BR112019027182A2 - nova composição de vacina conjugada de proteína - polissacarídeo multivalente e formulação da mesma - Google Patents

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Abstract

Formulação de vacina conjugada de proteína - polissacarídeo multivalente novo. A formulação é uma formulação pentavalente líquida ou liofilizada ou uma combinação líquido-liofilizado de polissacarídeos capsulares de Neisseria meningitidis do sorogrupo A, C, Y, W e X (Men A, C, Y, W, X), cada referido polissacarídeo é conjugado separadamente à proteína carreadora do toxóide tetânico (TT) para obter conjugados Men A, C, Y, W, X ?TT, com um ou mais tampões e com ou sem um adjuvante junto com componentes/excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Description

NOVA COMPOSIÇÃO DE VACINA CONJUGADA DE PROTEÍNA - POLISSACARÍDEO MULTIVALENTE E FORMULAÇÃO DA MESMA CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se à nova composição de vacina conjugada de proteína - polissacarídeo. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma formulação de vacina conjungada pentavalente de polissacarídeos capsulares (Men A, C, Y, W, X) do sorogrupo A, C, Y, W e X de Neisseria meningitidis, em que o referido polissacarídeo é conjugado separadamente à proteína carreadora do toxoide tetânico (TT) junto com componentes/excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A formulação de vacina conjugada pentavalente da presente invenção está na forma líquida ou liofilizada ou em uma combinação das mesmas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A fabricação e composição de vacinas são complexas e rigorosamente regulamentadas para garantir a segurança dos indivíduos e maximizar a eficácia e a estabilidade. Todas as vacinas contêm um componente ativo que gera a resposta imunoprotetora. As vacinas também contêm componentes adicionais farmaceuticamente aceitáveis para aprimorar a estabilidade da formulação e/ou imunogenicidade para uma forte resposta imunoprotetora.
[003] A Organização Mundial da Saúde recomenda que os países com uma taxa moderada ou alta de doença ou com surtos frequentes de uma doença evitável por vacina sejam vacinados rotineiramente. Em países com baixo risco de doença, eles recomendam que os grupos de alto risco sejam imunizados.
[004] A doença meningocócica é uma doença aguda potencialmente grave causada pela bactéria Neisseria meningitidis. A N. meningitidis (Meningococcus) é uma bactéria aeróbica gram-negativa que foi classificada sorologicamente em 13 principais sorogrupos A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y e Z. O sistema de agrupamento se baseia nos polissacarídeos capsulares dos organismos.
[005] Foi mencionado no site oficial da OMS que a N. meningitidis é uma das causas mais comuns de meningite bacteriana no mundo e é a única bactéria capaz de gerar grandes epidemias de meningite. Foram relatadas grandes epidemias com taxas de incidência de até 1000 casos por 100.000 habitantes, particularmente na África Subsaariana.
[006] A N. meningitidis é transmitida por aerossol ou contato direto com secreções respiratórias de pacientes ou portadores humanos saudáveis. A doença endêmica ocorre principalmente em crianças e adolescentes, com maiores taxas de incidência em crianças de 3 a 12 meses, enquanto nas epidemias podem estar mais envolvidos crianças mais velhas e adultos jovens. No entanto, a rápida progressão da doença meningocócica frequentemente resulta em morte dentro de 1 a 2 dias após o surgimento, as infecções por N. meningitidis podem ser prevenidas pela vacinação.
[007] A imunização é a única abordagem racional para controlar a doença da meningite. As vacinas mais eficazes para N. meningitidis são as vacinas conjugadas de polissacarídeo-proteína que são formadas pela ligação covalente da proteína ativada ao polissacarídeo ativo. O polissacarídeo sofre alguma modificação química que é conhecida como processo de "ativação", antes da anexação e a portadora pois a maioria dos polissacarídeos nativos não podem ser quimicamente eficientemente ligados a uma proteína portadora sem ativação.
[008] Existem muitas reações de conjugação que foram empregadas para ligar covalentemente polissacarídeos a proteínas. Três dos métodos mais comumente empregados incluem: 1) aminação redutora, em que o grupo aldeído ou cetona em um componente da reação reage com o grupo amina ou hidrazida no outro componente, e a ligação dupla C=N assim formada é subsequentemente reduzida à ligação simples C-N por um agente de redução; 2) conjugação de cianilação, em que o polissacarídeo é ativado pelo brometo de cianogênio (CNBr) ou pelo tetrafluoroborato de 1-ciano-4- dimetilaminapiridínio (CDAP) para introduzir um grupo cianato no grupo hidroxila, que forma uma ligação covalente ao grupo amina ou hidrazida após adição do componente proteico; e 3) uma reação de carbodiimida, em que a carbodiimida ativa o grupo carboxila em um componente da reação de conjugação, e o grupo carboxila ativado reage com o grupo amina ou hidrazida no outro componente. Essas reações também são frequentemente empregadas para ativar os componentes do conjugado antes da reação de conjugação.
[009] De acordo com uma publicação, historicamente o Sorogrupo A (MenA) tem sido a causa mais comum de doenças epidêmicas na África Subsaariana. Os sorogrupos B e C são responsáveis pela maioria dos casos nos países desenvolvidos, com os casos restantes causados pelos sorogrupos W135 e Y. Os casos do sorogrupo C foram observados recentemente na África subsaariana, onde o sorogrupo não era tão prevalecente historicamente. O sorogrupo X também surgiu em alguns países no passado recente. De acordo com Xie O et al., “Emergence of serogroup X meningococcal disease in Africa: need for a vaccine”, Vaccine. 12 de junho de 2013; 31 (27): 2852-6, os meningococos do sorogrupo X já foram anteriormente considerados uma causa rara de meningite esporádica, mas durante os anos de 2006 a 2010 ocorreram surtos de meningite do sorogrupo X no Níger, Uganda, Quênia, Togo e Burquina Faso, este último com pelo menos 1300 casos de meningite do sorogrupo X entre os 6732 casos relatados.
[010] De acordo com outra publicação do NCBI, no Togo, durante os anos de 2006 a 2009, os meningococos do sorogrupo X representaram 16% dos 702 casos confirmados de meningite bacteriana. O distrito de Kozah sofreu um surto de meningococos do sorogrupo X em março de 2007, com uma incidência cumulativa sazonal de meningococos do sorogrupo X de 33/100.000. No Burquina Faso, durante o período de 2007 a 2010, os meningococos do sorogrupo X representaram 7% dos 778 casos confirmados de meningite bacteriana, com um aumento de 2009 a 2010 (de 4% a 35% de todos os casos confirmados, respectivamente). Em 2010 ocorreram epidemias de meningococos do sorogrupo X nas regiões norte e central do Burquina Faso; a maior incidência cumulativa distrital de meningococos do sorogrupo X foi estimada em 130/100.000 durante o período de março a abril.
