KR100217317B1

KR100217317B1 - 올리고당류와 운반 단백질의 공유결합 콘쥬게이트 및 그의 제조방법 및 그로써 제조된 왁진

Info

Publication number: KR100217317B1
Application number: KR1019910016912A
Authority: KR
Inventors: 포어로 마씨모
Original assignee: 윌리암 에이취 캘넌; 아메리칸 사이아나미드 컴퍼니; 에곤 이 버그
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-27
Publication date: 1999-10-01
Also published as: KR920006366A; NO300759B1; DE69111168T2; CN1034054C; CN1060294A; FI104046B1; PT99067A; FI104046B; FI914564A0; CS296991A3; NZ239878A; CZ285650B6; US5306492A; JPH06340550A; IE71671B1; SK280112B6; NO913812L; IL99119A; PL169926B1; IE913399A1

Abstract

본 발명은 올리고당류 콘쥬게이트 왁진을 생성시키기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명의 부가적인 양상에서, 협막 다당류에 대한 단일 특이성 및 동종 면역 반응을 유도하는 올리고당류 왁진이 생성된다. 본 발명의 특이 실시양태는, 스트렙토코커스 뉴모니애의 널리 보급된 혈청형에 대한 면역성을 유도하는 왁진을 제공한다.

Description

올리고당류와 운반 단백질의 공유결합 콘쥬게이트 및 그의 제조방법 및 그로써 제조된 왁진

제1도. 올리고당류-단백질 콘쥬게이트의 합성을 위한 일반적인 전략.

A. 고분자량 다당류는 산 가수분해되어 평균 분자량 2.5 S10³의 올리고당류를 생성시킨다.

B. 올리고당류는 (1) pH=9 에서 디아미노에탄 [H₂H(CH₂)₂NH₂] 과의 반응에 의해 활성화되고, 피리딘 보로히드라이드(PyBH₃)로 환원되고나서, (2) 디메틸설폭시드(DMSO)내숙신이미딜 디에스테르 및 아디프산(SIDEA)과 반응한다.

C. 활성화 올리고당류는 리신 잔기를 거쳐 운반 단백질과 커플링된다.

제2도. 커플링 과정에서 "테일러드(tailred)"스페이서의 사용

A. 올리고당류 및 아디프산 4개 탄소 링커(linker)사이의 아미드 결합(화살표)을 가진, Perro 일행, (1985), Mol. Immunol. 22 : 907-919 에 의해 기술된 바와같이 글리코콘쥬게이트. 스페이서의 총 길이는 대략 10.4Å 이다.

B. 두개의 탄소 잔기(화살표, 디아미노에탄에 의해 형성됨) 및 아미드 결합이, SIDES 와의 반응에 의해 형성된 숙신산 두개 탄소 링커 및 올리고당류 사이에 존재하는, 본 발명에 따라 형성된 글리코콘쥬게이트. 스페이서의 총 길이는 대략 10Å 이다.

C. 두개의 탄소 잔기(화살표, 디아미노에탄에 의해 형성됨) 및 아미드 결합이, SIDEA 와의 반응에 의해 형성된 아디프산 네개 탄소 잔기 및 올리고당류 사이에 존재하는 본 발명에 따라 형성된 글리코콘쥬게이트. 스페이서의 총 길이는 대략 14.5Å 이다.

제3도. 아디프산 대 숙신산 유도체 스페이서를 함유하는 활성화 올리고당류에 대한 CRM₁₉₇콘쥬게이션의 효율. 콘쥬게이션반응 생성물들의 SDS -폴리아크릴아미드 겔 전기영동(은 염색된).

A. 레인1 : 분자량 표준물(92.5K, 66.2K, 45.0K, 31.0K, 21.5K)

레인2 : CRM₁₉₇(1㎍) 참고물.

레인3 : 스페이서로서 숙신산과의 콘쥬게이티드 올리고당류 6A-CRM₁₉₇(2㎍) (50% DMSO 내 비율 1:1 모노에스테르/CRM₁₉₇의 총 아미노기)

레인4 : 스페이서로서 숙신산과의 콘쥬게이티드 올리고당류 6A-CRM₁₉₇(2㎍) (50% DMSO 내 비율 1:2 모노에스테르/CRM₁₉₇의 총 아미노기).

레인5 : 스페이서로서 아디프산과 콘쥬게이티드 올리고당류 6A-CRM₁₉₇(2㎍) (50% DMSO 내 비율 1:2 모노에스테르/CRM₁₉₇의 총 아미노기).

레인6 : 스페이서로서 숙신산과의 콘쥬게이티드 올리고당류 14-CRM₁₉₇(2㎍) (50% DMSO 내 비율 1:4 모노에스테르/CRM₁₉₇의 총 아미노기).

