CN117089080A - 新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法，涉及疫苗制备技术领域。本发明包括第一种路线和第二种路线，第一种路线至少包括以下步骤：S1：将1、2、3型肺炎球菌多糖超声解聚；S2：在碱性条件下使用1‑氰‑4‑二甲氨基‑吡啶四氟硼酸盐（CDAP）将多糖上的羟基活化为氰基；S3：加入ADH己二酸二酰肼的一个肼基连接，形成多糖‑酰肼基衍生物；S4：加入炔基化合物BCN‑OH(1R,8S,9S)‑双环[6.1.0]壬‑4‑炔‑9‑基甲醇)中间体。本发明采用无铜点击化学对1、2、3型肺炎球菌多糖与CRM197蛋白进行结合。以探索全新的结合路线对三种肺炎球菌多糖结合蛋白的影响，为后续工艺多价肺炎球菌结合疫苗提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，具体为新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法。
背景技术
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, Spn)是一种兼性厌氧革兰氏阳性菌，是上呼吸道共生菌群的一部分，可无症状地定殖于鼻咽。若Spn定殖鼻咽后没有被免疫系统清除，则会传播到下呼吸道以及其他器官和组织中，引起许多Spn相关的疾病，例如：脑膜炎、菌血症、肺炎、急性中耳炎和鼻窦炎，其中侵袭性肺炎链球菌疾病(invasivepneumococcal disease，IPD)具有很高的致死率。Spn在两岁以下的儿童和老年人中的发病率更高。
肺炎链球菌荚膜多糖(capsule polysaccharides，CPS)是主要的毒力因子之一覆盖细菌整个表面，其作用机制是掩盖细胞表面并阻断针对细胞表面抗原的补体沉积，从而使细菌能够逃避吞噬作用并在宿主鼻咽处定殖。至今，已鉴定出98种肺炎链球菌血清型。CPS上补体沉积及其与补体抑制蛋白(如H因子)结合的不同，导致了不同血清型侵袭性上的差异，这种差异体现在Spn疾病发病机制的各个方面，包括对抗菌剂的敏感性和耐药性，血清型的比例也会随着时间的流逝和疫苗的使用而变化。同时CPS还具有免疫原性，可诱导产生抗肺炎链球菌感染的抗体，这也是目前研制肺炎球链菌疫苗的免疫学基础。
目前，市售的肺炎疫苗有两种：肺炎链球菌多糖疫苗(pneumococcalpolysaccharide vaccines，PPV)和肺炎链球菌结合疫苗(pneumococcal conjugatevaccine，PCV)。荚膜多糖属于非胸腺依赖性抗原(thymus independent antigen，TI-Ag)中的TI-2 Ag，用这种抗原进行免疫时只能通过交联B细胞受体(B-cell receptor，BCR)刺激成熟B细胞产生应答，而无法活化T细胞，也不能形成免疫记忆。因此，PPV在婴幼儿、老年人和免疫缺陷患者等人群中的免疫反应低下。这种缺陷可以通过将多糖抗原与蛋白载体缀合来克服，已经证明这种糖缀合物可有效诱导胸腺依赖性免疫。目前，应用最广泛的结合疫苗沛儿13就是由13种血清型的CPS与无毒的白喉毒素突变体(CRM197)偶联制成。目前常用的结合路线一是酰胺化，二是还原胺化。
尽管目前市售的肺炎链球菌疫苗可预防其所包含的肺炎链球菌血清型感染，但越来越多的数据表明市售疫苗针对3型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae serotype3，ST3)的免疫效果不佳。3型肺炎链球菌是成人IPD的第二大常见病原体，由其导致的IPD死亡率约为30%:，因此需要对以上问题提出一种新的解决方案。
发明内容
本发明的目的在于提供新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法，包括第一种路线和第二种路线，所述第一种路线至少包括以下步骤：
S1：将1、2、3型肺炎球菌多糖超声解聚；
S2：在碱性条件下使用1-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐（CDAP）将多糖上的羟基活化为氰基；
