JPS6230726A - 糖たんぱく質結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 質結合体、その製法及びワクチンとしての使用に関する
。

特に、本発明は、ＣＲＭ　１９７、破傷風トキソイド及
び百日咳毒素から選ばれるたんぱく質に、共有結合によ
り、グラム陰性細菌の莢膜多糖から誘導された少なくと
もｌのオリゴ糖ハプテン及びグラム陰性細菌の莢膜多糖
から誘導された少なくともｌのオリゴ糖ハプテンを、こ
れらオリゴ糖ハプテンを末端エステル基導入により予備
的に活性化させた後、結合せしめることにより得られる
、三価免疫原活性を有する糖たんぱく質結合体に関する
。

髄膜炎菌及び肺炎球菌の如き莢膜を有する細菌に対する
、これら細菌から誘導された莢膜多糖抗原を使用するワ
クチンの開発では、中でも幼児におけるこれら多糖抗原
の免疫性付与機能が不充分であることを示している。

これは、かかる莢膜を有する細菌によって生ずる感染の
頻度レベルが幼児において最大となるため、特に重大か
つ興味ある問題の１つである。

糖たんぱく露結合体の合成及び使用−は、多糖抗原に対
する免疫応答を改善することにおける特に興味深い解決
法である。

Ａｖｅｒｙ（ｒＪ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、Ｊ（１９２９
）５０，５３３）及びＧｏｂｅｌ（ｒＪ、　Ｅｘｐ、　
Ｍｅｄ、　Ｊ（１９３９）６９．５３）は、約５０年前
、糖たんぱく露結合体の調製及びその使用を開示すると
共に、かかる化合物（その糖部分はストレプトコッカス
・ニューモニエ（Ｓ、　Ｐｎｅｕｍｏｉａｅ）タイプ３
の多糖である）がこの細菌に対する免疫を発揮すること
　（多糖自体よりも効果的である）を実証している。

最近では、糖たんぱく露結合体の合成の分野で多数の研
究が行なわれており、ヘモフィルス・インフルエンゼ（
！Ｉａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ　）
　ｂ型及び髄膜炎菌グループＡ及びＣを使用する場合に
荷積な効果が得られている。

米国特許第４．３５６，１７０号は、グラム陽性又はグ
ラム陰性細菌の莢膜多糖及びたんぱく質によって構成さ
れる糖たんぱく露結合体、及び莢膜を有する細菌を、た
んぱく質に結合する萌に変性して、近接する水酸基の酸
化により末端アルデヒド基を生成させることを特徴とす
るかかる糖たんぱく露結合体の調製法を開示している。

従来の方法によれば、このようにして得られた糖たんぱ
く質は、グラム陽性又はグラム陰性細菌に対するワクチ
ンとして、又は混合ワクチン（すなわち、薬学上許容さ
れる液状キャリヤー中で２以上の糖たんぱく露結合体を
混合することにより、異種の細菌に免疫反応を示すワク
チン）の調製に使用される。

発明者らは、特殊な条件下では、同一のたんぱく質に、
グラム陽性及びグラム陰性細菌の莢膜多糖から誘導され
るオリゴ糖ハプテンを結合させることができ、三価免疫
原活性を有する糖たんぱく露結合体が得られることを見
出し、本発明に至った。

従って、本発明は、ＣＲＭ　１９７、破傷風トキソイド
及び百日咳毒素から選ばれるたんぱく質に、共有結合に
より、グラム陽性細菌の莢膜多糖から誘導された少なく
とも１のオリゴ糖ハプテン及びグラム陰性細菌の莢膜多
糖から誘導された少なくとも１のオリゴ糖ハプテンを、
これらオリゴ糖ハプテンを末端エステル基導入により予
備的に活性化させた後、結合せしめることにより得られ
る、三価免疫原活性を有する糖たんぱく露結合体に関す
る。

このようにして得られた糖たんぱく露結合体は、動物モ
デルに、同時に、グラム陽性細菌の莢膜多糖抗原、グラ
ム陰性細菌の莢膜多糖抗原及び使用したたんぱく質に対
する既往性免疫応答を誘発しうる。本発明の結合体は、
三価免疫原活性を有する唯１つの糖たんぱく露結合体を
使用して、疫学的に重大な莢膜を有するグラム陰性及び
グラム陽性細菌に対する新規なワクチンの調製に有用で
ある。

本発明によれば、三価免疫原活性を有する糖たんぱく露
結合体の調製に使用されるたんぱく質は、生理学上許容
される遊離のアミノ基を有するたんぱく質の中から選ば
れる。

