CN118078981A - 一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法及其产品 - Google Patents
一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法及其产品 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法及其产品，涉及疫苗制备技术领域。制备方法包括：将A、C群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，调pH至碱性，依次加活化剂和连接剂，得A、C群多糖衍生物；再与CP1蛋白缩合，得A、C群多糖‑CP1结合物；将X、Y和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，调pH至酸性，加氧化剂，再加CRM197蛋白，调pH呈酸性，加氰基硼氢化钠反应，得X、Y、W135‑CRM197结合物；分别将A、C群多糖‑CP1结合物与X、Y、W135‑CRM197结合物纯化后混合，再除菌、过滤、冻干，得成品。相较于单载体蛋白的多价结合疫苗，本申请的疫苗免疫原性更高。
Description
技术领域
本申请涉及疫苗制备技术领域，特别涉及一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法及其产品。
背景技术
流行性脑脊髓膜炎（流脑）是由脑膜炎奈瑟菌或称脑膜炎球菌引起的急性化脓性中枢神经系统感染疾病，具有发病急、进展快、传染性强、隐性感染率高、病死率高等特点，通常由脑膜炎奈瑟菌血清型A、B、C、X、Y或W135群引起。流脑的预防包括分离、化学预防和接种疫苗。而针对血清型脑膜炎奈瑟菌的疫苗对流脑的预防非常有效，副作用也最小。目前国内上市的脑膜炎球菌疫苗包括脑膜炎球菌多糖疫苗（Meningococcal PolysaccharideVaccine，MPSV）、脑膜炎球菌多糖结合疫苗（Meningococcal Polysaccharide Conjugatevaccine，MPCV）和含MPCV的联合疫苗。脑膜炎球菌多糖结合疫苗是通过化学键的方式将荚膜多糖与各种载体蛋白结合，形成稳定的化学结构，使原本的T细胞非依赖性抗原转变为T细胞依赖性抗原，能有效地激发2岁以下儿童以及免疫缺陷者的免疫反应与免疫记忆，且保护时间长。相比多糖疫苗，多糖结合疫苗的覆盖年龄范围更广，免疫效果更好，优势相当明显。因此，采用多价脑膜炎球菌多糖结合疫苗来预防流行性脑膜炎是现如今最佳医疗的策略。
但目前脑膜炎球菌多价结合疫苗常采用单载体蛋白，而同一种载体蛋白在多价结合疫苗中会竞争辅助型T细胞，进而对多糖免疫应答产生抑制作用，因此，为提高多价结合疫苗的免疫原性，本申请提出一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法及其产品。
发明内容
本申请的主要目的是提供一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法及其产品，旨在解决现有的脑膜炎球菌多价结合疫苗免疫原性不高的技术问题。
为实现上述目的，本申请提出了一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将A群脑膜炎球菌多糖原液和C群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到A、C群多糖解聚液；
调节所述A、C群多糖解聚液的pH至碱性后，加入活化剂进行羟基活化，再加入连接剂进行衍生，经超滤后，得到A、C群多糖衍生物；
将所述A、C群多糖衍生物与CP1蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，再超滤后，得到A、C群多糖-CP1结合物；
将X群脑膜炎球菌多糖原液、Y群脑膜炎球菌多糖原液和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到X、Y、W135群多糖解聚液；
调节所述X、Y、W135群多糖解聚液的pH至酸性后，加入氧化剂进行氧化，经超滤浓缩后，得到X、Y、W135群多糖氧化物；
将所述X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白浓缩液混合，调节pH呈酸性，再加入氰基硼氢化钠进行反应，经超滤后，得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液；
分别将所述A、C群多糖-CP1结合物与所述X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液进行纯化后混合，得到多糖结合物原液；将所述多糖结合物原液除菌、过滤、冻干后，得到成品多糖结合疫苗。
可选地，所述将A群脑膜炎球菌多糖原液和C群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到A、C群多糖解聚液的步骤，包括：
将A群脑膜炎球菌多糖原液和C群脑膜炎球菌多糖原液一同在1100bar-1300bar的压强下，超声循环解聚5次-20次，使A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖的分子量均为5万-10万，得到A、C群多糖解聚液。
可选地，所述调节所述A、C群多糖解聚液的pH至碱性后，加入活化剂进行羟基活化，再加入连接剂进行衍生，经超滤后，得到A、C群多糖衍生物的步骤，包括：
在所述A、C群多糖解聚液中加入NaOH溶液，调节pH为9.0-10.0，再加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化3min-5min，再加入己二酸二酰肼过夜反应后，经膜包超滤，得到A、C群多糖衍生物。