레인7 : 스페이서로서 숙신산과의 콘쥬게이티드 올리고당류 19F-CRM₁₉₇(2㎍) (50% DMSO 부재하에 비율 1:4 모노에스테르/CRM₁₉₇의 총 아미노기).

레인8 : 스페이서로서 숙신산과의 콘쥬게이티드 올리고당류 23F-CRM₁₉₇(2㎍) (50% DMSO 내 비율 1:2 모노에스테르/CRM₁₉₇의 총 아미노기).

레인9 : CRM₁₉₇(1㎍) 참고물.

B. 레인1 : CRM₁₉₇(1㎍) 참고물.

레인2 : CRM₁₉₇참고물(1㎍, 레인1 과 비교해 다른 몫)

레인3 : 스페이서로서 아디프산과의 콘쥬게이티드 올리고당류 23F-CRM₁₉₇(2㎍) (50% DMSO 내 비율 1:2 모노에스테르/CRM₁₉₇의 총 아미노기).

레인4 : 분자량 표준물(92.5K, 66.2K, 45.0K, 31.0K, 21.5K)

레인5 : 스페이서로서 아디프산과의 콘쥬게이티드 올리고당류 23F-CRM₁₉₇(2㎍) (50% DMSO 내 비율 1:2 모노에스테르/CRM₁₉₇의 총 아미노기).

레인6 : CRM₁₉₇(1㎍) 참고물. CRM₁₉₇참고물 (1㎍, 레인1과 비교해 다른 몫)

레인7 : 스페이서로서 아디프산과의 콘쥬게이티드 올리고당류 6A-CRM₁₉₇(2㎍)

C. 레인1 : 분자량 표준물(92.5K, 66.2K, 45.0K, 31.0K, 21.5K)

레인2 : CRM₁₉₇(1㎍) 참고물.

레인3 : 스페이서로서 아디프산과의 콘쥬게이티드 올리고당류 6A-CRM₁₉₇(2㎍)

레인4 : 스페이서로서 아디프산과의 콘쥬게이티드 올리고당류 14-CRM₁₉₇(2㎍)

레인5 : 스페이서로서 아디프산과의 콘쥬게이티드 올리고당류 19F-CRM₁₉₇(2㎍)

레인6 : 스페이서로서 아디프산과의 콘쥬게이티드 올리고당류 23F-CRM₁₉₇(2㎍)

레인7 : 분자량 마아커(92.5K, 66.2K, 45.0K, 31.0K, 21.5K)

제4도 : 에스. 뉴모니애(S. pneumoniae) 올리고당류 6A-CRM₁₉₇콘쥬게이티드에 대한 토끼 IgG 반응. 협막 다당류로 유도된 IgG 중복기준의 친화력 값의 저해- ELISA 분석.

A. 타잎 6A 협막 다당류

B. 유리형태 또는 CRM₁₉₇에 콘쥬게이티드된 타잎 6A 올리고당류= 10

C. 분자 스페이서에 의해 또는 CRM₁₉₇로 콘쥬게이티드되어 활성화된 타잎 14 올리고당류= 12

본 발명은 올리고당류 콘쥬게이트 왁진을 생성시키기 위한 개선된 방법에 관한 것이다. 본 발명의 부가적인 양상에서, 협막다당류에 대한 단일 특이성 및 동종 면역 반응을 유도하는 올리고당류 왁진이 생성된다. 본 발명의 특이 실시양태는, 허약 또는 질병에서 기인하는 감소된 면역성을 가진 사람들 (예컨대, AIDS 환자들을 포함하는) 및 중년뿐만 아니라 소아과 환자들에 사용하기 위해 특히 중요할 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)의 유병성(有病性)혈청형에 대한 면역성을 유도하는 왁진을 제공한다.

[스트렙토코커스 뉴모니애에 의해 야기된 질병]

폐렴구균(스트렙토코커스 뉴모니애)는 짝으로 또는 짧은 사슬로 대개 성장하는 그랩-양성 피낭 구균이다. 쌍구균형태로, 인접한 가장자리는 둥글고, 반대말단들은 약간 뾰족한 란셋형 유기물을 제공한다.

폐렴구균은 그들의 협막을 형성하는 복합 다당류를 기재로한 혈청형으로 나뉘어질 것이다. 타잎-특이성 항혈청으로의 노출, 노이펠드 켈링 반응(Neufeld quelling reaction)에 의해 84개 혈청형이 확인되었다. 모두는 인간에 대해 병원성이지만, 타잎 1,3,4,7,8 및 12가 의학용 실습에서 가장 빈번하게 고려된다.

