KR20180043122A - 신규링커를 통한 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규링커로 제작된 폐렴구균 백신 조성물로서, 상기 신규링커는 에틸렌글리콜 디하이드라자이드를 합성으로 만들어진 링커로서, 수용액 상에서 종래의 ADH링커보다 뛰어난 용해성 및 안정성을 확인하였으므로, 상기 링커를 다당류-단백질 접합체의 링커로 활용하여 백신을 제작할 경우, 제작된 백신의 높은 수용액상의 안정성을 보존할 수 있다.

Description

신규링커를 통한 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 및 이의 용도{Vaccine for pneumococcal polysaccharide-protein conjugate based on novel linker and uses therof}

본 발명은 신규링커를 통한 폐렴구균 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 상기 백신 제작을 위한 다당체-단백질 접합 링커를 개선하고 이를 통해 접합체의 수용성 및 안정성이 증가된 면역원성 조성물 및 이의 의약적 적용 가능한 형태의 용도에 관한 것이다.

현재, 시판되고 있는 PCV (Pneumococcal conjugate vaccine)는 폐렴구균 (혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F 등)으로 인하여 생기는 침습성 질환을 예방하는 백신으로 사용되고 있다. 폐렴구균 백신은 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid)의 비독성 변형체인 CRM197을 운반단백질로 사용하며, 각 혈청형별 다당류와의 화학결합은 환원성아민화(reductive amination) 및 다당류의 수산화기 활성화를 통해 다당류와 운반단백질의 공유결합을 유도한다. 다당류에 운반단백질 결합을 통한 면역원성 증진을 유도하기 위한 화학결합 방법 중 환원성 아민화를 이용한 화학결합은 절차가 다소 복잡하기 때문에 다당류의 항원결정기(epitope)에 변화를 줄 수 있다. 변화된 항원결정기를 가지는 다당류 백신은 면역반응에 있어 차이를 나타내며, 이는 백신의 면역원성에 영향을 준다.

현재, 다당류와 운반단백질의 접합을 위해 사용되는 링커로는 양쪽말단이 하이드라자이드(hydrazide)의 이중기능단으로 구성되어 있는 ADH(Adipic acid dihydrazide)링커를 사용하고 있으며, ADH 링커를 구성하는 6개의 탄소는 물리화학적 특성상 소수성질을 나타낸다. ADH 링커를 이용한 다당류와 운반단백질 접합 백신의 제작은 다당류와 ADH 링커 접합 과정 및 ADH 링커를 기반으로 하는 다당류와 운반단백질 접합 시, 링커의 낮은 용해도에 따른 수용액상의 안정성을 감소시킬 수 있다.

따라서, 다당류와 운반단백질 접합 시 이용 가능한 친수성 링커의 합성 및 이를 응용함으로써, 실제 접합 백신을 제작할 때, 보다 안정성이 높은 링커를 확보하고자 하는 연구가 진행되고 있으나 (한국공개특허 10-2015-0103656), 아직은 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 다당류-단백질 접합 백신 제작에 이용되는 하이드라자이드 링커에 에틸렌글리콜 그룹을 포함시킨 친수성 링커를 합성함으로써, 종래의 소수성 링커에 비해 다당류-단백질 접합체의 안정성을 높일 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 다당류-운반단백질 접합체를 포함하는, 면역원성 조성물로서,

상기 다당류-운반단백질 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 및 이의 유도체로 접합되는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다당류-운반단백질 접합체를 포함하는, 면역원성 조성물로서,

상기 다당류-운반단백질 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 및 이의 유도체로 접합되는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 일 구현예로, 상기 다당류는, 폐렴구균 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F로 이루어진 군으로부터 선택되어 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 운반단백질은 CRM197일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 면역원성 조성물은, 애쥬번트 (adjuvant)를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 애쥬번트 (adjuvant)는, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 및 알루미늄 하이록사이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폐렴구균성 질환의 치료방법을 제공한다.

