BE1023297A1 - Purification de polysaccharide capsulaire streptococcique - Google Patents

Abstract

Procédé de purification pour le polysaccharide capsulaire GBS de type II, dans lequel le polysaccharide capsulaire est filtré en utilisant une membrane avec un seuil de coupure de moins de 30 kDa. Ce procédé fournit un rendement plus élevé que les protocoles précédents.

Description

PURIFICATION DE POLYSACCHARIDE CAPSULAIRE STREPTOCOCCIQUE

La présente demande revendique le bénéfice de la demande de brevet européen 14199441.8 (déposée le 19 décembre 2014), dont le contenu complet est incorporé ici par référence à toutes fins utiles.

Domaine technique L'invention se situe dans le domaine de la purification de polysaccharides capsulaires bactériens, en particulier ceux de la souche Streptococcus agalactiae, et en particulier pour une utilisation dans la préparation de vaccins.

Etat de la technique antérieure

Les polysaccharides capsulaires sont d'importants immunogènes que l'on trouve à la surface des bactéries impliquées dans diverses maladies bactériennes. Cette caractéristique les a amenés à constituer un important composant dans la conception de vaccins. Ils se sont révélés utiles dans l'induction de réponses immunitaires, en particulier lorsqu'ils sont liés à des protéines véhiculaires (Réf. 1).

La référence 2 décrit un procédé de préparation de polysaccharides capsulaires, en particulier ceux de la souche Streptococcus agalactiae (également dénommée streptocoque du groupe B de Lancefield ou GBS) . Le procédé comprend : (a) la fourniture d'un isolat brut contenant le polysaccharide capsulaire ; (b) l'élimination d'un précipité alcoolique formé par mise en contact de l'isolat brut avec une solution alcoolique ; (c) l'ultrafiltration en utilisant une membrane de cellulose ayant un seuil de coupure d'environ 30 kDa pour éliminer les composants de poids moléculaires plus petits tout en retenant le polysaccharide capsulaire ; (d) l'élimination de contaminants protéiques avec un filtre adhérant aux protéines ; (e) la re-N-acétylation du polysaccharide capsulaire purifié ; et (f) l'ultrafiltration en utilisant une membrane de cellulose ayant un seuil de coupure d'environ 30 kDa à nouveau. Résumé de l'invention

Le ou les inventeurs ont purifié un polysaccharide capsulaire GBS de type II selon le procédé de la Réf. 2 et ont découvert que le procédé offrait seulement un rendement inférieur à 50 %. Par suite, il existe un besoin d'un procédé de purification amélioré qui produise un rendement plus élevé de polysaccharide capsulaire, en particulier pour le polysaccharide capsulaire GBS de type II. L'invention se base sur la découverte qu'une membrane avec un seuil de coupure de 10 kDa donne en comparaison de 30 kDa à l'étape (f) de la Réf. 2 un rendement plus élevé, par exemple environ 90 %. Sans vouloir se lier par une théorie quelconque, l'augmentation de rendement semble être provoquée par une conformation plus linéaire du polysaccharide capsulaire GBS de type II en comparaison des autres polysaccharides capsulaires GBS (par exemple des types Ia, Ib, III et V) . La conformation plus linéaire entraîne un encombrement stérique réduit et un rayon hydrodynamique plus faible, ce qui signifie que le polysaccharide est enclin à fuir à travers une membrane avec un seuil de coupure de poids moléculaires plus élevé.

Les inventeurs ont également découvert que de bons rendements de polysaccharide capsulaire GBS de type II pouvaient être obtenus avec un procédé qui ne nécessite pas d'étape chromatographique et, en particulier, ne nécessite pas de chromatographie par interaction hydrophobe (HIC).

Par suite, l'invention vise un procédé de purification d'un polysaccharide capsulaire GBS de type II comprenant une étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa. L'invention vise également, dans un procédé de purification d'un polysaccharide capsulaire GBS de type II, l'amélioration consistant à utiliser une membrane ayant un seuil de coupure de poids moléculaires de moins d'environ 30 kDa pour une étape de filtration au lieu d'une membrane ayant un seuil de coupure de poids moléculaires d'environ 30 kDa. L'étape de filtration peut utiliser une membrane ayant un seuil de coupure <25 kDa, par' exemple <20 kDa, <15 kDa ou <10 kDa. De préférence, l'étape de filtration utilise une membrane ayant un seuil de coupure de 10 kDa. L'étape de filtration sera discutée plus en détail ci-dessous.

Typiquement, on effectue une ou plusieurs étapes supplémentaires avant l'étape de filtration. Les étapes appropriées comprennent : (a) la fourniture d'un isolat brut contenant le polysaccharide capsulaire ; (b) l'élimination d'un précipité alcoolique formé en mettant en contact l'isolat brut avec une solution alcoolique ; et (c) l'élimination de contaminants protéiques avec un filtre adhérant aux protéines.

Dans certains modes de réalisation, on peut effectuer une ou plusieurs étapes supplémentaires après l'étape de filtration. Par exemple, les étapes supplémentaires peuvent être : (e) la précipitation du polysaccharide capsulaire purifié ; (f) la conjugaison du polysaccharide capsulaire avec une protéine véhiculaire, par exemple l'anatoxine diphtérique, l'anatoxine tétanique ou la CRM197 ; (g) la formulation d'un vaccin avec le polysaccharide capsulaire comme composant ; et/ou (h) le mélange avec un ou plusieurs polysaccharides capsulaires provenant d'un sérotype GBS-choisi dans le groupe constitué des types Ia, Ib, III, IV, V, VI, VII et VIII, en particulier dans lequel ce ou ces polysaccharides capsulaires est ou sont conjugués avec une ou des protéines véhiculaires, par exemple l'anatoxine diphtérique, l'anatoxine tétanique ou la CRM197.

Le procédé peut comprendre plus d'une étape de filtration. Dans un tel cas, c'est typiquement l'étape de filtration finale qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa. L'invention vise également une composition comprenant un polysaccharide capsulaire GBS de type II que l'on peut obtenir par le procédé de purification de 1'invention.

Brève description des dessins

La Fig. 1 représente la structure moléculaire d'un polysaccharide capsulaire GBS spécifique de sérotype du type II.

La Fig. 2 représente un procédé de purification d'un polysaccharide capsulaire GBS de type II.

Description détaillée de modes de réalisation préférés

Le saccharide capsulaire

Les maladies apparentées au GBS relèvent principalement des sérotypes Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII et VIII, plus de 90 % d'entre elles étant provoquées par cinq sérotypes : la, Ib, II, III et V. Le polysaccharide capsulaire de la souche S. agalactiae est lié par covalence à des résidus de GlcNAc dans le squelette de peptidoglycane de la bactérie et est distinct de l'antigène du groupe B, qui est un saccharide séparé qui est fixé à des résidus de MurNAc sur le même squelette de peptidoglycane ([3] ) . Les polysaccharides capsulaires de différents sérotypes sont chimiquement apparentés, mais sont très différents au plan antigénique. Tous les polysaccharides capsulaires GBS partagent le même cœur de trisaccharide suivant :

Les divers sérotypes GBS diffèrent par la manière dont ce cœur est modifié. L'invention utilise des GBS qui appartiennent au sérotype II. De préférence, l'invention utilise n'importe quelle souche GBS de type II qui exprime une quantité raisonnable de polysaccharide capsulaire pour compléter la purification, par exemple 18RS21 ou DK21.

Comme montré sur la Fig. 1, le saccharide capsulaire GBS de type II comprend : (a) un résidu d'acide N-acétylneuraminique (NeuNAc) terminal (couramment dénommé acide sialique), qui, dans tous les cas, est lié 2—>3 à un résidu de galactose ; et (b) un résidu de N-acétyl-glucosamine (GlcNAc) dans le cœur de trisaccharide. Le cœur de trisaccharide des polysaccharides capsulaires GBS type II contient trois résidus de galactose par unité récurrente.

Les saccharides purifiés selon l'invention seront généralement sous leur forme naturelle, mais ils peuvent avoir été modifiés. Par exemple, le saccharide peut être plus court que le saccharide capsulaire naturel ou peut être chimiquement modifié. Par exemple, il peut être modifié pour produire des polysaccharides capsulaires non naturels ou des polysaccharides hétérologues ou pour augmenter le rendement.

Par suite, le saccharide utilisé selon l'invention peut être un polysaccharide capsulaire sensiblement de pleine longueur, comme on en trouve dans la nature, ou bien il peut être plus court que la longueur naturelle. Les polysaccharides de pleine longueur peuvent être dépolyraérisés pour donner des fragments plus courts pour utilisation avec l'invention, par exemple, par hydrolyse dans un acide doux par chauffage, par chromatographie à exclusion, etc. On a rapporté que la longueur de chaîne affectait l'immunogénicité des saccharides GBS chez les lapins [4].