これらの中でも、特にＣＲＭ　１９７、破傷風トキソイ
ド及び百日咳毒素が好適である。

このようなたんぱく質は、各々の生産微生物を培養し、
濾過により培養基から分離し、沈殿させ、最後にクロマ
トグラフィーにより精製することによって調製される。

本発明によれば、オリゴ糖ハプテンは、疫学上重大なグ
ラム陽性及びグラム陰性細菌の莢膜多糖から誘導される
ものの中から選択される。

特に、ストレプトコッカス・ニューモニエ（５ｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ　　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）、スト
レプトコッカス・ベータ−エモリティカス（５ｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓβ−ｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓ　）に属す
るグラム陽性細菌に由来するもの、及びナイセリア・メ
ニンギチノス（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　　ｍｅｎｉｎｇｉ
ｔｉｄｉｓ　）、シュードモナス１アエルギノーザ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）、
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ
ｌｉ　）及びヘモフィルス・インフルエンゼ（ｌｌａｅ
ｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎＮｕｅｎｚａｅ　）に属するグラ
ム陰性細菌の莢膜多糖から誘導されるものが好適である
。

オリゴ糖ハプテンは相当する莢膜多糖の酸性加水分解に
より調製される。代表的には、加水分解反応は、莢膜多
糖をｐＨ３ないし５．５の酢酸水溶液中に懸濁させるこ
とによって行なわれる。

加水分解は、密閉したアンプル内で溶液を温度１００℃
に４ないし４０時間維持することにより実施される。

加水分解終了後、オリゴ糖ハプテンをゲル−クロマトグ
ラフィーによって反応混合物から分離する。流出液の分
析により、メチルペントース、リン及び還元基の存在を
確認する。

このオリゴ糖ハプテンの分子量は、ゲル−クロマトグラ
フィー分析において分布係数（Ｋｄ）を測定することに
より確認され、一方、物理的手段による特性の確認はＮ
ＭＲ分析によって行なわれる。

オリゴ糖ハプテンの免疫化学特性は、Ｐｏｒｒｏらの方
法（「モレキュラー・イミュノロジー（Ｍｏ１ｅｃ。

１ｍｍｕｎｏ１．　）Ｊ　１９８５　）に従って確認さ
れる。かかる方法は、電気泳動親和法と「ロケット（ｒ
ｏｃｋｅｔ）　Ｊ免疫電気泳動法とを組合せたもので、
抗原と相同抗体との間の免疫沈殿反応におけるハプテン
の阻害能力を基礎とする方法である。

この目的に好適なオリゴ糖ハプテンは、分子１１０３な
いし２×１０３、好ましくは分子量１５００を有しかつ
末端還元基の存在によって特徴ずけられるものの中から
選ばれる。

本発明によれば、上記オリゴ糖ハプテンは、共有結合に
よりたんぱく質に結合される前に、末端へのエステル基
の導入によって活性化される。

活性化は、オリゴ糖ハプテンの末端還元基への第１アミ
ノ基の導入及びつづく該アミノ基の相当するエステルへ
の変換によって行なわれる。

一般に、オリゴ糖ハプテンを、塩化アンモニウム及びＮ
ａＢＨ，ＣＮの存在下、水中に懸濁化させることにより
実施される。

得られた溶液のｐｌを７．５ないし９．５に調整し、密
閉アンプル内において、温度３０ないし５５℃に、１な
いし２週間の対応する期間維持する。

反応終了後、オリゴ糖ハプテンをゲル−クロマトグラフ
ィーによって分離し、流出液を分析して、メチルペント
ース、リン及びアミノ基の存在を確認する。

このようにして得られたオリゴ糖ハプテンを、つづいて
ジメチルスルホキシド内に移し、有機酸エステル（たと
えばアジピン酸の誘導体）の存在下でエステル化する。

好ましくは、アジピン酸ヒドラジドのジスクシンイミジ
ルエステルが、オリゴ糖ハプテンに導入されたアミノ基
に対して過剰のモル濃度、一般に２＝１ないし１０：１
のモル濃度で使用される。

活性化されたオリゴ糖ハプテンは、１．４−ジオキサン
の添加（１，４−ジオキサン／ジメチルスルホキシドの
容屯比−１０／１　）により、反応混合物から沈殿、分
離される。

ついで、活性化オリゴ糖ハプテンは反応混合物から遠心
分離され、アミノ基の消失及びアミノ基の活性エステル
への変化を確認するため分析に付される。

本発明は、さらに、ＣＲＭ　１９７、破傷風トキソイド
及び百日咳毒素から選ばれるたんぱく質抗原に、グラム
陽性細菌の莢膜多糖から誘導された少なくともｌのオリ
ゴ糖ハプテン及びグラム陰性細菌の莢膜多糖から誘導さ
れた少なくともｌのオリゴ糖ハプテンを、これらオリゴ
糖ハプテンを末端エステル基導入により予備的に活性化
させた後、同時に又は順次、共有結合を介して結合させ
てなる、三価免疫原活性を有する糖たんぱく露結合体の
製法にも係る。

たんぱく質とオリゴ糖ハプテンとの間の結合反応は、ハ
プテンに、予じめ活性化せしめたオリゴ糖ハプテンを、
同時に又は順次、たんぱく質／ノ１ブテンのモル比１／
１０で添加することによって実施される。

代表的には、結合反応は、液相中、有機溶媒の存在下、
温度１０ないし４０℃、時間２ないし２４時間で行なわ
れる。好ましくは、ジメチルスルポキンドの存在下、温
度１５℃、１５時間の各条件下で実施される。

