KR101161033B1

KR101161033B1 - 컨쥬게이트 백신에 사용하기 위한 피막 다당류의 제조 방법

Info

Publication number: KR101161033B1
Application number: KR1020067006249A
Authority: KR
Inventors: 아드 하미디; 미첼 프랑스와 뷰렛
Original assignee: 드 슈타트 데르 네덜란덴, 베르테겐부어디그트 두어 드 미니스터 반 폭스겐트존하이트 벨지인 엔 스포츠
Priority date: 2003-09-11
Filing date: 2004-09-10
Publication date: 2012-06-28
Also published as: CA2538691C; ES2341863T3; CA2538691A1; SI1664319T1; EP1664319A2; PT1664319E; EP1664319B1; WO2005024038A3; KR20060092234A; ATE460498T1; DE602004025951D1; WO2005024038A2; PL1664319T3; US7582459B2; US20070065460A1; DK1664319T3

Abstract

본 발명은 다당류의 제조 방법, 및 본 발명의 방법에 따라 제조된 다당류를 포함하는 컨쥬게이트 백신에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에서 특징적인 단계는 염기 또는 산을 사용한 배양 배지의 pH의 조절이 더 이상 불가능할 때까지 염기 또는 산으로 배양 배지의 pH를 일정 값으로 유지한다는 것이다. 본 발명의 방법을 이용하여, 피막 다당류를 비교적 단시간 내에 고수율로 얻을 수 있다. 본 방법은 직접적이고 재현가능하며 비용 면에서 유리하다.

다당류, 컨쥬게이트, 백신,

Description

컨쥬게이트 백신에 사용하기 위한 피막 다당류의 제조 방법 {PROCESS FOR PRODUCING A CAPSULAR POLYSACCHARIDE FOR USE IN CONJUGATE VACCINES}

본 발명은 박테리아 피막 다당류의 제조 및 컨쥬게이트 백신의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.

백신을 제조하는 데 있어서 제1 단계는 면역-유도 활성으로부터 질환-유발 활성을 분리하는 것이다. 실제로, 이것은 완전한 질환을 유발할 수 없지만 여전히 숙주의 면역 반응을 유도하는 역할을 하는 항원을 보유하는 유기체 또는 유기체의 일부를 단리하거나 생성하는 것을 의미한다.

본 발명자들은 두 가지 주요 백신 군을 구별한다: 전체 유기체 백신과 서브-유니트 백신. 전체 유기체 백신은 유기체를 사멸/불활성화시키거나 약독화/약화시킴으로써 제조한다. 서브-유니트 백신은 예를 들어, 단백질 항원 및 탄수화물 항원을 기초로 한 백신이다.
탄수화물 항원을 사용하여 제조한 항-박테리아 백신은 질환-유발 유기체로부터 정제된 (피막) 다당류로 구성될 수 있다. 이러한 백신의 예로는 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 타입 b (Hib), 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria Meningitidis) (A, C, W 및 Y), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi) (Vi), 및 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) (23가지 상이한 혈청형) 다당류 백신이 있다.

다당류 백신은 2살 미만의 유아를 보호하지 못하고 장기 T-세포 기억을 유도하지 못하는 듯하였다. 그러므로, 신세대 컨쥬게이트 다당류 백신이 도입되었다. 컨쥬게이트 백신은 유아들에서 면역원성을 나타내고 장기 기억을 유도하는 것으로 보였다. 컨쥬게이트 백신은 다당류를 단백질 운반체에 부착시킴으로써 주로 제조된다.

전세계적으로 도입된 최초 컨쥬게이트 백신은 해모필러스 인플루엔자 타입 b (Hib)에 대한 것이다. 해모필러스 인플루엔자 타입 b는 주로 유아들에서 폐렴 및 수막염을 일으킨다.

해모필러스 인플루엔자 타입 b는 기침을 통한 비말 (droplet), 재채기 및 군중 생활 환경에 의해 퍼진다. 매년 2백만 내지 3백만의 감염 및 약 450,000명의 사망을 유발하고, 이들 중 거의 대다수는 개발도상국에서 일어나는 것으로 추정된다.

Hib에 대한 여러 백신은 고소득 국가에서 이미 널리 사용되고 있고, 이들 국가들은 사실상 상기 질환을 전멸시킨 상태이다. 상기 백신은 현재 사용중인 가장 안전한 것들에 속한다. 여러 연구가 저소득 국가에서 이들 백신의 효과를 확인하였지만, 이 백신들 중 상대적으로 극소수만이 유아에서 통상적으로 사용되기 시작하였다. Hib 백신은 규칙적인 유년 면역 프로그램에서 통상적으로 사용되는 백신과 비교할 때 상대적으로 높은 그의 비용 때문에 가장 잘 사용되지 않는 백신들 중 하나이다.

현재 이용되는 제조 방법은 비교적 비용이 비싸고, 약 16-18 시간의 긴 배양 단계를 포함하고 (예를 들어, US 4,644,059를 참조함), 배양 기간이 전형적으로 임의적의 파라미터, 예컨대, 시간 또는 광학 밀도를 기준으로 한다 (예를 들어, US 4,220,717를 참조함). 이러한 방법에서, 배양 조건에서의 변화를 보완할 수 없고 최적 수율보다 낮은 수율의 다당류는 불가피한 결과이다. 또한, 페놀과 같은 유해한 화학물질을 사용하여 다당류를 회수한다 (예를 들어, US 4,695624 및 EP 0 528 635를 참조함).

WHO (세계보건기구) 및 GAVI (백신 및 면역화를 위한 전세계적 동맹)의 목적에 이바지하고 세계의 모든 어린이들에게 사용될 수 있는 Hib 컨쥬게이트 백신을 만들기 위해, 그리고 Hib 기술에 접근할 기회를 개발도상국의 국민에게 부여하기 위하여, 비교적 단순하고 용이한 대량생산가능한 제조 방법이 타당한 조건 하에 이들 국가에서 개발되고 특허받고 허가를 받아야 한다. 제조된 백신은 관련 WHO 요건을 충족시켜야 한다.

도 1은 40 ℓ 스케일로 시험 배양하는 동안의 OD₅₉₀, pH 및 폴리리보실 리비톨 포스페이트 (PRP) 농도를 보여준다.

도 2는 폴리리보실 리비톨 포스페이트 (PRP)의 단순 정제 공정을 보여준다.

본 발명은 다당류의 제조 방법, 및 약학 조성물의 제조를 위한 다당류의 용도에 관한 것이다. 다당류의 제조 방법은

- 적합한 pH 및 온도에서 적합한 배양 배지 중에서 피낭성 (encapsulated) 박테리아를 배양하는 단계;

- 염기 또는 산을 사용한 배양 배지의 pH 조절이 더 이상 불가능할 때까지 염기 또는 산을 사용하여 배양 배지의 pH를 일정한 값으로 조절하는 단계;

- 바람직하게는 배양에 이용된 온도 미만으로 냉각될 때까지 세포의 용해를 지연시키는 단계; 및

- 임의로 배양 배지로부터 다당류를 회수하는 단계

를 포함한다.