Le saccharide peut être modifié chimiquement par rapport au saccharide capsulaire, tel qu'on le trouve dans la nature. Par exemple, le saccharide peut être dé-O-acétylé (en partie ou en totalité), dé-N-acétylé (en partie ou en totalité), N-propionaté (en partie ou en totalité), etc. En fonction du saccharide particulier, la désacétylation peut ou non affecter l'immunogénicité, par exemple, le vaccin NeisVac-C™ utilise un saccharide dé-O-acétylé, tandis que le Menjugate™ est acétylé, mais les deux vaccins sont efficaces. L'importance de la 0-acétylation sur les saccharides GBS dans divers sérotypes est discutée dans la référence 5 et on préfère conserver la O-acétylation de résidus d'acide sialique aux positions 7, 8 et/ou 9 avant, pendant et après la purification, par exemple en utilisant du formaldéhyde pour l'extraction du saccharide et/ou l'inactivation bactérienne, par protection/déprotection, par réacétylation, etc. L'effet de la désacétylation, etc. peut être évalué par des essais de routine.

Procédé de purification

Le procédé de purification contient typiquement plusieurs étapes, comme cela sera expliqué plus en détail ci-dessous. Les étapes ont typiquement lieu dans l'ordre décrit ci-dessous, bien que d'autres ordres puissent également être efficaces.

Matériau de départ

Les procédés de préparation de saccharides capsulaires à partir de bactéries sont bien connus dans la technique, par exemple se référer aux références 6, 7, 8, etc. Pour les GBS, les procédés suivants peuvent être utilisés (se référer également à la Réf. 9) .

Le procédé de purification de l'invention peut démarrer avec un isolat brut contenant le polysaccharide capsulaire GBS de type II. Le saccharide capsulaire est sous forme aqueuse, typiquement sous la forme d'une suspension comprenant des protéines streptococciques, des acides nucléiques et le polysaccharide capsulaire.

De manière générale, une petite quantité de polysaccharide capsulaire est libérée dans le milieu de culture au cours de la croissance bactérienne et, de la sorte, le matériau de départ pour la précipitation alcoolique de protéines de contamination et/ou d'acides nucléiques peut donc être le surnageant d'une culture bactérienne centrifugée. Par exemple, dans certains modes de réalisation, le polysaccharide peut être isolé de la bactérie Streptococcus agalactiae qui comprend des mutations en cpsA (numéro d'accès uniprot Q9RPC7) et/ou en cpsD (numéro d'accès uniprot K0JNC2) et sécrète de grandes quantités de polysaccharide capsulaire dans le milieu de culture. Des mutants et des mutations appropriés sont divulgués dans la demande de brevet international n° PCT/EP2015/059773 (publiée sous le numéro WO2015/169774) incorporée à la présente demande par référence. Plus typiquement, cependant, le matériau de départ sera préparé en traitant les bactéries capsulées elles-mêmes (ou le matériau contenant le peptidoglycane bactérien) de sorte que le saccharide capsulaire soit libéré.

Le polysaccharide capsulaire peut être libéré de bactéries par divers procédés, notamment un traitement chimique, physique ou enzymatique. Par suite, une préparation aqueuse de polysaccharide peut être traitée avant la réaction de précipitation initiale de la protéine et de l'acide nucléique.

Un traitement chimique typique est l'extraction par une base [10] (par exemple en utilisant de 1'hydroxyde de sodium) qui peut cliver la liaison phosphodiester entre le saccharide capsulaire et le squelette de peptidoglycane. L'extraction par une base est avantageuse du fait qu'elle inactive la bactérie en même temps qu'elle libère le polysaccharide capsulaire. En outre, le traitement par une base libère le polysaccharide intact et provoque un clivage extensif de l'antigène du groupe B en raison de ses multiples liaisons phosphodiester [3] , ce qui facilite la séparation ultérieure d'antigènes de saccharides capsulaires et spécifiques au groupe. Le traitement à 1'hydroxyde de sodium est donc un procédé préféré pour libérer le polysaccharide capsulaire. Les inventeurs ont découvert qu'un traitement à 1'hydroxyde de sodium en utilisant 0,8 M de NaOH à 37 °C pendant 36 heures était particulièrement utile avec le procédé de l'invention. Comme le traitement à 1'hydroxyde dé-N-acétyle le saccharide capsulaire, cependant, une re-N-acétylation ultérieure peut être utile.

Un traitement enzymatique typique implique l'utilisation à la fois de mutanolysine et de ß-N-acétylglucosaminidase [3]. Ceux-ci agissent sur le peptidoglycane GBS pour libérer le saccharide capsulaire pour une utilisation avec l'invention, mais mènent également à la libération de l'antigène d'hydrate de carbone spécifique au groupe. Un autre traitement enzymatique implique le traitement avec une phosphodiestérase de type II (PDE2). Les enzymes PDE2 peuvent cliver les mêmes phosphates que l'hydroxyde de sodium (voir ci-dessus) et peuvent libérer le saccharide capsulaire sans cliver l'antigène d'hydrate de carbone spécifique au groupe et sans dé-N-acétyler le saccharide capsulaire, ce qui a pour effet de simplifier les étapes en aval. Les enzymes PDE2 sont donc une option préférée pour préparer des saccharides capsulaires GBS pour utilisation dans le procédé de l'invention.

Un matériau de départ préféré pour le procédé de l'invention est donc un polysaccharide capsulaire dé-N-acétylé qui peut être obtenu par extraction par une base comme décrit dans la référence 10. Un autre matériau de' départ préféré est donc le produit du traitement au PDE2 du GBS. Ces matériaux peuvent être soumis à une concentration (par exemple une ultrafiltration) avant la précipitation par le procédé de l'invention.

Précipitation alcoolique et échange cationique

Le saccharide capsulaire GBS de type II obtenu après culture sera généralement impur et sera contaminé par des acides nucléiques et des protéines bactériens. Le procédé de l'invention peut utiliser une précipitation alcoolique. Si nécessaire (par exemple après extraction par une base), les matériaux seront habituellement neutralisés avant précipitation. L'alcool utilisé pour précipiter les acides nucléiques et/ou les protéines contaminants est de préférence un alcool inférieur, tel que le méthanol, l'éthanol, le propan-l-ol, le propan-2-ol, le butan-1-ol, le butan-2-ol, le 2-méthyl-propan-l-ol, le 2-méthyl-propan-2-ol, les diols, etc. La sélection d'un alcool approprié peut être testée de manière empirique sans charge exagérée, mais les alcools tels que l'éthanol et l'isopropanol (propan-2-ol) sont préférés plutôt que des alcools tels que le phénol. L'alcool est de préférence ajouté à la suspension de polysaccharide pour donner une concentration d'alcool finale comprise entre 10 % et 50 % (par exemple, aux environs de 30 %) . Les concentrations les plus utiles sont celles qui permettent une précipitation adéquate de contaminants sans précipiter également le polysaccharide. La concentration en alcool finale optimale peut dépendre de la souche de GBS d'où le polysaccharide est tiré et peut être déterminée par des essais de routine sans charge exagérée. La précipitation de polysaccharides à des concentrations d'éthanol supérieures à 50 % a été observée.

Dans certaines formes de réalisation, la solution d'alcool est ajoutée en concentration suffisante pour précipiter les contaminants d'acides nucléiques, mais pas le polysaccharide capsulaire. Dans des formes de réalisation préférées, l'alcool est l'éthanol de préférence ajouté en concentration comprise entre environ 10 % et environ '50 %, mieux encore en concentration d'environ 30 % d'éthanol. Les inventeurs ont découvert qu'une étape de précipitation alcoolique qui implique l'addition d'éthanol en concentration d'environ 30 % d'éthanol était particulièrement utile avec le procédé de l'invention.

La solution d'alcool peut comprendre éventuellement un cation, de préférence un cation métallique, mieux encore un cation divalent, bien mieux encore du calcium. L'alcool peut être ajouté sous forme pure ou peut être ajouté sous forme diluée avec un solvant miscible (par exemple de l'eau). Des mélanges de solvants préférés sont des mélanges d'éthanol et d'eau avec un rapport préféré compris entre environ 70:30 et environ 95:5 (par exemple, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10).

Le saccharide est également traité avec un cation de métal aqueux. Les cations métalliques monovalents et divalents sont préférés et les cations divalents sont particulièrement préférés, notamment Mg++, Mn++, Ca++, etc., car ils sont plus efficaces dans la formation de complexes. Les ions de calcium sont particulièrement utiles et notamment le mélange d'alcool comprend de préférence des ions de calcium solubles. Ceux-ci peuvent être ajoutés à un mélange de saccharide et d'alcool sous la forme de sels de calcium ajoutés sous forme solide ou sous forme aqueuse. Les ions de calcium sont de préférence fournis par l'utilisation de chlorure de calcium.

Les ions de calcium sont de préférence présents en concentration finale comprise entre 10 et 500 mM, par exemple environ 0,1 M. La concentration en Ca++ finale optimale peut dépendre du sérotype GBS d'où le polysaccharide est tiré et peut être déterminée par des essais de routine sans charge exagérée. L'alcool et le cation jouent différents rôles (l'alcool est utilisé pour précipiter les contaminants, tandis que le cation stabilise et complexe le saccharide sous forme soluble), mais produisent un effet combiné. Bien que le but soit de préparer un mélange du saccharide, de l'alcool et du cation, ces trois composants ne doivent pas nécessairement être mélangés ensemble simultanément. Par suite, l'alcool et le cation peuvent être utilisés de manière séquentielle ou simultanée. Le traitement séquentiel est préféré et un procédé particulièrement préféré implique l'addition du cation au saccharide suivie de l'addition de l'alcool au mélange de cation et de saccharide, bien que l'alcool puisse être utilisé avant le cation si on le souhaite.

