CN117866036A - 一种基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法及其产品 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法及其产品,涉及疫苗制备技术领域。包括以下步骤:将多糖原液解聚,再加入硫羰基化试剂进行反应,结束后,得到多糖硫基化产物;将载体蛋白与连接子和缩合试剂反应,使连接子结合在载体蛋白上,得到蛋白结合物;将多糖硫基化产物和蛋白结合物反应,使硫基与碳碳双键还原形成硫‑碳键,反应结束,得到多糖蛋白结合物;对多糖蛋白结合物进行纯化,即得多糖结合疫苗。本申请通过硫醇点击化学来使多糖与蛋白特异性结合,不仅解决了传统结合疫苗中结合位点不明确,多糖和蛋白偶联时随机性较强的问题,而且使多糖结合疫苗在病理研究中成分与靶点分析更直接,有利于在疫苗生产中重复实验。
Description
技术领域
本申请涉及疫苗制备技术领域,特别涉及一种基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法及其产品。
背景技术
多糖结合疫苗是指采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上所制备成的疫苗。现如今,由b型流感嗜血杆菌(Hib)、肺炎链球菌(Sp)(10至20种血清型)、脑膜炎奈瑟菌(Nm)(A、C、W、Y)和伤寒沙门氏菌VI(Vi)与载体蛋白化学偶联的多糖抗原组成的糖结合疫苗已被批准。普通多糖(T细胞非依赖性抗原)疫苗虽然显示出可接受的耐受性和安全性,但是,它们在免疫原性方面存在一些限制(如没有免疫记忆,低反应性)。相反,多糖结合疫苗可诱导T细胞依赖性反应,从而诱导免疫记忆,具有高度免疫原性,即使接种给婴儿、老年人和免疫功能低下的受试者,与多糖疫苗相比,记忆反应也更长。
目前,生产许可的多糖结合疫苗的方法是还原胺化法和酰胺化法,但是在传统生产方法中,多糖可以在多个位点进行修饰,并随机偶联在蛋白质上,这种随机修饰可能会改变多糖抗原的天然表位,而且在疫苗生产中这种随机修饰和蛋白偶联很难重复实验。因此,有必要开发一种新的多糖结合疫苗的制备方法。
发明内容
本申请的主要目的是提供一种基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法及其产品,旨在解决现有的多糖结合疫苗的制备方法中多糖与蛋白偶联时具有随机性的技术问题。
为实现上述目的,本申请提出了一种基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法及其产品,包括以下步骤:
将多糖原液解聚,再加入硫羰基化试剂进行反应,结束后,得到多糖硫基化产物;
将载体蛋白与连接子和缩合试剂反应,使所述连接子结合在所述载体蛋白上,得到蛋白结合物;
将所述多糖硫基化产物和所述蛋白结合物反应,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,得到多糖蛋白结合物;
对所述多糖蛋白结合物进行纯化,即得多糖结合疫苗。
可选地,所述将多糖原液解聚的步骤,包括:
将多糖原液进行超声破碎,并设置所述超声破碎的参数为:超声功率为180W-220W,超声间隔为超声3s,间隔1s,破碎16min-22min。
可选地,所述加入硫羰基化试剂进行反应,结束后,得到多糖硫基化产物的步骤,包括:
将解聚后的多糖原液浓缩,得到浓缩多糖原液,在所述浓缩多糖原液中加入硫羰基化试剂,所述浓缩多糖原液与所述硫羰基化试剂的质量比为1:(2.5-3.5),在常温常压下反应25min-35min,得到多糖硫基化产物。
可选地,所述硫羰基化试剂为劳森试剂。
可选地,所述将载体蛋白与连接子和缩合试剂反应,使所述连接子结合在所述载体蛋白上,得到蛋白结合物的步骤,包括:
采用pH为5-7的PBS缓冲液对载体蛋白进行浓缩,再加入连接子和缩合试剂,在20℃-30℃下反应1.5h-2.5h,使所述连接子结合在所述载体蛋白上,再通过30KD的超滤管进行超滤,得到蛋白结合物。
可选地,所述载体蛋白包括CRM197蛋白以及DT蛋白中的一种。
可选地,所述连接子为2-氨基-5-己烯酸,所述缩合试剂为1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮。
可选地,所述将所述多糖硫基化产物和所述蛋白结合物反应,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,得到多糖蛋白结合物的步骤,包括:
