KR20180120482A - 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 스트렙토코커스 뉴모니아로부터 협막 다당체를 생산하기 위한 배지 성분을 최적화하여 협막 다당체의 생산성을 향상시키고, 기존 공정에서 pH나 온도 조절 단계, 한외여과 공정을 생략하여 협막 다당체의 분리 정제 공정을 간소화하여 시간을 단축시킴으로써, 협막 다당체를 고수율, 고순도로 생산할 수 있으며, 이를 백신 조성물 제조에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 고수율, 고순도로 수득할 수 있는 생산 방법에 관한 것이다.
스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)는 그람 양성균으로서, 사람에서 폐렴, 균혈증, 중이염, 뇌막염 등의 질병을 일으킨다. 스트렙토코커스 뉴모니아의 혈청형 세포는 각 세포의 주변을 감싸는 다당체 코팅인 협막을 가지며, 이러한 다당체 협막은 발병인자로서 혈청형을 결정하는 것으로 알려져 있다. 현재 약 90여개의 혈청형이 밝혀져 있으며, 세계적으로 11개의 혈청형이 침습성 질환의 약 70%~93%를 차지하는 것으로 보고되었다. 다당체 협막은 혈청형에 따라 병독력이 다르며 지역사회획득 폐렴, 균혈증, 수막염 등의 침습성 질환과 중이염, 부비강염 등의 비침습성 국소감염질환을 일으킨다. 국내에서 지역사회획득 폐렴은 항생제 치료에도 불구하고 사망률이 12~14%에 이르며 감염성 질환 중 가장 흔한 사망원인 중 하나이다.
이러한 협막 다당체는 백신 제조에 사용되고 있으며, 현재 사용되는 백신에 포함된 혈청형의 수는 백신에 따라 다양하지만 기본적으로 침습성 폐렴질환을 유발하는 혈청형을 포함한다. 1920년대 이후 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체 백신은 다양한 혈청형에 대하여 개발되었다. 1977년부터 14가 협막 다당체 백신이 사용되었고 1983년부터 현재까지 23가지 혈청형(1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F)의 협막 다당체를 항원으로 하여 제조된 백신이 사용되고 있다. 그러나, 23가지 혈청형에 대한 각각의 항체 생성률이 일정하지 않고, 노인이나 만성 질환자 또는 면역 저하자의 경우에는 항체 생성률이 떨어지는 한계점이 있다. 또한 T 세포 비의존성 면역반응에 의해서만 항체가 생성되므로 면역계 발달이 미숙한 2세 미만의 영유아에서는 항체가 생성되지 않아 백신효과가 적은 문제점 또한 발견되어 현재는 거의 성인에게만 사용되고 있다.
상기 단점을 극복하고자 각 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체와 전달 단백질을 결합시켜 제조하는 스트렙토코커스 뉴모니아 접합 백신이 개발되었다. 현재까지 개발되어 사용된 스트렙토코커스 뉴모니아 접합 백신은 PCV-7(Prevnar, Wyeth, 2000년), PCV-10(Synflorix, GSK, 2009년), PCV-13(Prevnar13, Pfizer, 2010년) 등으로 영유아에서 감염을 잘 일으키는 주요 혈청형을 선택하였고, 각 백신에 따라 다당체의 크기, 다당체/단백질의 비율, 다당체와 단백질의 결합 방법, 면역 보강제의 포함 여부 등에 차이가 있다.
접합 백신이 도입된 후 이들 백신에 포함된 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체 혈청형에 의한 침습성 감염질환이 99% 감소하였지만 93가지 혈청형에 대해 모두 방어할 수 없으며 비백신 혈청형이 차지하는 비율이 증가하는 추세를 보이고 있어, 보다 많은 혈청형에 대해 효과를 보이는 단백질 접합 백신에 대한 개발이 필요한 실정이다.
스트렙토코커스 뉴모니아 접합 백신의 개발과정은 스트렙토코커스 뉴모니아의 배양과 그 협막 다당체의 정제 공정을 통해 순수하게 분리 정제된 다당체와 전달 단백질을 접합시키는 과정을 포함하는데, 이를 위한 가장 중요한 단계는 고생산성, 고순도의 협막 다당체의 분리 정제 공정이다. 특히, 혈청형별로 그 협막 다당체 당쇄의 크기와 모양이 달라 동일한 정제 공정으로는 고순도의 정제가 어렵다고 알려져 있다. 따라서, 다양한 혈철형에 적용하기 위해 스트렙토코커스 뉴모니아 용해물로부터 단백질 및 불순물을 제거하는 개선된 방법이 요구된다. 일반적으로 스트렙토코커스 뉴모니아의 협막 다당체는 숙주세포에 감염을 일으키는 과정인 침윤과 콜로니화(colonization) 과정에서 면역체계의 식균작용을 회피하는 중요한 병원성 인자 중 하나이며 숙주의 환경에 따라 다른 형태를 나타내는데, 특히 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 3형의 경우 두꺼운 협막 다당체를 갖고 있어 배양 시 낮은 성장과 함께 배양액의 점성도가 높아져 원심분리 및 초기 정제 공정에 어려움이 있다.
