KR20200136756A - 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23f의 면역원성 접합체 제조방법 - Google Patents
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23f의 면역원성 접합체 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 (i) 정제된 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F의 협막 다당류를 아세트산 나트륨(NaOAc) 완충액에 혼합하여 혼합물을 얻는 단계, (ii) 상기 혼합물과 산화제를 반응시켜 활성화된 혈청형 23F 다당류를 생성시키는 단계, (iii) 활성화된 혈청형 23F 다당류를 아세트산 나트륨으로 여과시켜 적어도 300kDa 을 갖는 활성화된 혈청형 23F 다당류를 선택하는 단계, (iv) 활성화된 혈청형 23F 다당류를 운반체 단백질과 혼합하는 단계, 및 (v) 활성화된 혈청형 23F 다당류 및 운반체 단백질의 혼합물에 환원제를 첨가하여 컨쥬게이션시켜 활성화된 혈청형 23F 다당류 및 운반체 단백질의 접합체를 형성하는 단계를 포함하는, 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 본 발명은 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F의 협막 다당류의 크기를 일정하게 유지할 수 있고, 우수한 면역원성을 갖는 접합체를 제공하는데 유리할 수 있다.
Description
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F의 면역원성 접합체 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F의 면역원성 접합체를 포함하는 백신 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)라는 박테리아에 감염되면 여러 종류의 질병이 생길 수 있는데 그 예로는 폐렴 (폐의 염증), 중이염 (중이의 염증), 수막염 (뇌와 척수를 둘러 싼 막의 염증) 등이 있다. 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)는 폐렴의 주요한 원인균이다. 뿐만 아니라 패혈증, 균혈증, 수막염 등의 침습성 질환을 유발한다. 통계청 [2014년 사망원인통계]에 의하면 2014년 폐렴으로 인한 사망률은 10만 명당 23.7 명으로 2013년 대비 11% 증가한 것으로 나타났으며 2015년 대비 2.8배 증가한 것으로 나타나, 폐렴으로 인한 사망률은 지속적으로 증가하는 추세를 보였다. 또한 2012년 WHO에 따르면 2008년도에 전세계적으로 HIV 음성인 5세 이하 영유아 476,000 명이 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 감염으로 사망하였으며, 이는 5세 이하 영유아 사망원인 중 5%를 차지하는 것이다.
상기 스트렙토코커스 뉴모니애는 혈청형 특이성을 부여하는 화학적으로 연결된 다당류로 캡슐화되어 있다. 이를 협막(capsule)이라 하며, 스트렙토코커스 뉴모니애를 둘러싼 두꺼운 점액질층으로, 자신을 방어하거나 특정 표면에 부착할 때 사용한다. 상기 협막 다당류는 스트렙토코커스 뉴모니애 질병의 예방을 위해 여러 해 동안 면역학에서 널리 사용되어 왔다. 대략 90개의 공지된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형이 존재하며, 협막은 보체로부터 상기 스트렙토코커스 뉴모니애의 내부 표면을 보호할 뿐만 아니라 그 자체로 불완전한 면역원이므로, 상기 협막은 스트렙토코커스 뉴모니애에 대한 주요 독성 결정인자이다. 다당류는 T-비의존성 항원이고, 가공되거나 MHC 분자에 제시되어 T-세포와 상호작용할 수 없다. 그러나, 이들은 B 세포 상의 표면 수용체의 가교를 포함하는 대안적인 메커니즘을 통해 면역계를 자극할 수 있다.
스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F는 소아 및 성인 폐구균 침습성 감염 환자들에서 높은 분포도를 나타내고 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 아직까지 혈청형 23F를 갖는 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 감염을 효과적으로 예방할 수 있는 백신 생산에는 어려움이 있다. 예를 들어, 다당류와 단백질 운반체를 컨쥬게이션하여 만들어지는 접합체를 이용한 백신은, 다당류의 접합 과정에서 산화에 의해 다당류 크기가 감소된다거나, 다당류와 단백질 운반체의 결합율이 낮다는 등의 문제를 안고 있다.
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F의 백신을 제공하고자 한다.
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F의 협막 다당류가 운반체 단백질에 컨쥬게이션된 접합체의 크기를 유지하고, 면역을 유발할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F의 협막 다당류의 크기 감소가 적은, 접합체 제조 방법을 제공하고자 한다.
또한, 다른 구현예에서 상기 접합체 제조 방법으로 제조된 접합체를 면역원성 조성물로 제공하고자 한다.
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F가 유발하는 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 접합체를 제공하고, 상기 접합체를 백신 용도로 제공하고자 한다.
