BE1025162A9 - Procede de purification pour les polysaccharides capsulaires - Google Patents

Abstract

Il est fourni des procédés de purification appropriés pour la purification des polysaccharides capsulaires bactériens de souches de Streptococcus.

Description

PROCEDE DE PURIFICATION POUR LES POLYSACCHARIDES CAPSULAIRES

Domaine de 1¹ invention [0001] Cette invention se situe dans le domaine de la production de polysaccharides capsulaires bactériens, et concerne de nouveaux procédés de purification.

Contexte de 1¹ invention [0002] Les polysaccharides capsulaires (PSC) sont des immunogènes trouvés sur la surface de certaines bactéries pathogènes impliquées dans des maladies humaines et non humaines. Cette caractéristique a conduit les PSC à être un composant important dans la conception de vaccins. Les PSC se sont révélés utiles dans le déclenchement de réponses immunitaires spécialement lorsqu'ils sont liés à des protéines de support (référence 1).

[0003] Divers procédés de production à grande échelle pour le développement de bactéries par fermentation sont connus, tels que la culture fermée dans un milieu complexe, par exemple, pour la production

BE2017/5905 de polysaccharides capsulaires de Streptococcus du groupe B (S. agalactiae), Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae (pneumocoque) et Haemophilus influenza ; la culture alimentée, par exemple, pour la production de PSC de H. influenzae ; et la culture continue, par exemple, pour la production de PSC de Streptococcus du groupe B et Lactobacillus rhamnosus. (Références 2 à 7).

[0004] Il existe un besoin de procédés efficaces qui peuvent être utilisés pour augmenter le pourcentage relatif des PSC dans une composition, par élimination préférentielle des composants non-PSC (contaminants) tels que les protéines et les acides nucléiques cellulaires. Un tel procédé est utile dans la production de polysaccharides capsulaires bactériens, y compris de ceux provenant de S. agalactiae, à la suite d'une culture et/ou d'une fermentation. De tels procédés sont appelés ici purification, ou étape de purification.

Résumé de 1'invention [0005] La présente invention fournit un procédé d'élimination des protéines à partir d'une solution, où la solution contient à la fois des polysaccharides capsulaires bactériens (PSC) et des protéines bactériennes.

Le procédé comprend une étape de filtration de la solution en utilisant une chromatographie (une étape de chromatographie), dans laquelle la phase stationnaire de la chromatographie est une résine polymère particulaire (sous la forme de petites particules séparées).

BE2017/5905 [0006] Dans un mode de réalisation, la chromatographie est réalisée en utilisant une chromatographie sur colonne.

[0007] Dans un mode de réalisation, la résine polymère particulaire est sous la forme de particules sphériques (l'homme du métier comprendra que de telles particules ne seront pas parfaitement sphériques et varieront dans une certaine mesure en diamètre et irrégularités de surface).

[0008] Dans un autre mode de réalisation, la résine polymère est faite de polystyrène, de polydivinylbenzène, de copolymères de divinylbenzène et de styrène, ou de styrène et de divinylbenzène réticulés.

[0009] Dans un autre mode de réalisation, la résine polymère particulaire présente une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : (a) le diamètre d'un échantillon représentatif desdites particules sphériques

se situi	e dans la	plage de	300	μm	à 1500 μm,	500	μm à
750 μm,	560 μm à	710 μm,	350	à	600 μm, ou	350	μm à
1200 μm	; (b) non	ionique ;	(c)	stable dans une	plage de
valeurs	de pH de 0	à 14, 0	à 12,	1	à 14, là 12	, 2	à 14,

ou 2 à 12 ; (d) contient des pores d'un diamètre moyen d'approximativement 100 Angströms (Ä) , d'approximativement 200 Ä, d'approximativement 350 Ä, d'approximativement 600 Ä, d'approximativement 700 Ä, ou d'approximativement 1100 Ä, (e) contient des pores avec une plage de diamètres, dans la plage de 200 Ä à 250 Ä, 200 Ά à 300 Ä, 300 Ά à 400 Ä, ou 300 Ά à 500 Ά ; et/ou (f) contient des macropores d'un diamètre situé dans la plage de 10 microns à 200 microns.

BE2017/5905 [0010] Dans un mode de réalisation, la résine polymère est sous la forme de particules sphériques faites de styrène et de divinylbenzène réticulés et ayant des diamètres situés dans la plage de 35 à 120 μm et une taille de pore située dans la plage de 200 à 300 Â.

	[0011]	Dans	un mode de	réalisation, au moins	50 %,
60	%, 70 %,	80 %	, 85 %, 87	%, 90 %, 91 %, 92 %,	93 %,
94	%, 95 %,	96 %,	97 %, 98 %,	çÿ 0} o, 9 9 2 ^ 9 9 5 ^	99,9 %

ou 100 % des protéines sont éliminées de la solution par l'étape de chromatographie.

	[0012]	Dans	un	mode de réalisation, au	moins 50	o θ r
60	%, 70 %,	80 %	, 8	5 %, 87 %	, 90 %, 91 %,	92 %, 93	o θ r
94	%, 95 %,	96 %,	97	%, 98 %,	99 % ou 100 %	des PSC dans
la	solution sont	retenus	dans 1'éluat	après	la
chromatographie.
	[0013]	Dans	un	mode de	réalisation,	1'étape	de

filtration de la solution utilisant une chromatographie, dans laquelle la phase stationnaire de la chromatographie est une résine polymère particulaire, aboutit à l'élimination d'au moins 90 % des protéines dans la solution, tout en retenant au moins 80 %, 83 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, ou 95 % des PSC dans la solution.

[0014] Dans un mode de réalisation, l'étape de filtration utilisant une chromatographie a un effet minimal sur la polydispersité des PSC. L'indice de polydispersité est utilisé comme mesure de la largeur de la distribution des masses moléculaires d'un polymère, et est défini par : Indice de polydispersité = Mw/Mn. Plus l'indice de polydispersité est grand, plus les masses moléculaires sont larges. Un polymère monodispersé où toutes les longueurs des chaînes sont égales (comme une protéine) a un Mw/Mn = 1. Dans un mode de réalisation de la présente invention, la différence de masse moléculaire entre le matériau de départ et

BE2017/5905

1'éluat	est	inférieure à environ	10 %,	inférieure	à
environ	8 %	, inférieure à environ	5 %,	inférieure	à
environ	3 %,	inférieure à environ 2	%, ou	inférieure	à
environ	1 %.
[0015]	Dans un mode de réalisation,	la solution	à

filtrer comprend un tampon à environ pH 8, éventuellement un tampon phosphate de sodium (NaPi).

[0016] Dans un mode de réalisation, l'étape de filtration de la solution utilisant une chromatographie débute à une densité de charge des protéines de 0,5 à 4,0 mg de protéines totales (PT) par millilitre de résine particulaire.

[0017] Dans un mode de réalisation, l'étape de filtration de la solution utilisant une chromatographie débute à une densité de charge des PSC de 40 à 60 mg de polysaccharides totaux par millilitre de résine particulaire.

[0018] Dans un mode de réalisation, le procédé ne comprend pas d'étape de traitement par un détergent cationique pour précipiter les polysaccharides capsulaires. De façon particulière, le procédé ne comprend pas d'étape de déprotéinisation utilisant du phénol. Certains polysaccharides sont sensibles à 1'hydrolyse.

Par conséquent, lorsqu'il est utilisé pour les GBS en particulier, le procédé ne comprend pas d'étape

BE2017/5905 d'abaissement du pH, par exemple à moins de 4,5, pour précipiter les protéines et les acides nucléiques.

[0019] Dans un mode de réalisation, l'étape de chromatographie est précédée d'une précipitation alcoolique des protéines et/ou des acides nucléiques contaminants, et ensuite d'une diafiltration.

[0020] Dans un mode de réalisation, l'étape de chromatographie est suivie d'une ré-N-acétylation des PSC, et d'une diafiltration.

[0021] Dans un mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes : (a) la fourniture d'une composition contenant des polysaccharides capsulaires bactériens (PSC) et des protéines bactériennes ; (b) la mise en contact de la composition avec une solution alcoolique, et l'élimination de tout précipité qui se forme ; (c) le maintien du matériau non précipité issu de l'étape (b) en solution et la filtration de la solution pour éliminer les composés de masse moléculaire plus petite tout en retenant les polysaccharides capsulaires en solution ; et (d) le recueil du filtrat issu de l'étape (c) et l'élimination par chromatographie des contaminants protéiniques à partir dudit filtrat, en utilisant une phase stationnaire de résine polymère, pour fournir des polysaccharides capsulaires purifiés.

Ce procédé peut comprendre en outre une étape (e) de ré-N-acétylation des polysaccharides de précipitation capsulaires purifiés, une étape (f) des polysaccharides capsulaires polysaccharides capsulaires avec une protéine de support.

purifiés, et une étape (g) de conjugaison des

BE2017/5905 [0022] Dans un mode de réalisation le procédé de l'invention comprend la mise en contact de la composition avec une solution alcoolique pour atteindre une concentration d'alcool suffisante pour précipiter les contaminants d'acides nucléiques mais pas pour précipiter les polysaccharides capsulaires. La solution alcoolique peut comprendre de l'éthanol, et éventuellement comprendre en outre du CaC12. Dans un mode de réalisation, la solution alcoolique est ajoutée pour atteindre une concentration située entre environ 10 % et environ 50 % d'éthanol, ou une concentration d'environ 30 %.

[0023] Dans un mode de réalisation de la présente invention, le polysaccharide capsulaire bactérien est un PSC de Streptococcus agalactiae. Le PSC de Streptococcus agalactiae peut être choisi parmi les sérotypes la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII et IX, par exemple, la, Ib et III ; la, Ib, II, III et V ; la, Ib, II, III, IV et V ; la, Ib, II, III, IV, V et VI.

[0024] La quantité des protéines dans une solution, comme dans un éluat chromatographique obtenu en utilisant un procédé de la présente invention, peut être mesurée par tout procédé approprié, comme le test BCA tel que décrit ici. La quantité des PSC dans une solution, comme dans un éluat chromatographique obtenu en utilisant un procédé de la présente invention, peut être mesurée par tout procédé approprié, comme des procédés décrits ici.

[0025] En particulier, les inventeurs ont découvert que la séparation chromatographique des PSC des contaminants, particulièrement des contaminants

BE2017/5905 protéiniques, peut être réalisée de façon efficace en utilisant une résine comme phase stationnaire de la chromatographie. Dans un aspect, la chromatographie est une chromatographie sur colonne. Les résines appropriées pour une utilisation dans la présente invention comprennent des résines polymères faites de polystyrène, de polydivinylbenzène, de copolymères de divinylbenzène et de styrène, ou de styrène et de divinylbenzène réticulés. La résine est appropriée sous la forme d'une sphère ou d'une bille, où le diamètre de la particule (dans un échantillon représentatif des billes de résine) se situe dans la plage de 300 μm à 1500 μm, de 500 μm à 750 μm, de 5 60 μm à 710 μm, de 350 à 600 μm, ou de 35 0 μm à 1200 μm.

[0026] L'étape chromatographique peut être combinée avec une ou plusieurs des étapes décrites ici, y compris une précipitation alcoolique et un échange de cations, une diafiltration, une ré-N-acétylation, et une conjugaison à une molécule de support. L'invention envisage spécifiquement un procédé de purification de polysaccharides capsulaires bactériens, tels que provenant de Streptococcus agalactiae, comprenant une étape de filtration chromatographique en utilisant un matériau de résine comme phase stationnaire, où le procédé ne comprend pas (soit avant soit à la suite de la chromatographie) une étape de traitement par un détergent cationique pour précipiter le polysaccharide capsulaire suivie d'une étape de resolubilisation du polysaccharide capsulaire.

[0027] L'invention fournit en outre des procédés pour purifier des polysaccharides capsulaires (PSC) sur une échelle industrielle. L'espèce préférée de

Streptococcus est Streptococcus agalactiae, également appelé Streptococcus du groupe B ou GBS de Lancefield, en particulier, les souches 090, H36b, CBJ111, ou M781.

[0028] Dans le présent procédé, la solution alcoolique est ajoutée à une concentration suffisante

BE2017/5905 pour précipiter les contaminants du type acides nucléiques mais pas les polysaccharides capsulaires.

Dans des modes de réalisation préférés, l'alcool est l'éthanol et est ajouté de préférence à une concentration située entre environ 10 % et environ 50 % d'éthanol, de façon davantage préférée une concentration située d'environ 30 % d'éthanol.

La solution alcoolique peut comprendre éventuellement un cation, de préférence un cation métallique, de façon davantage préférée un cation bivalent, de façon préférée entre toutes du calcium.

Brève description des figures [0029] La figure 1 est une représentation schématique de la liaison des polysaccharides capsulaires (PSC) de Streptococcus du groupe B et de la molécule de glucide du groupe B.

[0030] La figure 2 représente la structure de la bille de résine AMBERLITE™XAD ; chaque bille est un conglomérat de microsphères.