따라서 다양한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 효율적으로 생산할 수 있는 생산 공정에 대한 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 다양한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 효과적으로 생산할 수 있는 방법을 연구한 결과, pH 및 온도 조절 단계 없이도 고순도, 고수율로 다양한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 생산할 수 있는 방법을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 스트렙토코커스 뉴모니아를 배양하는 단계; (b) 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 불활화하고 생물학적 계면활성제를 첨가하여 협막 다당체를 회수하는 단계; (c) 상기 (b) 단계로부터 얻은 회수물에 양쪽성 계면활성제를 처리하여 협막 다당체를 침전시키고 침전물을 회수하는 단계; (d) 상기 (c) 단계로부터 얻은 회수물에 음이온성 계면활성제를 처리하여 불순물을 침전시키고 상등액을 얻는 단계; (e) 상기 (d) 단계로부터 얻은 상등액을 원심분리하여 협막 다당체를 침전시키고 침전물을 회수하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계로부터 얻은 회수물을 한외여과 및 크로마토그래피로 정제하는 단계;를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 스트렙토코커스 뉴모니아를 배양하는 단계; (b) 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 불활화하고 생물학적 계면활성제를 첨가하여 협막 다당체를 회수하는 단계; (c) 상기 (b) 단계로부터 얻은 회수물에 양쪽성 계면활성제를 처리하여 협막 다당체를 침전시키고 침전물을 회수하는 단계; (d) 상기 (c) 단계로부터 얻은 회수물에 음이온성 계면활성제를 처리하여 불순물을 침전시키고 상등액을 얻는 단계; (e) 상기 (d) 단계로부터 얻은 상등액을 원심분리하여 협막 다당체를 침전시키고 침전물을 회수하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계로부터 얻은 회수물을 한외여과 및 크로마토그래피로 정제하는 단계; 를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 스트렙토코커스 뉴모니아로부터 협막 다당체를 생산하기 위한 배지 성분을 최적화하여 협막 다당체의 생산성을 향상시키고, 기존 공정에서 pH나 온도 조절 단계, 한외여과 공정을 생략하여 협막 다당체의 분리 정제 공정을 간소화하여 시간을 단축시킴으로써, 협막 다당체를 고수율, 고순도로 생산할 수 있으며, 이를 백신 조성물 제조에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 스트렙토코커스 뉴모니아 15종의 성장 곡선을 나타낸 도이다.
도 2는 별도의 pH 조절 단계 및 가열 단계를 불포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 다양한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 생산하기 위한 방법의 단계를 간략히 나타낸 도이다.
도 3은 15종의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체 혈청형별 협막 다당체 함량을 나타낸 도이다.
도 4는 별도의 pH 조절 단계 및 가열 단계를 불포함하고, 수득된 상층액의 농축 단계 및 초기 한외 여과 공정까지 추가적으로 생략된 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 다양한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 생산하기 위한 방법의 단계를 간략히 나타낸 도이다.
도 5는 기존에 알려진 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법을 간략히 나타낸 도이다.
도 2는 별도의 pH 조절 단계 및 가열 단계를 불포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 다양한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 생산하기 위한 방법의 단계를 간략히 나타낸 도이다.
도 3은 15종의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체 혈청형별 협막 다당체 함량을 나타낸 도이다.
도 4는 별도의 pH 조절 단계 및 가열 단계를 불포함하고, 수득된 상층액의 농축 단계 및 초기 한외 여과 공정까지 추가적으로 생략된 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 다양한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 생산하기 위한 방법의 단계를 간략히 나타낸 도이다.
도 5는 기존에 알려진 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법을 간략히 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 스트렙토코커스 뉴모니아를 배양하는 단계; (b) 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 불활화하고 생물학적 계면활성제를 첨가하여 협막 다당체를 회수하는 단계; (c) 상기 (b) 단계로부터 얻은 회수물에 양쪽성 계면활성제를 처리하여 협막 다당체를 침전시키고 침전물을 회수하는 단계; (d) 상기 (c) 단계로부터 얻은 회수물에 음이온성 계면활성제를 처리하여 불순물을 침전시키고 상등액을 얻는 단계; (e) 상기 (d) 단계로부터 얻은 상등액을 원심분리하여 협막 다당체를 침전시키고 침전물을 회수하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계로부터 얻은 회수물을 한외여과 및 크로마토그래피로 정제하는 단계; 를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법을 제공한다.
본 발명의 생산 방법은 스트렙토코커스 뉴모니아의 배양 및 이로부터 생산되는 협막 다당체의 정제를 모두 포함하는 의미로 사용되며, 상기 방법은 도 5에 나타낸 기존 방법과 비교하여, 가열, pH 조절 단계가 없을 뿐만 아니라, 수득된 상층액의 농축 단계 및 초기 한외 여과 공정까지 추가적으로 생략된 것을 특징으로 할 수 있으며, 이와 같은 단계의 생략에도 불구하고 기존 공정 대비 고순도로 다양한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 수득할 수 있는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 각 단계를 상세히 설명한다.
본 발명의 (a) 단계는, 스트렙토코커스 뉴모니아를 배양하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 동물 유래 성분, 예컨대 동물 유래 혈청 등이 포함되지 않는 배지를 사용하여 이루어지는 것이 바람직하다.
동물 유래 성분을 포함하는 배지, 예컨대 BHI 배지는 기존에 스트렙토코커스 뉴모니아를 배양할 때 사용하는 배지로 널리 알려져 있다. 이 배지내의 화학적으로 정의되지 않은 많은 성분들(예: 혈청, 혈액 성분 등)로 인해 박테리아의 생장에 필요한 성분을 확인하는데 어려움이 있으며, 동물 유래 성분에 포함된 단백질은 박테리아 세포 표면의 화학적 환경 변화를 가져온다. 이들이 배지 성분에 포함될 경우 화학적으로 알 수 없는 많은 변화를 초래하며, 나아가 동물유래 성분의 제거를 위해 정제 공정을 복잡하게 만들고, 최종적으로 정의할 수 없는 다양한 면역학적 반응을 가져오는 문제점을 갖는다. 이러한 문제점들을 해결하고자 동물 유래 성분을 포함하는 배지를 대체할 수 있는 새로운 조성의 배지를 개발함으로써 스트렙토코커스 뉴모니아로부터 협막 다당체 생산의 최적 배양조건을 확립하여 협막 다당체의 생산성을 향상시킬 수 있다.