[011] Com base nos fatos acima, uma vacina conjugada com polissacarídeo meningocócico ACYWX-proteína pentavalente poderia oferecer uma cobertura mais ampla contra a doença meningocócica, exceto o sorogrupo B, para o qual uma vacina conjugada é uma possibilidade remota devido à semelhança estrutural do polissacarídeo capsular MenB com as moléculas encontradas nas células neuronais humanas. Atualmente, várias vacinas monovalentes ou multivalentes, incluindo conjugados de polissacarídeos do sorogrupo A, C, Y e W135, são licenciadas para venda no mercado. O estado da técnica existente divulga vacinas para a prevenção de vários sorogrupos, incluindo N. meningitidis, sorogrupo A, B, C, W e Y, como o pedido de patente dos EUA n. US2015/0044253, que divulga a composição imunogênica compreendendo um fragmento de sacarídeo obtido do sorotipo B de Haemophilus influenzae (Hib), Neisseria meningitidis serogrupo A, B, C, W, Y conjugado com uma proteína transportadora. No entanto, no documento US2015/0044253, o ligante de carbamato está ligado diretamente a grupos amina da proteína carreadora, o que resulta em baixa eficiência de conjugação.
[012] O pedido de patente indiano 281/MUM/2012 divulga uma composição conjugada e liofilizada de proteína-polissacarídeo N. meningitidis pentavalente. No entanto, o aplicativo é restrito a cepas específicas de Men X e utiliza várias proteínas carreadoras.
[013] O pedido PCT/EP2006/006188 ensina uma composição imunogênica composta por polisacarídeos capsulares meningocócicos de pelo menos um dentre os grupos A, C, W135 e Y conjugados a uma proteína carreadora, no entanto, isso não ensina o conjugado de Men X na composição imunogênica.
[014] As vacinas conjugadas meningocócicas multivalentes disponíveis são de custo mais alto e possuem formulações complexas. Nenhum dos estados da técnica anteriores ensina a formulação de conjugado polissacarídeo-proteína de N. meningitidis com conjugados Men X na forma líquida ou liofilizada ou uma combinação dos mesmos utilizando uma combinação otimizada da química de conjugação.
[015] Há uma necessidade urgente de vacina meningocócica conjugada que tem maior homogeneidade, maior imunogenicidade, menor custo e que é simples de formular e administrar.
OBJETIVO DA INVENÇÃO
[016] A fim de evitar os inconvenientes no estado da técnica existente, o principal objetivo da presente invenção é fornecer uma nova composição de vacina conjugada polissacarídeo - proteína.
[017] Um outro objetivo da presente invenção é fornecer uma nova composição de vacina conjugada polissacarídeo - proteína, em que os conjugados são produzidos usando a combinação otimizada da química de conjugação.
[018] Ainda, outro objetivo da presente invenção é fornecer nova composição de vacina conjugada polissacarídeo - proteína, em que a referida composição é capaz de ser usada na produção de uma vacina em combinção com ACYWX-TT meningocócico pentavalente contendo polissacarídeos do sorogrupo ACYWX, cada um conjugado ao toxoide tetânico como proteína carreadora.
[019] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer uma nova formulação de vacina da composição de vacina conjugada polissacarídeo- proteína compreendendo conjugados polissacarídeo-proteína juntamente com componentes/excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[020] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer uma nova formulação de vacina à composição de vacina conjugada de polissacarídeo - proteína compreendendo conjugados de proteína - polissacarídeo ACYWX-TT meningocócico juntamente com componentes/excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[021] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer nova formulação de vacina conjugada de polissacarídeo - proteína, em que a referida formulação ACYWX-TT meningocócica pentavalente é uma formulação de vacina líquida ou liofilizada ou como uma combinação de porções liofilizadas e líquidas.
[022] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer nova composição de vacina conjugada de proteína carreadora do toxoide tetânico - polissacarídeo ACYWX meningocócico pentavalente e a formulação na qual a referida composição possui nova combinação de conjugados preparados usando químicas de conjugação aprimoradas.
[023] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer a dosagem ideal de cada um dos conjugados na composição e formulação da vacina.
[024] Ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer uma formulação de vacina pentavalente que seja estável a altas temperaturas e mostre alta imunogenicidade e antigenicidade.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[025] Adequadamente, a presente invenção fornece uma nova composição de vacina conjugada de polissacarídeo - proteína e formulação da mesma. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito a uma formulação de vacina conjugada compreendendo conjugados de proteína - polissacarídeo produzidos usando química de conjugação. A química de conjugação usada inclui um ou mais dos compostos químicos de carbamato e/ou cianilação, mas não se limitando a eles. A formulação da presente invenção é capaz de ser utilizada na produção de vacinas com combinação meningocócica pentavalente.
[026] Os polissacarídeos utilizados para a preparação de conjugados da presente invenção são obtidos através de um processo de fermentação otimizado.
[027] A nova formulação de vacina da composição de vacina conjugada polissacarídeo-proteína compreende conjugados polissacarídeo-proteína juntamente com componentes/excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Todos os conjugados na composição e formulação da vacina têm a mesma proteína carreadora. A presente invenção fornece uma formulação de vacina pentavalente.
[028] A uma nova formulação de vacina conjugada polissacarídeo-proteína da presente invenção compreende cinco conjugados polissacarídeo-proteína. O polissacarídeo é selecionado a partir de bactérias gram-negativas, pertencentes aos polissacarídeos do sorogrupo A, C, Y, W e X capsulares a Neisseria meningitidis. O toxoide tetânico é usado como proteína carreadora na preparação de todos os conjugados.
[029] O polissacarídeo capsular é degradado para tamanhos menores adequados para conjugação com proteína carreadora para obter conjugados com alta antigenicidade e alta imunogenicidade. O polissacarídeo capsular é degradado na faixa de tamanho de 0,38 ± 0,1 Kd quando testado para distribuição de tamanho molecular usando colunas HPLC PWXL4000 e 5000 em série. Os polissacarídeos capsulares estão preferencialmente na faixa de tamanho de 0,38 ± 0,06 Kd. Tanto o polissacarídeo quanto a proteína carreadora são ativados antes da conjugação. Os conjugados são obtidos com hidrazina ou dihidrazida do ácido adípico como ligante.
[030] O polissacarídeo capsular degradado dimensionado (polissacarídeo capsular dimensionado) é conjugado com a proteína carreadora do toxoide tetânico. A formulação contém os conjugados preparados por química de carbamato otimizada para um ou mais sorogrupos, mais preferencialmente para polissacarídeo do sorogrupo X e química de cianilação para um ou mais sorogrupos, preferencialmente para cada um dos polissacarídeos do serogrupo A, C, Y e W.
