ES2942133T3 - Purificación de polisacárido capsular estreptocócico - Google Patents

Abstract

Un método de purificación para el polisacárido capsular de GBS tipo II en el que el polisacárido capsular se filtra usando una membrana con un corte de menos de 30 kDa. Este método proporciona un mayor rendimiento que los protocolos anteriores. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Purificación de polisacárido capsular estreptocócico

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente europea 14199441.8 (presentada el 19 de diciembre de 2014).

CAMPO TÉCNICO

Esta invención está en el campo de la purificación de polisacáridos capsulares bacterianos, particularmente aquellos de Streptococcus agalactiae, y particularmente para su uso en la preparación de vacunas.

TÉCNICA ANTERIOR

Los polisacáridos capsulares son inmunógenos importantes encontrados sobre la superficie de bacterias implicadas en diversas enfermedades bacterianas. Esta característica ha conducido a que sean un componente importante en el diseño de vacunas. Han demostrado ser útiles a la hora de provocar respuestas inmunitarias especialmente cuando están asociadas a proteínas portadoras (ref. 1).

La referencia 2 describe un método para preparar polisacáridos capsulares, particularmente de Streptococcus agalactiae (también denominado estreptococo del grupo B de Lancefield, o GBS). El método comprende: (a) proporcionar un aislado bruto que contiene el polisacárido capsular; (b) eliminar un precipitado de alcohol formado poniendo en contacto el aislado bruto con una disolución de alcohol; (c) someter a ultrafiltración usando una membrana de celulosa que tiene un límite de aproximadamente 30 kDa para eliminar componentes de menor peso molecular al tiempo que retiene el polisacárido capsular; (d) eliminar contaminantes de proteína con un filtro adherente de proteína; (e) N-acetilar de nuevo el polisacárido capsular purificado; y (f) someter a ultrafiltración usando una membrana de celulosa que tiene un límite de aproximadamente 30 kDa de nuevo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

El/Los inventor(es) purificó/purificaron polisacárido capsular de GBS de tipo II según el método de la ref. 2 y encontró/encontraron que el método solo proporcionaba un rendimiento <50%. Por tanto, hay una necesidad de un método de purificación mejorado que produzca un rendimiento mayor de polisacárido capsular, en particular para polisacárido capsular de ^g B^s de tipo II.

La invención se basa en el hallazgo de que una membrana con un límite de 10 kDa en comparación con 30 kDa en la etapa (f) de la ref. 2 proporciona un rendimiento mayor, por ejemplo de aproximadamente el 90%. Sin querer restringirse a la teoría, el aumento en el rendimiento parece estar provocado por una conformación más lineal del polisacárido capsular de GBS de tipo II en comparación con los otros polisacáridos capsulares de GBS (por ejemplo de los tipos Ia, Ib, III y V). La conformación más lineal da como resultado un impedimento estérico reducido y un radio hidrodinámico menor, lo que significa que el polisacárido es propenso a pérdida a través de una membrana con un límite de peso molecular mayor.

Los inventores han encontrado también que pueden obtenerse buenos rendimientos de polisacárido capsular de GBS de tipo II con un método que no requiere una etapa de cromatografía y, en particular, no requiere cromatografía de interacción hidrófoba (HIC).

Por tanto, la invención proporciona un método para purificar un polisacárido capsular de GBS de tipo II, que comprende una etapa de filtración que usa una membrana con un límite de aproximadamente 10 kDa.

La invención proporciona también, en un método para purificar un polisacárido capsular de GBS de tipo II, la mejora que consiste en el uso de una membrana con un límite de peso molecular de aproximadamente 10 kDa para una etapa de filtración, en lugar de una membrana con un límite de peso molecular de aproximadamente 30 kDa.

La etapa de filtración se discute en más detalle más adelante.

Normalmente se realizan una o más etapas adicionales antes de la etapa de filtración. Las etapas adecuadas incluyen: (a) proporcionar un aislado bruto que contiene el polisacárido capsular; (b) eliminar un precipitado de alcohol formado poniendo en contacto el aislado bruto con una disolución de alcohol; y (c) eliminar contaminantes de proteína con un filtro adherente de proteína.

En determinadas realizaciones pueden realizarse una o más etapas adicionales después de la etapa de filtración. Por ejemplo, las etapas adicionales pueden ser: (e) hacer precipitar el polisacárido capsular purificado; (f) conjugar el polisacárido capsular con una proteína portadora, por ejemplo toxoide de difteria, toxoide de tétano o CRM197; (g) formular una vacuna con el polisacárido capsular como componente; y/o (h) mezclar con uno o más polisacáridos capsulares de un serotipo de GBS seleccionado del grupo que consiste en Ia, Ib, III, IV, V, VI, VII y VIII, particularmente en el que estos polisacáridos capsulares se conjugan con proteína(s) portadora(s), por ejemplo toxoide de difteria, toxoide de tétano o CRM197.

El método puede comprender más de una etapa de filtración. En cuyo caso, es normalmente la etapa de filtración final que usa una membrana con un límite de aproximadamente 10 kDa.

La solicitud también da a conocer una composición que comprende un polisacárido capsular de GBS de tipo II, que puede obtenerse mediante el método de purificación de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra la estructura molecular de polisacárido capsular de serotipo específico de GBS de tipo II.

La figura 2 muestra un método de purificación para polisacárido capsular de GBS de tipo II.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES PREFERIDAS

El sacárido capsular

La enfermedad relacionada con GBS surge principalmente de los serotipos Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII y VIII, estando provocado más del 90% por cinco serotipos: Ia, Ib, II, III y V. El polisacárido capsular de S. agalactiae está ligado covalentemente a residuos GlcNAc en la estructura principal de peptidoglicano de la bacteria, y es distinto del antígeno del grupo B, que es un sacárido independiente que está unido a residuos MurNAc en la misma estructura principal de peptidoglicano ([3]). Los polisacáridos capsulares de diferentes serotipos están relacionados químicamente, pero son antigénicamente muy diferentes. Todos los polisacáridos capsulares de GBS comparten el siguiente núcleo de trisacárido:

(3-D-Glc/?NAc( 1 —>3)P-D-Gal/?( 1 -^4)P-D-Glc/?

Los diversos serotipos de GBS difieren en el modo en el que está modificado su núcleo.

La invención usa GBS que pertenecen al serotipo II. Preferiblemente, la invención usa cualquier cepa de GBS de tipo II que exprese una cantidad razonable de polisacárido de cápsula para completar la purificación, por ejemplo 18RS21 o DK21.

Como se muestra en la figura 1, el sacárido capsular de GBS de tipo II incluye: (a) un residuo ácido W-acetilneuramínico (NeuNAc) terminal (denominado comúnmente ácido siálico), que en todos los casos está ligado 2 ^ 3 a un residuo galactosa; y (b) un residuo W-acetil-glucosamina (GlcNAc) dentro del núcleo de trisacárido. El núcleo de trisacárido del polisacárido capsular de GBS de tipo II contiene tres residuos galactosa por unidad de repetición.

Los sacáridos purificados según la invención estarán generalmente en su forma nativa, pero pueden estar modificados. Por ejemplo, el sacárido puede ser más corto que el sacárido capsular nativo, o puede estar modificado químicamente. Por ejemplo, puede estar modificado para producir polisacáridos capsulares no naturales o polisacáridos heterólogos o para aumentar el rendimiento.

Por tanto, el sacárido usado según la invención puede ser un polisacárido capsular sustancialmente de longitud completa, tal como se encuentra en la naturaleza, o puede ser más corto que la longitud natural. Los polisacáridos de longitud completa pueden despolimerizarse para dar fragmentos más cortes para su uso con la invención por ejemplo mediante hidrólisis en ácido suave, mediante calentamiento, mediante cromatografía de exclusión por tamaños, etc. Se ha notificado que la longitud de cadena afecta a la inmunogenicidad de sacáridos de GBS en conejos [4].