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F 접합체의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직하게 본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F의 협막 다당류와 운반 단백질의 접합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae)의 접합체를 제조할 때, 활성화된 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F 협막 다당류의 크기 감소를 줄이고 접합에 효과적인 크기의 다당류를 얻을 수 있는 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예는 천연 23F 혈청형의 다당류의 크기의 약 50 내지 60% 정도의 크기를 갖는 활성화된 다당류를 제공하고자 한다. 바람직하게 상기 활성화된 다당류는 약 300kDa 대의 일정한 크기를 가질 수 있다. 본 발명의 일 실시예는 천연 23F 혈청형의 다당류의 약 50 내지 60% 정도의 크기를 유지하는 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성화된 다당류"는 "활성화된 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F 다당류"를 의미하며, 산화처리를 거친 협막 다당류를 일컫는 것으로 이해된다. 협막 다당류가 운반체 단백질과 접합하기 전 상태의 다당류를 의미하는 것을 이해될 수 있다. 상기 산화처리를 거친 협막 다당류는 동결건조 단계를 추가로 거칠 수 있으며, 이 경우 동결건조 후 단백질과 접합하기 전 상태의 다당류를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae)의 접합체는 다음의 단계를 포함할 수 있다.
(i) 정제된 혈청형 23F 다당류를 산화제와 반응시켜 활성화된 혈청형 23F 다당류를 생성시키는 단계; (ii) 활성화된 혈청형 23F 다당류와 운반체 단백질을 동결건조 시키는 단계; (iii) 동결 건조된 활성화 혈청형 23F 다당류와 운반체 단백질 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 재현탁시키는 단계; (iv) 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 재현탁된 활성화된 혈청형 23F 다당류와 운반체 단백질을 혼합시키는 단계; 및 (v) 혼합된 활성화된 혈청형 23F 다당류와 운반체 단백질을 환원제와 반응시켜 혈청형 23F 다당류와 운반체 단백질의 접합체를 생성시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 추가로 혈청형 23F 다당류와 운반체 단백질 접합체 중의 미반응된 알데히드를 캡핑(capping)시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 접합체를 제조하는 혈청형 23F 다당류는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 정제 절차를 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0286838 등 참조). 또한, 합성 프로토콜을 사용하여 생산할 수 있다. 전형적으로 협막 다당류는 각각의 혈청형 23F를 배지(예를 들어, 대두-기재 배지)에서 증식시킴으로써 제조되며, 이어서 상기 다당류를 상기 세균 배양물로부터 제조할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 관련 기술분야에 공지된 정제 기술을 사용하여 협막 다당류를 정제할 수 있다.
본 발명의 일 구현예는 정제된 혈청형 23F 다당류는 완충액에서 산화제와 반응할 수 있다. 상기 완충액은 바람직하게 탈이온수(Deionized Water) 또는 아세트산/아세트산 나트륨(NaOAc)이 이용될 수 있으며, 가장 바람직하게 아세트산/아세트산 나트륨(NaOAc)이 이용될 수 있다. 본 발명의 발명자들은 다당류의 활성화 과정에서 사용되는 완충액의 특성에 따라 접합체의 수율을 개선할 수 있고, 다당류의 크기를 조절할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
일 구현예에서 상기 아세트산/아세트산 나트륨(NaOAc) 완충액을 사용할 때, 산화 과정에서 다당류의 크기가 급격히 줄어드는 현상이 덜 관찰될 수 있고, 다당류와 운반체 단백질의 접합 수율을 향상시켜 궁극적으로는 면역원성을 향상시킬 수 있다. 이 효과는 100mM 이상의 고농도 완충액에서도 나타난다.
일 구현예에서 상기 아세트산/아세트산 나트륨(NaOAc) 완충액은 1 내지 550 mM의 농도, 5 내지 540 mM의 농도, 8 내지 520mM의 농도, 또는 9 내지 510mM의 농도를 가질 수 있다. 바람직하게 10 내지 500mM의 농도를 가질 수 있다.
상기 (i) 단계에서의 pH는 pH 2.5-8, pH 3-6, 또는 pH 4-5, 또는 pH 4.5이다. 바람직하게 pH 4.5 아세트산/아세트산 나트륨(NaOAc) 완충액은 1 내지 550 mM의 농도를 가질 때, 본 발명의 목적 달성에 유리할 수 있다.
본 발명의 발명자들은 다른 구현예에서 다당류의 활성화 과정에서 사용되는 완충액의 특성과 함께 산화제의 몰당량에 따라서 접합체의 수율을 개선할 수 있고, 다당류의 크기를 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다. 바람직하게 상기 산화제는 과요오드화나트륨을 포함하며, 페리오데이트, 과요오드산도 본 발명의 산화제로 포함할 수 있다. 본 발명의 다당류가 페리오데이트와 반응하는 경우, 페리오데이트는 인접 히드록실기를 산화시켜 카르보닐 또는 알데히드기를 형성시키고, C-C 결합의 분해를 야기시킨다. 이러한 목적상, 용어 '항원과 페리오데이트를 반응시키다'는 페리오데이트에 의한 인접 히드록실기의 산화를 포함한다.