Après précipitation alcoolique de protéines et/ou d'acides nucléiques contaminants, le polysaccharide capsulaire GBS est laissé en solution. Le matériau précipité peut être séparé du polysaccharide par des moyens appropriés quelconques, notamment par centrifugation. Le surnageant peut être soumis à une microfiltration et, en particulier, à une filtration frontale (filtration perpendiculaire) pour éliminer les particules qui peuvent obturer les filtres aux étapes ultérieures (par exemple, des particules précipitées d'un diamètre supérieur à 0,22 μπι) . Comme autre solution à la filtration frontale, on peut utiliser une microfiltration tangentielle.

Etape de filtration L'invention implique une étape de filtration en utilisant une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa. Le procédé peut utiliser une membrane ayant un seuil de coupure ^25 kDa, par exemple ^20 kDa, <15 kDa ou <10 kDa. De préférence, l'étape de filtration utilise une membrane avec un seuil de coupure de 10. kDa. La membrane de filtration permet le passage de produits de l'hydrolyse tout en retenant le polysaccharide capsulaire. L'invention peut utiliser plus d'une étape de filtration. Par exemple, le procédé peut comprendre : (i) une ou plusieurs étapes de filtration (par exemple 2, 3, 4, 5, 6, etc.) après l'étape de précipitation alcoolique et d'échange cationique décrite ci-dessus et avant la filtration avec un filtre adhérant aux protéines décrit ci-dessous et (ii) une étape de filtration après la filtration avec un filtre adhérant aux protéines, dans lequel l'étape de filtration de (ii) est celle qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa. En variante, toutes les étapes de filtration utilisent une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa, en particulier <10 kDa.

Dans au moins une étape de filtration de l'invention (typiquement, l'étape de filtration finale, par exemple l'étape (ii) ci-dessus), la membrane de l'étape de filtration a un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa (par exemple ^25 kDa, ^20 kDa, £15 kDa ou £10 kDa) . Dans les autres étapes de filtration (par exemple à l'étape (i) ci-dessus), un seuil de coupure dans la plage d'environ 10 kDa à 30 kDa peut être utile. On peut utiliser des tailles de coupure plus petites, car les fragments d'hydrolyse de l'antigène spécifique au groupe se situent généralement aux environ de 1 kDa (saccharides 5-mères, 8-mères et 11-mères), mais le seuil de coupure plus élevé permet avantageusement l'élimination d'autres contaminants sans mener à une fuite du saccharide capsulaire. L'invention peut être un procédé comprenant plus d'une étape de filtration et l'étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa est l'étape de filtration finale. Le procédé peut comprendre plus de deux étapes de filtration et l'étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa est l'étape de filtration finale. En particulier, l'étape de filtration finale peut utiliser une membrane avec un seuil de coupure d'environ 10 kDa. En particulier, le procédé peut comprendre : (i) une étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa ; (ii) une autre étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa ; et (iii) une autre étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure d'environ 10 kDa.

En particulier, l'invention peut être un procédé comprenant une ou plus ou la totalité des étapes suivantes : (i) une étape de filtration qui utilise une membrane ^0,65 μπι ; (ii) une étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa ; (iii) une étape de filtration qui utilise une membrane de 0,45 à 0,22 pm ; (iv) une étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa ; (v) une étape de filtration qui utilise un filtre adhérant aux protéines ; (vi) une étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure d'environ 10 kDa ; (vii) une étape de filtration qui utilise un filtre à seringue jetable de 0,22 pm. L'étape de filtration peut être une étape d'ultrafiltration. L'ultrafiltration est un processus de séparation dans lequel un solvant est éliminé d'une solution (notamment une solution colloïdale) ou d'une suspension en la forçant à s'écouler à travers une membrane par application d'une pression hydraulique. Les composants de la solution qui sont notablement plus gros que les pores de la membrane ne peuvent passer à travers la membrane. L'ultrafiltration est de préférence une ultrafiltration à écoulement croisé ou à écoulement tangentiel. Dans l'ultrafiltration à écoulement tangentiel, la solution s'écoule de manière sensiblement parallèle à la surface de la membrane au lieu de s'écouler perpendiculairement à la surface comme dans une filtration ordinaire. Une diafiltration d'écoulement tangentiel est typique. L'étape d'ultrafiltration entraîne de préférence la diafiltration de la solution. Dans la diafiltration, le solvant et/ou les microsolutés (par exemple des sels) qui sont éliminés au cours de l'ultrafiltration sont remplacés par un nouveau solvant et de nouveaux microsolutés. En général, l'élimination et le remplacement se font à la même cadence et le volume de la solution est donc maintenu constant. L'effet global du processus est donc le remplacement du solvant et des microsolutés initiaux par de nouveaux solvants/microsolutés. Les nouveaux solvants/microsolutés peuvent être n'importe quel tampon approprié, par exemple un tampon de Tris, un tampon de NaPi ou un tampon de Na2C03.

Typiquement, chaque étape de diafiltration remplace le tampon par un tampon différent. Par exemple, lorsque le procédé de l'invention implique l'utilisation de deux ou plus d'étapes de diafiltration, par exemple (i) une ou plusieurs étapes de diafiltration (par exemple 2, 3, 4, 5, 6, etc.) après l'étape de précipitation alcoolique et d'échange de cations décrite ci-dessus et avant la filtration avec un filtre adhérant aux protéines décrit ci-dessous et (ii) une étape de diafiltration après la filtration avec un filtre adhérant aux protéines, la ou les étapes de diafiltration dans (1) remplace(nt) le tampon (par exemple un tampon de Tris) par un tampon différent (par exemple un tampon de NaPi) et l'étape de diafiltration dans (ii) remplace le tampon (par exemple un tampon de NaPi) par un autre tampon (par exemple, un tampon de KPi) . De préférence, la ou les étapes de diafiltration dans (i) utilise(nt) une membrane avec un seuil de coupure d'environ 30 kDa et l'étape de diafiltration dans (ii) utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa (par exemple ^25 kDa, ^20 kDa, ^15 kDa ou ^10 kDa).

Dans certaines formes de réalisation, l'étape (i) comprend deux étapes de diafiltration. Dans ce cas, la première étape de diafiltration remplace le tampon (par exemple un tampon de Tris) par un tampon différent (par exemple un tampon de NaPi) et la seconde étape de diafiltration remplace le tampon (par exemple un tampon de NaPi) par un autre tampon (par exemple un tampon de Na2CÜ3) . De préférence, les deux étapes de diafiltration dans (i) utilisent une membrane avec un seuil de coupure d'environ 30 kDa et l'étape de diafiltration dans (ii) utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa (par exemple ^25 kDa, ^20 kDa, ^15 kDa ou ^10 kDa).

Au moins 5 cycles de diafiltration sont habituellement réalisés, par exemple 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou plus. Le nombre de cycles de diafiltration peut différer à différentes étapes de diafiltration. Par exemple, lorsque le procédé de l'invention implique l'utilisation de deux ou plus d'étapes de diafiltration, par exemple (i) une ou plusieurs étapes de diafiltration (par exemple 2, 3, 4, 5, 6, etc.) après l'étape de précipitation alcoolique et d'échange de cations décrite ci-dessus et avant la filtration par un filtre adhérant aux protéines décrit ci-dessous et (ii) une étape de diafiltration après la filtration avec un filtre adhérant aux protéines, le nombre de cycles de diafiltration (i) et (ii) peuvent être différents. Par exemple, l'invention peut utiliser un nombre x de cycles à l'étape de diafiltration de (i) et un nombre y de cycles à l'étape de diafiltration de (ii). x et y peuvent indépendamment être ^5, par exemple 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou plus. De préférence, x<y. De préférence, x=6 et y=16. De préférence, l'étape de diafiltration de (i) utilise une membrane avec un seuil de coupure d'environ 30 kDa et l'étape de diafiltration de (ii) utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa (par exemple <25 kDa, <20 kDa, <15 kDa ou <10 kDa).

Une étape de diafiltration dure de préférence moins de 10 heures, par exemple entre 2 et 6 heures, mieux encore entre 3 et 5 heures, par exemple entre 3,5 et 4,5 heures.

Les membranes de filtration peuvent être constituées de n'importe quel matériau approprié, par exemple des membranes de cellulose, de polyéthersulfone ou de cellulose régénérée.

De préférence, l'étape de filtration finale du procédé de l'invention est une étape d'ultrafiltration qui entraîne une diafiltration et qui utilise une membrane de cellulose avec un seuil de coupure de 10 kDa.

Filtration avec un filtre adhérant aux protéines

La purification des polysaccharides capsulaires peut en outre comprendre une étape dans laquelle les contaminants de protéines et/ou d'ADN sont éliminés par filtration avec un filtre, par exemple un filtre adhérant aux protéines auquel les protéines et/ou l'ADN adhèrent, mais auquel le polysaccharide capsulaire n'adhère pas ou n'adhère que faiblement.