S3：加入ADH己二酸二酰肼的一个肼基连接，形成多糖-酰肼基衍生物；
S4：加入炔基化合物BCN-OH(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇)中间体；
S5：将叠氮四聚乙二醇乙酸与CRM197蛋白连接中间体；
S6：将多糖与炔基化合物中间体与叠氮四聚乙二醇乙酸与CRM197蛋白中间体混合，在碱性条件下形成疫苗结合物。
优选的，所述第二种路线至少包括以下步骤：
S1：将1、2、3型肺炎球菌多糖超声解聚；
S2：在酸性条件下使用高典酸钠将多糖上的羟基活化为醛基；
S3：加入ADH己二酸二酰肼与氰基硼氢化纳形成多糖衍生物；
S4：加入炔基化合物BCN-OH(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇)形成中间体；
S5：将叠氮四聚乙二醇乙酸与CRM197蛋白连接中间体；
S6：将多糖与炔基化合物中间体与叠氮四聚乙二醇乙酸与CRM197蛋白中间体混合，在碱性条件下形成疫苗结合物。
优选的，所述第一种路线中的多糖超声解聚至少包括以下步骤：取肺炎1、2、3型多糖溶液20ml，多糖溶液的浓度为1.5～2mg/ml，放置于超声波细胞粉碎机中。设置功率为300W，超声间隔为超声3s，终止1s，超声30～40min；
所述第二种路线中的多糖超声解聚至少包括以下步骤：取肺炎1、2、3型多糖溶液20ml，多糖溶液的浓度为1.5～2mg/ml，放置于超声波细胞粉碎机中，调节变幅杆为6，设置功率为300W，超声间隔为超声3S，终止1S，超声30～40min。
优选的，所述第一种路线中的多糖衍生至少包括以下步骤：将解聚后的CP1、CP2和CP3溶液浓缩至5mg/ml，所述CP1、CP2和CP3对应肺炎1型、2型和3型多糖，取1ml CP2溶液加入pH为9的NH4Cl-NH3缓冲液1ml调节pH，然后加入浓度为20mg/ml的 CDAP溶液200ul，混匀，室温活化3min，加入固体ADH 20 mg，充分混匀后放2~8℃条件下反应过夜，反应结束后，将衍生物超滤除掉ADH；
所述第二种路线中的多糖衍生至少包括以下步骤：将解聚后的CP1、CP2、CP3溶液浓缩至7mg/ml，所述CP1、CP2和CP3对应肺炎1型、2型和3型多糖，分别取720μl CP2溶液至3支5ml离心管中，分别加入pH为4.8的醋酸-醋酸铵缓冲液820μl调节pH，然后分别加入浓度为5mg/ml的高碘酸钠溶液60μl，混匀，25℃恒温水浴氧化20h，反应结束后，将氧化多糖超滤除掉高碘酸钠与醋酸-醋酸铵缓冲液。
优选的，所述第一种路线中的形成中间体至少包括以下步骤：将衍生后的多糖衍生样品用1000WMCO超滤管超滤换液，浓缩至5mg/ml后，加入炔基化合物BCN-OH(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇)形成中间体，于2~8度反应16h，用3000WMCO超滤管超滤换液，得到结合物；
所述第二种路线中的形成中间体至少包括以下步骤：将衍生后的衍生后的多糖衍生样品用1000WMCO超滤管超滤换液，浓缩至5mg/ml后，加入炔基化合物BCN-OH(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇)形成中间体，于室温反应4h，用3000WMCO超滤管超滤换液，得到结合物。
优选的，所述第一种路线中的活化蛋白和第二种路线中的活化蛋白步骤相同，所述活化蛋白至少包括以下步骤：CRM197蛋白用pH为6的PBS浓缩为4～6mg/ml，然后加入浓度为20mg/ml的叠氮四聚乙二醇乙酸，再加入20mg/ml的DMT试剂，形成蛋白-叠氮四聚乙二醇乙酸化合物，用1000WMOC超滤管超滤换液，除去小分子。
优选的，所述第一种路线中的形成多糖蛋白结合物和第二种路线中的形成多糖蛋白结合物的步骤相同，所述形成多糖蛋白结合物至少包括以下步骤：将中间体和活化后的蛋白在pH为8的碱性条件下，在25度反应16h，形成多糖蛋白结合物，反应结束用3000WMCO超滤管超滤换液，除去小分子。
