CN118105477A - 多价b群链球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

多价b群链球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118105477A
CN118105477A CN202211519246.0A CN202211519246A CN118105477A CN 118105477 A CN118105477 A CN 118105477A CN 202211519246 A CN202211519246 A CN 202211519246A CN 118105477 A CN118105477 A CN 118105477A
Authority
CN
China
Prior art keywords
group
streptococcus
polysaccharide
protein conjugate
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211519246.0A
Other languages
English (en)
Inventor
黄镇
陈玉秋
吴凯
施競
袁琳
方国良
樊会兰
向左云
姜玲
李永贵
杨志萍
龚雅琼
伏红亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Watson Innovation Biotechnology Co ltd
Yuxi Walvax Biotechnology Co ltd
Walvax Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Sichuan Watson Innovation Biotechnology Co ltd
Yuxi Walvax Biotechnology Co ltd
Walvax Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Watson Innovation Biotechnology Co ltd, Yuxi Walvax Biotechnology Co ltd, Walvax Biotechnology Co ltd filed Critical Sichuan Watson Innovation Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211519246.0A priority Critical patent/CN118105477A/zh
Publication of CN118105477A publication Critical patent/CN118105477A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了多价B群链球菌多糖‑蛋白结合物组合物及其制备方法和应用，所述组合物包含6种B群链球菌多糖‑蛋白结合物，每种B群链球菌多糖‑蛋白结合物由Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型B群链球菌荚膜多糖和纯度≥90％的破伤风类毒素载体蛋白结合而成。母体接种含6个血清型的B群链球菌多糖‑蛋白结合物后，产生针对上述6个血清型B群链球菌的抗体，可预防母体怀孕过程中因6个型的B群链球菌感染引起的早产、死胎、产褥期综合征等疾病，同时母体通过脐带将6个型B群链球菌的抗体传递给胎儿，使胎儿在出生时就具备了6个血清型B群球菌的抗体，预防新生儿因B群链球菌感染引起的疾病。

Description

多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及B群链球菌蛋白结合物领域，尤其涉及多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
B群链球菌(Group B Streptococcus，GBS)也称无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)，为兼性厌氧的产微荚膜的革兰氏阳性球菌，β溶血，导致疾病的主要毒力因子有荚膜多糖(CPS)、β-溶血素、C蛋白等。根据荚膜多糖不同GBS又分为10个血清型：Ia，Ib，II， III，IV，V，VI，VII，VIII和IX型，每个血清型的荚膜多糖都具有独特的抗原性和结构。