따라서 본 발명의 배양은 동물 유래 성분이 포함되지 않으며, 스트렙토코커스 뉴모니아의 다양한 혈청형을 모두 효과적으로 배양할 수 있는 배지를 이용하여 배양되는 것이 바람직하며, 바람직하게는 소야 펩톤, 효모 추출물, K2HPO4, 글루코오스 및 NaHCO3를 포함하는 배지를 사용하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 혈청형 6B를 기준으로 배지 1리터 당 소야 펩톤(Soya peptone) 30g, 효모 추출물(Yeast extract) 20g, NaCl 2.5g, K2HPO4 0.5g, MgSO47H2O 0.4g, CaCl2 0.01g, L-시스테인 HCl 0.15g, (D+)글루코오스 5g, NaHCO3 0.22g을 포함하는 합성배지를 이용하였다.
본 발명의 배양은 종 배양과 본 배양을 통해 이루어질 수 있으며, 상기와 같은 최적의 합성 배지를 사용함에 따라, (a) 단계에 의해 배양된 스트렙토코커스 뉴모니아는 혈청형과 무관하게 모두 협막 다당체를 효과적으로 생산할 수 있는 특징을 가질 수 있다. 상기 스트렙토코커스 뉴모니아는 이에 제한되는 것은 아니나 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F 혈청형일 수 있다.
본 발명의 (b) 단계는, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 불활화하고 생물학적 계면활성제를 첨가하여 협막 다당체를 회수하는 단계이며, 본 발명의 (c) 단계는, 상기 (b) 단계로부터 얻은 회수물에 양쪽성 계면활성제를 처리하여 협막 다당체를 침전시키고 침전물을 회수하는 단계이다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 생산 방법은 (b) 단계와 (c) 단계 사이에 한외여과 수행단계가 생략된 것을 특징으로 할 수 있으며, 이 경우 한외여과는 최종 회수물에 대하여 크로마토그래피 정제 직전에 1회만 수행되는 것을 특징으로 한다. 기존 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 정제 또는 생산 방법은 총 2회 이상의 한외 여과를 수행하는 것을 필수적인 구성으로 하였으나, 본 발명의 생산 방법은 1회의 한외여과만을 수행하더라도 기존 방법 대비 더욱 우수한 정제 및 생산 효과를 나타내는 우수성이 있다. 또한 상기 방법은 종래 방법과 비교하여 가열, pH 조절 등의 공정이 생략되어 간단한 단계만으로도 목적하는 협막 다당체를 생산할 수 있는 특징이 있다. 특히, (b) 단계와 (c) 단계 사이에 한외여과 수행단계가 생략되는 방법은 다양한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법에 적용가능하나, 바람직하게는 3형 혈청형인 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산을 위해 사용될 수 있다. 스트렙토코커스 뉴모니아 3형 혈청형은 세포 용해시 배지 속으로 방출되는 2000~3000 KDa의 글루코스/글루쿠론산 쇄를 생산하는 거대 다당체로써 이의 점도가 높아 원심분리와 여과를 어렵게 하여 상등액을 얻기 어려우므로 단백질 불순물의 제거를 불충분하게 만들 수 있으므로, 상기와 같이 1회의 한외여과만을 수행하는 본 발명에 따른 생산 방법은 2회의 한외여과를 수행하는 기존 공정이 가지고 있었던 불필요하고 부적절한 단계를 선택적으로 생략함으로써 간단하면서도 순도 및 수율을 높이는 효과를 달성할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 생산 방법은 (b) 단계와 (c) 단계 사이에 상기 (b) 단계로부터 얻은 협막 다당체에 대해 한외여과를 수행하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.
이 경우, 생산방법은 종래 생산 방법과 대비하여 가열을 통한 온도 조절 단계, pH 조절 단계 등이 생략된 것을 특징으로 하며, 종래 필수적인 것으로 고려되었던 상기 조절 단계 없이도 다양한 혈청형의 협막 다당체를 수득할 수 있다는 것을 최초로 확인한 것을 특징으로 한다. 추가적인 단계를 포함하는 생산방법은 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 3형을 제외한 나머지 혈청형을 정제하는데 특히 바람직하다.
상기 (b) 단계의 불활화는 포르말린 처리에 의해 이루어질 수 있고, 상기 (b) 단계의 회수는 생물학적 계면활성제의 첨가에 의해 이루어진다. 본 발명의 생물학적 계면활성제는 비교적 약학 활성의 계면활성제이며, 바람직하게는 디옥시콜레이트 (deoxycholate) 또는 소듐 디옥시콜레이트 (sodium deoxycholate)일 수 있다. (b) 단계의 생물학적 계면활성제는 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 회수를 위하여 최종 농도 0.05% 내지 0.2% 로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 0.15%로 첨가될 수 있다.
구체적으로, 상기 (a) 단계에 의해 배양된 스트렙토코커스 뉴모니아의 용해물에 포르말린을 처리하여 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 불활화시키고 용해제, 예컨대 생물학적 계면활성제인 디옥시콜레이트를 처리하여 협막 다당체를 분리한다. 분리 후, 원심분리에 의해 협막 다당체를 회수한다.
상기 양쪽성 계면활성제는 음이온성인 협막 다당체와 복합체를 형성할 수 있는 것을 제한 없이 포함할 수 있고, 바람직하게는 CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide)일 수 있다.
협막 다당체와 계면활성제의 복합체는 고염 조건 하에서 해리되고, 해리 후 에탄올을 첨가하여 협막 다당체를 원심분리시키고 침전물을 회수한다.
본 발명의 (d) 단계는, 상기 (c) 단계로부터 얻은 회수물에 음이온성 계면활성제를 처리하여 불순물을 침전시키고 상등액을 얻는 단계이다.
상기 (d) 단계의 음이온성 계면활성제는 불순물인 DNA, 단백질 등과 복합체를 형성할 수 있는 것을 제한 없이 포함할 수 있고, 바람직하게는 약한 활성을 나타내는 음이온성 계면활성제, 더욱 바람직하게는 디옥시콜레이트 또는 소듐 디옥시콜레이트일 수 있다. (d) 단계의 음이온성 계면활성제가 디옥시콜레이트인 경우, 이는 0.1 내지 1%(w/v), 바람직하게는 0.5 내지 1%(w/v) 로 첨가될 수 있다.