타잎 6,14,19 및 23은 종종 어린이에게 폐렴 및 중이염을 야기시키지만, 성인에게는 보다 덜 흔하다 (Austriar, 1983, in "Harrison's Prinoiples of Internal Medicine", Petersdorf 일행, eds., 10판, McGraw Hill Book Co. New York pp. 918-922). 현저하게, 폐렴구균은 어린이에게 있어서 폐렴, 패혈증 및 뇌막염의 원인이되는 세계의 주요병원체중 하나이다 (McMillan, 1982, in "Core Textbook of Pediatrics, Kaye 일행, eds. 2판, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, P. 498).

[폐렴구균 왁진]

발전하는 폐렴구균 감염의 평균 이상으로 높은 위험에 있는 개인들은, 심장병, 만성 폐기관 질병, 간장병, 신장 불충분 및 악성같은 만성 전신병을 가진 환자들을 포함한다. 이들 개인들은 폐렴구균 감염에 대해 예방주사가 놓여지는 것이 추천된다.

상기 목적을 위해, 폐렴 구균 타잎 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12f, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F 및 33F 의 협막 다당류로 구성되는 23개 왁진(이는 미합중국 및 세계의 나머지에서 심각한 폐렴구균 질병 90%의 원인이 되는 혈청형 또는 기를 포함한다)이 유용하다 (뉴모박스 (Pneumovax)Merck, Sharpe & Dohme 및 뉴-임뮴(Pnu-Immune), Iederle Iaboratories). 상기 왁진의 효율은 6세 이하의 어린이에 있어서 의심스럽고, 다양한 협막 항원에 대한 면역학적 반응은 면역 시스템의 성숙 특성의 결과로서 서로 다른 시기에 발전하고, 보호는 성인에게서 관찰된 것보다 짧은 지속기간을 가질 것이다. (Harrison 일행, ibid). 비교적 적은 폐렴구균 혈청형이 소아과 폐렴 구균 감염 대부분의 원인이 된다고 여겨진다 할지라도 (Gray 일행, 1979, J. Infect, Disease 140 : 979-983), 이들은, 왁진으로서 사용된 정제 협막 다당류에 대한 인간 항체 반응의 성숙이 가장 느린 타잎들을 포함한다 (Anderson 및 Bett, 1989, Pediatric Infec. Dis. J. 8 : S50-S53 : Borgono 일행, 1978, Proc. Soc. E게. Biol. Med. 157:148-154).

[콘쥬게이트 왁진]

헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) b 협막 다당류에 대한 유아의 면역 반응은 "콘쥬게이트" 왁진을 생성시키기 위한, 운반 단백질로의 협막 항원의 커플링에 의해 얻어졌다; T 림프구 조력자 효과는 운반 단백질에 의해 유도되고, 면역성 발전에 원인이 된다고 여겨진다 (Robbins 일행, 1984, in "Bacterial Vaccines", Germanier, ed. Academic Press, New York, pp. 289-316) 또한, Cruse & Lewis, 1989 in "Conjugate Vaccines" eds. Cruse & Lewis, Karger, Basel, pp. 1-10 가 참고된다. 유사한 접근은 폐렴구균 왁진을 생성시키는 것과 관련된다.

[왁진내 항원으로서 무자(無疵)협막 중합체들]

많은 연구원들은 왁진에 또는 왁진으로서 유용한 무자 협막 중합체들을 단리시키고 정제시켰다.

예컨대, U.S. 특허 제4,220,717호는 에이취.인플루엔자 b 의 협막 중합체로 부터의 면역학적 활성 폴리리보실 리비톨 포스페이트(PRP)의 단리 및 정제 방법을 기술한다. 부가적으로, U.S. 특허 제4,210,641호는 200,000 달톤 이상의 명백한 분자량을 갖고, 주로 갈락로즈, 글루코즈 및 만노즈로 구성되고, 소량의 오사민을 함유하는 에이취. 인플루엔자의 다당류 추출물에 관한 것이다.

많은 연구원들이 보다 나은 면역학적 반응을 얻기 위해 배합물내에 상기 및 다른 무자 협막 중합체들을 이용했다.

예컨대, U.S. 특허 제4,196,192호는 정제된 무자 PRP를 함유하는 왁진 및 완전한 세포 보르데렐라 페르루씨스(Bordetella pertussis) 왁진 배합물을 기술한다. 증가되는 면역원성에 대한 상기 접근은 어린 포유동물에 있어서 항-PRP 및 항-백일해 항체의 향상된 수준을 결과시킨다.

[헵텐에 대한 항혈청을 제조하기 위한 운반 단백질의 사용]

운반 단백질은 콘쥬게이트 협막 중합체들의 면역원성을 향상시키는 것 이상의 역할을 할 수 있다 ; 그들은 또한 헵탄 면역원성을 가능케할 수 있다. 헵텐은, 항체 또는 림프구 수용기에 특이하게 결합될 수 있는 분자로서 정의되지만, 그들 스스로 면역 반응을 유도하지 않을 것이다(즉, 그들은 면역원성이 아니다).