可选地，所述将所述A、C群多糖衍生物与CP1蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，再超滤后，得到A、C群多糖-CP1结合物的步骤，包括：
将所述A、C群多糖衍生物与CP1蛋白混合，调节pH为5.5-6.5，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，并于20℃-30℃下搅拌反应4h-6h，再超滤后，得到A、C群多糖-CP1结合物。
可选地，所述将X群脑膜炎球菌多糖原液、Y群脑膜炎球菌多糖原液和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到X、Y、W135群多糖解聚液的步骤，包括：
将X群脑膜炎球菌多糖原液、Y群脑膜炎球菌多糖原液和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同在1100bar-1300bar的压强下，超声循环解聚5次-20次，使X群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖和W135群脑膜炎球菌多糖的分子量均为5万-10万，得到X、Y、W135群多糖解聚液。
可选地，所述调节所述X、Y、W135群多糖解聚液的pH至酸性后，加入氧化剂进行氧化，经超滤浓缩后，得到X、Y、W135群多糖氧化物的步骤，包括：
在所述X、Y、W135群多糖解聚液中加入醋酸-醋酸铵缓冲液，调节pH至4.7-4.9，再加入高碘酸钠溶液，混匀后，在25℃恒温水浴下氧化22h-26h，再采用10KD的超滤离心管并加注射用水换液至6-8倍体积后浓缩，得到X、Y、W135群多糖氧化物。
可选地，所述将所述X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白浓缩液混合，调节pH呈酸性，再加入氰基硼氢化钠进行反应，经超滤后，得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液的步骤，包括：
将所述X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白浓缩液混合，再加入磷酸氢二钠溶液，调节pH至6.1-6.3，在25℃水浴条件下反应1.5h-2.5h，反应完成后，加入氰基硼氢化钠，在25℃水浴条件下反应46h-50h，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液至6-8倍体积后，再加入氰基硼氢化钠进行封端反应，反应结束后，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液至6-8倍体积后，得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液。
可选地，所述分别将所述A、C群多糖-CP1结合物与所述X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液进行纯化后混合，得到多糖结合物原液的步骤，包括：
分别将所述A、C群多糖-CP1结合物与所述X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液通过4FF凝胶色谱柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，进行混合，并于2℃-8℃下保存，得到多糖结合物原液。
可选地，所述将所述多糖结合物原液除菌、过滤、冻干后，得到成品多糖结合疫苗的步骤，包括：
在所述多糖结合物原液中加入冻干蔗糖保护剂与注射用水，采用0.22μm针头滤器除菌过滤，再分装、冻干后，得到成品多糖结合疫苗。
本申请还提出了一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗产品，采用上述基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法所得。
本申请至少具有以下有益效果：
本申请为制备五价结合疫苗，首先将A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖解聚成较小的分子量，适宜的分子量有利于脑膜炎球菌多糖与载体蛋白的结合，再对A、C群多糖上的羟基进行活化，以便于连接剂通过活化的羟基连接到脑膜炎球菌多糖上，再选取CP1蛋白作为载体蛋白，在缩合剂的催化作用下，使A、C群多糖衍生物与CP1蛋白发生缩合反应，即可得到A、C群多糖-CP1结合物，再将X群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖和W135群脑膜炎球菌多糖解聚成适宜的分子量，并对解聚后的X、Y、W135群脑膜炎球菌多糖进行氧化，使多糖上的羟基被氧化成醛基，再选取CRM197蛋白作为载体蛋白，使X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白结合并形成席夫碱结构，再以氰基硼氢化钠作为还原剂，使席夫碱结构还原为C-N键，从而得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物，再分别将A、C群多糖-CP1结合物与X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物纯化后混合，得到多糖结合物原液，经除菌、过滤、冻干后，即可得到含A群、C群、X群、Y群、W135群血清的脑膜炎球菌五价结合疫苗。本申请采用CP1蛋白和CRM197蛋白共同作为载体蛋白，可避免同一种载体蛋白在多价结合疫苗中会竞争辅助型T细胞而对多糖免疫应答产生抑制作用，相比于单载体蛋白的多价结合疫苗，本申请具有更高的免疫原性，且含有A群、C群、X群、Y群和W135群五种血清型，血清型数量的增加，进一步提高了多糖结合疫苗的免疫原性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本申请实施例所述的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的合成路线图。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