GBS通常定植于尿道、胃肠道、女性阴道及婴儿上呼吸道，是引发女性生殖道感染的重要原因之一，健康人生殖道与肠道内GBS携带率达10％-35％左右，在青春前期儿童中大约为10％，育龄期女性(不考虑妊娠情况)为30％，妊娠妇女带菌率为10％-30％，男性为25％，健康老年人为22％。GBS感染孕妇中，40％～70％发生垂直传播，带菌的婴儿中约1％～3％早期出现侵入性感染，其中5％-8.5％会致死。GBS对成人的侵袭力较弱，主要对肾盂肾炎、子宫内膜炎、糖尿病和泌尿生殖道功能失调、肿瘤和免疫功能低下者易感。目前已成为围产期母婴感染的主要致病菌之一，在围产医学中占有不可忽视的地位。产妇直肠阴道定植是新生儿GBS感染的主要的危险因素，40％～70％的孕妇在分娩过程中通过脐带或产道垂直传染给新生儿，引起新生儿早发型(EOD)或迟发型(LOD)侵袭性GBS 感染，导致新生儿菌血症、败血症、肺炎和脑膜炎等严重侵袭性感染。
在无GBS疫苗的情况下，WHO目前推荐分娩时预防性抗生素(IAP)静脉注射治疗GBS定植的妇女，预防新生儿GBS感染，但该但该方法的推行存在很多的风险和局限性。在高收入国家，筛查妊娠第35周和第37周之间的直肠阴道定植和使用预防性产时抗生素是预防GBS感染的主要手段这些策略有助于降低早发性疾病(EOD)(<7天)感染GBS的发生率，但不能降低晚发性疾病(LOD)(出生后3个月7天)的发生率。在中低收入国家分娩时预防性抗生素(IAP)静脉注射治疗措施十分困难，感染占据了死亡原因的75％。而且采用IAP处理无法预防IAP处理前的侵袭性GBS疾病的发生，即在早产的情况下，产时抗生素预防为时过晚，也不能预防LOD型GBS疾病。因此开发有效疫苗是预防孕产妇及新生儿GBS感染的最佳途径。
目前全球均未批准多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物上市，国外GSK公司的3价GBS结合疫苗包括Ia、Ib、Ⅲ三个血清型与CRM197载体蛋白结合，目前正在phase II 临床试验研究，辉瑞公司的6价GBS多糖蛋白结合疫苗也采用CRM197为载体蛋白，正在进行II期临床研究。其中根据辉瑞公司发表的“A novel hexavalent capsular polysaccharideconjugate vaccine(GBS6)for the prevention of neonatal group B streptococcalinfections by maternal immunization”研究结果表明用含5μg/型的其6价GBS多糖蛋白结合疫苗(CRM197为载体蛋白)免疫母鼠后，分别用Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型105～107CFU的活菌攻以击出生24h内的新生小鼠，攻击后观察90h，新生小鼠的存活率仅为≥50％。
另外，现有疫苗采用的载体蛋白破伤风类毒素(TT)为破伤风梭状芽孢杆菌经发酵后，经提取、精制、脱毒制备而得，根据《中国药典》2015版，制备疫苗的破伤风类毒素的纯度要求为≥1500Lf/mg蛋白氮，根据文献及生产破伤风类毒素的经验，生产获得的破伤风类毒素纯度一般在1500-3000Lf/mg蛋白氮，由此数据可以看出：不同批次的破伤风类毒素纯度有较大的差别，其中含有比例不小的杂蛋白。根据文献资料，现行药典工艺制备的破伤风类毒素其中的单体纯度仅在约55-70％。而如果采用含有较多杂蛋白的破伤风类毒素用于与GBS球菌多糖结合，势必影响载体蛋白的效果和结合物中游离蛋白的含量，并进而影响GBS球菌多糖结合物的免疫原性和安全性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用，所述组合物包含6个血清型的B群链球菌多糖蛋白结合物组合物能诱导机体产生对B群链球菌多糖的T细胞依赖的体液免疫，母体接种含6个血清型的B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物后，产生针对6个血清型B群球菌的抗体，可预防母体怀孕过程中因6个型的B群链球菌感染引起的早产、死胎、产褥期综合征等疾病，同时母体通过脐带将6个型的B群链球菌抗体传递给胎儿，使胎儿在出生时就具备了6个血清型B群球菌的抗体，从而预防新生儿因6个型的B群链球菌感染引起的疾病，免疫性和保护效力更高。