优选的，所述第一种路线中的形成疫苗结合物和第二种路线中的形成疫苗结合物相的步骤相同，所述形成疫苗结合物至少包括以下步骤：将肺炎多糖蛋白结合物在4FF层析柱上纯化，分段收集洗脱峰，然后将洗脱液浓缩换液测量多糖与蛋白含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用无铜点击化学对1、2、3型肺炎球菌多糖与CRM197蛋白进行结合。以探索全新的结合路线对三种肺炎球菌多糖结合蛋白的影响，为后续工艺多价肺炎球菌结合疫苗提供技术支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明第一种路线的反应原理示意图；
图2为本发明第二种路线的反应原理示意图。
实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例
请参阅图1，新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法，包括第一种路线和第二种路线，第一种路线至少包括以下步骤：
S1：将1、2、3型肺炎球菌多糖超声解聚；
S2：在碱性条件下使用1-氰-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸盐（CDAP）将多糖上的羟基活化为氰基；
S3：加入ADH己二酸二酰肼的一个肼基连接，形成多糖-酰肼基衍生物；
S4：加入炔基化合物BCN-OH(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇)中间体；
S5：将叠氮四聚乙二醇乙酸与CRM197蛋白连接中间体；
S6：将多糖与炔基化合物中间体与叠氮四聚乙二醇乙酸与CRM197蛋白中间体混合，在碱性条件下形成疫苗结合物。
第一种路线中的多糖超声解聚至少包括以下步骤：取肺炎1、2、3型多糖溶液20ml，多糖溶液的浓度为1.5～2mg/ml，放置于超声波细胞粉碎机中。设置功率为300W，超声间隔为超声3s，终止1s，超声30～40min；
第一种路线中的多糖衍生至少包括以下步骤：将解聚后的CP1、CP2和CP3溶液浓缩至5mg/ml，CP1、CP2和CP3对应肺炎1型、2型和3型多糖，取1ml CP2溶液加入pH为9的NH4Cl-NH3缓冲液1ml调节pH，然后加入浓度为20mg/ml的 CDAP溶液200ul，混匀，室温活化3min，加入固体ADH 20 mg，充分混匀后放2~8℃条件下反应过夜，反应结束后，将衍生物超滤除掉ADH；
第一种路线中的形成中间体至少包括以下步骤：将衍生后的多糖衍生样品用1000WMCO超滤管超滤换液，浓缩至5mg/ml后，加入炔基化合物BCN-OH(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇)形成中间体，于2~8度反应16h，用3000WMCO超滤管超滤换液，得到结合物；
第一种路线中的活化蛋白至少包括以下步骤：CRM197蛋白用pH为6的PBS浓缩为4～6mg/ml，然后加入浓度为20mg/ml的叠氮四聚乙二醇乙酸，再加入20mg/ml的DMT试剂，形成蛋白-叠氮四聚乙二醇乙酸化合物，用1000WMOC超滤管超滤换液，除去小分子；
第一种路线中的形成多糖蛋白结合物至少包括以下步骤：将中间体和活化后的蛋白在pH为8的碱性条件下，在25度反应16h，形成多糖蛋白结合物，反应结束用3000WMCO超滤管超滤换液，除去小分子；
第一种路线中的形成疫苗结合物至少包括以下步骤：将肺炎多糖蛋白结合物在4FF层析柱上纯化，分段收集洗脱峰，然后将洗脱液浓缩换液测量多糖与蛋白含量。
实施例
本实施例用于在上述实施例的前提下进一步的公开了第二种路线；
第二种路线至少包括以下步骤：
S1：将1、2、3型肺炎球菌多糖超声解聚；
S2：在酸性条件下使用高典酸钠将多糖上的羟基活化为醛基；
S3：加入ADH己二酸二酰肼与氰基硼氢化纳形成多糖衍生物；
S4：加入炔基化合物BCN-OH(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇)形成中间体；
S5：将叠氮四聚乙二醇乙酸与CRM197蛋白连接中间体；
S6：将多糖与炔基化合物中间体与叠氮四聚乙二醇乙酸与CRM197蛋白中间体混合，在碱性条件下形成疫苗结合物；