Le filtre adhérant aux protéines comprend typiquement du charbon activé (par exemple sous la forme d'un lit de charbon granulaire ou d'un bloc de charbon pressé ou extrudé) qui agit comme filtre pour la purification de l'échantillon. Typiquement, un filtre de charbon pour usage dans la présente invention contient du charbon activé immobilisé dans une matrice. La matrice peut être n'importe quel milieu filtrant poreux perméable à l'échantillon.

La matrice peut comprendre un matériau de support et/ou un matériau liant. Le matériau de support peut être un polymère synthétique ou un polymère d'origine naturelle. Comme polymères synthétique appropriés, on peut citer le polystyrène, le polyacrylamide et le poly(méthacrylate de méthyle), tandis que les polymères d'origine naturelle peuvent comprendre la cellulose, un polysaccharide et le dextrane, l'agarose. Typiquement, le matériau de support polymère se présente sous la forme d'un réseau fibreux pour fournir une rigidité mécanique. Le matériau liant peut être une résine. La matrice peut se présenter sous la forme d'une feuille membranaire.

Typiquement, le charbon activé immobilisé dans la matrice peut se présenter sous la forme d'une cartouche. Une cartouche est une entité autonome contenant du charbon activé en poudre immobilisé dans la matrice et préparé sous la forme d'une feuille membranaire. La feuille membranaire peut être capturée dans un support perméable en matière plastique pour former un disque. En variante, la feuille membranaire peut être enroulée en spirale. Pour augmenter la surface spécifique du filtre, divers disques peuvent être empilés l'un sur l'autre. En particulier, les disques empilés l'un sur l'autre ont un tuyau central pour recueillir et éliminer l'échantillon traité au charbon du filtre. La configuration de disques empilés peut être lenticulaire.

Le charbon activé dans le filtre de charbon peut être tiré de différents matériaux bruts, par exemple de la tourbe, de la lignite, du bois ou de coques de noix de coco. N'importe quel procédé connu dans la technique, notamment un traitement à la vapeur d'eau ou un traitement chimique, peut être utilisé pour activer le charbon.

Dans la présente invention, le charbon activé immobilisé dans une matrice peut être placé dans un logement pour former une unité de filtration indépendante. Chaque unité de filtration a sa propre entrée et sa propre sortie pour l'échantillon à purifier. Comme exemples d'unités de filtration qui sont utilisées dans la présente invention, on citera les cartouches de charbon de Cuno Inc. (Meriden, USA) ou Pall Corporation (East Hill, USA).

De préférence, l'invention utilise des filtres de type CUNO zetacarbon™. Ces filtres de charbon comprennent une matrice de cellulose dans laquelle de la poudre de charbon activé est piégée et liée en place par de la résine.

Re-N-acétylation

Lorsque le matériau de départ est traité avec une extraction par une base, par exemple un traitement par un hydroxyde (voir ci-dessus), le procédé de l'invention peut comprendre une étape de N-acétylation pour ré-N-acétyler le saccharide capsulaire.

Les inventeurs ont découvert qu'une étape de N-acétylation qui utilise une solution contrôlée d'anhydride acétique dans les proportions suivantes était particulièrement utile avec le procédé de l'invention : 4,15 mL d'anhydride acétique par L, avec un rapport de l'anhydride acétique à l'éthanol de 1:1.

Autre traitement du polysaccharide capsulaire

Le polysaccharide peut encore être traité pour éliminer les contaminants. C'est particulièrement important dans les situations où une contamination même mineure n'est pas acceptable (par exemple, pour la production de vaccins humains).

Une autre étape préférée est une étape de précipitation. Par exemple, la précipitation peut utiliser une solution cationique aqueuse. Le saccharide précipité peut ensuite être séparé de contaminants aqueux restants éventuels, par exemple par centrifugation. Le matériau précipité est stable et peut être stocké pour un futur usage. L'étape de précipitation peut utiliser de l'AcONa. En particulier, les contaminants peuvent être éliminés en ajoutant 400 mM d'AcONa à pH 4,4 (1/5 en volume). Le mélange peut être mélangé pendant 15 à 20 minutes à température ambiante, puis stérilisé par filtration en utilisant un filtre de 0,45/0,2 μιη. L'invention peut également utiliser une ou plusieurs étapes de filtration stérile, qui impliquent typiquement une filtration en utilisant un filtre de 0,65 pm à 0,22 pm et/ou un filtre de 0,45/0,2 pm.

Le matériau précipité peut être soumis à un séchage sous vide. Ce traitement sera typiquement utilisé non pas pour stabiliser le saccharide pour le stockage, mais pour sécher le saccharide et éliminer tout alcool résiduel. D'autres étapes de précipitation et de filtration peuvent également être réalisées. La filtration en profondeur peut également être utilisée, par exemple, comme alternative à la centrifugation. Une filtration en profondeur sera typiquement utilisée après solubilisation dans de l'alcool.

Le polysaccharide peut être dépolymérisé pour former des oligosaccharides, après qu'ils ont été préparés à partir de la bactérie, mais avant conjugaison. La dépolymérisation réduit la longueur de chaîne des saccharides et ne peut être valable pour le GBS. Les oligosaccharides peuvent être préférés aux polysaccharides pour un usage dans des vaccins et la longueur de chaîne a été rapportée comme affectant l'immunogénicité des saccharides GBS chez les lapins [4]. Si une dépolymérisation est effectuée, les produits seront généralement calibrés de manière à éliminer les oligosaccharides de longueur courte. Cela peut se faire de diverses manières, notamment par une ultrafiltration suivie d'une chromatographie à échange d'ions. Lorsque la composition de l'invention comprend un saccharide dépolymérisé, on préfère que la dépolymérisation précède une conjugaison quelconque.

Si des résidus d'acide sialique dans les saccharides capsulaires GBS ont été dé-N-acétylés, le procédé de l'invention peut comprendre une étape de ré-N-acétylation. Une ré-N-acétylation contrôlée peut commodément être réalisée en utilisant un réactif tel que l'anhydride acétique (CH3CO)20, par exemple dans 5 % de bicarbonate d'ammonium [11].

Ces étapes supplémentaires peuvent généralement être réalisées à température ambiante.

Les inventeurs ont découvert que de bons rendements de polysaccharide capsulaire GBS de type II pouvaient être obtenus avec un procédé qui ne nécessite pas une étape de chromatographie. Par suite, le procédé de l'invention ne comprend pas d'étape de chromatographie. En particulier, le procédé ne comprend pas d'étape de chromatographie par interaction hydrophobe (HIC). En particulier, le procédé ne comprend pas d'étape impliquant une chromatographie en utilisant de la phénylsépharose.

Préparation à la conjugaison

Le polysaccharide capsulaire purifié final de l'invention peut être utilisé comme antigène sans autre modification, par exemple pour un usage dans des essais de diagnostic in vitro, pour une utilisation en immunisation, etc.

Cependant, dans le cadre d'une immunisation, on préfère conjuguer le saccharide avec une molécule véhiculaire, telle qu'une protéine. En général, une conjugaison covalente de saccharides avec des véhicules améliore l'immunogénicité des saccharides, car elle les convertit d'antigènes T-indépendants en antigènes T-dépendants, ce qui permet un amorçage pour une mémoire immunologique. La conjugaison est particulièrement utile pour des vaccins pédiatriques [par exemple la réf. 12] et est une technique bien connue [par exemple, revue dans les réf. 13 à 21]. Le procédé de l'invention peut donc comprendre l'autre étape de conjugaison du saccharide purifié avec une molécule véhiculaire.

La conjugaison de saccharides GBS a été largement rapportée [par exemple se référer aux références 22, 23, 24, 4, 25, 26, 27, 28]. Le procédé typique de l'état de la technique pour la conjugaison de saccharides GBS implique typiquement une amination réductrice d'un saccharide purifié à une protéine véhiculaire telle qu'une anatoxine tétanique (TT) ou le CRM197 [23]. L'amination réductrice implique un groupement amino sur la chaîne latérale d'un acide aminé du véhicule et un groupement aldéhyde dans le saccharide. Comme les saccharides capsulaires GBS ne comprennent pas de groupement aldéhyde dans leur forme naturelle, celui-ci est généré avant conjugaison par oxydation au periodate d'une partie (par exemple entre 5 et 15 %, de préférence environ 10 %) des résidus d'acide sialique du saccharide [23, 29] . Les vaccins conjugués préparés de cette manière se sont révélés sûrs et immunogéniques chez les humains pour chacun des sérotypes GBS Ia, Ib, II, III et V [30]. Un autre procédé de conjugaison implique l'utilisation de groupements -NH2 dans le saccharide (soit à partir d'une dé-N-acétylation, soit après introduction d'amines) conjointement avec des lieurs bifonctionnels, comme décrit dans la réf. 31.