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物，所述组合物包含6种B群链球菌多糖-蛋白结合物，每种B群链球菌多糖-蛋白结合物由相应B群链球菌血清型的荚膜多糖和载体蛋白共价结合形成；所述B群链球菌多糖选自Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型B群链球菌荚膜多糖，所述载体蛋白是纯度≥90％的破伤风类毒素。
作为优选，所述Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型B群链球菌荚膜多糖具备如下质量标准；
作为优选，Ia型、Ib型、V型B群链球菌多糖在活化、衍生前使用超声波降解，将多糖分子大小降低到在HPSEC方法TSKgel G4000PWXL柱上检测KD值在0.20-0.60范围。
作为优选，各型B群链球菌多糖-蛋白结合物具有如下多糖蛋白比：Ia型B群链球菌多糖蛋白结合物0.15-0.80，Ib型B群链球菌多糖蛋白结合物0.15-0.80，Ⅱ型B群链球菌多糖蛋白结合物0.15-0.90，Ⅲ型B群链球菌多糖蛋白结合物0.10-0.70，Ⅳ型B群链球菌多糖蛋白结合物0.15-0.70，Ⅴ型B群链球菌多糖蛋白结合物0.15-0.90。
作为进一步优选，Ia型B群链球菌多糖蛋白结合物0.20-0.50，Ib型B群链球菌多糖蛋白结合物0.20-0.60，Ⅱ型B群链球菌多糖蛋白结合物0.20-0.70，Ⅲ型B群链球菌多糖蛋白结合物0.15-0.45，Ⅳ型B群链球菌多糖蛋白结合物0.15-0.45，Ⅴ型B群链球菌多糖蛋白结合物0.20-0.55。
作为优选，各型B群链球菌多糖-蛋白结合物分子大小用HPSEC方法TSKgelG4000PWXL柱上检测KD值≥0.4的回收率≥80％，游离多糖含量均≤40％，游离蛋白含量均≤5％。
本发明第二方面，还提供所述多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤(1)各型B群链球菌工作种子在发酵罐中发酵培养，培养结束采用脱氧胆酸钠杀菌，离心，去除菌体，经乙醇分级沉淀法提取B群链球菌荚膜多糖粗糖；B群链球菌荚膜多糖粗糖采用醋酸钠溶液(饱和醋酸钠溶液稀释至5％～20％)溶解后，用苯酚抽提去除蛋白，经超滤及分级乙醇沉淀去除杂质和沉淀多糖，收集沉淀后用易挥发的有机溶剂洗涤后真空抽干，即为B群链球菌荚膜多糖；
步骤(2)Ia型、Ib型、V型B群链球菌采用注射用水溶解后，超声波降解多糖至在HP-SEC方法TSKgel G4000PWXL柱上检测KD值在0.20-0.60范围，获得降解的Ia型、Ib 型、V型B群链球菌荚膜多糖；
步骤(3)降解后的Ia型、Ib型、Ⅴ型群链球菌荚膜多糖和Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型多糖均采用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸酯(CDAP)活化后，加入ADH衍生，超滤后得到B 群链球菌多糖衍生物；
步骤(4)在EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)存在下，将6个型别的B群链球菌多糖衍生物分别与纯度≥90％的破伤风类毒素载体蛋白结合，上Sepharose 4FF柱纯化，收集KD 0.4之前的组分，经除菌过滤后为B群链球菌多糖-TT结合物原液；
步骤(5)6个型别的B群链球菌多糖-TT结合物原液分别加入磷酸铝佐剂、PBS和氯化钠溶液至所需目标体积，吸附至少1h后，再将6个型的吸附液混合后，搅拌混匀不低于1h后分装。
作为优选，加入磷酸铝至终浓度0.25mg/mL～2mg/mL，再加入5mmol/L～20mmol/L的 PBS和0.75％～0.95％氯化钠溶液至所需目标体积。
本申请采用的PBS缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