第二种路线中的多糖超声解聚至少包括以下步骤：取肺炎1、2、3型多糖溶液20ml，多糖溶液的浓度为1.5～2mg/ml，放置于超声波细胞粉碎机中，调节变幅杆为6，设置功率为300W，超声间隔为超声3S，终止1S，超声30～40min；
第二种路线中的多糖衍生至少包括以下步骤：将解聚后的CP1、CP2、CP3溶液浓缩至7mg/ml，CP1、CP2和CP3对应肺炎1型、2型和3型多糖，分别取720μl CP2溶液至3支5ml离心管中，分别加入pH为4.8的醋酸-醋酸铵缓冲液820μl调节pH，然后分别加入浓度为5mg/ml的高碘酸钠溶液60μl，混匀，25℃恒温水浴氧化20h，反应结束后，将氧化多糖超滤除掉高碘酸钠与醋酸-醋酸铵缓冲液；
第二种路线中的形成中间体至少包括以下步骤：将衍生后的衍生后的多糖衍生样品用1000WMCO超滤管超滤换液，浓缩至5mg/ml后，加入炔基化合物BCN-OH(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇)形成中间体，于室温反应4h，用3000WMCO超滤管超滤换液，得到结合物；
第二种路线中的活化蛋白至少包括以下步骤：CRM197蛋白用pH为6的PBS浓缩为4～6mg/ml，然后加入浓度为20mg/ml的叠氮四聚乙二醇乙酸，再加入20mg/ml的DMT试剂，形成蛋白-叠氮四聚乙二醇乙酸化合物，用1000WMOC超滤管超滤换液，除去小分子；
第二种路线中的形成多糖蛋白结合物至少包括以下步骤：将中间体和活化后的蛋白在pH为8的碱性条件下，在25度反应16h，形成多糖蛋白结合物，反应结束用3000WMCO超滤管超滤换液，除去小分子；
第二种路线中的形成疫苗结合物至少包括以下步骤：将肺炎多糖蛋白结合物在4FF层析柱上纯化，分段收集洗脱峰，然后将洗脱液浓缩换液测量多糖与蛋白含量。
本研究将采用无铜点击化学（Click Chemistry)对1、2、3型肺炎球菌多糖与CRM197蛋白进行结合。以探索全新的结合路线对三种肺炎球菌多糖结合蛋白的影响，为后续工艺多价肺炎球菌结合疫苗提供技术支撑。由于叠氮化衍生物的特异性和有效性，该反应可能会在未来药物或生物分子的设计中广泛应用。因为CRM197不具有酶活性以及毒性，但具有DT的免疫原性，因此CRM197也常被用作一种免疫蛋白载体交联其他半抗原一起作为疫苗。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (8)
1.新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法，其特征在于：包括第一种路线和第二种路线，所述第一种路线至少包括以下步骤：
S1：将1、2、3型肺炎球菌多糖超声解聚；
S2：在碱性条件下使用CDAP将多糖上的羟基活化为氰基；
S3：加入ADH的一个肼基连接，形成多糖-酰肼基衍生物；
S4：加入炔基化合物BCN-OH(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇)中间体；
S5：将叠氮四聚乙二醇乙酸与CRM197蛋白连接中间体；
S6：将多糖与炔基化合物中间体与叠氮四聚乙二醇乙酸与CRM197蛋白中间体混合，在碱性条件下形成疫苗结合物。
2.根据权利要求1所述的新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法，其特征在于：所述第二种路线至少包括以下步骤：
S1：将1、2、3型肺炎球菌多糖超声解聚；
S2：在酸性条件下使用高典酸钠将多糖上的羟基活化为醛基；
S3：加入ADH己二酸二酰肼与氰基硼氢化纳形成多糖衍生物；
S4：加入炔基化合物BCN-OH(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇)形成中间体；
S5：将叠氮四聚乙二醇乙酸与CRM197蛋白连接中间体；
S6：将多糖与炔基化合物中间体与叠氮四聚乙二醇乙酸与CRM197蛋白中间体混合，在碱性条件下形成疫苗结合物。