[031] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser adjuvante, tampão, conservante, estabilizador, tensoativo, isoladamente ou em combinação. A formulação da presente invenção é líquida ou liofilizada ou uma combinação de formulação de líquido e liofilizado (formulação líquido-lio) com regime de mono- ou multidose com ou sem conservante.
[032] A presente invenção também fornece a dosagem ideal de cada um dos conjugados na composição e formulação da vacina.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Fig. 1 a-e representa Estudos de Estabilidade em Tempo Real sobre a Vacina Conjugada ACYWX-TT Meningogócica Pentavalente a 5 ± 3°C. A Figura 2 a-e representa os Estudos de Estabilidade Acelerada em Vacina Conjugada ACYWX-TT Meningocócica Pentavalente Líquida a 25 ± 2°C. Figura 3 a-e: Estudos de Estabilidade de Estresse em Vacina Conjugada ACYWX-TT Meningocócica Pentavalente Líquida a 37 ± 2°C. Fig. 4 a-e: representa os títulos de IgG e SBA de camundongo anti-
meningocócicos após a dose 2 contra a vacina conjugada ACYWX-TT meningocócica pentavalente líquida adjuvante e não-adjuvante em comparação à vacina conjugada ACYW licenciada e/ou controle de veículo. Fig. 5 a-e: representa os títulos de IgG e SBA de coelho anti-meningocócico após a dose 2, contra a vacina conjugada ACYWX-TT meningocócica pentavalente líquida adjuvante e não adjuvante em comparação à vacina ou controle de veículo conjugado ACYW licenciado. Figura 6 a-e: Títulos de IgG e SBA de camundongo anti-meningocócicos após a dose 3 contra a vacina conjugada ACYWX-TT meningocócica pentavalente líquida adjuvante e não-adjuvante em comparação à uma vacina pentavalente líquida com VVM7 adjuvante e vacina ou controle de veículo conjugado ACYW licenciado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO COM EXEMPLOS E ILUSTRAÇÕES NÃO LIMITANTES
[033] Adequadamente, a presente invenção fornece uma nova composição de vacina conjugada de polissacarídeo - proteína e formulação da mesma. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito a uma composição de vacina conjugada compreendendo conjugados de proteína - polissacarídeo produzidos usando química de conjugação. A química de conjugação usada inclui a combinação de compostos químicos de carbamato e/ou cianilação. A composição da presente invenção é capaz de ser utilizada na produção de uma vacina com combinação meningocócica pentavalente.
[034] Os polissacarídeos utilizados para a preparação de conjugados da presente invenção são obtidos através de um processo de fermentação livre de componentes de origem animal.
[035] A nova formulação de vacina da presente invenção compreende conjugados polissacarídeo-proteína juntamente com componentes/excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Todos os conjugados na composição e formulação da vacina têm a mesma proteína carreadora. A presente invenção fornece uma formulação de vacina pentavalente.
[036] A uma nova composição e formulação de vacina conjugada polissacarídeo-proteína da presente invenção compreende cinco conjugados polissacarídeo-proteína individuais. O polissacarídeo é selecionado a partir de bactérias gram-negativas dos polissacarídeos capsulares do sorogrupo A, C, Y, W e X de Neisseria meningitidis. A proteína carreadora usada para preparar de todos os conjugados é Toxoide Tetânico (TT).
[037] O polissacarídeo capsular é degradado para tamanhos menores adequados para conjugação com proteína carreadora para obter conjugados com alta antigenicidade, alta imunogenicidade e alta estabilidade. O polissacarídeo capsular é degradado na faixa de tamanho de 0,38 ± 0,1 Kd, preferencialmente 0.38 ± 0.06 Kd quando testado para distribuição de tamanho molecular usando colunas HPLC PWXL4000 e 5000 em série. O polissacarídeo e a proteína carreadora são ativados antes da conjugação. Os conjugados são produzidos com um braço ligante entre as frações de polissacarídeo e proteína. O ligante está ligado ao polissacarídeo ou à proteína carreadora ou ao polissacarídeo e à proteína.
[038] A nova formulação de vacina conjugada polissacarídeo-proteína multivalente da presente invenção compreende polissacarídeos dos sorogrupos A, C, Y, W, X meningocócicos, cada um conjugado individualmente ao toxoide tetânico (Men ACYWX-TT), em que o polissacarídeo X do serogrupo é conjugado ao toxoide tetânico usando química de carbamato otimizada e os polissacarídeos do sorogrupo A, C, Y e W são conjugados usando a química de cianilação otimizada. Cada conjugado referido possui a razão de proteína carreadora para polissacarídeo entre 0,3-1,0.
[039] A nova formulação de vacina conjugada de polissacarídeo-proteína multivalente da presente invenção compreende polissacarídeos dos sorogrupos A, C, Y, W, X meningocócicos, cada um conjugado individualmente ao toxoide tetânico (Men ACYWX-TT) misturado com um ou mais tampões e um ou mais excipientes meningocócicos aceitáveis, com ou sem adjuvante.
[040] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis podem ser adjuvante, tampão, conservante, estabilizador, tensoativo, isoladamente ou em combinação. A formulação da presente invenção é uma formulação líquida ou liofilizada ou uma combinação de líquido-lio com regime de mono- ou multidose com ou sem conservante. A formulação de vacina da presente invenção é estável a altas temperaturas. Considerando 40% de PS livre como o objetivo máximo, a formulação mostra estabilidade na alta temperatura de 37±2 °C por pelo menos 21 dias, a 25±2°C por pelo menos 3 meses e a 5±3°C por pelo menos 9 meses.
[041] Em uma das melhores modalidades, a nova formulação de vacina conjugada de polissacarídeo-proteína líquida pentavalente da presente invenção compreende Ingrediente Quantidade/Concentração Men ACYWX-TT 4-20 µg de polissacarídeo/sorogrupo/mL Tampão 5-30 mM mM de solução salina tamponada com fosfato (pH 7.0±0.2) Excipiente 0-150 mM de NaCl suficiente para manter a osmolalidade entre 240-330 mOsmol/kg 5-30 mM de Histidina Adjuvante: Fosfato de alumínio como 500-2000 µg Al+++/mL Água (MQW) qs
[042] Os ingredientes são misturados por agitação à temperatura ambiente durante 0,5-2 horas e na sequência colocados em tubos e armazenados a 2-8°C.
[043] Em outra modalidade, a nova formulação de vacina conjugada de polissacarídeo-proteína líquida pentavalente da presente invenção compreende Ingrediente Quantidade/Concentração Men ACYWX-TT 10-20 µg de polissacarídeo/sorogrupo/mL Tampão 10-25 mM de solução salina tamponada com fosfato (pH 7.0±0.2) Excipiente 0-150 mM de NaCl para manter a osmolalidade entre 240-330 mOsmol/kg Adjuvante: 750-1500 µg Al+++/mL de fosfato de alumínio Água (MQW) qs
[044] Os ingredientes são misturados por agitação à temperatura ambiente durante 0,5-2 horas e na sequência colocados em tubos e armazenados a 2-8°C.