본 발명에 따른 다당류 제조 방법의 이점 중 하나는 병원성 박테리아로부터 추출된 피막 다당류, 즉 피막 항원을 매우 짧은 시간 내에 고수율 (약 200-400 ㎎/ℓ)로 얻을 수 있다는 점이다. 물론, 배지 및/또는 배양 방법 [한탕배양 (batch culture) 대신에 회분식 배양 (fed batch culture)]을 더 최적화하면 훨씬 더 높은 다당류 농도를 얻을 수 있을 것이다. 피막 다당류의 제조를 위한 최신 방법은 약 16 내지 18 시간의 배양을 요구하는 반면, 본 발명에 따른 방법에서 전형적으로 약 6 내지 14 시간, 바람직하게는 약 7, 8, 9, 10 또는 11 시간 내에 발효가 완결될 수 있고, 즉 발효의 최적기에 도달된다. 전형적으로 약 12 내지 14 시간보다 더 많은 시간이 소요되지 않을 것이다. 물론, 정확한 시간은 이용되는 박테리아 및 균주에 달려 있을 것이고 박테리아의 "물리적 상태"에 따라 다소 다를 수 있다. 여기서, 박테리아의 "물리적 상태"는 여러 가지 중에서 접종의 질을 말하고 예를 들면, 배양의 지체기의 지속기간으로 반영된다.

본 발명에 따른 방법의 다른 이점은 본 방법이 직접적이고 재현가능하며 비용면에서 유리하고, 심지어 배양 조건의 변화 후에도 최적 수율을 제공한다는 점이다. 더욱이, 헤민을 제외하고 동물 유래의 성분을 함유하지 않은 단순 배지를 사용하여 박테리아를 배양한다. 이것은 큰 장점이 되는 청정 배지라는 결과를 가져오는데, 이는 가능한 동물 유래의 성분이 없는 배지를 사용하여 BSE와 같은 동물 질환의 전염을 최소화하려는 것이 오늘날의 추세이기 때문이다.

또 다른 이점은 냉각이 시작되자마자 세포 용해가 지연되고, 냉각이 시작된지 약 24 시간 내, 바람직하게는 약 8, 10, 12, 14 또는 16 시간 내, 보다 바람직하게는 약 2, 4 또는 6 시간 내에 다당류의 수확을 시작하는 한 언제라도 편한 시간에 다당류를 수확할 수 있다는 점에서 본 발명의 방법은 매우 유연하다는 점이다. 당업자는 최고의 결과를 얻기 위해서는 냉각 후의 온도가 높을수록 수확의 개시가 빨라야 한다는 것을 이해할 것이다. 한 실시양태에서, 온도를 낮춘 지 약 1.5 시간 후에 수확을 개시한다. 본 방법은 특히 물리적 파라미터 (pH)를 기준으로 회수를 하고 예를 들어, 시간 또는 광학 밀도 (OD)와 같은 임의적인 파라미터를 기준으로 회수를 하지 않기 때문에 실질적인 문제점 없이 스케일업된다. 게다가, 본 방법은 비교적 단순한 공정을 이용하여 정제할 수 있는 매우 안정한 대량의 다당류를 얻게 한다. 이 정제 공정은 농축된 상청액을 주재료로 하므로, 보조 물질의 양은 최소화된다. 상기 정제는 장기간 동안 안정하며 모든 WHO 요건을 충족하는 정제된 다당류를 얻게 한다.

피막 다당류는 그람 음성 또는 그람 양성일 수 있는 임의의 피낭성 박테리아로부터 추출될 수 있다. 이용할 수 있는 박테리아의 비-제한 예로는 스트렙토코커스 (Streptococcus), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 엔테로코커스 (Enterococcus), 바실러스 (Bacillus), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 리스테리아 (Listeria), 클로스트리디움 (Clostridium), 해모필러스 (Haemophilus), 뉴모코커스 (Pneumococcus), 네이세리아 (Neisseria) 및 에스케리치아 (Escherichia)의 균주가 있다. 물론, 인간이 관심을 갖는 것은 해모필러스 인플루엔자, 스트렙토코커스 뉴모니아 및 네이세리아 메닝기티디스로부터 얻은 피막 다당류이다. 특히 해모필러스 인플루엔자는 널리 사용된다 [예를 들어, 문헌 (Rosenberg et al.(1961) J. Biol. Chem. 236: 2845 and Zamenhof et al. (1953) J. Biol. Chem. 203: 695)을 참조함]. 해모필러스 인플루엔자 타입 b (Hib)의 어떤 균주도 사용할 수 있다. 적합한 균주의 예에는 표준 Hib 균주, 이간 (Eagan) 및 균주 A760705가 포함된다.

이들 박테리아의 배양 방법은 예를 들어, 문헌 (Meritt et al. (2000) J Biotechnology 81: 189)으로부터 당분야에 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 적합한 배양 배지는 아미노산 및/또는 효모 추출물 또는 펩톤, 염화나트륨 (NaCl) 및 글루코스를 주성분으로 하고, NAD 및 헤민으로 보충되고 인산염 완충제로 완충된다. 바람직하게는, 배지는 헤민을 제외하고 동물 유래의 성분을 함유하지 않아야 한다. 적합한 pH는 일반적으로 약 6 내지 8, 바람직하게는 약 6.5 내지 7.5, 또는 약 6.8 내지 7.2의 pH이다. 배양 온도는 전형적으로 약 30-37℃, 바람직하게는 약 35 내지 37℃이다.

본 발명의 방법에 따라, 산 또는 염기를 사용하여 pH를 소정의 값으로 일정하게 유지한다. 세포 배양에서 pH를 조절하기 위해 통상적으로 사용되는 임의의 염기 또는 산을 사용할 수 있다. 적합한 염기 및 산에는 바람직하게는 약 1-5 몰/ℓ 농도의 NaOH, 및 바람직하게는 농축된 형태의 HCl이 포함된다.

특정 시점에서, pH는 낮아지거나 높아지는 경향을 보이기 때문에 선택된 산 또는 염기를 사용하여 pH를 더 이상 조절할 수 없다. 이 시점은 대략 대수증식 후기에 상응한다 (도 1 참조). pH는 추가 조절 없이 모니터링한다. 약 35℃에서 배양하는 경우 pH 조절이 계속되지 않은 지 몇 시간 후, 통상적으로 약 2-4 시간 후에 pH의 감소 또는 증가의 속도가 늦어질 것이다. 보다 낮은 온도에서, 이것은 더 오래 걸릴 것이다. 시험 진행 (예를 들어, 다른 광학 밀도)으로부터 예측가능한 시점인, 상기 감소 또는 증가의 속도가 늦어지기 시작하는 시기 직전에, 발효를 종결하고 배양 브로쓰를 수확한다. 바람직하게는 냉각을 이용하여 발효를 종결하는데, 이는 이 방법이 많은 이점을 가지기 때문이다. 첫째, 상기 방법은 종결에 사용될 수도 있는 포름알데히드와 같은 유해한 화합물질의 사용을 수반하지 않는다. 둘째, 상기 방법이 추가 물질을 수반하지 않기 때문에 상기 방법은 생장을 종결시키는 매우 경제적인 방법이다. 셋째, 상기 방법은 수확하는 동안 세포용해의 기회가 최소화된다는 부수적인 이점을 가진다. 수확이 전형적으로는 수 분 내에 완결되지 않는 과정이기 때문에, 냉각은 유연성과, 최적 환경 하에 최적 시점에서 수확할 시간을 제공한다. 보다 이른 수확은 수확 시기에 달려있는 다당류의 수율을 예를 들어, 50% 미만으로 낮출 수 있다 (예를 들어, 도 1 참조). 보다 늦은 시점에서의 수확은 다당류 분획을 오염시킬 것인데, 이는 세포가 용해되어 모든 종류의 세포성 물질이 다당류가 단리될 배지 내에 결과적으로 포함될 것이기 때문이다 (예를 들어, 도 1 참조). 이러한 세포성 오염물질은 다당류의 임의의 추가 단리 및 정제 과정을 복잡하게 할 것이다.