El sacárido puede estar modificado químicamente en relación con el sacárido capsular tal como se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, el sacárido puede ser des-O-acetilado (parcial o completamente), des-N-acetilado (parcial o completamente), N-propionado (parcial o completamente), etc. Dependiendo del sacárido particular, la desacetilación puede afectar o no a la inmunogenicidad, por ejemplo la vacuna NeisVac-C™ usa un sacárido des-O-acetilado, mientras que Menjugate™ está acetilada, pero ambas vacunas son efectivas. La relevancia de la O-acetilación sobre los sacáridos de GBS en diversos serotipos se discute en la referencia 5, y se prefiere para conservar la O-acetilación de ácido siálico residuos en las posiciones 7, 8 y/o 9 antes de, durante y después de la purificación por ejemplo usando formaldehído para la extracción del sacárido y/o la inactivación bacteriana, mediante protección/desprotección, mediante reacetilación, etc. El efecto de la desacetilación, etc. puede evaluarse mediante ensayos rutinarios.

Método de purificación

El método de purificación contiene normalmente múltiples etapas, tal como se explica más adelante. Las etapas tienen lugar normalmente en el orden descrito más adelante, aunque otros órdenes también pueden ser efectivos.

Material de partida

Los métodos para preparar sacáridos capsulares de bacterias se conocen ampliamente en la técnica, por ejemplo, véanse las referencias 6, 7, 8, etc. Para GBS, pueden usarse los siguientes métodos (véase también la ref. 9).

El método de purificación de la invención puede empezar con un aislado bruto que contiene el polisacárido capsular de GBS de tipo II. El sacárido capsular está en forma acuosa, normalmente como suspensión que comprende proteínas, ácidos nucleicos y polisacárido capsular estreptocócicos.

Generalmente, una pequeña cantidad de polisacárido capsular se libera al medio de cultivo durante el crecimiento bacteriano, y así el material de partida para la precipitación alcohólica de proteínas y/o ácidos nucleicos contaminantes puede ser por tanto el sobrenadante de un cultivo bacteriano centrifugado. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el polisacárido puede aislarse de bacterias de Streptococcus agalactiae que comprenden mutaciones en cpsA (número de registro uniprot Q9RPC7) y/o cpsD (número de registro uniprot K0JNC2) y secretan grandes cantidades de polisacárido capsular al medio de cultivo. Mutantes y mutaciones adecuados se dan a conocer en la solicitud de patente internacional n.° PCT/EP2015/059773 (publicada como WO2015/169774), incorporada al presente documento mediante referencia. Más normalmente, sin embargo, el material de partida se preparará tratando las propias bacterias encapsuladas (o material que contiene el peptidoglicano bacteriano), de modo que se libere el sacárido capsular.

El polisacárido capsular puede liberarse de bacterias mediante diversos métodos, incluyendo tratamiento químico, físico o enzimático. Por tanto, una preparación acuosa de polisacárido puede tratarse antes de la reacción de precipitación de proteína/ácido nucleico inicial.

Un tratamiento químico típico es la extracción con base [10] (por ejemplo usando hidróxido de sodio), que puede escindir el enlace fosfodiéster entre el sacárido capsular y la estructura principal de peptidoglicano. La extracción con base es ventajosa porque inactiva las bacterias al mismo tiempo que libera el polisacárido capsular. Además, el tratamiento con base libera el polisacárido intacto y provoca una escisión extensa del antígeno de grupo B debido a sus múltiples enlaces fosfodiéster [3], facilitando la separación posterior de los antígenos de sacáridos capsulares y específicos de grupo. Por tanto, el tratamiento con hidróxido de sodio es un método preferido para liberar el polisacárido capsular. Los inventores encontraron que un tratamiento con hidróxido de sodio que usa NaOH 0,8 M a 37°C durante 36 horas es particularmente útil con el método de la invención. Sin embargo, como el tratamiento con hidróxido des-N-acetila el sacárido capsular, puede ser útil una re-N-acetilación posterior.

Un tratamiento enzimático típico implica el uso tanto de mutanolisina como de p-N-acetilglucosaminidasa [3]. Estas actúan sobre el peptidoglicano de GBS para liberar el sacárido capsular para su uso con la invención, pero también conducen a la liberación del antígeno carbohidrato específico de grupo. Un tratamiento enzimático alternativo implica el tratamiento con una fosfodiesterasa de tipo II (PDE2). Las enzimas PDE2 pueden escindir los mismos fosfatos que el hidróxido de sodio (véase anteriormente) y pueden liberar el sacárido capsular sin escindir el antígeno carbohidrato específico de grupo y sin des-N-acetilar el sacárido capsular, simplificando de ese modo las etapas posteriores. Por tanto, las enzimas PDE2 son una opción preferida para preparar sacáridos capsulares de GBS para su uso en el método de la invención.

Por tanto, un material de partida preferido para el método de la invención es polisacárido capsular des-N-acetilado, que puede obtenerse mediante la extracción con base tal como se describe en la referencia 10. Por tanto, otro material de partida preferido es el producto del tratamiento con PDE2 de GBS. Tales materiales pueden someterse a concentración (por ejemplo ultrafiltración) antes de la precipitación mediante el método de la invención.

Precipitación alcohólica e intercambio catiónico

El sacárido capsular de GBS de tipo II obtenido tras el cultivo será generalmente impuro y estará contaminado con ácidos nucleicos y proteínas bacterianos. El método de la invención puede utilizar precipitación alcohólica. Si es necesario (por ejemplo tras la extracción con base), los materiales se neutralizarán habitualmente antes de la precipitación.

El alcohol usado para hacer precipitar ácidos nucleicos y/o proteínas contaminantes es preferiblemente un alcohol inferior, tal como metanol, etanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metilpropan-1-ol, 2-metil-propan-2-ol, dioles, etc. La selección de un alcohol apropiado puede someterse a prueba empíricamente, sin una carga excesiva, pero se prefieren alcoholes tales como etanol e isopropanol (propan-2-ol), en vez de alcoholes tales como fenol.

El alcohol se añade preferiblemente a la suspensión de polisacárido para dar una concentración de alcohol final de entre el 10% y el 50% (por ejemplo alrededor del 30%). Las concentraciones más útiles son aquellas que consiguen una precipitación adecuada de contaminantes sin hacer precipitar también el polisacárido. La concentración de alcohol final óptima puede depender de la cepa de GBS de la que se obtiene el polisacárido, y puede determinarse mediante experimentos rutinarios sin una carga excesiva. Se ha observado precipitación de polisacáridos a concentraciones de etanol >50%.

En determinadas realizaciones, la disolución de alcohol se añade hasta una concentración suficiente para hacer precipitar contaminantes de ácido nucleico, pero no el polisacárido capsular. En realizaciones preferidas, el alcohol es etanol añadido preferiblemente hasta una concentración de entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 50% de etanol, más preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente el 30% de etanol. Los inventores encontraron que una etapa de precipitación alcohólica que implica añadir etanol hasta una concentración de entre el 30% de etanol es particularmente útil con el método de la invención.

La disolución de alcohol puede incluir opcionalmente un catión, preferiblemente un catión metálico, más preferiblemente un catión divalente, lo más preferiblemente calcio.

El alcohol puede añadirse en forma pura o puede añadirse en una forma diluida con un disolvente miscible (por ejemplo agua). Mezclas de disolventes preferidas son mezclas de etanol:agua, con una relación preferida de entre alrededor de 70:30 y alrededor de 95:5 (por ejemplo 75:25, 80:20, 85:15, 90:10).

El sacárido se trata también con un catión metálico acuoso. Se prefieren los cationes metálicos monovalentes y divalentes, y se prefieren particularmente los cationes divalentes, tal como Mg++, Mn++, Ca++, etc., ya que son más eficientes en la formación de complejos. Los iones calcio son particularmente útiles, y así la mezcla de alcohol incluye preferiblemente iones calcio solubles. Estos pueden añadirse a una mezcla de sacárido/alcohol en forma de sales de calcio, ya sea añadidas como un sólido o en una forma acuosa. Los iones calcio se proporcionan preferiblemente mediante el uso de cloruro de calcio.

Los iones calcio están presentes preferiblemente a una concentración final de entre 10 y 500 mM, por ejemplo aproximadamente 0,1 M. La concentración de Ca++ final óptima puede depender del serotipo de GBS del que se obtenga el polisacárido, y puede determinarse mediante experimentos rutinarios sin una carga excesiva.