[045] Uma das melhores modalidades da formulação com adjuvante que fornece osmolalidade desejada e alta estabilidade e imunogenicidade desejada compreende: Ingrediente Quantidade/Concentração Men ACYWX-TT 10-20 µg de polissacarídeo/sorogrupo/mL Tampão: PBS 10 mM (pH 7,0±0,2) Excipiente: 0-150 mM de NaCl Adjuvante: Fosfato de alumínio como 1000 µg Al+++/mL Água (MQW) qs
[046] Os ingredientes são misturados por agitação à temperatura ambiente durante 0,5-2 horas e na sequência colocados em tubos e armazenados a 2-8°C.
[047] Outra modalidade da formulação sem adjuvante que fornece osmolalidade desejada e alta estabilidade e imunogenicidade desejada compreende: Ingrediente Quantidade/Concentração Men ACYWX-TT 10 µg de polissacarídeo/sorogrupo/mL Tampão: PBS 10 mM (pH 7,0±0,2) Excipientes: 0-150 mM de NaCl Água (MQW) qs
[048] Os ingredientes são misturados por agitação à temperatura ambiente durante 0,5-2 horas e na sequência colocados em tubos e armazenados a 2-8°C.
[049] As formulações da presente invenção com ou sem adjuvante foram testadas quanto à osmolalidade, estabilidade e imunogenicidade. As formulações foram expostas a altas temperaturas de 37±2 °C (VVM) por 21 dias para verificar o aumento do teor de polissacarídeos livres. O teor de polissacarídeos livres na formulação de vacina pentavalente foi separado pelo método de precipitação e filtração por desoxicolato (DOC) e estimado por cromatografia de troca aniônica de alto desempenho com o método de detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD).
[050] A formulação é estável a altas temperaturas. Considerando 40% de PS livre como o objetivo máximo, a formulação mostra estabilidade na alta temperatura de 37±2 °C por pelo menos 21 dias, a 25±2°C por pelo menos 3 meses e a 5±3°C por pelo menos 9 meses.
[051] A formulação da presente invenção está na forma líquida ou liofilizada ou em uma combinação das mesmas. A presente invenção também fornece a dosagem ideal de cada um dos conjugados na composição e formulação da vacina. A dose ideal é de 5 a 10 µg de polissacarídeo do sorogrupo A e X e 5 µg de polissacarídeo do sorogrupo C, Y e W por dose humana sem adjuvante ou com 500 µg de Al+++ na forma de adjuvante com fosfato de alumínio por dose humana.
EXEMPLO 1: Preparação de formulações líquidas de placebo:
[052] O NaCl foi misturado com diferentes tampões para alcançar a osmolalidade do tampão na faixa de 300±30 mOsmol/kg. Uma formulação de placebo sem nenhum sorogrupo (antígeno ativo) meningocócico foi preparada misturando fosfato de alumínio com diferentes tampões e NaCl para conhecer a força osmótica da formulação, conforme tabela 1 abaixo: Tabela 1: Matriz para preparação da formulação líquida de placebo Formulação Tipo de tampão Força Força do Teor de fosfato No de NaCl tampão de alumínio (como Al+++) Cloreto de sódio 0,85% MLF1 - 1mg/mL (NaCl) Ácido 2-(N- 100 mM 1mg/mL morfolino) MLF2 25mM etanossulfônico (MES) Solução salina 100 mM 1mg/mL MLF3 tamponada com 25mM fosfato (PBS) MLF4 L-Histidina 100 mM 25mM 1mg/mL MLF5 MES e Histidina 100 mM 25mM 1mg/mL MLF6 PBS e Histidina 100 mM 25mM 1mg/mL
[053] As formulações acima (placebo) foram analisadas quanto à osmolaridade e pH para determinar a concentração adequada de NaCl para alcançar a osmolaridade desejada nas formulações finais. A osmolalidade das formulações é fornecida na Tabela 2. Tabela 2: Osmolalidade e pH das formulações líquidas de Placebo Formulação N.° Osmolalidade pH (mOsmol/kg) MLF1 417 6,64 MLF2 357 6,77 MLF3 367 6,97 MLF4 346 6,69 MLF5 352 6,78
MLF6 353 6,85
[054] A Tabela 2 sugeriu que a osmolalidade das formulações da Tabela 1 foi superior aos limites esperados de 240-330 mOsmol/kg, indicando a redução da força de NaCl para reduzir a osmolalidade. A força molar de NaCl foi reduzida para alcançar a osmolalidade desejada das formulações. EXEMPLO 2: Preparação da formulação líquida de Placebo por meio da redução da força de NaCl:
[055] A força de NaCl foi reduzida pela metade em comparação com a força de NaCl na Tabela 1, ou seja, de 100mM a 50mM para obter o índice de osmolalidade dentro do intervalo desejado, conforme a tabela 2 abaixo: Tabela 3: Osmolalidade e pH das formulações de Placebo Teor de Formulação Força Resultados Tipo de Força do fosfato de N.° do tampão NaCl alumínio Osmola-dade tampão pH (como Al+++) (mOsmol/Kg) MLF1 NaCl 0,42% - 1mg/mL 282 6,90 MLF2 MES 50mM 25mM 275 6,62 1mg/mL NaCl - 0,9% - - 289 6,90 Fosfato de - - - 2mg/mL 276 - alumínio Com NaCl próximo a 50 mM, a osmolalidade das formulações alcançada na faixa de 275 mOsmol/kg a 282 mOsmol/kg, que está dentro da faixa da osmolalidade desejada para as formulações. EXEMPLO 3: Preparação de diferentes formulações de Meningococos Pentavalentes líquidas para estabelecer a estabilidade do produto na presença de diferentes excipientes e tampões:
[056] Várias formulações pentavalentes de ACYWX-TT meningocócicas foram preparadas por meio da mistura do antígeno com os tampões, tais como tampão MES, tampão PBS, tampão Tris, tampão Tris, tampão HEPES e Histidina. Uma combinação de diferentes excipientes, como Glicina, Dextrose, Histidina, Manitol e Polissorbato 80, foi tentada para avaliar a estabilidade do medicamento quando exposto a uma temperatura mais alta de 37±2°C. As formulações foram preparadas conforme a Tabela 4 abaixo:
[057] Tabela 4: Matriz para a formulação da vacina conjugada ACYWX-TT meningocócica pentavalente líquida. 1mg/ 10 Tween 80 Dextrose Histidina Glicina mL de µg/mL NaCl fosfa- de antí- Código to de geno de alu- de cada Formulaç mínio sorogru ão Total Total -po Tampão 60mM 75mM 10mM 1% 10mM 0,05% Solução - - - - - - √ √ salina normal 0,45% MLF-7 (pH 7,0) MLF-13 PBS √ - - - - - √ √ MLF-14 (pH7,0) - √ - - - - √ √ MLF-21 MES √ - - - - - √ √ MLF-22 (pH6,5) - √ - - - - √ √ Histidi- √ - - - - - √ √ na (pH MLF-29 6,8) TRIS √ - - - - - √ √ MLF-30 (pH7,0)
HEPES √ - - - - - √ √ MLF-31 (pH7,0) PBS/ √ √ √ √ √ √ √ Histidi- na/ Dextrose / Glicina/ Tween 80 MLF-32 (pH7,0) -
[058] As formulações acima foram expostas a uma temperatura de 37 ± 2 °C por 14 dias para avaliar o efeito de tampões e excipientes no perfil de estabilidade do produto. O parâmetro indicador de estabilidade para formulações do conjugado meningocócico é a geração de PS livre com o tempo. As amostras foram retiradas nos dias 7 e 14 e analisadas pelo método HPAEC- PAD (Dionex) quanto à % de PS total e livre. Os resultados foram compilados para Polissacarídeos livres gerados ao longo do tempo de acordo com as tabelas 5 e 6 abaixo:
[059] Tabela 5: Teor de polissacarídeos livres em formulações líquidas ACYWX-TT meningocócicas pentavalentes líquidas para Men A, C e Y quando expostas a 37 ± 2 °C por até 14 dias. Formulação % PS Men A Livres % PS Men C Livres % PS Men Y Livres Código Inicial 7 dias 14 dias Inicial 7 dias 14 dias Inicial 7 dias 14 dias MLF-7 <1 23 37 20 34 41 14 11 14 MLF-13 2 6 8 22 29 31 11 13 14 MLF-14 <1 4 14 21 23 24 11 12 10 MLF-21 3 12 24 20 32 38 10 10 13 MLF-22 3 14 31 20 30 32 9 12 15
MLF-29 2 7 15 Int. Int. Int. 14 11 12 MLF-30 3 16 30 28 37 32 Int. Int. Int. MLF-31 2 20 35 19 25 42 9 17 12 MLF-32 Int. Int. Int. 12 28 39 Int. Int. Int.
Int. Interferência do ensaio
[060] Tabela 6: Teor de polissacarídeos livres em formulações de vacina conjugada ACYWX-TT meningocócicas pentavalentes líquidas para Men W e X quando expostas a 37 ± 2 °C por até 14 dias. Formulação % PS Men W Livres % PS Men X Livres Código Inicial 7 dias 14 dias Inicial 7 dias 14 dias MLF-7 18 18 20 <1 <1 <1 MLF-13 18 19 20 <1 <1 <1 MLF-14 18 19 21 <1 <1 <1 MLF-21 20 21 22 <1 <1 <1 MLF-22 19 21 22 <1 3 <1 MLF-29 19 21 23 <1 1 <1 MLF-30 18 18 18 <1 2 1 MLF-31 19 19 21 <1 <1 1 MLF-32 17 18 21 <1 1 3 EXEMPLO 4: Preparação de diferentes formulações líquidas ACYWX-TT Meningocócicas Pentavalentes sem fosfato de alumínio:
[061] As formulações meningocócicas pentavalentes foram preparadas sem a adição de fosfato de alumínio. Todas as formulações foram preparadas em PBS. A seguinte matriz foi usada para preparar as diferentes formulações:
[062] Tabela 7: Matriz para a preparação das formulações de vacina conjugada ACYWX-TT meningocócica pentavalente líquida sem adjuvante A,C,Y,W,X -TT Formulação PBS NaCl Manitol Histidina MQW (PS por Código conjugado)
MLF-36 10 mM 100 mM - - qs 10mg/mL MLF-38 10 mM 100 mM - 10 mM qs 10mg/mL MLF-39 10 mM 100 mM 0,1% - qs 10mg/mL
[063] As formulações acima foram analisadas quanto à osmolaridade e pH para confirmar as características básicas da formulação.
[064] Tabela 8: Resultados das formulações de vacina conjugada meningocócica pentavalente líquida sem adjuvante Código de Formulação Osmolalidade pH (mOsmol/kg) MLF-36 289 7,14 MLF-38 315 7,32 MLF-39 295 7,11
[065] Os resultados obtidos atendem aos valores desejados de Osmolalidade e pH. EXEMPLO 5: Preparação de formulações líquidas ACYWX-TT Meningocócicas Pentavalentes com dose mais alta de Men A e Men X:
[066] A formulação foi preparada com uma dose mais alta de 10 µg/0,5 mL para os sorogrupos MenA e MenX, mantendo a dose de MenC, MenY, MenW na dose de 5 µg/0,5 mL.
[067] Tabela 9: Matriz para a preparação de formulações com dose mais alta de MenA e MenX Fosfato de Formulação PBS NaCl alumí-nio MQW conjugados A,C,Y,W,X -TT Código (como Al+++) 10 100 20 µg/mL de A e X e 10 µg/mL MLF-35 500 µg/mL qs mM mM de C, Y e W
[068] As formulações acima foram analisadas quanto ao teor de polissacarídeos, % de polissacarídeos livres, osmolaridade e pH para confirmar as características básicas da formulação.
[069] Tabela 10: Resultados da formulação ACYWX-TT meningocócica pentavalente líquida com dose mais alta de MenA e MenX Código de Formulação Osmolaridade mOsmol/kg pH
MLF-35 321 7,0
[070] Tabela 11: Resultados das Formulações ACYWX-TT Meningocócicas Pentavalentes Líquidas com todos os sorogrupos a 10 µg de polissacarídeo por mL Código de pH Alúmen Osmolaridade Formulação mg/mL mOsmol/kg MLF-13 7,06 0,84 320 MLF-15 7,21 0,91 330 MLF-33 7,02 1,04 326 MLF-36 7,14 - 289 MLF-38 7,32 - 315 MLF-39 7,11 - 295 EXEMPLO 6: Preparação de diferentes formulações de Meningococos Pentavalentes liofilizadas para estabelecer a estabilidade do produto na presença de diferentes excipientes e tampões:
[071] Várias formulações pentavalentes de ACYWX-TT meningocócicas foram preparadas por meio da mistura do antígeno com os tampões, tais como tampão MES e tampão PBS. Uma combinação de diferentes excipientes, como Sacarose, Maltose, Arginina, Lactose, Sorbitol, Histidina e Glicina, tentou avaliar o pH, osmolaridade e teor de umidade à temperatura ambiente e atingir o teor de umidade desejado após a liofilização.