作为优选，细菌发酵液用0.05％-0.3％脱氧胆酸钠溶液杀菌15-120min，离心收集上清液，上清液进行超滤。乙醇分级沉淀获得粗多糖。粗多糖溶解于饱和中性乙酸钠中，冷酚抽提去除蛋白，30～100KD的超滤膜超滤去除杂质，再用有机溶剂沉淀去核酸，超滤去杂质，有机溶剂沉淀，离心收集沉淀，真空抽干获得精制多糖。
作为优选，Ia型、Ib型、V型B群链球菌荚膜多糖，分别采用注射用水溶解为 5-10mg/mL，分别于冰浴条件下，进行超声波处理，超声波功率为350～400W，超声6-10 秒，暂停1-5秒的条件下，超声2-10分钟，降解至在HP-SEC方法TSKgel G4000PWXL 柱上检测KD值在0.20-0.60范围。
本发明第三方面，还提供所述B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物用于制备诱导对B 群链球菌的体液免疫应答的药物或疫苗的用途。各型B群链球菌多糖-蛋白结合物注射小鼠体内试验，与生理盐水对照组相比，多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物免疫组新生小鼠对Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型攻击的保护效力均为100％。
进一步地，所述药物或疫苗适用于18-49岁育龄女性人群。用于预防18-49岁育龄女性(含孕妇)B群链球菌Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型感染引起的流产、死胎、早产和新生儿早发型、迟发型GBS的感染以及由B群链球菌感染导致的新生儿肺炎、脑膜炎、败血症等疾病。
进一步地，所述B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物配制成每毫升含有：除了B群链球菌Ia型多糖为5～15μg外，其余血清型B群链球菌多糖均为7～13μg；并且该组合物还每毫升含有0.25～1mg磷酸铝佐剂、7.5～9.5mg氯化钠、41.1μg～164.4μg磷酸二氢钠和 22.4μg-89.6μg磷酸氢二钠。
本发明的特点如下：GBS链球菌荚膜多糖为重复单元组成的长链分子，其分子量较大，使得荚膜多糖与载体蛋白的结合形成可制备疫苗的GBS球菌多糖-蛋白结合物面临极大的技术挑战。细菌多糖与载体蛋白共价结合之后，由T细胞非依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原，而细菌多糖-蛋白结合物的免疫原性取决于细菌多糖的分子量大小、衍生结合工艺、载体蛋白、结合物纯化方法、结合物的质量控制标准以及佐剂等多重因素的影响，而这些因素之间是相互关联的，均对免疫原性有着重要影响。
细菌荚膜多糖是由多糖重复单元通过糖苷键链接的长链分子，研究表明细菌荚膜多糖的免疫原性与其分子大小直接相关，对于脑膜炎球菌多糖疫苗、伤寒Vi多糖疫苗、肺炎球菌多糖疫苗均将多糖分子大小作为关键控制指标，且制定了分子大小的下限以确保多糖疫苗的免疫原性。而目前尚未有GBS球菌多糖的分子大小标准，本申请通过多次试验发现HPSEC方法TSKgel G4000PWXL柱上检测KD值<0.7的回收率应≥80％的GBS多糖免疫原性更高。本发明还研究了荚膜多糖中唾液酸含量和氨基己糖对免疫性会造成影响，具体含量标准如下：
本发明通过控制荚膜多糖中唾液酸和氨基己糖含量保证各个型别的荚膜多糖的抗原纯度以及免疫原性。
另外，本发明通过大量的工艺研究及动物免疫原性试验证明采用超声降解将Ia型、Ib 型和V型GBS链球菌多糖部分降解到在Sepharose CL-4B上检测的Kd值在0.20-0.60之后，再进行多糖的活化衍生，不但提高了GBS球菌多糖蛋白结合物在动物体内的免疫原性，同时也提高了收率、工艺重复稳定性和结合物的过滤特性，并降低了游离多糖含量。
在本发明研制初期，进行了GBS链菌多糖与多种载体蛋白的结合工艺比较，分别采用破伤风类毒素、单体纯度90％的破伤风类毒素、白喉类毒素、重组CRM197和重组乙肝表面抗原(rHBsAg)与各型GBS多糖进行了结合，并在动物体内进行了免疫原性评价，结果表明：但以采用单体纯度90％破伤风类毒素为载体蛋白的抗体滴度GMT(几何平均滴度)最高，所以筛选单体纯度90％的破伤风类毒素作为GBS链球菌多糖蛋白结合疫苗的载体蛋白。