계면활성제와 불순물의 복합체를 침전시킨 후 원심분리하여 상등액을 얻는다. 이 과정에 의하여 스트렙토코커스 뉴모니아 배양액 내에 포함된 불순물을 효과적으로 제거할 수 있다.
본 발명의 (e) 단계는, 상기 (d) 단계로부터 얻은 상등액을 원심분리하여 협막 다당체를 침전시키고 침전물을 회수하는 단계이다.
상기 (d) 단계를 통해 불순물이 제거된 상등액으로부터 협막 다당체를 침전시킨 후 통상의 분리 방법(예: 원심분리)에 의해 침전물을 회수하여 더욱 정제된 협막 다당체를 회수할 수 있다.
본 발명의 (f) 단계는, 상기 (e) 단계로부터 얻은 회수물을 한외여과 및 크로마토그래피로 정제하는 단계이다.
상기 한외여과는 (e) 단계로부터 얻은 회수물 내 잔류하고 있는 DNA 또는 단백질 불순물을 여과시킬 수 있는 막을 이용하여 수행될 수 있으나, 예컨대는 50~300 kDa, 바람직하게는 100 kDa 막(membrane)을 사용하여 이루어질 수 있다.
상기 크로마토그래피는 최종 정제를 위해 사용되는 것으로, 제거되지 않은 DNA와 단백질 불순물을 흡착시킬 수 있는 크로마토그래피를 제한 없이 포함하나, 바람직하게는 수산화인회석 크로마토그래피를 포함한다. 크로마토그래피에 의해 DNA와 단백질 불순물이 레진과 결합하여 분리되고, 정제된 협막 다당체는 레진과 상호작용 하지 않고 통과액으로 용출된다.
본 발명에 있어서, 스트렙토코커스 뉴모니아는 다양한 혈청형을 제한없이 포함할 수 있으나, 바람직하게는 혈청형은 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 생산 방법은 pH나 열을 처리하지 않고, 또는 추가적인 한외 여과 방법을 생략하여 협막 다당체를 정제 및 생산함으로써 정제 시간이 절감되며 다량의 협막 다당체를 고순도로 생산할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 상기 생산방법에 의해 생산된, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 포함하는, 백신 조성물을 포함한다.
생산방법 및 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체는 상기 기재한 바와 같으며, 중복 기재를 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 생산방법은, 동물 유래 성분을 불포함하는 배지를 사용하여 이루어지는 배양을 포함하므로 동물 유래 성분에 포함된 단백질에 의해 발생할 수 있는 문제, 예컨대 박테리아 세포 표면의 화학적 환경 변화, 다양한 면역학적 반응 등이 발생하지 않는다. 따라서 본 발명의 생산방법에 의해 생산된 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 백신 제조용으로 사용한다면, 바이러스, 프리온, 마이코플라즈마(mycoplasma) 등이 배지의 구성성분에 포함되어 발생할 수 있는 건강상의 치명적인 문제를 피할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 전달 단백질을 더 포함할 수 있다.
상기 조성물에 포함된 전달 단백질은 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체와 접합하여 접합 백신으로 사용할 수 있다. 전달 단백질과 접합될 수 있는 협막 다당체의 혈청형은 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 혈청형일 수 있다. 상기 백신 조성물은 다수의 협막 다당체를 포함하는 다가 백신에 사용될 수 있다.
본 발명에서 전달 단백질은 바람직하게는 무독성이고 비반응원성이며 충분한 양 및 순도로 수득할 수 있는 단백질이다. 또한 전달 단백질은 표준 접합 방법에 적절해야 한다. 전달 단백질은 예컨대, CRM197, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드(참조: 국제공개공보 제WO2004/083251), 이.콜라이(E. coli) LT, 이.콜라이 ST, 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래의 외독소 A와 같은 불활성화된 세균 독소, 세균 외막 단백질, 예를 들면, 외막 복합체 c (OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 뉴모리신, 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA), 폐렴구균 어드헤신(adhesin) 단백질(PsaA), 그룹 A 또는 그룹 B 연쇄구균 유래의 C5a 펩티다제, 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 단백질 D, 난알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체(PPD)와 같은 다른 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 협막 다당체 또는 협막 다당체와 전달 단백질의 접합을 제형화하여 백신으로 사용할 수 있다. 당업계에서 인정된 방법을 사용하여 본 발명의 백신 조성물의 제형화를 수행할 수 있다. 예를 들면, 백신 조성물은 비히클을 포함할 수 있고, 이러한 비히클의 예에는, 물, 완충 식염수, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 애쥬번트를 포함할 수 있다. 상기 "애쥬번트"는 본 발명의 백신 조성물의 면역원성을 증가시키는데 사용되는 물질이다. 따라서, 애쥬번트는 종종 면역 반응을 부스터하기 위하여 제공되고 당업자에게 익히 공지되어 있다.
본 발명의 백신 조성물의 제형은 전신 또는 점막 경로로 백신을 투여함으로써, 스트렙토코커스 뉴모니아에 감염되기 쉬운 개체를 보호, 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 투여에는 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사; 또는 구강/소화관, 기도관 또는 비뇨생식관으로의 점막 투여가 포함될 수 있다. 예컨대, 폐렴 또는 중이염의 치료를 위하여 비내 투여가 사용된다 (스트렙토코커스 뉴모니아의 비인두 보균을 보다 효과적으로 예방하여, 초기 단계에서 감염을 약화시킬 수 있기 때문이다).
각 백신 용량에서 협막 다당체 또는 협막 다당체와 전달 단백질의 접합체의 양은, 상당한 부작용 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로 선택된다. 이러한 양은 스트렙토코커스 뉴모니아의 혈청형에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 각 용량은 0.1 내지 100㎍, 특히 0.1 내지 10㎍, 그리고 보다 특히 1 내지 5㎍의 다당체를 포함할 것이다.