[072] A osmolalidade e o pH desejados foram alcançados com tampão de fosfato de sódio 10 mM com diferentes combinações de excipientes (isoladamente ou em combinação), em que o teor de umidade após a liofilização não é superior a 3% e a qualidade do bolo é satisfatória (Tabela 12).
[073] Tabela 12: Análise de várias combinações para formulação liofilizada (exemplos não limitativos):
Formulação Tampão de fosfato 10 mM mais pH Osmolaridade Teor de Código Outros excipientes (mOsmol/kg) umidade (%) Sacarose Lactose Glicina MF59 (1%) (4%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3 Sacarose Maltose Glicina MF60 (1%) (4%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3 Sacarose Manitol Glicina MF61 (1%) (4%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3 Sacarose Lactose Glicina MF62 (2%) (3%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3
Sacarose Maltose Glicina MF63 (2%) (3%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3 Sacarose Manitol Glicina MF64 (2%) (3%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3 Sacarose Lactose Glicina MF65 (3%) (2%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3 Sacarose Maltose Glicina MF66 (3%) (2%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3 Sacarose Manitol Glicina MF67 (3%) (2%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3 Maltose Lactose Glicina MF71 (1%) (4%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3 Maltose Manitol Glicina MF72 (1%) (4%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3 Maltose Manitol Glicina MF74 (2%) (3%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3 Maltose Lactose Glicina MF75 6,5-7,5 240-330 <3 (3%) (2%) (20mM) Maltose Manitol Glicina MF76 (3%) (2%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3 Maltose Lactose Glicina MF77 (4%) (1%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3
Lactose Manitol Glicina MF82 (4%) (1%) (20mM) 6,5-7,5 240-330 <3
[074] EXEMPLO 7: A formulação combinada Líquido-Lio Ingrediente Quantidade/Concentração Men A, C, Y, W, X –TT 10-20 µg de polissacarídeo/sorogrupo/mL Tampão: PBS 5-20 mM (pH 6,5-7,5) Excipientes: 2-10% Diluente qs
[075] Na formulação de líquido-lio, a porção liofilizada (lyo) contém o conjugado MenA-TT, o conjugado MenC-TT isoladamente ou em combinações variáveis, com o excipiente sendo selecionado a partir de sacarose, maltose, arginina, lactose, sorbitol, histidina, glicina, isoladamente ou em combinações de variáveis. O diluente é selecionado a partir de água, solução salina tamponada com fosfato 5-20 mM, fosfato de alumínio como 500-1500 µg de Al+++/mL, contendo MenC-TT, MenY-TT, MenX-TT, MenW-TT, isoladamente ou em combinações variáveis. EXEMPLO 8: Ciclos de liofilização: (Exemplos não limitantes)
[076] A formulação pentavalente foi liofilizada através de congelamento, secagem primária e secagem secundária. Os ciclos de liofilização são mostrados na Tabela 13. O ciclo de liofilização - 3 é o melhor modo, produzindo uma formulação estável com menos de 3% de teor de umidade e um bolo de boa qualidade.
[077] Tabela 13: Ciclos de liofilização CICLO-1 DA LIOFILIZAÇÃO CICLO-2 DA LIOFILIZAÇÃO CICLO-3 DA LIOFILIZAÇÃO Congelando Congelando Congelando Temp Tempo R/ Temp Tempo R/ Temp Tempo R/ Etapa Etapa Etapa (°C) (min) H (°C) (min) H (°C) (min) H 1 4 60 H 1 4 60 H 1 4 60 H 2 -48 250 R 2 -48 250 R 2 -48 250 R 3 -48 5 H 3 -48 120 H 3 -48 360 H Secagem primária Secagem primária Seco primário g em
Temp Tempo Vácuo R/ Temp Tempo Vácuo R/ Temp Tempo Vácuo mTor R/ Etapa Etapa Etapa (°C) (min) mTor(Pa) H (°C) (min) mTor (Pa) H (°C) (min) (Pa) H 1 -20 90 50 (6666,1) R 1 -20 90 50 (6666,1) R 1 -28 240 50 (6666,1) R (Paa 2 -20 15 50 (6666,1) H 2 -20 180 50 (6666,1) H 2 -20 180 50 (6666,1) R 3 10 90 50 (6666,1) R 3 10 90 50 (6666,1) R 3 -20 600 50 (6666,1) H 4 10 30 50 (6666,1) H 4 10 60 50 (6666,1) H 4 -10 60 50 (6666,1) R 5 20 300 50 (6666,1) R 5 20 300 50 (6666,1) R 5 10 120 50 (6666,1) R 6 20 10 50 (6666,1) H 6 20 60 50 (6666,1) H 6 25 60 50 (6666,1) R 7 30 30 50 (6666,1) R 7 30 30 50 (6666,1) R 7 30 30 50 (6666,1) R Secagem secundária Secagem secundária Secagem secundária Temp Tempo Vácuo R/ Temp Tempo Vácuo R/ Temp Tempo Vácuo R/ Etapa Etapa Etapa (°C) (min) mTor (Pa) H (°C) (min) mTor(Pa) H (°C) (min) mTor(Pa) H 1 30 810 50 (6666,1) H 1 30 810 50 (6666,1) H 1 30 500 50 (6666,1) H R: Rampa; H: Espera; min: Minutos EXEMPLO 9: Estabilidade de formulações líquidas ACYWX-TT Meningocócicas Pentavalentes em condições de Estresse, Aceleração e Tempo real:
[078] A estabilidade da vacina conjugada ACYWX-TT meningocócica pentavalente é testada quando exposta a várias condições de temperatura durante o período. O teste foi realizado para obter o efeito das temperaturas durante certos períodos de tempo. Os testes de estabilidade foram realizados usando três parâmetros de temperatura, sendo condições de armazenamento em tempo real a 5 ± 3°C, temperaturas mais altas a 25 ± 2°C e condições de estresse a 37 ± 2°C, os resultados são mencionados na Fig. 1-3 (Fig. 1a-1e, 2a-2e, 3a-3e). a. condições de armazenamento em tempo real a 5 ± 3°C - temperatura de armazenamento recomendada (Estudos de Estabilidade em Tempo Real) (Fig. 1 a-e). b. temperaturas mais altas a 25 ± 2°C - mais altas do que as recomendadas para armazenamento (Estudos de Estabilidade Acelerada) (Fig. 2 a-e). c. condições de estresse a 37 ± 2°C - condições extremas (Estudos de Estabilidade do Estresse) (Fig. 3 a-e)
[079] As amostras foram armazenadas por um período de 21 dias em condições de estresse, por 6 meses em condições aceleradas e por 3 anos em condições de armazenamento em tempo real (estudo em andamento, dados disponíveis até 9 meses). As amostras foram retiradas conforme o plano e analisadas quanto à melhor estabilidade indicando parâmetro da % de conteúdo livre de PS ao longo do tempo. EXEMPLO 10: Imunização de camundongos e coelhos com a formulação de vacina conjugada ACYWX-TT meningocócica pentavalente líquida