针对现有技术所存在的技术问题，本申请的实施例提供了一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将A群脑膜炎球菌多糖原液和C群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到A、C群多糖解聚液；
调节所述A、C群多糖解聚液的pH至碱性后，加入活化剂进行羟基活化，再加入连接剂进行衍生，经超滤后，得到A、C群多糖衍生物；
将所述A、C群多糖衍生物与CP1蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，再超滤后，得到A、C群多糖-CP1结合物；
将X群脑膜炎球菌多糖原液、Y群脑膜炎球菌多糖原液和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到X、Y、W135群多糖解聚液；
调节所述X、Y、W135群多糖解聚液的pH至酸性后，加入氧化剂进行氧化，经超滤浓缩后，得到X、Y、W135群多糖氧化物；
将所述X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白浓缩液混合，调节pH呈酸性，再加入氰基硼氢化钠进行反应，经超滤后，得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液；
分别将所述A、C群多糖-CP1结合物与所述X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液进行纯化后混合，得到多糖结合物原液；将所述多糖结合物原液除菌、过滤、冻干后，得到成品多糖结合疫苗。
本申请为制备五价结合疫苗，首先将A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖解聚成较小的分子量，适宜的分子量有利于脑膜炎球菌多糖与载体蛋白的结合，再对A、C群多糖上的羟基进行活化，以便于连接剂通过活化的羟基连接到脑膜炎球菌多糖上，再选取CP1蛋白作为载体蛋白，在缩合剂的催化作用下，使A、C群多糖衍生物与CP1蛋白发生缩合反应，即可得到A、C群多糖-CP1结合物，再将X群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖和W135群脑膜炎球菌多糖解聚成适宜的分子量，并对解聚后的X、Y、W135群脑膜炎球菌多糖进行氧化，使多糖上的羟基被氧化成醛基，再选取CRM197蛋白作为载体蛋白，使X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白结合并形成席夫碱结构，再以氰基硼氢化钠作为还原剂，使席夫碱结构还原为C-N键，从而得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物，再分别将A、C群多糖-CP1结合物与X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物纯化后混合，得到多糖结合物原液，经除菌、过滤、冻干后，即可得到含A群、C群、X群、Y群、W135群血清的脑膜炎球菌五价结合疫苗。本申请采用CP1蛋白和CRM197蛋白共同作为载体蛋白，可避免同一种载体蛋白在多价结合疫苗中会竞争辅助型T细胞而对多糖免疫应答产生抑制作用，相比于单载体蛋白的多价结合疫苗，本申请具有更高的免疫原性，且含有A群、C群、X群、Y群和W135群五种血清型，血清型数量的增加，进一步提高了多糖结合疫苗的免疫原性。并且，由于目前国内关于X群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的研究和报道较少，而本申请的多价结合疫苗含有X群血清型，通过检测该多价结合疫苗的质量和免疫原性，也能为后续研究提供参考意义。
具体的，多糖结合疫苗使用的载体蛋白主要为CRM197（白喉毒素突变体）、DT（人工制备的失活白喉毒素）、TT（甲醛处理的破伤风梭菌制备物）、OMP（外膜蛋白复合物）以及PD（源自Haemophilus influenzae的表面脂蛋白）。其中，仅有CRM197和PD是成分单一的重组蛋白。CRM197是白喉毒素（DT）的无毒突变株，具有第52位甘氨酸被谷氨酸替代的单个氨基酸突变，其毒性消失但仍保留与DT相同的免疫刺激特性，CRM197无需进行甲醛处理，其T细胞识别表位得以完整保存，因此其载体效果要高于DT，相较于DT制备需培养白喉杆菌，CRM197可利用基因重组工程技术，使用大肠杆菌作为宿主菌进行重组表达，其产量更高。而本申请所采用的CP1蛋白为新型载体蛋白，CP1蛋白是基于CRM197蛋白信息，利用EvoDesign算法进行重新设计，并利用基因重组工程技术，使用大肠杆菌作为宿主菌异源表达后，所获得重组表达的CP1蛋白，其氨基酸序列以及制备方法参考系列申请（CN202410008283.8）。本申请采用CP1蛋白和CRM197蛋白作为载体蛋白，CP1蛋白和CRM197蛋白均具有较高的免疫刺激特性，且CP1蛋白与CRM197蛋白之间几乎无交叉反应且CP1蛋白的抗体滴度较高，有利于提高多糖结合疫苗的免疫效力。
作为本申请的一种可实施方式，所述将A群脑膜炎球菌多糖原液和C群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到A、C群多糖解聚液的步骤，包括：