수확을 위해 발효를 종결시키기 위하여, 온도를 바람직하게는 30℃ 미만, 보다 바람직하게는 25℃ 미만, 가장 바람직하게는 20℃ 미만으로 낮춘다. 실제 수확, 즉 발효기를 비우는 것은 발효가 종결된 지 수 분 내에 개시할 수 있지만, 냉각은 상기 과정을 매우 유연하게 하고 수확자의 편의에 따라 몇 시간의 지연을 가능하게 한다. 세포를 사멸시키는 데 포름알데히드를 사용하는 경우 거의 불가피한 밤샘을 기다릴 필요가 없다. 한 실시양태에서, 발효가 종결된 지 2 시간 이상 후에 수확을 개시한다. 또 다른 실시양태에서, 생장이 종결된 지 3, 4, 5 또는 6시간 이상 후에 수확을 개시한다.

전형적으로, 수확은 원심분리 후, 경우에 따라 상청액의 불활성화, 농축 및 바람직하게는 정용여과 (diafiltration)를 이용하여 행한다. 원심분리는 바람직하게는 약 3000-6000 rpm의 속도로 행한다. 경우에 따라, 원심분리 후 불활성화를 행한다. 임의의 미생물을 사멸시키기 위해 행하는 불활성화는 약 2 내지 8℃에서 바람직하게는 0.1% (w/v)를 초과하지 않는 최종 농도의 포름알데히드를 사용하여 밤새 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 0.04% w/w의 포름알데히드를 사용하여 상청액을 불활성화시켰다. 다당류를 회수하기 전에 바람직하게는 동결, 가장 바람직하게는 ≤ -20℃에서의 동결로 농축된 상청액을 저장할 수 있고, 이 상청액은 본 발명에 따라 제조된다면 2년 이상 동안 안정할 것이다. 한 실시양태에서, 상기 상청액은 3년 이상 동안 안정하였다.

한 실시양태에서, 발효과정 동안 ELISA를 이용하여 다당류 생산을 평가하고 상청액 중의 다당류 생산은 전형적으로 약 200 내지 400 ㎎/ℓ이고, 상기 다당류는 상대적으로 다소 높은 분자 질량 (700-800 kDa)을 가졌다.

다당류 회수

당분야의 최신 기술을 이용하여 배지, 통상적으로 상청액으로부터 다당류를 회수할 수 있다. 회수를 통해 부분적으로, 실질적으로 또는 완전하게 정제된 다당류를 얻을 수 있다. 바람직하게는, 회수를 통해 80%, 85%, 90% 또는 95%보다 더 많은 출발 다당류를 함유하는 생성물을 얻는다.
그러나, 본 발명의 방법에 따른 발효는 당분야의 최신 다당류 제조 방법과 함께 사용될 수도 있는 매우 단순한 회수 공정을 가능하게 한다. 이 단순한 회수 및 정제 공정은 페놀과 같은 유해한 화학물질을 사용하지 않는다는 점을 특징으로 한다. 게다가, 고속 원심분리 또는 초원심분리, 또는 크로마토그래피를 할 필요성이 없다. 이로 인해 경제적인 면에서 상기 정제가 유리해지는데, 이는 (한외) 고속 원심분리 또는 초원심분리, 또는 비싼 컬럼 물질에 투자할 필요성이 없기 때문이다. 본 공정은 당분야의 최신 정제 과정에서 종종 있는 경우이며 각 침전시 최대 24 시간 동안 지속되는 여러 차례의 침전의 반복이 요구되지 않는 4회의 단순한 침전 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 침전은 편리하게는 밤새, 즉 15-18시간 동안 수행한다.

이 단순한 회수 공정은

a) 양이온성 계면활성제를 사용하여 상청액으로부터 다당류 또는 오염물질의 일부를 침전시킴으로써 제1 다당류 분획을 얻는 단계;

b) 알코올을 사용하여 제1 다당류 분획으로부터 다당류를 침전시킴으로써 제2 다당류 분획을 얻는 단계;

c) 음이온성 계면활성제의 존재 하에 제2 다당류 분획을 알코올 침전시킴으로써, 다당류가 침전되는 농도 미만의 농도로 알코올이 존재하게 하는 단계;

d) 알코올을 사용하여 가용성 분획으로부터 다당류를 침전시켜 다당류 침전물을 얻는 단계; 및

e) 다당류 침전물을 용해시키고 이를 농축 및 정용여과하는 단계

를 포함한다.

a)에서 양이온성 계면활성제는 바람직하게는 약 0.01-1% (w/v)의 최종 농도의 세타블론 (Cetavlon) (헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드)인 것이 바람직하다. c)에서 음이온성 계면활성제는 바람직하게는 약 0.1-1% (w/v)의 최종 농도의 나트륨 데옥시콜레이트 (DOC)인 것이 바람직하다. 침전 단계에서 사용되는 알코올은 바람직하게는 b)에서 약 60-74% (v/v); c)에서 약 10-50% (v/v); 그리고 e)에서 약 60-85% (v/v)의 최종 농도의 에탄올인 것이 바람직하다. 각 단계에서, 고체와 유체 (펠릿과 상청액으로도 지칭됨)는 원심분리, 디칸팅 (decanting) 및 여과 중 어느 하나 또는 이들을 병용하여 분리한다. 마지막 알코올 침전 후, 펠릿은 바람직하게는 원심분리가 아니라 디칸팅을 행하여 상청액으로부터 분리한다. 임의의 단계에서, 침전된 다당류와 함께 펠릿을 사용하기 편한 임의의 용매 또는 액체, 예를 들어, 물 또는 1 몰 NaCl을 사용하여 용해시킬 수 있다. 모든 유형의 다당류에 사용할 수 있는 이 단순화된 회수 공정도 본 발명의 일부이다.

바람직하게는, 정제는 농축된 상청액을 사용하여 수행한다. 계면활성제 및/또는 에탄올의 필요량은 농축물 부피를 기준으로 한다. 그 후, 정제된 다당류는 ≤ -20℃에서 2년 이상 동안 안정하다. 한 실시양태에서, 정제된 다당류는 3년 이상 동안 안정하였다.

한 실시양태에서, 바람직하게는 정화 후, 0.65% (w/v) 세타블론 침전, 72% (v/v) 에탄올 침전, 0.5% (w/v) DOC의 존재 하의 32% (v/v) 에탄올 침전 및 64% (v/v) 에탄올 침전을 포함하는 방법을 이용하여 다당류를 회수한다.