[080] Grupos de 8 camundongos fêmeas e 4 coelhos fêmeas (6-9 semanas de idade) foram imunizados no intervalo de 2 semanas com a nova vacina conjugada ACYWX-TT meningocócica pentavalente líquida adjuvante ou não adjuvante, um controle de veículo sem conjugados a granel ou uma vacina conjugada ACYW licenciada. A nova vacina conjugada ACYWX-TT meningocócica pentavalente liquida também foi usada no modelo de camundongo após armazenamento a 37°C por 7 dias (VVM7) para avaliação da estabilidade da formulação. Todas as imunizações foram realizadas por meio da administração da vacina por via subcutânea em camundongos e via intramuscular em coelhos. Cada camundongo foi imunizado com formulação equivalente a 1 µg de polissacarídeo por sorogrupo, enquanto que cada coelho foi imunizado com a dose humana pretendida total. Os títulos de anticorpos IgG anti-meningocócicos específicos ao sorogrupo foram estimados por ELISA indireto e títulos de anticorpos funcionais por ensaio bactericida sérico em soros coletados após a dose 2 e 3. Os resultados pós-dose 2 e 3 para a nova vacina conjugada ACYWX- TT meningocócica pentavalente líquida indicamm títulos de imunogenicidade significativamente altos em comparação ao controle do veículo no modelo de camundongo e de coelho e títulos não inferiores aos títulos de vacina licenciada IgG e SBA em ambos os modelos animais (Fig. 4a-4e, 5a-5e, 6a-6e). Além disso, a nova vacina conjugada ACYWX-TT meningocócica pentavalente líquida não mostrou diminuição nos títulos de imunogenicidade quando exposta a 37°C por 7 dias (Fig. 6a-6e). EXEMPLO 11: Determinação de títulos de IgG específicos ao sorogrupo polissacarídeo anti-meningocócico por ELISA indireto
[081] Noventa placas de seis poços (Nunc Maxisorp) foram revestidas com PS meningocócico padrão específico ao sorogrupo pela adição de 100 µl por mistura de poço de 5 µg/mL de PS e m-HSA em tampão PBS, pH 7.3±0.1. As placas foram incubadas durante a noite a 4 °C e depois lavadas três vezes com tampão PBS (0,1% Brij 35 em PBS, pH 7.3±0.1) e bloqueadas com 200 µl por poço de solução de FBS a 5% em tampão PBS (0,1% Brij 35 em PBS, pH 7.3±0.1) por 1 hora a 37 °C. Cada etapa de incubação foi seguida por três lavagens com tampão PBS. As amostras de soro de referência e de teste foram diluídas em tampão PBS (0,1% Brij 35, 5% FBS em PBS, pH 7.3±0.1), transferidas para placas bloqueadas revestidas (200 µl) e diluídas em série duas vezes seguidas de incubação durante a noite a 4 °C. Em seguida, 100 µL por poço de IgG anti-camundongo/coelho conjugados com peroxidase idealmente diluídos foram adicionados e deixados por 1 hora a 25 °C. Foram adicionados 100 µl por poço de substrato, 3, 3', 5, 5' - tetrametilbenzidina-H2O2 para o desenvolvimento da cor. Após 10 minutos de desenvolvimento a 25 °C, a reação foi interrompida pela adição de 50 µL de 2 M H2SO4, e a OD foi medida a 450 nm no leitor de microplacas. As concentrações de IgG do polissacarídeo Anti-MenC (em termos de unidades ELISA/mL) para cada formulação foram avaliadas usando o software Combistat e as concentrações médias geométricas (IgG GMC) foram mostradas para estudos representativos e comparações de formulação na Figura 4-6 (Fig. 4a-e 5a-e, 6a- e). EXEMPLO 12: Ensaio bactericida sérico (SBA) para a titulação de anticorpos funcionais específicos de um sorogrupo
[082] O estoque bacteriano específico do sorogrupo de N. meningitidis foi cultivado durante a noite em placa de ágar de sangue de ovelha a 37°C com 5% de CO2. Colônias isoladas foram colhidas e incubadas na superfície de outra placa de ágar de sangue de ovelha a 37°C com 5% de CO2. O crescimento bacteriano da segunda placa foi suspenso em tampão SBA otimizado para o respectivo sorogrupo.
A densidade óptica (OD650) da suspensão foi ajustada no estoque bacteriano de trabalho para atingir uma contagem de colônias de 60-250 por ponto no final do ensaio.
Os soros de controle de qualidade (QC) e os soros de teste foram inativados pelo calor por 30 minutos a 56 °C.
Na microplaca de poço, foram misturados 20 µL de diluições em série do soro de teste com 10 µL de bactérias na diluição de trabalho e 10 µL de complemento de coelho bebê (Pel- Freez). Para controles negativos, as bactérias foram incubadas, em um poço separado, com complemento de coelho bebê ativo sem o soro de teste e com soro de teste e complemento de coelho de bebê inativado pelo calor.
Os conteúdos do poço foram misturados ao bater levemente a placa de ensaio e incubados durante 1 hora a 37°C com 5% de CO2. Amostra de dez µL de cada poço plaqueado na placa de ágar-sangue pelo método da placa estriada.
As placas de ágar-sangue foram incubadas durante a noite a 37 °C com 5% de CO2 e as colônias foram contadas.
A maior diluição sérica mostrando uma redução de ≥ 50% nas unidades formadoras de colônias após a incubação de bactérias com mistura de reação, em comparação com o respectivo controle do complemento ativo, foi considerada como título da SBA.
Os resultados para estudos representativos e comparações de formulações são apresentados na Figura 4-6 (Fig. 4a-e 5a-e, 6a-e).

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Nova formulação de vacina conjugada de proteína - polissacarídeo multivalente em que a referida formulação é uma formulação pentavalente líquida ou liofilizada ou uma combinação líquido-liofilizado de polissacarídeos capsulares de Neisseria meningitidis sorogrupo A, C, Y, W e X (Men A, C, Y, W, X ), cada referido polissacarídeo sendo conjugado separadamente à proteína carreadora do toxóide tetânico (TT) para obter conjugados Men A, C, Y, W, X -TT, com um ou mais tampões e com ou sem um adjuvante junto com componentes/excipientes farmaceuticamente aceitáveis em que a referida formulação fornece osmolaridade desejada, pH desejado, alta estabilidade e imunogenicidade desejada.