結合反応後、反応混合物から、ゲル−クロマトグラフィ
ーにより糖たんぱく露結合体を分離する。

流出液のクロマトグラフィーでは、たんぱく質及び結合
されたオリゴ糖ハプテンに対する化学活性が併存するこ
とが明らかになる。流出液は２２μｍの濾過膜を使用す
る濾過によって滅菌される。

たんぱく質分子におけるオリゴ糖ハプテンによる置換率
は、糖たんぱく質の化学分析及びこれにっづく３成分の
モル％への換算により測定される。

本発明によれば、三価免疫原活性を有する糖たんぱく露
結合体の置換率とは、たんぱく質１モル当りのグラム陰
性細菌の莢膜多糖から誘導された少なくとも１のオリゴ
糖ハプテンの置換率、及びグラム陰性細菌の莢膜多糖か
ら誘導された少なくとも１のオリゴ糖ハプテンの置換率
である。一般に、たんぱく質１モル当り、グラム陰性細
菌の莢膜多糖から誘導されたオリゴ糖ハプテンのモル数
はＩないし６であり、グラム陰性細菌の莢膜多糖から誘
導されたオリゴ糖ハプテンのモル数は１ないし２である
。

本発明による糖たんぱく露結合体は、疫学上重大な莢膜
を有するグラム陰性細菌及び莢膜を有するグラム陰性細
菌に対するワクチンとして有用である。

特に、幼児を免疫するためのワクチンとして使用される
。このような分子は、莢膜多糖から誘導されたオリゴ糖
ハプテンを含有し、その免疫応答は胸腺非依存性（ｔｈ
ｙｍｕｓ　−１ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）である。

このような多糖は、それ自体では幼児における免疫性付
与作用に乏しいが、本発明の糖たんぱく露結合体の調製
に使用される場合には、動物モデルに、胸腺依存（ｔｈ
ｙｍｕｓ　−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）形の免疫応答を生ず
る。

特に、ＥＬＩＳＡ法により行ったテストでは、本発明の
糖たんぱく露結合体を使用する場合、莢膜多糖に特異的
な抗体の抗血清が生産されることが実証された。

本発明によれば、ワクチンは、三価免疫原活性を有する
糖たんぱく露結合体の有効量を、生理溶液又は他の注射
用液状キャリヤーの中から選ばれる液状キャリヤーと混
合することにより調製される。

このような混合物に、ワクチンの調製に現在使用されて
いるものの中から選ばれる添加剤を添加することもでき
る。かかる目的に適する添加剤は、ラクトースまたはソ
ルビトールの如き安定剤、及び水酸化アルミニウム、リ
ン酸塩又はアルギニン酸塩の如きアジュバントである。

好ましくは、Ａｌ２ＰＯ，が使用される。

このようにして調製されたワクチンは筋肉内又は皮下注
射法によって投与される。

小児用ワクチンの調製における糖たんぱく露結合体の濃
度は２５ないし２００μ７である。体重に応じて、これ
よりも多い量で投与されてもよい。

ワクチンは一度で、又は数回に分けて投与される。

本発明を説明するため（しかし、本発明を制限するもの
ではない）、糖たんぱく露結合体を合成した。この結合
体では、たんぱく質ＣＲＭ　１９７が、共有結合を介し
て、グラム陰性細菌であるストレプトコッカス・ニュー
モニエタイプ６Ａの莢膜多糖から誘導された少なくとも
１つのオリゴ糖ハプテン及びグラム陰性細菌であるナイ
セリア・メニンギチジス　グループＣの莢膜多糖から誘
導された少なくとも１つのオリゴ糖ハプテンに結合して
いる。

このような糖たんぱく露結合体の免疫特性を、実験動物
を用いてテストし、たんぱく質ＣＲＭ　１９７、ストレ
プトコッカス・ニューモニエタイプ６Ａ及びナイセリア
・メニンギチジス　グループＣの莢膜多糖に対する免疫
応答を評価した。

次に、後述する図面に関して記述する。

第１図は、糖たんぱく質の電気泳動における挙動（５μ
９、ライン２）及び結合前のたんぱく質ＣＲＭ　１９７
の電気泳動における挙動（５μ９、ライン３）を表わす
図である。

化学法による糖付加（ｇｌｙｃｏｓｉｌａｎｉｚｉｎｇ
）は、たんぱく質ＣＲＭ　１９７を形成するサブユニッ
トＡ及びＢの両方に分配されて生ずる。

糖たんぱく露結合体の分子中は、ラインｌに示す分子量
の基準と比較して、約７８，０００である。

第２図は、時間（日）を横軸に、免疫グロブリンＩｇＧ
の濃度（ＥＬＩＳＡ単位で表示）を縦軸にプロットした
チャートである。

図中、劃−−１は、抗ストレプトコッカス・ニューモニ
ア　タイプ６Ａ　ＩｇＧの値を示し、・・・・・・・・
・・・は、抗ナイセリア・メニンギチジス　グループＣ
ＩｇＧの値を示す。