한 실시양태에서, 다당류는 a)에서 0.04% (w/v) 세타블론 침전을 이용하여 정제한다. 그 후, 다당류는 상청액에 존재할 것이다. 알코올 침전은 알코올을 상청액에 직접 첨가함으로써 수행할 수 있다. 상기 방법의 나머지는 상술한 바와 같다.

또 다른 실시양태에서, 회수 방법은 0.65% (w/v) 세타블론 침전 및 0.04% (w/v) 세타블론 침전을 포함한다. 0.04% (w/v) 세타블론 침전은 예를 들어 64% (v/v) 에탄올 단계 후에 얻은 다당류를 추가로 정제하는 데 이용할 수 있다.

c)에서 알코올은 계면활성제의 첨가 전 또는 후에 첨가할 수 있다. 별법으로, 상기 알코올은 동시에, 즉 동시에 개별적으로 첨가하거나 혼합물로서 첨가한다. 바람직하게는, 알코올은 계면활성제 다음에 첨가한다.

본 발명의 발효 방법과 회수 방법의 병용은 고순도의 다당류를 가능하게 한다. 예를 들면, 본 발명의 방법을 병용하여 단리한 해모필러스 인플루엔자 타입 b의 피막 다당류는 컨쥬게이트 Hib 백신의 제조에 사용되는 정제된 다당류의 모든 WHO 요건을 만족시킨다.

바람직하게는, 정제된 다당류 분획은 건조 질량을 기준으로 90% (w/w) 이상의 다당류, 보다 바람직하게는 94, 95 또는 96% (w/w) 이상의 다당류를 함유한다. 내독소 함량은 다당류 분획 1 ㎍ 당 바람직하게는 10 IU 미만, 보다 바람직하게는 8 IU 미만, 5 IU 미만, 2 IU 미만 또는 1 IU 미만이고, 가장 바람직하게는 0.5 IU 미만 또는 0.2 IU 미만이다. 핵산 함량은 바람직하게는 1% (w/w) 미만, 보다 바람직하게는 0.8 (w/w) 미만이다.

백신 제조

본 발명의 방법을 이용하여 제조한 다당류를 사용하여 감염에 대해 대항할 인간 또는 동물 면역시스템의 능력을 증가시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 다당류는 인간 또는 동물 대상에게 투여할 약학 조성물의 제조에 사용할 수 있다. 다당류 또는 그의 컨쥬게이트는 예컨대, 정맥내, 복막내, 근육내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입을 이용하여 비경구 투여하는 것이 바람직하다. 다당류 또는 그의 컨쥬게이트는 당분야에 공지된 통상적인 기술을 이용하여 약학적으로 허용가능한 매질 또는 전달 비히클과 배합될 수 있다. 경구 투여가능한 조성물의 제조 방법은 당분야에 잘 공지되어 있고 예를 들어, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. AR Gennaro, 20th edition, 2000, Williams & Wilkins, PA, USA)을 비롯한 다양한 문헌에 보다 상세히 기재되어 있다. 다당류는 바람직하게는 치료 유효량, 즉 감염에 대해 대항할 인간 또는 동물 면역시스템의 능력을 증가시킬 양으로 투여한다.

바람직하게는, 다당류는 백신, 예를 들어, 다당류 컨쥬게이트 백신의 제조에 사용된다. 컨쥬게이트 백신의 제조 방법은 당분야에 공지되어 있고 예를 들어, 문헌 [Ada et al (2003) Clin. Microbiol. Infect. 9 (2): 79-85, Dick et al (1986) Contributions to Microbiology and Immunology, vol. 10: Conjugate Vaccines: 48-114, and Jennings et al (1994) Neoglycoconjugates: Preparation and Applications: 325-371]에 기재되어 있다. 컨쥬게이트 백신의 제조에 이용되는 방법에서 다소의 변경이 있다 하더라도, 제조 방법은 전형적으로

- 다당류 및/또는 단백질 운반체의 활성화

- (활성화된) 다당류와 (활성화된) 단백질 운반체의 컨쥬게이션

- 경우에 따라, 다당류-단백질 컨쥬게이트의 정제

- 경우에 따라, 다당류-단백질 컨쥬게이트의 형성

을 포함한다.

다당류는 당분야에 공지된 조절된 해중합 방법을 이용하여 컨쥬게이션 전에 일정한 분자 질량까지 크기를 줄일 수 있다. 적절한 해중합 방법은 인접 디올의 산화, 초음파처리, 및 산 또는 알칼리성 가수분해를 포함한다. 반응 전체를 통해 pH 안정성을 보증하기 위하여 알칼리성 가수분해를 완충제 중에서 용이하게 수행할 수 있다. 적절한 알칼리성 완충제는 pH가 9를 초과한, 바람직하게는 10을 초과한 0.1 내지 1 몰/ℓ의 중탄산염-탄산염 완충제이다. 이 해중합 반응은 실온에서 수행할 수 있지만, 2 내지 8℃와 같은 냉각 상태에서 바람직하게는 격렬한 교반 하에 수행하여 원하지 않는 부반응을 최소화할 수 있다.

다당류는 컨쥬게이션 전, 또는 당분야에 공지된 활성화 방법, 예를 들어 시아닐화제를 사용한 크기 축소 전에 활성화시킬 수 있다 (Kohn et al (1986) Appl. Biochem. Biotechnol. 9: 285-305). 적당한 시아닐화제에는 브롬화시아노겐 (CNBr), 1-시아노-4-(디메틸아미노)-피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP), N-시아노-N,N,N-트리에틸암모늄 테트라플루오로보레이트 (CTEA) 및 p-니트로페닐시아네이트 (pNPC)가 포함된다. 별법으로, 말단 알데히드기는 인접 디올의 산화 절단을 통해 다당류에서 형성될 수 있고, 그 다음 적절한 환원제 예를 들면, 나트륨 시아노보로하이드라이드를 사용한 환원성 아민화로 컨쥬게이션을 수행할 수 있다.

단백질 운반체는 당분야에 공지된 활성화 방법, 예를 들어, 할로게노알킬화제를 사용하여 컨쥬게이션 전에 활성화될 수도 있다 (Bernatowicz et al (1986) Anal. Biochem. 155(1): 95-102). 적절한 할로게노알킬화제는 브로모-아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르이다.

다당류는 단백질 운반체에 직접 컨쥬게이션하거나, 또는 (활성화된) 다당류 및/또는 (활성화된) 단백질 운반체에 도입되는 스페이서 또는 링커 분자를 통한 (추가) 활성화 후에 단백질 운반체에 컨쥬게이션할 수 있다. 예를 들어, 시아닐화제로 다당류를 활성화한 후, (디)아미노 또는 아미노산 스페이서, 예컨대, 시스타민 또는 글리신을 다당류에 도입할 수 있다. 일부 디아미노 스페이서를 추가로 환원시켜 자유 티올기를 생성시킬 수 있다 (de Weers et al (1998) Bioconjugate Chem. 9 (3): 309-315). 또 다른 적절한 스페이서는 이디프산 디히드라지드 (ADH)이다 (Chu et al (1983) Infect. Immun. 40(1): 245-256). 별법으로, 이들 스페이서는 아미드화 반응에 의해 단백질 운반체에 도입될 수 있다.