Les protéines véhiculaires préférées sont des toxines ou des anatoxines bactériennes, telles que l'anatoxine diphtérique ou l'anatoxine tétanique. Le mutant CRM197 de la toxine diphtérique [32-34] est un véhicule particulièrement préféré à cet effet, car il s'agit d'une anatoxine diphtérique. D'autres protéines véhiculaires appropriées comprennent la protéine membranaire externe de la N. meningitidis [35], les peptides synthétiques [36, 37], les protéines du choc thermique [38, 39], les protéines de la coqueluche [40, 41], les cytokines [42], les lymphokines [42], les hormones [42], les facteurs de croissance [42], l'albumine de sérum humain (de préférence recombinante), les protéines artificielles comprenant des épitopes de cellules T de CD4+ humaines multiples provenant de divers antigènes dérivés d'agents pathogènes [43], telles que le N19 [44], la protéine D de la souche H. influenzae [45, 46], la protéine de surface pneumococcique PspA [47], la pneumolysine [48], les protéines de fixation du fer [49] , la toxine A ou B de la souche C. difficile [50], une protéine GBS [51], etc. Comme autres protéines véhiculaires appropriées, on citera la peptidase C5a (« SCP ») divulguée dans le document W02010/053986, par exemple, la peptidase C5a du streptocoque du groupe A (SCPA) ou du streptocoque du groupe B (SCPB).

La fixation au véhicule se fait de préférence via un groupement -NH2, par exemple, dans la chaîne latérale d'un résidu de lysine dans une protéine véhiculaire ou d'un résidu d'arginine. La fixation peut également se faire via un groupement -SH, par exemple dans la chaîne latérale d'un résidu de cystéine.

Il est possible d'utiliser plus d'une protéine véhiculaire, par exemple, pour réduire le risque de la suppression du véhicule. Par suite, on peut utiliser différentes protéines véhiculaires pour différents sérotypes GBS, par exemple des saccharides de sérotype la pour les conjuguer avec le CRM197, tandis que les saccharides de sérotype Ib pourraient être conjugués avec l'anatoxine tétanique. Il est également possible d'utiliser plus d'une protéine véhiculaire pour un antigène de saccharide particulier, par exemple les saccharides de sérotype III pourraient se présenter en deux groupes, certains conjugués au CRM197 et d'autres conjugués à l'anatoxine tétanique. Dans d'autres formes de réalisation, des protéines GBS telles que la SCPB décrite ci-dessus peuvent être utilisées comme véhicule pour un ou plus de types de polysaccharides la, Ib, II, III et V ou comme composant d'antigène de protéine supplémentaire dans une telle composition. En général, cependant, on préfère utiliser la même protéine véhiculaire pour tous les saccharides.

Une seule protéine véhiculaire pourrait porter plus d'un antigène de saccharide [52, 53]. Par exemple, une seule protéine véhiculaire pourrait se voir conjuguée à des saccharides provenant des sérotypes la et Ib. Pour atteindre cet objectif, différents saccharides peuvent être mélangés avant la réaction de conjugaison. En général, cependant, on préfère avoir des conjugués séparés pour chaque sérogroupe, les saccharides différents étant mélangés après conjugaison. Les conjugués séparés peuvent être basés sur le même véhicule.

Des conjugués avec un rapport du saccharide à la protéine (p/p) entre 1:5 (c'est-à-dire un excès de protéine) et 5:1 (c'est-à-dire un excès de saccharide) sont préférés. Les rapports entre 1:2 et 5:1 sont préférés tout comme les rapports entre 1:1,25 et 1:2,5. Les rapports entre 1:1 et 4:1 sont également préférés. Avec des chaînes de saccharides plus longues, un excès de poids de saccharide est typique. En général, l'invention fournit un conjugué, dans lequel le conjugué comprend un streptocoque, de préférence un fragment de saccharide capsulaire de la souche S. agalactiae joint à un véhicule, dans lequel le rapport pondéral du saccharide au véhicule est d'au moins 2:1.

Les conjugués peuvent être utilisés conjointement avec un véhicule libre [54]. Lorsqu'une protéine véhiculaire donnée est présente à la fois dans la forme libre et dans la forme conjuguée dans une composition de l'invention, la forme non conjuguée n'est de préférence pas présente à raison de plus de 5 % de la quantité totale de la protéine véhiculaire dans la composition dans son ensemble et, mieux encore, est présente à moins de 2 % en poids.

On peut utiliser n'importe quelle réaction de conjugaison appropriée avec un lieur approprié quelconque si nécessaire.

Le saccharide sera typiquement activé ou fonctionnalisé avant conjugaison. L'activation peut impliquer, par exemple, des réactifs de cyanylation tels que le CDAP (par exemple, le tétraf luoroborate de 1-cyano-4-diméthylaminopyridinium ((55, 56, etc.)). D'autres techniques appropriées utilisent des carbodiimides, des hydrazides, des esters activés, du norborane, de l'acide p-nitrobenzoïque, du N-hydroxysuccinimide, S-NHS, l'EDC et TSTU (se référer également à l'introduction à la référence 57).

Des liaisons via un groupement lieur peuvent être réalisées en utilisant n'importe quelle procédure connue, par exemple, les procédures décrites dans les références 58 et 59. Un type de liaison implique une amination réductrice du polysaccharide, le couplage du groupement amino obtenu avec une extrémité d'un groupement lieur d'acide adipique, puis le couplage d'une protéine à l'autre extrémité du groupement lieur d'acide adipique [60, 61, 62]. Comme autres lieurs, on citera le B- propionamido [63], la nitrophényl-éthylamine (réf. 64), les halogénures d'haloacyle [65], les liaisons glycosidiques [66], l'acide 6-amino-caproïque [67], l'ADH [68], les fragments en C4 à C12 [69], etc. Comme alternative à l'utilisation de lieurs, on peut utiliser une liaison directe. Des liaisons directes avec la protéine peuvent comprendre l'oxydation du polysaccharide suivie d'une amination réductrice avec la protéine, comme décrit, par exemple, dans les références 70, 71, 72.

Après conjugaison, le niveau de protéine véhiculaire non conjuguée peut être mesuré. Une manière de procéder à cette mesure implique une électrophorèse capillaire [73] (par exemple en solution libre) ou une chromatographie électrocinétique micellaire [74] .

Après conjugaison, le niveau de saccharide non conjugué peut être mesuré. Une façon de procéder à cette mesure implique une HPAEC-PAD [75].

Après conjugaison, on peut utiliser une étape de séparation du saccharide conjugué du saccharide non conjugué. Une façon de séparer ces saccharides consiste à utiliser un procédé qui précipite sélectivement un composant. On préfère une précipitation sélective du saccharide conjugué pour laisser le saccharide non conjugué en solution, par exemple, par un traitement au désoxycholate [69].

Après conjugaison, on peut effectuer une étape de mesure de la taille moléculaire et/ou de la masse molaire d'un conjugué. En particulier, on peut mesurer les distributions. Une manière de procéder à ces mesures implique une chromatographie d'exclusion stérique avec détection par photométrie de diffusion lumineuse multi-angles et une réfractométrie différentielle (SEC-MALS/RI) [76] .

Combinaisons de conjugués

Les saccharides préparés par les procédés de l'invention (en particulier après conjugaison comme décrit ci-dessus) peuvent être mélangés, par exemple, l'un avec l'autre et/ou avec d'autres antigènes. Par suite, le procédé de l'invention peut comprendre l'autre étape de mélange du saccharide avec un ou plus d'autres antigènes. Par exemple, les conjugués tirés du GBS type II obtenus par les procédés de l'invention peuvent être mélangés à d'autres conjugués streptococciques, tels que le GBS d'autres sérogroupes, par exemple Ia, Ib, III et/ou V.

Par exemple, le procédé de l'invention peut comprendre une autre étape de mélange du saccharide capsulaire GBS de type II obtenu par les procédés de purification de l'invention (et éventuellement conjugué à une protéine véhiculaire) avec d'autres antigènes choisis dans le groupe constitué des suivants : (i) un saccharide capsulaire GBS de type la (et éventuellement conjugué avec une protéine véhiculaire) ; (i i ) un saccharide capsulaire GBS de type Ib (et éventuellement conjugué avec une protéine véhiculaire) ; (iii) un saccharide capsulaire GBS de type III (et éventuellement conjugué avec une protéine véhiculaire) ; et (iv) un saccharide capsulaire GBS de type V (et éventuellement conjugué avec une protéine véhiculaire). De préférence, la quantité totale de saccharides capsulaires GBS dans la composition est ^70 pg. De préférence, le rapport des masses des saccharides GBS est de la:Ib:II : III : V = 1:1:1:1:1. Par exemple, chaque saccharide capsulaire GBS est présent à raison de 1 à 30 pg par dose unitaire (par exemple, 5 pg, 10 pg ou 20 pg par dose unitaire).

La composition sera produite en préparant des conjugués séparés (par exemple un conjugué différent pour chaque sérotype) et en combinant les conjugués.

Les conjugués peuvent être mélangés en les ajoutant individuellement à une solution tamponnée. Une solution préférée est une solution saline physiologique tamponnée au phosphate (concentration finale de 10 mM de phosphate de sodium). Une concentration préférée de chaque conjugué (mesuré comme saccharide) dans le mélange final se situe entre 1 et 20 pg/mL, par exemple, entre 5 et 15 pg/mL, notamment autour de 8 pg/mL. Un adjuvant de sel d'aluminium facultatif peut être ajouté à ce stade (par exemple pour donner une concentration finale d'Al3+ entre 0,4 et 0,5 mg/mL) .

Après mélange, les conjugués mélangés peuvent être filtrés en milieu stérile.