第３図は、ナイセリア・メニンギチノスの生菌に関する
家兎の抗血清の殺菌活性の測定について得られたチャー
トである。

横軸に時間（臼）を、縦軸に希釈の対数の逆数をプロッ
トしている。ユーーロは抗−グループＣ殺菌活性を示す
。

第４図は、三価免疫原活性を有する糖たんぱく露結合体
により免疫したモルモットの抗血清中の抗ジフテリア菌
毒素の定潰に関するチャートである。

横軸に時間（日）を、縦軸に濃度Ｓ、１．（単位／ｆｆ
ｅ）をプロットしている。

Ｎ−一込は抗ジフテリア菌毒素を示す。

各点は、ｌグループ１０匹の動物を使用して得た滴定量
の平均値を表す。

実施例１ 調製 Ｓ、ニューモニエ　タイプ６Ａの莢膜多糖　２ｙｔｔ９
を、１０ｍＭ酢酸水溶液（ｐＨ３，４）　１　ｒｌ（ｌ
中に溶解させた。

油浴中に浸漬した密閉アンプル内において、溶液を温度
１００℃に３９時間維持することにより、加水分解した
。

かかる時間の経過後、２００ｔｎＭ　ＮａＣＱ溶液（ｐ
Ｈ７，０）で処理した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　１５　（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ）上でのカラム
クロマトグラフィー（４℃で操作）によって、生成した
オリゴ糖を反応混合物から分離した。

ついで、クロマトグラフィー流出液を、メチルペントー
ス、リン及び還元基の存在を確認するため、それぞれＫ
ａｂａｔの方法（［エキスペリメンタル・イミュノケミ
ストリー（Ｅｘｐ、Ｉｍｉｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
）ＪＥ、　Ａ、　Ｒａｂａｔ　＆　Ｍａｙｅｒ編、５３
１５４１頁）、Ｃｈｅｎらの方法（「アナリティカル・
ケミストリー（Ａｎａｌ。

Ｃｈｅｍ、　）　２８　、１７５６−１７５８．１９５
６　）及びＰｏｒｒｏらの方法（「アナリティカル・バ
イオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）Ｊ
　１１８　、３０１−３０６．１９８１　）に従って分
析した。

得られた結果では、リン／ラムノースのモル比はｌであ
り、ラムノース／還元基のモル比は３であった。

５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　５０での分析では、このオリゴ
糖は、分布係数（Ｋｄ）０．４８（分子量（Ｍ’Ｄ約１
５００に相当）を示した。

ＮＭＲ分析では、このオリゴ糖は約８個の単糖残基（こ
のうちには免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）
の糖であるガラクトース残基がみられる）で形成されて
いることを示した。

ＮＭＲ分析は、代表的には、重水（Ｄ、Ｏ）　１　ｒｎ
Ｑにオリゴ糖５０巧を溶解し、３５６Ｃの５ｉｉプロー
ブ、Ｖａｒｉａｎ分光計モデルＣＦＴ　２０を使用し、
内部基準としてδ＝３９．５　ＰＰｍのメタノールを使
用して２０メガヘルツ（ＭＢ２）で操作することにより
行なわれる。

実施例２ 実施例１と同様にして、Ｎ、メニンギチジスグループＣ
の莢膜多糖の加水分解について、０．５ｍＭ酢酸溶液中
、ｐＨ５，８時間でテストを行った。

このようにして得られたオリゴ糖ハプテンは、５ｅｐｈ
ａｄｅｘ　Ｇ５０上でＫｄ　Ｏ，４６（分子量約１５０
０に相当）を示した。

クロマトグラフィー流出液の化学分析では、末端還元基
の存在及びＮ−アセチル−ノイラミン酸（シアリン酸と
しても公知）の存在を示した。

ＮＭＩｉ分析では、かかるハプテンが１０−１２個の単
糖残基（これらの中で、免疫優性残基はＮ−アセチル−
ノイラミン酸である）で構成されることを示した。

実施例３ Ｐｏｒｒｏらの方法（［モレキュラー・イミュノロジー
Ｊ　１９８５　）に従ってテストを行った。

３つの区域（区域Ａ、Ｂ及びＣ）に分画した免疫電気泳
動用プラスチックプレート（各区域はアーガロース（Ａ
ｇａｒｏｓｅ　　Ｍ−ＬＫＢ、　Ｂｒｏｍｍａ社）０．
１％（ｗ／ｖ）　２　ＲＱを含有する）を使用した。

区域Ａには、Ｓ　ニューモニエタイプ６Ａの莢膜多糖用
又はＮ、メニンギチジス　グループＣ（Ｓｔａｔｅｎ　
Ｓｅｒｕｍｉｎｓｔｉｔｕｔ、コペンハーゲン）の莢膜
多糖用検出剤として家兎の抗血清０．０５％（ｖ／ｖ）
を導入した。