3.根据权利要求2所述的新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法，其特征在于：所述第一种路线中的多糖超声解聚至少包括以下步骤：取肺炎1、2、3型多糖溶液20ml，多糖溶液的浓度为1.5～2mg/ml，放置于超声波细胞粉碎机中。设置功率为300W，超声间隔为超声3s，终止1s，超声30～40min；
所述第二种路线中的多糖超声解聚至少包括以下步骤：取肺炎1、2、3型多糖溶液20ml，多糖溶液的浓度为1.5～2mg/ml，放置于超声波细胞粉碎机中，调节变幅杆为6，设置功率为300W，超声间隔为超声3S，终止1S，超声30～40min。
4.根据权利要求3所述的新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法，其特征在于：所述第一种路线中的多糖衍生至少包括以下步骤：将解聚后的CP1、CP2和CP3溶液浓缩至5mg/ml，所述CP1、CP2和CP3对应肺炎1型、2型和3型多糖，取1ml CP2溶液加入pH为9的NH4Cl-NH3缓冲液1ml调节pH，然后加入浓度为20mg/ml的 CDAP溶液200ul，混匀，室温活化3min，加入固体ADH 20 mg，充分混匀后放2~8℃条件下反应过夜，反应结束后，将衍生物超滤除掉ADH；
所述第二种路线中的多糖衍生至少包括以下步骤：将解聚后的CP1、CP2、CP3溶液浓缩至7mg/ml，所述CP1、CP2和CP3对应肺炎1型、2型和3型多糖，分别取720μl CP2溶液至3支5ml离心管中，分别加入pH为4.8的醋酸-醋酸铵缓冲液820μl调节pH，然后分别加入浓度为5mg/ml的高碘酸钠溶液60μl，混匀，25℃恒温水浴氧化20h，反应结束后，将氧化多糖超滤除掉高碘酸钠与醋酸-醋酸铵缓冲液。
5.根据权利要求4所述的新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法，其特征在于：所述第一种路线中的形成中间体至少包括以下步骤：将衍生后的多糖衍生样品用1000WMCO超滤管超滤换液，浓缩至5mg/ml后，加入炔基化合物BCN-OH(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇)形成中间体，于2~8度反应16h，用3000WMCO超滤管超滤换液，得到结合物；
所述第二种路线中的形成中间体至少包括以下步骤：将衍生后的衍生后的多糖衍生样品用1000WMCO超滤管超滤换液，浓缩至5mg/ml后，加入炔基化合物BCN-OH(1R,8S,9S)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇)形成中间体，于室温反应4h，用3000WMCO超滤管超滤换液，得到结合物。
6.根据权利要求5所述的新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法，其特征在于：所述第一种路线中的活化蛋白和第二种路线中的活化蛋白步骤相同，所述活化蛋白至少包括以下步骤：CRM197蛋白用pH为6的PBS浓缩为4～6mg/ml，然后加入浓度为20mg/ml的叠氮四聚乙二醇乙酸，再加入20mg/ml的DMT试剂，形成蛋白-叠氮四聚乙二醇乙酸化合物，用1000WMOC超滤管超滤换液，除去小分子。
7.根据权利要求6所述的新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法，其特征在于：所述第一种路线中的形成多糖蛋白结合物和第二种路线中的形成多糖蛋白结合物的步骤相同，所述形成多糖蛋白结合物至少包括以下步骤：将中间体和活化后的蛋白在pH为8的碱性条件下，在25度反应16h，形成多糖蛋白结合物，反应结束用3000WMCO超滤管超滤换液，除去小分子。
8.根据权利要求7所述的新型反应路线在肺炎球菌多糖结合疫苗制备中应用方法，其特征在于：所述第一种路线中的形成疫苗结合物和第二种路线中的形成疫苗结合物相的步骤相同，所述形成疫苗结合物至少包括以下步骤：将肺炎多糖蛋白结合物在4FF层析柱上纯化，分段收集洗脱峰，然后将洗脱液浓缩换液测量多糖与蛋白含量。
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