    2. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida formulação líquida compreende: Ingrediente Quantidade/Concentração Men A, C, Y, W, X –TT 4-20 µg de polissacarídeo/sorogrupo/mL Tampão 5-30 mM de solução salina tamponada com fosfato Excipiente 0-150 mM de NaCl 5-30 mM de Histidina Adjuvante: Fosfato de alumínio como 500-2000 µg Al+++/mL Água (MQW) qs
    3. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida formulação líquida compreende: Ingrediente Quantidade/Concentração Men A, C, Y, W, X 10-20 µg de polissacarídeo/sorogrupo/mL –TT Tampão 10-25 mM de solução salina tamponada com fosfato (pH
    7.0±0.2) Excipiente 0-150 mM de NaCl Adjuvante: Fosfato de alumínio como 750-1500 µg Al+++/mL
    Água (MQW) qs
    4. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida formulação líquida compreende: Ingrediente Quantidade/Concentração Men A, C, Y, W, X –TT 10-20 µg de polissacarídeo/sorogrupo/mL Tampão: PBS 10 mM (pH 7,0±0,2) Excipiente: 0-150 mM de NaCl Adjuvante: Fosfato de alumínio como 1000 µg Al+++/mL Água (MQW) qs
    5. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida formulação líquida compreende: Ingrediente Quantidade/Concentração Men A, C, Y, W, X –TT 10 µg de polissacarídeo/sorogrupo/mL Tampão: PBS 10 mM (pH 7,0±0,2) Excipientes: 0-150 mM de NaCl Água (MQW) qs
    6. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida formulação liofilizada compreende: Ingrediente Quantidade/Concentração Men A, C, Y, W, X –TT 10-20 µg de polissacarídeo/sorogrupo/mL Tampão: PBS 5-20 mM (pH 6,5-7,5) Excipientes: 2-10% Diluente qs
    7. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida formulação de combinação de líquido-liofilizado compreende: Ingrediente Quantidade/Concentração
    Men A, C, Y, W, X –TT 10-20 µg de polissacarídeo/sorogrupo/mL Tampão: PBS 5-20 mM (pH 6,5-7,5) Excipientes: 2-10% Diluente qs
    8. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que os referidos conjugados Men A, C, Y, W, X –TT são obtidos ao empregar a combinação otimizada da química de conjugação.
    9. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 8 em que a referida química de conjugação para obter pelo menos o referido um conjugado que é a química de carbamato.
    10. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 9 em que pelo menos o referido um conjugado que emprega a referida química de carbamato é preferencialmente o conjugado MenX-TT.
    11. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 8 em que a referida química de conjugação para obter pelo menos o referido um conjugado é a química de cianilação.
    12. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 11 em que pelo menos o referido um conjugado que emprega a referida química de cianilação é preferencialmente os referidos conjugados Men A, C, Y, W-TT.
    13. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que cada referido polissacarídeo capsular é degradado na faixa de tamanho de 0,38±0,1 Kd quando testado para distribuição de tamanho molecular usando colunas em série de HPLC PWXL4000 e 5000, preferencialmente na faixa de tamanho de 0,38 ± 0,06 Kd obter conjugados com alta antigenicidade, alta imunogenicidade e alta estabilidade.
    14. A nova formulação de vacina, como reivindicada nas reivindicações 1 e 8 em que os referidos conjugados são produzidos tendo um braço ligante entre o referido polissacarídeo e a referida proteína carreadora, em que o ligante é ligado ao referido polissacarídeo ou à referida proteína carreadora ou ambos aos referidos polissacarídeo e proteína carreadora.
    15. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 14 em que o referido ligante é selecionado a partir de hidrazina ou dihidrazida de ácido adípico.
    16. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que o referido conjugado MenX-TT tem preferencialmente um ligante de hidrazina e os referidos conjugados MenA, C, Y, W-TT têm preferencialmente um ligante dihidrazida de ácido adípico.
    17. A nova formulação de vacina como reivindicado na reivindicação 1 em que cada referido conjugado possui a razão de proteína carreadora para polissacarídeo entre 0,3 a 1,0.
    18. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que os referidos excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados a partir de adjuvante, tampão, conservante, estabilizador, tensoativo, isoladamente ou em combinação.
    19. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 6 em que o referido excipiente é selecionado a partir de Sacarose, Maltose, Arginina, Lactose, Sorbitol, Histidina, Glicina, isoladamente ou em combinações variáveis.
    20. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 6 em que o referido diluente é selecionado a partir de água, 5 a 20 mM de solução salina tamponada com fosfato, fosfato de alumínio como 500 a 1500 µg de Al+++/mL, isoladamente ou em combinações variáveis.
    21. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 7 em que a referida porção liofilizada (lio) contém conjugado MenA-TT, conjugado MenC-TT, isoladamente ou em combinações variáveis.
    22. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 7 em que o referido excipiente é selecionado a partir de Sacarose, Maltose, Arginina, Lactose, Sorbitol, Histidina, Glicina, isoladamente ou em combinações variáveis.
    23. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 7 em que o referido diluente é selecionado a partir de água, 5 a 20 mM de solução salina tamponada com fosfato, fosfato de alumínio como 500 a 1500 µg de Al+++/mL, contendo MenC-TT, MenY-TT, MenX-TT, MenW-TT, isoladamente ou em combinações variáveis.
    24. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida formulação é formulação líquida ou liofilizada ou uma combinação das mesmas com regime de mono- ou multidose com ou sem um conservante.
    25. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a dose humana ideal dos sorogrupos A, C, Y, W e X varia entre 2 a 10 µg de polissacarídeo por sorogrupo por dose, preferencialmente 5 a 10 µg de cada um dos polissacarídeos do sorogrupo A e X e 5 µg de cada um dos polissacarídeos do sorogrupo C, Y e W.
    26. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida osmolalidade desejada da formulação é 240 a 330 mOsmol/kg.
    27. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que o referido pH desejado da formulação é 6,5 a 7,5.
    28. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida porção liofilizada da formulação liofilizada ou de líquido-liofilizado tem um teor de umidade não superior a 3%.
    29. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida formulação de vacina é estável a alta temperatura de 37±2°C por pelo menos 21 dias e a 25±2°C por pelo menos 3 meses mostrando menos de 40% de polissacarídeos livres.
    30. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida formulação de vacina mostra alta antigenicidade e alta imunogenicidade.
    31. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida formulação de vacina é igualmente imunogênica, mesmo após exposição a 37±2°C por 7 dias, em comparação à formulação armazenada em condições de armazenamento em tempo real.
    32. A nova formulação de vacina como reivindicado na reivindicação 1 em que a referida formulação é preferencialmente uma formulação de vacina conjugada meningocócica pentavalente líquida com regime de mono- ou multidose com ou sem um conservante.
    33. A nova formulação de vacina como reivindicada na reivindicação 1 em que a referida formulação e a referida composição são capazes de serem utilizadas na produção de vacina combinada ACYWX-TT meningocócica pentavalente líquida ou liofilizada ou com líquido-liofilizado.
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