在所述多糖硫基化产物中按质量比1:1的比例加入所述蛋白结合物,再加入pH为5-7的PBS缓冲液调节pH,在1MPa-10MPa下反应0.5h-1.5h,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,再通过30KD的超滤管进行超滤,得到多糖蛋白结合物。
可选地,所述对所述多糖蛋白结合物进行纯化,即得多糖结合疫苗的步骤,包括:
将所述多糖蛋白结合物在4FF层析柱上纯化,洗脱液为1mol/L-2mol/L的Tris-HCl层析平衡液,所述洗脱液的流速为55mL/min-65mL/min,经过洗脱后,分段收集洗脱峰,即得多糖结合疫苗。
本申请还提出了一种多糖结合疫苗产品,采用上述基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法所得。
本申请首先通过硫羰基化试剂与多糖进行反应,硫羰基化试剂作为一种氧硫交换试剂,在与多糖进行反应时,可在非常温和的条件下使硫基取代多糖上的羟基上的氧,氧被硫替换之后形成硫醇,由于硫醇易于在非常温和的条件下通过自由基或者在催化过程中与多种底物反应,使其在糖缀合反应中成为流行的底物,而糖基硫醇是硫醇点击化学的有用构建块,能够合成某些硫键连接的糖缀合物,从而将多糖结合位点特异化,然后将载体蛋白与连接子和缩合试剂反应后,在多糖硫基化产物与蛋白结合物反应时,经过特异化修饰的多糖结合位点可与载体蛋白点对点的进行连接,使多糖硫基化产物上的硫基与蛋白结合物上的碳碳双键发生特异性结合,还原形成硫-碳键,从而获得了多糖与蛋白一对一连接的结合物,且硫-碳键连接的多糖蛋白结合物具有更强的化学稳定性和对酶水解的抗性。因此,本申请通过硫醇点击化学来使多糖与蛋白特异性结合,不仅解决了传统结合疫苗中结合位点不明确,多糖和蛋白偶联时随机性较强的问题,而且使多糖结合疫苗在病理研究中成分与靶点分析更直接,有利于在疫苗生产中进行重复实验。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本申请实施例所述的多糖结合疫苗的合成路线图;
图2为本申请实施例所述的多糖结合疫苗的洗脱结果示意图。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例,参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
普通多糖(T细胞非依赖性抗原)疫苗虽然显示出可接受的耐受性和安全性,但是,它们在免疫原性方面存在一些限制(如没有免疫记忆,低反应性)。婴儿除了大多数时候是幼稚的受试者外,免疫系统还不成熟,对疫苗接种刺激的反应与其他年龄不同。而多糖结合疫苗通常为荚膜多糖与被称为“载体蛋白”的蛋白质化学连接而成,可诱导T细胞依赖性反应,从而诱导免疫记忆,在婴儿中,与普通多糖疫苗不同,多糖结合疫苗也能够诱导婴儿的IgG反应,且多糖结合疫苗在老年人和免疫功能低下的人群中也能显示出改善的反应(优于普通多糖疫苗)。故多糖结合疫苗具有高度免疫原性,即使接种给婴儿、老年人和免疫功能低下的受试者,与多糖疫苗相比,记忆反应也更长。
多糖结合疫苗发挥作用的关键是B细胞受体(BCR)和疫苗抗原之间的相互作用,其中存在于B细胞表面的BCR结合滤泡树突状细胞(FDC)膜上的多糖抗原,并以亲和依赖性方式检索多糖和连接的载体蛋白,然后将偶联物内化和处理,并将蛋白质衍生成分呈现给T细胞,以便T细胞可以间接感知B细胞亲和力,具有较高亲和力的B细胞将检索更多的抗原,并将从T滤泡辅助细胞中获得更强的帮助,从而发挥作用。
目前,多糖结合疫苗的制备方法主要是还原胺化法和酰胺化法,但是在这种传统生产方法中,多糖可以在多个位点进行修饰,并随机偶联在蛋白质上,这种随机修饰可能会改变多糖抗原的天然表位,而且在疫苗生产中这种随机修饰和蛋白偶联很难重复实验。
针对现有的多糖结合疫苗的制备方法所存在的技术问题,本申请的实施例提供了一种基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,包括以下步骤:
将多糖原液解聚,再加入硫羰基化试剂进行反应,结束后,得到多糖硫基化产物;
将载体蛋白与连接子和缩合试剂反应,使所述连接子结合在所述载体蛋白上,得到蛋白结合物;
将所述多糖硫基化产物和所述蛋白结合物反应,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,得到多糖蛋白结合物;
对所述多糖蛋白结合物进行纯化,即得多糖结合疫苗。