将A群脑膜炎球菌多糖原液和C群脑膜炎球菌多糖原液一同在1100bar-1300bar的压强下，超声循环解聚5次-20次，使A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖的分子量均为5万-10万，得到A、C群多糖解聚液。
由于多糖的分子量对于多糖与蛋白的结合会产生影响，多糖的分子量过大与过小时都会影响多糖蛋白结合物的分子量，进而影响多糖蛋白结合物的免疫原性，故本申请首先将A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖进行解聚成较小分子量，A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖分子量优选为5万-10万，有利于与CP1蛋白的结合。
作为本申请的一种可实施方式，所述调节所述A、C群多糖解聚液的pH至碱性后，加入活化剂进行羟基活化，再加入连接剂进行衍生，经超滤后，得到A、C群多糖衍生物的步骤，包括：
在所述A、C群多糖解聚液中加入NaOH溶液，调节pH为9.0-10.0，再加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化3min-5min，再加入己二酸二酰肼过夜反应后，经膜包超滤，得到A、C群多糖衍生物。
在具体实施过程中，本申请以1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐（CDAP）作为活化剂，其可将多糖上的羟基活化，形成多糖氰化物，再加入己二酸二酰肼后，可使己二酸二酰肼能够通过氰基连接到多糖氰化物上，以便于后续多糖与载体蛋白进行连接，从而得到多糖与蛋白的结合物。
作为本申请的一种可实施方式，所述将所述A、C群多糖衍生物与CP1蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，再超滤后，得到A、C群多糖-CP1结合物的步骤，包括：
将所述A、C群多糖衍生物与CP1蛋白混合，调节pH为5.5-6.5，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，并于20℃-30℃下搅拌反应4h-6h，再超滤后，得到A、C群多糖-CP1结合物。
在具体实施过程中，在缩合剂4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐的作用下，A、C群多糖衍生物与CP1蛋白上会发生缩合反应，从而形成A、C群多糖-CP1结合物，再通过超滤，可去除未反应的缩合剂，以便于后续纯化去除未结合的多糖与CP1蛋白。
作为本申请的一种可实施方式，所述将X群脑膜炎球菌多糖原液、Y群脑膜炎球菌多糖原液和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到X、Y、W135群多糖解聚液的步骤，包括：
将X群脑膜炎球菌多糖原液、Y群脑膜炎球菌多糖原液和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同在1100bar-1300bar的压强下，超声循环解聚5次-20次，使X群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖和W135群脑膜炎球菌多糖的分子量均为5万-10万，得到X、Y、W135群多糖解聚液。
具体的，将X群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖和W135群脑膜炎球菌多糖解聚成较小的分子量，有利于后续对解聚后的X、Y、W135群脑膜炎球菌多糖进行氧化，X群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖和W135群脑膜炎球菌多糖的分子量优选为5万-10万，有利于与CRM197蛋白的结合。
作为本申请的一种可实施方式，所述调节所述X、Y、W135群多糖解聚液的pH至酸性后，加入氧化剂进行氧化，经超滤浓缩后，得到X、Y、W135群多糖氧化物的步骤，包括：
在所述X、Y、W135群多糖解聚液中加入醋酸-醋酸铵缓冲液，调节pH至4.7-4.9，再加入高碘酸钠溶液，混匀后，在25℃恒温水浴下氧化22h-26h，再采用10KD的超滤离心管并加注射用水换液至6-8倍体积后浓缩，得到X、Y、W135群多糖氧化物。
在具体实施过程中，采用高碘酸钠作为氧化剂，其可将X、Y、W135群多糖上的羟基氧化为醛基，以便于后续跟载体蛋白的氨基进行反应，再经超滤浓缩后，去除未反应的高碘酸钠以及多糖，即可得到X、Y、W135群多糖氧化物。
作为本申请的一种可实施方式，所述将所述X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白浓缩液混合，调节pH呈酸性，再加入氰基硼氢化钠进行反应，经超滤后，得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液的步骤，包括：
将所述X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白浓缩液混合，再加入磷酸氢二钠溶液，调节pH至6.1-6.3，在25℃水浴条件下反应1.5h-2.5h，反应完成后，加入氰基硼氢化钠，在25℃水浴条件下反应46h-50h，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液至6-8倍体积后，再加入氰基硼氢化钠进行封端反应，反应结束后，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液至6-8倍体积后，得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液。