El alcohol y el catión desempeñan papeles diferentes (el alcohol se usa para hacer precipitar contaminantes, mientras que el catión estabiliza y compleja el sacárido en forma soluble), pero producen un efecto combinado. Aunque el propósito es preparar una mezcla del sacárido, el alcohol y el catión, no es necesario mezclar estos tres componentes entre sí simultáneamente. Por tanto, el alcohol y el catión pueden usarse secuencial o simultáneamente. Se prefiere el tratamiento secuencial y un método particularmente preferido implica la adición del catión al sacárido seguida de la adición del alcohol a la mezcla de catión/sacárido, aunque el alcohol puede usarse antes del catión si se desea.

Después de la precipitación alcohólica de proteínas y/o ácidos nucleicos contaminantes, el polisacárido capsular de GBS se deja en disolución. El material precipitado puede separarse del polisacárido mediante cualquier medio adecuado, tal como mediante centrifugación. El sobrenadante puede someterse a microfiltración, y en particular a filtración de extremo muerto (filtración perpendicular) con el fin de eliminar partículas que puedan obstruir los filtros en etapas posteriores (por ejemplo partículas precipitadas con un diámetro mayor de 0,22 gm). Como una alternativa a la filtración de extremo muerto, puede usarse microfiltración tangencial.

Etapa de filtración

La invención implica una etapa de filtración que usa una membrana con un límite de aproximadamente 10 kDa. La membrana de filtración permite el paso de productos de hidrólisis, al tiempo que retiene el polisacárido capsular.

La invención puede usar más de una etapa de filtración. Por ejemplo, el método puede comprender: (i) una o más (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, etc.) etapas de filtración después de la etapa de precipitación alcohólica e intercambio catiónico descrita anteriormente y antes de la filtración con un filtro adherente de proteína descrita más adelante, y (ii) una etapa de filtración después de la filtración con un filtro adherente de proteína, siendo la etapa de filtración en (ii) la que usa una membrana con un límite de menos de aproximadamente 30 kDa. Alternativamente, todas las etapas de filtración usan una membrana con un límite de menos de aproximadamente 30 kDa, particularmente <10 kDa.

En al menos una etapa de filtración en la invención (normalmente la etapa de filtración final, por ejemplo en la etapa (ii) anterior), la membrana de la etapa de filtración tiene un límite de menos de aproximadamente 30 kDa (por ejemplo <25 kDa, <20 kDa, <15 kDa o <10 kDa). En las otras etapas de filtración (por ejemplo en la etapa (i) anterior), puede ser útil un límite en el intervalo de aproximadamente 10 kDa-30 kDa. Pueden usarse tamaños de límite menores, ya que los fragmentos de hidrólisis del antígeno específico de grupo son generalmente de alrededor de 1kDa (sacáridos 5-méricos, 8-méricos y 11-méricos), pero el límite superior permite ventajosamente la eliminación de otros contaminantes sin conducir a pérdida del sacárido capsular.

La invención es un método que comprende más de una etapa de filtración, y la etapa de filtración que usa una membrana con un límite de aproximadamente 10 kDa es la etapa de filtración final. El método comprende más de dos etapas de filtración, y la etapa de filtración que usa una membrana con un límite de aproximadamente 10 kDa es la etapa de filtración final. En particular, la etapa de filtración final usa una membrana con un límite de aproximadamente 10 kDa. En particular, el método puede comprender: (i) una etapa de filtración que usa una membrana con un límite de menos de aproximadamente 30 kDa; (ii) una etapa de filtración adicional que usa una membrana con un límite de menos de aproximadamente 30 kDa; y (iii) una etapa de filtración adicional que usa una membrana con un límite de aproximadamente 10 kDa.

En particular, la invención es un método que comprende todas las etapas siguientes: (i) una etapa de filtración que usa una membrana de <0,65 pm; (ii) una etapa de filtración que usa una membrana con un límite de menos de aproximadamente 30 kDa; (iii) una etapa de filtración que usa una membrana de 0,45-0,22 pm; (iv) una etapa de filtración que usa una membrana con un límite de menos de aproximadamente 30 kDa; (v) una etapa de filtración que usa un filtro adherente de proteína; (vi) una etapa de filtración que usa una membrana con un límite de aproximadamente 10 kDa; (vii) una etapa de filtración que usa un filtro de jeringa desechable de 0,22 pm.

La etapa de filtración puede ser una etapa de ultrafiltración. La ultrafiltración es un proceso de separación mediante el que se elimina disolvente de una disolución (incluyendo una disolución coloidal) o una suspensión forzándola a fluir a través de una membrana mediante la aplicación de una presión hidráulica. Los componentes en la disolución que son significativamente mayores que los poros en la membrana no pueden pasar a través de la membrana. La ultrafiltración es preferiblemente ultrafiltración de flujo cruzado o de flujo tangencial. En la ultrafiltración de flujo tangencial, la disolución fluye sustancialmente en paralelo a la superficie de la membrana, en lugar de fluir en perpendicular a la superficie como en la filtración ordinaria. La diafiltración de flujo tangencial es típica.

La etapa de ultrafiltración da como resultado preferiblemente diafiltración de la disolución. En la diafiltración, el disolvente y/o los microsolutos (por ejemplo sales) que se eliminan durante la ultrafiltración se reemplazan por nuevo disolvente y microsolutos. En general, la eliminación y el reemplazo se producen a la misma velocidad y por tanto el volumen de la disolución se mantiene constante. Por tanto, el efecto global del proceso es el reemplazo del disolvente/microsolutos originales por nuevo disolvente/microsolutos. El nuevo disolvente/microsolutos pueden ser cualquier tampón adecuado, por ejemplo un tampón Tris, un tampón NaPi o un tampón Na2CO3.

Normalmente, cada etapa de diafiltración reemplaza el tampón por un tampón diferente. Por ejemplo, cuando el método de la invención implica usar dos o más etapas de diafiltración, por ejemplo (i) una o más (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, etc.) etapas de diafiltración después de la etapa de precipitación alcohólica e intercambio catiónico descrita anteriormente y antes de la filtración con un filtro adherente de proteína descrita más adelante, y (ii) una etapa de diafiltración después de la filtración con un filtro adherente de proteína, la(s) etapa(s) de diafiltración en (1) reemplaza(n) el tampón (por ejemplo un tampón Tris) por un tampón diferente (por ejemplo un tampón NaPi), y la etapa de diafiltración en (ii) reemplaza el tampón (por ejemplo un tampón NaPi) por otro tampón (por ejemplo tampón KPi). Preferiblemente, la(s) etapa(s) de diafiltración en (i) usa(n) una membrana con un límite de aproximadamente 30 kDa, y la etapa de diafiltración en (ii) usa una membrana con un límite de menos de aproximadamente 30 kDa (por ejemplo <25 kDa, <20 kDa, <15 kDa o <10 kDa).

En algunas realizaciones, la etapa (i) comprende dos etapas de diafiltración. En ese caso, la primera etapa de diafiltración reemplaza el tampón (por ejemplo un tampón Tris) por un tampón diferente (por ejemplo un tampón NaPi) y la segunda etapa de diafiltración reemplaza el tampón (por ejemplo un tampón NaPi) por otro tampón (por ejemplo un tampón Na2CO3). Preferiblemente, ambas etapas de diafiltración en (i) usan una membrana con un límite de aproximadamente 30 kDa, y la etapa de diafiltración en (ii) usa una membrana con un límite de menos de aproximadamente 30 kDa (por ejemplo <25 kDa, <20 kDa, <15 kDa o <10 kDa).

Habitualmente se realizan al menos 5 ciclos de diafiltración, por ejemplo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o más. El número de ciclos de diafiltración puede diferir en diferentes etapas de diafiltración. Por ejemplo, cuando el método de la invención implica usar dos o más etapas de diafiltración, por ejemplo (i) una o más (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, etc.) etapas de diafiltración después de la etapa de precipitación alcohólica e intercambio catiónico descrita anteriormente y antes de la filtración con un filtro adherente de proteína descrita más adelante, y (ii) una etapa de diafiltración después de la filtración con un filtro adherente de proteína, los números de ciclos de diafiltración (i) y (ii) pueden ser diferentes. Por ejemplo, la invención puede usar un número x de ciclos en la etapa de diafiltración en (i), y un número y de ciclos en la etapa de diafiltración en (ii). x e y pueden ser independientemente >5, por ejemplo 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o más. Preferiblemente, x < y. Preferiblemente, x = 6 e y = 16. Preferiblemente, la etapa de diafiltración en (i) usa una membrana con un límite de aproximadamente 30 kDa, y la etapa de diafiltración en (ii) usa una membrana con un límite de menos de aproximadamente 30 kDa (por ejemplo <25 kDa, <20 kDa, <15 kDa o <10 kDa).