区域Ｂには、Ｓ、ニューモニエタイプ６Ａの莢膜多糖抗
原用又はＮ、メニンギチジス　グループＣの莢膜多糖抗
原用検出剤として、予じめ３７°Ｃで１５分間培養して
おいた各々　Ｓ、ニューモニエタイプ６Ａの莢膜多糖５
ｎ９及びＮ、メニンギチジスグループＣの莢膜多糖５ｎ
９を含有する家兎の抗血清０．０５％（ｖ／ｖ）を導入
した。

区域Ｃには、Ｓ、ニューモニエタイプ６Ａの莢膜多糖用
又は家兎の抗血清用検知剤として、Ｎ。

メニンギチジス　グループＣの莢膜多糖用検知剤として
、予め３７°Ｃで１５分間培養した、それぞれオリゴ糖
ハプテン５　、５０．５００及び５０００ｎ？を含有す
る家兎抗血１０．０５％（ｖ／ｖ）を導入した。

対照として使用した莢膜多糖タイプ６Ａ及びグループＣ
を、各回１：２の比（計２．４，８．１６μｇ）で４回
希釈し、区域Ｂ及びＣのアーガロースに設けた４つのく
ぼみの各々に希釈物１０μρずつを導入した。

このように調製したプレートを、７０Ｖ／ｃｚ、１ない
し２時間で操作して電気泳動させた。終了後、プレート
を３７℃で乾燥し、免疫沈殿した「ロケット」を測定し
、定量した。

この方法の感度は、Ｓ、ニューモニエタイプ６Ａの莢膜
多糖の定量では約２０　ｎｆｌ／！ＩＱであり、Ｎ。

メニンギチジス　グループＣの多糖の定量では約５０ｎ
９／ｆｆ１２である。

オリゴ糖ハプテンの阻害は、免疫沈殿「ロケットＪがア
ーガロース区域Ｃ（オリゴ糖ハプテンと共に予培養され
た対照抗血清を含有する）において、区域Ｂ（多糖抗原
と共に予培養された対照抗血清を含有する）におけるよ
りも高い場合に明らかであった。

ついで、実施例Ｉ及び２に示す如くして得られたオリゴ
糖ハプテンの最小阻害濃度、及び対照家兎抗血清により
認識された抗原に対するその免疫化学特異性を、Ｐｏｒ
ｒｏらの記載（［モレキュラー・イミュノロジーＪ　１
９８５　）に従って証明した。

特に、Ｓ、ニューモニエタイプ６Ａの莢膜多糖から誘導
されたオリゴ塘ハプテンに関しては、構造中に免疫優性
糖であるガラクトースが存在する場合、Ｎ、メニンギチ
ジスの莢膜多糖から誘導されたオリゴ糖ハプテンに関し
ては、構造中に免疫優性酸であるＮ−アセチル−ノイラ
ミン酸が存在する場合に低い特異性値を示すことが観察
された。

オリゴ糖ハプテンの特異性は、それぞれの多糖抗原のも
のと比較する場合、Ｓ、ニューモニエタイプ６Ａの莢膜
多糖から誘導されたオリゴ糖ハプテンでは１．０８ｘ　
１０’であり、Ｎ、メニンギチジス　グループＣの多糖
から誘導されたオリゴ糖ハプテンでは１．０６Ｘ　１０
’であった。

実施例４ たんぱく質ＣＲＭ　１９７の調製 菌株コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅ−
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ　Ｃ７
（βｔｏｘ−１９７）によって生産されたＣＲＭ　１９
７を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　ＸＭ　５０（ＮＭＷＩ、５
Ｘ１０’）膜を使用する分子濾過によって培養基から分
離した。

ついで、濾液に硫酸アンモニウムの飽和溶液（６５％以
下）を添加することにより、たんぱく質を沈殿させた。

沈殿したたんぱく質を遠心分離によって分離し、０．０
１ＭＩＪ　ン酸塩緩衝Ｌ＆（ｐＨ７，２）　１．：溶解
させ−た。

つづいて、イオン交換クロマトグラフィーにより、たん
ぱく質ＣＲＭ　１９７を精製した。

０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）で処理したＤ
ＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ／　ＣＬカラム（２，
５ＸＬＯＯｃｍ）を使用し、溶離剤として０．０９Ｍ　
ＮａＣＱ　Ｅｌｌ液液使用した。

Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒら方法（「イミュノケミスト
リ−（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）Ｊ　９　　
、８９１−９０６．１９７２　）に従って、還元条件下
、ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による
硫酸ナトリウムドデシル−電気泳動により分析したとこ
ろ、得られたＣＲＭ　１９７の８０％は、天然分子形で
あった。

このたんぱく質の純度は約４００フロキユレーシヨン限
界（Ｌｆ）／ｕであった。

実施例５ 実施例１及び２の如くして得られたオリゴ糖ハプテンを
別々に蒸留水に溶解して最終濃度１０Ｍ９／ｍＱ　　と
した。各溶液に、塩化アンモニウム５０朽／ｍ（ｌ及び
ＮａＢｔ１３ＣＮ　２０ｍ９／　７ＩＱを添加した。