본 발명의 발명자들은 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae)의 혈청형 23F 면역원성 조성물로 사용하기 위한 접합체를 제조하기 위해서는 바람직하게 0.07 내지 0.23, 0.01 내지 0.2, 0.015 내지 0.19, 0.02 내지 0.18, 0.05 내지 0.17, 0.1 내지 0.165 또는 0.16 몰당량의 페리오데이트를 반응시켜 활성화시킬 수 있다. 상기 범위의 몰당량으로 산화시킬 때, 다당류의 크기를 적당한 범위로 얻을 수 있다. 상기 범위가 본 발명의 목적상 바람직하다.
본 발명의 일 구현예는 다음의 단계를 포함하는, 활성화된 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F의 크기 변화율이 감소된 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법을 제공한다.
(i) 정제된 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F의 협막 다당류를 아세트산 나트륨(NaOAc) 완충액에 혼합하여 혼합물을 얻는 단계;
(ii) 상기 혼합물과 과요오드산나트륨를 반응시켜 활성화된 혈청형 23F 다당류를 생성시키는 단계;
(iii) 활성화된 혈청형 23F 다당류를 아세트산 나트륨으로 투석여과시켜 적어도 300kDa 을 갖는 활성화된 혈청형 23F 다당류를 선택하는 단계;
(iv) 활성화된 혈청형 23F 다당류를 운반체 단백질과 혼합하는 단계; 및
(v) 활성화된 혈청형 23F 다당류 및 운반체 단백질의 혼합물에 환원제를 첨가하여 컨쥬게이션시켜 활성화된 혈청형 23F 다당류 및 운반체 단백질의 접합체를 형성하는 단계.
다른 구현예에서 상기 (i) 단계의 아세트산 나트륨(NaOAc) 완충액 대신 탈이온수(Deionized Water)를 이용할 수 있다.
상기 (i) 및 (ii) 단계를 거쳐 활성화된 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F의 협막 다당류는 100kDa MWCO 한외여과를 이용하여 아세트산 나트륨(pH4.5)으로 투석 여과시켜 다당류 중량-평균 분자량 100kDa 이상, 200kDa 이상, 300kDa 이상, 400kDa 이상, 500kDa 이상일 수 있다. 바람직하게 본 발명의 목적상, 300 내지 500Da의 크기를 가질 수 있다. 본원의 당류의 분자량 또는 평균 분자량은 컨쥬게이션 전에 측정된 박테리아 당류의 중량-평균 분자량(Mw)을 의미하고, 이는 MALLS에 의해 측정된다. MALLS 기술은 당 분야에 널리 공지되어 있다. MALLS 분석은 RI/DAWN-EOS 검출기를 이용하여 0.5 ml/분으로 용리 완충액으로서 Ultrahydrogel analytical column 및 100 mM sodium phosphate (pH 7.2)/0.05% sodium azide를 이용하여 수행될 수 있다.
용어 "운반체 단백질"은 작은 펩티드 및 큰 폴리펩티드(>10 kDa) 둘 모두를 포함한다. 운반체 단백질은 임의의 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 이는 하나 이상의 T-헬퍼 에피토프를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 운반체 단백질은 테타누스 톡소이드(TT), 테타누스 톡소이드의 단편 C, 디프테리아 톡소이드(DT), CRM197, 뉴몰리신(Ply), 단백질 D, PhtD, PhtDE 및 N19로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 한 추가 구체예에서, 운반체 단백질은 CRM197이다. 하나의 실시양태에서, CRM197이 운반 단백질로서 사용된다. CRM197 단백질은 디프테리아 독소의 비독성 변이체로, 면역학적으로는 디프테리아 독소와 구별할 수 없다. CRM197은 카사미노산 및 효모 추출물 기재 배지에서 성장된 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 균주 C7 (β197)의 배양물로부터 생산된다. 전형적으로, CRM197은 한외여과, 황산암모늄 침전 및 이온 교환 크로마토그래피의 조합을 거쳐 정제된다. 또 다른 추가 구체예에서, 운반체 단백질은 테타누스 톡소이드(TT)이다. 본 발명의 발명자들은 아세트산 나트륨 완충액에서 특정 몰당량의 페리오데이트와 반응시켜 활성화되거나, 또는 1 내지 550mM 아세트산 나트륨 완충액에서 활성화시킨 혈청형 23F 다당류는 특히 상기 운반체 단백질과의 접합체 형성이 안정적으로 이루어지고 유리 다당류와 유리 단백질의 발생율을 줄일 수 있다는 것을 확인하였다. 유리 단백질의 경우 1% 이하로 거의 생성되지 않았다. 특히 이러한 안정적인 접합체 형성은 CRM197을 운반체 단백질로 이용하여 얻어질 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 (iii) 단계 후에 활성화된 혈청형 23F 다당류를 운반체 단백질과 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 혼합 단계는
(a) 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스, 스타키오스, 멜레지토오스, 덱스트란, 만니톨, 및 락티톨 중에서 선택된 어느 하나의 당과 활성화된 혈청형 23F와 운반체 단백질을 혼합하는 단계;
(b) 상기 당과 혼합된 활성화된 혈청형 23F와 운반체 단백질을 각각 동결 건조 시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 활성화된 혈청형 23F 다당류와 운반체 단백질을 용매에 현탁시키는 단계를 포함한다.