면역 반응을 야기시키기 위해, 헵텐으로 일컬어지는, 적은/저 분자량 또는 열등하게 면역원성 분자들은 대개, 큰 분자 또는, 대개 이종 단백질인 캐리어에 먼저 커플링되어야만 한다.

동물로의 헵텐-캐리어 복합체의 주입은 그리고나서, 항체의B 림프구에 의한 생성을 야기시킬 것이고, 이중 일부는 유리, 비커플링된 헵텐 분자에 특이하게 결합될 수 있을 것이다.

연구될 초기 헵텐중 일부는 아닐린 및 0-아미노벤조산 같은 아조 염료 화합물들이었다. Landsteiner 및 Lampl (1981, Z. Immun. Forsch 26 : 293)에서, 디아조화에 의해 이들 화합물들은 혈청 단백질에 커플링되었다. 이들 인공적으로 제조된 아조-단백질이 주사될때, 토끼는 결합된 화학 부분에 대해 특이적인 침전하는 항체들을 발전시켰다.

헵텐류 화합물들의 다른예는, 소 혈청 알부민 또는 소 감마 글로블린(BGG) 및 리세르그산 디에틸아미드에 대한 디니트로페닐(DNP)기로서 커플링중 면역원성이 될 디니트로페놀이다. 포름알데히드 조차도 헵텐으로서 행동한다고 보여졌다 : 실험실에서 또는 생성물들로부터 포름 알데히드 증기에 노출된 사람들은 화합물에 대해 "민감"해지고 나서, 그들의 내인성 기대분자들은 생체내에서 포르밀화되었다.

헵텐성 행동은 작은 유기 분자들로 제한되지 않고, 인슐린 크기 이하의 폴리펩티드호르몬은 종종, 있다해도, 열등하게, 면역원성이다. 이들 호르몬들에 대한 높은 항체역가를 얻기 위해, 그들을 캐리어 분자로 콘쥬게이트시키는 것(또는, 이들 많은 폴리펩티드를 함께 가교시켜 큰 분자들을 생성시키는 것)이 필요하다.

캐리어 분자의 관련은, 캐리어가 미약한 운반 역할이상의 역할을한다는 점에서 특히 관심을 끈다. Ovary 및 Benaceraff (1963, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 114 : 723) 은 토끼를 DNP-BCG 주사시켜 이를 보여주었다.

많은 면역원성 재료의 동물로의 주사는 노출의 면역학적 "기억"을 생성시킬 것이다. 두번째 주사가 후에 제공될때, 훨씬 더 활발한 면역 반응이 있다. Ovary 및 Benaceraff가 DNP-BCG를 다시 주입했을때, DNP 및 BCG 모두에 대해 향해진 항체의 상당히 증가된 수준으로 이끄는 강한, 이차 반응이 있다. 그러나, 두번째 주사가 DNP-난(卵)알부민으로 대신 행해졌을때, 훨씬 더 약한 항-DNP 항체 반응이 주목되었다. 반응에서의 차이는 캐리어 효과로 불리워지는 것에서 기인했고, 이는 조력자T 림프구가 관련되는 것같다.

예비 증거는, 모든 단백질들이 제공된 헵텐에 대해 동등하게 효과적인 캐리어 단백질이 아닐 수 있음을 지시한다.

Robbins 일행 (Infect. Immun. 40: 245-256)은, 동일한 다당류 헵텐이 서로 다른 단백질 캐리어에 콘쥬게이트되었고, 헵텐에 대한 항체 반응이 양적측정된, 실험적 단백질-다당류 콘쥬게이트 왁진에 대한 데이타를 제시했다. 뚜렷한 차이가 생성된 항-헵텐 항체와 양에 주목되며 이는, 캐리어에 대한 주요한 역할을 제시한다.

특히, 페렴구조 왁진에 대해, Lin 및 Lee (1982, Immunology 46 : 333)는 단백질에 콘쥬게이티드된 19F 뿐아니라 타잎 6A 및 19F 다당류에 노출된 성숙한 그리고 어린 생쥐에서의 면역 반응을 연구했다. 상당히 높은 IgM 및 IgG 2항체역가는, 19F 다당류만을 수신하는 대조표준 군에서 보다 19F 다당류-단백질 콘쥬게이트를 수신하는 생쥐에서 유도되었다.