本发明制备工艺中杀菌采用脱氧胆酸钠，杀菌时间短，易于操作和放大；多糖采用物理降解，不破坏多糖抗原决定簇，降解多糖分子量分布在Kd0.2～0.6之间；多糖采用CDAP在水溶液中进行活化，然后与ADH衍生后进行间接结合，反应周期短，无大量有机废物产生。另外采用柱层析纯化，用pH6.3～7.2的10mM PB+0.85％NaCl溶液作为洗脱液，收集KD0.4前的结合物洗脱液，结合物收率高达40％。故本申请缩短了工艺周期，减少了环境污染，提高了产品收率和大规模生产的可行性，降低了生产成本。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明使用单体纯度大于90％的破伤风类毒素作为载体蛋白与GBS链球菌多糖结合，有利于提高GBS链球菌多糖蛋白结合物的免疫原性同时降低结合物中的游离蛋白、游离多糖含量。
本申请用含2μg/型的多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物免疫母鼠后，分别用Ia 型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型105～107CFU的活菌攻击出生24h内的新生小鼠，攻击后观察120h新生小鼠的存活率均为100％，即本申请多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物对小鼠Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型的保护效率均为100％。
附图说明
图1为6价B群链球菌多糖结合疫苗第2正免疫母鼠后2周，用105～107CFU的菌液攻击新生小鼠的生存曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
实施例1B群链球菌多糖的制备
分别将Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型B群链球菌工作种子接种于发酵罐中，于36±2℃进行发酵培养后，采用0.1～0.3％的脱氧胆酸钠杀菌，8℃条件下离心15～30min，去除菌体，收集上清液。用30～100KD的超滤膜超滤，加入乙醇至浓度为20～35％，进行一级乙醇沉淀，然后再加入乙醇至浓度为60％～80％，进行二级乙醇沉淀，10000rpm、8℃条件下离心15min收集沉淀，洗涤沉淀后真空抽干，即为B群链球菌粗多糖。
B群链球菌粗糖采用醋酸钠溶液(饱和醋酸钠溶液稀释至10％～15％)溶解至 5-20mg/mL后，用0.2-2倍的苯酚抽提3～5次去除蛋白，用30～50KD的超滤膜超滤，加入的乙醇至浓度为20％～30％沉淀后，离心收集上清，再用30～50KD的超滤膜超滤，加入的乙醇至浓度为60～80％的沉淀，离心收集沉淀，易挥发有机溶剂(乙醇、乙醚或丙酮)洗涤后，真空抽干即得B群链球菌多糖。
表1B群链球菌多糖检测结果
实施例2Ia型、Ib型、V型B群链球菌多糖的降解
B群链球菌Ia型、Ib型、V型多糖，分别用注射用水溶解为5-10mg/mL，分别于冰浴条件下，进行超声波处理，超声波功率为350～400W，超声6秒，暂停3秒的条件下，超声2-10分钟。超声降解后的多糖采用HP-SEC方法TSKgel G4000PWXL柱上检测，以0.9％氯化钠溶液为流动相；流速为每分钟0.4mL；检测器：示差检测器，检测器温度：40℃，记录时间为45分钟，柱温：30℃，进样体积：50ul。
表2B群链球菌Ia型、Ib型、V型多糖超声降解后检测结果
多糖型别 分子大小(KD值)
Ia型 0.36
Ib型 0.26
V型 0.33
实施例3Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型B群链球菌多糖的活化衍生
分别取B群链球菌多糖各100mg，分别按多糖：CDAP为1:0.5～1:1的质量比加入CDAP，控制pH9.0±1反应2～15min，然后再分别加入500mg的1,6-己二酰肼，维持pH9.0±1反应30～60min，用10KD的超滤膜超滤，即分别制得B群链球菌Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型多糖-己二酰肼衍生物(多糖-AH衍生物)。
表3衍生物的检测结果
项目 衍化率(％) 衍生物KD值
Ia型B群链球菌多糖衍生物 3.4 0.32
Ib型B群链球菌多糖衍生物 2.9 0.24