구체적으로, 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스, 스타키오스, 멜레지토오스, 덱스트란, 만니톨, 및 락티톨 중에서 선택된 어느 하나의 당과 활성화된 혈청형 23F와 운반체 단백질은 먼저 혼합되고, 상기 당의 존재 하에서 다당류와 운반체 단백질은 동결건조될 수 있다. 바람직하게 상기 당은 수크로오스를 포함한다.
그 후, 이를 용매 존재 하에서 현탁시키며, 상기 용매는 본 발명의 목적상 DMSO(디메틸설폭시드) 용매를 이용할 수 있다.
본 발명의 방법 중 (v) 단계는 활성화된 혈청형 23F 다당류 및 운반체 단백질의 혼합물이 1:0.1 내지 5의 중량비로 혼합될 수 있으며, 바람직하게 활성화된 혈청형 23F 다당류: 운반체 단백질의 중량비는 1:1일 수 있다.
(v) 단계 후에, 다당류와 운반체가 접합체를 이루고 나서, 남아있는 반응되지 않은 카르보닐기가 존재할 수 있고, 이들은 적합한 캡핑(capping) 작용제를 이용하여 캡핑될 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 캡핑 작용제는 소디움 보로하이드라이드를 포함할 수 있고, 예를 들어, 상기 (v) 단계 후의 생성물은 15분-15시간, 15분-45분, 2-10시간 또는 3-5시간, 약 30분 또는 약 4시간 동안 소디움 보로하이드라이드와 반응될 수 있다. 한 추가 구체예에서, 캡핑은 단계 (v)의 생성물과 약 0.8 내지 0.12 몰당량의 소디움 보로하이드라이드를 혼합시킴으로써 달성된다.
본 발명은 또한 접합체를 정제시키는 추가 단계를 포함할 수 있으며, 미반응된 혈청형 23F 다당류와 운반체 단백질을 100kDa 한외여과로 투석 여과 시키는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 운반체 단백질에 공유 결합된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F 다당류를 포함하는 면역원성 접합체의 제조 방법은 다음의 구체예를 가질 수 있다.
(1) 정제된 혈청형 23F 다당류를 1mM ~ 550mM 아세트산 나트륨(NaOAc)(pH4.5)으로 희석 시키고;
(2) 혈청형 23F 다당류를 과요오드산나트륨과 반응시켜 활성화된 혈청형 23F 다당류를 생성시키고;
(3) 활성화 혈청형 23F 다당류를 100kDa MWCO 한외여과를 이용하여 아세트산 나트륨(pH7.4)으로 투석 여과 시키고;
(4) 활성화된 혈청형 23F 다당류를 수크로오스와 혼합하고;
(5) 활성화된 혈청형 23F와 운반체 단백질을 각각 동결 건조 시키고;
(6) 활성화된 혈청형 23F 다당류와 운반체 단백질을 DMSO에 재현탁시키고;
(7) 재현탁된 활성화된 혈청형 23F 다당류와 운반체 단백질을 1:1로 혼합 시키고 나트륨 시아노보로하이드라이드와 반응시켜 혈청형 23F 다당류:운반체 단백질 접합체를 생성시키고;
(8) 혈청형 23F 다당류:운반체 단백질 접합체 중의 미반응된 알데히드를 나트륨 보로하이드라이드로 캡핑시키고;
(9) 미반응된 혈청형 23F 다당류와 운반체 단백질을 100kDa 한외여과로 투석 여과 시켜;
(10) 운반체 단백질에 공유 결합된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F 다당류를 포함하는 면역원성 접합체를 생성시킴을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 (1) 의 아세트산 나트륨 대신에 Deionized Water로 희석할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 본 발명에 의해 구현된 방법으로 수득된, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F와 운반체 단백질의 결합된 접합체를 제공한다. 또한 상기 접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 즉, 일 구현예에서 상기 방법으로 수득된 활성화된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F와 CRM197의 접합체 및 이를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일 구현예에서 상기 방법으로 수득된, 적어도 300kDa 이상의 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F와 CRM197의 접합체 및 이를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 일 구현예에서 상기 방법으로 수득된, 250kDa 내지 400kDa의 크기를 갖는 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F와 CRM197의 접합체 및 이를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함할 수 있으며, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 상기 면역원성 조성물에 포함되는 첨가제 또는 부형제는 업계에서 통상적으로 사용되는 예를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 면역원성 조성물을 포함하는 백신 또는 백신으로서의 용도를 제공한다. 상기 백신은 개체에 투여하기 위해 일반적으로 사용하는 백신 투여 경로를 통해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F가 운반체 단백질과 결합된 접합체를 개체에 투여하여 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F에 의해 유발되는 폐렴, 수막염, 또는 균혈증 등을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 스트랩토코커스 뉴모니애 혈청형 23F 다당류의 면역원성 접합체 제조를 위해, 구현예는 스트랩토코커스 뉴모니애 혈청형 23F 다당류의 활성화 방법을 제공한다. 상기 방법은 통상적인 방법으로 정제된 스트랩토코커스 뉴모니애 혈청형 23F 다당류를 아세트산 나트륨(NaOAc)(pH4.5), 바람직하게 1mM ~ 550mM 농도의 아세트산 나트륨으로 희석 시키고, 이를 과요오드산나트륨과 반응시켜 활성화시키는 단계를 포함한다. 바람직하게 상기 과요오드산나트륨은 몰당량 0.07 내지 0.23, 바람직하게 0.16 몰당량을 포함할 수 있다.