Una etapa de diafiltración dura preferiblemente menos de 10 horas, por ejemplo entre 2 y 6 horas, preferiblemente entre 3 y 5 horas, por ejemplo entre 3,5 y 4,5 horas.

Las membranas de filtración pueden estar hechas de cualquier material adecuado, por ejemplo membranas de celulosa, de polietersulfona o de celulosa regenerada.

Preferiblemente, la etapa de filtración final del método de la invención es una etapa de ultrafiltración que da como resultado diafiltración y que usa una membrana de celulosa con un límite de 10 kDa.

Filtración con un filtro adherente de proteína

La purificación de los polisacáridos capsulares puede incluir además una etapa mediante la que se eliminan contaminantes de proteína y/o de ADN mediante filtración con un filtro, por ejemplo un filtro adherente de proteína, al que se adhiere la proteína y/o el ADN, pero al que el polisacárido capsular no se adhiere o solo se adhiere débilmente.

El filtro adherente de proteína comprende normalmente carbono activado (por ejemplo como lecho de carbono granular o como bloque de carbono prensado o extruido), que actúa como filtro para la purificación de la muestra. Normalmente, un filtro de carbono para su uso en la presente invención contiene carbono activado inmovilizado en una matriz. La matriz puede ser cualquier medio de filtro poroso permeable para la muestra.

La matriz puede comprender un material de soporte y/o un material aglutinante. El material de soporte puede ser un polímero sintético o un polímero de origen natural. Los polímeros sintéticos adecuados pueden incluir poliestireno, poliacrilamida y poli(metacrilato de metilo), mientras que los polímeros de origen natural pueden incluir celulosa, polisacárido y dextrano, agarosa. Normalmente, el material de soporte polimérico está en forma de una red de fibras para proporcionar rigidez mecánica. El material aglutinante puede ser una resina. La matriz puede tener la forma de una lámina de membrana.

Normalmente, el carbono activado está inmovilizado en la matriz puede estar en forma de un cartucho. Un cartucho es una entidad autocontenida que contiene carbono activado en polvo inmovilizado en la matriz y preparado en forma de una lámina de membrana. La lámina de membrana puede estar capturada en un soporte permeable de plástico para formar un disco. Alternativamente, la lámina de membrana puede estar enrollada en espiral. Para aumentar el área superficial de filtro, pueden apilarse varios discos uno sobre otro. En particular, los discos apilados uno sobre otro tienen un tubo de núcleo central para recoger y retirar la muestra tratada con carbono del filtro. La configuración de los discos apilados puede ser lenticular.

El carbono activado en el filtro de carbono puede derivarse de diferentes materias primas, por ejemplo turba, lignito, madera o cáscara de coco. Cualquier proceso conocido en la técnica, tal como tratamiento con vapor o químico, puede usarse para activar el carbono.

En la presente invención, el carbono activado inmovilizado en una matriz puede estar situado en un alojamiento para formar una unidad de filtro independiente. Cada unidad de filtro tiene su propia entrada y salida para la muestra que debe purificarse. Ejemplos de unidades de filtro que pueden usarse en la presente invención son los cartuchos de carbono de Cuno Inc. (Meriden, EE. UU.) o Pall Corporation (East Hill, EE. Uu .).

Preferiblemente, la invención usa filtros CUNO zetacarbon™. Estos filtros de carbono comprenden una matriz de celulosa en la que polvo de carbono activado está atrapado y unido mediante resina en su sitio.

Re-N-acetilación

Cuando el material de partida se trata con extracción con base, por ejemplo tratamiento con hidróxido (véase anteriormente), entonces el método de la invención puede incluir una etapa de N-acetilación para re-N-acetilar el sacárido capsular.

Los inventores encontraron que una etapa de N-acetilación que usa una disolución madre de anhídrido acético a las siguientes proporciones es particularmente útil con el método de la invención: 4,15 ml de anhídrido acético por l, con anhídrido acético:etanol =1:1.

Tratamiento adicional del polisacárido capsular

El polisacárido puede tratarse adicionalmente para eliminar contaminantes. Esto es particularmente importante en situaciones en la que incluso una contaminación mínima no es aceptable (por ejemplo para la producción de vacunas para humanos).

Una etapa adicional preferida es una etapa de precipitación. Por ejemplo, la precipitación puede usar una disolución catiónica acuosa. El sacárido precipitado puede separarse entonces de cualquier contaminante acuoso restante por ejemplo mediante centrifugación. El material precipitado es estable y puede almacenarse para su uso futuro.

La etapa de precipitación puede usar AcONa. En particular, pueden eliminarse contaminantes añadiendo AcONa 400 mM a pH 4,4 (1/5 de volumen). La mezcla puede mezclarse durante 15-20 minutos a temperatura ambiente y entonces esterilizarse por filtración usando un filtro de 0,45/0,2 pm.

La invención puede usar también una o más etapas de filtración estéril, que normalmente implica filtrar usando un filtro de 0,65 pm - 0,22 pm y/o un filtro de 0,45/0,2 pm.

El material precipitado puede someterse a secado a vacío. Este tratamiento se usará normalmente no para estabilizar el sacárido para su almacenamiento, sino para secar el sacárido y eliminar cualquier alcohol residual.

También pueden realizarse rondas adicionales de precipitación y filtración. También puede usarse filtración profunda por ejemplo como alternativa a la centrifugación. La filtración profunda se usará normalmente tras la solubilización en alcohol.

El polisacárido puede despolimerizarse para formar oligosacáridos, después de haberse preparado a partir de las bacterias, pero antes de la conjugación. La despolimerización reduce la longitud de cadena de los sacáridos y puede no ser buena para GBS. Pueden preferirse oligosacáridos a polisacáridos para su uso en vacunas, y se ha notificado que la longitud de cadena afecta a la inmunogenicidad de sacáridos de GBS en conejos [4]. Si se realiza la despolimerización, los productos generalmente se dimensionarán con el fin de eliminar oligosacáridos de cadena corta. Esto puede conseguirse de diversos modos, tales como ultrafiltración seguida de cromatografía de intercambio iónico. Cuando la composición de la invención incluye un sacárido despolimerizado, se prefiere que la despolimerización preceda a cualquier conjugación.

Si los residuos ácido siálico en los sacáridos capsulares de GBS se han des-N-acetilado, entonces el método de la invención puede incluir una etapa de re-N-acetilación. Puede realizarse convenientemente una re-N-acetilación controlada usando un reactivo tal como anhídrido acético (CH3CO)2O por ejemplo en bicarbonato de amonio al 5% [11].

Estas etapas adicionales pueden realizarse generalmente a temperatura ambiente.

Los inventores han encontrado que pueden obtenerse buenos rendimientos de polisacárido capsular de GBS de tipo II con un método que no requiere una etapa de cromatografía. Por tanto, el método de la invención no incluye una etapa de cromatografía. En particular, el método no incluye una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). En particular, el método no incluye una etapa que implica cromatografía que usa fenilsefarosa.

Preparación de la conjugación

El polisacárido capsular purificado final de la invención puede usarse como antígeno sin modificación adicional por ejemplo para su uso en ensayos de diagnóstico in vitro, para su uso en inmunización, etc.

Con fines de inmunización, sin embargo, se prefiere conjugar el sacárido con una molécula portadora, tal como una proteína. En general, la conjugación covalente de sacáridos con portadores potencia la inmunogenicidad de sacáridos, ya que los convierte de antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, permitiendo así el cebado para la memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas [por ejemplo ref. 12] y es una técnica ampliamente conocida [por ejemplo revisada en las ref. 13 a 21]. Por tanto, el método de la invención puede incluir la etapa adicional de conjugar el sacárido purificado con una molécula portadora.