如图1所示,本申请首先通过硫羰基化试剂与多糖进行反应,硫羰基化试剂作为一种氧硫交换试剂,在与多糖进行反应时,可在非常温和的条件下使硫基取代多糖上的羟基上的氧,氧被硫替换之后形成硫醇,由于硫醇易于在非常温和的条件下通过自由基或者在催化过程中与多种底物反应,使其在糖缀合反应中成为流行的底物,而糖基硫醇是硫醇点击化学的有用构建块,能够合成某些硫键连接的糖缀合物,从而将多糖结合位点特异化,然后将载体蛋白与连接子和缩合试剂反应后,在多糖硫基化产物与蛋白结合物反应时,经过特异化修饰的多糖结合位点可与载体蛋白点对点的进行连接,使多糖硫基化产物上的硫基与蛋白结合物上的碳碳双键发生特异性结合,还原形成硫-碳键,从而获得了多糖与蛋白一对一连接的结合物,且硫-碳键连接的多糖蛋白结合物具有更强的化学稳定性和对酶水解的抗性。因此,本申请通过硫醇点击化学来使多糖与蛋白特异性结合,不仅解决了传统结合疫苗中结合位点不明确,多糖和蛋白偶联时随机性较强的问题,而且使多糖结合疫苗在病理研究中成分与靶点分析更直接,有利于在疫苗生产中进行重复实验。
具体的,硫醇是指包含巯基官能团(-SH)的一类非芳香化合物,可以看成普通醇中的氧被硫替换之后形成的。点击化学,又称为“链接化学”,是通过小单元的拼接,来快速完成分子的化学合成。
在一些实施例中,多糖原液选择脑膜炎球菌A、C、Y、W135群多糖以及肺炎球菌多糖中的一种。
作为本申请的一种可实施方式,所述将多糖原液解聚的步骤,包括:
将多糖原液进行超声破碎,并设置所述超声破碎的参数为:超声功率为180W-220W,超声间隔为超声3s,间隔1s,破碎16min-22min。
多糖在水中时,由于多糖分子之间的相互作用,会使分散的分子相互聚集,形成聚集态,而当多糖溶液中的聚集态达到一定大小时,会形成大的聚集体,这个过程是多糖的聚集,在多糖与蛋白特异性结合前,需打破多糖的聚集状态,故本申请通过超声破碎来降低多糖分子之间的相互作用,促进解聚。
作为本申请的一种可实施方式,所述加入硫羰基化试剂进行反应,结束后,得到多糖硫基化产物的步骤,包括:
将解聚后的多糖原液浓缩,得到浓缩多糖原液,在所述浓缩多糖原液中加入硫羰基化试剂,所述浓缩多糖原液与所述硫羰基化试剂的质量比为1:(2.5-3.5),在常温常压下反应25min-35min,得到多糖硫基化产物。
优选的,浓缩多糖原液与硫羰基化试剂的质量比为1:3,在常温常压下反应30min,硫羰基化试剂即可将多糖上羟基上的氧替换为硫,形成硫醇。
作为本申请的一种可实施方式,所述硫羰基化试剂为劳森试剂。劳森试剂即为2,4一双(对甲氧基苯基)-1,3-二硫-2,4-二磷杂环丁烷-2,4-二硫化物,其可以将酮、酰胺、酯中的羰基转变为相对应的硫羰基化合物,劳森试剂作为硫羰基化试剂方便易得,在氧硫交换反应中,反应产率高且易于与产物分离。
作为本申请的一种可实施方式,所述将载体蛋白与连接子和缩合试剂反应,使所述连接子结合在所述载体蛋白上,得到蛋白结合物的步骤,包括:
采用pH为5-7的PBS缓冲液对载体蛋白进行浓缩,再加入连接子和缩合试剂,在20℃-30℃下反应1.5h-2.5h,使所述连接子结合在所述载体蛋白上,再通过30KD的超滤管进行超滤,得到蛋白结合物。
通过将连接子结合在载体蛋白上,可使所得蛋白结合物通过连接子与多糖硫基化产物特异性结合,再通过30KD的超滤管进行超滤,可将未反应的小分子物质如连接子和缩合试剂除去,从而提高蛋白结合物的纯度。
作为本申请的一种可实施方式,所述载体蛋白包括CRM197蛋白以及DT蛋白中的一种。
CRM197蛋白是指白喉毒素突变体,DT蛋白为人工制备的失活白喉毒素,CRM197蛋白是白喉毒素的无毒突变株,具有第52位甘氨酸被谷氨酸替代的单个氨基酸突变,其毒性消失但仍保留与DT蛋白相同的免疫刺激特性,CRM197蛋白无需进行甲醛处理,其T细胞识别表位得以完整保存,因此其载体效果要高于DT蛋白,且相较于DT蛋白制备需培养白喉杆菌,CRM197蛋白可利用基因重组工程技术,使用大肠杆菌作为宿主菌进行重组表达,其产量更高。本申请的载体蛋白优选CRM197蛋白。
作为本申请的一种可实施方式,所述连接子为2-氨基-5-己烯酸,所述缩合试剂为1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮。
1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮可作为一种性能优异的缩合试剂与其他化学试剂或小分子底物进行结合,形成更具特异性和生物活性的活性化合物,而2-氨基-5-己烯酸分子结构上同时含有氨基和羧基,在缩合试剂的作用下,可与载体蛋白形成具有特异性的活性化合物。
作为本申请的一种可实施方式,所述将所述多糖硫基化产物和所述蛋白结合物反应,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,得到多糖蛋白结合物的步骤,包括:
在所述多糖硫基化产物中按质量比1:1的比例加入所述蛋白结合物,再加入pH为5-7的PBS缓冲液调节pH,在1MPa-10MPa下反应0.5h-1.5h,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,再通过30KD的超滤管进行超滤,得到多糖蛋白结合物。
多糖硫基化产物与蛋白结合物的特异性结合是通过多糖硫基化产物上的糖基硫醇与蛋白结合物上的碳碳双键发生特异性结合,还原形成硫-碳键,从而形成的硫键连接的糖缀合物,再通过30KD的超滤管进行超滤,可将未反应完的物质如多糖硫基化产物和蛋白结合物进行去除,以便后续进行纯化分离,从而得到纯度更高的多糖蛋白结合物。
作为本申请的一种可实施方式,所述对所述多糖蛋白结合物进行纯化,即得多糖结合疫苗的步骤,包括:
将所述多糖蛋白结合物在4FF层析柱上纯化,洗脱液为1mol/L-2mol/L的Tris-HCl层析平衡液,所述洗脱液的流速为55mL/min-65mL/min,经过洗脱后,分段收集洗脱峰,即得多糖结合疫苗。
具体的,本申请采用AKTA pilot纯化系统与4FF层析柱对多糖蛋白结合物进行纯化分离,采用波长为206nm、280nm的紫外检测器检测流出液,经缓冲液洗脱后出现洗脱峰,收集主要的洗脱峰即为纯化的多糖结合疫苗,次要洗脱峰即为没有结合上的多糖硫基化产物与蛋白结合物。
本申请的实施例还提供了一种多糖结合疫苗产品,采用上述基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法所得。
下面结合具体实施例对本申请上述技术方案进行详细说明。
实施例1
一种基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,包括以下步骤:
将脑膜炎球菌A群多糖原液配制成2mg/mL,进行超声破碎,并设置超声功率为200W,超声间隔为超声3s,间隔1s,破碎20min,用无菌丝口瓶盛装,再将解聚后的多糖原液浓缩为12mg/mL,得到浓缩多糖原液,在浓缩多糖原液中加入劳森试剂,使浓缩多糖原液与劳森试剂的质量比为1:3,在常温常压下反应30min,得到多糖硫基化产物;
采用pH为6的PBS缓冲液对CRM197蛋白进行浓缩至5mg/mL,再加入2-氨基-5-己烯酸和1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮,得到反应液,使1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮在反应液中的浓度为0.4mol/L,在25℃下反应2h,使2-氨基-5-己烯酸结合在CRM197蛋白上,再通过30KD的超滤管进行超滤,除去未反应的2-氨基-5-己烯酸和1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮,得到蛋白结合物;
在多糖硫基化产物中按质量比1:1的比例加入蛋白结合物,再加入pH为6的PBS缓冲液调节pH,在5MPa下反应1h,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,再通过30KD的超滤管进行超滤,除去未反应的多糖硫基化产物和蛋白结合物,得到多糖蛋白结合物;
采用AKTA pilot纯化系统与4FF层析柱来对多糖蛋白结合物进行纯化,洗脱液为1mol/L的Tris-HCl层析平衡液,洗脱液的流速为60mL/min,采用波长为206nm、280nm的紫外检测器检测流出液,经缓冲液洗脱后出现2个洗脱峰,如图2所示,其中洗脱峰1对应于多糖蛋白结合物,为主要的洗脱峰,洗脱峰2为没有结合上的多糖硫基化产物和蛋白结合物,使用无菌瓶收集峰1,即得多糖结合疫苗。
实施例2
一种基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,包括以下步骤:
将脑膜炎球菌C群多糖原液配制成2mg/mL,进行超声破碎,并设置超声功率为180W,超声间隔为超声3s,间隔1s,破碎22min,用无菌丝口瓶盛装,再将解聚后的多糖原液浓缩为10mg/mL,得到浓缩多糖原液,在所述浓缩多糖原液中加入劳森试剂,使浓缩多糖原液与劳森试剂的质量比为1:2.5,在常温常压下反应35min,得到多糖硫基化产物;
采用pH为5.5的PBS缓冲液对DT蛋白进行浓缩至4mg/mL,再加入2-氨基-5-己烯酸和1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮,得到反应液,使1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮在反应液中的浓度为0.3mol/L,在25℃下反应2h,使2-氨基-5-己烯酸结合在DT蛋白上,再通过30KD的超滤管进行超滤,除去未反应的2-氨基-5-己烯酸和1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮,得到蛋白结合物;
在多糖硫基化产物中按质量比1:1的比例加入蛋白结合物,再加入pH为5.5的PBS缓冲液调节pH,在1MPa下反应1.5h,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,再通过30KD的超滤管进行超滤,除去未反应的多糖硫基化产物和蛋白结合物,得到多糖蛋白结合物;
将所述多糖蛋白结合物在4FF层析柱上纯化,洗脱液为1mol/L的Tris-HCl层析平衡液,所述洗脱液的流速为65mL/min,经过洗脱后,分段收集洗脱峰,即得多糖结合疫苗。
实施例3
一种基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,包括以下步骤:
将脑膜炎球菌W135群多糖原液配制成1mg/mL,进行超声破碎,并设置超声功率为220W,超声间隔为超声3s,间隔1s,破碎16min,用无菌丝口瓶盛装,再将解聚后的多糖原液浓缩为15mg/mL,得到浓缩多糖原液,在所述浓缩多糖原液中加入劳森试剂,使浓缩多糖原液与劳森试剂的质量比为1:3.5,在常温常压下反应35min,得到多糖硫基化产物;
采用pH为6.5的PBS缓冲液对CRM197蛋白进行浓缩至6mg/mL,再加入2-氨基-5-己烯酸和1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮,得到反应液,使1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮在反应液中的浓度为0.5mol/L,在25℃下反应2h,使2-氨基-5-己烯酸结合在CRM197蛋白上,再通过30KD的超滤管进行超滤,除去未反应的2-氨基-5-己烯酸和1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮,得到蛋白结合物;
在多糖硫基化产物中按质量比1:1的比例加入蛋白结合物,再加入pH为6.5的PBS缓冲液调节pH,在10MPa下反应1.5h,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,再通过30KD的超滤管进行超滤,除去未反应的多糖硫基化产物和蛋白结合物,得到多糖蛋白结合物;
将所述多糖蛋白结合物在4FF层析柱上纯化,洗脱液为2mol/L的Tris-HCl层析平衡液,所述洗脱液的流速为65mL/min,经过洗脱后,分段收集洗脱峰,即得多糖结合疫苗。
实施例4
一种基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,包括以下步骤:
将肺炎球菌多糖原液配制成1mg/mL,进行超声破碎,并设置超声功率为200W,超声间隔为超声3s,间隔1s,破碎20min,用无菌丝口瓶盛装,再将解聚后的多糖原液浓缩为13mg/mL,得到浓缩多糖原液,在所述浓缩多糖原液中加入劳森试剂,所述浓缩多糖原液与所述劳森试剂的质量比为1:3,在常温常压下反应32min,得到多糖硫基化产物;
采用pH为6的PBS缓冲液对CRM197蛋白进行浓缩至4mg/mL,再加入2-氨基-5-己烯酸和1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮,得到反应液,使1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮在反应液中的浓度为0.3mol/L,在25℃下反应2h,使2-氨基-5-己烯酸结合在CRM197蛋白上,再通过30KD的超滤管进行超滤,除去未反应的2-氨基-5-己烯酸和1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮,得到蛋白结合物;
在多糖硫基化产物中按质量比1:1的比例加入蛋白结合物,再加入pH为6的PBS缓冲液调节pH,在8MPa下反应1h,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,再通过30KD的超滤管进行超滤,除去未反应的多糖硫基化产物和蛋白结合物,得到多糖蛋白结合物;
将所述多糖蛋白结合物在4FF层析柱上纯化,洗脱液为1mol/L的Tris-HCl层析平衡液,所述洗脱液的流速为62mL/min,经过洗脱后,分段收集洗脱峰,即得多糖结合疫苗。
以上所述仅为本申请的可选实施例,并非因此限制本申请的专利范围,凡是在本申请的发明构思下,利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构变换,或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将多糖原液解聚,再加入硫羰基化试剂进行反应,结束后,得到多糖硫基化产物;
将载体蛋白与连接子和缩合试剂反应,使所述连接子结合在所述载体蛋白上,得到蛋白结合物;
将所述多糖硫基化产物和所述蛋白结合物反应,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,得到多糖蛋白结合物;
对所述多糖蛋白结合物进行纯化,即得多糖结合疫苗。
2.根据权利要求1所述的基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,其特征在于,所述将多糖原液解聚的步骤,包括:
将多糖原液进行超声破碎,并设置所述超声破碎的参数为:超声功率为180W-220W,超声间隔为超声3s,间隔1s,破碎16min-22min。
3.根据权利要求1所述的基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,其特征在于,所述加入硫羰基化试剂进行反应,结束后,得到多糖硫基化产物的步骤,包括:
将解聚后的多糖原液浓缩,得到浓缩多糖原液,在所述浓缩多糖原液中加入硫羰基化试剂,所述浓缩多糖原液与所述硫羰基化试剂的质量比为1:(2.5-3.5),在常温常压下反应25min-35min,得到多糖硫基化产物。
4.根据权利要求1所述的基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,其特征在于,所述硫羰基化试剂为劳森试剂。
5.根据权利要求1所述的基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,其特征在于,所述将载体蛋白与连接子和缩合试剂反应,使所述连接子结合在所述载体蛋白上,得到蛋白结合物的步骤,包括:
采用pH为5-7的PBS缓冲液对载体蛋白进行浓缩,再加入连接子和缩合试剂,在20℃-30℃下反应1.5h-2.5h,使所述连接子结合在所述载体蛋白上,再通过30KD的超滤管进行超滤,得到蛋白结合物。
6.根据权利要求1所述的基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,其特征在于,所述载体蛋白包括CRM197蛋白以及DT蛋白中的一种。
7.根据权利要求1所述的基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,其特征在于,所述连接子为2-氨基-5-己烯酸,所述缩合试剂为1-乙基-3-甲基-2-咪唑啉-4-酮。
8.根据权利要求1所述的基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,其特征在于,所述将所述多糖硫基化产物和所述蛋白结合物反应,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,得到多糖蛋白结合物的步骤,包括:
在所述多糖硫基化产物中按质量比1:1的比例加入所述蛋白结合物,再加入pH为5-7的PBS缓冲液调节pH,在1MPa-10MPa下反应0.5h-1.5h,使硫基与碳碳双键还原形成硫-碳键,反应结束,再通过30KD的超滤管进行超滤,得到多糖蛋白结合物。
9.根据权利要求1所述的基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法,其特征在于,所述对所述多糖蛋白结合物进行纯化,即得多糖结合疫苗的步骤,包括:
将所述多糖蛋白结合物在4FF层析柱上纯化,洗脱液为1mol/L-2mol/L的Tris-HCl层析平衡液,所述洗脱液的流速为55mL/min-65mL/min,经过洗脱后,分段收集洗脱峰,即得多糖结合疫苗。
10.一种多糖结合疫苗产品,其特征在于,采用如权利要求1-9任一项所述的基于硫醇点击化学制备多糖结合疫苗的方法所得。
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