본 발명의 발명자들은 본 발명의 방법을 이용하여 얻은 활성화된 혈청형 23F 다당류 접합공정에 사용 가능한 활성화 다당류를 얻으면, 활성화 후 산화도(Do), 분자량, 수율이 유사하였고, 접합 결과 접합체의 다당류/단백질 비율(PS/PR), 유리당(비접합 다당류, Free PS), 접합체의 크기(MSD, MALLS), 수율등 접합체의 특성이 유사하다는 것을 확인하였다.
특히 KH2PO4(pH7.4)를 사용하여 정제된 혈청형 23F 다당류를 희석하여 산화시켜 얻어지는 활성화된 23F 다당류는 과요오드산나트륨의 첨가량에 상관 없이 주사용수(Water For Injection, WFI)와 100mM phosphate에서는 활성화된 혈청형 23F 다당류 분자량이 50kDa 이하로 나타났으나, 본 발명의 경우에는 적어도 300kDa 이상의 활성화된 23F 다당류를 얻을 수 있었다. Phosphate buffer의 경우 효과적인 농도가 10mM로 제한적이지만, 아세트산 나트륨(pH4.5)은 10 내지 500mM의 범위에서 본 발명의 목적상 적절한 활성화된 PS를 얻을 수 있다.
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F의 백신을 제공한다.
본 발명의 접합체는 면역을 유발할 수 있다.
본 발명은 산화제 처리에 의해 다당류 크기가 감소되더라도, 면역원성을 나타내는데 적합한 정도의 크기를 얻을 수 있는 최적의 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F가 유발하는 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 접합체를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위하여 하기 실시예 등을 들어 설명한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명의 구체적 이해를 돕기 위해 예시적으로 제공되는 것이다.
실시예
1. S.
뉴모니애
협막 다당류의 제조
S. 뉴모니애 배양과 협막 다당류의 정제는 당업자에게 공지된 방법에 의해서 수행하였다. S. 뉴모니애의 혈청형 23F는 ATCC를 포함한 다양한 수탁기관이나 연구기관 등으로부터 입수할 수 있다 (Strain: Spain 23F-1[Sp264]). 협막과 비운동성, 그람 양성, lancet-shaped 쌍구균, 혈액한천배지에서 알파용혈현상으로 S. 뉴모니애를 동정하였다. 혈청형은 특정한 항혈청을 이용한 Quellung test를 바탕으로 확인하였다(미국특허 제5,847,112호).
세포은행의 제조
균주를 증대시키고 동물성 기원의 성분을 제거하기 위하여 원종균(seed stock)을 여러 세대 배양하였다(F1, F2 및 F3 세대). 원종균을 추가적으로 두 세대 더 배양하였다. 추가적인 제1세대는 F3 바이알로부터 배양하였고, 후속 세대는 추가적인 제1세대의 바이알로부터 배양하였다. 냉동보존제로서 합성 글리세롤과 함께 종균 바이알을 냉동보관하였다(-70℃ 이하). 세포 은행 제조를 위하여, 모든 배양물을 대두-기제 배지에서 증식시켰다. 냉동시키기 전에, 원심분리에 의해서 세포를 농축시키고, 사용된 배지를 제거한 후, 냉동보존제(예: 합성 글리세롤)를 함유하는 새로운 배지에 세포 펠렛을 재현탁시켰다.
접종
제조용 세포 은행 유래의 배양물을 사용하여 대두-기제 배지를 함유하는 종균병에 접종하였다. 종균병을 사용하여 대두-기제 배지를 함유하는 종균 발효기에 접종하였다.
종균배양
온도와 pH를 조절하면서 종균발효기에서 발효하였다. 목표 흡광도에 도달한 후에, 대두-기제 배지를 함유하는 생산 발효기에 접종하였다.
생산배양
생산 배양은 발효의 마지막 단계이다. 온도와 pH 및 교반 속도를 조절하였다.
불활성화
성장이 중단된 후 pH가 하락하도록 한 후 불활성화제를 첨가하여 발효를 종결시켰다. 불활성화 후 발효기의 내용물을 냉각시켰다.
정제
배양물 브로스를 원심분리하고 여과하여 세균 세포 잔해를 제거하였다. 수회의 농축/투석여과 작업, 침전/용출 및 다층여과를 사용하여 불순물을 제거하고 협막 다당류를 정제하였다.