특정 백신에 대한 성분의 최적량은 개체에서 적당한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해서 확인될 수 있다. 최초 백신접종 후에, 개체는 적당한 간격으로 1회 또는 수회의 부스터 면역접종을 받을 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 다른 세균에 감염되어 발생하는 중이염에 대해 사용하기 위한 하나 이상의 추가적인 항원을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
스트렙토코커스
뉴모니아
균주 및 확인
1.1
스트렙토코커스
뉴모니아
균주
스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 균주는 CCUG(Culture Collection, University of Gothenburg)로부터 분양 받아 사용하였다. 구체적으로, 스트렙토코커스 뉴모니아 1형(CCUG 2839A), 3형(CCUG 6798), 4형 (CCUG 6654), 5형 (CCUG 2541), 6A형 (CCUG 3114), 6B형 (CCUG 10068), 7F형 (CCUG 8438), 9V형 (CCUG 36618), 14형 (CCUG 1086B), 18C형 (CCUG 7206), 19A형 (CCUG 35180), 19F형 (CCUG 1407), 23F형 (CCUG 3150)과 그 외 2종을 추가하여 총 15종을 사용하였다.
1.2 균주 확인
스트렙토코커스 뉴모니아 균주는 호기성, 그람양성의 알파 용혈(alpha-hemolysis)을 나타내는 균주로, 옵토킨(optochin) 감수성이 있고 담즙 용해성을 갖는 특징이 있다. 상기 1.1에 기재된 15종의 균주가 스트렙토코커스 뉴모니아 균주인지 확인하기 위하여, 15종의 균주에 대하여 균주 확인을 수행하였다.
구체적으로, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 정제하여 각 혈청형들에 대한 동정 시험으로서 직접적 ELISA(direct ELISA) 방법을 이용하였다. ATCC 다당체 표준품 및 정제한 각 다당체(1 mg/mL) 100 mL 코팅한 후, 각 혈청형의 항체를 반응시켜, 450 nm와 630 nm에서의 흡광도 차이인 델타 흡광도(Δ OD)를 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. 양성 대조군으로는 표준품인 ATCC 다당체를 사용하였고, 음성 대조군으로는 다당체로 코팅하지 않은 웰을 사용하였다.
| 혈청형 | Δ OD (450-630 nm) | ||
| ATCC 다당체 (표준품) |
정제 다당체 | 음성 대조군 | |
| 1 | 0.91 | 0.92 | 0.28 |
| 3 | 1.72 | 0.99 | 0.03 |
| 4 | 3.34 | 3.39 | 0.17 |
| 5 | 2.09 | 2.04 | 0.07 |
| 6A | 1.62 | 0.87 | 0.14 |
| 6B | 1.02 | 0.92 | 0.08 |
| 7F | 1.45 | 1.40 | 0.05 |
| 9V | 3.38 | 1.28 | 0.14 |
| 11A | 1.50 | 1.37 | 0.20 |
| 14 | 3.67 | 2.29 | 0.18 |
| 18C | 2.52 | 2.79 | 0.24 |
| 19A | 3.68 | 3.57 | 0.29 |
| 19F | 1.05 | 0.99 | 0.09 |
| 22F | 2.70 | 2.54 | 0.18 |
| 23F | 1.15 | 1.22 | 0.06 |
표 1에 나타낸 바와 같이, ATCC 다당체(표준품, 양성 대조군)와 실시예 1.1의 스트렙토코커스 뉴모니아 15종의 혈청형을 갖는 협막 다당체는 기준 값(>0.8)을 만족하며 정제된 협막 다당체가 각 혈청형에 해당함을 확인하였다.
실시예
2:
스트렙토코커스
뉴모니아
배양
혈청형별 스트렙토코커스 뉴모니아를 아가 플레이트에 도말하여 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 약 16시간 동안 배양하였다. 여기서 생성된 콜로니를 이용하여 20% 글리세롤이 함유된 TSB(Tryptic Soy Browth)에 풀어 스탁(Stock)을 만들어 사용하였다.
배양 배지는 혈청형 6B를 기준으로 배지 1리터 당 소야 펩톤(Soya peptone) 30g, 효모 추출물(Yeast extract) 20g, NaCl 2.5g, K2HPO4 0.5g, MgSO47H2O 0.4g, CaCl2 0.01g, L-시스테인 HCl 0.15g, (D+)글루코오스 5g, NaHCO3 0.22g을 포함하는 합성배지를 사용하였다.
종 배양은, 보관된 스트렙토코커스 뉴모니아 스탁 1 바이알을 해동하여 상기 배양 배지 100mL에 접종하고 37℃, 5% CO2조건에서 정치 배양하였다.
본 배양은, 종 배양을 하고 약 4시간 후 OD600nm가 0.6~1.2이 되면, 본 배양액의 5%(v/v)가 되도록 1.9L의 본 배양 배지가 들어있는 멸균한 5L 배양기에 종 배양액 100mL을 접종하고 34~38℃, pH 7.0~7.2 (2M NaOH로 유지), 60~100rpm 조건에서 배양하며 균의 농도(OD600nm값)가 0.8 이상이 되면 접종 용액(Feeding solution) 인 40% 글루코오스를 0.5~1.5 mL/min/L의 속도로 주입하여 글루코오스 농도가 1.5~2.0%가 되도록 유지하였다. 더 이상 균의 농도(OD600nm값)가 증가하지 않으면 접종을 중단하고 1~2시간 동안 배양 후, pH 조정을 하지 않고 0.1 vvm으로 공기를 주입시키며 1~2시간 추가 배양 후 종료하였다. 상기와 같은 방법에 의해 스트렙토코커스 뉴모니아 15종을 배양한 성장곡선을 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 시험한 스트렙토코커스 뉴모니아 15종 혈청형 모두 상기 배양 방법에 의하여 잘 성장하는 것을 확인하였다.