더욱이, 본 발명의 상기 면역원성 조성물의 폐렴구균성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명은 신규링커로 제작된 폐렴구균 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 상기 신규링커는 에틸렌글리콜 디하이드라자이드를 합성으로 만들어진 링커로서, 수용액 상에서 종래의 ADH링커보다 뛰어난 용해성 및 안정성을 확인하였으므로, 상기 링커를 다당류-단백질 접합체의 링커로 활용하여 백신을 제작할 경우, 제작된 백신의 높은 수용액상의 안정성을 보존할 수 있다. 이로 인해, 폐렴구균 백신 효능을 향상시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 단백질 접합용 친수성 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 링커의 합성을 위한 전체적인 공정을 나타낸 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 다당류와 운반단백질 접합용 친수성 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 링커의 합성 모식도(a)이며, 링커의 합성 여부는 HPLC-Mass를 이용하여 확인한 결과(b)를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 다당류와 운반단백질 접합용 친수성 테트라에틸렌글리콜 디하이드라자이드 링커의 합성 모식도(a)이며, 링커의 합성 여부는 HPLC-Mass를 이용하여 확인한 결과(b)를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 링커가 다당류 및 운반단백질과 접합 시 이용되는 합성 조건 및 백신 제작을 위한 모식도이다.
도 5는 본 발명의 다당류와 운반단백질 접합용 친수성 테트라에틸렌글리콜 디하이드라자이드 링커를 이용하여 6B 다당류에 접합을 시도한 뒤, 크기배제크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 종래 ADH 링커를 이용한 다당류와 운반단백질 접합 백신의 제작은 다당류와 ADH 링커 접합 과정 및 ADH 링커를 기반으로 하는 다당류와 운반단백질 접합 시, 접합체의 낮은 용해도에 따른 수용액상에서의 불안정성을 극복하기 위해서, 하이드라자이드 링커에 에틸렌글리콜 그룹을 합성하여 친수성의 접합체를 제조하고자 하였다.

이에, 본 발명의 일실시예에서는 에틸렌글리콜을 포함하는 디하이드라자이드 접합체를 합성하였으며 (실시예 1 참조), 상기 접합체를 이용하여 6B 다당류와의 접합을 통해서 기존의 ADH 링커와의 접합 효율을 비교하였다 (실시예 2 참조).

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 폐렴구균성 질환을 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 기대된다.

이에, 본 발명은 다당류-운반단백질 접합체를 포함하는, 면역원성 조성물로서,

상기 다당류-운반단백질 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 및 이의 유도체로 접합되는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

이 때, 상기 화학식 1에 있어서, n은 바람직하게는 1 내지 10일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 1 내지 5일 수 있고, 가장 바람직하게는, 1 내지 3일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다당류-운반단백질 접합체의 "다당류" 성분은 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F의 폐렴구균 혈청형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 다당류-운반단백질의 "운반 단백질", "단백질 담체" 또는 "담체 단백질" 란 용어들은 본 발명에서 호환적으로 사용될 수 있으며, 이 때, 상기 운반 단백질은 표준 접합 방법에 따라 처리될 수 있어야 한다. 본 발명의 운반 단백질로는 CRM197 또는 디프테리아 톡소이드일 수 있으며, 가장 바람직한 운반 단백질로는 CRM197일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

더욱이, 본 발명에 따른 상기 면역원성 조성물은 애쥬번트 (adjuvant)를 더 포함할 수 있으며, 상기 "애쥬번트"는 본 발명의 면역원성 조성물의 면역원성을 증가시키는데 사용되는 물질이다. 따라서, 애주번트는 종종 면역 반응을 부스터하기 위하여 제공되고 당업자에게 잘 알려져 있다. 이 때, 본 발명에 바람직한 애쥬번트 (adjuvant)로는 알루미늄계 애쥬번트 (adjuvant)로서, 바람직하게는, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 및 알루미늄 하이록사이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 면역원성 조성물은, 개체에 투여하여 개체에서의 폐렴구균에 대한 면역 반응 (예방학적 및/또는 치료학적 면역 반응)을 유도할 수 있다. 상기 면역원성 조성물은, 이에 한정되는 것은 아니나, 생리 식염수 또는 그 외 주사 가능한 액체를 포함한 백신에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체, 완충액 또는 보존제 형태로 전달될 수 있다. 제조된 백신은 다수의 감염성 물질에 대하여 면역 반응을 유도하는, 다가 백신의 구성성분으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 면역원성 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 에틸렌글리콜을 포함하는 디하이드라자이드 링커의 합성

본 발명에 따른 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 제조를 위한 링커를 합성하였다 (도 1 참조).

1-1. 친수성 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 링커 합성

우선, 도 2a의 합성 모식도에 따라서, 친수성 에틸렌글리콜 디하이드라아지드 링커를 합성하였다.

보다 구체적으로, 1.78 g (10 mmol)의 에틸렌글리콜 디아세트산을 10 ㎖의 메탄올에 녹인 뒤, 촉매량의 황산을 적가한 뒤 24 시간동안 환류교반하였다. 다음으로, 감압농축을 진행한 후, 잔류물을 수용액 상에서 디클로로메탄으로 추출한 뒤, 다시 한 번 감압농축을 진행하였으며, 정제과정 없이 다음 반응을 진행하였다.