실시예
2. S.
뉴모니애
협막 다당류와
CRM197의
접합체 제조
혈청형 23F 다당류는 활성화시킨 후 CRM197에 접합시켰다. 활성화 공정은 목표 분자량이 되도록 협막 다당류의 크기를 줄이고, 화학적으로 활성화하며, 한외여과를 통한 버퍼 교환을 포함한다. 정제 CRM197은 활성화된 다당류와 접합되며, 접합체는 한외여과를 이용하여 정제하고 최종적으로 0.22㎛ 필터로 여과한다. pH, 온도, 농도 및 시간 등의 공정 파라미터는 하기에 기재된 바와 같다.
(1) 활성화 공정
Step 1
최종 농도 범위가 1.0 내지 2.0mg/mL이 되도록 각각의 혈청형 다당류를 주사용수 및 아세트산나트륨 희석시켰다. 아세트산나트륨 완충액의 최종 농도는 0.5mM, 10mM, 120mM, 150mM, 180mM, 200mM, 300mM 그리고 500mM이 되도록 첨가하였다.
Step 2:
과요오드산염
반응
혈청형 23F 다당류 활성화에 필요한 과요오드산나트륨은 다당류 함량에 대한 몰당량 0.16을 사용하였다. 완전히 혼합하면서, 실온 (21-25℃) 에서 16 내지 20시간 동안 산화 반응을 진행시켰다.
Step 3:
한외여과
활성화된 혈청형 23F 다당류를 100 kDa MWCO 한외여과 필터로 농축 및 0.01M 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)으로 투석여과 하였다. 투과액을 폐기하고 잔류액을 0.22㎛ 필터를 통해서 여과시켰다.
| Oxidation | DW | 0.5mM NaOAc | 10mM NaOAc | 120mM NaOAc | 150mM NaOAc | 180mM NaOAc | 200mM NaOAc | 300mM NaOAc | 500mM NaOAc |
| Do (degree of oxidation) | 7.4 | 6.4 | 8.8 | 8.8 | 8.2 | 8.3 | 8.8 | 8.2 | 7.9 |
| M.W . ( kDa ) | 178 | 292 | 351 | 320 | 316 | 315 | 316 | 321 | 316 |
| Yield ( % ) | 67.3 | 53.7 | 49.3 | 51.5 | 56.5 | 53.9 | 56.2 | 60.1 | 60.0 |
상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, Acetate 버퍼를 이용하여 활성화를 진행한 결과, 10mM -500 mM 농도의 NaOAc를 사용하여 7.5 이상의 비슷한 수준의 Do값과, 300 kDa 이상의 비슷한 수준의 분자량을 얻을 수 있었다. 이러한 결과를 통해 10mM-500 mM 농도의 NaOAc를 사용하여 균일한 크기의 혈청형 23F의 다당류를 얻을 수 있는 NaOAc 완충액의 농도를 확인하였다.
Step 4: 동결건조
활성화된 혈청형 23F 다당류에 5%±3% 수크로오스 농도에 도달하도록 계산된 특정량의 수크로오스를 첨가하였다. 농축된 당류와 CRM197 운반체 단백질을 각각 유리병 속에 충전하고 동결 건조시켰다.
(2) 접합 공정
Step 1: 용해
동결건조된 활성화된 당류 혈청형 23F 및 동결건조된 CRM197 운반체 단백질을 실온에서 평형화시키고 DMSO에 재현탁시켰다.
Step 2: 접합 반응
활성화된 당류 및 CRM197 운반체 단백질을 0.8 내지 1.25g 당류/g CRM197 범위의 비로 혼합하였다. 활성화된 당류 1몰에 대해 나트륨 시아노보로하이드라이드 0.8 내지 1.2 몰당량의 비로 나트륨 시아노보로하이드라이드 용액(100mg/mL)을 첨가함으로써 접합 반응을 개시시켰다. 1%(v/v)의 목표 농도로 주사용수를 반응 혼합물에 첨가하고 혼합물을 23℃±2℃에서 24시간 항온처리하였다. 100mg/mL의 나트륨 보로하이드라이드 용액(활성화된 당류 1몰 당 통상적으로 나트륨 보로하이드라이드 1.8 내지 2.2 몰당량) 및 주사용수(목표 농도 5% v/v)를 반응물에 첨가하고 혼합물을 23℃±2℃에서 4.5시간 동안 항온처리하였다. 이 과정을 통해서, 당류에 존재하는 반응하지 않은 임의의 알데히드를 환원시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 0.9% 염화나트륨으로 희석하고, 희석된 접합체 혼합물을 0.45㎛ 필터를 통해서 여과시켰다.
단계 3:
한외여과
희석된 접합 혼합물을 최소 20 용적의 0.9% 염화나트륨 또는 완충액을 사용하여 100 kDa MWCO 한외여과필터에 농축 및 투석여과시켰다. 투과액을 폐기하였다.