Ｓ、ニューモニエタイプ６Ａの莢膜多糖から誘導された
オリゴ糖ハプテンを含有する溶液をｌＮＮａＯＨでＩ）
Ｈ９に調整し、密閉アンプル内で、ゆっくりと撹拌しな
がら、温度５０℃に２週間維持した。

一方、Ｎ、メニンギチジス　の莢膜多糖から誘導された
オリゴ糖ハプテンを含有する溶液については、ｐＨ８に
調整し、密閉アンプル内で、ゆっくりと撹拌しながら温
度３７℃に１週間維持した。

反応終了後、ＬＯｎＭ　ＮａＣＱ緩衝溶液（ｐＨ７，０
）で処理した５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１５を使用して、ゲ
ル−クロマトグラフィーにより、オリゴ糖ハプテンを精
製した。

Ｋｄ≦０．１及び各々、メチルペントース残基、リン及
びアミノ基についての化学活性又はＮ−アセチル−ノイ
ラミン酸残基及びアミノ基についての化学活性を有する
クロマトグラフィー流出液を集め、これらを併わせだ。

ｂ）アミノ基含有ハプテン誘導体から相当するアミノ基
が導入されているオリゴ糖ハプテンを、ジメチルスルホ
キシド水溶液（８０−９５％、Ｖ／Ｖ）に溶解して、濃
度１０３９／肩ｅの溶液とした。この溶液を、オリゴ糖
ハプテンに導入されているアミノ基に対して過剰のモル
量でアジピン酸のジスクシンイミジルエステル（ＤＥＡ
）を含有する溶液（１：１Ｇ）に１ないし２時間で滴加
した。

溶液を２０−２５℃に４時間維持することによってエス
テル化反応を行った。かかる時間の経過後、エステル化
されたオリゴ糖ハプテンを１．４−ジオキサンを最終濃
度９０％（ｖ／ｖ）となるように添加して沈殿させ、つ
づいて遠心分離により、反応混合物から分離した。

ついで、Ｍｉｒｏｎ　−Ｗｉ　Ｉｃｈｅｋにより報告さ
れている方法（「アナリティカル・バイオケミストリー
」世、　４３３−４３５．１９８２）により、アミノ基
が相当する活性エステルに変化されていることを確認し
た。

Ｃ）エステル化オリゴ糖ハプテンの０８Ｍ１９７への結
合 ＣＲＭ　１９７２Ｍ９／Ｒ（ｌを含有する水溶液に、Ｓ
、ニューモニエ　タイプ６Ａの莢膜多糖から誘導された
活性化オリゴ糖ハプテンを含有するジメチルスルホキシ
ド溶液を、該たんぱく質に対してモル比１０／１で、水
中におけるジメチルスルホキシドの最終濃度が２０％（
ｖ／ｖ）となるまで添加した。

このようにして得られた混合物を、ゆっくりと撹拌しな
がら、室温（２０−２５°Ｃ）に１５時間維持した。

この時間の経過後、Ｎ、メニンギチジス　グループＣの
莢膜から誘導された活性化オリゴ糖ハプテンを含有する
有機溶液をたんぱく質に１０：ｌ　　のモル比で添加し
、得られた混合物を室温に１５時間維持した。

別法によれば、ＣＲＭ　１９７含有溶液に、Ｓ、ニュー
モニエタイプ６Ａの莢膜多糖及びＮ、メニンギチジス　
グループＣの莢膜多糖から誘導された２つの活性化オリ
ゴ糖ハプテンを同時に添加することによっても結合反応
を実施できる。

上述の如くして得られた糖たんぱく露結合体を０．２Ｍ
　　ＮａＣＱ含有するＯ、０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ
−７，０）で処理した５ｅｐｈａｃｊｅｘ　Ｇ　１００
カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｕｐｐｓａｌａ　）を使用して、ゲル−クロマトグラフ
ィーにより分離した。たんぱく質、リン及びシアリン酸
に関する化学活性を示す溶出フラクションを併わせ、気
孔率０．２２μ肩を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜を通し
て濾過した。

このようにして得られた糖たんぱく露結合体の化学分析
では、たんぱく賃金１８７％（ｗ／ｗ）　、タイプ６Ａ
オリゴ糖ハプテン含１８％（Ｗ／Ｗ）及びグループＣオ
リゴ糖ハプテン含量５％（ｗ／ｗ）を示した。

これらの値（モルに換算して）は、置換率（たんぱく質
ＣＲＭ　１９７　１モル当り）がタイプ６Ａのオリゴ糖
ハプテンに関して４モル、グループＣのオリゴ糖ハプテ
ンに関して２モルであることを表示する。

糖たんぱく露結合体の物理−化学特性については、Ｌａ
ｅｍｕ　ｌ　ｉ法（「ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　
Ｊ　２２ユ、６８０−６８５．１９７０　）に従って、
５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びアクリルアミド傾斜溶！（３−９
％）によって測定した。