La conjugación de sacáridos de GBS se ha notificado ampliamente, véanse por ejemplo las referencias 22, 23, 24, 4, 25, 26, 27, 28]. El proceso de la técnica anterior típico para la conjugación de sacárido de GBS implica normalmente una aminación reductora de un sacárido purificado con una proteína portadora tal como toxoide de tétano (TT) o CRM197 [23]. La aminación reductora implica un grupo amina en la cadena lateral de un aminoácido en el portador y un grupo aldehído en el sacárido. Como los sacáridos capsulares de GBS no incluyen un grupo aldehído en su forma natural, entonces este se genera antes de la conjugación mediante la oxidación peryodato de una porción (por ejemplo entre el 5 y el 15%, de manera preferible aproximadamente el 10%) de los residuos ácido siálico del sacárido [23,29]. Las vacunas de conjugado preparados de esta manera han mostrada ser seguras e inmunogénicas en humanos para cada uno de los serotipos de GBS la, Ib, II, III y V [30]. Un proceso de conjugación alternativo implica el uso de grupos -NH2 en el sacárido (o bien de la des-N-acetilación o bien tras la introducción de aminas) junto con ligadores bifuncionales, tal como se describe en la ref. 31.

Proteínas portadoras preferidas son toxinas bacterianas o toxoides, tales como toxoide de difteria o toxoide de tétano. El mutante CRM197 de toxina de difteria [32-34] es un portador particularmente preferido, ya que es un toxoide de difteria. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de membrana externa de N. meningitidis [35], péptidos sintéticos [36,37], proteínas de choque térmico [38,39], proteínas de tosferina [40,41], citocinas [42], linfocinas [42], hormonas [42], factores de crecimiento [42], albúmina sérica humana (preferiblemente recombinante), proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos T de células CD4+ humanas de diversos antígenos derivados de patógeno [43] tal como N19 [44], proteína D de H. influenzae [45,46], proteína de superficie de neumococo PspA [47], neumolisina [48], proteínas de captación de hierro [49], toxina A o B de C. difficile [50], una proteína de GBS [51], etc. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen peptidasa C5a (“SCP”) dada a conocer en el documento WO2010/053986, por ejemplo, peptidasa de C5a de estreptococo del grupo A (SCPA) o estreptococo del grupo B (SCPB).

La unión al portador es preferiblemente por medio de un grupo -NH2 por ejemplo en la cadena lateral de un residuo lisina en una proteína portadora, o de un residuo arginina. La unión también puede ser por medio de un grupo -SH por ejemplo en la cadena lateral de un residuo cisteína.

Es posible usar más de una proteína portadora por ejemplo para reducir el riesgo de la supresión del portador. Por tanto, pueden usarse diferentes proteínas portadoras para diferentes serotipos de GBS, por ejemplo sacáridos del serotipo Ia pueden conjugarse con CRM197, mientras que sacáridos del serotipo Ib pueden conjugarse con toxoide de tétano. También es posible usar más de una proteína portadora para un antígeno de sacárido particular, por ejemplo sacáridos del serotipo III pueden estar en dos grupos, con algunos conjugados con CRM197 y otros conjugados con toxoide de tétano. En otras realizaciones, pueden usarse proteínas de GBS, tal como SCPB descrito anteriormente, o bien como portador para uno o más de los tipos Ia, Ib, II, III y V de polisacárido o bien como componente de antígeno de proteína adicional en una composición de este tipo. En general, sin embargo, se prefiere usar la misma proteína portadora para todos los sacáridos.

Una única proteína portadora puede portar más de un antígeno de sacárido [52,53]. Por ejemplo, una única proteína portadora puede tener conjugada con la misma sacáridos de los serotipos Ia y Ib. Para conseguir este objetivo, diferentes sacáridos pueden mezclarse antes de la reacción de conjugación. En general, sin embargo, se prefiere tener conjugados independientes para cada serogrupo, mezclándose los diferentes sacáridos después de la conjugación. Los conjugados independientes pueden basarse en el mismo portador.

Se prefieren conjugados con una razón de sacárido:proteína (p/p) de entre 1:5 (es decir exceso de proteína) y 5:1 (es decir exceso de sacárido). Se prefieren razones de entre 1:2 y 5:1, así como razones de entre 1:1,25 y 1:2,5. También se prefieren razones de entre 1:1 y 4:1. Con cadenas de sacárido más largas, es típico un exceso de peso de sacárido. En general, la invención proporciona un conjugado, comprendiendo el conjugado un estreptococo, preferiblemente un radical de sacárido capsular de S. agalactiae unido a un portador, siendo la razón en peso de sacárido:portador de al menos 2:1.

Pueden usarse conjugados junto con portador libre [54]. Cuando una proteína portadora dada está presente en forma tanto libre como conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es preferiblemente no más del 5% de la cantidad total de la proteína portadora en la composición en su totalidad, y más preferiblemente presente a menos del 2% en peso.

Puede usarse cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier ligador adecuado cuando sea necesario.

El sacárido normalmente se activará o funcionalizará antes de la conjugación. La activación puede implicar, por ejemplo, reactivos de cianilación tal como CDAP (por ejemplo, tetrafluoroborato de 1 -ciano-4-dimetilaminopiridinio (55, 56, etc.)). Otras técnicas adecuadas usan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC y TSTU (véase también la introducción a la referencia 57).

Los enlaces por medio de un grupo ligador pueden hacerse usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 58 y 59. Un tipo de enlace implica aminación reductora del polisacárido, acoplamiento del grupo amino resultante con un extremo de un grupo ligador ácido adípico, y entonces acoplamiento de una proteína al otro extremo del grupo ligador ácido adípico [60, 61, 62]. Otros ligadores incluyen B-propionamido [63], nitrofenil-etilamina (ref.64), haluros de haloacilo [65], enlaces glicosídicos [66], ácido 6-aminocaproico [67], ADH [68], radicales C4 a C12 [69], etc. Como alternativa al uso de un ligador, puede usarse enlace directo. Los enlaces directos a la proteína pueden comprender oxidación del polisacárido seguida de aminación reductora con la proteína, tal como se describe en, por ejemplo, las referencias 70, 71,72.

Tras la conjugación, puede medirse el nivel de proteína portadora no conjugada. Un modo de hacer esta medición implica electroforesis capilar [73] (por ejemplo, en disolución libre) o cromatografía electrocinética micelar [74].

Tras la conjugación, puede medirse el nivel de sacárido no conjugado. Un modo de hacer esta medición implica HPAEC-PAD [75].

Tras la conjugación, puede usarse una etapa de separación de sacárido conjugado de sacárido no conjugado. Un modo de separar estos sacáridos es usar un método que hace precipitar de manera selectiva un componente. Se prefiere la precipitación selectiva de sacárido conjugado, para dejar sacárido no conjugado en disolución, por ejemplo, mediante un tratamiento con desoxicolato [69].

Tras la conjugación, puede llevarse a cabo una etapa de medición del tamaño molecular y/o de la masa molar de un conjugado. En particular, pueden medirse distribuciones. Un modo de hacer estas mediciones implica cromatografía de exclusión por tamaños con detección mediante fotometría de dispersión de luz multiangular y refractometría diferencial (SEC-MALS/RI) [76].

Combinaciones de conjugados

Los sacáridos preparados mediante los métodos de la invención (en particular tras conjugación tal como se describió anteriormente) pueden mezclarse por ejemplo entre sí y/o con otros antígenos. Por tanto, el método de la invención puede incluir la etapa adicional de mezclar el sacárido con uno o más antígenos adicionales. Por ejemplo, conjugados de GBS de tipo II obtenidos de los métodos de la invención pueden mezclarse con otros conjugados estreptocócicos, tal como GBS de otros serogrupos, por ejemplo Ia, Ib, III y/o V.