Compositions et procédés pharmaceutiques L'invention vise des procédés pour la préparation de compositions pharmaceutiques, comprenant les étapes consistant à mélanger (a) un saccharide de l'invention (éventuellement sous la forme d'un conjugué) avec (b) un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les « véhicules pharmaceutiquement acceptables » typiques comprennent tout véhicule qui n'induit pas lui-même la production d'anticorps nocifs pour l'individu recevant la composition. Les véhicules appropriés sont typiquement de grosses macromolécules lentement métabolisées telles que des protéines, des polysaccharides, des acides polylactiques, des acides polyglycoliques, des acides aminés polymères, des copolymères d'acides aminés, le lactose et des agrégats de lipides (tels que des gouttelettes d'huiles ou des liposomes). Ces véhicules sont bien connus des hommes du métier. Les vaccins peuvent également contenir des diluants tels que l'eau, une solution saline, du glycérol, etc. En outre, des substances auxiliaires telles que des agents de mouillage ou d'émulsionnement, des substances de tampon du pH, etc. peuvent être présentes. Une solution saline physiologique stérile exempte de pyrogène et tamponnée au phosphate est un véhicule typique. Une discussion complète des excipients pharmaceutiquement acceptables est disponible dans la référence 77.

Les compositions pharmaceutiques peuvent être conditionnées en flacons ou dans des seringues. Les seringues peuvent être fournies avec ou sans aiguille. Une seringue comprendra une dose unique de la composition, tandis qu'un flacon peut comprendre une dose unique ou de multiples doses.

Les compositions aqueuses de saccharides de l'invention conviennent pour reconstituer d'autres vaccins à partir d'une forme lyophilisée. Lorsqu'une composition de l'invention doit être utilisée pour cette reconstitution extemporanée, l'invention vise un procédé de reconstitution d'un tel vaccin lyophilisé, comprenant l'étape de mélange du matériau lyophilisé avec une composition aqueuse de l'invention. Le matériau reconstitué peut être utilisé pour une injection.

Les compositions peuvent comprendre un agent antimicrobien, en particulier si elles sont conditionnées dans un format à doses multiples.

Les compositions peuvent comprendre un détergent, par exemple un Tween (polysorbate), tel que le TWEEN 80 (TM) . Des détergents sont généralement présents à de faibles niveaux (par exemple >0,01 %).

Les compositions peuvent comprendre des sels de sodium (par exemple du chlorure de sodium) pour donner une certaine tonicité. Une concentration de 10±2 mg/mL de NaCl est typique.

Les compositions comprendront généralement un tampon. Un tampon de phosphate est typique.

Les compositions peuvent comprendre un alcool de sucre (par exemple le mannitol) ou un disaccharide (par exemple le saccharose ou le tréhalose) par exemple à raison d'environ 15 à 30 mg/mL (par exemple, 25 mg/mL), en particulier si elles doivent être lyophilisées ou si elles comprennent un matériau qui a été reconstitué à partir d'un matériau lyophilisé. Le pH de la composition pour la lyophilisation peut être ajusté à environ 6,1 avant lyophilisation.

Des conjugués peuvent être administrés conjointement avec d'autres agents immunorégulateurs. En particulier, les compositions comprendront habituellement un adjuvant de vaccin. Les adjuvants qui peuvent être utiles avec des compositions de 1'invention sont connus dans la technique.

Utilisations pharmaceutiques L'invention vise également un procédé de traitement d'un patient comprenant l'administration de la composition au patient. Le patient peut présenter un risque vis-à-vis des maladies elles-mêmes ou peut être une femme enceinte (immunisation maternelle). Le patient est de préférence un humain. L'humain peut avoir n'importe quel âge, par exemple, plus petit que 2 ans, de 2 à 11 ans, de 11 à 55 ans, plus âgé que 55 ans, etc. L'invention vise également la composition pour utilisation en thérapie. L'invention vise également l'utilisation de la composition dans la fabrication d'un médicament pour le traitement d'une maladie. De préférence, la maladie est 1'influenza ou la pneumonie.

Les compositions seront généralement administrées directement à un patient. Une délivrance directe peut être réalisée par injection parentérale (par exemple, par voie transcutanée, sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse, intramusculaire ou dans l'espace interstitiel d'un tissu) ou encore par voie rectale, buccale, vaginale, optique, transdermique, intranasale, oculaire, auriculaire, pulmonaire ou autre administration mucosale. Une administration intramusculaire (par exemple à la cuisse ou au bras supérieur) est préférée. L'injection peut se faire via une aiguille (par exemple une aiguille hypodermique), mais une injection sans aiguille peut également être utilisée. Une dose intramusculaire typique est de 0,5 mL. L'invention peut être utilisée pour déclencher une immunité systémique et/ou mucosale.

Un traitement de dosage peut être un programme à dose unique ou un programme à doses multiples. Les doses multiples peuvent être utilisées dans un programme d'immunisation primaire et/ou dans un programme d'immunisation de rappel. Un programme de doses principales peut être suivi d'un programme de doses de rappel. Une synchronisation appropriée entre les doses d'amorçage (par exemple entre 4 et 6 semaines) et entre amorçage et rappel peut être déterminée par routine.

Des infections bactériennes affectent diverses zones du corps et les compositions peuvent donc être préparées sous diverses formes. Par exemple, les compositions peuvent être préparées sous la forme injectable, soit en solution ou en suspension liquide. Des formes solides convenant à une solution ou à une suspension dans des véhicules liquides avant injection peuvent également être préparées (par exemple une composition lyophilisée). La composition peut être préparée pour une administration topique, par exemple sous la forme d'un onguent, d'une crème ou d'une poudre. La composition peut être préparée pour une administration buccale, par exemple sous la forme d'un comprimé ou d'une capsule, ou sous la forme d'un sirop (éventuellement aromatisé). La composition peut être préparée pour une administration pulmonaire, par exemple sous la forme d'un inhalateur en utilisant une poudre fine ou une pulvérisation. La composition peut être préparée sous la forme d'un suppositoire ou d'un pessaire.

La composition peut être préparée pour une administration nasale, auriculaire ou oculaire, par exemple une pulvérisation, des gouttes, un gel ou une poudre (par exemple, réf. 143 et 144). Des compositions injectables sont préférées. Généralités

Le terme « comprenant » vise le terme « incluant » ainsi que « consistant en », par exemple, une composition « comprenant » X peut être constituée exclusivement de X ou peut comprendre quelque chose de plus, par exemple X + Y. L'expression « constitué essentiellement de » signifie que le procédé ou la composition comprend des étapes supplémentaires et/ou des parties qui ne modifient pas matériellement les caractéristiques nouvelles de base du procédé ou de la composition revendiqués. L'expression « constitué de » est généralement adoptée pour signifier que l'invention telle qu'elle est revendiquée est limitée aux éléments spécifiquement mentionnés dans la revendication (et peut comprendre leurs équivalents, pour autant que la doctrine des équivalents soit applicable).

Le terme « environ » en rapport avec une valeur numérique x signifie, par exemple, x±10 %.

Le terme « sensiblement » n'exclut pas « complètement », par exemple une composition qui est « sensiblement exempte » de Y peut être complètement exempte de Y. Lorsque cela s'avère nécessaire, le mot « sensiblement » peut être omis de la définition de 1'invention.

Lorsque l'invention fournit un procédé impliquant de multiples étapes séquentielles, l'invention peut également fournir un procédé impliquant moins du nombre total d'étapes. Par exemple, si un saccharide a déjà été partiellement purifié en éliminant les acides nucléiques et/ou les protéines de contamination, cette étape peut être omise des procédés de l'invention. De manière similaire, une étape d'élimination de contaminants peut être réalisée pour donner un matériau prêt à une précipitation médiée par un détergent, mais la précipitation ne doit pas être réalisée. L'étape de précipitation ne doit pas être réalisée pour entrer dans le cadre de l'invention, car le matériau de préprécipitation a une utilité comme intermédiaire dans la préparation de saccharides et peut être utilisé, stocké, exporté, etc. pour un usage ultérieur, par exemple, pour une précipitation ultérieure. Ces différentes étapes peuvent être réalisées à des moments très différents par différentes personnes dans différents endroits (par exemple dans différents pays).

Il est à noter que des cycles de sucre peuvent exister en forme ouverte et fermée et que, si des formes fermées sont illustrées dans les formules structurelles de la présente demande, des formes ouvertes sont également visées par l'invention. De la même manière, il est à noter que des sucres peuvent exister sous forme de pyranose et de furanose et que, tandis que les formes de pyranose sont représentées dans les formules structurelles de la présente demande, les formes de furanose sont également visées. Différentes formes anomères de sucres sont également visées.

Exemples

Pour illustrer les procédés de la présente demande, on a étudié la souche Streptoccus agalactiae 18RS21, qui produit des polysaccharides de sérotype II isolés de patients atteints de la maladie de GBS.

Exemple 1

Cet exemple montre un exemple de protocole de purification qui fournit des rendements beaucoup plus élevés que cela n'a été précédemment possible pour des polysaccharides GBS de type II.

Isolement et purification de polysaccharides GBS de type II

Des polysaccharides GBS naturels de type II ont été extraits et purifiés à partir de bactéries en utilisant les étapes de traitement suivantes (se référer à la Fig. 2) :

Fermentation bactérienne : une souche de GBS de type II a été soumise à une croissance pour obtenir un milieu complexe. On peut utiliser n'importe quel procédé de culture bien que l'on préfère une culture par fermentation comme décrit dans la présente demande.