たんぱく質ＣＲＭ　１９７の異なるエピトープに関する
モノクロナール抗体の免疫化学特異性を、たんぱく質が
ＣＲＭ　１９７である糖たんぱく露結合体に関して観察
されたものと比較して第１表にしめす。

各々の値（テスト３回から得られた）は、ＥＬＩＳＡ法
を利用して測定されたものである。

たんぱく、露結合体に関するモノクロナール抗体の特異
性割合（％）は、ＥＬＩＳＡ法ニオイテｃＲＭ　１９７
１：ついて吸収値を測定することにより観察された特異
性割合を１００と仮定して算出したものである。

第１表から理解されるように、糖たんぱく露結合体のた
んぱく質ＣＲＭ　１９７には、たんぱく質の４６５−５
３５配列に局在化されたＣＲＭ　１９７の最も重要なエ
ピトープが存在する。

このエピトープはジフテリア菌毒素の最も重要な免疫優
性体であり、感受性細胞に対する同一の毒素の細胞性結
合を阻害することによって中和抗体を誘発する。

実施例６ 各グループが体重的２に９の家兎１０匹でなる２グルー
プ、体重３５０９のモルモット１０匹でなる１グループ
に、ＡＱＰＯ４担体上に吸収させた糖たんぱく質′結合
体（糖たんぱく露結合体３７．５１９／　Ａｌ２ＰＯ４
１，５Ｉｌ！９）を、２回にわけて、皮下注射により接
種した。

各回の容量中には、ＣＲＭ　１９７　１２．５　Ｌｆ、
　Ｓ、ニューモニエタイプ６Ａの莢膜多糖から誘導され
たオリゴ糖ハプテン４．８ｎ９及びＮ、メニンギチジス
グルーブＣの莢膜多糖から誘導されたオリゴ糖ハプテン
３ｎ９が含まれる。

つづいて、第１回目の接種から２８日後に、第２回目の
接種を行った。

これら２回の接種の直後及び２回目の接種から１１１回
目家兎から血清を採取した。

ＡＪｏｌｌｅｒらの方法（「シャガス病に関する血小板
、酵素結合免疫吸収検定法（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　　
Ｅｎｚｙｍｅ　−Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ
ｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　ｆｏｒ　Ｃｈａｇａｓ　Ｄｉｓｅ
ａ−ｓｅ）Ｊ　Ｌａｎｃｅｔ　ｌ　　、　４２Ｇ（１９
７５）　）に従い、免疫酵素法（ＥＬＩＳＡ）によって
家兎の抗血清を分析して、Ｓ。

ニューモニエ　タイプ６Ａの莢膜多糖から誘導されたオ
リゴ糖ハプテン及びＮ、メニンギチジスグループＣの莢
膜多糖から誘導されたオリゴ糖ハプテンに特異的な免疫
グロブリンＩｇＧの存在を確認した（第２図）。

ｌｏｎｇの方法（「ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・スタンダード（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄ、）Ｊ
　５　、１９７−２１５．１９７７　）に従って、Ｎ、
メニンギチジスの生菌に関し、家兎抗血清の殺菌活性を
確認した。