실시예
3:
스트렙토코커스
뉴모니아
협막 다당체 정제 및 배양
다양한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 고순도로 빠르게 생산하기 위하여, 하기와 같이 변형된 정제 및 배양 방법을 수행하였고 각 단계를 도 2에 간략히 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체 정제 및 배양 방법은 기존 방법과 비교하여 별도의 pH 조절 단계 및 가열 단계를 불포함하는 것을 특징으로 하며, 이와 같이 기존 공정을 단순화 시켰음에도 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 고순도로 생산할 수 있다. 각 단계에 대한 상세한 설명은 다음과 같다.
3.1
스트렙토코커스
뉴모니아
협막 다당체의 불활화 및 회수
상기 실시예 2의 방법에 의한 배양이 종료된 후, 스트렙토코커스 뉴모니아 용해물에 포르말린을 0.2% 농도로 첨가하여 25℃에서 30분간 교반하며 불활화 시켰다. 스트렙토코커스 뉴모니아 균체와 배양액을 회수하고 생물학적 계면활성제인 13% 디옥시콜레이트(deoxycholate)를 최종농도 0.13%로 넣은 후 4℃에서 16～20시간 교반하여 협막 다당체의 분리를 유도하고, 원심분리 하여 상층액을 얻었다.
3.2
한외여과
및
CTAB
침전
상기 회수된 상층액을 100 kD 막을 이용한 한외여과 시스템을 통하여 1/10 부피 (200 mL)로 농축시키고, 18배(3.6 L)의 정제수를 이용해서 한외여과를 통해 완충액을 교환하였다. 특히 한외여과 전 별도의 가열 (boiling) 단계 및 pH 조절 단계를 수행하지 않았으며, 기존에 필수적으로 생각되었던 상기 단계를 생략하고 공정을 수행함으로써 비용과 시간의 절감을 달성하였다.
이후 CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide)를 0.7%가 되도록 첨가하고 약 20분간 교반하여 음이온성 협막 다당체와 양쪽성 계면활성제인 CTAB 간의 복합체 형성을 유도하였다.
3.3 협막 다당체 침전
협막 다당체와 CTAB 복합체에 1M의 농도가 되도록 NaCl을 첨가하고 상온에서 30분간 교반하여 고염의 조건에서 협막 다당체와 CTAB 복합체의 해리를 유도하였다. 복합체가 유도된 상기 용액 200 mL에 3배 부피(600 mL)의 차가운 에탄올을 천천히 첨가하고 4℃에서 3시간 두어 침전시키고 원심분리하여 침전물을 회수한 후 정제수(200 mL)에 녹였다.
3.4 불순물 침전
6%(w/v) 소듐 아세테이트(12 g)와 0.5%(w/v) 디옥시콜레이트(1 g)를 첨가하고 8 M 아세트산으로 pH 6.4를 만들고, 0.5배(100 mL)의 차가운 에탄올을 첨가한 후 4℃에서 1시간 두어 침전시키고 원심분리하여 상층액을 회수하였다.
3.5 협막 다당체 침전
회수한 상층액에 6%(w/v) 소듐 아세테이트(12 g)를 첨가한 후 8 M 아세트산을 사용하여 pH 6.2로 조정하고, 1.2배(360 mL)의 차가운 에탄올을 첨가한 후 4℃에서 16~24시간 두어 침전시킨 후 원심분리하여 침전물을 회수하고 200 mL의 정제수에 녹였다.
3.6
한외여과
100 kD 막의 한외여과 시스템을 이용하여 4배(800 mL)의 한외여과 완충액 I(50 mM Tris HCl, 2 mM EDTA, 0.3% DOC, pH 7.1), 완충액 II(50 mM Tris HCl, 2 mM EDTA, pH 7.1), 완충액 III(150 mM NaCl)을 순차적으로 첨가하여 DOC와 EDTA에 의해 잔류된 DNA 불순물과 단백질 불순물을 각각 제거하였다. 그 후 18배(3.6 L)의 정제수로 한외여과를 통해 완충액을 교환하고 최종적으로 약 200 mL의 협막 다당체 수용액을 얻었다.
3.7
수산화인회석
크로마토그래피(
Hydroxyapatite
chromatography)
한외여과를 통해 잔류 시약과 불순물이 95% 이상 제거된 협막 다당체 시료를 10 mM 소듐 인산염 완충액이 평형화된(equilibration)된 수산화인회석 크로마토그래피를 이용하여 최종 정제 단계를 수행하였다. 이 단계를 통해 제거되지 않은 DNA와 단백질 불순물은 레진에 흡착되고, 다당체는 레진과 상호작용 없이 통과액(flow-through)으로 용출된다. 이러한 최종 정제 단계를 통해 99.9% 이상의 순도를 갖는 협막 다당체를 정제하였고, 안정적인 보존을 위해 동결건조 후 냉장 보관하였다. 최종 정제 단계 진행 과정에서 정제되는 협막 다당체의 함량과 제거되는 단백질 및 불순물의 함량을 표 2에 나타내었다. 또한 혈청형별 협막 다당체의 함량을 도 3에 나타내었다.
| 혈청형 | 협막 다당체 함량 (mg) |
협막 다당체 대비 불순물 함량 (%) |
|
| DNA | 단백질 | ||
| 1 | 450 | 0.01 | 0.00 |
| 3 | 0 | 0.00 | 0.00 |
| 4 | 780 | 0.07 | 0.25 |
| 5 | 440 | 0.66 | 2.26 |
| 6A | 420 | 0.20 | 0.00 |
| 6B | 1100 | 0.05 | 0.00 |
| 7F | 550 | 0.05 | 2.05 |
| 9V | 500 | 0.07 | 0.20 |
| 14 | 390 | 1.31 | 2.21 |
| 18C | 810 | 0.44 | 0.40 |
| 19A | 1150 | 0.15 | 0.00 |
| 19F | 1500 | 0.22 | 0.00 |
| 23F | 500 | 0.17 | 0.12 |
| 11A | 450 | 0.82 | 0.00 |
| 22F | 490 | 0.63 | 0.00 |
| WHO 기준 불순물 함량(%) | <2.00 | <3.00 | |
표 2에 나타낸 바와 같이, 정제한 15종의 혈청형 모두 WHO 기준 불순물 함량(DNA: 2.00 이하; 단백질: 3.00 이하)보다 현저히 낮은 협막 다당체 대비 불순물 함량을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 도 3에 나타낸 바와 같이, 15종의 혈청형 모두에서 협막 다당체의 함량이 높은 수준임을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 생산 방법은 기존 공정에서 필수적으로 생각되었던 가열 및 pH 조절 단계를 생략하여 공정을 단순화 했음에도 불구하고 다양한 혈청형 모두에서 공통적으로 협막 다당체 함량이 감소되지 않으면서도 불순물의 함량이 현저히 감소되는 효과가 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따르면 간소화된 방법을 통해 다양한 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체 혈청형을 고순도로 빠르게 생산할 수 있다.