다음으로, 상기 감압농축 후, 얻은 0.5 g (2.4 mmol)의 중간체 1과 0.6 ㎖(12.1 mmol)의 하이드라진을 20 ㎖의 메탄올에 녹인 후, 12 시간 동안 환류교반하였다. 다음으로, 감압농축 후 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 0.1 g (수율 20%)의 화합물 I을 제조하였다 (메탄올 : 디클로로메탄 =1 : 5). 이 때, 생성물의 구조는 질량분석을 이용하여 확인하였다 (도 2b 참조). (M+Na = 229.1)

1-2. 친수성 테트라에틸렌글리콜 하이드라자이드 링커 합성

다음으로, 도 3a의 합성 모식도에 따라서, 친수성 에틸렌글리콜 디하이드라아지드 링커를 합성하였다. 300 ㎖의 디메틸폼아마이드(dimethylformamide)에 6.6 ㎖ (50 mmol)의 테트라에틸렌글리콜과 포타슘3차-부톡사이드 (500 mmol)를 녹인다. 이 후, 0 ℃ 조건에서 15분 동안 교반하여 에틸브로모아세테이드 (110 mmol)를 교반 용액에 적가한 후, 12시간 동안 환류교반하였다. 다음으로, 감압농축 후, 잔류물을 수용액 상에서 디클로로메탄으로 추출한 뒤 다시 한 번 감압농축 하여 정제과정 없이 다음 반응을 진행하였다.

다음으로, 상기 감압농축 후, 얻은 0.5 g(1.5 mmol)의 중간체 2와 0.37 ㎖(7.5 mmol)의 하이드라진을 20 ㎖의 메탄올에 녹인 후, 12 시간 동안 환류교반하였다. 감압농축 후 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 0.08 g (수율 18%)의 화합물 II를 제조하였다 (메탄올 : 디클로로메탄 =1 : 5). 이때, 생성물의 구조는 질량분석을 이용하여 확인하였다 (도 3b 참조). (M-H = 293.0)

실시예 2. 6B 다당류와 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 링커간 접합 효율 확인

상기 실시예 1에 따라 합성된 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 링커를 CDAP (1-Cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate)에 의해 수산화기가 시안화 작용기로 활성화된 다당류에 접합을 시도하였다. 이 때, 화합물 I과 다당류의 접합 여부는 시료 분자 크기 또는 분자량에 기초하여 크기배제크로마토그래피 (Size Exclusion Chromatography; SEC)를 이용하여 확인하였으며, 240 nm에서의 흡광도를 관찰함으로써 링커의 접합 여부를 판단하였다. 이 때, 상기 크기배제크로마토그래피 분석에 사용된 컬럼(column)은 Tosoh Bioscience사의 TSKgel G3000SWXL을 이용하였으며, pH 7.4 1xPBS를 용매로 하여 0.5 mL/min의 유속으로 흘려주었다.

다당류 6B에 ADH 링커 분자가 결합하면 240 nm의 파장에서 높은 UV 흡광도를 보이는 것을 근거로 하여, 화합물 I 또한 결합 후 높은 흡광도 나타내는 것으로 결합을 관찰할 수 있다.

당쇄활성화 시약인 CDAP를 이용한 6B 다당류의 수산화기 활성화를 통해 화합물 I (PEG dihydrazine) 링커의 접합을 시도한 결과, 도 5a에 도시된 바와 같이, 크로마토그램의 11분 근처에서 6B 다당류와의 접합에 의한 높은 UV 흡광도가 확인되었다. 이 후, CDAP 당쇄활성화 시약을 통해 PEG dihydrazine 링커가 결합된 다당체 6B 다당류는 투석과 여과 과정을 거쳐 높은 순도로 정제하였다 (도 5b 참조).

한편, 같은 방법으로 ADH 링커가 결합되어 있는 다당류 6B(0.3 mg/mL)의 흡광도를 확인한 결과, 도 5a에 나타난 패턴과 유사한 경향을 보이는 것을 확인하였으며, CDAP 당쇄활성화 시약을 통해 ADH dihydrazine 링커가 결합된 다당체 6B는 투석과 여과 과정을 거쳐 높은 순도로 확보하였다 (도 5d 참조).

이를 통해서, 다당류와 운반단백질 접합용 에틸렌글리콜 링커가 기존 링커(ADH)와 동일한 접합 효율을 보였음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (5)

1. 다당류-운반단백질 접합체를 포함하는, 면역원성 조성물로서,
   상기 다당류-운반단백질 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 및 이의 유도체로 접합되는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서, 상기 다당류는, 폐렴구균 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F로 이루어진 군으로부터 선택되어 제조된 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 운반단백질은 CRM197인 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은, 애쥬번트 (adjuvant)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 애쥬번트 (adjuvant)는, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 및 알루미늄 하이록사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물.

Images