その結果、糖たんぱく露結合体の各回の投与直後に殺菌
活性が形成されることが確認された（第３図）。

モルモットからの抗血清については、米国薬局法に従っ
て、抗ジフテリア菌毒素の含量を測定した。

生物学的分析法において利用するノツチリア菌毒素の滴
定における標準として、ジフテリア菌毒素に関するウマ
抗血清を使用した。第４図に、得られた結果を図示した
。

いずれの動物においても、免疫前では、特殊な抗体が存
在しないことが確認されている。

オリゴ糖ハプテン又は莢膜多糖のみで対照動物を免疫し
た場合には、上述の精製された化合物による場合のよう
な免疫は見られなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による糖たんぱく露結合体及び結合重の
たんぱく質ＣＲＭ　１９７の電気泳動における挙動を示
す図、 第２図ないし第４図は本発明による糖たんぱく露結合体
の各種の免疫学上の特性を証明するグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ＣＲＭ　１９７、破傷風トキソイド及び百日咳毒素
   から選ばれるたんぱく質抗原に、共有結合により、グラ
   ム陽性細菌の莢膜多糖から誘導された少なくとも１のオ
   リゴ糖ハプテン及びグラム陰性細菌の莢膜多糖から誘導
   された少なくとも１のオリゴ糖ハプテンを、これらオリ
   ゴ糖ハプテンを末端エステル基導入により予備的に活性
   化させた後、結合せしめてなる、三価免疫原活性を有す
   る糖たんぱく質結合体。 ２　特許請求の範囲第１項記載のものにおいて、前記グ
   ラム陽性細菌の莢膜多糖から誘導されたオリゴ糖ハプテ
   ンが、ストレプトコッカス　ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐ
   ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びストレ
   プトコッカス・ベータ−エモリティカス（Ｓｔｒｅｐｔ
   ｏｃｏｃｃｕｓ　β−ｅｍｏｌｉｔｉｃｕｓ）に属する
   細菌に由来するものの中から選ばれ、前記グラム陰性細
   菌の莢膜多糖から誘導されるオリゴ糖ハプテンが、ナイ
   セリア・メニンギチジス （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、
   ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ
   ｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、シュードモナス・アエル
   ギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏ
   ｓａ）及びエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ−ｃｈ
   ｉａ　ｃｏｌｉ）に属する細菌に由来するものの中から
   選ばれる三価免疫活性を有する糖たんぱく質結合体。 ３　特許請求の範囲第１項記載のものにおいて、前記た
   んぱく質抗原がＣＲＭ　１９７であり、前記グラム陽性
   細菌の莢膜多糖から誘導されるオリゴ糖ハプテンがスト
   レプトコッカス・ニューモニエから得られたものであり
   、前記グラム陰性細菌の莢膜多糖から誘導されるオリゴ
   糖ハプテンがナイセリア・メニンギチジスがら得られた
   ものであり、こられ３種の成分間のモル比が１／４／２
   である、三価免疫原活性を有する糖たんぱく質結合体。 ４　特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項
   に記載のものにおいて、活性化後のオリゴ糖ハプテンが
   分子量約１５０を有する、三価免疫原活性を有する糖た
   んぱく質結合体。 ５　ＣＲＭ　１９７、破傷風トキソイド及び百日咳毒素
   から選ばれるたんぱく質抗原に、共有結合により、グラ
   ム陽性細菌の莢膜多糖から誘導された少なくとも１のオ
   リゴ糖ハプテン及びグラム陰性細菌の莢膜多糖から誘導
   された少なくとも１のオリゴ糖ハプテンを、これらオリ
   ゴ糖ハプテンを末端エステル基導入により予備的に活性
   化させた後、同時に又は順次結合させることを特徴とす
   る、三価免疫原活性を有する糖たんぱく質結合体の製法
   。 ６　特許請求の範囲第５項記載の製法において、前記グ
   ラム陽性細菌の莢膜多糖から誘導されたオリゴ糖ハプテ
   ンが、ストレプトコッカス・ニューモニエ及びストレプ
   トコッカス・ベータ−エモリティカスに属する細菌に由
   来するものの中から選ばれ、前記グラム陰性細菌の莢膜
   多糖から誘導されたオリゴ糖ハプテンが、ナイセリア・
   メニンギチジス、ヘモフィルス・インフルエンゼ、シュ
   ードモナス・アエルギノーザ及びエシェリキア・コリに
   属する細菌に由来するものの中から選ばれる、三価免疫
   原活性を有する糖たんぱく質結合体の製法。 ７　特許請求の範囲第６項記載の製法において、前記た
   んぱく質抗原がＣＲＭ　１９７であり、前記グラム陽性
   細菌の莢膜多糖から誘導されるオリゴ糖ハプテンがスト
   レプトコッカス・ニューモニエから得られたものであり
   、前記グラム陰性細菌の莢膜多糖から誘導されるオリゴ
   糖ハプテンがナイセリア・メニンギチジスから得られた
   ものである、三価免疫原活性を有する糖たんぱく質結合
   体の製法。 ８　特許請求の範囲第５項ないし第７項のいずれか１項
   に記載の製法において、前記たんぱく質抗原と前記活性
   化オリゴ糖ハプテンとの間の結合を、液状溶媒中、ジメ
   チルスルホキシドの存在下、温度２０ないし２５℃、反
   応時間４ないし２４時間で、同時に又は順次行なう、三
   価免疫原活性を有する糖たんぱく質結合体の製法。 ９　ＣＲＭ　１９７、破傷風トキソイド及び百日咳毒素
   から選ばれるたんぱく質抗原に、共有結合により、グラ
   ム陽性細菌の莢膜多糖から誘導された少なくとも１のオ
   リゴ糖ハプテン及びグラム陰性細菌の莢膜多糖から誘導
   された少なくとも１のオリゴ糖ハプテンを、これらオリ
   ゴ糖ハプテンを末端エステル基導入により予備的に活性
   化させた後、結合せしめてなる三価免疫原活性を有する
   糖たんぱく質結合体を有効量含有すると共に、当分野で
   公知のものの中から選ばれるキャリヤーを薬学上許容さ
   れる量で含有してなる、莢膜を有するグラム陰性及びグ
   ラム陽性細菌に対するワクチン。 １０　ＣＲＭ　１９７、破傷風トキソイド及び百日咳毒
   素から選ばれるたんぱく質抗原に、共有結合により、グ
   ラム陽性細菌の莢膜多糖から誘導された少なくとも１の
   オリゴ糖ハプテン及びグラム陰性細菌の莢膜多糖から誘
   導された少なくとも１のオリゴ糖ハプテンを、これらオ
   リゴ糖ハプテンを末端エステル基導入により予備的に活
   性化させた後、結合せしめてなる三価免疫原活性を有す
   る糖たんぱく質結合体を免疫有効量で含有するワクチン
   を投与することを特徴とする、莢膜を有するグラム陽性
   及びグラム陰性細菌による感染に対する活性な免疫性を
   動物に付与する方法。