[콘쥬게이트 함유 왁진]

다른 연구원들은 소위 "캐리어 효과"로 항체 형성을 향상시키기 위한 노력으로, 운반 단백질에 대한 협막 중합체들의 콘쥬게이션을 연구 했다. 예컨대, Schneerson 일행, Journal of Experimental Medicine 152: 361-376 (1980) 은 에이취. 인플루엔자b에 의해 야기된 침습성 질병에 대한 면역성을 부여하도록 밝혀진 에이취.인플루엔자b 중합체-단백질 콘쥬게이트를 기술한다. 참고문헌은 유아에서 협막 중합체들의 나이-관련 면역학적 행동을 증명하고, 혈청 알부민 리물러스 폴리페무스 헤모시아닌(Limulus polyphemus hemocyanin) 및 디프테리아 독소를 포함하는 다양한 단백질들과 무자 협막 중합체의 콘쥬게이션으로 상기 나이-의존을 극복하려고 노력한다. 콘쥬게이션 방법은 아디프산 디히드라지드 같은 결합제의 사용과 관련된다.

Geyer 일행, Med. Microbiol. Immunol. 165:171-288(1979) 는 환원성 아민화로, 니트로페닐- 에틸 아민 결합제에 대한 특정 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae) 협막 다당류 단편들의 콘쥬게이트를 제조했고, 그리고 나서, 유도된 당은 아조 커플링을 사용하여 단백질에 결합시켰다.

1974년 5월 9일 출원된 Mcintire 에 의한 U.S. 특허 제4,057,685호는, 할로아실 할로겐화물과의 반응에 의해 단백질 항원에 공유적으로 커플링된 감소된 독성의 에쉐리시아 콜리 (Escherichia coli) 리포 다당류에 관한 것이다.

1981년 5월 27일 출원되고 1982년 10월 26일 특허된 Jennings 일행의 U.S. 특허 제4,356,170호는 환원성 아민화에 의한 다당류-단백질 콘쥬게이트 생성에 관한 것이다.

Anderson (1983, Infection and Immunity 39 : 233-238)은 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 타잎 b 협막 다당류로 부터의 올리고당류와 CRM₁₉₇, 비독성 이지만 디프테리아 독소의 항원적으로 동일한 변종 사이의 콘쥬게이트에 관한 것이다.

Snippe 일행(1983, Infection and Immunity 42:842-844)은, 협막 다당류 S3의 부분적인 상 가수분해물로부터 단리된 육당류를 환원성 아민화로, 스테아릴 아민에 커플링시키고나서 리포종으로 혼입시키는, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 타잎 3에 대한 반합성 왁진에 관한 것이다. 결과되는 콘쥬게이트/리포좀 왁진이 생쥐에서 에스.뉴모니애 타잎 3에 대한 보호를 유도시킴이 관찰되었다.

1983년 3월 14일 출원되고, 1987년 5월 5일 특허된 Tsay 일행에 의한 U.S. 특허 제4,663,160호는 그램-음성 세균으로 부터의 탈독성 다당류가 4-12개 탄소 부분에 의해 동일종의 그램-음성 세균으로 부터의 탈독성 단백질에 공유적으로 커플링되는, 세균에 관한 것이다.

1984년 1월 5일 출원되고, 1986년 10월 28일 특허된, Gordon에 의한 U.S. 특허 제4,619,828호는 병원성 세균 예컨대, 헤모필루스 인플루엔자b, 스트렙토코커스 뉴모니애, 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 및 에쉐리시아 콜리 및 T세포 의존 항원 예컨대, 디프테리아 및 파상풍 변성독소로부터의 다당류 분자들 사이의 콘쥬게이트에 관한 것이다.

1984년 8월 10일 출원되고, 1989년 2월 28일 특허된 Anderson 및 Clements 의 U.S. 특허 제4,808,700호 및, 1986년 3월 28일 출원되고, 1988년 8월 2일 특허된 Anderson 의 U.S. 특허 제4,761,283호는 환원성 아민화에 의한, 세균성 독소, 변성독소 또는 결합 아단위에 대한 협막 중합체 단편의 공유결합에 관한 것이다.

1986년 7월 2일 출원되고, 1987년 12월 8일 특허된 Parro일행의 U.S. 특허 제4,711,779호는, 삼가 면역원성 활성을 갖고, CRM₁₉₇파상풍 변성독소 또는 백일해독소뿐 아니라 그램 양성 세균 및 그램 음성 세균의 협막 다당류로 부터의 항원 결정기로 구성되는 글리코 단백질 콘쥬게이트 왁진에 관한 것이다.

[콘쥬게이트 왁진의 제조방법]

협막 다당류 헵텐이 운반 단백질에 결합되는, 콘쥬게이트 왁진 제조는 하기 과정을 필요로 한다 :

(ⅰ) 협막 다당류가 제조되어야만 한다.

