分が、単独でまたは可変の組み合わせで、MenA−TTコンジュゲート、MenC−TTコンジュゲートを含有する請求項7に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記賦形剤が、単独でまたは可変の組み合わせで、スクロース、マルトース、アルギニン、ラクトース、ソルビトール、ヒスチジン、グリシンから選択される請求項7に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記希釈剤が、単独でまたは可変の組み合わせでMenC−TT、MenY−TT、MenX−TT、MenW−TTを含有する水、5〜20mMのリン酸緩衝化生理食塩水、500〜1500μgのAl+++/mLとしてのリン酸アルミニウムから選択される請求項7に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記製剤が、保存剤の有無にかかわらず、単回用量または複数回用量の投薬計画を伴う液体製剤または凍結乾燥製剤またはそれらの複合である請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 血清型A、C、Y、W及びXの最適なヒト用量が、用量当たり血清型当たり2〜10μgの間の多糖類にわたり、好ましくは血清型A及びXの各5〜10μgの多糖類、ならびに血清型C、Y及びWの各5μgの多糖類にわたる請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 製剤の前記所望の浸透圧が240〜330mOsmol/kgである請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 製剤の前記所望のpHが6.5〜7.5である請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 凍結乾燥製剤または液体・凍結乾燥製剤の前記凍結乾燥部分が3%以下の水分含量を有する請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記ワクチン製剤が37±2℃の高温で少なくとも21日間、且つ25±2℃で少なくとも3ヵ月間安定であり、40%未満の遊離の多糖類を示す請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記ワクチン製剤が高い抗原性及び高い免疫原性を示す請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記ワクチン製剤が、37±2℃での7日間の曝露の後でさえ、リアルタイム保存条件で保存された製剤と比べて同等に免疫原性である請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記製剤が好ましくは、保存剤の有無にかかわらず、単回用量または複数回用量の投薬計画を伴った液体の5価髄膜炎菌コンジュゲートワクチン製剤である請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
- 前記製剤及び前記組成物が、液体または凍結乾燥または液体・凍結乾燥の5価髄膜炎菌ACYWX−TT混合ワクチンの製造で使用することができる請求項1に記載の新規ワクチン製剤。
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