具体的，磷酸氢二钠溶液可作为缓冲溶液，以调节后续反应的pH值，再加入氰基硼氢化钠，其作为还原剂，可将X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白所生成的席夫碱还原为C-N键，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液，以去除未反应的CRM197蛋白、X、Y、W135群多糖氧化物等物质，然后再次加入氰基硼氢化钠进行封端反应，将没有结合的醛基还原，反应结束后，通过50KD的超滤离心管并加注射用水进行换液，以去除未反应的物质，从而获得含X、Y、W135群血清的蛋白结合物。
作为本申请的一种可实施方式，所述分别将所述A、C群多糖-CP1结合物与所述X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液进行纯化后混合，得到多糖结合物原液的步骤，包括：
分别将所述A、C群多糖-CP1结合物与所述X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液通过4FF凝胶色谱柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，进行混合，并于2℃-8℃下保存，得到多糖结合物原液。
具体的，本申请采用AKTA pure蛋白纯化系统与4FF凝胶色谱柱对多糖蛋白结合物进行层析纯化，采用波长为280nm的紫外检测器检测流出液，经缓冲液洗脱后出现洗脱峰，收集洗脱峰部分，并通过注射用水超滤换液后，再经0.22μm的滤膜过滤，最后将纯化后的A、C群多糖-CP1结合物与X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物混合后，即可得到含A-CP1、C-CP1、Y-CRM197、X-CRM197、W135-CRM197结合物的纯度较高的多糖结合物原液。
作为本申请的一种可实施方式，所述将所述多糖结合物原液除菌、过滤、冻干后，得到成品多糖结合疫苗的步骤，包括：
在所述多糖结合物原液中加入冻干蔗糖保护剂与注射用水，采用0.22μm针头滤器除菌过滤，再分装、冻干后，得到成品多糖结合疫苗。
具体的，多糖结合疫苗中A-CP1、C-CP1、Y-CRM197、X-CRM197、W135-CRM197结合物的浓度分别为20μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、10μg/mL、10μg/mL。
本申请的实施例还提供了一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗产品，采用上述基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法所得。
下面结合具体实施例对本申请上述技术方案进行详细说明。
实施例1
一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
如图1所示，将A群脑膜炎球菌多糖原液和C群脑膜炎球菌多糖原液一同在1200bar的压强下，超声循环解聚12次，使A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖的分子量均为7.5万，得到A、C群多糖解聚液；
在所述A、C群多糖解聚液中加入0.2M NaOH溶液，调节pH为9.5，再加入5mg/mL的1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化4min，再加入20mg/mL的己二酸二酰肼过夜反应后，经膜包超滤，得到A、C群多糖衍生物；
将所述A、C群多糖衍生物与CP1蛋白混合，CP1蛋白浓度为4mg/mL，调节pH为6.0，加入45mg/mL的4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，并于25℃下搅拌反应5h，再超滤后，得到A、C群多糖-CP1结合物；
将X群脑膜炎球菌多糖原液、Y群脑膜炎球菌多糖原液和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同在1200bar的压强下，超声循环解聚12次，使X群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖和W135群脑膜炎球菌多糖的分子量均为7.5万，得到X、Y、W135群多糖解聚液；
在所述X、Y、W135群多糖解聚液中加入醋酸-醋酸铵缓冲液，调节pH至4.8，再加入15mg/mL的高碘酸钠溶液，混匀后，在25℃恒温水浴下氧化24h，再采用10KD的超滤离心管并加注射用水换液至7倍体积后浓缩，得到X、Y、W135群多糖氧化物；
将所述X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白浓缩液混合，再加入0.5mol/L磷酸氢二钠溶液，调节pH至6.2，在25℃水浴条件下反应2.0h，反应完成后，加入氰基硼氢化钠，使氰基硼氢化钠的浓度为15mg/mL，在25℃水浴条件下反应48h，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液至7倍体积后，再加入30mg的氰基硼氢化钠进行封端反应，反应结束后，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液至7倍体积后，得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液；