Por ejemplo, el método de la invención puede incluir una etapa adicional de mezclar el sacárido capsular de GBS de tipo II obtenido de los métodos de purificación de la invención (y opcionalmente conjugado con una proteína portadora) con antígenos adicionales seleccionados del grupo que consiste en (i) un sacárido capsular de GBS de tipo Ia (y opcionalmente conjugado con una proteína portadora); (ii) un sacárido capsular de GBS de tipo Ib (y opcionalmente conjugado con una proteína portadora); (iii) un sacárido capsular de GBS de tipo III (y opcionalmente conjugado con una proteína portadora); y (iv) un sacárido capsular de GBS de tipo V (y opcionalmente conjugado con una proteína portadora). Preferiblemente, la cantidad total de sacáridos capsulares de GBS en la composición es <70 |ug. Preferiblemente, la razón de las masas de los sacáridos capsulares de GBS es Ia:Ib:II:III:V = 1:1:1:1:1. Por ejemplo, cada sacárido capsular de GBS está presenta a 1-30 |ug por dosis unitaria (por ejemplo 5 |ug, 10 |ug o 20 |ug por dosis unitaria).

La composición se producirá preparando conjugados independientes (por ejemplo un conjugado diferente para cada serotipo) y combinando entonces los conjugados.

Los conjugados pueden mezclarse añadiéndolos individualmente a una disolución tamponada. Una disolución preferida es solución salina fisiológica tamponada con fosfato (concentración final fosfato de sodio 10 mM). Una concentración preferida de cada conjugado (medido como sacárido) en la mezcla final es de entre 1 y 20 |ug/ml, por ejemplo entre 5 y 15 |ug/ml, tal como alrededor de 8 |ug/ml. Puede añadirse un adyuvante de sal de aluminio opcional en esta fase (por ejemplo, para dar una concentración de Al3+ final de entre 0,4 y 0,5 mg/ml).

Tras el mezclado, los conjugados mezclados pueden filtrarse de manera estéril.

Composiciones farmacéuticas y métodos

La solicitud da a conocer procesos para preparar composiciones farmacéuticas, que comprenden las etapas de mezclar (a) un sacárido de la invención (opcionalmente en forma de un conjugado) con (b) un portador farmacéuticamente aceptable. Los “portadores farmacéuticamente aceptables” típicos incluyen cualquier portador que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son normalmente macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, lactosa y agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas). Tales portadores se conocen ampliamente por los expertos habituales en la técnica. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento de pH y similares. La solución salina fisiológica tamponada con fosfato, libre de pirógenos, estéril, es un portador típico. Una discusión exhaustiva de excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 77.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar envasadas en viales o en jeringas. Las jeringas pueden suministrarse con o sin agujas. Una jeringa incluirá una única dosis de la composición, mientras que un vial puede incluir una única dosis o múltiples dosis.

Las composiciones acuosas de sacáridos de la invención son adecuadas para reconstituir otras vacunas a partir de una forma liofilizada. Cuando deba usarse una composición de la invención para la reconstitución extemporánea, la solicitud da a conocer un proceso para reconstituir una vacuna liofilizada de este tipo, que comprende la etapa de mezclar el material liofilizado con una composición acuosa de la invención. El material reconstituido puede usarse para inyección.

Las composiciones pueden incluir un antimicrobiano, particularmente si están envasadas en un formato de múltiples dosis.

Las composiciones pueden comprender detergente, por ejemplo, un Tween (polisorbato), tal como TWEEN 80 (TM). Los detergentes están presentes generalmente a niveles bajos (por ejemplo, >0,01%).

Las composiciones pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10±2 mg/ml de NaC1 es típica.

Las composiciones incluirán generalmente un tampón. Un tampón fosfato es típico.

Las composiciones pueden comprender un alcohol de azúcar (por ejemplo, manitol) o un disacárido (por ejemplo, sacarosa o trehalosa) por ejemplo, a alrededor de 15-30 mg/ml (por ejemplo, 25 mg/ml), particularmente si deben liofilizarse o si incluyen material que se ha reconstituido a partir de material liofilizado. El pH de una composición para liofilización puede ajustarse a alrededor de 6,1 antes de la liofilización.

Los conjugados pueden administrarse junto con otros agentes inmunorreguladores. En particular, las composiciones incluirán habitualmente un adyuvante de vacuna. Adyuvantes que pueden ser útiles con composiciones de la invención se conocen en la técnica.

Usos farmacéuticos

La solicitud da a conocer un método de tratamiento de un paciente, que comprende administrar la composición al paciente. El paciente o bien puede correr el riesgo de la propia o bien puede ser una mujer embarazada (inmunización materna). El paciente es preferiblemente un humano. El humano puede ser de cualquier edad, por ejemplo <2 años de edad, de 2-11 años de edad, de 11 -55 años de edad, >55 años de edad, etc.

La solicitud también da a conocer la composición para su uso en terapia. La solicitud también da a conocer el uso de la composición en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad. Preferiblemente la enfermedad es gripe o neumonía.

Las composiciones generalmente se administrarán directamente a un paciente. La administración directa puede llevarse a cabo mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía transcutánea, vía subcutánea, vía intraperitoneal, vía intravenosa, vía intramuscular o al espacio intersticial de un tejido), o mediante administración rectal, oral, vaginal, óptica, transdérmica, intranasal, ocular, auricular, pulmonar u otra mucosa. Se prefiere la administración intramuscular (por ejemplo, al muslo o el brazo). La inyección puede ser por medio de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero puede usarse alternativamente inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es 0,5 ml.

La invención puede usarse para provocar inmunidad sistémica y/o mucosa.

El tratamiento de dosificación puede ser un calendario de única dosis o un calendario de múltiples dosis. Pueden usarse múltiples dosis en un calendario de inmunización primario y/o en un calendario de inmunización de recuerdo. Un calendario de dosis primaria puede ir seguido de un calendario de dosis de recuerdo. El tiempo adecuado entre dosis de cebado (por ejemplo, entre 4-16 semanas), y entre el cebado y el recuerdo, puede determinarse de manera rutinaria.

Las infecciones bacterianas afectan a diversas áreas del cuerpo y así pueden prepararse composiciones en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, como o bien disoluciones o bien suspensiones líquidas. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo, una composición liofilizada). La composición puede prepararse para administración tópica, por ejemplo, como pomada, crema o polvo. La composición puede prepararse para administración oral, por ejemplo, como comprimido o cápsula, o como jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, como inhalador, usando un polvo fino o una pulverización. La composición puede prepararse como supositorio u óvulo vaginal.

La composición puede prepararse para administración nasal, auricular u ocular, por ejemplo, como pulverización, gotas, gel o polvo (por ejemplo, ref. 143 y 144). Se prefieren composiciones inyectables.

General

El término “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste en”, por ejemplo una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional por ejemplo X Y. El término “que consiste esencialmente en” significa que el proceso, el método o la composición incluye etapas adicionales y/o partes que no alteran de manera material las características básicas y novedosas del proceso, método o composición reivindicado. El término “que consiste en” se toma generalmente como que significa que la invención tal como se reivindica está limitada a aquellos elementos citados específicamente en la reivindicación (y puede incluir sus equivalentes, siempre que sea aplicable la doctrina de equivalentes).

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x±10%.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo una composición que está “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definición de la invención.

Cuando la invención proporciona un proceso que implica múltiples etapas secuenciales, la invención también puede proporcionar un proceso que implica menos del número total de etapas. Por ejemplo, si un sacárido ya se ha purificado parcialmente eliminando ácidos nucleicos y/o proteínas contaminantes, entonces esta etapa puede omitirse de los procesos de la invención. De manera similar, puede realizarse una etapa de eliminación de contaminantes para dar material listo para la precipitación mediada por detergente, pero no es necesario realizar la precipitación. No es necesario realizar la etapa de precipitación con el fin de encontrarse dentro del alcance de la invención, ya que el material previo a la precipitación tiene utilidad como producto intermedio en la preparación de sacáridos, y puede usarse, almacenarse, exportarse, etc. para su uso posterior, por ejemplo para una precipitación posterior. Estas diferentes etapas pueden realizarse en tiempo muy diferentes por diferentes personas en diferentes lugares (por ejemplo en diferentes países).

Se apreciará que los anillos de azúcar pueden existir en forma abierta y cerrada y que, aunque se muestran formas cerradas en fórmulas estructurales en el presente documento, las formas abiertas también están abarcadas por la invención. De manera similar, se apreciará que los azúcares pueden existir en formas de piranosa y furanosa, y que, aunque se muestren formas de piranosa en fórmulas estructurales en el presente documento, las formas de furanosa también están abarcadas. Diferentes formas anoméricas de azúcares también están abarcadas.