(ⅱ) 다당류 단편이 사용된다면, 무자 다당류로부터 분리되어야만 한다.

(ⅲ) 당류는 활성화되거나 콘쥬게이션 가능해야만 한다. 즉, 단백질에 공유적으로 결합될 수 있는 부분이 생성되어야만 한다.

(ⅳ) 당류를 단백질에 콘쥬게이트시킨다. 이들 4가지 단계들을 수행하기 위해 당분야에 알려진 다양한 방법들은 표 1에 나열된다.

본 발명은 세균성 협막 다당류로부터 유도된 올리고당류를 신규 방법을 사용하여 운반단백질에 공유 결합시키는 것에 관한 것이다.

상기 방법은 현재 적용된 방법보다 상당히 빠른 생성 속도로 글리코콘쥬게이트의 효율적인 합성을 허용한다. 본 발명의 글리코콘쥬게이트는 왁진 배합물을 사용할 것이고, 면역원성임을 보여 주었다.

특이 실시양태에서, 본 발명은 스트랩토코커스 뉴모니애 협막 다당류로부터 유도된 올리고당류를 혼입시키는 글리코콘쥬게이트의 생성에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 주요한 병의 많은 비율이 에스.뉴모니애에 감염과 관련되는, 소아과 인구에 특히 관련되는 왁진 배합물에 사용될 수 있는 높은 수율의 에스.뉴모니애 글리코콘쥬게이트의 효율적인 생성을 결과시킨다. 면역원성 콘쥬게이트가 단독으로의 협막 중합체보다 나이에 덜 의존적이고, 개별적인 피낭 세균에 의한 전신계 감염에 대한 매우 어린 온혈 포유 동물의 활성 면역에 유용함이 밝혀졌다.

본 발명의 부가적인 양상에서, 본 발명의 클리코콘쥬게이트가, 놀랍게도, 자가면역 반응 및 관련된 후속-왁진주사 증상의 발생을 유리하게 회피시키는, 단일특이성 및 균질 면역 반응을 유도함이 밝혀졌다.

중요하게, 본 발명의 면역원성 콘쥬게이트는, 단백질에 대한 카르보히드레이트의 콘쥬게이팅에 사용되어왔던, 잠재적인 독성 결합제 예컨대, 아디프산 디히드라지드 또는 p-니트로-페닐에틸아민을 포함하지 않는다.

[약어 및 정의]

CRM디프테리아 독소와 항원적으로 가교-반응성인 비-독성 단백질

DMSO 디메틸설폭시드

DP 중합도

MIC 최소 저해 농도

SD 치환도

SIDEA 아디프산의 숙신이미딜디에스테르

SIDES 숙신산의 숙신이미딜디에스테르

본 발명은 운반 단백질에 대한 세균성 협막 다당류로부터 유도된 올리고당류의 공유결합에 관한 것이다; 본 발명 방법은 신규 방법을 거쳐 신규 글리코콘쥬게이트를 생성시킨다.

제한하지 않고, 명확하게 기술하기 위해, 본 발명의 상세한 설명을 하기 단락으로 나누었다 :

(ⅰ) 올리고당류 제조

(ⅱ) 올리고당류 활성화

(ⅲ) 단백질에 대한 올리고당류의 콘쥬게이션

(ⅳ) 글리코콘쥬게이트의 면역화학적 특성

(ⅴ) 왁진 배합 및 투여

(ⅵ) 폐렴구균 올리고당류 콘쥬게이트 왁진의 이용

[올리고당류의 제조]

고분자량 협막 다당류는 상업적으로 구입(American Type Culture Collection) (ATCC) (Rockville, MD) 되거나, Parro 일행, 1983, J. Biol. Stand. 11 : 65-71에 의해 기술된 방법에 의해 얻어질 수 있다. 제한하지는 않고, 스트렙토코커스 뉴모니애, 헤모필루스 인플루엔자, 나이세리아 레닌기티디스, 에쉐리시아 콜리, 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 스트렙토코커스 무란스(Streptococcus mutans), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 스트라필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 협막에서 밝혀진 것들을 포함하여 임의의 다당류가 사용될 수 있다.

적어도 하나의 환원 말단을 가진 항원 단편은, 특히 협막 중합체의 구조적 특징에 의존하여, 다양한 방법들에 의해 협막 중합체들로부터 생성될 수 있다. 과요오드산염(또는 관련된 시약)에 의한 제한된 산화성 쪼개짐은 알데히드성 종결기를 남길것이다; 상기 접근은 비-환형 잔기상 근접한 디히드록시기를 갖는 중합체들에 제한될 것이다. 글리코시드 결합의 가수분해는 환원 당 종결기를 생성시킨다. 상기 가수분해는 글리코시다제에 의해 효소적으로 가장 특이하게 수행될 수 있지만, 상기 출원은 비교적 적은 협막 중합체들 예컨대, 스트렙토코커스 뉴모니애 8에 제한될 것이고, 이를 위해 글리코시다제가 알려져있다. 글리코시드 결합의 가수분해를 위해 산 가수분해가 대개 통상적이다. 중합체가 산-민감 비-글리코시드 결합을 포함하거나, 중합체가 항원 특이성에 중요한 산-민감 분자 결합을 포함한다면, 상기 접근의 이용은 제한될 것이다.