分别将所述A、C群多糖-CP1结合物与所述X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液，通过4FF凝胶色谱柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，进行混合，并于5℃下保存，得到多糖结合物原液；在所述多糖结合物原液中加入冻干蔗糖保护剂与注射用水，采用0.22μm针头滤器除菌过滤，再分装、冻干后，得到成品多糖结合疫苗。
实施例2
一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将A群脑膜炎球菌多糖原液和C群脑膜炎球菌多糖原液一同在1100bar的压强下，超声循环解聚5次，使A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖的分子量均为5万，得到A、C群多糖解聚液；
在所述A、C群多糖解聚液中加入NaOH溶液，调节pH为9.0，再加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化3min，再加入己二酸二酰肼过夜反应后，经膜包超滤，得到A、C群多糖衍生物；
将所述A、C群多糖衍生物与CP1蛋白混合，调节pH为5.5，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，并于20℃下搅拌反应6h，再超滤后，得到A、C群多糖-CP1结合物；
将X群脑膜炎球菌多糖原液、Y群脑膜炎球菌多糖原液和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同在1100bar的压强下，超声循环解聚5次，使X群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖和W135群脑膜炎球菌多糖的分子量均为5万，得到X、Y、W135群多糖解聚液；
在所述X、Y、W135群多糖解聚液中加入醋酸-醋酸铵缓冲液，调节pH至4.7，再加入高碘酸钠溶液，混匀后，在25℃恒温水浴下氧化22h，再采用10KD的超滤离心管并加注射用水换液至6倍体积后浓缩，得到X、Y、W135群多糖氧化物；
将所述X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白浓缩液混合，再加入磷酸氢二钠溶液，调节pH至6.1，在25℃水浴条件下反应1.5h，反应完成后，加入氰基硼氢化钠，在25℃水浴条件下反应46h，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液至6倍体积后，再加入氰基硼氢化钠进行封端反应，反应结束后，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液至6倍体积后，得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液；
分别将所述A、C群多糖-CP1结合物与所述X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液，通过4FF凝胶色谱柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，进行混合后，并于2℃下保存，得到多糖结合物原液；在所述多糖结合物原液中加入冻干蔗糖保护剂与注射用水，采用0.22μm针头滤器除菌过滤，再分装、冻干后，得到成品多糖结合疫苗。
实施例3
一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将A群脑膜炎球菌多糖原液和C群脑膜炎球菌多糖原液一同在1300bar的压强下，超声循环解聚20次，使A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖的分子量均为10万，得到A、C群多糖解聚液；
在所述A、C群多糖解聚液中加入NaOH溶液，调节pH为10.0，再加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化5min，再加入己二酸二酰肼过夜反应后，经膜包超滤，得到A、C群多糖衍生物；
将所述A、C群多糖衍生物与CP1蛋白混合，调节pH为6.5，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，并于30℃下搅拌反应4h，再超滤后，得到A、C群多糖-CP1结合物；
将X群脑膜炎球菌多糖原液、Y群脑膜炎球菌多糖原液和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同在1300bar的压强下，超声循环解聚20次，使X群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖和W135群脑膜炎球菌多糖的分子量均为10万，得到X、Y、W135群多糖解聚液；
在所述X、Y、W135群多糖解聚液中加入醋酸-醋酸铵缓冲液，调节pH至4.9，再加入高碘酸钠溶液，混匀后，在25℃恒温水浴下氧化26h，再采用10KD的超滤离心管并加注射用水换液至8倍体积后浓缩，得到X、Y、W135群多糖氧化物；
将所述X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白浓缩液混合，再加入磷酸氢二钠溶液，调节pH至6.3，在25℃水浴条件下反应2.5h，反应完成后，加入氰基硼氢化钠，在25℃水浴条件下反应50h，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液至8倍体积后，再加入氰基硼氢化钠进行封端反应，反应结束后，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液至8倍体积后，得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液；
