JP2022532142A - コンジュゲートの製造 - Google Patents

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Abstract

本出願は、多糖抗原-担体タンパク質コンジュゲート、具体的にはB群連鎖球菌(GBS)莢膜多糖及び担体タンパク質、具体的にはCRM197のコンジュゲートを製造する方法に関する。本方法は、遊離多糖及び遊離担体タンパク質からコンジュゲートを分離するためのハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーのステップを含む。【選択図】なし

Description

本発明は、多糖及びタンパク質担体のコンジュゲートを製造及び精製する方法に関する。
細菌の莢膜多糖(CPS)はT細胞非依存性抗原であり、一般的に免疫原性に乏しい。細菌のCPSを担体分子(例えばタンパク質担体)に共有結合的にコンジュゲートすると、T細胞非依存性抗原がT細胞依存性抗原に変わり、それによってメモリー応答及び防御免疫の発現が促進される。ワクチンに使用するための、タンパク質担体にコンジュゲートされた細菌の莢膜多糖が知られており、それにはヘモフィルスインフルエンザb型菌(Haemophilus influenzae type b)(Hib)コンジュゲート(Peltola 2000)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)コンジュゲート(Wuorimaa & Kayhty 2002)及び血清型C株髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)(MenC)コンジュゲート(Balmerら 2002)が含まれる。認可されたワクチンにおいて使用されている担体タンパク質としては、破傷風トキソイド(TT)、ジフテリアトキソイド(DT)、ジフテリア毒素の無毒性CRM197変異体、及びB群髄膜炎菌(group B N. meningitidis)由来の外膜タンパク質複合体が含まれる。
ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)(「B群連鎖球菌」又は「GBS」としても知られる)は、健康な女性の25%～30%の肛門性器管に定着しているβ溶血性の被包性グラム陽性菌である。それは、特にその細菌を有する女性の子として生まれた乳幼児において、新生児敗血症及び髄膜炎の主な原因となっている。GBS血清型の莢膜多糖(莢膜糖とも称される)がワクチンに使用するために検討されており、それには糖-タンパク質コンジュゲートの形態のものが含まれる。
多糖及びタンパク質担体のコンジュゲート、例えばGBS莢膜多糖抗原と担体タンパク質のコンジュゲートを製造及び精製する効率的な方法が必要とされている。
本発明は、多糖及び担体タンパク質のコンジュゲートを製造する方法であって、サイズ調整された(sized)多糖を提供し、担体タンパク質とコンジュゲートして多糖-タンパク質コンジュゲート及び遊離多糖を含む混合物を提供し、混合物をハイドロキシアパタイトに接触させることによるクロマトグラフィーのステップを、コンジュゲートがハイドロキシアパタイトに結合するが遊離多糖は結合しない条件下で実施し、混合物から遊離多糖を除去し、ハイドロキシアパタイトに結合したコンジュゲートを回収する方法を提供する。
本発明の実施形態では、混合物が更に遊離担体タンパク質を含み、クロマトグラフィーのステップが、コンジュゲート及び遊離担体タンパク質がハイドロキシアパタイトに結合する条件下で実施される。
本発明の実施形態では、多糖は細菌の莢膜多糖である。
本発明の更なる実施形態では、多糖は、約50キロダルトン(kDa)から約200kDaの間の平均分子量にサイズ調整されたGBS莢膜多糖である。
本発明の実施形態では、担体タンパク質は破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、シュードモナスの外毒素A(EPA)、GBS線毛タンパク質及びCRM197から選択される。
本発明の更なる実施形態では、回収された莢膜多糖コンジュゲートを薬学的に許容される希釈剤又は担体と混合して、医薬組成物を提供する。
GBS血清型Iaの繰り返し構造とGBS血清型IIIの繰り返し構造間の違いを示す図である。 GBS血清型Ia、Ib、II、III及びVにおける莢膜糖の繰り返し構造を示す図である。 末端のシアル酸残基の過ヨウ素酸酸化を示す図である。 異なるプロセスによって得られたGBS CPS-CRM197コンジュゲートを使用して得られた、マウスにおける抗体反応を示す図である。 相対単位(RU)及び幾何平均力価±95%信頼区間(それぞれドット及びバーで示す)として表される、マウスの群毎の個々の血清からの総IgG力価を示す図である。 IgG反応を示す図である。単一のマウスのLuminexデータ(RU/ml)をドットで表し、バーは幾何平均力価±95%信頼区間(CI)を表す。グラフ上部のバーにより、得られた幾何平均IgG力価(GEOMEAN)を報告する。
医学的用途のための多糖-タンパク質コンジュゲートの製造、例えばワクチンの調製においては、バルクコンジュゲート生成物中の遊離担体タンパク質(すなわち多糖分子にコンジュゲートされていない担体タンパク質分子、非コンジュゲート担体タンパク質とも称される)及び遊離多糖(すなわちタンパク質分子にコンジュゲートされていない多糖分子、非コンジュゲート多糖とも称される)の量を最小化することが望ましい。
遊離担体タンパク質を除去するための様々な方法が当分野において知られており、疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外ろ過、透析ろ過等が含まれる。例えばLeiら(2000)、WO00/38711、米国特許第6,146,902号等を参照のこと。GBSコンジュゲートの精製するためのゲルろ過の使用(リサーチディスクロージャー(Research Disclosure)、453077に匿名で記載されている(Jan 2002))は、大量のゲルろ過マトリックスを必要とし、製造規模で適用することが難しい。限外ろ過を含めた代替の方法、例えば100kDaのメンブランを用いたタンジェンシャルフロー透析ろ過の使用は、糖抗原が適切に高分子量でない限り効果的ではなく、従ってGBS血清型IIIコンジュゲート、又は糖抗原が<100kDaである他のコンジュゲートには適さない。WO2009/010877(米国特許第9,463,250号)には、ハイドロキシアパタイトを使用して非コンジュゲート担体タンパク質を除去する方法が提供されており、そこでは遊離担体タンパク質がハイドロキシアパタイトに結合する。
WO2009/010877(米国特許第9,463,250号)において実証されているように、非コンジュゲートCRM197担体タンパク質からGBS多糖CRM197のコンジュゲートを分離するためのクロマトグラフィーにおいて、Type I及びType IIの両方のハイドロキシアパタイト樹脂を使用することができる。コンジュゲート及び非コンジュゲートCRM197の両方が適切な条件下で樹脂に結合し、その後に別々に回収することが可能である。大部分の遊離多糖が樹脂に結合することなく通過し、それゆえ出発混合物から除去される。WO2009/010877において記載されているハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの方法により、CRM197にコンジュゲートされた脱シアル化GBS V型莢膜多糖の80%超を、コンジュゲート及び非コンジュゲートCRM197の両方を含有する出発混合物から回収することが可能となった。
本発明者らは、天然のGBS Ia又はIb PSを出発精製糖として使用して、上記の方法に従ってGBS血清型Ia又はIb多糖とCRM197とのコンジュゲートを調製した場合、結果として得られるバルクコンジュゲート生成物は遊離多糖(PS)を高含有量(結果として得られるバルク生成物中の多糖の総重量の10%超)で含むことを明らかにした。対照的に、GBS IIIの天然PSを出発精製糖として使用した場合には、同じ方法を使用して製造したGBS血清型IIIのバルクコンジュゲート中の遊離PS量は、より少ないことを見出した。
疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外ろ過及び透析ろ過を含む、混合物から遊離多糖を分離する方法が当分野において知られている。例えばLeiら、(2000);WO2000/038711を参照のこと。
出発混合物が(a)サイズ調整された細菌の多糖と担体タンパク質とのコンジュゲート並びに(b)サイズ調整された遊離多糖の両方を含有する場合、本明細書に開示された方法によって出発混合物から遊離多糖を効率的に除去することが可能になる。出発混合物はまた、(c)遊離担体タンパク質を含有し得る。
GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV及びVについて、GBS多糖-CRM197コンジュゲートを、以下のプロセスを用いてバルクで調製した。
Figure 2022532142000001
コンジュゲーションステップにより、多糖-タンパク質コンジュゲート並びに遊離多糖及び遊離担体タンパク質を含有する混合物が提供される。次いで、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用してコンジュゲートから遊離多糖及び遊離担体タンパク質を分離することにより、多糖-タンパク質コンジュゲートを含む最終的なバルク生成物が提供される。
本発明者らは、出発多糖分子のサイズが、最終的なバルク生成物中の遊離PS含有量に影響を及ぼすことを明らかにし、更に上記のプロセスにおいて、サイズ調整されたGBS Ia多糖(すなわち、天然の又はサイズ調整されていないGBS Iaと比べてMWが減少したGBS Ia多糖分子)を出発物質(精製多糖)として使用することにより、(同じプロセスにおいて天然の又はサイズ調整されていないGBS Ia多糖を精製多糖として使用した場合の遊離PSレベルと比べて)遊離GBS Ia多糖レベルが減少したバルクコンジュゲート生成物がもたらされることを明らかにした。結果として得られたGBS血清型Ia-CRM197コンジュゲートが、動物モデルを使用した場合に免疫原性を保持することを更に示した。
本発明者らは、更に加えて、上記のプロセスにおいて、サイズ調整されたGBS Ib多糖(すなわち、天然の又はサイズ調整されていないGBS Ibと比べてMWが減少したGBS Ib多糖分子)を出発物質(精製多糖)として使用することにより、(同じプロセスにおいて天然の又はサイズ調整されていないGBS Ib多糖を精製多糖として使用した場合の遊離PSレベルと比較して)遊離GBS Ib多糖レベルが減少したバルクコンジュゲート生成物がもたらされることを明らかにした。結果として得られたGBS血清型Ib-CRM197コンジュゲートが、動物モデルを使用した場合に免疫原性を保持することを更に示した。
本発明者らは、更に加えて、上記のプロセスにおいてサイズ調整されたGBS II多糖(すなわち、天然の又はサイズ調整されていないGBS IIと比べてMWが減少したGBS II多糖分子)を出発物質(精製多糖)として使用することにより、(同じプロセスにおいて天然の又はサイズ調整されていないGBS II多糖を精製多糖として使用した場合の収量と比較して)コンジュゲートの収量が増加することを明らかにした。結果として得られたGBS血清型II-CRM197コンジュゲートが、動物モデルを使用した場合に免疫原性保持することを更に示した。
天然のGBS多糖血清型Ia、Ib及びIIのそれぞれは、天然のGBS多糖血清型IIIよりも高分子量を有する。天然のGBS IIIのMWは約100kDaであり、天然のGBS IaのMWは約270kDaであり、天然のGBS IbのMWは約185kDaであり、天然のGBS IIのMWは約419kDaである。CRM197のMWは約60kDaである。
従って、本発明は、多糖抗原-担体タンパク質コンジュゲートを製造する方法であって、出発精製多糖としてサイズ調整された多糖を使用することによりバルクコンジュゲート生成物中の遊離PSの量を(天然の又はサイズ調整されていない多糖を使用した場合のバルクコンジュゲート生成物中の遊離PSの量と比べて)減少させる方法を提供する。そのプロセスの間に、(コンジュゲーションステップ後に得られた)糖-タンパク質コンジュゲート、遊離タンパク質及び遊離多糖の混合物をハイドロキシアパタイトに接触させる。適切なクロマトグラフィー条件下においては、コンジュゲート及び遊離タンパク質担体の両方はハイドロキシアパタイトに結合するが、遊離多糖は結合せず、従って遊離PSを、例えばクロマトグラフィーの素通り画分において分離することができる。次いでコンジュゲートをハイドロキシアパタイトから回収(溶出)する。次いで遊離担体タンパク質もハイドロキシアパタイトから回収(溶出)することができ、次のコンジュゲーション反応において再使用するか、アッセイするか、又は廃棄することができる。
担体タンパク質
担体タンパク質が、本方法において使用される条件下でハイドロキシアパタイトに結合するのであれば、どのような担体タンパク質でも本発明の方法において使用することができる。ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)及びCRM197(無毒化DTバリアント)が、多糖抗原に対する担体タンパク質として、市販の小児ワクチンにおいて現在使用されている。(CRMはCross Reacting Material（交差反応物質）を表す)。従って、担体タンパク質は当分野において既知のもの、例えば破傷風トキソイド(TT)、ジフテリアトキソイド(DT)、又はそれらの誘導体、例えばCRM197若しくはDTの他の無毒化バリアント(例えば、Anderson(1983)及びAndersonら(1985)を参照のこと)から選択することができる。他の適した担体タンパク質としては、EPA(シュードモナスの外毒素A、例えば、Brokerら(2017)を参照のこと)及びGBS線毛タンパク質(例えばWO02/34771、WO2002/012294を参照のこと)、髄膜炎菌の外膜タンパク質(EP-A-0372501)、合成ペプチド(EP-A-0378881、EP-A-0427347)、熱ショックタンパク質(WO93/17712、WO94/03208)、百日咳タンパク質(WO98/58668、EP-A-0471177)、サイトカイン(WO91/01146)、リンホカイン(WO91/01146)、ホルモン(WO91/01146)、成長因子(WO91/01146)、種々の病原体由来抗原からの複数のヒトCD4+T細胞エピトープを含む人工タンパク質(Falugiら(2001))、例えばN19(Baraldoら 2004)等、ヘモフィルスインフルエンザ菌(H. influenzae)由来のタンパク質D(Ruanら1990;EP-A-0594610、WO00/56360)、ニューモリシン(Kuoら 1995)、肺炎球菌表面タンパク質PspA(WO02/091998)、鉄取り込みタンパク質、クロストリディオイデス・ディフィシル(C. difficile)からの毒素A又はB(WO00/61761)等が挙げられる。
本発明の一実施形態では、担体タンパク質はCRM197である。CRM197はジフテリア毒素の無毒形態であるが、免疫学的にはジフテリア毒素と区別がつかない。(Uchidaら、Nature New Biology (1971)233;8～11)。CRM197タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子中の単一塩基の変化であって、フラグメントAをNADに結合できなくする位置52におけるグリシンからグルタミン酸への変化によってジフテリア毒素とは異なっており、従って無毒である(Pappenheimer 1977;Rappuoliら、1983)。無毒性DT担体タンパク質は配列番号1(CRM197)のアミノ酸配列を有していてもよく、又はそれが無毒であり、フラグメントAがNADに結合できなくなるような配列番号1中の位置52に対応するアミノ酸位置でのアミノ酸置換を含有する(例えば、配列番号1中の位置52に対応するアミノ酸位置がグルタミン酸残基)という条件で、無毒性DT担体タンパク質が配列番号1と少なくとも90%、95%又は99%同一であるアミノ酸配列を有してもいてもよい。
配列番号1-ジフテリア菌(C.diphtheriae)変異体CRM197
Figure 2022532142000002
Figure 2022532142000003
B群連鎖球菌(GBS)
ストレプトコッカス・アガラクチア(B群連鎖球菌又はGBS)の莢膜は、ヒトの自然免疫防御を細菌が回避するのを助ける主要な病原性因子である。GBSの莢膜は、4から7個の単糖からなる複数の同一の反復単位でできている高分子量のポリマーからなる。莢膜多糖反復単位の化学組成及びグリコシド結合のパターンに基づいて、GBSを10個の血清型(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII及びIX)に分類することができる。分類できないGBSの株も存在することが知られている。GBS CPSの構造についての記載が、発表文献(例えば、WO2012/035519を参照のこと)において見出され得る。
世界的な疾患の原因となる分離株の65～95%が血清型Ia、Ib又はIIIのいずれかであると推定されている。これら3つのGBSの血清型(Ia、Ib及びIII)は、欧州及び米国における早発性GBS疾患の65%から75%、及び遅発性GBS疾患の80から90%の原因であると推定されている。
担体タンパク質にコンジュゲートされたGBS莢膜多糖(GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV及びV由来のCPS)を含む組成物は、ヒトにおいて免疫原性であることが臨床試験において示されてきた。そのような免疫原性組成物における使用に適したコンジュゲートには、単一のCPS分子が単一の担体タンパク質分子にコンジュゲートされたもの、又は単一の担体タンパク質分子が糖抗原の複数分子にコンジュゲートされたもの(例えば、同じCRM197分子にコンジュゲートされた複数のGBS Ia糖分子)が含まれる。
本発明に従って使用されるGBS莢膜多糖は、化学修飾又は脱重合されていてもよい。例えば、WO2006/050341を参照のこと。
糖及びサイズ調整(sizing)の定義
本明細書全体にわたり、用語「糖」は多糖(PS)及びオリゴ糖を意味する。あるGBS血清型の多糖は、本明細書で使用される場合、その血清型のGBS細菌の莢膜多糖を意味する。単離されたGBS血清型の多糖は「サイズ調整されて」もよく、すなわち、それらのサイズを既知の方法(例えば、EP497524及びEP497525を参照のこと)によって減少させてもよい。多糖をサイズ調整する方法には、酸加水分解処理、過酸化水素処理、EMULSIFLEX後に過酸化水素処理で糖断片を生じさせることによるサイズ調整、及び顕微溶液化が含まれる。
好ましくは、本発明の方法において使用されるサイズ調整された多糖は、約50キロダルトン(kDa)から約200kDaの間、約70kDaから約170kDaの間、約80kDaから約170kDaの間、約90kDaから約170kDaの間、約100kDaから約170kDaの間、約100kDaから約160kDaの間、又は約70kDa、約80kDa、約90kDa、約100kDa、約110kDa、約120kDa、約130kDa、約140kDa、約150kDa、約160kDa、約170kDa、約180kDa、約190kDa若しくは約200kDaの平均分子量を有する。
好ましくは、本発明の方法において使用されるGBS莢膜多糖は、約80kDaから約110kDaの間、約90kDaから約110kDaの間、又は約100kDaの平均分子量を有するサイズ調整されたGBS血清型Ia莢膜多糖;約80kDaから約110kDaの間、約90kDaから約110kDaの間、又は約100kDaの平均分子量を有するサイズ調整されたGBS血清型Ib莢膜多糖;及び約100kDaから約170kDaの間、約110kDaから約170kDaの間、約120kDaから約170kDaの間、約130kDaから約170kDaの間、約140kDaから約170kDaの間、約150kDaから約170kDaの間、又は約150kDa、約160kDa若しくは約170kDaの平均分子量を有するサイズ調整されたGBS血清型II莢膜多糖、から選択される。
本明細書で使用される場合、「サイズ調整された」多糖とは、サイズ調整プロセス前の出発多糖の分子量と比べてその分子量を減少させるプロセスを経たものである。出発多糖は、野生型(天然)の多糖であってもよい。
本発明の一実施形態では、細菌の多糖は機械的な切断、例えば顕微溶液化又は超音波処理によってサイズ調整される。
サイズ調整は、×20、×10、×8、×6、×5、×4、×3又は×2以下の倍率によるものであってもよい。
本発明の目的の場合、「×2の倍率によってサイズ調整される」は、糖が、出発多糖(サイズ調整プロセス前の多糖で、天然の多糖であり得る)の2分の1のサイズに糖のサイズを減少させるプロセスを受けることを意味する。「×3の倍率によってサイズ調整される」は、糖が、出発多糖の3分の1のサイズに糖のサイズを減少させるプロセスを受けることを意味する。
本発明の目的の場合、「×2以下(又は最大×2まで)の倍率によってサイズ調整される」は、糖が、糖のサイズを減少させるがその糖が出発多糖の少なくとも2分の1のサイズ(すなわち2分の1以上)は保持するプロセスを受けることを意味する。「×3以下(又は最大×3まで)の倍率によってサイズ調整される」は、糖が、糖のサイズを減少させるがその糖が出発多糖の少なくとも3分の1のサイズ(すなわち、3分の1以上)は保持するプロセスを受けることを意味する。
本発明の目的の場合、「少なくとも×2の倍率によってサイズ調整される」は、多糖を出発糖の2分の1以下のサイズに減少させるサイズ調整プロセスを意味する。「少なくとも×3の倍率によってサイズ調整される」は、多糖を出発糖の3分の1以下に減少させるサイズ調整プロセスを意味する。
本発明の目的の場合、「少なくとも×2から最大×3までの倍率によってサイズ調整される」は、多糖を、出発糖の2分の1以下であるが出発多糖のサイズの3分の1以上(それらの終点を含む)であるサイズに減少させる(例えば、少なくとも×2から最大×3までの倍率によってサイズ調整される300kDaの出発糖は、150～100kDa(150及び100kDaを含む)の間のサイズに減少する)サイズ調整プロセスを意味する。
用語×4、×5、×6、×7、×8、×9、×10、×20は、×2及び×3に対する上記と同様に解釈することができる。
本発明の目的の場合、「天然の」すなわち「野生型の」多糖は、糖のサイズを減少させることが目的であるプロセスを受けていない糖を意味する。
分子量
本明細書における糖の分子量又は平均分子量は、MALLS(多角度レーザー光散乱)によって測定されるような糖の重量平均分子量(Mw)を意味する。MALLS技術は、当技術分野において周知である。遊離すなわち非コンジュゲート糖の分子量を、任意の担体タンパク質へのコンジュゲーションの前に測定する。
糖抗原
一実施形態では、本発明の方法において使用される糖抗原は細菌の糖であり、具体的には細菌の莢膜糖であり、より具体的にはGBSの莢膜多糖である。本発明の一実施形態では、糖はGBS血清型Ia莢膜多糖である。本発明の更なる実施形態では、糖はGBS血清型Ib莢膜多糖である。本発明の更なる実施形態では、糖はGBS血清型II莢膜多糖である。
本発明の一実施形態では、野生型又は天然の糖抗原は100kDaを超える分子量を有し、更なる実施形態では、野生型又は天然の糖抗原は約120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480若しくは500kDaを超える分子量、約160～約300の間の分子量、又は任意の与えられた分子量の間の分子量を有する。
本発明の一実施形態では、糖抗原はGBS血清型Ia、Ib及びIIから選択される莢膜糖である。詳細には、これらの血清型由来のGBS莢膜糖は、細菌のペプチドグリカン骨格中のGlcNAc残基に共有結合的に連結している可能性がある。異なるGBS血清型の莢膜多糖は、化学的には関連しているが、抗原的には非常に異なる。すべてのGBS莢膜多糖が、以下の三糖コアを共有する。
β-D-GlcpNAc(1→3)β-D-Galp(1→4)β-D-Glcp
GBS血清型は、このコアの修飾のされ方によって異なる。例えば、血清型Ia及びIIIの間の違いは、本コア中のGlcNAc(Ia)又はGal(III)のどちらを、連続する三糖コアを結合するために使用するかによって生じる(図1)。血清型Ia及びIbの両方がコア中のGlcNAcに結合した[α-D-NeupNAc(2→3)β-D-Galp-(1→]ジサッカライドを有するが、結合は1→4(Ia)又は1→3(Ib)のどちらか一方である。
図2に示されるように、5つのGBS血清型の莢膜糖には、(a)すべての場合でガラクトース残基に2→3結合している、末端のN-アセチル-ノイラミン酸(NeuNAc)残基(一般にノイラミン酸又はシアル酸と称される)、及び(b)三糖コア内のN-アセチル-グルコサミン残基(GlcNAc)が、含まれる。
本発明の方法において使用され得る更なる細菌の莢膜糖の例としては、髄膜炎菌(血清型A、B、C、W135及び/又はY)、肺炎連鎖球菌(血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及び33F、特に4、6B、9V、14、18C、19F及び/又は23F)、ストレプトコッカス・アガラクチア(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、及び/又はVIII型)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)(分類可能株:a、b、c、d、e及び/又はf)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(例えば、血清型5及び8由来)、フェカリス菌(Enterococcus faecalis)又はフェシウム菌(E.faecium)(三糖反復)、エンテロコリチカ菌(Yersinia enterocolitica)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、チフス菌(Salmonella typhi)、クレブシエラ属菌(Klebsiella spp.)等の由来の莢膜糖が挙げられる。別に挙げることのできる糖は、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)群特異抗原(GAS炭水化物)である。
莢膜糖抗原の調製
細菌の莢膜糖抗原の調製方法が、当分野において知られている。例えば、WO03/007985には、髄膜炎菌由来の糖抗原の調製が記載されている。ヘモフィルスインフルエンザ菌由来の糖抗原の調製は、Vaccine(Plotkinら編)の第14章に記載されている。肺炎球菌(S. pneumoniae)由来の糖抗原及びコンジュゲートの調製も、当分野において記載されている。ストレプトコッカス・アガラクチア由来の糖抗原の調製のためのプロセスが、Wesselsら(1990)、Wesselsら(1989)、WO2006/082527において詳細に記載されている。
糖は、自然界で見出される莢膜糖に対して化学修飾されていてもよい。例えば、糖は(部分的又は完全に)脱-O-アセチル化されていてもよく、(部分的又は完全に)脱-N-アセチル化されていてもよく、(部分的又は完全に)N-プロピオニル化されていてもよい、等である。脱アセチル化は、コンジュゲーション前、コンジュゲーション中又はコンジュゲーション後に起こってもよいが、好ましくはコンジュゲーション前に起こる。特定の糖によっては、化学修飾、例えば脱-アセチル化が免疫原性に影響を及ぼす可能性がある場合とない場合があり、抗原の免疫原性に対する化学修飾の影響は通常のアッセイによって評価することができる。
GBS由来の糖抗原は修飾されていてもよい。例えば、糖抗原がストレプトコッカス・アガラクチア血清型V莢膜糖である場合には、糖抗原はWO2006/050341に記載されているように修飾されてもよい。具体的には、ストレプトコッカス・アガラクチア血清型V莢膜糖は脱シアル化されてもよい(図3)。脱シアル化されたGBS血清型V莢膜糖は、WO2006/050341に記載されているように、精製GBS血清型V莢膜糖を穏和な酸性条件(例えば0.1M硫酸、80℃で60分間)下で処理することにより、又はノイラミニダーゼで処理することにより調製されてもよい。脱シアル化されたGBS血清型V莢膜糖を調製する方法は、精製糖を1Mの酢酸で、81℃+/-3℃で2時間処理することによるものである。
糖-担体コンジュゲート
本発明の方法によって製造されたバルクコンジュゲート生成物には、少量の遊離(すなわち非コンジュゲート)タンパク質担体が含まれていてもよい。本発明の方法によって製造された組成物中に、所与の担体タンパク質が遊離及びコンジュゲート形態の両方において存在する場合、非コンジュゲート形態は、好ましくは組成物全体における担体タンパク質の総量(重量で)の5%以下で存在し、より好ましくは組成物全体における担体タンパク質の総量(重量で)の2%未満、1.5%未満又は1.0%未満で存在する。
本発明の方法によって製造されたバルクコンジュゲート生成物には、少量の遊離(すなわち非コンジュゲート)多糖が含まれていてもよい。本発明の方法によって製造された組成物中に、所与の多糖が遊離及びコンジュゲート形態の両方において存在する場合、非コンジュゲート形態は、好ましくは組成物全体における全多糖の総量(重量で)の5%以下で存在し、より好ましくは組成物全体における担体タンパク質の総量(重量で)の2%未満、1%未満又は0.5%未満で存在する。
必要に応じて任意の適切なリンカーを用いて、任意の適切なコンジュゲーション反応を本発明の方法において使用することができる。糖抗原の担体への結合は、好ましくは-NH2基、例えば担体タンパク質中のリジン残基又はアルギニン残基の側鎖中の-NH2基を介する。糖が遊離型のアルデヒド基を有する場合には、これが担体中のアミンと反応して還元的アミノ化によりコンジュゲートを形成することが可能である。結合はまた、-SH基、例えばシステイン残基の側鎖中の-SH基を介してであってもよい。
糖は、典型的には、コンジュゲーションの前に活性化又は官能基化される。活性化には、例えばシアニル化試薬、例えばCDAP(例えば、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボラート）(例えば、Leesら(1996);WO95/08348を参照のこと)を関与させてもよい。他の適切な手法においては、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン(norborane)、p-ニトロ安息香酸、N-ヒドロキシスクシンイミド、S-NHS、EDC、TSTU(例えば、WO98/42721を参照のこと)が使用される。
糖抗原がストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜糖の場合には、Wesselsら(1990)に記載されているように、コンジュゲーションには、典型的には、担体タンパク質への糖の還元的アミノ化が関与する。還元的アミノ化には、担体中のアミノ酸の側鎖上のアミン基及び糖中のアルデヒド基が関与する。GBSの莢膜糖がそれらの天然の形態においてアルデヒド基を含まない場合は、図3に示すように、アルデヒド基は、糖のシアル酸残基の一部を過ヨウ素酸酸化することによって、コンジュゲーション前に生成される(Wesselsら(1990)、米国特許第4,356,170号)。ストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜糖の担体タンパク質へのコンジュゲーションはまた、WO2006/082530に記載されている方法を使用して実施されてもよい。
ハイドロキシアパタイト
本発明において使用されるハイドロキシアパタイト((Ca5(PO4)3OH)2)は、当分野において知られている多数の形態のうちの1つであってもよい。ハイドロキシアパタイト(HA)は、結晶、ゲル又は樹脂の形態であってもよい。或いは、標準結晶形態を高温で焼結してそれをセラミック形態に改変してもよい。セラミックHAは、CHT(商標)セラミックハイドロキシアパタイトとしてBio-Radから入手可能であり、高温で焼結されて結晶形態からセラミック形態に改変されたそのハイドロキシアパタイトは球状粒子を提供する。そのようなセラミックHAは異なる粒子サイズ、例えば、直径約20μm、直径約40μm又は直径約80μmで入手することができる。
ハイドロキシアパタイトは、通常クロマトグラフィー精製において使用されるような、カラムにゲル充填(gelpacked)された形態であってもよい。
ハイドロキシアパタイトが粒子形態である場合、その粒子は、好ましくは約20μm、約40μm、約80μm、約20μmから約80μmの間、又は約40μmから約80μmの間の直径を有する。
pH
好ましくは、本方法は6から8の間、より好ましくは6.5から7.5、より好ましくは7.2のpHで実施される。7.2のpHが、糖の安定化を助けるため好ましい。pHは、当分野において既知の酸/塩基を使用して調整することができる。
リン酸濃度
クロマトグラフィー分野の技術者には既知であろうように、条件、例えばバッファーのpH及び塩濃度は、(a)クロマトグラフィーカラムの固定相への移動相中の成分の結合及び(b)それに続く固定相からの結合成分の溶出(回収)、に影響を及ぼす。本方法のクロマトグラフィーのステップでは、クロマトグラフィーの条件は、最初に遊離及びコンジュゲートタンパク質の両方がHA固体相に結合するが遊離多糖は結合しないようなものであり、条件は、次いで、コンジュゲート及び遊離タンパク質を別々に回収するために変更され得る。
本方法の一実施形態では、最初に遊離タンパク質及びコンジュゲートタンパク質の両方がHAに結合するが遊離多糖は結合しないように、異なる濃度のリン酸を含むが本質的に同じpHであるバッファーがクロマトグラフィーのステップにおいて使用される。その後に、クロマトグラフィーの条件を変えてコンジュゲートを溶出(回収)する。遊離タンパク質を別に回収するために更に条件を変えてもよい。
好ましくは、出発物質(ローディングバッファー)のリン酸濃度は、約10mM未満、約1mMから約10mM、約1mMから約5mM、約1mMから約2mM、又は約2mMである。次いで、コンジュゲート(担体タンパク質+多糖)の溶出を、約5mMから約50mM、約10mMから約50mM、約10mMから約40mM、約10mMから約35mMのリン酸濃度で実施する。コンジュゲートは、2種の異なる溶出バッファー、例えば約10mMのリン酸のバッファーを使用する第1の溶出及び約35mMのリン酸の第2のバッファーを使用して溶出してもよい。
その後に、遊離タンパク質を、コンジュゲートを溶出するために使用したものよりも高いリン酸濃度、例えば、約50mMから約500mM、約100mMから約500mM、約200mMから約500mM、又は約400mMのバッファーを使用してクロマトグラフィーカラムからはがしてもよい。
典型的にはリン酸ナトリウムバッファーが使用される。代替のバッファーとしては、MES(2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸)、HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、イミダゾール又は酢酸が挙げられる。
製剤、医療方法及び使用
本発明は更に、医薬組成物を調製する方法であって、出発精製多糖としてサイズ調整された多糖を使用して多糖抗原-タンパク質コンジュゲートを本方法に従って作製するステップと、次いで前記多糖抗原-担体タンパク質コンジュゲートを薬学的に許容される希釈剤又は担体と混合するステップとを含む方法を提供する。本発明はまた、前記方法によって調製された組成物も提供する。
従って、本発明の方法を使用して得られたコンジュゲート(又はバルクコンジュゲート)は、薬学的に許容される希釈剤又は担体を加えることにより、医薬組成物として製剤化され得る。そのような製剤には更に、免疫アジュバント、更なる抗原、又は免疫アジュバント及び更なる抗原の両方を含んでもよい。
最終的な医薬品形態、例えばワクチンに製剤化した後、コンジュゲートの多糖成分に対する免疫反応を誘導する(又は生じさせる)ために、対象に本発明の組成物を投与することができる。対象は、非ヒト哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類等であってもよく、又はヒト対象であってもよい。組成物はワクチンとして製剤化することができる。任意の適した経路でそれらを送達することができる。本発明の組成物は、予防手段(疾患又は感染を予防するための)又は治療手段(疾患又は感染を治療するための)において使用することができる。多糖抗原が細菌の多糖である場合には、本発明の組成物は、細菌が原因の感染又は疾患を予防又は治療することにおいて使用され得る。
本発明は、医薬における(治療目的における、感染を治療するための、免疫反応を生じさせるための、及び/又はワクチンとしての)使用のための、本発明の方法を使用して得られるコンジュゲートを提供する。
本発明はまた、患者内に免疫反応を生じさせる（raising）又は患者における細菌感染を治療するための薬物の製造における、本発明のコンジュゲートの使用を提供する。
本発明のコンジュゲートは、他の免疫調節剤と共に投与してもよい。具体的には、免疫原性組成物又はワクチン組成物には、アジュバントを含んでもよい。本発明の組成物中で使用され得るアジュバントには、アルミニウム塩及びカルシウム塩等の組成を含有するミネラル;オイルエマルジョン、例えば水中油型又はスクアレン-水型の乳剤;サポニン製剤;ビロソーム及びウイルス様粒子(VLP);細菌又は微生物の誘導体、例えばリポ多糖及びリポ多糖の無毒性誘導体、例えば3-0-脱アシル化モノホスホリル脂質A(3dMPL);免疫刺激性オリゴヌクレオチド;リポソーム;イミダゾキノロン化合物;及びTLR4アンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない。
定義
用語「含む(comprising)」は、「含む(including)」及び「からなる(consisting)」を包含しており、例えば、Xを「含む(comprising)」組成物は専らXからなっていてもよく、又は例えばX+Y等の、追加的なものを含んでいてもよい。
数値xに関する用語「約(about)」又は「約(approximately)」は、例えば、x+10%を意味する。本明細書におけるすべての数値は、文脈上他の意味を示す場合を除いて、「約(about)」又は「約(approximately)」によって修飾されていると考えることができる。
単語「実質的に」は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まないものであってもよい。必要に応じて、単語「実質的に」を本発明の定義から外してもよい。
本明細書で使用される場合、「バルク」生成物とは、すべてのプロセス段階を完了しているが最終的な医薬品には製剤化されていない生成物のことである。
本明細書で使用される場合、クロマトグラフィーにおける「素通り画分」とは、使用されるクロマトグラフィー条件下ではクロマトグラフィーカラムに結合しないタンパク質を主に含有する画分のことである。
[実施例1]
サイズ調整されていないGBSコンジュゲートの製造
天然の(サイズ調整されていない)GBS CPSのコンジュゲートを、以下の通り製造した。精製莢膜多糖を、ストレプトコッカス・アガラクチア血清型(血清型Ia、Ib、II及びIII)から得た。過ヨウ素酸酸化とその後の還元的アミノ化により、精製GBS CPSを担体タンパク質にコンジュゲートした。担体タンパク質はCRM197であり、GBS血清型Ia莢膜多糖-CRM197(血清型Ia-CRM197)、GBS血清型Ib莢膜多糖-CRM197(血清型Ib-CRM197)、GBS血清型II莢膜多糖-CRM197(血清型II-CRM197)及びGBS血清型III莢膜多糖-CRM197(血清型III-CRM197)のコンジュゲートを得た。
WO2009/010877に記載されているように、GBS CPSとタンパク質担体のコンジュゲートは、ハイドロキシアパタイト(HA)クロマトグラフィーを使用して、遊離担体タンパク質から分離することができる。遊離多糖は結合しない。WO2009/010877には、80μm粒子サイズの、Type I及びType IIのBIO-RADのHA樹脂を使用することが記載されている。Type IのHA樹脂は、タンパク質結合能がより高く、酸性タンパク質に対してより優れた能力を有すると報告されているのに対し、Type IIは、タンパク質結合能はより低いものの、特定のタンパク質の優れた分離能（resolution）を有すると報告されている。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを7.2のpHで実施して糖の安定性を確実にした場合、Type I及びType IIの両方のハイドロキシアパタイト樹脂が、非コンジュゲートCRM197からコンジュゲートCRM197を分離するのに有用であるとWO2009/010877において報告された(より典型的には6.8のpHがハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに対して用いられるが、WO2009/010877において報告されているように、このpHの変化はクロマトグラフィーの効率に影響を及ぼさなかった)。WO2009/010877にはまた、異なるリン酸濃度の使用についても記載されており、pH7.2の平衡化/ローディング後洗浄バッファーを用いた場合、出発物質におけるリン酸濃度が35mM以下で、CRM197は本質的に完全にハイドロキシアパタイトカラムに結合することが報告された。コンジュゲート及び遊離担体タンパク質は、その後に別々に溶出することができる。
WO2009/010877には、以下のパラメータを使用する試験的なプロセスが記載されている。
- カラム体積(CV)=4リットル(L)(許容範囲:>3L)。選択されたカラムは、20cmの直径(対応する高さは約11センチメートルプラス/マイナス2.5cm)を有した。
- カラムリンス及び平衡化:80cm/時間(419ml/分)での、5CVの400mMリン酸ナトリウムpH6.8バッファーに加えて、80cm/hでの、5CVの35mMリン酸ナトリウムpH7.2バッファー。
- カラムローディング及び生成物(コンジュゲート)の回収:生成物をロードし(80cm/h)、次いで平衡化バッファーで洗浄し、0.4CVまで素通り画分を廃棄し、2.2CVまでコンジュゲート生成物を回収し、その後2.9CVまで廃棄する。
- 次いで、カラムに結合した非コンジュゲートCRMを回収するために、2CVの400mMのリン酸ナトリウムバッファー、pH6.8を用いて、カラムを80cm/hで溶出する。
[実施例2]
サイズ調整されたGBS血清型Ia及びIb
GBS血清型Ia及びIbの莢膜多糖のサイズ調整
GBS Ia及びIbの多糖のサイズを約100kDaの平均MWに低減するために、顕微溶液化（microfluidisation）技術を使用した。サイズの低減は、固定形状ホモジナイジングセル(homogenizing cell)(MICROFLUIDICS F20Y-75μm)を備えた高圧ホモジナイザー(AvestinのEMULSIFLEX C50)を使用して行った。多糖のサイズを、システム内の高圧及びホモジナイジングセルの形状に起因する分子間の衝撃によって低減させた。サイズ調整は連続的なプロセスであり、目標サイズに達した場合にプロセスを停止するためのプロセス内試験がそれに続く。
7.25mg/mlの濃度の天然のGBS Ia多糖を、10000から15000psi(ポンド/平方インチ)の間の圧力を使用して、顕微溶液化によりサイズ調整した。サイズ低減後に、サイズ排除-高速液体クロマトグラフィー(SEC-HPLC)を続けて行い、顕微溶液化を停止した。65サイクル後に多糖をMALLSによって分析したところ、サイズ調整されたGBS Ia多糖は約80kDaであることが示された。
天然のGBS Ia多糖をサイズ調整するための、顕微溶液化を用いた更なる試行(7.25mg/mlの糖濃度、10000から15000psiの間の圧力)により、25サイクルのSEC-HPLCによって約100kDaのサイズ調整されたGBS Ia多糖(MALLS分析によって確認した)が得られることを明らかにした。サイズ調整後のシアル酸の完全性(免疫原性にとって重要である)を、核磁気共鳴(NMR)によって実証した。
天然のGBS Ib多糖のサイズを低減する場合には、約100kDaの目標サイズを達成するために23サイクルが必要であった(7.25mg/mlの糖濃度、10000から15000psiの間の圧力)。MALLS分析によって、約105.6kDaのサイズが確認された。サイズ調整後のシアル酸の完全性(免疫原性にとって重要である)を、NMRによって実証した。
サイズ調整されたGBS Ia及びIbのコンジュゲーション及びHA精製
上記の通りに得られたサイズ調整されたGBS Ia多糖(約100kDa)のコンジュゲーションを以下の通りに実施した:サイズ調整された精製多糖を酸化及びそれに続く限外ろ過にかけ、その後にCRM197とのコンジュゲーションを行った。
酸化:酸化のステップを、天然の多糖で使用された条件と同じ条件を使用して行った。天然の多糖で観察された酸化速度と同じ酸化速度が、サイズ調整されたGBS Ia及びIbの多糖に対して観察された(±20%)。
カップリング時間:サイズ調整されたGBS Ia及びIb多糖を使用して、4つの異なるカップリング時間を評価した(24時間、48時間、72時間及び96時間)。
(上記の通りに得られた)サイズ調整されたGBS Ib多糖(約105kDa)の酸化及びコンジュゲーションを、サイズ調整されたGBS Iaに対して使用されたのと同じプロセスを使用して実施した。
結果として得られた混合物(コンジュゲート、非コンジュゲートCRM197、及びサイズ調整された非コンジュゲートGBS Ia又はIb多糖を含有する)をハイドロキシアパタイト(HA)クロマトグラフィー(CHT(商標)セラミックハイドロキシアパタイトtype I、80μmの粒子サイズ、Bio-Rad Laboratories, Inc.)にかけて、遊離多糖及び遊離CRM197担体タンパク質から、多糖-CRM197コンジュゲートを分離した。クロマトグラフィーのステップ(精製)は、以下の通りに実施した。
ロード 0.6mg CRM/ml 樹脂;
平衡化:2mM Na/Na2PO4、pH7.2、550mM NaCl、4CV;
ロード/リンス:2mM Na/Na2PO4、pH7.2、550mM NaCl、5CV;
溶出1:10mM Na/Na2PO4、pH7.2、4CV;
溶出2:35mM Na/Na2PO4、pH7.2、4CV;
プール(コンジュゲート)=溶出1の0.5CVから溶出2の3.75CVまで。
ストリッピング(Stripping)(非コンジュゲート担体タンパク質の回収):400mMNa/Na2PO4、pH7.2、3CV。
遊離多糖はHAには結合せず、クロマトグラフィーの素通り画分において除去された。コンジュゲートは、記載したように、リン酸バッファーを用いた溶出によって回収した。次いで、HAクロマトグラフィーから得られたコンジュゲートをクエンチング反応及びそれに続くろ過にかけ、精製多糖コンジュゲートを得た。
サイズ調整されたGBS Ia及びサイズ調整されたGBS Ibを使用して製造したコンジュゲートの特性評価
上記のように、サイズ調整されたGBS Ia(約100kDaのMW)を使用してCPS-CRM197コンジュゲートを4ロット製造した。表1に示すように、各ロットに使用されたカップリング時間は異なった。次いで、それらのロットを上記のようにハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーで処理し、最終生成物を得た。各ロットについて最終生成物中の遊離多糖は(重量での総PSの)<1%であり、遊離の(カップリングしていない(uncoupled))サイズ調整されたGBS Ia多糖は、ハイドロキシアパタイト精製の間に除去されることが示された。サイズ調整されたGBS Ib多糖(約105kDaのmw)を使用して、同様の結果が得られた。
Figure 2022532142000004
[実施例3]
クエンチング及びろ過を行わないサイズ調整されたGBS Iaのコンジュゲーションプロセス
サイズ調整されたGBS Iaのコンジュゲーション:酸化のステップを、天然の多糖で使用した条件と同じ条件を使用して行った。3つの異なる酸化バッチを使用し、1バッチあたり8回の実行を行った。コンジュゲーション温度及び反応体積を、それぞれ22℃及び4mLに固定した。コンジュゲーション反応条件は:CRM197が9mg/ml、GBS多糖が11mg/ml、NaCNBH3が9mg/ml、48時間の反応であった。本実施例には、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー後のクエンチング及びろ過のステップは含まれなかった。
24h、48h、72h及び96時間において、コンジュゲーション反応の実行ごとにサンプリングを行い、モニターした。
各バッチについて、GBS Iaの天然のPSの設定値(PS:6.35mg/ml、CRM197:8.47mg/ml、NaCNBH3:6.35mg/ml)での追加の実行を組み入れた。
Figure 2022532142000005
 次いで、上記の結果を確認するために、HAクロマトグラフィー及びろ過を含むプロセスにおいて、選択されたサイズ調整されたパラメータを評価した。
Figure 2022532142000006
Figure 2022532142000007
 サイズ調整されたGBS Ia多糖を使用した本実施例により、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー後に、(天然のGBS Ia多糖を使用したプロセスと比べて)遊離多糖の含有量が減少した生成物が得られた。予想された通り、サイズ調整されたGBS Ia多糖を使用して調製したGBS Ia-CRM197コンジュゲートのサイズは、(天然のGBS Ia多糖を使用して調製したGBS Ia-CRM197コンジュゲートと比べて)より小さかったが、天然のGBS血清型III-CRM197コンジュゲートのサイズには類似していた。グリコシル化度はより低かった。
[実施例4]
サイズ調整されたGBS血清型Ib多糖の使用
GBS Ibについて、GBS Iaについての上記と同様の一連の実験を行った。以下のコンジュゲーションパラメータを使用して、サイズ調整されたロットを製造した:CRM197が8mg/ml、PSが10mg/ml、NaCNBH3が9mg/ml及び48時間の反応
Figure 2022532142000008
[実施例5]
サイズ調整されたGBS血清型II多糖を使用することにより、コンジュゲートの収量が増加する
本発明者らは、多糖-タンパク質コンジュゲートの製造における、サイズ調整されたGBS血清型II多糖の使用を検討した。天然のGBS II多糖は、約419kDaの平均分子量を有する。天然のGBS II多糖のサイズを低減するために、上記の顕微溶液化技術を使用した。8000psiでの6サイクルにより、159kDaの平均分子量を有するGBS血清型II莢膜多糖を製造した。GBS PSは液体形態であり、PS濃度はわずかに異なり得る。ここで、GBS IIの最初の顕微溶液化を5.42mg/mlのPSを用いて行い、次の顕微溶液化を5.47mg/mlのPS濃度を有するGBS IIを使用して行った。
酸化を、天然のGBS血清型II多糖と同じ条件を使用して実施した。サイズ調整されたGBS IIの酸化レベルは、天然のGBS II PSで観察された酸化レベルに近かった(それぞれ、18.2%対19.5～20.1%)。
天然のGBS II PSに対する既存のプロセス条件に従って、コンジュゲーション及び精製を実施した。サイズ調整されたGBS II PSを使用した場合のCRM197変換率(コンジュゲートされたCRM197のパーセンテージ)は、天然のGBS II PSを用いて得られたものよりもわずかに低いようであった(52.5%対58～60%)。サイズ調整されたGBS血清型II PSの場合は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー前の遊離多糖含有量は23.6%と推定された。これと比較して天然のGBS血清型II PSでは6～7%であった。
天然の多糖ではなくサイズ調整されたGBS血清型II多糖を使用した場合には、GBS血清型II PSの収量は40%から53%に増加した。更に収量を改善するために、コンジュゲートされたPSの%を増加させるためのコンジュゲーション条件を評価した。
コンジュゲーションステップを改善する(ハイドロキシアパタイト精製ステップ以前の、コンジュゲートされたサイズ調整GBS II PSの%を増加させる)ために、以下のコンジュゲーション反応条件を使用して、700mgのPSスケールで3ロットを製造した:CRM197が6mg/ml、多糖が11mg/ml、NaCNBH3が9mg/ml、22℃での48時間の反応。
SEC-UPLCモニタリングによって評価されたように、コンジュゲーションにおいて3ロットは同じ挙動を示した。
精製においては、HAクロマトグラフィーカラムからの素通り画分中に、サイズ調整されたGBS II-CRM197コンジュゲートの著しいロスは観察されなかった。
Figure 2022532142000009
Figure 2022532142000010
 (1)逆相(RP)サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、
(2)パルスアンペロメトリック検出(PAD)を用いた高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)、
(3)マイクロビシンコニン酸(μBCA)アッセイ。
[実施例6]
マウスにおけるGBS Ia-CRM197抗体反応
天然のGBS Ia PS又は(上記の通りに製造された)サイズ調整されたGBS Ia PSのいずれかを使用し、かつ表8に記載の2つのコンジュゲーションプロセスのうちの1つを使用して製造されたGBS Ia-CRM197コンジュゲートを使用して、マウス試験を実施した。
Figure 2022532142000011
 「既存の」コンジュゲーションプロセス:PS濃度=6.35mg/ml、初期のPS/CRM比率=0.75/1 w/w、NaBH3CN濃度=6.35mg/ml。
「改善された」コンジュゲーションプロセス:PS濃度=11mg/ml、初期のPS/CRM比率=1.22/1 w/w、NaBH3CN濃度=9mg/ml。
表8に規定した試験を3回繰り返した(1群あたり32マウス、1群あたり16マウス、及び1群あたり16マウスを用いて、合計1群あたり64マウスに対して)。全群において、5週齢の雌のCD1マウスを使用した。コンジュゲートされた多糖を水酸化アルミニウム製剤2mg/ml、1μgの免疫化PS投与量で用意し、腹腔内経路(IP)を介して、1、21及び35日目に投与した。0.6の標準偏差で、少なくとも80%の検定力でIgG力価における2から3倍の差を評価するために、64マウスを1群あたりのサンプルサイズとして決定した。
3回目の免疫化の2週間後に各マウスから血清を回収し、モノプレックス(monoplex)PS Ia-ビオチン(相対単位/ml又はRU/ml)におけるLuminexを使用してIgG力価を試験した。ストレプトアビジンのビーズを1μg/mlのGBS PS Ia-ビオチンとカップリングさせ、そのビーズセットを個々のマウスの血清とインキュベートした(1時間)。解析により、5群(100kDaのサイズ調整されたGBS Ia PS、上記の改善されたコンジュゲーションプロセスを使用)が試験したマウスにおいて有意に高い抗体反応を誘発する(1.3から5.2倍の間の差)ことが確認された。3群及び5群の両方が、他の群に比べて高い力価を示した。図4を参照のこと。図4には、64個の血清/群におけるすべての結果が示されている。3種の独立した実験間で、群内での差は検出されなかった。多重比較に対して調整されたANOVAのP値>0.1。
[実施例7]
マウスにおける、GBS Ib-CRM197抗体反応
前臨床マウス試験において、GBS Ib-CRM197コンジュゲートも評価した。5週齢の雌のCD1マウス(1群あたり64マウス)を以下で免疫化した。
Figure 2022532142000012
コンジュゲートされた多糖を水酸化アルミニウム(2mg/ml)製剤、1μgの免疫化PS投与量で用意し、腹腔内経路(IP)を介して、1、21及び35日目に投与した。3回目の免疫化の2週間後に各マウスから血清を回収し、モノプレックスPS Ib-ビオチンアッセイにおけるLuminexによって、IgG力価を試験した。各群からプールした血清を使用して、抗体の機能性を、オプソニン食作用性殺傷アッセイ(OPKA)により試験した。
図5は、各群の個々の血清由来の総IgG力価を示す図であり、相対単位(RU)及び幾何平均力価±95%信頼区間(それぞれドット及びバーで示される)として表される。3つのGBS Ib群間で、IgG反応における有意な差は見出されなかった。
50%のGBS殺傷をもたらす血清の希釈度の逆数として表されるOPKAの力価は、3つのGBS Ib群間で大きな差を示さなかった(データは示さない)。
[実施例8]
マウスにおける、GBS II-CRM197抗体反応
GBS II-CRM197の3つの異なる調製物(1μgのCPS、2mg/mlミョウバンでの製剤、200ulが1、21及び35日目にIP経路により投与される)。5週齢の雌のCD1マウス、1製剤あたり合計64マウス。3回目の免疫化の2週間後に血清を免疫化マウスから回収し、LuminexアッセイによるIgG力価の試験、及びOPKA力価による抗体機能活性の試験を行った。
表10～表12に示されるように、3つの試験を行った。
Figure 2022532142000013
Figure 2022532142000014
Figure 2022532142000015
3つのGBS II試験のそれぞれからの結果、及び統合された試験の全体的な結果:
3種の試験のそれぞれにおいて、対照マウスと比較して、GBS II-CRM197コンジュゲートで免疫化したマウスの全群がワクチン接種に反応した。探索的統計解析(ANOVAにより多重比較のために調整されたP値)においては、試験1において、他の2つの調製物(EB26及び003)と比べて有意に低くより分散型のIgG反応がロット002に対して観察されたが、試験2及び試験3においては、3つ(EB26、002及び003)の間でIgG反応における有意な差は観察されなかった。全体として、3つの試験間で一貫性のあるデータが観察された。従って、主な目的として、図6に示されるように、全3試験(合計64マウスを含む)からのデータを最終的な解析において統合した。探索的統計解析(ANOVAにより多重比較のために調整されたP値)により、調製物EB26と002の間に、IgG反応における統計学的に有意な差が示された。
図6:IgG反応-単一マウスのLuminexデータ(RU/ml)をドットとして表した。バーは幾何平均力価±95%信頼区間(CI)を表す。グラフ上部のバーにより、得られた幾何平均IgG力価(GEOMEAN)を報告する。
50%のGBS殺傷をもたらす血清希釈度の逆数として表されるOPKA力価は、3つの試験において、GBS II群間で大きな差を示さなかった(データは示さない)が、Luminexによって測定されたIgG反応と一致して、試験1においては5群及び6群(002)で他のコンジュゲート調製物に比べてより低いOPKA力価が示された。
参考文献
Figure 2022532142000016
Figure 2022532142000017

Claims (20)

  1. B群連鎖球菌(GBS)莢膜多糖及び担体タンパク質のコンジュゲートを製造する方法であって、
    (a)サイズ調整されたGBS莢膜多糖分子を用意すること、
    (b)前記サイズ調整されたGBS莢膜多糖分子及び担体タンパク質分子でコンジュゲーション反応を実施して、多糖-タンパク質コンジュゲート及び遊離多糖を含む混合物を提供すること、
    (c)前記混合物をハイドロキシアパタイトに接触させることによるクロマトグラフィーのステップを、前記コンジュゲートがハイドロキシアパタイトに結合し、遊離多糖がハイドロキシアパタイトに結合しない条件下で実施すること、
    (d)混合物から遊離多糖を除去すること、並びに
    (e)前記ハイドロキシアパタイトからコンジュゲートを回収すること
    を含む方法。
  2. サイズ調整されたGBS莢膜多糖が、約50キロダルトン(kDa)から約200kDaの間の平均分子量を有する、請求項1に記載の方法。
  3. サイズ調整された莢膜多糖が、約100kDaの平均分子量を有する、請求項1に記載の方法。
  4. 前記B群連鎖球菌(GBS)莢膜多糖が、GBS血清型Ia、血清型Ib、及び血清型IIから選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記GBS莢膜多糖が、約100kDaの平均分子量を有するサイズ調製されたGBS血清型Ia莢膜多糖、約100kDaの平均分子量を有するサイズ調製されたGBS血清型Ib莢膜多糖、及び約160kDaの平均分子量を有するサイズ調製されたGBS血清型II莢膜多糖から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記GBS莢膜多糖が、少なくとも×2から最大×3までの倍率によってサイズ調整されたGBS血清型Ia莢膜多糖、少なくとも×2から最大×3までの倍率によってサイズ調整されたGBS血清型Ib莢膜多糖、及び少なくとも×2から最大×5までの倍率によってサイズ調整されたGBS血清型II莢膜多糖から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 混合物が更に遊離担体タンパク質を含み、前記クロマトグラフィーのステップが、前記コンジュゲート及び前記遊離担体タンパク質がハイドロキシアパタイトに結合する条件下で実施される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 担体タンパク質が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、GBS線毛タンパク質、シュードモナスの外毒素A(EPA)、及びCRM197から選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記担体タンパク質がCRM197である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 莢膜多糖がグリコシル化されている、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 莢膜多糖がリンカーによって担体タンパク質にコンジュゲートされている、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記クロマトグラフィーのステップが約6.5から約7.5までのpHで実施される、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記クロマトグラフィーのステップが約pH7.2で実施される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記コンジュゲートの回収が、約5mMから約50mMの間、約5mMから約40mMの間、約10mMから約40mMの間、及び約10mMから約35mMの間から選択されるリン酸濃度を有する1種以上のバッファーを使用する溶出による、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ハイドロキシアパタイトが粒子形態である、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記ハイドロキシアパタイトが、約20μmから約80μmの間、約20μm、約40μm、又は約80μmの直径を有する粒子形態である、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記回収された莢膜多糖コンジュゲートを薬学的に許容される希釈剤又は担体と混合し、それによって、医薬組成物を調製することを更に含む、請求項1に記載の方法。
  18. 組成物をアジュバントと混合することを更に含む、請求項17に記載の方法。
  19. (i)治療において、(ii)免疫反応を生じさせるために、又は(iii)ワクチンとして、使用するための、請求項17に記載の方法によって調製された医薬組成物。
  20. (i)免疫反応を生じさせるための、又は(ii)細菌感染を治療するための薬物の製造における、請求項17に記載の方法によって調製された医薬組成物の使用。
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