단계 4: 멸균 여과
100 kDa MWCO 투석여과 후의 잔류액을 0.22㎛ 필터를 통해서 여과시켰다. 여과된 산물 23F-CRM197 접합체에 대해 제조과정 중 제어(당류 함량, 유리 단백질, 유리 당류, 잔여 시아나이드 및 잔여 DMSO)를 실시하였다. 여과시킨 잔류액에 대해 제조과정 중 제어를 실시하여 추가적인 농축, 투석여과 및/또는 희석이 필요한지의 여부를 결정하였다. 필요한 경우, 여과된 접합체를 최종 농도가 0.55g/L 미만이 되도록 0.9% 염화나트륨을 사용하여 희석시켰다. 이 단계에서 당류 함량, 단백질 함량 및 당류:단백질 비에 대한 유리 시험을 실시하였다. 접합체를 여과시키고(0.22㎛) 유리 시험(외관, 유리 단백질, 유리 당류, 내독소, 분자 크기 결정, 잔여 시아나이드, 잔여 DMSO, 당류 동일성 및 CRM197 동일성)을 실시하였다. 최종 접합체 농축액을 2 내지 8℃에 냉장 보관하였다.
|
Sodium acetate
Conc . ( mM ) |
Activated PS M.W. ( kDa ) | Scale (mg) | Ratio (PS/PR) | Free PS (%) | MSD ( % ) | MALLS (kDa) |
Conjugation
yield (%) |
| 0 (DW) | 178 | 196.0 | 0.75 | 11.7 | 32 | 721 | 56.6 |
| 0.5 | 292 | 192.4 | 0.85 | 13.8 | 40 | 753 | 51.7 |
| 10 | 351 | 162.1 | 0.72 | 1.6 | 47 | 953 | 50.7 |
| 120 | 320 | 170.3 | 0.72 | 0.2 | 44 | 900 | 49.5 |
| 150 | 316 | 183.6 | 0.74 | 0.7 | 46 | 907 | 53.1 |
| 180 | 315 | 178.6 | 0.71 | 1.5 | 45 | 897 | 52.4 |
| 200 | 316 | 185.9 | 0.71 | 0.6 | 42 | 825 | 47.4 |
| 300 | 321 | 211.6 | 0.76 | 3.0 | 51 | 1106 | 54.4 |
| 500 | 316 | 214.5 | 0.66 | 0.0 | 58 | 1490 | 37.0 |
상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, DW를 사용하는 경우와 5mM의 Sodium acetate 를 사용하는 경우에는 300 kDa 이하의 활성화된 다당류를 얻었고, 이를 이용하여 제조한 접합체의 면역원성도 저조한 것을 알 수 있었다(면역원성 결과는 실시예 4).
실시예
3. 폐렴구균 접합체 백신의 제제화
배치 용적(batch volume) 및 혈청형 23F 접합체 당류 농도를 기준으로 하여 최종 원액의 필요량을 계산하였다. 필요량의 0.85% 염화나트륨(생리 식염수), 폴리솔베이트 80 및 석시네이트 완충액을 미리 라벨링한 제제화 용기에 첨가한 후에, 접합체 농축액을 첨가하였다. 충분히 혼합하고 0.22㎛ 필터를 통해서 여과시켰다. 알루미늄 포스페이트의 첨가 후에 제제화된 완제액을 서서히 혼합하였다. 제제화된 제품을 2 내지 8℃에서 보관하였다. 얻어진 백신 조성물은 총 0.5 mL 중에 2 ㎍의 당류, 약 2.5㎍의 CRM197 운반체 단백질; 0.125 mg의 알루미늄 원소(0.5 mg 알루미늄 포스페이트) 애주번트; 염화나트륨 약 4.25 mg; 석시네이트 완충액 약 295 ㎍; 및 폴리솔베이트 80 약 100 ㎍을 함유하였다.
실시예
4. 23F 접합체의 면역원성 평가
OPA assay로 혈청을 분석하여 항체의 기능을 평가하였다. 각 개체 별로 동일한 양의 혈청을 취하여 10-배씩 희석하였다. Opsonization buffer를 이용하여 serial dilution (계단희석) 한 혈청 20 uL 에 희석한 적절히 희석한 에스.뉴모니애 10uL를 혼합하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 혈청-에스.뉴모니애 반응액에, 미리 분화시킨 HL-60 세포와 보체의 혼합액을 첨가하고 CO2 배양기(37℃)에서 45분간 반응하였다. 온도를 낮춰 식세포 작용을 중단시키고 반응액 10uL를 미리 30 내지 60분간 말린 THY 한천배지에 도말하였다. 도말 후, 반응액이 THY 한천 배지에 완전히 흡수되면, TTC가 포함된 THY 한천배지를 추가로 중층(overlay)해주었다. CO2 배양기(37℃)에서 12 내지 18시간 배양하고 군집의 개수를 세었다. OPA 역가는 50% 사멸이 관찰되는 희석배수로 표현하였다. 그 결과는 하기 표 3과 같다.