당분야에 공지된 정제 방법, 예를 들어, 겔 투과 크로마토그래피, 차등 침전 및 정용여과를 이용하여 과량의 스페이서를 제거할 수 있다. 적합한 정용여과 시스템은 미세다공성 막 상의 접선류 여과 (tangential flow filtration) 방식을 이용한다. 완충된 염 용액은 이 정제 과정을 촉진하는 것으로 입증된 바 있다. 적절한 용액은 약 0.5 내지 3 몰/ℓ의 염화나트륨 또는 등가염이 함유된 약 0.01 내지 0.2 몰/ℓ의 인산염 완충제이다. 이러한 방법을 이용하여, ADH와 같은 스페이서를 제거하여 다당류에 결합된 ADH가 약 0.05 내지 0.5% (w/w) 미만이 되게 오염도를 낮출 수 있다. 이러한 오염물제거는 낮은 파장, 예컨대, 약 210 내지 230 nm에 맞춰진 UV 검출기를 갖춘 고성능 겔 투과 크로마토그래피 (HP-GPC)를 이용하여 모니터링할 수 있다. 그 다음, 표준 보정을 이용하여 잔류 ADH를 정량한다.

스페이서를 다당류에 도입한 후, 카르보디이미드 아미드화제의 매개를 통해 단백질에의 컨쥬게이션을 수행할 수 있다. 적합한 아미드화제는 반응을 촉진시키기 위하여 N-히드록시숙신이미드 (NHS)에 의해 보충될 수 있는 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC)이다. 별법으로, 티오에테르 결합은 추가 시약을 사용하지 않고 티올화 다당류와 할로게노아세틸화 단백질 운반체 사이의 축합에 의해 형성될 수 있다.

카르보디이미드-매개 컨쥬게이션 반응은 약한 산성 pH, 전형적으로 pH 4 내지 6에서 일어날 수 있고, 이로써 단백질 운반체 상에서 발견되는 아미노기보다 히드라지드 스페이서기의 아미드화가 확실히 더 우세하게 일어나게 한다. 한 실시양태에서, 반응 전체에 걸쳐 pH 안정성을 보증하기 위하여 적합한 완충제에서 컨쥬게이션 반응을 일으킨다. 이것은 규칙적인 산 첨가를 하기 위하여 자동 적정기가 장착된 pH 미터에 접근하거나 투자할 필요성을 없앤다. 바람직한 실시양태에서, 카르보디이미드와 반응하여 소정의 컨쥬게이션 반응에 악영향을 주는 카르복실기가 없는 완충제를 사용한다. 예를 들면, 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 0.05 내지 0.2 몰/ℓ 및 염화나트륨 0.2 내지 1 몰/ℓ으로 구성된 pH 5.5 내지 6.1에서 완충제를 사용할 수 있다. 컨쥬게이션 반응은 반응 혼합물의 pH를 약 pH 7 이상이 되게함으로서 추가 카르보디이미드-매개 아미드화를 방해하거나 급격히 그 속도를 늦추는 알칼리 또는 알칼리성 완충제를 첨가하여 컨쥬게이션 반응을 켄칭시킬 수 있다. 적절한 알칼리성 완충제는 반응 혼합물을 약 pH 7로 중화시키기에 충분한 양으로 첨가되는 약 0.1 내지 0.4 몰/ℓ의 pH 8 내지 9의 인산염 완충제이다.

겔 투과 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 차등 침전 및 정용여과와 같은 당분야에 공지된 정제 방법을 이용하여 미반응 다당류 및 단백질을 제거할 수 있다. 적합한 겔 투과 크로마토그래피 시스템은 용출제로서 중성 완충 식염수와 함께 세파로스 CL-4B, 세파크릴 S-500HR (아머샴) 또는 등가 겔 매질을 사용한다. 적합한 소수성 상호작용 크로마토그래피 시스템은 결합 용출제로서 중성 완충 황산암모늄 용액과 함께 부틸, 옥틸-, 또는 페닐 세파로스 6 고속류 (아머샴) 또는 등가 겔 매질을 사용한다. 적합한 차등 침전 시스템은 농축된 황산암모늄 용액을 사용한다. 미반응 잔류 다당류 및 단백질은 280 nm로 맞춰진 UV 검출기 및 미분 굴절률 검출기를 갖춘 고성능 겔 투과 크로마토그래피 (HP-GPC)를 이용하여 검출 및 정량할 수 있다. 잔류 미반응 다당류는 컨쥬게이트의 침전 후 특이적 비색 분석시험을 이용하여 정량할 수도 있다.

컨쥬게이트의 제조는 문헌 (US 4,356,170, US 4,644,059, US 4,673,574, US 4,695,624, US 4,902,506, US 7,667,170, EP 0 161 188, EP 0 477 508 및 EP 0 848 O11)에도 기재되어 있다.

바람직하게는 폴리리보실 리비톨 포스페이트 (PRP)인 다당류를 임의의 단백질 운반체에 커플링할 수 있다. 적합한 단백질 운반체는 그의 면역원성을 증가시키고 면역원성 막 단백질, 바이러스성 단백질 서브-유니트, 합성 폴리펩티드 및 다른 면역원성 단백질을 포함한다. 가장 바람직하게는, 단백질 운반체는 톡소이드(toxoid)이다. 컨쥬게이트 백신에 사용되는 잘 공지되어 있는 톡소이드는 파상풍 톡소이드 및 디프테리아 톡소이드이다.

본 발명의 방법을 이용하여 제조한 다당류는 1가 백신을 제조하는 데 사용할 수 있다. 1가 백신의 적절한 예로는 해모필러스 인플루엔자 타입 b (Hib)에 대해서만 대항하는 다당류 또는 컨쥬게이트 백신이다. 별법으로, 본 발명의 다당류는 다가 백신을 제조하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 다당류를 사용하여 디프테리아-파상풍-소아마비-Hib 또는 디프테리아-백일해-파상풍-Hib와 같은 4가 백신, 또는 디프테리아-백일해-파상풍-소아마비-Hib 또는 디프테리아-백일해-파상풍-B형 간염-Hib와 같은 5가 백신을 제조할 수 있다.

백신은 임의의 편리한 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들면, 1가 Hib 백신은 락토스와 같은 안정화제 또는 인산알루미늄과 같은 보조제가 첨가되거나 첨가되지 않은 상태의 동결-건조 형태 또는 액체 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 제조 방법이 다른 다당류 함유 미생물로부터 다당류를 제조하는 데 이용할 수도 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

실시예 1 해모필러스 인플루엔자 타입 b의 생장 시험

NOVO 조절 시스템을 갖춘 50 ℓ 생물반응기 (작동 부피 40 ℓ)를 사용하여, 암스테르담에서 단리된 해모필러스 인플루엔자 타입 b 균주 (A760705)를 배양하였다. 면역- 및 혈청형결정 및 형태학 시험과 같은 통상적으로 이용되는 시험을 이용하여 이 균주가 해모필러스 인플루엔자 타입 b임을 확인하였다. 생물반응기를 먼저 기초 배지 (표 1의 화합물 1 내지 5가 35.5 ℓ에 용해됨)로 채운 후 110℃에서 20분 동안 원위치에서 멸균하였다. 접종 직전에, 적당량의 원액을 상기 배지에 첨가하였다 (표 2 참조). 1 ℓ 예비-배양물을 사용하여 상기 생물반응기를 접종하고, 상기 배지 및 -70℃에서 동결된 Hib 균주의 시드 랏 (seed lot)을 사용하여 3.5 ℓ 규모로 배양하였다.