Ⅱ型B群链球菌多糖衍生物 3.5 0.31
Ⅲ型B群链球菌多糖衍生物 4.7 0.36
Ⅳ型B群链球菌多糖衍生物 3.2 0.44
Ⅴ型B群链球菌多糖衍生物 4.8 0.31
实施例4Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型B群链球菌多糖与破伤风类毒素载体蛋白的结合
在2～8℃条件下，分别取各型B群链球菌多糖-AH衍生物，按多糖-AH衍生物：破伤风类毒素为1：0.5-1：1.5的质量比加入破伤风类毒素载体蛋白(TT)，调节体系pH为 5.5±0.5，加入EDAC至终浓度0.01～0.1mol/L，反应2-4小时。上样于Sepharose 4FF柱，用10mmol/L PB+0.85％NaCl溶液洗脱，收集KD 0.4及以前的组分，经除菌过滤后，为B 群链球菌多糖-TT结合物原液。
表4各型B群链球菌多糖-TT结合物原液检测结果
实施例5 6价B群链球菌多糖结合疫苗半成品配制、分装
6个型B群链球菌多糖-TT结合物原液分别加入磷酸铝佐剂至终浓度1.0mg/mL，加入 10mmol/L的PBS+0.85％氯化钠溶液至所需目标体积吸附，再将6个单型的吸附液混合，搅拌混匀后分装。使1mL含B群链球菌多糖Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型各10.0μg，磷酸二氢钠0.822mg/mL，磷酸氢二钠0.448mg/mL，氯化钠8.5mg/mL，磷酸铝佐剂 1.0mg/mL。
实施例6 6价B群链球菌多糖蛋白结合物组合物新生小鼠保护效力
母鼠接种6价B群链球菌(GBS)多糖结合疫苗共2针，第1针免疫于孕前21天左、右侧大腿肌肉各注射0.1mL，第2针免疫于孕后第7天左、右侧大腿肌肉各注射0.1mL；新生小鼠出生后24小时内，分别用6个型105～107CFU的活菌经腹腔注射新生小鼠。连续观察小鼠一般状态5d，前12h每4h记录1次死亡数，以后每12h记录1次死亡数；
用生理盐水做对照，方法及攻毒菌浓度同疫苗组。连续观察小鼠一般状态5d，前12h 每4h记录1次死亡数，以后每12h记录1次死亡数。
实验结果如图1所示，图1表明：母鼠用6价B群链球菌多糖结合疫苗第2针免疫后 2周，小鼠出生，用105～107CFU各型菌体攻击出生24h内的新生小鼠，与生理盐水对照组相比，6价B群链球菌多糖结合疫苗对新生小鼠针对6个血清型的保护效力均为100％。实施例76价B群链球菌多糖蛋白结合物组合物免疫母鼠后新生乳鼠血清抗体滴度的检测
6价B群链球菌多糖蛋白结合物组合物疫苗组：每窝小鼠随机取3只，共8窝，采集血液共24份。
生理盐水对照组：每窝小鼠随机取3只，共8窝，采集血液共24份。
血清处理：全血2～8℃静置过夜，8℃、5000rpm离心10分钟，收集血清，用ELISA 法检测抗体。
表5新生乳鼠血清中6个型特异性抗体水平检测结果
Ia型 Ib型 II型 III型 IV型 V型
GMT 3175 3364 4000 3462 8000 4621
由表5可知，小鼠接种6价B群链球菌多糖蛋白结合物组合物疫苗后，抗体水平都较高。
实施例8用不同蛋白作为载体蛋白制备的各型多糖结合物免疫原性
按照实施例1～4的方法，分别采用破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素无毒变异体(CRM197)、白喉毒素(DT)、rEPA、OMP作为载体制备结合物，分别用6个型别的不同载体蛋白的结合物肌肉注射免疫CD-1小鼠共2针(0，28天各免1针)，每组免疫10 只小鼠，每只小鼠免疫含各型多糖为1μg的结合物，第2针免疫后14天采集小鼠血清， ELISA检测抗体水平，结果如表6-表11所示。
表6Ia型多糖不同载体蛋白结合物免疫原性比较
由表6可看出：Ia型用TT为载体蛋白与用CRM197、DT、rEPA、OMP为载体蛋白的结合物免疫原性相比，抗体水平均具有显著差异(P＜0.05)
表7Ib型多糖不同载体蛋白结合物免疫原性比较
由表7可看出：Ib型用TT为载体蛋白与用CRM197、rEPA和OMP为载体蛋白的结合物免疫原性相比，抗体水平具有差异(P＜0.05).
表8II型多糖不同载体蛋白结合物免疫原性比较
由表8可看出：II型用TT为载体蛋白与用CRM197、DT、rEPA、OMP为载体蛋白的结合物免疫原性相比，抗体水平均具有差异(P＜0.05).