[0031] Les figures 3A et

3B montrent les déformations des pics chromatographiques :

(A) « Tailing » (lorsque le profil s'élève brusquement et atteint rapidement le point maximal puis descend lentement vers la ligne de départ) et (B) « Fronting » (lorsque le profil s'élève lentement jusqu'au point

BE2017/5905 maximal et descend rapidement vers le pic de la ligne de départ). Les nombres sont présentés en utilisant une virgule comme séparateur décimal.

[0032] La figure 4 est un diagramme des pourcentages d'élimination des protéines pour diverses résines testées dans la purification chromatographique.

[0033] La figure 5 est un diagramme des pourcentages de rendement (% de récupération) pour diverses résines testées pour la purification chromatographique.

[0034] La figure 6 est un diagramme du pourcentage des protéines éliminées dans différentes conditions de charge. Les densités de charge sont indiquées en utilisant une virgule comme séparateur décimal.

[0035] La figure 7 est un diagramme des pourcentages de rendement en polysaccharides dans différentes conditions de charge.

Description détaillée [0036] Streptococcus agalactiae, également connu sous le nom de streptocoque du groupe B (GBS) , est la cause la plus courante d'une infection sérieuse et d'une méningite chez les bébés âgés de moins de 3 mois. Le GBS est habituellement transmis de la mère au bébé durant la naissance. L'introduction de directives nationales recommandées dans plusieurs pays afin de dépister les femmes enceintes porteuses du GBS, et l'utilisation appropriée d'antibiotiques durant l'accouchement ont significativement réduit l'occurrence de la maladie au cours des premières heures de la vie (infection précoce, EOD) , mais ils n'ont eu aucun effet significatif sur

BE2017/5905 l'infection tardive (LOD) et ne sont pas faisables dans certains pays. La recherche de vaccins contre le GBS est continue.

[0037] Il existe un besoin de procédés efficaces qui peuvent être utilisés pour purifier des polysaccharides bactériens, tels que provenant de S. agalactiae, à la suite d'une culture et/ou d'une fermentation. L'approche illustrée dans le document WO 2007/052168 est basée sur le procédé décrit dans le document WO 2006/082527, qui comprend (a) une étape d'extraction pour extraire le polysaccharide à partir d'une biomasse de fermentation, (b) une étape de précipitation alcoolique pour réduire les acides nucléiques et les protéines contaminants par précipitation, (c) une étape de filtration, telle qu'une diafiltration, pour éliminer le précipité résultant, (d) une étape de précipitation des polysaccharides dans laquelle un traitement avec un détergent cationique est utilisé pour précipiter les polysaccharides, et (e) une étape de resolubilisation des polysaccharides.

[0038] Le traitement d'un mélange de polysaccharides capsulaires du GBS et de polysaccharides spécifiques de groupes avec un détergent cationique mène à une précipitation préférentielle des polysaccharides capsulaires, réduisant la contamination par les polysaccharides spécifiques de groupes. Les détergents pour une utilisation dans la précipitation des polysaccharides solubles comprennent des sels de tétrabutylammonium et de cétyltriméthylammonium (par exemple, les sels bromures) (référence 14). D'autres

BE2017/5905 détergents comprennent le bromure d'hexadiméthrine et des sels de myristyltriméthylammonium.

[0039] Lorsqu'une étape de précipitation par un détergent est utilisée, les polysaccharides (généralement sous la forme d'un complexe avec le détergent cationique) peuvent être resolubilisés, soit dans un milieu aqueux soit dans un milieu alcoolique. Le matériau resolubilisé est purifié par rapport à la suspension pré-précipitation.

[0040] Toutefois, la séparation subséquente du précipité a partir du surnageant (par exemple, par centrifugation) et la resolubilisation des PSC sont laborieuses et peuvent aboutir à la perte de polysaccharides capsulaires, réduisant de cette façon le rendement. L'efficacité du traitement avec un détergent cationique peut également dépendre de la pureté initiale (présence relative) de la composition de polysaccharides capsulaires traitée. Plus la pureté initiale des polysaccharides capsulaires est basse, moins le traitement avec un détergent cationique peut être efficace, limitant encore le rendement.

[0041] Le document WO 2009081276 (PCT/IB2008/003729) décrit un procédé pour la purification d'un polysaccharide capsulaire dans lequel un filtre adhérant aux protéines est utilisé pour séparer les polysaccharides capsulaires des contaminants. L'étape de filtration adhérente aux protéines est utilisée à la place de la précipitation utilisant un traitement avec un détergent cationique (tel que décrit dans les documents WO 2007/052168 et WO 2006/082527) . Le fait d'éviter la précipitation du polysaccharide

BE2017/5905 capsulaire à ce stade du procédé de purification signifie qu'il n'y a pas besoin de séparer le précipité à partir du surnageant, ou de resolubiliser les PSC. Les filtres adhérants peuvent contenir du charbon actif immobilisé dans une matrice. Les exemples d'unités de filtres appropriées comprennent des cartouches de charbon de Cuno Inc. (Meriden, Etats-Unis), tels que des filtres ZETACARBON. Ces filtres de charbon comprennent une matrice cellulosique dans laquelle le charbon actif en poudre est emprisonné et lié à une résine sur place.

[0042] La présente invention fournit un procédé amélioré de purification des PSC qui utilise une étape de filtration sur résine chromatographique, remplaçant le besoin d'une précipitation par un traitement avec un

détergent	cationique	ou	une filtration	utilisant un
filtre de	charbon.	Le	présent procédé	fournit un
rendement	amélioré en	PSC	comparativement à	celui obtenu

en utilisant une filtration sur charbon. En outre, la différence entre la distribution des masses moléculaires des PSC dans le matériau de départ et dans 1'éluat est réduite, comparativement à celle observée en utilisant un filtre de charbon. Plus particulièrement, la différence entre la distribution des masses moléculaires des PSC dans le matériau de départ et dans 1'éluat est inférieure à 10 %, inférieure à 5 %, inférieure à 4 %, inférieure à 3 %, inférieure à 2 % ou inférieure à 1 %. La masse moléculaire est mesurée de préférence en Daltons, par exemple, en kilodaltons (kDa). Ainsi, les procédés de la présente invention ne comprennent ni étape de traitement avec un détergent cationique ni filtration utilisant un filtre de charbon.

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Aperçu du procédé [0043] La production par fermentation des PSC bactériens, et la récupération initiale du matériau contenant les PSC à partir du récipient de fermentation, fournissent le matériau brut pour la purification des PSC. Un tel matériau de départ peut être un culot ou une pâte cellulaire obtenus (par exemple, par centrifugation) à partir d'une biomasse de fermentation. En variante, le matériau peut être le surnageant provenant d'une culture bactérienne centrifugée, car durant la croissance bactérienne en culture, une petite quantité de polysaccharides capsulaires est généralement libérée dans le milieu de culture.

[0044] Le procédé de l'invention peut comprendre une ou plusieurs des étapes suivantes.

(a) Extraction [0045] Une première étape d'extraction peut être utilisée pour libérer les PSC à partir des bactéries (ou à partir d'un matériau contenant les peptidoglycanes bactériens, voir la figure 1) . Des procédés de préparation de polysaccharides capsulaires à partir de bactéries sont connus dans l'art, par exemple, voir les références 8 à 11. Les PSC peuvent être libérés à partir de bactéries par divers procédés, y compris un traitement chimique, physique ou enzymatique.

[0046] Un traitement chimique classique est une extraction par une base (référence 12) (par exemple, en utilisant de 1'hydroxyde de sodium), qui peut cliver la liaison phosphodiester entre le polysaccharide capsulaire et le squelette de peptidoglycane. Toutefois, comme le traitement par une base dés-N-acétyle le

BE2017/5905 polysaccharide capsulaire, une ré-N-acétylation ultérieure peut être nécessaire.

[0047] Une ré-N-acétylation peut être utilisée avec tout procédé de préparation de PSC bactériens, où le procédé dés-N-acétyle le polysaccharide capsulaire.

[0048] Un traitement enzymatique classique implique l'utilisation à la fois de mutanolysine et de ß-Nacétylglucosaminidase (référence 13). Celles-ci agissent sur les peptidoglycanes bactériens pour libérer les polysaccharides capsulaires pour une utilisation avec le procédé de purification de l'invention, mais mènent également à la libération des antigènes glucidiques spécifiques des groupes. Une variante de traitement enzymatique implique un traitement avec une phosphodiestérase de type II (PDE2) . Les enzymes PDE2 peuvent cliver les mêmes phosphates que 1'hydroxyde de sodium (voir ci-dessus) et peuvent libérer les polysaccharides capsulaires sans cliver les antigènes glucidiques spécifiques des groupes et sans dés-Nacétyler les polysaccharides capsulaires, simplifiant de cette façon les étapes en aval. Par conséquent, les enzymes PDE2 sont une option préférée pour préparer des polysaccharides capsulaires. Les polysaccharides capsulaires dés-N-acétylés peuvent être obtenus par extraction avec une base comme il est décrit dans le brevet US No. 6 248 570 (référence 12).

(b) Précipitation alcoolique et échange de cations [0049] Les compositions de polysaccharides capsulaires bactériens obtenues initialement après la culture (par exemple, par extraction) seront généralement impures, contaminées par des acides

BE2017/5905 nucléiques et des protéines bactériens. Ces contaminants peuvent être éliminés par des traitements séquentiels pendant une nuit avec une RNAse, une DNAse et une protéase. Toutefois, en tant que variante préférée, plutôt que d'éliminer de tels contaminants par des enzymes, une étape de précipitation alcoolique peut être utilisée. Si nécessaire (par exemple, après extraction avec une base), les matériaux seront habituellement neutralisés avant l'étape de précipitation alcoolique.

[0050] Les alcools utilisés pour précipiter les acides nucléiques et/ou les protéines contaminants sont de préférence un alcool inférieur, tel que le méthanol, l'éthanol, le propan-l-ol, le propan-2-ol, le butan-1ol, le butan-2-ol, le 2-méthyl-propan-l-ol, le 2-méthylpropan-2-ol, des diols, etc. Le choix d'un alcool approprié peut être testé empiriquement, sans charge excessive, mais des alcools tels que l'éthanol et 1'isopropanol (propan-2-ol) sont préférés, plutôt que des alcools comme le phénol.

[0051] L'alcool est ajouté de préférence à la composition de polysaccharides pour donner une concentration finale en alcool située entre 10 % et 50 % (par exemple, autour de 30 %) . Les concentrations les plus utiles sont celles qui atteignent une précipitation adéquate des contaminants sans également précipiter les polysaccharides. La concentration optimale finale de l'alcool peut dépendre du sérotype bactérien à partir duquel le polysaccharide est obtenu, et peut être déterminée par des expériences de routine sans charge excessive. La précipitation des polysaccharides avec des concentrations d'éthanol > 50 % a été observée.

BE2017/5905 [0052] L'alcool peut être ajouté sous forme pure ou il peut être ajouté sous une forme diluée avec un solvant miscible (par exemple, l'eau). Les mélanges de solvants préférés sont des mélanges éthanol/eau, avec un rapport préféré situé entre autour de 70/30 et autour de 95/5 (par exemple, 75/25, 80/20, 85/15, 90/10).

[0053] Le polysaccharide peut être également traité avec un cation métallique aqueux. Les cations métalliques monovalents et bivalents sont préférés, et les cations bivalents sont particulièrement préférés, tels que Mg, Mn, Ca, etc., car ils sont plus efficaces dans la formation de complexes. Les ions calcium sont particulièrement utiles, et ainsi le mélange alcoolique comprend de préférence des ions calcium solubles. Ceuxci peuvent être ajoutés à un mélange polysaccharide/ alcool sous la forme de sels de calcium, ajoutés soit sous la forme d'un solide soit sous une forme aqueuse. Les ions calcium sont fournis de préférence par l'utilisation de chlorure de calcium.

[0054] Les ions calcium sont présents de préférence à une concentration finale située entre 10 et 500 mM (par exemple, environ 0,1 M) . La concentration finale optimale en Ca peut dépendre de la souche et du sérotype de Streptococcus à partir duquel le polysaccharide est obtenu, et elle peut être déterminée par des expériences de routine sans charge excessive.

[0055] Après la précipitation alcoolique des protéines et/ou des acides nucléiques contaminants, le polysaccharide capsulaire est laissé en solution. Le matériau précipité peut être séparé du polysaccharide par tout moyen approprié, comme par centrifugation. Le

BE2017/5905 surnageant peut être soumis à une microfiltration, comme une filtration frontale (filtration perpendiculaire), afin d'éliminer les particules qui peuvent colmater les filtres dans les étapes ultérieures (par exemple, les particules précipitées avec un diamètre supérieur à 0,22 μm). Comme variante de la filtration frontale, une microfiltration tangentielle peut être utilisée. Par exemple, une microfiltration tangentielle utilisant une membrane cellulosique de 0,2 μm peut être utilisée. L'étape de microfiltration tangentielle est généralement suivie d'une filtration utilisant un filtre de 0,45/0,2 μm.

(c) Piafiltration [0056] Une étape de diafiltration peut être utilisée. Par exemple, si une étape de précipitation alcoolique et d'échange de cations est utilisée (par exemple, comme il est décrit ci-dessus), alors une étape de diafiltration peut être réalisée après la précipitation des protéines et/ou des acides nucléiques. Généralement, une étape de diafiltration est utilisée après la précipitation des protéines et/ou des acides nucléiques, et avant la séparation chromatographique utilisant une matrice de résine comme phase stationnaire [0057] L'étape de diafiltration est particulièrement avantageuse si une extraction par une base ou une phosphodiestérase a été utilisée pour la libération du polysaccharide capsulaire à partir de la bactérie ou du peptidoglycane, car le polysaccharide spécifique du groupe aura été également hydrolysé, fournissant des fragments plus petits que le

BE2017/5905 polysaccharide capsulaire intact. Ces petits fragments peuvent être éliminés par l'étape de diafiltration.

[0058] La diafiltration à flux tangentiel peut être utilisée. La membrane de filtration devra ainsi être une qui permet le passage des produits de l'hydrolyse de l'antigène spécifique du groupe tout en retenant le polysaccharide capsulaire. Un seuil de coupure dans la plage de 10 kDa à 30 kDa est classique. Des tailles de seuil de coupure plus petites peuvent être utilisées, car les fragments de l'hydrolyse de l'antigène spécifique du groupe sont généralement autour de 1 kDa (polysaccharides 5-mer, 8-mer et 11-mer), mais un seuil de coupure plus grand permet l'élimination d'autres contaminants sans mener à la perte du polysaccharide capsulaire.

[0059] Au moins cinq cycles de diafiltration à flux tangentiel sont habituellement effectués, par exemple, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou plus. Généralement, deux séries de diafiltration à flux tangentiel sont effectuées. Entre les première et seconde séries, le rétentat de la première série de diafiltration peut être traité avec une solution d'acide acétique/acétate de sodium. La suspension résultante peut être filtrée pour éliminer le précipité, par exemple en utilisant un filtre de 0,45 μm. La suspension peut également, ou en outre, être filtrée en utilisant un filtre de 0,2 μm.

[0060] La diafiltration peut être suivie d'une autre filtration utilisant un filtre de 0,45/0,2 μm.

BE2017/5905 (d) Filtration chromatographique utilisant une résine [0061] Une étape de chromatographie est réalisée en utilisant une matrice de résine comme stade stationnaire De façon appropriée, la chromatographie est une chromatographie sur colonne. Les résines appropriées pour une utilisation dans la présente invention comprennent des résines polymères faites de polystyrène, de polydivinylbenzène, de copolymères de divinylbenzène et de styrène, ou de styrène et de divinylbenzène réticulés. La résine est de façon appropriée sous la forme d'une sphère ou d'une bille, où le diamètre de la particule (dans un échantillon représentatif des billes de résine) se situe dans la plage de 300 μm à 1500 μm, de 500 μm à 750 μm, de 560 μm à 710 μm, de 350 à 600 μm, ou de 350 μm à 1200 μm.

[0062] L'éluat obtenu à partir de l'étape de chromatographie contient des PSC purifiés, par rapport à la solution de départ (c'est-à-dire, la solution immédiatement avant la chromatographie).

(e) Ré-N-acétylation [0063] Une étape de ré-N-acétylation peut être réalisée, par exemple, après une étape de filtration chromatographique en utilisant une résine, ou après toute étape de filtration subséquente. La ré-Nacétylation peut être avantageuse si les résidus d'acide sialique dans les polysaccharides capsulaires de GBS ont été dés-N-acétylés par une étape précédente quelconque dans le procédé, par exemple, durant le traitement avec une base. Une ré-N-acétylation contrôlée peut être effectuée de façon pratique en utilisant un réactif tel

BE2017/5905 que l'anhydride acétique (CEhCOHO, par exemple, dans 5 % de bicarbonate d'ammonium (Wessels et al. (1989) Infect Immun 57: 1089-94).

[0064] Une autre étape de diafiltration peut être réalisée, par exemple, après la ré-N-acétylation à la suite de la filtration chromatographique utilisant une résine. La diafiltration peut être suivie d'une autre filtration utilisant un filtre de 0,45/0,2 μm.

[0065] Les polysaccharides capsulaires bactériens produits par le présent procédé peuvent être en outre préparés sous la forme d'une poudre séchée, prête pour la conjugaison.

Préparation des conjugués [0066] A la suite de la purification, Les PSC peuvent être conjugués à une molécule de support, telle qu'une protéine. Par conséquent, l'invention peut comprendre en outre des étapes de purification des PSC et de conjugaison des polysaccharides capsulaires avec une protéine de support, pour donner un conjugué protéine-saccharide (voir les figures 1 et 2) . Les PSC conjugués peuvent être ensuite formulés dans une composition immunogène, telle qu'un vaccin.

[0067] Les polysaccharides capsulaires purifiés obtenus par la présente invention peuvent être conjugués avec une ou plusieurs protéines de support. En général, la conjugaison des polysaccharides aux supports amplifie l'immunogénicité des polysaccharides car elle les convertit d'antigènes indépendants des lymphocytes T en antigènes dépendants des lymphocytes T, permettant ainsi la sensibilisation pour la mémoire immunologique. La conjugaison est particulièrement utile pour les vaccins

BE2017/5905 pédiatriques (par exemple, référence 15) et il s'agit d'une technique bien connue (par exemple, décrite dans les références 16 à 24).

[0068] Les protéines de support connues comprennent des toxines ou des anatoxines bactériennes, telles que l'anatoxine diphtérique ou l'anatoxine tétanique, y compris le mutant CRM197 de la toxine diphtérique. D'autres protéines de support appropriées comprennent la protéine de la membrane externe de N. meningitidis (référence 25), des peptides synthétiques (références 26, 27), des protéines de choc thermique (références 28, 29), des protéines pertussiques (références 30, 31), des cytokines (référence 32), des lymphokines (référence 32), des hormones (référence 32), des facteurs de croissance (référence 32), des protéines artificielles comprenant de multiples épitopes de lymphocytes T CD4 humains provenant de divers antigènes dérivés de pathogènes (référence 33) comme N19 (référence 34), la protéine D de H. influenzae (références 35, 36) , la protéine de surface pneumococcique PspA (référence 37), la pneumolysine (référence 38), des protéines de capture du fer (référence 39) , la toxine A ou B de C. difficile (référence 40), les polypeptides antigéniques de GBS tels que BP-2a, spbl, GBS59, GBS80, GBS1523 ou leurs combinaisons (voir les références 41 à 79). La fixation au support est réalisée de préférence par l'intermédiaire d'un groupe -NH2, par exemple, dans la chaîne latérale d'un résidu de lysine dans une protéine de support, ou d'un résidu d'arginine. Lorsqu'un saccharide comporte un groupe aldéhyde libre, alors celui-ci peut être mis à réagir avec une amine dans le

BE2017/5905 support pour former un conjugué par amination réductrice Un tel conjugué peut être créé en utilisant une amination réductrice impliquant un galactose oxydé dans le saccharide (à partir duquel un aldéhyde est formé) et une amine dans le support ou dans le lieur. La fixation peut être également réalisée par l'intermédiaire d'un groupe -SH, par exemple, dans la chaîne latérale d'un résidu de cystéine.

[0069] Il est possible d'utiliser plus d'une protéine de support dans une composition immunogène, par exemple, pour réduire le risque de suppression par le support de la réponse immunitaire. Ainsi, dans une composition multivalente, différentes protéines de support peuvent être utilisées pour différentes souches ou différents sérotypes de Streptococcus, par exemple, les polysaccharides de GBS du sérotype la pourront être conjugués au CRM197 alors que les polysaccharides du sérotype Ib pourront être conjugués à l'anatoxine tétanique. Il est également possible d'utiliser plus d'une protéine de support pour un antigène polysaccharidique particulier, par exemple, les polysaccharides du sérotype III pourront être divisés en deux groupes, avec certains conjugués au CRM197 et d'autres conjugués à l'anatoxine tétanique.

[0070] Une seule protéine de support peut porter plus d'un antigène polysaccharidique (références 42, 43) Par exemple, une seule protéine de support pourra avoir des polysaccharides des sérotypes la et Ib conjugués à elle.

[0071] Les conjugués avec un rapport polysaccharide/support (p/p) situé entre un excès de

BE2017/5905 support (par exemple, 1/5) et un excès de polysaccharide (par exemple, 5/1) sont préférés. Des rapports situés entre 1/2 et 5/1 sont préférés, comme le sont des rapports situés entre 1/1,25 et 1/2,5. Les rapports situés entre 1/1 et 4/1 sont également préférés. Avec des chaînes polysaccharidiques plus longues, un excès de polysaccharide en poids est classique. En général, l'invention fournit un conjugué qui comprend une fraction de polysaccharide capsulaire de Streptococcus, de préférence de S. agalactiae, jointe à un support, dans lequel le rapport pondéral du polysaccharide/support est d'au moins 2/1.

[0072] Les compositions peuvent comprendre une petite quantité de support libre. Lorsqu'un support donné, telle qu'une protéine, est présent à la fois sous forme libre et conjuguée dans une composition de l'invention, la forme non conjuguée est de préférence de pas plus de 5 % de la quantité totale du support dans la composition comme un tout, et de façon davantage préférée présente à moins de 2 % en poids.

[0073] Toute réaction de conjugaison appropriée peut être utilisée, avec tout lieur approprié lorsque nécessaire.

[0074] Le polysaccharide sera généralement activé ou fonctionnalisé avant la conjugaison. L'activation peut impliquer, par exemple, des réactifs de cyanylation tels que le CDAP (par exemple, le tétrafluoroborate de 1.-cyano-4-diméthylamino-pyridinium (références 44, 45, etc.)). D'autres techniques appropriées utilisent des carbodiimides, des hydrazides, des esters actifs, du norborane, de l'acide p-nitrobenzoïque, du N25

BE2017/5905 hydroxysuccinimide, du S-NHS, de l'EDC, et du TSTU (voir également l'introduction à la référence 29).

[0075] Les liaisons par l'intermédiaire d'un groupe lieur peuvent être réalisées en utilisant toute procédure connue, par exemple, les procédures décrites dans les références 46 et 47. Un type de liaison implique une amination réductrice du polysaccharide, en couplant le groupe amino résultant avec une extrémité d'un groupe lieur d'acide adipique, et ensuite en couplant une protéine à l'autre extrémité du groupe lieur d'acide adipique (références 27, 48, 49). D'autres lieurs comprennent le groupe B-propionamido (référence 50), la nitrophényl-éthylamine (référence 51), des halogénures d'halogénoacyle (référence 52), des liaisons glycosidiques (référence 53), l'acide 6-aminocaproïque (référence 54), 1'ADH (référence 55), des fractions en C4 à C12 (référence 56), etc. Comme variante à l'utilisation d'un lieur, une liaison directe peut être utilisée. Les liaisons directes à la protéine peuvent comprendre l'oxydation du polysaccharide suivie d'une amination réductrice avec la protéine, comme il est décrit, par exemple, dans les références 57 et 58.

[0076] Un procédé impliquant l'introduction de groupes amino dans le saccharide (par exemple, en remplaçant les groupes =0 terminaux par -NH₂) suivie d'une dérivatisation avec un diester adipique (par exemple, le diester de N-hydroxysuccinimide de l'acide adipique) et d'une réaction avec la protéine de support est préféré. Une autre réaction préférée utilise l'activation par du CDAP avec une protéine D de support.

BE2017/5905 [0077] Après la conjugaison, les polysaccharides libres et conjugués peuvent être séparés. Il existe de nombreux procédés appropriés, y compris la chromatographie hydrophobe, l'ultrafiltration tangentielle, la diafiltration, etc. (voir également les références 59 et 60).

[0078] Lorsque la composition de l'invention comprend un oligosaccharide dépolymérisé, il est préféré que la dépolymérisation précède la conjugaison, par exemple, qu'elle survienne avant l'activation du saccharide.

[0079] Dans un procédé de conjugaison préféré, un polysaccharide est mis à réagir avec du dihydrazide de l'acide adipique. Pour les PSC de Streptococcus du sérogroupe A, un carbodiimide peut être également ajouté à ce stade. Après une période de réaction, du cyanoborohydrure de sodium est ajouté. Le polysaccharide dérivatisé peut être ensuite préparé, par exemple, par ultrafiltration. Le polysaccharide dérivatisé est ensuite mélangé avec la protéine de support (par exemple, avec une anatoxine diphtérique), et un carbodiimide est ajouté. Après une période de réaction, le conjugué peut être récupéré.

Etapes supplémentaires [0080] Tout en incluant les étapes décrites cidessus, les procédés de l'invention peuvent comprendre d'autres étapes. Par exemple, les procédés peuvent comprendre une étape de dépolymérisation des polysaccharides capsulaires, après leur préparation à partir des bactéries mais avant la conjugaison. La dépolymérisation réduit la longueur des chaînes des

BE2017/5905 polysaccharides et peut ne pas être appropriée pour les

PSC de GBS. Pour Streptococcus, spécialement le GBS, les polysaccharides plus longs tendent à être plus immunogènes que les plus courts (référence 61).

[0081] Après la conjugaison, le taux de protéine de support non conjuguée peut être mesuré. Une façon d'effectuer cette mesure implique une électrophorèse capillaire (référence 62) (par exemple, en solution libre), ou une chromatographie électrocinétique micellaire (référence 63).

[0082] Après la conjugaison, le taux de polysaccharide non conjugué peut être mesuré. Une façon d'effectuer cette mesure implique la chromatographie avec échange d'anions haute performance avec détection par ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD).

[0083] Après la conjugaison, une étape de séparation du polysaccharide conjugué du polysaccharide non conjugué peut être utilisée. Une façon de séparer ces polysaccharides est d'utiliser un procédé qui précipite sélectivement un composant. La précipitation sélective du polysaccharide conjugué, par exemple, par un traitement au désoxycholate, est préférée, pour laisser le polysaccharide non conjugué en solution.

[0084] Après la conjugaison, une étape de mesure de la taille moléculaire et/ou de la masse molaire d'un conjugué peut être réalisée. En particulier, les distributions peuvent être mesurées. Une façon d'effectuer ces mesures implique la chromatographie d'exclusion avec détection par photométrie de diffusion de la lumière sous des angles multiples et réfractométrie différentielle (SEC-MALS/RI) (référence 64).

BE2017/5905

Combinaisons de conjugués [0085] Les PSC purifiés de sérogroupes de Pneumococcus peuvent être conjugués comme il a été décrit ci-dessus, pour tout sérogroupe de Pneumococcus. Les sérogroupes de Pneumococcus utilisés pour préparer des conjugués immunogènes comprennent les sérogroupes 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, et 23F. Les conjugués individuels peuvent être ensuite mélangés, afin de fournir un mélange polyvalent, tel qu'un mélange bivalent, trivalent, tétravalent, 5-valent, 6-valent, 7valent, 11-valent ou 13-valent (par exemple, pour mélanger les sérogroupes 1+3+4+5+6B+7F+9V+14+18C+ 19F+23F, 4+6B+9V+14+18C+19F+23F ou 1+4+6B+9V+14+18C+ 19F+23F, etc.).

[0086] Les PSC purifiés de GBS, peuvent être conjugués comme il a été décrit ci-dessus et les conjugués peuvent être préparés à partir d'un ou de plusieurs des sérogroupes la, lb, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, et IX. Les conjugués individuels peuvent être ensuite mélangés, afin de fournir un mélange polyvalent, tel qu'un mélange bivalent, trivalent, tétravalent, 5valent, 6-valent, 7-valent, 8-valent, 9-valent ou lovaient (par exemple, pour mélanger les sérogroupes Ia+Ib+III, Ia+Ib+II+III+V, Ia+Ib+II+III+IV+V, Ia+Ib+II+III+IV+V+VI, etc.).

[0087] Les différents conjugués peuvent être mélangés en les ajoutant individuellement à une solution tamponnée. Une solution préférée est le sérum physiologique tamponné par du phosphate (concentration finale de 10 mM de phosphate de sodium) . Une concentration préférée de chaque conjugué (mesurée en

BE2017/5905 polysaccharide) dans le mélange final se situe entre 1 et 20 pg/ml, par exemple, entre 5 et 15 pg/ml, comme autour de 8 pg/ml. Un adjuvant éventuel de sel d'aluminium peut être ajouté à ce stade (par exemple, pour donner une concentration finale d'Al³⁺ située entre 0,4 et 0,5 mg/ml).

Compositions pharmaceutiques [0088] Les conjugués préparés par des procédés de 1'invention peuvent être combinés avec des supports pharmaceutiquement acceptables. De tels supports comprennent tout support qui n'induit pas lui-même la production d'anticorps nocifs envers l'individu recevant la composition. Les supports appropriés sont généralement des grosses macromolécules métabolisées lentement telles que des protéines, des polysaccharides, des polyacides lactiques, des polyacides glycoliques, des acides aminés polymères, des copolymères d'acides aminés, le saccharose, le tréhalose, le lactose, et des agrégats lipidiques (tels que des gouttelettes d'huile ou des liposomes) . De tels supports sont bien connus d'une personne de compétence moyenne dans le domaine. Les vaccins peuvent également contenir des diluants, tels que l'eau, le sérum physiologique, le glycérol, etc. En outre, des substances auxiliaires, telles que des agents de mouillage ou émulsifiants, des substances tampons du pH, et analogues, peuvent être présentes. Le sérum physiologique tamponné par du phosphate stérile apyrogène est un support classique. Une discussion complète sur les excipients pharmaceutiquement acceptables est disponible dans la référence 65.

compositions peuvent comprendre un

BE2017/5905 antimicrobien, particulièrement sr elles sont conditionnées sous un format de doses multiples.

Les compositions peuvent comprendre un détergent, par exemple, un polysorbate, tel que

TWEEN™ 80.

Les détergents sont généralement présents à des taux bas (par exemple, >

[0090] Les compositions peuvent comprendre des sels de sodium (par exemple, le chlorure de sodium) pour donner la tonicité. Une concentration de 10

NaCI est classique. Les compositions ± 2 mg/ml de comprendront généralement un tampon. Un tampon phosphate est classique.

[0091] Les compositions peuvent comprendre un alcool de sucre (par exemple, le mannitol) ou un disaccharide (par exemple, le saccharose ou le tréhalose) par exemple, à une concentration autour de 15 à 30 mg/ml (par exemple, 25 mg/ml), particulièrement si elles doivent être lyophilisées ou si elles comprennent un matériau qui doit être reconstitué à partir d'un matériau lyophilisé. Le pH d'une composition pour une lyophilisation peut être ajusté autour de 6,1 avant la lyophilisation.

[0092] Les conjugués peuvent être administrés au sujet conjointement avec d'autres agents immunorégulateurs. En particulier, les compositions administrées en tant que vaccins pour induire une réponse immunitaire protectrice, prophylactique, ou thérapeutique peuvent comprendre un adjuvant de vaccin.

Les adjuvants qui peuvent être utilisés dans des compositions de l'invention comprennent, mais n'y sont

BE2017/5905 pas limités : des compositions contenant des minéraux tels que des sels de minéraux, tels que des sels d'aluminium et des sels de calcium (ou des mélanges de ceux-ci ; lorsqu'un adjuvant d'hydroxyde d'aluminium et/ou de phosphate d'aluminium est utilisé, les antigènes sont généralement absorbés sur ces sels) ; des compositions d'émulsions huileuses, y compris des émulsions squalène-eau, telles que MF59 (chapitre 10 de la référence 66 ; voir également la référence 67) (5 % de squalène, 0,5 % de TWEEN™ 80, et 0,5 % de SPAN™ 85 (trioléate de sorbitane), formulées dans des particules submicroniques en utilisant un microfluidiseur) ; l'adjuvant complet de Freund (CFA) et l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) ; des formulations de saponines telles que QS21 (les saponines sont un groupe hétérologue de glycosides de stérol et de glycosides de triterpénoïde qui se trouvent dans tout un éventail d'espèces végétales, y compris l'arbre Quillaia saponaria Molina) ; des virosomes et des particules pseudovirales (PPV) ; des dérivés bactériens ou microbiens tels que des dérivés non toxiques de lipopolysaccharide entérobactérien (LPS) ; des oligonucléotides immunostimulants.

[0093] D'autres adjuvants appropriés comprennent des virosomes et des particules pseudovirales (PPV), qui contiennent généralement une ou plusieurs protéines provenant d'un virus éventuellement combinées ou formulées avec un phospholipide (voir, par exemple, références 68 à 74) ; des adjuvants à base de dérivés bactériens ou microbiens, tels que des dérivés du lipide A, des oligonucléotides immunostimulants, des

BE2017/5905 toxines ADP-ribosylantes et leurs dérivés détoxifiés, des dérivés non toxiques de LPS y compris le monophosphoryl-lipide A (MPL) et le MPL 3-O-désacylé (3d-MPL), des dérivés d'aminoalkyl-glucosaminide phosphates (par exemple, RC-529, références 75 et 76), et OM-174 (références 77 et 78).

[0094] D'autres adjuvants appropriés comprennent des oligonucléotides immunostimulants tels que des séquences nucléotidiques contenant un motif CpG ; des toxines bactériennes ADP-ribosylantes et leurs dérivés détoxifiés ; des immunomodulateurs humains tels que des interleukines, des interférons, le facteur de stimulation des colonies de macrophages, et le facteur de nécrose tumorale ; des composés d'imidazoquinolone tels que IMIQUAMOD™ et ses homologues (par exemple, RESIQUIMOD 3M™) .

[0095] L'invention peut également comprendre des combinaisons d'un ou de plusieurs des adjuvants identifiés ci-dessus.

Compositions [0096] Les compositions de la présente invention peuvent être administrées à tout sujet approprié ayant besoin d'une telle administration, tel que les êtres humains, les primates non humains, le bétail et les animaux de compagnie. Les compositions immunogènes peuvent être stériles et/ou apyrogènes. Les compositions peuvent être isotoniques par rapport au sujet visé, par exemple, les êtres humains.

[0097] Les compositions immunogènes utilisées en tant que vaccins comprennent une quantité immunologiquement efficace d'un ou de plusieurs

BE2017/5905 antigènes, ainsi que tout autre composant, selon les besoins et adaptée au receveur prévu. Par quantité immunologiquement efficace, il est signifié que l'administration de cette quantité à un individu, tel qu'un individu humain, soit en une dose unique soit faisant partie d'une série, est efficace pour le traitement ou la prévention d'une infection ou d'une maladie provoquée par le pathogène cible. Cette quantité varie selon la santé et la condition physique de l'individu à traiter, son âge, le groupe taxonomique de l'individu à traiter (par exemple, primate non humain, primate, etc.), la capacité du système immunitaire de l'individu à synthétiser des anticorps, le degré de protection souhaité, la formulation du vaccin, l'évaluation par le médecin traitant de la situation médicale, et d'autres facteurs pertinents. Une quantité classique de chaque conjugué streptococcique dans une composition vaccinale pour un usage humain se situe entre pg et 20 pg par conjugué (mesurée en saccharide).

[0098] Ainsi l'invention fournit un procédé pour préparer une composition pharmaceutique, comprenant les étapes suivantes : (a) la préparation d'un conjugué polysaccharide/support tel que décrit ci-dessus ; (b) le mélange du conjugué avec un ou plusieurs supports pharmaceutiquement acceptables.

[0099] L'invention fournit en outre un procédé de préparation d'un produit pharmaceutique, comprenant les étapes suivantes : (a) la préparation d'un conjugué polysaccharide/support tel que décrit ci-dessus ; (b) le mélange du conjugué avec un ou plusieurs supports pharmaceutiquement acceptables ; et (c) le

BE2017/5905 conditionnement du mélange conjugué/support dans un récipient, tel qu'un flacon ou une seringue, pour donner un produit pharmaceutique.

[00100] Le procédé de conjugaison et l'étape de mélange peuvent être effectués à des temps différents par des personnes différentes en des lieux différents (par exemple, dans des établissements ou des pays différents).

Streptococcus [00101] Le terme « Streptococcus » se rapporte à des bactéries qui peuvent être choisies parmi

S. agalactiae (GBS),

S. pyogenes (streptocoque du groupe A, GAS), S. pneumoniae (pneumocoque) et S. mutans.

Le streptocoque peut être en variante S. thermophilus ou S. lactis. De préférence, le streptocoque est le GBS. Si le streptocoque utilisé est le GBS, alors de préférence, le sérotype choisi est la, Ib, II, III, IV, ou V. De préférence, les souches de GBS utilisées sont 090 (la),

7357 (lb), H36b (lb), DK21 (2), M781 (3), 2603 (5), ou

CJB111 (5) . Si le streptocoque utilisé est S. pneumoniae, alors de préférence, les sérotypes choisis sont un ou plusieurs ou la totalité de 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, et

23F. Le sérotype 1 peut être également choisi de préférence. De préférence, les sérotypes choisis sont un ou plusieurs, ou la totalité de 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, et 23F.

[00102] En outre, la culture peut être homogène (c'est-à-dire, constituée d'une seule espèce ou souche de Streptococcus) , ou elle peut être hétérogène (c'està-dire, comprendre deux espèces ou souches ou plus de Streptococcus). De préférence, la culture est homogène.

BE2017/5905 [00103] Le streptocoque utilisé peut être une souche de type sauvage ou il peut être génétiquement modifié. Par exemple, il peut être modifié pour produire des polysaccharides capsulaires non naturels ou des polysaccharides hétérologues ou pour augmenter le rendement.