Inactivation de la biomasse en fermentation et extraction des polysaccharides (traitement de base) : si nécessaire, la biomasse peut être chauffée pour l'amener à température ambiante. De 1'hydroxyde de sodium (4 M) a été ajouté à la biomasse récupérée en concentration finale de 0,8 M et mélangé jusqu'à homogénéité. La suspension a été ensuite incubée à 37 °C pendant 36 heures tout en mélangeant.

Neutralisation de la biomasse : après extraction avec le traitement par la base, on a ajouté une base TRIS 1 M en concentration finale de 50 mM et la suspension a été mélangée jusqu'à homogénéité. Le pH du mélange a été ajusté à 7,8 avec du HCl (6 M) (dilution 1:1 de l'acide concentré).

Précipitation alcoolique : 2 M de CaCl2 ont été ajoutés en concentration finale de 0,1 M (52,6 mL par 1 L de mélange neutralisé) et la suspension a été mélangée jusqu'à homogénéité. De l'éthanol (96 % (v/v)) a été ajouté en concentration finale de 30 % (v/v) d'éthanol (428 mL par 1 L) et la suspension a été mélangée jusqu'à homogénéité.

Microfiltration tangentielle : le mélange a été diafiltré avec une membrane de 0,22 pm (Hydrosart Sartorius) pour éliminer le précipité. Tout d'abord, la biomasse a été concentrée jusqu'à un volume de travail de 50 à 7 5 mL, puis diafiltrée avec un tampon de NaCl 1 M, TRIS 100 mM, CaCl2 100 mM, EtOH 30 % (6 cycles de lavage).

Première dia filtration tangentielle de 30 kDa : le matériau a été diafiltré sur une membrane de cellulose de 30 kDa (Sartorium Sartocon Hydrosart 0,1 m2) contre 16 volumes de TRIS 50 mM + NaCl 0,5 M tamponné à pH 8,8, puis contre 8 volumes de NaPi 10 mM tamponné à pH 7,2.

AcONa : les contaminants encore présents sur le rétentat ont été traités par addition par précipitation en ajoutant 400 mM d'AcONa à pH 4,4 (1/5 volume). Le mélange a été modérément mélangé pendant 15 à 20 minutes à température ambiante, puis stérilisé par filtration en utilisant un filtre de 0,45/0,2 pm (filtre Sartorius Sartobran). Le matériau a été ensuite stocké à 2 à 8 °C jusqu'à ce qu'il soit nécessaire (max 15 jours).

Seconde diafiltration tangentielle de 30 kDa : le matériau a été diafiltré sur une membrane de cellulose de 30 kDa (Sartorius Sartocon Hydrosart 0,1 m2) contre 10 volumes de Na2Co3 300 mM + NaCl 300 mM tamponné à pH 8,8.

Filtration avec un filtre adhérant aux protéines : le matériau a été passé à travers un filtre de charbon activé (un filtre ZetaCarbon™ de 3M) pour éliminer les contaminants protéiques résiduels. Ré-N-acétylation de polysaccharide : une solution mère d'anhydride acétique a été préparée dans les proportions suivantes : 4,15 mL d'anhydride acétique par L avec un rapport de l'anhydride acétique à l'éthanol de 1:1. Une solution mère d'anhydride acétique fraîche a été ajoutée à la solution de polysaccharide diluée jusqu'à 2 mg/mL dans un rapport de plus de 22:1 d'anhydride acétique au motif récurrent de polysaccharide. Le matériau a été incubé sous mélange pendant 2 heures à température ambiante. Le mélange a été contrôlé à la fin des 2 heures pour vérifier qu'il était de ~ 8,8.

Diafiltration tangentielle finale de 10 kDa : le matériau a été diafiltré sur une membrane de cellulose de 10 kDa (Sartorius Sartocon Hydrosart 0,1 m2) contre 16 volumes de KPi tamponné à raison de 10 mM à pH 7,2. Du PSII purifié a été filtré à raison de 0,22 pm avec un filtre à seringue jetable (NALGENE®, PES) et stocké à +4/8 °C.

Procédés analytiques

Essais chimiques par voie humide : la teneur en saccharide a été déterminée par l'essai chimique par voie humide à l'acide sialique [78]. L'échantillon a été hydrolysé dans du HCl à 80 °C pendant 90 minutes, neutralisé avec du NaOH et injecté dans un système DIONEX™. Les données sont traitées par le logiciel CHROMELEON™. Les saccharides ont été élués en utilisant un gradient linéaire de sept minutes de 90:10 à 60:40 avec 0,1 M de NaOH, 0,1 M d'acétate de Na:0,1 M de NaOH, 0,5 M de NaN03 sur une colonne de CarboPac PA1 avec une garde de PA1 à un débit de 1,0 mL/min. L'acide sialique libre a été déterminé en injectant l'échantillon de polysaccharide solubilisé dans de l'eau à raison de 1,0 mg/mL sans hydrolyser l'échantillon. De cette manière, il a été possible de séparer l'acide sialique libre de l'acide sialique lié. Dans l'échantillon de polysaccharide, l'acide sialique libre n'est pas détecté. Le pic à l'étape de régénération était le polysaccharide non hydrolysé. L'acide sialique libre est un paramètre important du fait qu'il est en rapport avec une réponse immunitaire.

La teneur en protéines résiduelle a été déterminée par un kit commercial MicroBCA (TM) (Pierce). La teneur en acides nucléiques résiduelle a été déterminée en suivant le procédé publié dans la référence 79.

La teneur en polysaccharide du groupe B résiduelle a été déterminée en déterminant les résidus de rhamnose et en utilisant un procédé basé sur l'analyse par HPAEC-PAD. Le rhamnose est un saccharide spécifique dans les hydrates de carbone du groupe B qui n'est pas trouvé dans les polysaccharides types et il a été utilisé pour déterminer la concentration de résidus d'hydrates de carbone contaminants après une purification des polysaccharides capsulaires.

Des échantillons et des standards ont été hydrolysés dans du TFA 2 N à 100 °C pendant 3,0 heures, puis évaporés dans un SpeedVac et reconstitués avec 450 pL de H20. La plage de la courbe standard du rhamnose est de 1,0 à 10,0 pg/mL. Les conditions chromatographiques étaient une colonne de CarboPac PA1 avec une garde PA1 à débit de 1,0 mL/min de NaOH 12 mM pendant 15 minutes suivies de 5 minutes de régénération avec du NaOH 500 mM, puis rééquilibrage dans du NaOH 12 mM pendant 25 minutes. Résultats et discussion

Le nouveau procédé de purification (Fig. 2) fournit des améliorations pour purifier des polysaccharides de type II du GBS. En comparaison du procédé de l'état de la technique où une membrane de cellulose de 30 kDa est utilisée à l'étape de filtration finale, le nouveau procédé de purification récupère un rendement beaucoup plus élevé, tandis que tous les contaminants potentiels principaux (protéines, acides nucléiques et polysaccharide du qroupe B) restent bas (comparer les rangées « post-N-acétylation ret UF 30K » et « post-N-acétylation perm UF30K et ret 10K pool » dans le tableau 1, page 25) . Le nouveau procédé de purification peut être utilisé pour fabriquer des matériaux cliniques et commerciaux tirés de ces polysaccharides capsulaires.

Le nouveau procédé de purification fournit également des rendements reproductibles (tableau 2), une identité, une conformité et une pureté (tableau 3) à chaque étape de purification entre différents lots.

Tableau 2. Rendement entre différents lots à chaque étape du procédé de purification

Tableau 3. Identité, conformité et pureté entre différents lots en utilisant le procédé de purification de l'invention

Exemple 2

Le poids moléculaire relatif et la taille particulaire du polysaccharide capsulaire GBS de type II ont été étudiés. Les tailles particulaires des polysaccharides capsulaires GBS de types Ia, Ib, III et V ont été également déterminées.

Procédés analytiques

Analyse RMN : des échantillons de polysaccharides purifiés ont été préparés en dissolvant la poudre dans 1 mL d'oxyde de deutérium (D2O, Aldrich) en concentration uniforme. Des fractions aliquotes (750 μΒ) d'échantillon ont été transférées dans des tubes RMN de 5 mm (Wilmad). Les expériences de 1H RMN ont été enregistrés à 25 °C sur un spectromètre Bruker de 600 MHz et en utilisant une sonde à bande large de 5 mm (Bruker) . Pour l'acquisition et le traitement des données, on a utilisé la suite logiciel XWINNMR (Bruker). Des spectres RMN de proton 1-D ont été recueillis en utilisant un essai standard à une pulsion avec 32 balayages. L'émetteur a été réglé à la fréquence HDO (4,79 ppm). Des spectres 1H RMN ont été obtenus en matière quantitative en utilisant un temps de recyclage total pour assurer une pleine récupération de chaque signal (5 x temps de relaxation longitudinale Ti) .

Des spectres RMN d'homo- et hétérocorrélation 2-D ont été enregistrés pour affecter les profils RMN de proton 1-D. L'affectation d'un pic a été également confirmée par comparaison avec les données publiées [80].

Diffusion statique de la lumière (MALLS) : cette technique détermine le rayon quadratique moyen (RMS) ou « rayon de giration » Rg d'une molécule. Il s'agit de la distance moyenne en masse de chaque centre de diffusion depuis le centre de gravité de la molécule. Ce procédé prend en compte l'intensité de la lumière diffusée moyenne et est indépendant du solvant et du temps (se référer à la Réf. 81).

Diffusion dynamique de la lumière (DLS) : cette technique mesure le rayon hydrodynamique Rh d'une molécule. C'est le rayon d'une sphère ayant le même coefficient de diffusion que la molécule. Ce procédé prend en compte les fluctuations de l'intensité de la lumière diffusée et dépend du temps et de la viscosité du solvant (se référer à la Réf. 81). Résultats et discussion

Le poids moléculaire moyen pour le polysaccharide capsulaire GBS de type II estimé par chromatographie à exclusion de tailles était de ~270 à 420 kDa (tableau 4). L'identité structurelle des polysaccharides capsulaires GBS de type II a été confirmée par spectroscopie 1H RMN (données non illustrées).

Tableau 4. Poids moléculaire d'un polysaccharide capsulaire GBS de type II

Les mesures de tailles particulaires sont fournies dans le tableau 5 ci-dessous. Dans des objets compacts, la masse est proche du centre de la masse. Rg est plus petit que Rh et Rg/Rh<l. Pour un objet étendu, Rg' est fortement influencé par les masses éloignées, mais le rayon hydrodynamique Rh est moins fortement influencé. Le rapport de Rg à Rh augmente à mesure que l'objet devient moins compact (Rg/Rh>l).

Tableau 5. Tailles particulaires des saccharides capsulaires GBS déterminées par MALLS et DLS

Le polysaccharide capsulaire GBS de type II purifié par croissance bactérienne de la souche 18RS21 présentait un rayon hydrodynamique (PM apparent en chromatographie d'exclusion stérique d'écoulement à travers une membrane de filtration) inférieur à la valeur attendue en considérant son PM absolu (>200 kDa comme estimé par analyse SEC-MALLS).

Le comportement inhabituel d'un saccharide capsulaire GBS de type II en comparaison d'autres types GBS de saccharides capsulaires (c'est-à-dire, la, Ib, III et V) est probablement dû à l'aménagement différent des monosaccharides constituant le motif récurrent. Comme exemple, tandis que, pour les saccharides capsulaires GBS de types la et Ib, la branche est composée de trois monosaccharides (en dehors des cinq sucres totalement contenus), pour un saccharide capsulaire GBS de type II, la branche contient un monosaccharide seulement. La branche plus courte confère probablement une conformation plus linéaire et, par suite, un empêchement stérique réduit. Résumé L'étape de filtration tangentielle finale du protocole classique pour la purification des saccharides capsulaires GB'S est habituellement réalisée par un filtre à seuil de coupure de 30 kDa (par exemple, se référer à la réf. 2) . Les inventeurs ont déterminé le poids moléculaire moyen pour le polysaccharide capsulaire GBS de type II qui serait de ~270 à 420 kDa, si bien que l'on s'attendait à ce que ce polysaccharide capsulaire soit retenu par un filtre de 30 kDa. Cependant, comme montré dans l'exemple 1, on a constaté non sans surprise qu'une grande quantité (~50 %) du polysaccharide capsulaire GBS de type II passait à travers le filtre de 30 kDa à l'étape de filtration tangentielle finale du protocole de purification (tableau 1). Les inventeurs ont constaté non sans surprise que le polysaccharide capsulaire GBS de type II a un rayon hydrodynamique inférieur en comparaison des autres types GBS de saccharides capsulaires (c'est-à-dire Ia, Ib, III et V) . Par suite, le remplacement du filtre à l'étape de filtration tangentielle finale de l'écoulement du protocole de purification classique par un filtre à seuil de coupure PM plus bas, par exemple par un filtre à seuil de coupure de 10 kDa, est particulièrement avantageux pour retenir le polysaccharide capsulaire GBS de type II. Le procédé de l'invention fournit donc un rendement plus élevé du polysaccharide capsulaire GBS de type II.

Il est entendu que l'invention a été décrite à titre d'exemple uniquement et que des modifications peuvent y être apportées tout en restant dans la portée et l'esprit de l'invention. Références [1] Ada &amp; Isaacs (2003) Clin Microbiol Infect 9:79-85.

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Tableau 1. Caractérisation à chaque étape du procédé de purification de l'exemple 1

Claims (27)

1. REVENDICATIONS

   1. Procédé de purification d'un polysaccharide capsulaire GBS de type II comprenant une étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape de filtration est une étape d'ultrafiltration.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel l'étape de filtration entraîne une diafiltration.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la filtration est transversale ou tangentielle.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape de filtration utilise une membrane de cellulose.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape de filtration utilise une membrane avec un seuil de coupure <25 kDa.
7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape de filtration utilise une membrane avec un seuil de coupure d'environ 10 kDa.
8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une ou plusieurs étapes supplémentaires est ou sont effectuées avant l'étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa, comprenant les étapes consistant à : (a) fournir un isolat brut contenant le polysaccharide capsulaire ; (b) éliminer un précipité alcoolique formé par mise en contact de l'isolat brut avec une solution alcoolique ; et (c) éliminer les contaminants de protéines avec un filtre adhérant aux protéines.
9. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une ou plusieurs étapes supplémentaires est ou sont effectuées après l'étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa, comprenant la précipitation du polysaccharide capsulaire purifié.
10. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une ou plusieurs étapes supplémentaires est ou sont effectuées après l'étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa, comprenant la conjugaison du polysaccharide capsulaire avec une protéine véhiculaire, par exemple l'anatoxine diphtérique, l'anatoxine tétanique ou le CRMi97.
11. 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une ou plusieurs étapes supplémentaires est ou sont effectuées après l'étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa, comprenant la formulation d'un vaccin avec le polysaccharide capsulaire comme composant.
12. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel une ou plusieurs étapes supplémentaires est ou sont effectuées après l'étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa, comprenant le mélange avec un ou plusieurs polysaccharides capsulaires d'un sérotype GBS choisi dans le groupe constitué de Ia, Ib, III, IV, V, VI, VII et VIII, éventuellement dans lequel le ou les polysaccharides capsulaires est ou sont conjugués avec une ou des protéines véhiculaires, par exemple l'anatoxine diphtérique, l'anatoxine tétanique ou le CRM197.
13. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le procédé comprend plus d'une étape de filtration et l'étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa est l'étape de filtration finale.
14. 14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel le procédé comprend plus de deux étapes de filtration et l'étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa est l'étape de filtration finale.
15. 15. Procédé selon la revendication 13 ou la revendication 14, dans lequel l'étape de filtration finale utilise une membrane avec un seuil de coupure d'environ 10 kDa.
16. 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, dans lequel le procédé comprend : (i) une étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure d'environ 30 kDa ; (ii) une autre étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure d'environ 10 kDa.
17. 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, dans lequel le procédé comprend : (i) une étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure d'environ 30 kDa ; (ii) une autre étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa ; et (iii) une autre étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure d'environ 10 kDa.
18. 18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, dans lequel chaque étape utilise un tampon différent.
19. 19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel les tampons sont choisis parmi des tampons comprenant NaPi, Na2C03 ou KPi.
20. 20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, dans lequel l'étape (i) est tamponnée avec un tampon comprenant du NaPi ; l'étape (ii) est tamponnée avec un tampon comprenant du Na2CC>3 ; et l'étape (iii) est tamponnée avec un tampon comprenant du KPi.
21. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 20, dans lequel le procédé comprend une ou plusieurs ou la totalité des étapes suivantes : (i) une étape de microfiltration qui utilise une membrane ^0,65 pm ; (ii) une étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa ; (iii) une étape de filtration qui utilise une membrane de 0,45 à 0,22 pm ; (iv) une étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa ; (v) une étape de filtration qui utilise un filtre adhérant aux protéines ; (vi) une étape de filtration qui utilise une membrane avec un seuil de coupure d'environ 10 kDa ; (vii) une étape de microfiltration qui utilise un filtre à seringue jetable de 0,22 μιη.
22. 22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel toutes les étapes sont effectuées en séquence.
23. 23. Procédé selon la revendication 21, dans lequel l'étape (iii) de la revendication 21 comprend l'addition d'AcONa.
24. 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, dans lequel l'étape (v) de la revendication 21 utilise un filtre de charbon.
25. 25. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la ré-N-acétylation du polysaccharide est effectuée avant l'étape de filtration finale qui utilise une membrane avec un seuil de coupure de moins d'environ 30 kDa.
26. 26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 25, dans lequel le procédé comprend en outre : (a) la fourniture d'un isolat brut contenant le polysaccharide capsulaire ; (b) l'élimination d'un précipité alcoolique formé en mettant en contact l'isolat brut avec une solution alcoolique ; (c) la réalisation des une ou plus d'étapes de filtration selon l'une quelconque des revendications 13 à 25.
27. 27. Composition comprenant un polysaccharide capsulaire GBS de type II qui peut être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.