表9III型多糖不同载体蛋白结合物免疫原性比较
由表9可看出：III型用TT为载体蛋白与用rEPA、OMP为载体蛋白的结合物免疫原性相比，抗体水平具有显著差异(P＜0.05)。
表10IV型多糖不同载体蛋白结合物免疫原性比较
由表10可看出：IV型用TT为载体蛋白与用CRM197、DT、rEPA、OMP为载体蛋白的结合物免疫原性相比，抗体水平均具有显著差异(P＜0.05)。
表11V型多糖不同载体蛋白结合物免疫原性比较
由表11可看出：V型用TT为载体蛋白与用rEPA、OMP为载体蛋白的结合物免疫原性相比，抗体水平具有显著差异(P＜0.05)。
实施例9不同唾液酸和氨基己糖含量的精糖的免疫原性
Y1：按照实施例1的方法制备Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型多糖。
Y2：按照实施例1的方法制备Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型多糖制备B群链球菌粗糖，然后用5％～10％饱和醋酸钠溶液溶解后，用苯酚抽提1次去除蛋白，用30～50KD的超滤膜超滤，用15％的乙醇沉淀后，离心收集上清，再用30～50KD的超滤膜超滤，用 45％的乙醇沉淀，离心收集沉淀，易挥发有机溶剂洗涤后，真空抽干即得Y2。
分别用Y1、Y2按照实施例2～4的方法制备结合物，分别用各型结合物肌肉注射免疫 CD-1小鼠共2针(0，28天各免1针)，每组免疫10只小鼠，每只小鼠免疫含各型多糖为1μg的结合物，第2针免疫后14天采集小鼠血清，ELISA检测抗体水平；
Y1和Y2多糖检测结果如表12所示，Y1各型多糖唾液酸含量和氨基己糖含量符合质量标准，且高于Y2；Y2各型多糖唾液酸含量和氨基己糖含量低于质量标准。用Y1和Y2 多糖分别制备的结合物免疫CD-1小鼠，结果如表13所示，Y1样各型多糖制备的结合物免疫小鼠阳转率均为100％，Y2样各型多糖制备的结合物免疫小鼠阳转率在30～40％之间；且Y1样各型多糖制备的结合物免疫小鼠产生的抗体水平(GMT)与Y2样各型多糖制备的结合物免疫小鼠产生的抗体水平(GMT)相比，有显著差异(p＜0.01)。
表12各型不同唾液酸和氨基含量的精糖检测结果
表13各型不同唾液酸和氨基己糖含量的精糖制备结合物的免疫小鼠的阳转率和抗体水平
由表12和表13可看出，控制唾液酸和氨基己糖含量能提高其抗体水平和免疫原性。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物，其特征在于，所述组合物包含6种B群链球菌多糖-蛋白结合物，每种B群链球菌多糖-蛋白结合物由相应B群链球菌血清型的荚膜多糖和载体蛋白共价结合形成；所述B群链球菌多糖选自Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型B群链球菌荚膜多糖，所述载体蛋白是纯度≥90％的破伤风类毒素。
2.根据权利要求1所述的多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物，其特征在于，所述Ia型、Ib型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型B群链球菌荚膜多糖具备如下质量标准；
3.根据权利要求1所述的多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物，其特征在于，所述Ia型、Ib型和V型B群链球菌多糖在活化、衍生前使用超声波降解，将多糖分子大小降低到在HPSEC方法TSKgelG4000PWXL柱上检测KD值在0.20-0.60范围。
4.根据权利要求书1所述B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物，其特征在于，各型B群链球菌多糖-蛋白结合物具有如下多糖蛋白比：Ia型B群链球菌多糖蛋白结合物0.15-0.80，Ib型B群链球菌多糖蛋白结合物0.15-0.80，Ⅱ型B群链球菌多糖蛋白结合物0.15-0.90，Ⅲ型B群链球菌多糖蛋白结合物0.10-0.70，Ⅳ型B群链球菌多糖蛋白结合物0.15-0.70，Ⅴ型B群链球菌多糖蛋白结合物0.15-0.90。
5.根据权利要求书1所述B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物，其特征在于，各型B群链球菌多糖-蛋白结合物分子大小用HPSEC方法TSKgelG4000PWXL柱上检测KD值≥0.4的回收率≥80％，游离多糖含量均≤40％，游离蛋白含量均≤5％。
6.根据权利要求1所述的多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤(1)各型B群链球菌工作种子在发酵罐中发酵培养，培养结束采用脱氧胆酸钠杀菌，离心，去除菌体，经乙醇分级沉淀法提取B群链球菌荚膜多糖粗糖；B群链球菌荚膜多糖粗糖采用醋酸钠溶液溶解后，用苯酚抽提去除蛋白，经超滤及分级乙醇沉淀去除杂质和沉淀多糖，收集沉淀后用易挥发的有机溶剂洗涤后真空抽干，即为B群链球菌荚膜多糖；
步骤(2)Ia型、Ib型、V型B群链球菌采用注射用水溶解后，用超声波降解多糖，至在HP-SEC方法TSKgelG4000PWXL柱上检测KD值在0.20-0.60，获得降解的Ia型、Ib型、V型B群链球菌荚膜多糖；
步骤(3)降解后的Ia型、Ib型、Ⅴ型荚膜多糖和Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型多糖均采用CDAP活化后，加入ADH衍生，超滤后浓缩为B群链球菌多糖衍生物；
步骤(4)在EDAC存在下，将6个型别的B群链球菌多糖衍生物分别与纯度≥90％的破伤风类毒素载体蛋白结合，经Sepharose4FF柱纯化，收集KD0.4之前的组分，经除菌过滤后为B群链球菌多糖-TT结合物原液；