5 몰/ℓ NaOH를 사용하여 pH를 7.0으로 일정하게 유지하였다. 온도를 35℃로 일정하게 유지하였다. 5 ℓ/분의 기류를 사용하는 헤드스페이스를 통과하는 공기 및 산소를 사용하여 용존 산소 (DO)를 30%로 일정하게 유지하였다. 교반기 속도를 300 rpm에서 700 rpm까지 점점 증가시켰다.

자동 샘플러를 사용하여 여러 상이한 샘플을 얻었다. 590 nm (OD₅₉₀)에서의 광학 밀도, pH 및 PRP 농도를 측정함으로써 배양을 모니터링하였다 (도 1 참조). 배양물의 세포용해를 모니터링하기 위하여, 다수의 샘플의 그람 염색을 조절하였다.

먼저, 생장에 다소 평행한 PRP 농도를 약 320 ㎎/ℓ까지 증가시켰다. pH는 약 7 시간 배양 후에 증가시키기 시작하고, OD₅₉₀은 그의 최적값인 6.88이었다. 약 12 시간 배양 후, pH는 다소 증가하고 OD₅₉₀은 다소 감소하고 세포의 용해가 서서히 개시되는 한편, PRP는 330 ㎎/ℓ에서 다소 일정하였다. 16 시간 배양 후, 세포는 아직 전체적으로 용해되지 않았고 pH는 7.92이었다.

배지 조성

번호	화합물	농도(g/ℓ)
1	L-글루탐산	1.3
2	Na₂HPO₄.2H₂O	2.5
3	KCl	0.09
4	NaCl	6
5	NH₄Cl	1.25
6	효모추출물 (저분자 질량 분획만 <30 kDa)	10
7	시스틴	0.015
8	MgSO₄.7H₂O	0.6
9	덱스트로스	5
10	헤민	0.005
11	NAD	0.002

주: 화합물 1 내지 5는 pH가 7.5로 맞춰진 후 물에 용해하고 멸균하여 저장할 수 있다 (기초 배지). 화합물 6 내지 11은 개별적으로 저장한다 (하기 표 2).

실온에서 2 시간을 초과한 시간의 경과 후, 세포의 전체 용해가 관찰되었고, pH는 8.43이었고 OD₅₉₀은 4.08이었다. PRP 농도는 전체 세포용해로 인해 480 ㎎/ℓ이었다.

제조 배지용 원액

원액	화합물	배지 (g/ℓ)	원액 (g/ℓ)	㎖ 원액/ℓ
1	6: 효모 추출물	10	120	83.33
2	7: 시스틴	0.015	0.6	25
	8: MgSO₄.7H₂O	0.6	24
	9: 덱스트로스	5	200
3	10: 헤민	0.005	1	5
4	11: NAD	0.002	0.4	5

본 실험은 Hib 배양을 모니터링하기 위한 것이고, 상청액은 상기 방법에 따라 정제되지 않았다.

본 배양의 최적 수확 시기는 배양한 지 약 10 시간 후이었다. 세포용해를 지연하기 위하여, 배양물을 배양 온도보다 더 낮은 온도로 냉각시킬 수 있었고, 냉각시키는 동안 약간 더 많은 PRP가 분비될 수 있었다. 대수기에서의 수확은 낮은 PRP 농도를 의미할 것이다.

실시예 2 폴리리보실 리비톨 포스페이트 ( PRP )의 생산

350 ℓ의 규모로 실시예 1의 조건 하에 PRP를 생산하였다. 모든 세포가 용해될 때까지 배양을 계속하지는 않았지만, 생물반응기 재킷을 통해 수도물을 사용하여 냉각을 개시함으로써 7.43의 pH 및 4.4의 OD₅₉₀에서 8.3 시간 후에 배양을 중지하였다. 연속적인 원심분리를 이용하여 1.5 시간 후에 배양물을 수확하였다. 수확 개시 시점에서, 상청액 중의 PRP 농도는 277-377 ㎎/ℓ이고, 배양 온도는 19℃이었다. 약 0.1% (v/v)의 농도까지 2.7 몰/ℓ의 포름알데히드 용액을 상청액에 첨가함으로써 상청액을 불활성화시켰다. 상청액을 약 9.6 ℓ까지 농축하고 PBS를 사용하여 정용여과하였다. 농축된 상청액은 ≤-20℃에 저장하였다.

실시예 3 폴리리보실 리비톨 포스페이트 ( PRP )의 정제

배양한 지 4개월 후 도2의 방법을 이용하여, 실시예 2로부터 얻은 1.5 ℓ의 농축된 상청액을 정제하였다.

정제 후, 각각 30 ㎖의 순수한 PRP 액체를 함유하는 12개의 플라스크를 동결 건조하여 건조 질량을 기준으로 순도를 측정하였다 (WHO TRS 814 Annex 1 1991및 TRS 897 Annex 1, 2000).

모든 샘플 (IPC 샘플을 비롯한 액체 및 동결-건조 샘플)을 PRP, 핵산 및 단백질 함량에 대해 분석하였다. 또한, HP-GPC (Hennessey et al (1993) J. Liq. Chromatogr. 16 (8): 1715-1729), NMR (Lemercinier et al (2000) Biologicals 28 (3): 175-183) 및 UV 분광기를 이용하여 정제된 PRP를 분석하였다. 비색 분석시험을 이용하여 리보스 (오르시놀 반응: Ashwell et al (1957) Meth. Enzymol. III: 73-105), 인 (Ames et al (1966) Meth. Enzymol. VIII : 115-118) 및 잔류 단백질 (Lowry et al (1951) J. Biol. Chem. 193: 265-275)을 측정하였다. LAL 분석시험으로 내독소를 측정하였다.

정제된 PRP의 조성은 표 3을 참조한다. PRP의 상대 분자 질량은 765 kDa이었다. PRP는 컨쥬게이트 Hib 백신의 제조에 사용되는 정제된 다당류의 모든 WHO 요건을 충족시켰다. 오르시놀 분석시험을 기준으로 한 정제 수율은 80%이었다. 최종 생성물 중의 DOC 농도는 5 ㎍/㎖ (검출 한계)보다 더 낮았고, 포름알데히드는 0.005 nmol/ℓ보다 더 낮았다.

