JP2012506853A - 精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細菌の多糖類、特にStreptococcus pyogenesの多糖類を、特にワクチンの調製において使用するために精製する分野におけるものである。
細菌由来の多糖類は、多年にわたりワクチンに使用されてきた。しかしながら、糖類はT非依存性抗原であるから、それらは免疫原性に乏しい。担体への結合体化は、T非依存性抗原をT依存性抗原に変換して、それにより記憶応答を増強し、保護免疫が発達するのを可能にすることができる。最も有効な糖ワクチンは、それ故、複合糖質に基づくものであり、プロトタイプの結合体化ワクチンはHaemophilus influenzaeタイプb(「Hib」)に対するものであった[例えば参考文献95の第14章を参照されたい]。
本発明は、糖が陰イオン交換クロマトグラフィーに供される精製方法に基づく。本発明者らは、陰イオン交換クロマトグラフィーがGAS炭水化物の良好な収率を提供することを見出した。その上、陰イオン交換クロマトグラフィーは、特に純粋なGAS炭水化物調製物を提供する。特に、本発明者らは、GAS炭水化物がGAS莢膜多糖に由来するヒアルロン酸でしばしば汚染されることを見出した。陰イオン交換クロマトグラフィーは、GAS炭水化物のヒアルロン酸汚染を減少させるのに特に有効である。これは、ヒアルロン酸はそれ自体で免疫原性であることが公知であるので[11]、GAS炭水化物がワクチンにおける使用を意図されるときに特に有利である。したがって、ヒアルロン酸の存在は、GAS炭水化物に対する免疫応答に干渉し得る。その上、ヒアルロン酸は、ヒト組織と交差反応性である抗体を誘発すると考えられており([12]および[13])、そのため医薬製品中のその存在は、健康にとって有害であり得る。陰イオン交換クロマトグラフィーは、GAS炭水化物のタンパク質および核酸汚染を減少させるのにも特に有効である。
S.pyogenesのGAS炭水化物(GAS細胞壁多糖、またはGASPとしても公知)は、典型的には、交互のα−(1→2)結合およびα−(1→3)結合からなるL−ラムノピラノース(Rhap)骨格および交互のラムノース環にβ−(1→3)結合したD−N−アセチルグルコサミン(GlcpNAc)残基を有する分岐構造(図1および[14])を特徴とする。Rhap骨格は存在するがGlcpNAc分岐がないA群改変体連鎖球菌は記載されている(すなわちポリラムノース、図2および[6])。本発明は、好ましくは、A群改変体連鎖球菌よりもむしろS.pyogenes由来のGAS炭水化物を含む。実際、本発明の精製方法は、S.pyogenes由来のGAS炭水化物のポリラムノース汚染を減少させるのに特に有効である。
本発明の方法は、典型的には、水性形態にあるGAS炭水化物で、例えば水性懸濁物として、ヒアルロン酸および/またはポリラムノースをさらに含んで出発する。連鎖球菌のタンパク質および/または核酸が懸濁物中に存在してもよい。通常、懸濁物は、ヒアルロン酸、ポリラムノース、タンパク質および核酸を含む。ヒアルロン酸は、通常、Streptococcus pyogenesの莢膜多糖に由来する。
培養後に例えば上で論じた還元的酸処理により得られたGAS炭水化物は、一般に不純であり、ヒアルロン酸および/またはポリラムノースで汚染されている。連鎖球菌のタンパク質および/または核酸も存在することがある。高分子量種を除去することによりGAS炭水化物を精製するために、1回または複数回の濾過工程を使用することができる。例えば、本発明者らは、直交濾過(orthogonal filtration)を含む濾過工程は、濾液中に保持される、GAS炭水化物からの不純物を除去するために使用することができることを見出した。典型的には、直交濾過は、0.65μmのフィルタを使用して実施される。例えば、Sartopure GF2TM(Sartorius)カプセル(面積は0.2m2)を使用することができる。しかし、0.2μmのフィルタも使用することができる。収率を改善するために、いかなる残留濾液も、フィルタから取り出して濾液の残部と併せることができる。この取り出しは、例えば、推進力(例えば蠕動性推進力または圧力)をフィルタに加えることにより、または系に蒸留水を供給することにより行うことができる。
本発明の方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を含む。本発明者らは、陰イオン交換クロマトグラフィーが、糖の良好な収率を保ちながら、GAS炭水化物のヒアルロン酸、タンパク質および核酸汚染の除去に特に有効であることを見出した。
本発明の方法は、1回または複数回のゲル濾過の工程を含むことができる。このゲル濾過は、特定の長さのGAS炭水化物分子を選択し且つ特にタンパク質による汚染をさらに減少させるために使用される。しかしながら、本発明者らは、参考文献6とは反対に、ゲル濾過工程は、高純度のGAS炭水化物を得るために必要とされないことを見出した。したがって、この工程は、本発明の方法から省略することができる。この工程を省略すると、該方法を大規模に実現することの可能性を促進し得る。
本発明の方法は、1回または複数回のゲル濾過工程に加えて、またはその代わりに、GAS炭水化物を濃縮する1回または複数回の工程を含むことができる。この濃縮は、下で記載するように、その後のGAS炭水化物の担体分子との結合体化のために適当な濃度の試料を得るために有用である。しかしながら、本発明者らは、この濃縮工程は、高純度のGAS炭水化物を得るために必要とされないことを見出した。したがって、この工程は、本発明の方法から省略することができる。
精製後、糖を、汚染物質を除去するためにさらに処理することができる。これは、少しの汚染でさえ許容されない状況で(例えば、ヒト向けワクチン生産用)、特に重要である。
GAS炭水化物調製物は、精製方法中の任意の段階で、貯蔵のために、例えば、真空下の凍結乾燥により凍結乾燥するか、または溶液中で(例えば、最終濃縮工程が含まれた場合にはそれからの溶離物として)凍結することができる。したがって、調製物は方法の1つの工程から他の工程へ直ちに移される必要がない。例えば、GAS炭水化物調製物が濾過および/または限外濾過により精製されることになっていれば、その場合、それは、この精製に先だって、凍結乾燥するかまたは溶液中で凍結することができる。同様に、GAS炭水化物は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程に先だって凍結乾燥するかまたは溶液中で凍結することができる。GAS炭水化物調製物がゲル濾過により精製されることになっていれば、それは、この工程に先だって凍結乾燥するかまたは溶液中で凍結することができる。同様に、GAS炭水化物調製物が濃縮されることになっていれば、それは、この工程に先だって凍結乾燥するかまたは溶液中で凍結することができる。凍結乾燥された調製物は、さらなる処理に先だって適当な溶液中で再構成される。同様に、凍結された溶液は、さらなる処理に先だって解凍される。
本発明の最終精製されたGAS炭水化物は、さらに改変することなく、例えばインビトロ診断用のアッセイで使用するために、免疫化その他で使用するために、抗原として使用することができる。
本発明の方法により調製された糖類(特に上記のように結合体化後)は、例えば互いにおよび/または他の抗原と混合することができる。したがって、本発明の方法は、糖を1種または複数種のさらなる抗原と混合するさらなる工程を含むことができる。
−N.gonorrhoeae由来の抗原[例えば73、74、75]。
本発明は、(a)本発明の糖(場合により、結合体の形態で)を(b)薬学的に許容される担体と混合する工程を含む、医薬組成物を調製する方法を提供する。そのような担体の詳細な議論は引用文献122で参照できる。
「含む(comprising)」という用語は、「含む(including)」ならびに「からなる(consisting)」を包含し、例えば、Xを「含む(comprising)」組成物は、Xのみからなってもよく、または何かを付け加えて、例えばX+Yを含んでもよい。
(実施例1)
(Streptococcus pyogenes由来のGAS炭水化物の精製)
各精製工程の後、GAS炭水化物構造をNMR分析により検証した(下を見られたい)。GAS炭水化物について典型的NMRスペクトルを図3に提示する。
4LのStreptococcus pyogenes菌の増殖培養物を80℃で熱不活化して300gで遠心分離した。ペレット化した細菌を生理食塩水緩衝液中に再懸濁して、GAS炭水化物を還元的酸処理により放出させた。簡単に説明すると、0.1容積の4N亜硝酸ナトリウムおよび0.1容積の氷酢酸を、細菌の懸濁物に攪拌しながら、混合物が最終pHがおよそ3.0になるまで加えた。次にpHがおよそ6〜7になるまで中和した。
混合物を0.6μmフィルタ(Sartopure GF2、Sartorius)を使用して濾過し、次に3kDaカットオフ膜(膜面積0.1m2)を使用して限外濾過した。調製物はその容積が約200mLになるまで濃縮し、約10容積の水を使用して水に対して透析した。GAS炭水化物調製物のこの段階におけるタンパク質汚染を測定すると、約20〜30%であることが示された。
以下のクロマトグラフィー工程をAKTATMシステム(Farmacia)で実施した。GAS炭水化物は、溶離物の画分で215nmのUV吸収を測定することにより検出した。
GAS炭水化物調製物は−20℃で貯蔵した。
GAS炭水化物調製物の汚染を減少させる、異なったタイプのクロマトグラフィーの有効度を比較した。クロマトグラフィーのタイプは、ゲル濾過(SephadexTMG50ゲルを使用);陰イオン交換(Q SepharoseTMXL樹脂を使用);カチオン交換(SP SepharoseTMXL樹脂を使用);および疎水性相互作用(フェニルSepharoseTM6Fast Flow樹脂を使用)であった。全ての樹脂およびゲルは、GE healthcareから入手した。各タイプのクロマトグラフィーから得られたGAS炭水化物の最終収率(CHO)およびGAS炭水化物調製物のタンパク質汚染を測定した(表II)。
(GAS炭水化物濃度測定)
パルス電流測定検出を用いる高速陰イオン交換クロマトグラフィーを、DIONEXTMシステムを使用して実施した。GAS炭水化物調製物は、4Mトリフルオロ酢酸中で加水分解した。50mM NaOHを移動相緩衝液として、CarboPacTMPA1分析カラムを使用した。カラムを再生するために500mM NaOHを使用した。N−アセチル−グルコサミンおよびラムノースに対する保持時間は、それぞれ5.3分および7.2分であった。ラムノースおよびN−アセチル−グルコサミンのピークを積分して、GAS炭水化物の量を標準較正曲線に基づいて計算した。
タンパク質汚染はMicroBCAアッセイ(Pierce)を使用して測定した。
核酸濃度は260nmにおける吸光度(A)により測定した。濃度は、Lambert−Beer則、A=εbc(cは試料の濃度であり;bは試料の長さであり(1cm)およびεは0.020(μg/ml)−1cm−1である(DNA2本鎖に対する文献値))を使用して定量した。多糖の溶液は、石英キュベット中1mg/ml(水または緩衝液)で、対応する水または緩衝液で機器をリセットして、分光光度計(分光光度計Lambda 25 Perkin Elmer)で読んだ。核酸の濃度は、c=A/εbとして計算した。この値から、核酸濃度を多糖濃度で除し、結果に100を乗じることにより、核酸汚染の%を計算した。
試料(約1mgの多糖)を、プロトン化したH2O溶媒を排除するために、凍結乾燥により調製した。次に生成物を重水(D2O、99.9%D原子、Aldrichから)に溶解して均一溶液を生成させた。本発明者らは、凍結乾燥が糖部分の物理化学構造に影響しないことを見出した。
残存ヒアルロン酸含有率はCorgenix Incの市販キット(製品番号029−001)により推定した。このHA試験キットは、ヒアルロン酸に結合するタンパク質(HABP)として公知の捕捉分子を使用する酵素連結結合タンパク質アッセイ(enzyme−linked binding protein assay)である。適当に希釈された血清または血漿およびHA参照溶液をHABPでコートしたマイクロウェル中でインキュベートして、試料中に存在するHAを固定化された結合性タンパク質(HABP)と反応させた。結合していない試料分子の洗浄による除去後、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)と結合したHABP溶液がマイクロウェルに加えられて、結合したHAと複合体を形成する。別の洗浄工程に続いて、色素形成基質のテトラメチルベンジジンおよび過酸化水素が添加されて反応混合物に色変化を生じさせる。色の強度を、分光光度計を用いて450nmで光学的密度(OD)単位により測定する。未知のおよび対照試料のHAレベルを、ブランク試薬(0ng/mL)とキットで提供されたHA参照溶液(50、100、200、500、800ng/mL)とから調製された参照曲線に対して決定した。
(Streptococcus pyogenes由来のGAS炭水化物精製の最適化)
培養後に得られたGAS炭水化物は、一般に不純であり、ヒアルロン酸、タンパク質、ポリラムノースおよび核酸で汚染されている。タンジェンシャルフロー濾過、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー(ゲル濾過)に基づく実施例1の精製方法は、大規模化可能性を促進して且つ純度を改善するために最適化されている。
この最初の精製工程は、0.65μmの直交濾過を使用して粒子状汚染を除去する。濾過前に、硝酸ナトリウムおよび氷酢酸処理後に得られたGAS炭水化物懸濁物のpHを約6から7に中和した。次に、Sartopure GF2TMカプセル0.65μm(Sartorius)を使用して混合物を濾過した。5Lの発酵物から得られた約2Lの懸濁物に対して、通常0.2m2の濾過表面を使用して、作業は約30〜40分で完了した。
第2の工程は低分子量種(例えばタンパク質、核酸およびヒアルロン酸)を除去するためのタンジェンシャルフロー濾過である。異なったカットオフ膜を、精製を改善し処理時間を短縮するために比較した。
3kDa、流量=18mL/分
5kDa、流量=40mL/分
10kDa、流量=50mL/分
30kDa、流量=80〜100mL/分。
陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、GAS炭水化物のヒアルロン酸汚染ならびにタンパク質および核酸含有率を減少させるのに特に有効である。
タンジェンシャルフロー濾過工程は、GAS炭水化物溶液の濃縮をもたらす。これはGAS炭水化物の濃度がそれに続く結合体化のために最適化されることを可能にする。
(残存ポリラムノース含有率の推定)
NMRピークの帰属(図9)に基づいて、ポリラムノースの残存含有率を積分比:
ポリラムノース(%)=[H1 RhaB VAR/(H1 RhaA+H1 RhaA VAR)]×100
により推定した。
(10kDaまたは5kDaタンジェンシャルフロー濾過工程とゲル濾過工程との比較)
実施例1においては、汚染をさらに減少させるために、陰イオン交換クロマトグラフィー工程に続いて、ゲル濾過工程を実施した。対照的に、実施例2の最適化された方法は、方法のこの段階でゲル濾過の代わりに、タンジェンシャルフロー濾過(5kDaまたは10kDa)を含む。この2つの選択手段により、おおよそ同じレベルのGAS炭水化物を回収できる。しかしながら、タンジェンシャルフロー濾過は、より低いレベルのポリラムノース汚染を生じるように思われる(1HNMRにより測定した)。
クロマトグラフィーはAktaTMシステム(G & E Healthcare)で実施し、ゲル濾過はSephacryl S100ゲル(G & E healthcare)で実施した。GAS炭水化物調製物の容積が、ゲル濾過カラムの容積の5%を超えることは許容しなかった。移動相緩衝液はpH7.2の10mM NaPi緩衝液であった。
対照的に、最適化された方法で得られたGAS炭水化物の純度はそれより高い。
(結合体調製物)
(直接還元的アミノ化反応)
精製されたGAS炭水化を、直接還元的アミノ化反応により担体タンパク質CRM197と結合体化させた(図13)。還元的アミノ化反応には、担体タンパク質中のリシンの側鎖のアミン基と、糖中、特にGAS炭水化物多糖の還元性末端にあるアルデヒド基とが関わる。
GAS炭水化物は担体分子とリンカーを介して結合体化することもできる。精製されたGAS炭水化物を担体タンパク質CRM197と、アジピン酸リンカーを介して結合体化した。
(マウスによる研究)
直接還元的アミノ化反応によりCRM197と結合体化した精製GAS炭水化物の効果を、腹腔内GASチャレンジアッセイで試験した。明礬アジュバントと共に腹腔内投与することにより、結合体で(10μg糖の用量で)マウスを免疫化した。Streptococcus pyogenesのM1株でチャレンジしたとき、マウスの51%が生存したのに対し、免疫化しなかった対照は16%の生存であった。別の試験では、マウスをM1またはM23株のいずれかでチャレンジした。この研究では、M1株でチャレンジした免疫化マウスの56%が生存したのに対し、免疫化しなかった対照は20%であり、一方、M23株でチャレンジしたマウスの41%が生存したのに対し、対照は11%であった。したがって、本発明の方法により精製されたGAS炭水化物は保護免疫を提供する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を含む、Streptococcus pyogenesのGAS炭水化物を精製するための方法。
(項目2)
上記精製されたGAS炭水化物が約10kDaの分子量を有する、項目1に記載の方法。
(項目3)
上記糖が部分的にまたは完全に脱N−アセチル化されている、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
出発原料が、ヒアルロン酸および/またはポリラムノースをさらに含むGAS炭水化物の水性懸濁物である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目5)
上記懸濁物が、上記GAS炭水化物が放出されるようにS.pyogenesを処理することにより調製される、項目4に記載の方法。
(項目6)
上記GAS炭水化物が還元的酸処理により放出される、項目5に記載の方法。
(項目7)
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程に先だって、1回または複数回の濾過工程を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目8)
上記濾過が0.65μmフィルタを使用する直交濾過である、項目7に記載の方法。
(項目9)
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程に先だって、1回または複数回の限外濾過工程を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目10)
上記限外濾過が30kDaカットオフ膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過である、項目9に記載の方法。
(項目11)
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、陰イオン交換マトリックスとしてQ樹脂を使用して実施される、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目12)
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、GAS炭水化物1mg当たり1mLの陰イオン交換マトリックス樹脂を使用して実施される、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目13)
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、上記GAS炭水化物の貫流を可能にする条件下で実施される、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目14)
上記陰イオン交換クロマトグラフィーの移動相緩衝液がアルコールを含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目15)
上記移動相緩衝液中の最終アルコール濃度が15%と25%との間である、項目14に記載の方法。
(項目16)
上記アルコールがエタノールである、項目14または15に記載の方法。
(項目17)
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程の後に1回または複数回のゲル濾過工程を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目18)
上記ゲル濾過工程が、ゲル濾過マトリックスとしてデキストランゲルを使用して実施される、項目17に記載の方法。
(項目19)
上記ゲル濾過工程が、GAS炭水化物0.2mg当たり1mLのゲル濾過マトリックスを使用して実施される、項目17または18に記載の方法。
(項目20)
上記ゲル濾過工程が、上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程と同じ移動相緩衝液を使用して実施される、項目17から19のいずれかに記載の方法。
(項目21)
上記ゲル濾過工程が、項目14から16のいずれかに記載の移動相緩衝液を使用して実施される、項目17から20のいずれかに記載の方法。
(項目22)
上記陰イオン交換クロマトグラフィー工程の後に上記GAS炭水化物を濃縮する1回または複数回の工程を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目23)
上記濃縮工程が、5または10kDaカットオフ膜を使用してタンジェンシャルフロー濾過により実施される、項目22に記載の方法。
(項目24)
上記精製されたGAS炭水化物を担体分子と結合体化するさらなる工程を含む、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目25)
項目1から24のいずれかに記載の方法により得ることができる、Streptococcus pyogenes由来のGAS炭水化物を含む組成物。
(項目26)
a)80ng/ml未満;またはb)GAS炭水化物の重量に対してヒアルロン酸1重量%未満のレベルのヒアルロン酸汚染を含む、項目25に記載の組成物。
(項目27)
GAS炭水化物の重量に対してポリラムノース20重量%未満のレベルのポリラムノース汚染を含む、項目25または26に記載の組成物。
(項目28)
GAS炭水化物の重量に対してタンパク質約2重量%のレベルのタンパク質汚染を含む、項目25から27のいずれかに記載の組成物。
(項目29)
GAS炭水化物の重量に対して核酸1重量%未満のレベルの核酸汚染を含む、項目25から28のいずれかに記載の組成物。
Claims (29)
- 陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を含む、Streptococcus pyogenesのGAS炭水化物を精製するための方法。
- 前記精製されたGAS炭水化物が約10kDaの分子量を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記糖が部分的にまたは完全に脱N−アセチル化されている、請求項1または2に記載の方法。
- 出発原料が、ヒアルロン酸および/またはポリラムノースをさらに含むGAS炭水化物の水性懸濁物である、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記懸濁物が、前記GAS炭水化物が放出されるようにS.pyogenesを処理することにより調製される、請求項4に記載の方法。
- 前記GAS炭水化物が還元的酸処理により放出される、請求項5に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程に先だって、1回または複数回の濾過工程を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記濾過が0.65μmフィルタを使用する直交濾過である、請求項7に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程に先だって、1回または複数回の限外濾過工程を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記限外濾過が30kDaカットオフ膜を使用するタンジェンシャルフロー濾過である、請求項9に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、陰イオン交換マトリックスとしてQ樹脂を使用して実施される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、GAS炭水化物1mg当たり1mLの陰イオン交換マトリックス樹脂を使用して実施される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、前記GAS炭水化物の貫流を可能にする条件下で実施される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーの移動相緩衝液がアルコールを含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記移動相緩衝液中の最終アルコール濃度が15%と25%との間である、請求項14に記載の方法。
- 前記アルコールがエタノールである、請求項14または15に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程の後に1回または複数回のゲル濾過工程を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記ゲル濾過工程が、ゲル濾過マトリックスとしてデキストランゲルを使用して実施される、請求項17に記載の方法。
- 前記ゲル濾過工程が、GAS炭水化物0.2mg当たり1mLのゲル濾過マトリックスを使用して実施される、請求項17または18に記載の方法。
- 前記ゲル濾過工程が、前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程と同じ移動相緩衝液を使用して実施される、請求項17から19のいずれかに記載の方法。
- 前記ゲル濾過工程が、請求項14から16のいずれかに記載の移動相緩衝液を使用して実施される、請求項17から20のいずれかに記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィー工程の後に前記GAS炭水化物を濃縮する1回または複数回の工程を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記濃縮工程が、5または10kDaカットオフ膜を使用してタンジェンシャルフロー濾過により実施される、請求項22に記載の方法。
- 前記精製されたGAS炭水化物を担体分子と結合体化するさらなる工程を含む、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から24のいずれかに記載の方法により得ることができる、Streptococcus pyogenes由来のGAS炭水化物を含む組成物。
- a)80ng/ml未満;またはb)GAS炭水化物の重量に対してヒアルロン酸1重量%未満のレベルのヒアルロン酸汚染を含む、請求項25に記載の組成物。
- GAS炭水化物の重量に対してポリラムノース20重量%未満のレベルのポリラムノース汚染を含む、請求項25または26に記載の組成物。
- GAS炭水化物の重量に対してタンパク質約2重量%のレベルのタンパク質汚染を含む、請求項25から27のいずれかに記載の組成物。
- GAS炭水化物の重量に対して核酸1重量%未満のレベルの核酸汚染を含む、請求項25から28のいずれかに記載の組成物。
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