步骤(5)6个型别的B群链球菌多糖-TT结合物原液分别加入磷酸铝佐剂、PBS和氯化钠溶液至所需目标体积，吸附至少1h后，再将6个型的吸附液混合后，搅拌混匀不低于1h后分装。
7.根据权利要求1所述的多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物的制备方法，其特征在于，Ia型、Ib型、V型B群链球菌荚膜多糖，分别用注射用水溶解为5-10mg/mL，冰浴条件下进行超声波处理，超声波功率为350～400W，在超声6-10秒，暂停1-5秒的条件下超声2-10分钟，降解至在HP-SEC方法TSKgelG4000PWXL柱上检测KD值在0.20-0.60范围。
8.根据权利要求1-5任一所述的多价B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物用于制备诱导对B群链球菌的体液免疫应答的药物或疫苗的用途。
9.如权利要求8所述的B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物用于制备诱导对B群链球菌的体液免疫应答的药物或疫苗的用途，其特征在于，所述药物或疫苗适用于18-49岁育龄女性人群。
10.权利要求8所述的B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物用于制备诱导对B群链球菌的体液免疫应答的药物或疫苗的用途，其特征在于，所述B群链球菌多糖-蛋白结合物组合物配制成每毫升含有：除了Ia型B群链球菌多糖为5～15μg外，其余血清型B群链球菌多糖均为7～13μg；并且该组合物还每毫升含有0.25～1mg磷酸铝佐剂、7.5～9.5mg氯化钠、41.1μg～164.4μg磷酸二氢钠和22.4μg-89.6μg磷酸氢二钠。
CN202211519246.0A 2022-11-30 2022-11-30 多价b群链球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用 Pending CN118105477A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211519246.0A CN118105477A (zh) 2022-11-30 2022-11-30 多价b群链球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211519246.0A CN118105477A (zh) 2022-11-30 2022-11-30 多价b群链球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118105477A true CN118105477A (zh) 2024-05-31

Family

ID=91211208

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211519246.0A Pending CN118105477A (zh) 2022-11-30 2022-11-30 多价b群链球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118105477A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7268125B2 (ja) コンジュゲート化莢膜糖類抗原を含む免疫原性組成物、それを含むキットおよびこれらの使用
JP7227943B2 (ja) コンジュゲート化莢膜糖類抗原を含む免疫原性組成物およびその使用
JP7030235B2 (ja) 多価肺炎球菌多糖体－タンパク質複合体組成物
CN112336854A (zh) 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物
US10758604B2 (en) Methods for the prevention of Salmonella infections
JP2021512870A (ja) 多価肺炎球菌多糖体−タンパク質複合体組成物
KR20190051945A (ko) 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
CN108079286B (zh) 一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用
AU2014313699A1 (en) A bacterial vaccine and methods for manufacture thereof
CN118105477A (zh) 多价b群链球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用
CN1168501C (zh) 一种多糖-蛋白结合疫苗
WO2018074296A1 (ja) 低分子化ＰＲＰを用いたＨｉｂコンジュゲートワクチンの製造方法
CN116688109A (zh) 多糖蛋白缀合物
KR102493192B1 (ko) 살모넬라 타이피 유래의 피막 다당류-단백질 접합체를 포함하는 백신 조성물
CN113663065B (zh) 一种肌醇甘露寡糖缀合物、制备方法及作为抗结核糖疫苗的应用
CN116898960A (zh) 细菌多糖蛋白缀合物及其应用
KR20180120482A (ko) 스트렙토코커스 뉴모니아 협막 다당체의 생산방법
KR20200136756A (ko) 스트렙토코커스 뉴모니애 혈청형 23f의 면역원성 접합체 제조방법
CN110652585A (zh) 多糖-蛋白缀合物免疫制剂及其制备与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination