CN117643624A - 一种双价多糖结合疫苗的制备方法及双价多糖结合疫苗 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种双价多糖结合疫苗的制备方法及双价多糖结合疫苗，涉及疫苗制备技术领域。一种双价多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：将含有两种不同的脑膜炎球菌多糖的溶液解聚，得第一脑膜炎球菌多糖解聚液和第二脑膜炎球菌多糖解聚液，再分别调节pH至碱性后，再分别加入活化剂，得第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液；在第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖‑linker连接物，再加入第二脑膜炎球菌多糖活化液，得双价多糖‑linker连接物后，再与载体蛋白在缩合剂的作用下形成双价多糖‑linker‑蛋白结合物，纯化，得双价多糖结合疫苗。该双价多糖结合疫苗的免疫原性较高。
Description
技术领域
本申请涉及疫苗制备技术领域，特别涉及一种双价多糖结合疫苗的制备方法及双价多糖结合疫苗。
背景技术
脑膜炎奈瑟菌是引起细菌性脑膜炎和败血症的主要原因，通常由脑膜炎奈瑟菌血清型A、B、C、Y或W135群引起。脑膜炎球菌病的预防包括分离、化学预防和接种疫苗。而针对血清型脑膜炎奈瑟菌的脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗对脑膜炎球菌病的预防非常有效，副作用也最小。脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗是通过化学键的方式将荚膜多糖与各种载体蛋白结合，形成稳定的化学结构，使原本的T细胞非依赖性抗原转变为T细胞依赖性抗原。多糖蛋白结合疫苗能有效地激发2岁以下儿童以及免疫缺陷者的免疫反应与免疫记忆，且保护时间长。相比多糖疫苗，多糖蛋白结合疫苗的覆盖年龄范围更广，免疫效果更好，优势相当明显。因此，采用多价脑膜炎球菌多糖结合疫苗来预防流行性脑膜炎是现如今最佳医疗的策略。
但目前多价结合疫苗的生产涉及几个或是很多个单价结合物原液的组装过程，需要将单价结合物原液按不同的比例混合，然后按照制剂配方冻干，这样会导致操作耗时，增加了多个过程，过程越多就需要更多的风险控制点，同时，当结合疫苗价次过高时，传统的混合方法也会对靶抗原的免疫性降低。因此，为降低疫苗制造过程中的风险控制，提高结合疫苗的免疫原性，本申请提出一种新的多糖结合疫苗的制备方法。
发明内容
本申请的主要目的是提供一种双价多糖结合疫苗的制备方法及双价多糖结合疫苗，旨在解决现有的多糖结合疫苗免疫原性不高的技术问题。
为实现上述目的，本申请提出了一种双价多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液解聚，得到第一脑膜炎球菌多糖解聚液和第二脑膜炎球菌多糖解聚液；
分别调节所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液的pH至碱性后，再分别加入活化剂进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液；
在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，反应结束后，得到双价多糖-linker连接物；
将所述双价多糖-linker连接物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成双价多糖-linker-蛋白结合物；
将所述双价多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到双价多糖结合疫苗。
可选地，所述脑膜炎球菌多糖包括脑膜炎奈瑟菌血清型A群、C群、Y群、X群以及W135群。
可选地，所述分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液解聚，得到第一脑膜炎球菌多糖解聚液和第二脑膜炎球菌多糖解聚液的步骤，包括：
分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液在1000bar-1100bar的压强下，均质10次-15次，得到分子量为5万-9万的第一脑膜炎球菌多糖解聚液和分子量为5万-9万的第二脑膜炎球菌多糖解聚液，于2℃-8℃下保存。
可选地，所述分别调节所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液的pH至碱性后，再分别加入活化剂进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液的步骤，包括：
分别在所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液中加入NaOH溶液，调节pH为9.5-10.5，再分别加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液。
可选地，所述在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，反应结束后，得到双价多糖-linker连接物的步骤，包括：
在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物后，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，于2℃-8℃下反应15h-17h，反应结束后，进行超滤，得到双价多糖-linker连接物。
可选地，所述连接剂为3臂-PEG试剂，所述连接剂的结构式为：
。
可选地，所述将所述双价多糖-linker连接物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成双价多糖-linker-蛋白结合物的步骤，包括：
在所述双价多糖-linker连接物中加入PBS缓冲液，调节pH为5.5-6.5，再加入载体蛋白和缩合剂，在3℃-5℃下反应2h-4h，再进行超滤，得到双价多糖-linker-蛋白结合物。
可选地，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。
可选地，所述将所述双价多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到双价多糖结合疫苗的步骤，包括：
将所述双价多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，于2℃-8℃下保存，即得双价多糖结合疫苗。
本申请还提出了一种双价多糖结合疫苗，采用上述双价多糖结合疫苗的制备方法所得。
本申请首先将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖解聚成较小的分子量，适宜的分子量有利于脑膜炎球菌多糖与载体蛋白的结合，再分别对两种不同的脑膜炎球菌多糖上的羟基进行活化，以便于连接剂通过活化的羟基连接到脑膜炎球菌多糖上，在第一脑膜炎球菌多糖与连接剂形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物后，再与第二脑膜炎球菌多糖进行反应，使得第二脑膜炎球菌多糖同时连接到第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物上，形成双价多糖-linker连接物，这样即可通过一个连接剂同时连接两种不同的多糖，再在缩合剂的催化作用下，使双价多糖-linker连接物与载体蛋白发生缩合反应，形成双价多糖-linker-蛋白结合物，即可在一个载体蛋白上偶联两种不同的脑膜炎球菌多糖抗原，如此可降低多糖结合疫苗中的蛋白含量，进而避免潜在的载体蛋白所诱导的表位抑制，且本申请通过在一个载体蛋白上偶联两种不同的抗原来增加免疫原性，避免了传统的对单价结合物原液混合的方式所引起的对靶抗原的免疫性降低的问题，且由于载体蛋白含量的大幅减少，其所诱导的表位抑制降低，进而避免了通过增加血清型数量所导致的对竞争性抑制靶点的免疫原性产生影响的问题，从而提高了多糖结合疫苗的免疫原性，同时还可节省载体蛋白的用量，且本申请无需将多个单价结合物原液按不同的比例混合，可以节省疫苗制造工序，从而降低了疫苗制造过程中的风险控制点，有利于制备得到具有更高免疫原性的多糖结合疫苗。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本申请实施例所述的双价多糖结合疫苗的合成路线图；
图2为本申请实施例所述的双价多糖结合疫苗的纯化谱图。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
目前，多价结合疫苗的生产通常会涉及几个或是很多个单价结合物原液的组装过程，需要将单价结合物原液按不同的比例混合，然后按照制剂配方冻干，这样会导致操作耗时，并且增加了多个过程，而过程越多就需要更多的风险控制点，同时，当结合疫苗价次过高时，传统的混合方法也会对靶抗原的免疫性降低，所以，如果要提高结合疫苗的免疫原性就需要血清型数量的增加，但是血清型增加又会影响竞争性抑制靶点的免疫原性，因此，传统方法所制备的结合疫苗难以提高其免疫原性。
针对现有技术所存在的技术问题，本申请的实施例提供了一种双价多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液解聚，得到第一脑膜炎球菌多糖解聚液和第二脑膜炎球菌多糖解聚液；
分别调节所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液的pH至碱性后，再分别加入活化剂进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液；
在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，反应结束后，得到双价多糖-linker连接物；
将所述双价多糖-linker连接物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成双价多糖-linker-蛋白结合物；
将所述双价多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到双价多糖结合疫苗。
如图1所示，本申请首先将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖解聚成较小的分子量，适宜的分子量有利于脑膜炎球菌多糖与载体蛋白的结合，再分别对两种不同的脑膜炎球菌多糖上的羟基进行活化，以便于连接剂通过活化的羟基连接到脑膜炎球菌多糖上，在第一脑膜炎球菌多糖与连接剂形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物后，再与第二脑膜炎球菌多糖进行反应，使得第二脑膜炎球菌多糖同时连接到第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物上，形成双价多糖-linker连接物，这样即可通过一个连接剂同时连接两种不同的多糖，再在缩合剂的催化作用下，使双价多糖-linker连接物与载体蛋白发生缩合反应，形成双价多糖-linker-蛋白结合物，即可在一个载体蛋白上偶联两种不同的脑膜炎球菌多糖抗原，如此可降低多糖结合疫苗中的蛋白含量，进而避免潜在的载体蛋白所诱导的表位抑制，且本申请通过在一个载体蛋白上偶联两种不同的抗原来增加免疫原性，避免了传统的对单价结合物原液混合的方式所引起的对靶抗原的免疫性降低的问题，且由于载体蛋白含量的大幅减少，其所诱导的表位抑制降低，进而避免了通过增加血清型数量所导致的对竞争性抑制靶点的免疫原性产生影响的问题，从而提高了多糖结合疫苗的免疫原性，同时还可节省载体蛋白的用量，且本申请无需将多个单价结合物原液按不同的比例混合，可以节省疫苗制造工序，从而降低了疫苗制造过程中的风险控制点，有利于制备得到具有更高免疫原性的多糖结合疫苗。
作为本申请的一种可实施方式，所述脑膜炎球菌多糖包括脑膜炎奈瑟菌血清型A群、C群、Y群、X群以及W135群。
由于细菌性脑膜炎和败血症主要由脑膜炎奈瑟菌血清型A群、C群、Y群、X群以及W135群，针对血清型脑膜炎奈瑟菌的多糖结合疫苗需要将相应的荚膜多糖与载体蛋白结合，形成稳定的多糖蛋白结合物，使原本的T细胞非依赖性抗原转变为T细胞依赖性抗原，以激发使用者的免疫反应和免疫记忆，故本申请所采用的脑膜炎球菌多糖包括脑膜炎奈瑟菌血清型A群、C群、Y群、X群以及W135群。
作为本申请的一种可实施方式，所述分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液解聚，得到第一脑膜炎球菌多糖解聚液和第二脑膜炎球菌多糖解聚液的步骤，包括：
分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液在1000bar-1100bar的压强下，均质10次-15次，得到分子量为5万-9万的第一脑膜炎球菌多糖解聚液和分子量为5万-9万的第二脑膜炎球菌多糖解聚液，于2℃-8℃下保存。
由于多糖的分子量对于多糖与蛋白的结合会产生影响，多糖的分子量过大与过小时都会影响多糖蛋白结合物的分子量，进而影响多糖蛋白结合物的免疫原性，故本申请首先将第一脑膜炎球菌多糖和第二脑膜炎球菌多糖进行解聚成较小分子量，第一脑膜炎球菌多糖和第二脑膜炎球菌多糖分子量优选为5万-9万，有利于与载体蛋白的结合。
作为本申请的一种可实施方式，所述分别调节所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液的pH至碱性后，再分别加入活化剂进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液的步骤，包括：
分别在所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液中加入NaOH溶液，调节pH为9.5-10.5，再分别加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液。
在具体实施过程中，本申请以1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐（CDAP）作为活化剂，其可将多糖上的羟基活化，形成多糖氰化物，使得连接剂能够通过氰基连接到多糖氰化物上，以便于后续多糖与载体蛋白通过连接剂进行连接，从而得到多糖与蛋白的结合物。
作为本申请的一种可实施方式，所述在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，反应结束后，得到双价多糖-linker连接物的步骤，包括：
在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物后，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，于2℃-8℃下反应15h-17h，反应结束后，进行超滤，得到双价多糖-linker连接物。
为将两种不同的脑膜炎球菌多糖连接到同一个连接剂上，本申请首先将连接剂与活化后的第一脑膜炎球菌多糖进行连接，再与活化的第二脑膜炎球菌多糖连接，最后再通过超滤去除NaOH、1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐以及连接剂等杂质，从而得到的双价多糖-linker连接物上同时偶联了两种血清型脑膜炎球菌多糖，以便于后续制备双价多糖结合物。
作为本申请的一种可实施方式，所述连接剂为3臂-PEG试剂，所述连接剂的结构式为：
。
具体的，在该3臂-PEG试剂中含有羧基基团和两个氨基基团，而氨基可与氰基反应，经过活化后的脑膜炎球菌多糖的羟基转化成了氰基，3臂-PEG试剂中的两个氨基基团通过与脑膜炎球菌多糖上的氰基反应而连接，使得通过一个3臂-PEG试剂即可同时连接两种不同血清型的脑膜炎球菌多糖，而3臂-PEG试剂中的羧基基团又可与载体蛋白上的氨基反应，形成稳定的化学结构，如此即可将两种不同血清型的脑膜炎球菌多糖通过同一个载体蛋白进行结合，减少了载体蛋白的含量。
作为本申请的一种可实施方式，所述将所述双价多糖-linker连接物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成双价多糖-linker-蛋白结合物的步骤，包括：
在所述双价多糖-linker连接物中加入PBS缓冲液，调节pH为5.5-6.5，再加入载体蛋白和缩合剂，在3℃-5℃下反应2h-4h，再进行超滤，得到双价多糖-linker-蛋白结合物。
在具体实施过程中，在缩合剂的作用下，双价多糖-linker连接物上的羧基与载体蛋白上的氨基会发生缩合反应，从而双价形成多糖-linker-蛋白结合物，再通过超滤，可去除未反应的缩合剂，以便于后续纯化去除未结合的多糖与载体蛋白，得到纯度更高的双价多糖-linker-蛋白结合物。
具体的，载体蛋白包括CRM197蛋白、DT蛋白以及TT蛋白中的一种。CRM197蛋白是指白喉毒素突变体，DT蛋白为人工制备的失活白喉毒素，TT蛋白为甲醛处理的破伤风梭菌制备物。
作为本申请的一种可实施方式，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐（DMTMM）。
具体的，4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐可作为一种性能优异的缩合试剂与其他化学试剂或小分子底物进行结合，形成更具特异性和生物活性的活性化合物，而双价多糖-linker连接物分子结构上含有羧基，在缩合试剂的作用下，可与载体蛋白上的氨基发生特异性结合，形成具有特异性的活性化合物。
作为本申请的一种可实施方式，所述将所述双价多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到双价多糖结合疫苗的步骤，包括：
将所述双价多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，于2℃-8℃下保存，即得双价多糖结合疫苗。
具体的，本申请采用AKTA pure蛋白纯化系统与4FF凝胶色谱柱对多糖蛋白结合物进行层析纯化，采用波长为280nm的紫外检测器检测流出液，经缓冲液洗脱后出现洗脱峰，收集洗脱峰部分，并通过注射用水超滤换液后，再经0.22μm的滤膜过滤，即可得到纯度较高的双价多糖蛋白结合物。
本申请的实施例还提供了一种双价多糖结合疫苗，采用上述双价多糖结合疫苗的制备方法所得。
下面结合具体实施例对本申请上述技术方案进行详细说明。
实施例1
一种双价多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
如图1所示，分别将A群、C群脑膜炎球菌多糖的溶液在1050bar的压强下，均质13次，得到分子量为7万、浓度为3mg/mL的A群脑膜炎球菌多糖解聚液和分子量为7万、浓度为3mg/mL的C群脑膜炎球菌多糖解聚液，于5℃下保存；
分别在A群脑膜炎球菌多糖解聚液和C群脑膜炎球菌多糖解聚液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节pH为10，再分别加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化，得到A群脑膜炎球菌多糖氰化物与C群脑膜炎球菌多糖氰化物；
在A群脑膜炎球菌多糖氰化物中加入3臂-PEG试剂，形成A群脑膜炎球菌多糖-linker连接物后，再加入C群脑膜炎球菌多糖氰化物，于5℃下反应16h，反应结束后，进行超滤，得到双价多糖-linker连接物；
在双价多糖-linker连接物中加入PBS缓冲液，调节pH为6.0，再加入CRM197蛋白和缩合剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，使缩合剂浓度为40mol/L，在4℃下反应3h，再进行超滤，得到双价多糖-linker-蛋白结合物；
将双价多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，纯化谱图如图2所示，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，于5℃下保存，即得双价多糖结合疫苗。
实施例2
一种双价多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
分别将A群、Y群脑膜炎球菌多糖的溶液在1000bar的压强下，均质15次，得到分子量为5万、浓度为2mg/mL的A群脑膜炎球菌多糖解聚液和分子量为5万、浓度为2mg/mL的Y群脑膜炎球菌多糖解聚液，于2℃下保存；
分别在A群脑膜炎球菌多糖解聚液和Y群脑膜炎球菌多糖解聚液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节pH为9.5，再分别加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化，得到A群脑膜炎球菌多糖氰化物与Y群脑膜炎球菌多糖氰化物；
在A群脑膜炎球菌多糖氰化物中加入3臂-PEG试剂，形成A群脑膜炎球菌多糖-linker连接物后，再加入Y群脑膜炎球菌多糖氰化物，于2℃下反应17h，反应结束后，进行超滤，得到双价多糖-linker连接物；
在双价多糖-linker连接物中加入PBS缓冲液，调节pH为5.5，再加入DT蛋白和缩合剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，使缩合剂浓度为30mol/L，在3℃下反应4h，再进行超滤，得到双价多糖-linker-蛋白结合物；
将双价多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，于2℃下保存，即得双价多糖结合疫苗。
实施例3
一种双价多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
分别将C群、X群脑膜炎球菌多糖的溶液在1100bar的压强下，均质10次，得到分子量为9万、浓度为5mg/mL的C群脑膜炎球菌多糖解聚液和分子量为9万、浓度为5mg/mL的X群脑膜炎球菌多糖解聚液，于8℃下保存；
分别在C群脑膜炎球菌多糖解聚液和X群脑膜炎球菌多糖解聚液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节pH为10.5，再分别加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化，得到C群脑膜炎球菌多糖氰化物与X群脑膜炎球菌多糖氰化物；
在C群脑膜炎球菌多糖氰化物中加入3臂-PEG试剂，形成C群膜炎球菌多糖-linker连接物后，再加入X群脑膜炎球菌多糖氰化物，于8℃下反应17h，反应结束后，进行超滤，得到双价多糖-linker连接物；
在双价多糖-linker连接物中加入PBS缓冲液，调节pH为6.5，再加入TT蛋白和缩合剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，使缩合剂浓度为50mol/L，在5℃下反应2h，再进行超滤，得到双价多糖-linker-蛋白结合物；
将双价多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，于8℃下保存，即得双价多糖结合疫苗。
实施例4
一种双价多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
分别将Y群、W135群脑膜炎球菌多糖的溶液在1100bar的压强下，均质12次，得到分子量为6万、浓度为4mg/mL的Y群脑膜炎球菌多糖解聚液和分子量为6万、浓度为4mg/mL的W135群脑膜炎球菌多糖解聚液，于6℃下保存；
分别在Y群脑膜炎球菌多糖解聚液和W135群脑膜炎球菌多糖解聚液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节pH为10，再分别加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化，得到Y群脑膜炎球菌多糖氰化物与W135群脑膜炎球菌多糖氰化物；
在Y群脑膜炎球菌多糖氰化物中加入3臂-PEG试剂，形成Y群脑膜炎球菌多糖-linker连接物后，再加入W135群脑膜炎球菌多糖氰化物，于6℃下反应16h，反应结束后，进行超滤，得到双价多糖-linker连接物；
在双价多糖-linker连接物中加入PBS缓冲液，调节pH为6，再加入CRM197蛋白和缩合剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，使缩合剂浓度为40mol/L，在4℃下反应3h，再进行超滤，得到双价多糖-linker-蛋白结合物；
将双价多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，于6℃下保存，即得双价多糖结合疫苗。
以上所述仅为本申请的可选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是在本申请的发明构思下，利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液解聚，得到第一脑膜炎球菌多糖解聚液和第二脑膜炎球菌多糖解聚液；
分别调节所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液的pH至碱性后，再分别加入活化剂进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液；
在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，反应结束后，得到双价多糖-linker连接物；
将所述双价多糖-linker连接物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成双价多糖-linker-蛋白结合物；
将所述双价多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到双价多糖结合疫苗。
2.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述脑膜炎球菌多糖包括脑膜炎奈瑟菌血清型A群、C群、Y群、X群以及W135群。
3.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液解聚，得到第一脑膜炎球菌多糖解聚液和第二脑膜炎球菌多糖解聚液的步骤，包括：
分别将两种不同类型的脑膜炎球菌多糖溶液在1000bar-1100bar的压强下，均质10次-15次，得到分子量为5万-9万的第一脑膜炎球菌多糖解聚液和分子量为5万-9万的第二脑膜炎球菌多糖解聚液，于2℃-8℃下保存。
4.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述分别调节所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液的pH至碱性后，再分别加入活化剂进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液的步骤，包括：
分别在所述第一脑膜炎球菌多糖解聚液和所述第二脑膜炎球菌多糖解聚液中加入NaOH溶液，调节pH为9.5-10.5，再分别加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化，得到第一脑膜炎球菌多糖活化液与第二脑膜炎球菌多糖活化液。
5.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，反应结束后，得到双价多糖-linker连接物的步骤，包括：
在所述第一脑膜炎球菌多糖活化液中加入连接剂，形成第一脑膜炎球菌多糖-linker连接物后，再加入所述第二脑膜炎球菌多糖活化液，于2℃-8℃下反应15h-17h，反应结束后，进行超滤，得到双价多糖-linker连接物。
6.根据权利要求5所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述连接剂为3臂-PEG试剂，所述连接剂的结构式为：
。
7.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将所述双价多糖-linker连接物与载体蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，形成双价多糖-linker-蛋白结合物的步骤，包括：
在所述双价多糖-linker连接物中加入PBS缓冲液，调节pH为5.5-6.5，再加入载体蛋白和缩合剂，在3℃-5℃下反应2h-4h，再进行超滤，得到双价多糖-linker-蛋白结合物。
8.根据权利要求7所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述缩合剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。
9.根据权利要求1所述的双价多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将所述双价多糖-linker-蛋白结合物进行纯化，得到双价多糖结合疫苗的步骤，包括：
将所述双价多糖-linker-蛋白结合物通过4FF层析柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，于2℃-8℃下保存，即得双价多糖结合疫苗。
10.一种双价多糖结合疫苗，其特征在于，采用如权利要求1-9任一项所述的双价多糖结合疫苗的制备方法所得。
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