정제된 PRP의 조성

성분	PRP 조성	WHO 요건
총 질량 (g); 100%	7.39	-
건조 질량 (%)	98.62	-
PRP (%)	96.81	-
인 (%)	7.84	6.8-9
펜토스 (%)	35.22	32-38
핵산 (%)	0.75	<1
단백질 (%)	0.33	<1
내독소 (IU/㎍)	0.11	<10

IU = 국제 유니트

실시예 4 폴리리보실 리비톨 포스페이트 ( PRP )의 활성화

100 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 필터 카트리지를 갖춘 접선류 여과 시스템을 이용하여 PRP (1.023 g; 내독소: PRP 1 ㎍ 당 0.02 IU)를 ~10 g/ℓ까지 농축하였다. 회수: 999 ㎎ (98%). 이어서, PRP 농축물을 재킷이 갖춰진 용기로 옮기고 ~4℃로 냉각시켰다. 그 다음, 동일 부피의 미리-냉각된 중탄산나트륨염/탄산나트륨염 완충제 (0.4 mol/ℓ, pH 10.5)를 신속히 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 격렬한 교반 (~400 rpm) 하에 90 분 동안 ~4℃에서 유지하였다. PRP의 평균 상대 분자 질량 (M _r)의 감소를 HP-GPC로 모니터링하였다.

이 알칼리성 분해 단계의 말기에, CNBr (아세토니트릴 중의 5 mol/ℓ)를 첨가하였다 (PRP 1 g 당 2.2 ㎖). 이전 조건을 10분 더 유지하였다. 그 후, 중탄산염 용액 (1 mol/ℓ) 중의 미리-냉각한 ADH (PRP 1 g 당 18 g) 시약 3 부피 30 g/ℓ을 신속히 첨가하였다. 이전 조건을 (pH ~9에서) ~16 시간 더 유지하였다.

이어서, 10 kDa MWCO 필터 카트리지가 장착된 TFF 시스템을 이용하여, 활성화된 PRP (PRP-ADH)를 ~20 g/ℓ까지 농축하였다. 그 다음, 광범위한 정용여과를 수행하여 과량의 시약, 주로 ADH를 제거하였다. 제1 단계에서는 ~20 부피의 인산나트륨 완충제 (0.1 mol/ℓ, pH 7.2; NaCl 1.5 mol/ℓ을 함유함)를 사용하였다. 표준 보정 곡선에 비례하여, 215 nm에서 HP-GPC로 과량의 ADH 제거의 진행을 추적하였다. 과량의 ADH가 총 ADH의 0.05% (w/w) 미만이었을 때, ~5 부피의 MES 완충제 (0.1 mol/ℓ, pH 6.1; 0.5 mol/ℓ의 NaCl을 함유함)로 정용여과를 계속하였다. 그 후, PRP-ADH를 ~25 g/ℓ의 어림 농도까지 농축하였다. 농축된 PRP-ADH를 리보스 및 아미노기에 대해 분석하고 (TNBS 반응: Habeeb et al (1966) Anal. Biochem. 14: 328-336), 2 내지 8℃에서 저장하였다. 회수: 764 ㎎ (75%). 활성화 비율: ADH 기 당 또는 1.9% (w/w) ADH 당 25 PRP 반복 유니트 (RU).

실시예 5 활성화된 폴리리보실 리비톨 포스페이트 (PRP-ADH)와 파상풍 톡소이드 (TTd)의 컨쥬게이션

TFF 시스템 (10 kDa MWCO 필터 카트리지)로 파상풍 톡소이드 (TTd; 1.327 g; 1,623 Lf/㎎ PN; 1,900 Lf/㎖)를 ~20 g/ℓ까지 농축하였다. 그 다음, ~5 부피의 MES 완충제 (pH 6.1)로 정용여과를 수행하여 부분적으로 과량의 배지 성분을 제거하였다. 이어서, TTd를 ~30 g/ℓ의 어림 농도까지 농축하였다. 농축된 TTd를 단백질 함량 (로우리 반응)에 대해 분석하고 2 내지 8℃에서 저장하였다. 회수: 1.186 g (89%).

그 후, PRP-ADH 농축물 (707 ㎎)을 재킷이 갖춰진 반응기로 옮기고, ~4℃까지 냉각시켰다. 이어서, TTd 농축물 (786 ㎎)을 첨가하고, 생성 혼합물을 약한 교반 (~200 rpm) 하에 ~4℃까지 냉각시켜 발포를 방해하였다. 그 후, MES 완충제 (pH 6.1) 중의 미리-냉각된 EDC 시약 100 g/ℓ을 첨가하였다 (TTd 1 g 당 1 g). 마지막으로, MES 완충제 (pH 6.1)를 첨가하여 총 부피를 완성하였다. 약한 교반 하에 반응 혼합물 (0.93 w/w의 PRP/TTd 비율)을 ~4℃로 유지하였다. 280 nm에서 HP-GPC에 의해 측정된 잔류 TTd 함량이 4.4%가 될 때인 3시간 30분 후에 반응을 중단하였다. 동일 부피의 인산나트륨 완충제 (0.1 mol/ℓ, pH 8.0; EDTA 0.005 mol/ℓ를 함유함)를 첨가하여 반응을 켄칭한 후 2 내지 8℃에서 저장하였다.

실시예 6 다당류-단백질 컨쥬게이트의 정제

0.45 ㎛ 인-라인 필터 유니트 상에서 컨쥬게이션 혼합물을 정화하였다. 그 다음, 세파로스 CL-4B (아머샴 파마샤 바이오테크)로 팩킹되어 있고 6 ㎖/분의 유속의 인산나트륨 완충제 (0.1 mol/ℓ, pH 7.0; 0.005 mol/ℓ의 EDTA를 함유함)로 용출되는 GPC 컬럼 (4.4 ㎝ 직경, 45 ㎝ 팩킹 층 높이) 상에서 5개의 동일한 분획으로 상기 혼합물을 정제하였다. 미분 굴절률, UV (226 nm) 및 전도율 검출기를 이용하여 용출을 모니터링하였다. ~0.9 CV에서 2 분마다 분획을 모았다. 그 후, 제1 런 (run)의 분획을 리보스 및 단백질 함량에 대해 분석하고 (BCA 반응: Smith et al (1985) Anal. Biochem. 150(1): 76-85), 2 내지 8℃에서 저장하였다. 리보스 (187 ㎎ PRP) 및 단백질 (440 ㎎ TTd)를 함유하는 제1 피크에 상응하며 균일한 PRP/TTd 비율 (0.43 w/w)을 가진 분획을 모든 런으로부터 풀링하였다 (pool 1): 이것이 나중에 백신 제조에 사용되는 높은 M _r 컨쥬게이트 풀이다. 컨쥬게이션되지 않은 PRP를 주로 포함하는 잔류 분획도 풀링하여 (pool 2) 질량 평균을 계산하였다: 이 풀은 배지 및 낮은 M _r 컨쥬게이트, 자유 (즉, 컨쥬게이션되지 않은) PRP-ADH 및 자유 TTd를 함유한다. 질량 평균은 컨쥬게이션 출발 물질의 양을 기준으로 78% PRP 및 76% TTd이었다 (표 4 참조). 그 다음, TFF 시스템 (10 kDa MWCO 필터 카트리지)으로 높은 M _r 컨쥬게이트 풀 (풀 1)을 ~4 g/ℓ까지 농축하였다. 이어서, ~10 부피의 트리스 완충제 (0.02 mol/ℓ; pH 7.0)로 정용여과를 행하였다. 그 후, 완충제-교환 컨쥬게이트 (PRPTTd)를 ~1 g/ℓ까지 농축하고, 0.22 ㎛ 인-라인 필터 유니트 상에서 여과하여 멸균하였다. 그 다음, 멸균된 농축 PRPTTd 벌크 (bulk)를 리보스 및 단백질 함량 (BCA 반응)에 대해 HP-GPC로 분석한 다음, 2 내지 8℃에서 저장하였다. 회수: 170 ㎎ PRP (22%) 및 372 ㎎ TTd (45%). 최종 PRP/TTd 비율은 0.46 (v/w) (WHO 요건: 0.3-0.6)이고 내독소 함량은 1 ㎍의 PRP 당 6.58 IU이었다. 분석 결과 자유 PRP (Guo et al (1998) Biologicals 26(1): 33-38)는 12.7% (WHO 요건: < 20%)이었다. 그 후, 멸균된 농축 PRPTTd 벌크의 안정성은 2 내지 8℃에서 저장하면서 총 6개월 동안 연구하였다.