| Group | 활성화 공정에서 완충액 농도 | Geometric mean titer (95% CI*) |
| 1 | DW | 1002 (462.6-2171.9) |
| 2 | 0.5mM NaOAc | 340 (122.4-943.5) |
| 3 | 10mM NaOAc | 3013 (1596.6-5686.3)+ |
| 4 | 150mM NaOAc | 2976 (857.9-10321.0)+ |
*CI: confidence interval
그룹1, 2에 대한 그룹3, 4의 유의성:+(P<0.05)
혈청형 23F의 다당류가 10mM 또는 150mM의 완충액 농도에서 활성화되어 제조된 접합체(그룹3, 4)가 DW 또는 0.5mM의 완충액 농도에서 활성화된 접합체(그룹 1, 2)보다 유의하게 MOPA 역가가 높게 나타났다.
Claims (16)
- (i) 정제된 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F의 협막 다당류를 아세트산 나트륨(NaOAc) 완충액에 혼합하여 혼합물을 얻는 단계;
(ii) 상기 혼합물과 산화제를 반응시켜 활성화된 혈청형 23F 다당류를 생성시키는 단계;
(iii) 활성화된 혈청형 23F 다당류를 아세트산 나트륨으로 여과시켜 적어도 300kDa 을 갖는 활성화된 혈청형 23F 다당류를 선택하는 단계;
(iv) 활성화된 혈청형 23F 다당류를 운반체 단백질과 혼합하는 단계; 및
(v) 활성화된 혈청형 23F 다당류 및 운반체 단백질의 혼합물에 환원제를 첨가하여 컨쥬게이션시켜 활성화된 혈청형 23F 다당류 및 운반체 단백질의 접합체를 형성하는 단계를 포함하는,
스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 (i) 단계의 아세트산 나트륨(NaOAc)은 pH4.5에서 1 내지 550 mM의 농도를 갖는, 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 (i) 단계의 아세트산 나트륨(NaOAc)은 pH4.5에서 10 내지 500mM의 농도를 갖는, 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (ii) 단계의 산화제는 0.07 내지 0.23 몰당량을 갖는 과요오드화나트륨인, 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 (ii) 단계의 산화제는 0.16의 몰당량을 갖는 과요오드화나트륨인, 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (iii) 단계의 여과는 100kDa MWCO 한외여과를 이용하여 pH4.5의 아세트산 나트륨 완충액으로 투석여과하는 것을 특징으로 하는 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (iii) 단계 후에 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스, 스타키오스, 멜레지토오스, 덱스트란, 만니톨, 및 락티톨 중에서 선택된 어느 하나 이상의 당과 활성화된 혈청형 23F와 운반체 단백질을 혼합한 후, 이를 동결 건조하는 것을 특징으로 하는 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (iv) 활성화된 혈청형 23F 다당류를 운반체 단백질과 혼합하는 단계는
(a) 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스, 스타키오스, 멜레지토오스, 덱스트란, 만니톨, 및 락티톨 중에서 선택된 어느 하나 이상의 당을 활성화된 혈청형 23F와 운반체 단백질과 혼합하는 단계;
(b) 상기 당과 혼합된 활성화된 혈청형 23F와 운반체 단백질을 각각 동결 건조 시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 활성화된 혈청형 23F 다당류와 운반체 단백질을 용매에 현탁시키는 단계를 포함하는,
스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법. - 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 당은 수크로오스인 것을 특징으로 하는 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 (c) 단계의 용매는 DMSO 인 것을 특징으로 하는 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (v) 단계는 활성화된 혈청형 23F 다당류 및 운반체 단백질의 혼합물이 1:0.1 내지 5의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (v) 단계의 환원제는 소디움 시아노보로하이드라이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 스트랩토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae) 혈청형 23F와 운반체 단백질의 접합체를 제조하는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중에서 선택된 어느 하나의 항의 방법으로 수득된, 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F 다당류가 운반체 단백질과 결합된 접합체를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 접합체에서의 혈청형 23F 다당류는 250kDa 내지 400kDa의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
- 제1항 내지 제12항 중에서 선택된 어느 하나의 항의 방법으로 수득된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F가 운반체 단백질과 결합된 접합체를 개체에 투여하여 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F에 의해 유발되는 폐렴을 예방 또는 치료하는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중에서 선택된 어느 하나의 항의 방법으로 수득된 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23F가 운반체 단백질과 결합된 접합체의 백신으로의 용도.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| KR1020190062757A KR20200136756A (ko) | 2019-05-28 | 2019-05-28 | 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23f의 면역원성 접합체 제조방법 |
| PCT/KR2020/006863 WO2020242199A1 (ko) | 2019-05-28 | 2020-05-27 | 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23f의 면역원성 접합체 제조방법 |
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| KR1020190062757A KR20200136756A (ko) | 2019-05-28 | 2019-05-28 | 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23f의 면역원성 접합체 제조방법 |
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| KR20200136756A true KR20200136756A (ko) | 2020-12-08 |
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