본 발명의 특이 실시양태에서, 에스.뉴모니애 타잎 6A 협막 다당류는 약30시간동안 약 100℃에서 대략 10M 아세트산에서 가수분해될 것이다.; 에스.뉴모니애 타입 14 협막 다당류는 약7시간동안 약 70℃에서 대략 0.5M 트리플루오르아세트산에서 가수분해될 것이다; 에스 뉴모니애 타잎 19F 다당류는 약 48시간동안 약 50℃에서 대략 10M 아세트산내에서 가수분해될 것이고; 에스.뉴모니애 타잎 23F 다당류는 약 3시간동안 70℃에서 대략 0.25M 트리플루오로아세트산내에서 가수분해될 것이다;

본 발명에 따라, 단백질에 콘쥬게이트될 올리고당류는 바람직하게, 3-6개 반복 단위(또는 약 10-30개 단당류 잔기)로 구성되고, 보다 바람직하게, 글리코콘쥬게이트로 혼입되고, 최적 면역원성임이 보여진, 상기 길이의 올리고당류로서 3-4개 반복 단위(또는 약 15개 단당류잔기)로 구성된다.

[올리고당류의 활성화]

올리고당류는, 환원성 아민화 그리고나서는 이관능성 분자 예컨대, 제한되지 않고, 디에스테르와의 반응에 의해 활성화될 수 있다. 본 발명 방법의 개요는 제1도 및 표Ⅱ에 제시되고, 이는 본 발명의 방법을 Parro 일행, 1985, Mol. Immunol. 22:907-919에 기술된 방법과 비교한다. 이전 방법을 사용하는 활성화시간은 7-14일이었음이 주목된다; 이는 본 발명에 따라 15분으로 짧아졌다. 또한, 이전 방법을 사용하는 환원 시간은 7-14일이었음이 주목된다; 이는 본 발명에 따라 48시간으로 짧아졌다. 따라서, 본 발명은 이전방법에 비해 완료시키는데 12-26 적은 일 수를 요구한다. 이는 분해를 이끌 수 있는 고온 예컨대, 50℃로 노출되는 카르보히드레이트에서 중요한 장점이 된다.

본 발명의 방법에 따라, 올리고당류의 말단-환원 단위의 환원성 아민화는 두개의 아미노기를 함유하는 분자의 사용으로 수행된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 환원성 아민화는 대략 25-100℃ 및 바람직하게 100℃에서 약 1-60분 및 바람직하게 약 15분동안 약 pH=9에서 0.2M KHPO내 10%몰 과량으로 디아미노에탄 용액과 제공된 몰 양의 올리고당류의 반응으로 수행된다. 이후, 제조시 올리고당류 몰 농도 25배와 동일한 몰 양의 피리딘 보란이 첨가되고, 약 1-72 바람직하게 약 48시간동안 약 25-100℃, 바람직하게 약 50℃에서 반응이 수행된다.

환원성 아민화 반응의 결과되는 생성물은 그리고나서, 이관능성 분자와 반응할 수 있고, 각각의 관능기는, 이관능성 분자가 올리고당류 및 운반 단백질을 함께 결합시키도록, 운반 단백질의 구조에 존재하는 아미노기 또는 활성화 올리고당류의 종결 아미노기와 반응할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 이관능성기는 디에스테르이고, 보다 특이하게, 아디프산의 디에스테르이고, 이는 단백질의 보다 효율적인 글리코실화와 관련됨이 보여졌다. 본 발명의 바람직한, 특이 실시양태에서, 상기된 것과 같은 환원성 아민화에 적용된 올리고당류는 숙신산 또는 보다 바람직하게 아디프산의 숙신이미딜 디에스테르와 부가적으로 반응한다; 상기 반응은 약 0.5-5시간, 바람직하게 약 2시간동안, 약 0-25℃ 바람직하게, 약 4℃에서 디메틸설폭시드(DMSO)용액내, SIDEA(또는 SIDES) 몰농도의 약 5/1에 해당하는 몰 농도에서 아민화 올리고당류(아미노기로서)와 가장 잘 수행될 수 있다. 활성화 올리고당류는 그리고나서, 1,4 디옥산(80% v/v)을 사용하여 침전적으로 수집될 수 있고, 이는 또한, 상청액내에 과량의 SIDEA(또는 SIDES)를 남긴다.