EJEMPLOS

Para ilustrar los métodos en el presente documento, se estudió Streptococcus agalactiae 18RS21, que produce polisacáridos capsulares de serotipo II, aislado de pacientes con enfermedad por GBS.

Ejemplo 1

Este ejemplo muestra un protocolo de purificación a modo de ejemplo que proporciona rendimientos mucho mayores que los que eran previamente posibles para polisacáridos de GBS de tipo II.

Aislamiento y purificación de polisacáridos de GBS de tipo II

Se extrajo y se purificó polisacárido de GBS de tipo II nativo de bacterias usando las etapas de proceso (véase la figura 2):

Fermentación bacteriana: Se hizo crecer una cepa de GBS de tipo II en medio complejo. Puede usarse cualquier método de cultivo, aunque se prefiere el cultivo fermentativo tal como se da a conocer en el presente documento.

Inactivación de biomasa de fermentación y extracción de polisacárido (tratamiento con base): Si es necesario, la biomasa puede calentarse para llevarla hasta temperatura ambiente. Se añadió hidróxido de sodio (4 M) a la biomasa recuperada hasta una concentración final de 0,8 M y se mezcló hasta homogeneidad. La suspensión se incubó posteriormente a 37°C durante 36 horas con mezclado.

Neutralización de biomasa: Tras la extracción con tratamiento con base, se añadió base TRIS 1 M hasta una concentración final de 50 mM y la suspensión se mezcló hasta homogeneidad. El pH de la mezcla se ajustó a 7,8 con HCl (6 M) (dilución 1:1 del ácido concentrado).

Precipitación con alcohol: Se añadió CaCl22 M hasta una concentración final de 0,1 M (52,6 ml por 1 l de mezcla neutralizada) y la suspensión se mezcló hasta homogeneidad. Se añadió etanol (96% (v/v)) hasta una concentración final del 30% (v/v) de etanol (428 ml por 1 l) y la suspensión se mezcló hasta homogeneidad.

Microfiltración tangencial: La mezcla se sometió a diafiltración con una membrana de 0,22 gm (Hydrosart Sartorius) para eliminar el precipitado. En primer lugar, la biomasa se concentró hasta un volumen de trabajo = 50-75 ml, entonces se sometió a diafiltración con tampón NaCl 1 M, TRIS 100 mM, CaCl2100 mM, EtOH al 30% (6 ciclos de lavado).

Primera diafiltración tangencial 30 kDa: El material se sometió a diafiltración en una membrana de celulosa de 30 kDa (Sartorius Sartocon Hydrosart 0,1 m2) frente a 16 volúmenes de TRIS 50 mM NaCl 0,5 M tamponados a pH 8,8 y entonces frente a 8 volúmenes de NaPi 10 mM tamponados a pH 7,2.

AcONa: El contaminante todavía presente en el producto retenido se trató mediante precipitación añadiendo AcONa 400 mM pH 4,4 (1/5 de volumen). La mezcla se mezcló suavemente durante 15-20 minutos a temperatura ambiente y se esterilizó por filtración usando un filtro de 0,45/0,2 pm (filtro Sartorius Sartobran). El material se almacenó entonces a 2-8°C hasta que se necesitó (máx. 15 días).

Segunda diafiltración tangencial 30 kDa: El material se sometió a diafiltración en una membrana de celulosa de 30 kDa (Sartorius Sartocon Hydrosart 0,1 m2) frente a 10 volúmenes de Na2CO3300 mM NaCl 300 mM tamponados a pH 8,8.

Filtración con un filtro adherente de proteína'. El material se hizo pasar a través de un filtro de carbono activado, (un filtro ZetaCarbon™ de 3M) para eliminar contaminantes de proteína residuales.

Re-N-acetilación de polisacárido. Se preparó disolución madre de anhídrido acético a las siguientes proporciones.

4,15 ml de anhídrido acético por l, con anhídrido acético.etanol = 1.1. Se añadió disolución madre de anhídrido acético nueva a la disolución de polisacárido diluida hasta 2 mg/ml hasta una razón de >22.1 anhídrido acético.unidad de repetición de polisacárido. El material se incubó con mezclado durante 2 horas a temperatura ambiente. El pH se comprobó al final de 2 horas para verificar que era de ~ 8,8.

Diafiltración tangencial final 10 kDa: El material se sometió a diafiltración en una membrana de celulosa de 10 kDa (Sartorius Sartocon Hydrosart 0,1 m2) frente a 16 volúmenes de KPi 10 mM tamponados a pH 7,2. El PSII purificado se filtró a 0,22 pm con un filtro de jeringa desechable (NALGENE®, PES) y se almacenó a 4/8°C.

Métodos analíticos

Ensayos químicos húmedos. El contenido de sacárido se determinó mediante el ensayo químico húmedo de ácido siálico [78]. La muestra se hidrolizó en HCl a 80°C durante 90 minutos, se neutralizó con NaOH y se inyectó a un sistema DIONEX™. Los datos se procesan mediante software CHROMELEON™. Los sacáridos se eluyeron usando un gradiente lineal de siete minutos de 90.10 a 60.40 de NaOH 0,1 M, acetato de Na 0,1 M.NaOH 0,1 M, NaNO30,5 M en una columna CarboPac PA1 con precolumna PA1 a una tasa de flujo de 1,0 ml/min.

El ácido siálico libre se determinó inyectando la muestra de polisacárido solubilizada en agua a 1,0 mg/ml sin hidrolizar la muestra. De este modo fue posible separar el ácido siálico libre del unido. En la muestra de polisacárido no se detecta ácido siálico libre. El pico en la etapa de regeneración era el polisacárido no hidrolizado. El ácido siálico libre es un parámetro importante, porque está relacionado con la respuesta inmunitaria.

El contenido de proteína residual se determinó mediante un kit comercial MicroBCA (TM) (Pierce). El contenido de ácido nucleico residual se determinó siguiendo el método publicado en la referencia 79.

El contenido de polisacárido de grupo B residual se determinó determinando los residuos ramnosa y usando un método basado en análisis de HPAEC-PAD. La ramnosa es un sacárido específico en el carbohidrato de grupo B que no se encuentra en los polisacáridos tipo y se usó para determinar la concentración de residuo carbohidrato contaminante tras la purificación de polisacárido capsular. Las muestras y los patrones se hidrolizaron en TFA 2 N a 100°C durante 3,0 horas, entonces se evaporaron en SpeedVac y se reconstituyeron con 450 pl de H2O. El intervalo de la curva patrón de ramnosa es 1,0 - 10,0 pg/ml. Las condiciones cromatográficas eran. una columna CarboPac PA1 con precolumna PA1 con una tasa de flujo de 1,0 ml/min de NaOH 12 mM durante 15 minutos seguida de 5 minutos de regeneración con NaOH 500 mM y entonces reequilibrado en NaOH 12 mM durante 25 minutos.

Resultados y discusión

El nuevo método de purificación (figura 2) proporciona mejoras para purificar polisacáridos de tipo II de GBS. En comparación con el método de la técnica anterior, en el que se usa una membrana de celulosa de 30kDa en la etapa de filtración final, el nuevo método de purificación recupera un rendimiento mucho mayor, mientras que todos los contaminantes potenciales principales (proteínas, ácidos nucleicos y polisacárido del grupo B) permanecen bajos (comparar las filas “post N-acetilación ret UF 30K” y “post N-acetilación perm UF30K y grupo ret 10K” en la tabla 1, página 25). El nuevo método de purificación puede usarse para la fabricación de materiales clínicos y comerciales derivados de estos polisacáridos capsulares.

El nuevo método de purificación proporciona también rendimientos (tabla 2), identidad, conformidad y pureza (tabla 3) reproducibles en cada etapa de purificación entre diferentes lotes.

Tabla 2. El rendimiento entre diferentes lotes en cada etapa del método de purificación.

Tabla 3. La identidad, conformidad y pureza entre diferentes lotes usando el método de purificación de la invención.