分别将所述A、C群多糖-CP1结合物与所述X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液，通过4FF凝胶色谱柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，进行混合，并于8℃下保存，得到多糖结合物原液；在所述多糖结合物原液中加入冻干蔗糖保护剂与注射用水，采用0.22μm针头滤器除菌过滤，再分装、冻干后，得到成品多糖结合疫苗。
实验例1
测试本申请所制备的多糖结合疫苗的免疫原性。
采用A、C、Y、W135、X群脑膜炎球菌多糖包被酶标板，其浓度为5μg/mL，规格为100μL/孔，在2℃-8℃条件下过夜后，加入200μL/孔的封闭液，于25℃下孵育2h后；将待测样品稀释200倍，按100μL/孔加入对应孔板，同时设置BSA缓冲液为阴性对照组；于25℃下孵育1.5h，再通过PBST（磷酸盐吐温缓冲液）洗板3次；再将HRP（辣根过氧化物酶）标记的1:10000倍稀释的Goat Anti-Mouse IgG（H+L）按100μL/孔加入对应孔板中，于25℃下孵育1 h，再通过PBST洗板3次；再将TMB显色液按100μL/孔加入对应孔板，避光孵育10min后，加入2 mol/L硫酸终止反应；最后于酶标仪450nm波长下测定吸光度（A450）值，再计算每份待测样品的IgG的滴度。如果阴性对照组的平均A450值＜0.05，则按0.05计算。
待测样品：本申请实施例1所制备的多糖结合疫苗；传统单载体蛋白的ACYW135群多糖结合疫苗。测试结果如下表1所示。
表1
由表1可见，相比于阴性对照组，传统单载体蛋白的ACYW135群多糖结合疫苗与本申请的多糖结合疫苗对A群、C群、Y群、W135群血清型的抗体滴度明显更高，说明ACYW135群多糖结合疫苗与本申请的多糖结合疫苗均具有一定的免疫原性，而传统单载体蛋白的ACYW135群多糖结合疫苗由于不具有X群血清型，故其抗X群IgG滴度低于阴性对照组和实施例1多糖结合疫苗组；且相比于ACYW135群多糖结合疫苗组，本申请的多糖结合疫苗对A群、C群、Y群、X群、W135群血清型的抗体滴度显著提高，说明本申请采用双蛋白载体所制备的多糖结合疫苗相较于单载体蛋白，能够进一步提高免疫原性。
实验例2
对本申请所制备的多糖结合疫苗进行长期毒性试验。
依据《预防用生物制品临床前安全性评价技术审评一般原则》，长期毒性试验至少选择一种相关动物进行长期毒性试验，接种剂量原则上应使疫苗在动物体内达到最佳的免疫应答，也可以直接采用临床试验中拟用的高剂量进行长期毒性试验，一般采取2-3周的暴露间隔。
基于此，本试验选择6-8周的BALB/c小鼠（雌雄各半，雌鼠5只，雄鼠5只；体重18g-22g）进行长期毒性实验。在Day0、Day14和Day28时，每只小鼠肌肉注射100μg本申请所制备的多糖结合疫苗，共注射三次。在此期间对小鼠进行观察记录，包括小鼠日常活动表现、体重变化、摄食情况等，并且在末次接种后3天（Day31），对小鼠进行血液生化指标的检测，对小鼠眼眶静脉取血于抗凝管内，进行小鼠血常规检测，将小鼠全血室温放置2小时后于4℃、3000rpm条件下离心10min-15min，取上清用于生化指标检测。数据进行单因素方差分析，采用均值±标准差表示。
小鼠体重变化测试结果如下表2所示。
表2
由表2可见，小鼠按给药方案经肌肉注射多糖结合疫苗后，其体重增长情况与对照组无明显差异。
小鼠血液生化指标检测结果如下表3所示。
表3
由表3可见，与对照组相比，注射本申请的多糖结合疫苗后，并未引起小鼠红细胞数量、平均血红蛋白含量、血小板、血小板容积的变化，也不会引起血栓或血小板减少等不良反应。
综上所述，经过长期毒性试验表明，小鼠按给药方案经肌肉注射本申请的多糖结合疫苗后，多糖结合疫苗组及对照组小鼠均没有出现死亡的情况，并且各组小鼠精神状态良好、饮水饮食、活动等未见异常且无明显差异，小鼠体重增长情况与对照组无明显差异，血液生化指标与对照组也无明显差异，可见并无明显的长期毒性反应，符合预防用生物制品临床前安全性标准。
以上所述仅为本申请的可选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是在本申请的发明构思下，利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将A群脑膜炎球菌多糖原液和C群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到A、C群多糖解聚液；
调节所述A、C群多糖解聚液的pH至碱性后，加入活化剂进行羟基活化，再加入连接剂进行衍生，经超滤后，得到A、C群多糖衍生物；
将所述A、C群多糖衍生物与CP1蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，再超滤后，得到A、C群多糖-CP1结合物；
将X群脑膜炎球菌多糖原液、Y群脑膜炎球菌多糖原液和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到X、Y、W135群多糖解聚液；
调节所述X、Y、W135群多糖解聚液的pH至酸性后，加入氧化剂进行氧化，经超滤浓缩后，得到X、Y、W135群多糖氧化物；
将所述X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白浓缩液混合，调节pH呈酸性，再加入氰基硼氢化钠进行反应，经超滤后，得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液；
分别将所述A、C群多糖-CP1结合物与所述X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液进行纯化后混合，得到多糖结合物原液；将所述多糖结合物原液除菌、过滤、冻干后，得到成品多糖结合疫苗。