실시예
4:
스트렙토코커스
뉴모니아
협막 다당체의 간소화된 정제 및 배양
실시예 3에서 본 발명의 방법에 따른 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체 정제 및 배양 방법에서 추가적으로 단계를 더 간소화시킨 정제 및 배양 방법 역시 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 고순도로 빠르게 생산할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 본 실시예에서 사용된 생산 방법은 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 추가적으로 간소화된 생산 방법은 기존의 방법 및 실시예 3의 방법과 비교하여, 가열, pH 조절 단계가 없을 뿐만 아니라, 수득된 상층액의 농축 단계 및 초기 한외 여과 공정까지 추가적으로 생략된 것을 특징으로 한다.
4.1
스트렙토코커스
뉴모니아
협막 다당체의 불활화 및 회수
상기 실시예 2의 방법에 의해 배양이 종료된 후, 스트렙토코커스 뉴모니아 용해물에 포르말린을 0.2% 농도로 첨가하여 25℃에서 30분간 교반하며 불활화 시켰다. 스트렙토코커스 뉴모니아 균체와 배양액을 회수하고 생물학적 계면활성제인 13% 디옥시콜레이트를 최종농도 0.13%로 넣은 후 4℃에서 16～20시간 교반하여 협막 다당체의 분리를 유도하였다.
4.2
CTAB
침전
상기 회수된 배양액에 CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide)를 0.7%가 되도록 첨가하고 약 20분간 교반하여 음이온성 협막 다당체와 양쪽성 계면활성제인 CTAB 와의 복합체 형성을 유도하였다. 특히 CTAB 침전 전, 종래 공정에서 수행되는 회수된 배양 상층액의 한외여과 단계를 생략하였으며, 한외여과 이전 pH 조절 단계 역시 생략하여 공정을 수행함으로써 비용과 시간의 절감을 달성하였다.
4.3 협막 다당체 침전
협막 다당체와 CTAB 복합체에 1M의 농도가 되도록 NaCl을 첨가하고 상온에서 30분간 교반하여 고염의 조건에서 협막 다당체와 CTAB 복합체의 해리를 유도하였다. 복합체가 유도된 상기 용액 200 mL에 대한 2배 부피(400 mL)의 차가운 에탄올을 천천히 첨가하고 4℃에서 3시간 두어 침전시키고 원심분리하여 침전물을 회수한 후 정제수(200 mL)에 녹였다.
4.4 불순물 침전
6%(w/v) 소듐 아세테이트(12 g)와 음이온성 계면 활성제인 0.5%(w/v) 디옥시콜레이트(1 g)를 첨가하고 8 M 아세트산으로 pH 6.4를 만들고, 0.5배(100 mL)의 차가운 에탄올을 첨가한 후 4℃에서 1시간 두어 침전시키고 원심분리하여 상층액을 회수하였다.
4.5 협막 다당체 침전
회수한 상층액에 6%(w/v) 소듐 아세테이트(12 g)를 첨가하고 8 M 아세트산을 사용하여 pH 6.2로 조정하고, 1.2배(360 mL)의 차가운 에탄올을 첨가한 후 4℃에서 16~24시간 두어 침전시킨 후 원심분리하여 침전물을 회수하고 200 mL의 정제수에 녹였다.
4.6
한외여과
100 kD 막의 한외여과 시스템을 이용하여 4배(800 mL)의 한외여과 완충액 I(50 mM Tris HCl, 2 mM EDTA, 0.3% DOC, pH 7.1), 완충액 II(50 mM Tris HCl, 2 mM EDTA, pH 7.1), 완충액 III(150 mM NaCl)을 순차적으로 첨가하여 디옥시콜레이트와 EDTA에 의해 잔류된 DNA 불순물과 단백질 불순물을 각각 제거하였다. 그 후 18배(3.6 L)의 정제수로 한외여과를 통해 완충액을 교환하고 최종적으로 약 200 mL의 협막 다당체 수용액을 얻었다.
4.7
수산화인회석
크로마토그래피(
Hydroxyapatite
chromatography)
한외여과를 통해 잔류 시약과 불순물이 95% 이상 제거된 협막 다당체 시료를 10 mM 소듐 인산염 완충액이 평형화된(equilibration)된 수산화인회석 크로마토그래피를 이용하여 최종 정제 단계를 수행하였다. 이 단계를 통해 제거되지 않은 DNA와 단백질 불순물은 레진에 흡착되고, 다당체는 레진과 상호작용 없이 통과액(flow-through)으로 용출된다. 이러한 최종 정제 과정을 통해 99.9% 이상의 순도를 갖는 협막 다당체를 정제하였고, 안정적인 보존을 위해 동결건조 후 냉장 보관하였다.