Modes de réalisation particuliers [00104] Les modes de réalisation particuliers de l'invention comprennent : un procédé d'élimination des protéines à partir d'une solution de départ comprenant des polysaccharides capsulaires bactériens (PSC) et des protéines bactériennes, comprenant les étapes suivantes :

i. la fourniture d'un bouillon de fermentation comprenant une ou plusieurs cellules bactériennes choisies dans le groupe constitué de Streptococcus agalactiae des sérotypes la, lb, II, III, IV, V, VI, VII, VIII et IX ;

ii. la lyse des cellules bactériennes issues de l'étape (a) avec un agent lytique, produisant de cette

façon un lysat	cellulaire	comprenant	des	débris
cellulaires,	des	protéines	solubles,	des	acides
nucléiques et	des	polysaccharides ;
iii . la	clarification	éventuelle	du	lysat
cellulaire	de	l'étape (b)	en utilisant	une

centrifugation ou une filtration pour éliminer les débris cellulaires, produisant de cette façon une composition contenant des polysaccharides capsulaires bactériens (PSC) et des protéines bactériennes ;

a. la fourniture d'une composition contenant des polysaccharides capsulaires bactériens (PSC) et des protéines bactériennes ;

BE2017/5905

b. la mise en contact de ladite composition avec une solution alcoolique, et l'élimination de tout précipité qui se forme ;

c. le maintien du matériau non précipité issu de l'étape (b) en solution et la filtration de la solution pour éliminer les composés d'une masse moléculaire plus petite tout en retenant les polysaccharides capsulaires en solution ; et

d. le recueil du filtrat issu de l'étape (c) et l'élimination par chromatographie des contaminants protéiniques à partir dudit filtrat, en utilisant une phase stationnaire de résine polymère, pour fournir des polysaccharides capsulaires purifiés ;

e. la ré-N-acétylation éventuelle des polysaccharides capsulaires purifiés,

f. la précipitation éventuelle des polysaccharides capsulaires purifiés; et

g. la conjugaison éventuelle des polysaccharides capsulaires purifiés à une protéine de support.

Autres composants antigéniques des compositions de 1¹ invention [00105] Les procédés de l'invention peuvent également comprendre les étapes de mélange d'un conjugué streptococcique avec un ou plusieurs antigènes supplémentaires, y compris les autres antigènes suivants : un antigène saccharidique d'Haemophilus influenzae B ; un antigène protéinique purifié du sérogroupe B de Neisseria meningitides ; une préparation de membrane externe du sérogroupe B de Neisseria meningitides ; un antigène du virus de l'hépatite A, tel qu'un virus inactivé ; un antigène du virus de

BE2017/5905 l'hépatite B, tels que des antigènes de surface et/ou core ; un antigène diphtérique, tel que l'anatoxine diphtérique ; et un antigène tétanique, tel que l'anatoxine tétanique ; un antigène de Bordetella pertussis, tel que l'holotoxine pertussique (PT) et 1'hémagglutinine filamenteuse (FHA) de B. pertussis, éventuellement aussi en combinaison avec la pertactine et/ou les agglutinogènes 2 et 3 ; un ou plusieurs antigènes polio ; des antigènes de la rougeole, des oreillons et/ou de la rubéole ; un ou plusieurs antigènes de la grippe tels les protéines de surface hémagglutinine et/ou neuraminidase ; un antigène de Moraxella catarrhalis ; un antigène protéinique de Streptococcus agalactiae (streptocoque du groupe B) ; un antigène de Streptococcus pyogenes (streptocoque du groupe A) ; un antigène de Staphylococcus aureus. Les antigènes protéiniques toxiques peuvent être détoxifiés lorsque c'est nécessaire (par exemple, la détoxification de la toxine pertussique par un moyen chimique et/ou génétique).

[00106] Les antigènes dans la composition seront généralement présents à une concentration d'au moins 1 g/ml chacun. En général, la concentration de tout antigène donné sera suffisante pour déclencher une réponse immunitaire contre cet antigène chez le sujet traité.

Termes [00107] Tel qu'utilisé ici, la « purification » des

PSC bactériens se rapporte à un procédé de séparation, dans une composition contenant à la fois des PSC et des contaminants non-PSC, des PSC des contaminants. La

BE2017/5905 purification telle qu'utilisée ici n'est pas synonyme de fourniture d'une composition pure à 100 % de PSC (c'està-dire, l'élimination de tous les contaminants). Les composants non-PSC (contaminants) tels que les protéines et les acides nucléiques cellulaires sont éliminés de façon préférentielle du matériau de départ pour fournir un matériau présentant un pourcentage augmenté de PSC (par exemple, augmentation du % en MM des PSC) , par rapport à celui du matériau de départ. Un tel procédé est utile dans la production de polysaccharides capsulaires bactériens, y compris ceux de S. agalactiae, à la suite d'une culture et/ou d'une fermentation. De tels procédés sont appelés ici purification, ou étapes de purification.

[00108] Le terme « comprenant » englobe « incluant », par exemple, une composition « comprenant » X peut comprendre quelque chose de supplémentaire, par exemple, X + Y. Le terme « constitué essentiellement de » signifie que le procédé, la méthode ou la composition comprend des étapes et/ou des parties supplémentaires qui ne modifient pas matériellement les caractéristiques basiques et nouvelles du procédé, de la méthode ou de la composition revendiqué (e) . Le terme « constitué de » est généralement pris pour signifier que l'invention telle que revendiquée est limitée à ces éléments cités spécifiquement dans la revendication (et peut comprendre leurs équivalents, tant que la doctrine des équivalents est applicable).

[00109] Le terme « environ » en relation avec une valeur numérique x signifie, par exemple, x ± 10 %, ±5%, ±4%, ±3%, ± 2 % ou ± 1 %.

BE2017/5905 [00110] Le mot « sensiblement » n'exclut pas « complètement », par exemple, une composition qui est « sensiblement dépourvue » de Y peut être complètement dépourvue de Y. Le cas échéant, le terme « sensiblement » peut être omis de la définition de l'invention. Lorsque les procédés se rapportent à des étapes de procédé, celles-ci peuvent être effectuées séquentiellement, par exemple, (a) suivie de (b), suivie de (c), suivie de (d), suivie de (e) , etc.

[00111] La pratique de la présente invention emploiera, sauf indication contraire, des techniques classiques de biologie moléculaire, de microbiologie, d'ADN recombinant, et d'immunologie, qui se situent au sein des compétences de l'art. De telles techniques sont pleinement expliquées dans la littérature. Voir, par exemple, DNA Cloning, Volumes I et II (D.N Glover ed.

1985) ; Oligonucleotide Synthesis (MT Gait ed, 1984) ; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & ST Higgins eds. 1984) ; Transcription and Translation (B.D. Hames & ST Higgins eds. 1984) ; Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press,

1986) ; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) ; the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), spécialement les volumes 154 & 155 ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory) ; Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres) ; Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M.

BE2017/5905

Weir and C. C. Blackwell eds 1986), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19ème Edition (1995) ; Methods In Enzymology (S.

Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.) ; et Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications) ; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nde Edition, 1989) ;

Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997) ; Short Protocols in Molecular

Biology, 4ème éd. (Ausubel et al. eds., 1999, John Wiley & Sons) ; Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press) ; PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nde éd. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag) ; et Peters and Dalrymple, Fields Virology (2nde éd) , Fields et al. (eds.), B.N. Raven Press, New York, NY.

[00112] Les abréviations classiques pour les nucléotides et les acides aminés sont utilisées dans ce mémoire.

[00113] Toutes les publications, tous les brevets, et toutes les demandes de brevet cités ici sont incorporés en référence dans leur intégralité.

Exemples

Exemple 1 - Résines utilisées dans la chromatographie [00114] Le terme chromatographie indique un ensemble de techniques qui sont conçues pour séparer un mélange en parties composantes dont la qualité et la quantité peuvent être ensuite estimées. Ces techniques

BE2017/5905 sont basées sur la distribution différentielle des composants entre deux phases, une phase appelée phase fixée ou stationnaire et la phase mobile ou éluant, qui circule en continu à travers la phase stationnaire. La présente étudie les résines utilisées, telles que décrites ici, en tant que phase stationnaire.

[00115] En utilisant le polysaccharide capsulaire du GBS de type V, la chromatographie avec différentes matrices de résine a été estimée comme variante à l'utilisation d'un traitement avec un détergent cationique et/ou un filtre de charbon dans la purification des PSC bactériens.

[00116] Dix résines différentes disponibles dans le commerce (tableau 1) ont été choisies auprès de deux fournisseurs : Sigma-Aldrich (St. Louis, Missiouri, Etats-Unis ; une partie de MilliporeSigma) et Purolite Company (Bala Cynwyd, Pa., Etats-Unis). Ces résines sont décrites par le fabricant comme étant appropriées pour des procédés industriels et résistantes aux changements de pH.

Tableau 1

Fournisse urs	Marque commerciale
Sigma- Aldrich	AMBERLITE™ XAD4	Copolymère de styrène et de divinylbenzène ; chaque bille est un conglomérat de microsphères
	AMBERLITE™ XAD16N
	AMBERLITE™ XAD1180N
Purolite	PUROSORB™ PAD350	Polystyrène ; billes sphériques
	PUROSORB™ PAD550

BE2017/5905

	PUROSORB™ PAD700
	PUROSORB™ PAD910
	CHROMALITE PCG900M	Styrène/divinylbenzène réticulés
	CHROMALITE PCG1200M
	CHROMALITE 70MN

[00117] AMBERLITE AD est une résine polymère. Il s'agit d'un polymère macroréticulaire non ionique qui absorbe et libère des molécules par l'intermédiaire d'interactions hydrophobes dans des solvants polaires ou faiblement volatiles. Les AMBERLITE AD sont des copolymères de styrène et de divinylbenzène. Chaque granule (bille) est un conglomérat de microsphères (figure 2) qui offre une excellente stabilité structurale physique et chimique. Les pores permettent un transfert rapide de masse et les tailles des particules assurent une pression basse durant l'utilisation. La nature chimique hydrophobe fait de AMBERLITE™XAD un bon adsorbant dans des conditions de phase inverse.

[00118] AMBERLITE AD4 : adsorbant polymère pour les petits composants hydrophobes, les tensioactifs, les phénols, les agents pharmaceutiques.

[00119] AMBERLITE AD16N : adsorbant pour les composants hydrophobes de taille moyenne (jusqu'à 40 000 Daltons de MM) , tels que les antibiotiques, les agents pharmaceutiques, les tensioactifs, et les protéines.

[00120] AMBERLITE AD1180N : adsorbant polymère pour les composants organiques hydrophobes avec une masse moléculaire relativement élevée.

BE2017/5905 [00121] Les caractéristiques principales des résines AMBERLITE AD sont présentées dans le tableau 2.

BE2017/5905

Tableau 2

	AMBERLITE XAD4	AMBERLITE AD16N	AMBERLITE XAD1180N
Diamètre des particules (μm)	560 à 710	560 à 710	350 à 600
Taille des pores (Ä)	100	200	300 à 400
Surface spécifique (m2/g)	750	800	450
Volume des pores (ml/g)	0, 98	0,55	1,4

[00122] PUROSORB PAD est un adsorbant polymère synthétique présentant une réticulation et une porosité 5 élevée. Ces polymères sont produits en utilisant des monomères de pureté élevée qui sont appropriés pour purifier des agents pharmaceutiques et pour une utilisation dans les industries alimentaires.

[00123] PUROSORB PAD350 est un adsorbant polymère non ionique macroporeux. Ce produit présente une porosité relativement faible et, par conséquent, offre une grande surface spécifique.

[00124] PUROSORB PAD50 est un adsorbant polymère non ionique macroporeux qui présente une surface 15 spécifique supérieure à de nombreux autres adsorbants hydrophobes tout en conservant une bonne porosité.

[00125] PUROSORB PAD700 offre une porosité supérieure avec des pores plus petits et, comme résultat, une surface spécifique légèrement inférieure

BE2017/5905 comparativement à des produits similaires. Ceci est obtenu par l'intermédiaire d'une structure spéciale de polystyrène réticulé. Les particules sphériques donnent peu de contre-pression dans des conditions normales de 5 fonctionnement de débit.

[00126] PUROSORB PAD910 présente des pores plus gros (1200 Angströms, (Â)) tout en conservant les caractéristiques générales des résines PUROSORB cidessus .

[00127] Les caractéristiques principales des résines PUROSORB sont présentées dans le tableau 3.

Tableau 3

	PUROSORB PAD350	PUROSORB PAD550	PUROSORB PAD700	PUROSORB PAD910
Structure du polymère	Polystyrèn e	Polystyrèn e	Polystyrèn e	Polystyrèn e
Apparence	Billes sphériques	Billes sphériques	Billes sphériques	Billes sphériques
Groupe fonctionnel	Non ionique	Non ionique	Non ionique	Non ionique
Forme ionique à 1'expédition	Aucune	Aucune	Aucune	Aucune
Rétention d'humilité	58 à 64 %	58 à 64 %	56 à 62 %	62 à 68 %
Plage des tailles des particules	350 à 1200 μm	350 à 1200 μm	350 à 1200 μm	350 à 1200 μm
< 350 μm (maximum)	2 %	2 %	2 %	2 %
Coefficient d'uniformité (maximum)	1,6	1,6	1,6	1,6

BE2017/5905

	PUROSORB PAD350	PUROSORB PAD550	PUROSORB PAD700	PUROSORB PAD910
Volume des pores	0,7 ml/g	1,1 ml/g	1,2 ml/g	1,6 ml/g
Surface spécifique	700 m2/g	950 m2/g	550 m2/g	540 m2/g
D50, Méso- et Macropores Â	350	600	700	1100
Densité relative	1,05	1,05	1,02	1,02
Poids à 1'expédition (approximatif )	660 à 710 g/1	670 à 720 g/1	650 à 700 g/1	680 à 730 g/1
Limite du pH, stabilité	0 à 14	0 à 14	0 à 14	0 à 14

[00128] Les résines CHROMALITE sont utilisées principalement pour la chromatographie en phase inverse. Toutefois, il existe également différents types 5 « fonctionnalisés » pour l'échange d'ions. La résine est un adsorbant avec des particules de styrène/ divinylbenzène hautement réticulés présentant des macropores situés dans la plage de tailles de 10 microns à 200 microns.

[00129] Parce que les résines CHROMALITE sont stables sur une large plage de pH, de pressions et de solvants, elles peuvent être utilisées pour une chromatographie à haute résolution afin de purifier des biomolécules telles que des protéines, des peptides, des 15 oligonucléotides et des antibiotiques.

BE2017/5905

Tableau 4

Résine CHROMALITE	Taille des particules (μm)	Taille des pores (À)	Surface spécifique (m2/g)
PCG900	35	200 à 300	> 600
75
120
PCG1200	15	300 à 500	> 600
35
75
120
MN	5	200 à 250	> 1200
10
15

[00130] CHROMALITE PCG900M est un adsorbant macroporeux de polydivinylbenzène. L'adsorbant le plus 5 courant utilisé comme phase stationnaire pour une chromatographie hydrophobe est le vinylbenzène-styrène. Le divinylbenzène (DVB) est similaire au styrène, et est constitué d'un cycle benzène lié à deux groupes vinyle, tandis que le cycle styrène n'a qu'un groupe vinyle. La 10 présence de doubles liaisons carbone-carbone rend le divinylbenzène très réactif.

Exemple 2 - Préparation des polysaccharides capsulaires [00131] S. agalactiae de type V a été cultivé par 15 fermentation. Le PSC a été extrait et la préparation de

PSC a été soumise à une précipitation alcoolique pour

BE2017/5905 éliminer certaines protéines et/ou certains acides nucléiques contaminants.

[00132] Après l'étape de précipitation alcoolique, la préparation de PSC a subi ce qui suit : une première ultrafiltration à 30 kDa/diafiltration (UF/DF) à 30 kDa, avec échange de tampon (10 mM de NaPi, pH 7,2) ; précipitation à l'acide ; et une seconde filtration UF/DF à 30 kDa avec échange de tampon (0,3 M de carbonate + 0,3 M de NaCl) . La préparation résultante a été utilisée comme pour comparer l'utilisation de plusieurs résines dans la purification chromatographique des PSC.

[00133] Avant la chromatographie, la préparation a été dialysée pendant un temps supplémentaire, dans 50 mM de tampon phosphate de sodium (NaPi) pH 8. Cette étape supplémentaire d'ultrafiltration a fourni un tampon compatible avec les expériences chromatographiques. L'utilisation de 50 mM de tampon NaPi pH 8 a permis la chromatographie des polysaccharides dans diverses conditions, car des pH différents et des conductivités différentes pourraient être obtenus en ajoutant du NaCl et/ou en diluant avec du tampon phosphate (Na2HPC>4 1 M) . La préparation résultante a été utilisée comme matériau de départ dans la comparaison de l'utilisation des différentes résines dans la purification chromatographique des PSC.

Exemple 3 - Protocole pour le criblage des résines [00134] Les dix résines énumérées dans le tableau 1 ont été évaluées. La purification a été effectuée en mode fermé par écoulement gravitaire en utilisant des colonnes coniques de polypropylène d'une hauteur de 9 cm,

BE2017/5905 coniques 0,8-0,4 cm. Chaque type de résine a été prétraité dans des conditions recommandées par le fournisseur avant utilisation, comme suit.

[00135] AMBERLITE XAD : le conservateur a été éliminé par trois cycles de lavage avec de l'eau purifiée (purifiée en utilisant un système de purification MILLIQ, Millipore Corporation).

[00136] Pour les résines CHROMALITE et PUROSORB : après pesage de la quantité souhaitée de résine, elle a été dissoute dans de l'éthanol à 50 %. Le traitement avec l'éthanol a éliminé les contaminants. Après incubation pendant une nuit à une température de 2 à 8° Centigrade (C), l'éthanol a été éliminé et trois cycles de lavage ont été effectués avec de l'eau purifiée (système de purification MILLI-Q, Millipore Corporation) [00137] Après équilibrage de la colonne, 5 ml de matériau de départ contenant des PSC ont été appliqués à une densité de charge d'approximativement 7 mg de polysaccharide (PS)/ml de résine et 0,5 mg de protéines totales (PT)/ml de résine. Le polysaccharide qui n'est pas adsorbé sur la résine est élué, alors que les protéines demeurent fixées à la résine. Après le chargement/élution, une étape de lavage a été effectuée en utilisant 5 ml de tampon pour récupérer tout matériau restant dans la colonne, et cette fraction a été également recueillie.

[00138] Avant chaque série chromatographique, la résine a été tassée pour donner un lit stable et éviter des variations de volume, des vides et des bulles d'air.

[00139] Un test d'efficacité de colonne estime les performances de la colonne avant de démarrer la

BE2017/5905 purification. La référence est l'analyse de la distribution et le temps de résidence d'une substance traceur passant à travers la colonne. Pour caractériser la colonne chromatographique sans interférence, la substance traceur et l'éluant sont choisis pour éviter des interactions chimiques avec le milieu, ainsi que des problèmes d'écoulement de liquide.

[00140] L'efficacité de la colonne est généralement définie par deux paramètres : le nombre de plateaux théoriques (stades d'équilibre) et l'asymétrie du pic (la symétrie du pic).

[00141] L'amplitude d'un pic est généralement décrite par le nombre d'éléments « N » ou par la hauteur équivalente d'un plateau théorique (HETP), représentant l'état d'équilibre de la colonne. On peut imaginer que la colonne est divisée en N tranches, dans chacune d'elles un équilibre est atteint entre les phases stationnaire et mobile. Chacune de ces sections est un plateau théorique. Ce procédé implique la mesure de la largeur du pic à la moitié de la hauteur maximale du pic. Le temps de rétention ou le volume de rétention mesuré à la hauteur maximale du pic correspondant au temps de résidence moyen ou au volume requis pour éluer l'échantillon à partir de la colonne.

[00142] L'asymétrie est un paramètre sans dimension utile pour caractériser l'efficacité parce qu'il est

BE2017/5905 indépendant de la longueur de la colonne et du diamètre des particules de la phase stationnaire. Les déviations à partir d'une valeur idéale de symétrie des pics peuvent être provoquées par des irrégularités dans le lit conditionné lui-même. Les pics chromatographiques ont rarement une forme gaussienne. Les déformations qui apparaissent souvent sont de deux types : « Tailing » (lorsque le profil s'élève brusquement et atteint rapidement le point maximal puis descend plus lentement vers la ligne de départ) et « Fronting » (lorsque le profil s'élève lentement vers le point maximal et descend rapidement vers le pic de la ligne de départ). (Voir la figure 3) [00143] L'asymétrie d'un pic est exprimée par le rapport d'asymétrie AS = b/a, dans lequel « a » est la largeur de la première moitié du pic à 10 % de la hauteur maximale et « b » est la largeur de la seconde moitié du pic à 10 % de la hauteur maximale.

[00144] La procédure utilisée pour l'intégrité du lit de CHROMALITE™PCG90 0M est résumée dans le tableau 5.

BE2017/5905

Tableau 5

Séquence de la chromatographie	Paramètres	Détection	Débit
Equilibre	2,5 VC solution de NaCI 0,4 M	Conductivité (mS/cm)	200 cm/h
Charge	0,01 VC solution de NaCI 2 M (traceur)
Elution	1,5 VC avec une solution de NaCI 0,4 M
Système utilisé pour l'analyse : ÄKTA™ avant 25, logiciel Unicorn 6.1

VC = volume de colonne [00145] Le protocole de purification des polysaccharides pour la détermination de la plage des densités de charge à appliquer dans la procédure de purification est présenté dans le tableau 6.

Tableau 6

Séquence de la chromatographie	Volume	Tampon	Sortie	Détection	Débit
Equilibre	5 VC	Tampon 50 mM de phosphate pH 7,0	déchets	UV215nm UV2 8 0nm Conductivité (mS/cm) pH	150 cm/heure
Charge	90 ml	Fraction de 12 ml
Lavage	7 VC
Elution	10 VC	50 % p/p de DPG
Système utilisé pour l'analyse : ÄKTA™ avant 25, logiciel Unicorn 6.1

DPG = dipropylène glycol ; mS/cm = milliSiemens/centimètre

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Le protocole de purification des polysaccharides pour l'optimisation de l'étape (tableau 7) :

Séquence de la chromatographie	Volume	Tampon	Sortie	Détection	Débit
Equilibre	5 VC	Tampon variable selon la condition de conception	déchets	UV215nm UV2 8 0nm Conductivité (mS/cm) pH	variable selon la condition de conception ; 200 à 600 cm/h
Charge	Volume variable selon la condition de conception	Départ du recueil à la sortie 1 lorsque UV215nm > 2 mUA
Lavage	7	Arrêt du recueil lorsque UV215nm < 5 mUA ou après 3 VC à partir du début de la séquence de lavage
Système utilisé pour l'analyse : ÄKTATM avant 25, logiciel Unicorn 6.1

mUA = milli-unités d'absorption [00146] Comme il n'a été réalisé aucune étude concernant la réutilisation des résines, des nouvelles colonnes ont été utilisées à chaque fois et la résine 10 utilisée a été jetée. Comme il a été évident dans l'étude préliminaire, le polysaccharide a été élué dans la

BE2017/5905 fraction non adsorbée par la résine, alors que les protéines demeurent fixées à la résine. Par conséquent, puisque la résine n'est pas réutilisée, les étapes d ' élution/régénération ne sont pas incluses dans le 5 protocole expérimental.

Exemple 4 - Analyse technique

Tableau 8

Panel analytique

Procédé analytique	Intermédiaire du procédé analysé	Attribut	Résultats de DoE
Test micro BCA	Intermédiaire à purifier	Concentration des protéines	-
GPC	Intermédiaire à purifier ; intermédiaire purifié	Concentration des polysaccharides, masse moléculaire des polysaccharides	Quantité de polysaccharide (rendement de 1'étape chromatographique) delta de masse moléculaire
FLR	Intermédiaire à purifier ; intermédiaire purifié	Concentration des protéines	Teneur en impuretés

[00147] Le test MicroBCA est un test colorimétrique pour la détection et la quantification de la teneur totale en protéines dans un échantillon. Il s'agit d'un 15 procédé qui est basé sur la conversion de Cu²⁺ en Cu¹⁺ dans des conditions alcalines (réaction du biuret).

[00148] L'acide bicinchoninique (BCA) est utilisé pour la détermination de Cu¹⁺, qui se forme lorsque Cu²⁺

BE2017/5905 est réduit par une protéine dans un environnement basique Le procédé détermine par spectrophotométrie la quantité d'un complexe violet (absorbe à 562 nm) produit par la réaction du BCA et des ions formés lorsque le cuivre est réduit par les protéines dans un environnement basique.

[00149] L'absorbance est proportionnelle à la quantité de protéine présente en solution et peut être estimée par comparaison à un étalon de protéine, telle que la sérumalbumine bovine (BSA). La structure macromoléculaire d'une protéine, son nombre de liaisons peptidiques et la présence de quatre acides aminés spécifiques (cystéine, cystine, tryptophane et tyrosine) sont responsables de la formation de la couleur avec le BCA. Ce test peut être effectué en utilisant le kit de dosage des protéines Pierce™ BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific).

Exemple 5 - Chromatographie par perméation de gel (GPC) [00150] Dans cette étude, la concentration du polysaccharide et sa masse moléculaire dans des intermédiaires purifiés et des éluats purifiés ont été déterminées en utilisant la GPC.

Ce procédé identifie la concentration, la masse moléculaire, et la polydispersité du polysaccharide dans une session analytique.

La

GPC est un type de chromatographie d'exclusion moléculaire (SEC chromatographie la masse et qui sépare les molécules en se basant sur le volume hydrodynamique.

Dans la GPC, les solvant (phase mobile). Lorsqu'ils sont injectés, les analytes pénètrent selon la taille des pores dans la échantillons sont injectés dans un courant continu de

BE2017/5905 colonne et selon leur volume hydrodynamique (habituellement associé à la masse moléculaire). Les molécules plus petites entrent dans les pores ce qui entraîne un temps de rétention plus long. Les grosses molécules sont exclues des pores et elles sont éluées avec des temps de rétention faibles (limite d'exclusion) Les molécules intermédiaires pénètrent partiellement dans les pores et ont des temps de rétention intermédiaires. La colonne sépare les analytes selon la masse moléculaire et la distribution des masses moléculaires prend la forme d'un chromatogramme. Le détecteur est généralement un spectroscope ultraviolet (UV) -visible, mais pour les échantillons qui ne présentent pas d'absorption en UV, un détecteur d'indice de réfraction est utilisé. L'utilisation de polymères étalons de masses moléculaires permet l'estimation de la masse moléculaire de l'échantillon.

[00151] Dans la présente étude, ce procédé analytique est basé sur le principe de deux dimensions (2D pour lesquelles deux colonnes chromatographiques sont utilisées (RP-SEC-HPLC) ) . La première colonne est une colonne en phase inverse (RP) et élimine les impuretés (protéines, sels, etc.) surgissant de la fermentation. La seconde colonne est une colonne d'exclusion (SE) qui sépare les molécules des polysaccharides en se basant sur le volume hydrodynamique. Etant une analyse dimensionnelle, l'utilisation d'un logiciel permet la détermination du pic de masse moléculaire (Mp), de la masse moléculaire moyenne (Mw), de la masse moléculaire moyenne en nombre (Mn) et de leur relation (Mw/Mn) , pour exprimer la

BE2017/5905 polydispersité du polysaccharide (les molécules monodispersées ont une valeur de 1).

[00152] Pour effectuer l'analyse dimensionnelle des polysaccharides de GBS avec ce procédé, nous avons utilisé une sélection de fractions de polysaccharides de

GBS étalons à différentes masses moléculaires, spécifiques de chaque sérotype, obtenues par

1'intermédiaire du recueil dans les fractions des polysaccharides de GBS correspondants, obtenues au moyen d'une chromatographie préparative par filtration sur

Les étalons obtenus aliquotés et congelés pour chaque sérotype, ont (-20 °C) . Avant utilisation, été les échantillons ont été décongelés. Les différentes fractions étalons ont été caractérisées par les valeurs moyennes obtenues à la hauteur

SEC-MALLS et du pic (pic de MM, Mp) ont été prises la courbe d'étalonnage du comme valeur de référence pour système de GPC en utilisant le logiciel Empower 3.

Exemple 6 - Procédure de la GPC [00153] Les colonnes utilisées étaient :

• RP-Jupiter 5 μm C4 300 Ä 250 x 4, 6mm (PHENOMENEX, Torrance, Californie, Etats-Unis).

• TSKgel PWH 7,5 x 75 mm (Tosoh Bioscience, King of Prussia, Pennsylvanie, Etats-Unis).

• SEC-TSKgel G4000SW 7,8 mm DI x 300 mm (Tosoh Bioscience, King of Prussia, Pennsylvanie, Etats-Unis) [00154] La préparation des réactifs et des solutions a été la suivante :

[00155] RI (phase mobile A) : préparation de la phase mobile A (5 litres) : 10 mM de NaPi, 10 mM de NaCl,

BE2017/5905 % d'acétonitrile (CAN), pH 7,2. Pesage et fusion : 2,97 g de NaH₂PO₄ x H₂O ; 5,06 g de Na₂HPO₄ x 2H₂O ; 2,92 g de NaCl dans un volume final de 4750 ml d'eau purifiée, puis ajouter 250 ml d'ACN. Filtrer la solution résultante avec des membranes de 0,20 μm de filtre Phenex

en nylon de	47	mm (PHENOMENEX)	ou	équivalents.
[00156]	R2	(phase mobile	B)	: préparer environ 2	1
d'eau purifi	ée.
[00157]	R3	(phase mobile	C)	: préparation	de CAN	à
90 %.
[00158]	Me	surer 900 ml	d'acétonitrile	(ACN)	et
compléter à	1 1	avec de l'eau	pur	ifiée.
[00159]	R4	: préparation	du tampon de	dilution
(1 litre) de	NaPi à 100 mM, NaCl	à 100 mM, TFA	à 0,1	o O r
ACN à 5 % à	pH	7,2, pour les échantillons de matériau	à
purifier.
[00160]	Pour l'étalonnage,	des étalons	de
différentes	masses moléculaires	ont été utilisés.	La

préparation a été réalisée par chromatographie préparative par filtration sur gel, dans laquelle une polydispersité des polysaccharides est fractionnée. Les fractions individuelles ont été analysées, à partir desquelles nous avons déterminé les diverses masses moléculaires. Le tableau 9 présente les fractions avec les masses moléculaires (Daltons, Da) :

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Tableau 9

Fraction	Mp (Da)
1	130 500
2	120 500
3	112 500
4	106 500
5	9 6 90 0
6	79 600

[00161] Pour déterminer le polysaccharide, des étalons de concentration connue sont utilisés pour construire une courbe d'étalonnage en termes de concentration (tableau 10) :

Tableau 10

Etalon	Concentration pg/ml
1	50
2	100
3	250
4	500
5	750
6	1000

[00162] L'analyse est effectuée avec les dilutions appropriées des échantillons de polysaccharides de GBS, dilués dans R4. Selon la concentration à chaque phase de purification, procéder directement à la filtration sur 0,2 μm dans les flacons du passeur d'échantillons.

Injecter deux fois (consécutivement ou séparément)

100 μΐ de chaque échantillon provenant du même flacon.

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Tableau 11

Instrument	HPLC Waters Alliance W2690/5 ou équivalent
Logiciel	Empower
Equilibration	• Laver la colonne RPC pendant une heure avec 95 % de R2 et 5 % de R3 ; puis conditionner la colonne pendant deux heures avec RI. • Laver la colonne SEC pendant une heure avec R2 puis conditionner pendant au moins deux heures avec RI.
Eluant de la phase mobile A	10 mM de NaPi, 10 mM de NaCI, 5 % d'ACN, pH 7,2 (RI)
Eluant de la phase mobile B	Eau purifiée (R2)
Eluant de la phase mobile B	ACN à 90 % (R3)
Débit de la SEC	0,5 ml/min
Débit de la RP	Voir le tableau 12
Volume d'inj ection	100 μΐ
Temps de circulation	40 minutes
Révélation	UV 210 nm
Révélation FLR	277 nm, 305 nm

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Révélation RI

Sensibilité = 64

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Tableau 12

Temps	Eluant A (%)	Eluant B (%)	Eluant C (%)	Eluant D (%)	Débit
0	100	0	0	0	0,50
6	100	0	0	0	0,50
11	0	96	5	0	1,00
20	0	0	100	0	1,00
24	0	0	100	0	1,00
25	0	96	5	0	1,00
30	0	96	5	0	1,00
31	100	0	0	0	1,00
35	100	0	0	0	0,50

[00163] Durant le traitement, le logiciel de la GPC construit une courbe de référence, en utilisant les temps de rétention et le logarithme de la fraction de masse moléculaire du pic de l'étalon. L'échantillon est lu sur la courbe et le logiciel détermine les valeurs dimensionnelles des résultats en daltons : Mw, Mn et polydispersité (Mw/Mn). Pour chaque polysaccharide de GBS, le résultat final est calculé à partir de la moyenne de deux réplicats. Pour la quantification du polysaccharide, le logiciel construit une courbe d'étalonnage de la concentration de l'étalon et de la surface du pic chromatographique, le logiciel (Empower), permet le traitement des données recueillies et enregistrées à une date ultérieure. Pour la quantification de la taille du polysaccharide de GBS, un détecteur d'indice de réfraction a été utilisé.

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Exemple 7 - FLR [00164] Pour la détermination des impuretés présentes dans le polysaccharide, il a été utilisé une technique qui excite les échantillons à une certaine longueur d'onde et mesure l'émission. Si la concentration des analytes est suffisamment petite, l'intensité des radiations émises par fluorescence est proportionnelle à la concentration (s = KC) . Les détecteurs de fluorescence présentent l'avantage de la sensibilité. Toutefois, ce n'est pas toutes les molécules qui absorbent qui émettent une fluorescence ; de telles molécules peuvent être prétraitées avec des réactifs qui aboutissent à des produits fluorescents. Dans la présente étude, toutes les impuretés absorbant en UV d'intérêt ont émis une fluorescence.

Tableau 13

Points de la	Pourcentage d'étalon
courbe	(TRPUR %)
1	2,5
2	5
3	10
4	25
5	50
6	75
7	100

[00165] Ces impuretés présentent une absorption maximale à 330 nm en UV, et une ouverture de lumière fluorescente à 400 nm. A ces longueurs d'onde, le polysaccharide n'absorbe pas ni n'émet ce qui est

BE2017/5905 pourquoi le procédé peut être considéré comme spécifique pour les impuretés. Pour effectuer les mesures, un détecteur fluorimétrique a été utilisé.

Exemple 8 - Teneur en protéines [00166] Les résines AMBERLITE XAD1180N et XAD4 ont montré une efficacité élevée dans l'élimination des impuretés protéiniques (XAD1180N = 97 % et XAD4 = 100 % d'élimination). AMBERLITE XAD16N a montré un taux 10 d'élimination de 51 %. Les résultats sur PUROSORB PAD910 et PUROSORB PAD700 ont montré un pourcentage de 100 % et de 99 % d'élimination, respectivement. PUROSORB PAD550 et PAD350 ont montré 63 % et 52 %, respectivement.

[00167] CHROMALITE PCG900 a montré 100 % d'élimination des protéines, au contraire de CHROMALITE

70MN (48 %) (voir le tableau 14 et la figure 4).

Tableau 14

	RP-SEC	MicroBCA
Code	Echantillon	Volume	Concentration	Concentration	Rapport	%
de la	et résine	(ml)	de PS	des protéines	(mg de	d'élimination
résine			[RP-SEC]	[MicroBCA]	protéines/	des protéines
			(pg/ml)	(pg/ml)	1 g de PS)
Charge	GBSIa	5	3272	454	139	0
RI	XAD4	5	2966	2	1	100
R2	XAD16N	5	3026	221	73	51
R3	XAD1180N	5	2951	14	5	97
R4	PAD350	5	2941	170	58	63
R5	PAD550	5	2950	218	74	52
R6	PAD700	5	2538	< 1	< 1	100
R7	PAD910	5	2813	3	1	99
R8	PCG900M	5	2806	< 1	< 1	100
RIO	7 0MN	5	2581	235	91	48

[00168] Les résines AMBERLITE XAD4, PUROSORB PAD700

BE2017/5905 et CHROMALITE PCG900M ont éliminé 100 % des protéines.

PUROSORB PAD700 et CHROMALITE PCG900 ont été les seules resrnes qui ont fournr une teneur en proternes dans

1'éluat au-dessous de la limite inférieure de détection

du test BCA.
[00169] En	ce	qui
polysaccharide,	la	résine
rendements les	plus	élevés

concerne la perte de

AMBERLITE a montré les (voir le tableau 15 et la figure 5) . (AMBERLITE XAD4 = 91 %, XAD16N = 93 %

XAD1180N = 90 %). Les résines PUROSORB PAD350 et PAD550 ont également obtenu un rendement de 90 %. Les deux résines CHROMALITE ont donné des rendements < 90 %.

Tableau 15

	Analyse RP-SEC
Code	Echantillon	Volume	Concentration	Concentration	Rendement
de la	et résine	(ml)	de PS	de PS	de
résine			(tg/ml)	(mg)	1'étape
					de PS (%)
Charge	GBSIa	5	3272	16,36	100
RI	XAD4	5	2966	14,83	91
R2	XAD16N	5	3026	15, 13	93
R3	XAD1180N	5	2951	14,76	90
R4	PAD350	5	2941	14,71	90
R5	PAD550	5	2950	14,75	90
R6	PAD700	5	2538	12,69	78
R7	PAD910	5	2813	14,07	86
R8	PCG900M	5	2806	14,03	86
RIO	7 0MN	5	2581	12,91	79

[00170] Par opposition, l'utilisation d'un filtre de charbon tel que décrit dans le document WO 2009081276 (PCT/IB2008/003729) fournit des rendements inférieurs.

[00171] En outre, les filtres de charbon adhérents tendent à retenir les masses moléculaires inférieures, menant de cette façon une augmentation d'approximativement

KDa de MM dans

1'éluat. Les résines AMBERLITE pas montré une telle sélectivité la différence de masse moléculaire entre le matériau de départ et 1'éluat est jugée nulle ou équivalente la variabilité du procédé analytique (différences partir de la MM du matériau de départ inférieures

%) . La même chose a été observée pour

PUROSORB et

CHROMALITE (voir le tableau ' exception de

PUROSORB™

PAD700 (A

MM

Da) et de CHROMALITE

PCG900M (Δ MW effets observés pour toutes les résines sur la polydispersité

BE2017/5905 doivent être considérés comme négligeables.

Tableau 16

	GPC
Code	Echantillon	Mn	Mw	*Différence	Polydispersité
de la	et résine	(Daltons)	(Daltons)	(Δ) de MM
résine				(Daltons)
Charge	GBSIa	234805	258888		1,18
Rl	XAD4	234753	259052	164	1,18
R2	XAD16N	234510	258776	-112	1,18
R3	XAD1180N	235767	259623	735	1,18
R4	PAD350	234730	259076	188	1,18
R5	PAD550	234949	259181	293	1,18
R6	PAD700	245300	267668	8780	1,15
R7	PAD910	234571	258797	-91	1,18
R8	PCG900M	240888	263416	4528	1,16
RIO	7 0MN	234448	258930	42	1,18

*La différence de masse moléculaire a été calculée comme suit : MM de 1'éluat - MM du matériau de départ.

BE2017/5905

Exemple 9 - Détermination de la plage de charges pour CHROMALITE PCG900M [00172] CHROMALITE PCG900M a été choisie comme résine candidate appropriée. Cette résine a éliminé 100 % des protéines avec un rendement de 86 % et un effet léger sur la sélection des molécules de polysaccharides avec une masse moléculaire basse (différence de MM de 4528 Da) . Les données obtenues ont été confirmées sur le polysaccharide du sérotype V. Une colonne chromatographique (1,0 cm de diamètre, hauteur de 7,6 cm, volume de colonne de 6 ml) a été préparée avec CHROMALITE PCG900M.

[00173] Protocole pour le remplissage de la colonne de chromatographie avec CHROMALITE PCG900M : peser une quantité (3 g) de chaque résine en prenant en compte le VC à obtenir (approximativement 3,5 ml) . Dissoudre la résine dans de l'éthanol à 50 % (40 ml). Après incubation pendant une nuit à une température de 2 à 8 °C, l'éthanol a été éliminé et la résine a été lavée par trois cycles de lavage avec de l'eau purifiée. Transférer les résines dans des colonnes LRC (Pali Corporation, Port Washington, New York, Etats-Unis) de 20,0 cm x 1,0 et rincer en utilisant un débit de 20 ml/min en utilisant le système de chromatographie préparative ÄKTA AVANT 25 (GE Healthcare Life Sciences) pendant une heure. A ce point, le piston a été abaissé afin d'avoir la tête du piston en contact avec le lit de la résine.

[00174] Le matériau de départ a été préparé selon un procédé classique et dialysé dans du tampon phosphate pH 7. Le matériau affichait les caractéristiques présentées dans le tableau 17.

Tableau 17

BE2017/5905

Matériaux de départ
Volume (ml)	90
Protéines [pBCA] pg/ml	266
Concentration des polysaccharides [GPC] (pg/ml)	4002
Protéines totales (mg)	23, 9
Polysaccharides totaux (mg)	0,36
Masse moléculaire [GPC] (Da)	127 332
Polydispersité [GPC]	1,25

[00175] Le matériau de départ (90 ml de GBS du sérotype V) a été chargé dans la colonne et les fractions se sont éluées en sept fractions de 12 ml chacune, à l'exception de la dernière fraction contenant 6 ml.

[00176] Les profils chromatographiques ont été obtenus avec UV à 210 nm et absorbance en UV à 280 nm. L'absorbance en UV à 280 nm est caractéristique des acides aminés aromatiques alors que les polysaccharides n'absorbent pas significativement à cette longueur d'onde, ainsi ce test a identifié la présence de protéines. Le polysaccharide est élué dans la fraction et n'est pas absorbé par la colonne, alors que la plupart des protéines sont localisées dans la fraction éluée avec le DPG (dipropylène glycol) comme il a été indiqué par la présence d'un seul pic en UV à 280 nm dans les fractions 1C4-1C5 (résultats non présentés) . Les fractions individuelles (1A1-1B4) ont été analysées selon les procédés analytiques décrits ici. Les résultats sont fournis dans les tableaux 18 et 19.

BE2017/5905

Tableau 18

Protéines
fraction	Volume total	[Protéines] (MicroBCA)	Teneur en protéines totales
N°	nom	(ml)	(pg/ml)	(mg)
GBS V	1 A 1	90	266	23, 92
Fl	1 A 2	12	0	0
F2	1 A 3	12	5	0,06
F3	1 A 4	12	6, 8	0,08
F4	1 A 5	12	8,2	0,1
F5	1 A 6	12	9, 6	0,12
F6	1 B 1	12	11,8	0,14
F7	1 B 2	12	14	0,17
F8	1 B 3	6	10,8	0,07
F9 lavage	1 B 4	12	7,5	0,09

Tableau 19

BE2017/5905

Polysaccharides
fraction	Volume total	[GBSV] (GPC)	Teneur en PS totaux
(ml)	(pg/ml)	(mg)
GBS V	90	4002	360,18
Fl	12	2781	33,37
F2	12	3351	40,21
F3	12	3920	47,04
F4	12	3929	47, 15
F5	12	3938	47,26
F6	12	3970	47, 63
F7	12	4001	48,01
F8	6	2738	24,21
F-9 lavage	12	1474	17,69

[00177]

Les données obtenues et énumérées dans les tableaux 18 et 19 ont été utilisées pour déterminer les 5 différentes densités appliquées et leurs résultats. En particulier, en ajoutant les teneurs en protéines/ polysaccharides de chaque fraction aux fractions précédentes, les densités de charge ont été déterminées. Le tableau 20 et la figure 6 présentent les données en 10 termes de protéines.

Tableau 20

BE2017/5905

Protéines
Groupe	Volume total	Protéines chargées dans la colonne	Densités de charge en protéines totales (CV 6 ml)	Teneur en protéines du groupe élué	% de protéines éliminées
N°	Fractions combinées	(ml)	(mg)	(mg de PT/ml de résine)	(mg)	(%)
1	Fl	12	3, 19	0,5	0	100
2	Fl + F2	24	6,38	1,1	0,06	100
3	Fl - F3	36	9,57	1,6	0,14	99
4	Fl - F4	48	12,76	2,1	0,24	99
5	Fl - F5	60	15, 95	2,7	0,36	98
6	Fl - F6	72	19, 14	3,2	0,5	98
7	Fl - F7	84	22,33	3,7	0,66	97
8	Fl - F8	90	23, 94	4,0	0,79	97

[00178] En augmentant les densités de charge jusqu'à 4 mg de PT/ml, on a encore obtenu des valeurs 5 élevées (97 %). Voir le tableau 21 et la figure 7.

[00179] L'augmentation de la densité de charge jusqu'à 60 mg de PS/ml a produit des valeurs élevées (93 %) .

BE2017/5905

Tableau 21

Polysaccharides
Groupe	Volume total	PS chargé dans la colonne	Densités de charge en PS totaux (VC de 6 ml )	Teneur en PS du groupe élué	% de PS
N°	Fractions combinées	(ml)	(mg)	(mg de PS/ml de résine)	(mg)	( %)
1	Fl	12	48,02	8	33	69
2	Fl + F2	24	96,05	16	74	77
3	Fl - F3	36	144,07	24	121	84
4	Fl - F4	48	192, 1	32	168	87
5	Fl - F5	60	240,12	40	215	90
6	Fl - F6	72	288,14	48	263	91
7	Fl - F7	84	336,17	56	311	92
8	Fl - F8	90	360,38	60	335	93

BE2017/5905

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1. Procédé d'élimination des protéines à partir

Claims (19)

1. REVENDICATIONS d'une solution de départ comprenant des polysaccharides capsulaires bactériens (PSC) et des protéines bactériennes, comprenant une étape de filtration de ladite solution de départ en utilisant une chromatographie pour fournir un éluat, où ladite chromatographie utilise une phase stationnaire de chromatographie, et ladite phase stationnaire est une résine polymère particulaire.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la chromatographie est une chromatographie sur colonne.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans lequel la résine polymère particulaire est sous la forme de particules sphériques,

   BE2017/5905 et la résine polymère est faite de polystyrène, de polydivinylbenzène, de copolymères de divinylbenzène et de styrène, ou de styrène et de divinylbenzène réticulés.
4. 4. Procédé selon

   1 ' une quelconque des revendications précédentes, dans polymère présente une ou plusieurs lequel la résine des caractéristiques suivantes :

   (a) le diamètre d'un échantillon représentatif desdites particules sphériques se situe dans la plage d'environ 300 μm à environ 1500 μm, environ 500 μm à environ 750 μm, environ 560 μm à environ 710 μm, environ 350 à environ 600 μm, ou environ 350 μm à environ 1200 μm ;

   (b) non ionique ;

   BE2017/5905 (c) stable dans une plage de valeurs de pH de 0 à 14, 0 à 12, 1 à 14, 1 à 12, 2 à 14, ou 2 à 12 ;

   (d) contient des pores avec un diamètre moyen d'environ 100 Angströms (Â), environ 200 Â, environ 350 Â, environ 600 Â, environ 700 Â, ou environ 1100 Â, (e) contient des pores avec une plage de diamètres, situés dans la plage d'environ 200 Â à environ 250 Â, environ 200 Â à environ 300 Â, environ 300 Â à environ 400 Â, ou environ 300 Â à environ 500 Â ; et (f) contient des macropores situés dans la plage de diamètres d'environ 10 microns à environ 200 microns.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où la résine polymère est sous la forme de particules sphériques faites de styrène et de divinylbenzène réticulés et ayant une plage de diamètres entre environ 35 et environ 120 μm et une plage de tailles de pores entre environ 200 et environ 300 Â.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, où au moins 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 87 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,2 %, 99,5 %, 99,9 % ou 100 % des protéines sont éliminées de la solution de départ par ladite chromatographie.
7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, où au moins 50 %, 60 %, 70 %,

   80 %, 85 %, 87 %, 90 %, 91 % , 92 % , 93 %, 94 %, 95 o θ r 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % des PSC dans la solution de départ sont retenus dans 1'éluat après la chromatographie. 8. Procédé selon 1 . ' une quelconque des revendications précédentes, dans lequel 1'étape de

   BE2017/5905 filtration de la solution de départ utilisant une chromatographie telle que la phase stationnaire de la chromatographie est une résine polymère particulaire, aboutit à l'élimination d'au moins 90 % des protéines présentes dans la solution de départ, tout en retenant au moins 80 %, 83 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %,
8. 9. Procédé selon

   1 ' une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la différence de distribution des masses moléculaires des

   PSC dans la solution de départ et de moléculaires environ environ environ distribution inférieure à des PSC dans inférieure à des masses

   1'éluat est inférieure à environ 8 %, inférieure à environ 3 %, inférieure à environ 1 %.

   1 ' une quelconque des

   Procédé selon revendications précédentes, dans lequel la solution de départ comprend un tampon à environ pH 8, éventuellement un tampon phosphate de sodium (NaPi).
9. 11. Procédé selon

   1 ' une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape de filtration de la solution de départ utilisant une chromatographie est démarrée à une densité de charge en protéines d'environ

   0,5 à environ 4,0 mg de protéines
10. 12. Procédé selon

    1 ' une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape de filtration de la solution de départ utilisant une

    PSC d'environ 40 à environ

    60 mg de polysaccharides totaux par millilitre de résine particulaire.

    chromatographie est démarrée à une densité de charge en

    BE2017/5905
11. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, où le procédé ne comprend pas d'étape de traitement avec un détergent cationique pour précipiter les polysaccharides capsulaires.
12. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la chromatographie est précédée des étapes suivantes :

    (a) la précipitation alcoolique des protéines et/ou des acides nucléiques contaminants ; et (b) la diafiltration.
13. 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la chromatographie est suivie des étapes suivantes :

    (a) la ré-N-acétylation ; et (b) la diafiltration. 16. Procédé selon la revendication 1, comprenant (a) la fourniture d'une composition contenant d

    polysaccharides capsulaires bactériens (PSC) et des protéines bactériennes ;

    (b) la mise en contact de ladite composition avec une solution alcoolique, et l'élimination de tout précipité qui se forme ;

    (c) le maintien du matériau non précipité issu de l'étape (b) en solution et la filtration de la solution pour éliminer les composés de masse moléculaire plus petite tout en retenant les polysaccharides capsulaires en solution ; et (d) le recueil du filtrat issu de l'étape (c) et l'élimination par chromatographie des contaminants protéiniques à partir dudit filtrat, en utilisant une

    BE2017/5905 phase stationnaire de résine polymère, pour fournir des polysaccharides capsulaires purifiés.
14. 17. Procédé selon la revendication 16 comprenant en outre une ou plusieurs des étapes suivantes :

    (e) la ré-N-acétylation des polysaccharides capsulaires purifiés, (f) la précipitation des polysaccharides capsulaires purifiés ; et (g) la conjugaison des polysaccharides capsulaires purifiés à une protéine de support.
15. 18. Procédé selon la revendication 16, dans lequel l'étape (b) comprend l'addition d'une solution alcoolique à une concentration suffisante pour précipiter les acides nucléiques contaminants mais pas les polysaccharides capsulaires.
16. 19. Procédé selon la revendication 18, où ladite solution alcoolique est choisie parmi :

    (a) une solution alcoolique comprenant de 1 ' éthanol ; et (b) une solution alcoolique comprenant de l'éthanol et du CaC12.
17. 20. Procédé selon la revendication 18 où ladite solution alcoolique est ajoutée à une concentration située entre environ 10 % et environ 50 % d'éthanol, comme environ 30 % de d'éthanol.
18. 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes où ledit polysaccharide capsulaire bactérien est un PSC de Streptococcus agalactiae.

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19. 22. Procédé selon la revendication 24 où ledit PSC de Streptococcus agalactiae est choisi parmi les sérotypes la, Ib, II, III, IV, et V.