PRPTTd의 회수 및 질량 평균

	PRP		TTd		PRP/TTd (w/w)	WHO 요건 (w/w)
	(㎎)	(%)	(㎎)	(%)	PRP/TTd (w/w)	WHO 요건 (w/w)
초기 혼합물	768	100	829	100	0.93	-
GPC 풀 1	187	24	440	53	0.43	-
GPC 풀 2	415	54	188	23	-	-
질량 평균	602	78	628	76	-	-
멸균 최종 용적	170	22	372	45	0.46	0.3-0.6

주: 상대 분자 질량 (Mr)은 OHpak (쇼덱스) SB-805 및 SB-804 HP-GPC 컬럼 상에서 순수한 풀루란 (pullulan) 표준물에 대하여 측정하였다. 검출: 미분 굴절률 및 UV (215 및 280 nm). M _r 계산은 UV 280 nm 신호를 기준으로 하였다.

실시예 7 다당류-단백질 컨쥬게이트의 1가 Hib -백신으로의 형성

또 다른 실험에서, 멸균된 농축 PRPTTd 벌크 (121 ㎎ PRP; 348 ㎎ TTd; PRP/TTd 비율 0.35 w/w; 1.9% 자유 PRP, 1 ㎍의 PRP 당 7.27 IU의 내독소)를 트리스 완충제 및 슈크로스를 사용하여 동결건조용 제제로 제제화하였다. 벌크 백신을 먼저 트리스 완충제 (0.1 mol/ℓ; pH 7.0)로 희석한 후, 슈크로스를 첨가하고 (0.5 mol/ℓ), 주사용 물을 첨가하여 총 부피를 완성하였다. 1.4 ㎖ 분획을 다회 투여량의 백신 바이알로 옮긴 후, 동결건조를 행하였다. 자동 충진 공정에 본질적인 손실로 인해, 총 7,500 주사가능한 투여량 (즉, 바이알 당 5)의 경우 ~1,500개의 다회 투여량 바이알을 최종적으로 얻었다. 각 바이알은 ㎖ 당 8-12 ㎍ PRP의 인체 투여량을 함유하였고, 이것은 NaCl 용액으로 재구성된다. 이어서, 동결건조된 PRPTTd 백신의 안정성을 정상 실온에서 및 37℃에서 스트레스 조건 하에 18개월 (총 36개월 동안으로 계획되었음) 동안 연구하였다 (표 5 참조). 유리 전이 온도 (DSC에 의해 측정됨)는 약 63℃로 높게 유지되고, 동결건조된 백신이 안정한 물리적 상태로 있다는 것을 보여주면서 일정하게 유지되었다. 자유 PRP의 측정을 위해, 원심분리성 한외여과 장치 (10 kDa MWCO)를 사용한 완충제 교환으로 슈크로스를 먼저 제거해야 했다. 멸균된 농축 PRPTTd 벌크의 안정성도 총 6개월 동안 연구하였다 (표 5 참조). 이들 연구과정 동안, M _r은 일정하게 유지되고, 자유 PRP의 유의한 증가는 관찰되지 않았다.

PRPTTd의 안정성

	M _r (kDa)	자유 PRP (%)	유리 전이 (℃)	pH
멸균 최종 벌크
t = 0	1,463	1.9	-	7.00
t = 4 주	검출 불가	1.8	-	7.00
t = 24 주	1,439	2.7	-	6.90
동결건조된 백신
t = 0	1,381	10.1	64	6.56
t = 3 개월	1,325	n.a.	-	-
t = 6 개월	1,396	5.5	-	-
t = 12 개월	1,306	6.3	-	-
t = 18 개월	1,334	5.7	-	-
스트레스 연구 (37℃) (동결건조된 백신)
t = 1 주	1.337	6.9	63	-
t = 4 주	1,337	4.1	63	-
WHO 요건		<20	-	-

주: 동결건조된 백신 중의 자유 PRP 측정은 완충제 교환에 의한 과량의 슈크로스 제거 후에만 가능하다. 높은 값 (>10%)은 부분적으로는, 리보스에 대한 오르시놀 분석시험을 방해하는 잔류 슈크로스 때문이다. M _r 계산: 표 4 참조. 유리 전이는 시차 주사 열량계 (DSC)를 사용하여 측정하였다.

Claims

- 양이온성 계면활성제를 사용하여 상청액으로부터 다당류 또는 오염물의 일부를 침전시켜 제1 다당류 분획을 얻는 단계;

- 알코올을 사용하여 제1 다당류 분획으로부터 다당류를 침전시켜 제2 다당류 분획을 얻는 단계;

- 음이온성 계면활성제의 존재 하에 제2 다당류 분획을 알코올 침전시켜 다당류가 침전되는 농도 미만의 농도로 알코올이 존재하게 하는 단계;

- 알코올을 사용하여 가용성 분획으로부터 다당류를 침전시켜 다당류 침전물을 얻는 단계; 및

- 다당류 침전물을 용해하고 이것을 농축 및 정용여과하는 단계

를 포함하는, 발효 브로쓰로부터 다당류를 회수하는 방법.
제1항에 있어서, 양이온성 계면활성제는 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 음이온성 계면활성제는 나트륨 데옥시콜레이트를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 음이온성 계면활성제는 최종 농도가 0.1~1 % w/v인 방법.
제1항에 있어서, 알코올은 에탄올을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 알코올을 사용하여 제1 다당류 분획으로부터 다당류를 침전시켜 제2 다당류 분획을 얻는 단계 중에서, 알코올은 최종 농도가 60~74 % v/v인 방법.
제1항에 있어서, 음이온성 계면활성제의 존재 하에서 제2 다당류 분획을 알코올 침전시키는 단계 중에서, 알코올은 최종 농도가 10~50 % v/v인 방법.
제1항에 있어서, 가용성 분획으로부터 다당류를 침전시키는 단계 중에서 사용된 알코올은 최종 농도가 60~85% v/v인 방법.
제1항에 있어서, 상기 다당류는 해모필러스 인플루엔자 타입 b로부터 얻는 것인 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제