4.8 우수한 협막 다당체 생산 효율의 확인
상기 방법에 따른 생산 효율을 확인하기 위해서, 실시예 4에 따라 수득되는 협막 다당체 함량과 불순물 함량을 당 업계에서 기존에 알려진 생산방법(도 5)을 이용하여 수득되는 협막 다당체 및 불순물 함량과 비교하였다. 기존의 알려진 생산방법은 PCT/US2007/080768 에 기재된 내용을 참고하여 수행하였으며, 구체적으로 배양이 종료된 배양액을 회수하여 다음의 pH 및 온도 조건 하에서 수행하였다: 1) pH 를 pH 3.0 내지 3.5 로 낮추는 단계, 2) 60℃이상으로 30분 이상 가열하는 단계, 3) pH를 pH 8.0 내지 8.5으로 높이는 단계.
도 5에 나타낸 바와 같이, 기존의 협막 다당체 생산 방법은 불활화 후 가열 및 pH와 온도 조절 단계를 필수적으로 포함하며, 특히 실시예 4의 공정과 비교하여 한외여과 공정을 포함한다. 비교예 1에서 사용된 기존의 공정을 이용한 협막 다당체 생산 방법은 추가적으로 포함하는 단계를 제외하고는 실시예 4와 동일한 조건에서 수행하였으며, 추가 공정에서 이용된 조건은 다음과 같다.
두 가지 생산 방법에 따라 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 정제 및 생산한 후 협막 다당체의 함량, DNA, 단백질의 함량을 측정하였고, 특히 혈청형 3형에 대하여는 각 정제 단계에서의 측정 결과를 표 3에 나타내었으며, 혈청형 6A형 및 14형에 대하여는 정제를 마친 후의 측정 결과를 표 4에 나타내었다.
| 정제 단계 | 기존의 생산방법 | 본 발명의 생산방법 | ||||||||
| 협막 다당체 함량 (mg) |
DNA (mg, %) |
단백질 (mg, %) |
협막 다당체 함량 (mg) |
DNA (mg, %) |
단백질 (mg, %) |
|||||
| CTAB 침전 | 774 | 1531 | 197.80 | 4362 | 563.57 | 1038 | 3760 | 362.24 | 16430 | 1582.85 |
| 협막 다당체 침전 | 629 | 146 | 23.21 | 134 | 21.30 | 883 | 147 | 16.65 | 780 | 88.34 |
| 불순물 침전 | 361 | 4.2 | 1.16 | 3 | 0.83 | 522 | 2.8 | 0.54 | 8.2 | 1.57 |
| 여과 | 128 | 1.1 | 0.86 | 1.4 | 1.09 | 364 | 1.7 | 0.47 | 5.5 | 1.51 |
| 수산화 인회석 크로마토 그래피 |
60 | 0.552 | 0.92 | 0.0 | 0.00 | 150 | 1.02 | 0.68 | 0.0 | 0.00 |
| 혈청형 | 생산방법 | 협막 다당체 함량(mg) | 협막 다당체 대비 불순물 함량(%) | |
| DNA | 단백질 | |||
| 6A | 기존의 생산방법 | 540 | 0.95 | 0.00 |
| 본 발명의 생산방법 | 1210 | 0.45 | 0.00 | |
| 13 | 기존의 생산방법 | 80 | 0.64 | 0.00 |
| 본 발명의 생산방법 | 170 | 0.49 | 0.00 | |
| WHO 기준 불순물 함량(%) | <2.00 | <3.00 | ||
표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 기존의 생산 방법에 비하여 본 발명의 생산 방법을 사용하는 경우, 협막 다당체의 함량이 2배 이상 증가하고, 불순물의 함량도 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 생산 방법은 다양한 혈청형의 협막 다당체를 정제하는데 적용할 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 결과로부터 기존의 생산 방법에 포함된 단계인 pH 및 온도 조절 단계를 제외함으로써 공정의 복잡도가 감소하여 협막 다당체의 회수율이 증가하였음을 알 수 있다. 특히 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 두꺼운 협막 다당체를 갖고 있어 배양 시 낮은 성장과 함께 배양액의 점성도가 높아져 원심분리 및 초기 정제 공정에 어려움이 있는 것으로 알려져 있는 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 3형에 대해서 기존의 정제 공정에서 한외 여과 등을 제외한 간단한 공정만으로도 2배 이상의 높은 협막 다당체 수득을 달성할 수 있어, 기존 공정 대비 매우 효과적인 협막 다당체 생산을 달성할 수 있음을 확인하였다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
Claims (13)
- (a) 스트렙토코커스 뉴모니아를 배양하는 단계;
(b) 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체를 불활화하고 생물학적 계면활성제를 첨가하여 협막 다당체를 회수하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계로부터 얻은 회수물에 양쪽성 계면활성제를 처리하여 협막 다당체를 침전시키고 침전물을 회수하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계로부터 얻은 회수물에 음이온성 계면활성제를 처리하여 불순물을 침전시키고 상등액을 얻는 단계;
(e) 상기 (d) 단계로부터 얻은 상등액을 원심분리하여 협막 다당체를 침전시키고 침전물을 회수하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계로부터 얻은 회수물을 한외여과 및 크로마토그래피로 정제하는 단계;
를 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양은 동물 유래 성분을 불포함하는 배지를 사용하여 이루어지는 것인, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양은 소야 펩톤, 효모 추출물, K2HPO4, 글루코오스 및 NaHCO3를 포함하는 배지를 사용하여 이루어지는 것인, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계와 (c) 단계 사이에 한외여과 수행단계가 생략된 것을 특징으로 하는; 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계와 (c) 단계 사이에 상기 (b) 단계로부터 얻은 협막 다당체에 대해 한외여과를 수행하는 단계; 를 더 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생산방법은 pH 또는 온도 조절 단계가 생략된 것을 특징으로 하는; 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 양쪽성 계면활성제는 CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide)인, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 음이온성 계면활성제는 디옥시콜레이트(deoxycholate)인, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (f) 단계의 한외여과는 50-300 kDa 막(membrane)을 사용하여 이루어지는 것인, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (f) 단계의 크로마토그래피는 수산화인회석 크로마토그래피인, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법.
- 제1항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 혈청형은 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법.
- 제4항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 혈청형은 3형인 것을 특징으로 하는, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법.
- 제5항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 혈청형은 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법.
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