Ejemplo 2

Se investigaron el peso molecular y el tamaño de partícula relativos de polisacárido capsular de GBS de tipo II. También se determinaron los tamaños de partícula de polisacáridos capsulares de GBS de tipo Ia, Ib, III y V.

Métodos analíticos

Análisis de RMN: Se prepararon muestras de polisacáridos purificados disolviendo el polvo en 1 ml de óxido de deuterio (D2O, Aldrich) hasta una concentración uniforme. Se transfirieron alícuotas (750 pl) de la muestras a tubos de RMN de 5 mm (Wilmad). Los experimentos de 1H RMN se registraron a 25°C en un espectrómetro Bruker 600 MHz y usando una sonda de banda ancha de 5 mm (Bruker). Para la obtención y el procesamiento de datos se usó el paquete de software XWINNMR (Bruker). Se recogieron espectros de RMN de protón 1-D usando un experimento de uno pulso estándar con 32 barridos. El transmisor se fijó a la frecuencia de HDO (4,79 ppm). Se obtuvieron espectros de 1H RMN en materia cuantitativa usando un tiempo de recirculación total para garantizar una recuperación completa de cada señal (5 x tiempo de relajación longitudinal T1).

Se registraron espectros de RMN de homo- y heterocorrelación 2-D para asignar los perfiles de RMN de protón 1-D. La asignación de picos se confirmó también mediante la comparación con datos publicados [80].

Dispersión de luz estática (MALLS): Esta técnica determina el radio medio cuadrático (RMS) o “radio de giro” Rg de una molécula. Este es la distancia promediada con la masa de cada centro de dispersión con respecto al centro de gravedad de la molécula. Este método tiene en cuenta la intensidad de luz dispersada promediada y es independiente del disolvente y del tiempo (véase la ref. 81).

Dispersión de luz dinámica (DLS): Esta técnica mide el radio hidrodinámico, Rh, de una molécula. Este es el radio de una esfera con el mismo coeficiente de difusión que la molécula. Este método tiene en cuenta las fluctuaciones en la intensidad de luz dispersada y es dependiente del tiempo y de la viscosidad del disolvente (véase la ref. 81).

Resultados y discusión

El peso molecular promedio para el polisacárido capsular de GBS de tipo II, estimado mediante cromatografía por exclusión de tamaños, era de -270-420 kDa (tabla 4). La identidad estructural de polisacáridos capsulares de GBS de tipo II se confirmó mediante espectroscopía de 1H RMN (datos no mostrados).

Tabla 4. Peso molecular de polisacárido capsular de GBS de tipo II.

Las mediciones de tamaño de partícula se proporcionan en la tabla 5 a continuación. En objetos compactos, la masa está cerca del centro de la masa. Rg es menor que Rh y Rg / Rh < 1. Para un objeto extendido, Rg está intensamente influido por las masas periféricas, pero el radio hidrodinámico Rh está influido menos intensamente. La razón de Rg con respecto a Rh aumenta a medida que el objeto se vuelve menos compacto (Rg / Rh > 1).

Tabla 5. Tamaños de partícula de los sacáridos capsulares de GBS determinados mediante MALLS y DLS.

El polisacárido capsular de GBS de tipo II, purificado a partir de crecimiento bacteriano de la cepa 18RS21, mostró un radio hidrodinámico (MW aparente en cromatografía de exclusión por tamaños de flujo a través de una membrana de filtración) menor que el valor esperado considerando su MW absoluto (> 200 kDa tal como se estima mediante análisis de SEC-MALLS).

El comportamiento inusual del sacárido capsular de GBS de tipo II en comparación con el otros tipos de sacárido capsular de GBS (es decir Ia, Ib, III y V) se debe probablemente a la diferente disposición de monosacáridos que constituyen la unidad de repetición. Como ejemplo, mientras que para el sacárido capsular de GBS de tipo Ia y Ib la ramificación se compone de tres monosacáridos (de los cinco azúcares contenidos en total), para el sacárido capsular de GBS de tipo II la ramificación contiene solo un monosacárido. La ramificación más corta confiere probablemente una conformación más lineal y en consecuencia un impedimento estérico reducido.

Sumario

La etapa de filtración de flujo tangencial final del protocolo convencional para purificar sacáridos capsulares de GBS se realiza habitualmente mediante un filtro de límite de 30 kDa (por ejemplo véase la ref. 2). Los inventores determinaron que el peso molecular promedio para el polisacárido capsular de GBS de tipo II era de -270-420 kDa, así que se esperaba que este polisacárido capsular se retendría mediante un filtro de 30 kDa. Sin embargo, como se muestra en el ejemplo 1, sorprendentemente una gran cantidad (-50%) del polisacárido capsular de GBS de tipo II pasó a través del filtro de 30 kDa en la etapa de filtración de flujo tangencial final del protocolo de purificación (tabla 1). Los inventores encontraron sorprendentemente que el polisacárido capsular de GBS de tipo II tiene un radio hidrodinámico menor en comparación con los otros tipos de sacárido capsular de GBS (es decir Ia, Ib, III y V). Por tanto, reemplazar el filtro en la etapa de filtración de flujo tangencial final del protocolo de purificación convencional por un filtro de límite de MW menor, por ejemplo por un filtró de límite de 10 kDa es particularmente ventajoso para retener el polisacárido capsular de GBS de tipo II. Por tanto, el método de la invención proporciona un rendimiento mayor del polisacárido capsular de GBS de tipo II.

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Tabla 1. Caracterización en cada etapa del método de purificación del ejemplo 1.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Método para purificar un polisacárido capsular de GBS de tipo II, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar un aislado bruto que contiene el polisacárido capsular; (b) eliminar un precipitado de alcohol formado poniendo en contacto el aislado bruto con una disolución de alcohol; (c) realizar las siguientes etapas de filtración: (i) una etapa de microfiltración que usa una membrana de <0,65 gm; (ii) una etapa de filtración que usa una membrana con un límite de menos de aproximadamente 30 kDa; (iii) una etapa de filtración que usa una membrana de 0,45-0,22 gm; (iv) una etapa de filtración que usa una membrana con un límite de menos de aproximadamente 30 kDa; (v) una etapa de filtración que usa un filtro adherente de proteína; (vi) una etapa de filtración que usa una membrana con un límite de aproximadamente 10 kDa; (vii) una etapa de microfiltración que usa un filtro de jeringa desechable de 0,22 gm; y en el que todas las etapas se realizan secuencialmente.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de filtración (vi) es una etapa de ultrafiltración.

3. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la etapa de filtración (vi) da como resultado diafiltración.

4. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa de filtración (vi) es de flujo cruzado o flujo tangencial.

5. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa de filtración (vi) usa una membrana de celulosa.

6. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que se realizan una o más etapas adicionales después de la etapa de filtración (vi), que comprenden: hacer precipitar el polisacárido capsular purificado.

7. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que se realizan una o más etapas adicionales después de la etapa de filtración (vi), que comprenden: conjugar el polisacárido capsular con una proteína portadora, por ejemplo toxoide de difteria, toxoide de tétano o CRM197.

8. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que se realizan una o más etapas adicionales después de la etapa de filtración (vi), que comprenden: formular una vacuna con el polisacárido capsular como componente.

9. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que se realizan una o más etapas adicionales después de la etapa de filtración (vi), que comprenden: mezclar con uno o más polisacáridos capsulares de un serotipo de GBS seleccionado del grupo que consiste en: la, Ib, III, IV, V, VI, VII y VIII, opcionalmente en el que el/los polisacárido(s) capsular(es) está(n) conjugado(s) con proteína(s) portadora(s), por ejemplo toxoide de difteria, toxoide de tétano o CRM197.

10. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que cada etapa de filtración usa un tampón diferente.

11. Método según la reivindicación 10, en el que los tampones se seleccionan de tampones que comprenden NaPi, Na2CO3 o KPi.

12. Método según la reivindicación 10 u 11, en el que la etapa (ii) se tampona con un tampón que comprende NaPi; la etapa (iv) se tampona con un tampón que comprende Na2CO3; y la etapa (vi) se tampona con un tampón que comprende KPi.

13. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa (iii) incluye añadir AcONa.

14. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa (v) usa un filtro de carbono.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la nueva N-acetilación del polisacárido se realiza antes de la etapa de filtración (vi).