2.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将A群脑膜炎球菌多糖原液和C群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到A、C群多糖解聚液的步骤，包括：
将A群脑膜炎球菌多糖原液和C群脑膜炎球菌多糖原液一同在1100bar-1300bar的压强下，超声循环解聚5次-20次，使A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖的分子量均为5万-10万，得到A、C群多糖解聚液。
3.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述调节所述A、C群多糖解聚液的pH至碱性后，加入活化剂进行羟基活化，再加入连接剂进行衍生，经超滤后，得到A、C群多糖衍生物的步骤，包括：
在所述A、C群多糖解聚液中加入NaOH溶液，调节pH为9.0-10.0，再加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化3min-5min，再加入己二酸二酰肼过夜反应后，经膜包超滤，得到A、C群多糖衍生物。
4.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将所述A、C群多糖衍生物与CP1蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，再超滤后，得到A、C群多糖-CP1结合物的步骤，包括：
将所述A、C群多糖衍生物与CP1蛋白混合，调节pH为5.5-6.5，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，并于20℃-30℃下搅拌反应4h-6h，再超滤后，得到A、C群多糖-CP1结合物。
5.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将X群脑膜炎球菌多糖原液、Y群脑膜炎球菌多糖原液和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到X、Y、W135群多糖解聚液的步骤，包括：
将X群脑膜炎球菌多糖原液、Y群脑膜炎球菌多糖原液和W135群脑膜炎球菌多糖原液一同在1100bar-1300bar的压强下，超声循环解聚5次-20次，使X群脑膜炎球菌多糖、Y群脑膜炎球菌多糖和W135群脑膜炎球菌多糖的分子量均为5万-10万，得到X、Y、W135群多糖解聚液。
6.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述调节所述X、Y、W135群多糖解聚液的pH至酸性后，加入氧化剂进行氧化，经超滤浓缩后，得到X、Y、W135群多糖氧化物的步骤，包括：
在所述X、Y、W135群多糖解聚液中加入醋酸-醋酸铵缓冲液，调节pH至4.7-4.9，再加入高碘酸钠溶液，混匀后，在25℃恒温水浴下氧化22h-26h，再采用10KD的超滤离心管并加注射用水换液至6-8倍体积后浓缩，得到X、Y、W135群多糖氧化物。
7.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将所述X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白浓缩液混合，调节pH呈酸性，再加入氰基硼氢化钠进行反应，经超滤后，得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液的步骤，包括：
将所述X、Y、W135群多糖氧化物与CRM197蛋白浓缩液混合，再加入磷酸氢二钠溶液，调节pH至6.1-6.3，在25℃水浴条件下反应1.5h-2.5h，反应完成后，加入氰基硼氢化钠，在25℃水浴条件下反应46h-50h，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液至6-8倍体积后，再加入氰基硼氢化钠进行封端反应，反应结束后，再采用50KD的超滤离心管并加注射用水换液至6-8倍体积后，得到X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液。
8.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述分别将所述A、C群多糖-CP1结合物与所述X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液进行纯化后混合，得到多糖结合物原液的步骤，包括：
分别将所述A、C群多糖-CP1结合物与所述X-CRM197、Y-CRM197、W135-CRM197结合物溶液通过4FF凝胶色谱柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，进行混合，并于2℃-8℃下保存，得到多糖结合物原液。
9.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将所述多糖结合物原液除菌、过滤、冻干后，得到成品多糖结合疫苗的步骤，包括：
在所述多糖结合物原液中加入冻干蔗糖保护剂与注射用水，采用0.22μm针头滤器除菌过滤，再分装、冻干后，得到成品多糖结合疫苗。
10.一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗产品，其特征在于，采用如权利要求1-9任一项所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法所得。
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