[단백질에 대한 올리고당류의 콘쥬게이션]

본 발명에 따라 이용될 수 있는 단백질들은 어린 포유동물의 투여에 대해 안전하고, 면역학적으로 효과적인 운반 단백질로서 제공되는 임의 단백질을 포함한다. 특히 실시양태에서, 세포 표면 단백질, 막단백질, 독소 및 변독소가 사용될 수 있다. 안전에 대한 범주는 일차 독성의 부제 및 알레르기 반응의 최소 위험을 포함할 것이다. 디프테리아 및 파상풍 변성독소는 이들 범주를 만족할 것이다; 즉, 적절하게 제조되고, 그들은, 비독성이고, 알레르기 반응의 빈도는 적절하게 낮다. 알레르기 반응의 위험은 성인에 대해 뚜렷함에도 불구하고, 유아에게는 최소이다. 본 발명의 부가적인 특이 실시양태에 따라, 적절한 운반 단백질들은 제한하지는 않고, 살모넬라 플라젤린, 헤모필루스 필린, 헤모필루스 15KDa, 28-30KDa 및 40KDa 막 단백질, 에쉐리시아콜리 열 불안정 엔테로톡신 LTB, 콜레라 독소 및, 로타비루스 VP7을 포함하는 비루스성 단백질 및 호흡 신시리알 비(Sync tial virus) F 및 G 단백질을 포함한다.

캐리어 효과에서, 캐리어로서 보다강한 항원에 결합됨에 의해, 약한 항원(예컨대, 이종 단백질)은 단독으로 존재할 때보다 더 면역원성이 될 것이다. 동물에 캐리어 단독으로 앞서 면역화된다면, 동물은 프라임(primed)되어지고, 캐리어 항원뿐 아니라 결합된 헵텐 기에 대한 향상된 면역 반응을 생성시킬 것이다. 유아는 일상적으로, 파상풍 및 디프테리아 변성독소로 면역화된다. 그러므로, 그들은, 이들 변성독소 중 어느것에 콘쥬게이팅된 협막 중합체 항원의 후속 제시에 대해 프라임될 것이다.

대개, 임의의 이종 단백질은 캐리어 항원으로서 제공될 수 있다. 그러나, 파상풍 및 디프테리아 같은 특정 세균성 독소는, 그들이, 그 중 하나(결합 or 단위)는 포유동물 세포 표면에 대한 결합을 위한 강한 친화력을 갖는, 두개의 부분으로 구성된다는 점에서 부가적인 장점을 가질 것이다. 생각컨대, 상기 결합단백질에 대한 콘쥬게이션은 운반된 항원이 면역 시스템의 세포내 반응을 보다 효율적으로 개시시키도록 할것이다.

협막 중합체가 콘쥬게이팅되는 운반단백질은 천연 독소 또는 해독 독소(변성독소)일 수 있다. 또한, 비교적 최근의 변성기술로, 여전히 비 독성인 독소와 항원적으로 유사한 변질 단백질을 유전학적으로 생성시킬 것이다. 이들은 소위 가교반응재료 또는 CRM이다. CRM은, 천연 디프테리아 독소로부터 단일 아미노산 변화를 갖고, 면역학적으로 그와 구별할 수 없기 때문에 주목할만하다.

천연 독소에 대한 협막 중합체의 콘쥬게이션은 독성을 감소시키지만, 상당한 독성이 남을 것이다. 그러므로, 단백질 독소의 부가적인 해독은, 단백질의 유리 아미노기와 반응하는 포르말린을 사용한다. 잔류 독성은 여전히 관심을 끈다. 이외에, 자발적인 해독은 왁진 임의 특정한 몫으로 가능하고, 상기 접근에 대한 관심의 논쟁이 남는다.

대안적으로, 천연 독소는 포르말린으로 해독되어, 협막 중합체에 대한 콘쥬게이션이전에 통상적인 변성독소를 생성시킬 것이다. 그러나, 선행 포르말린 처리는, 협막 중합체 단편의 환원기와 반응하기에 유용한 유리 아미노기의 수를 감소시킨다. 그러므로, CRM는, 그들이 고유 독성을 가지지 않는다는 점에서 뚜렷한 장점을 가지지만, 그들의 아미노기중 어느것도 포르말린에 의해 점유되지 않는다. 부가적인 장점은 생물학적 위험(biohaxard)이 CRM와의 시험에 존재하지 않는다는 것이다.

천연독소와 면역학적으로 동일한 CRM의 경우에, 포르말린과의 처리(비록 해독시킬 필요가 없다 할지라도)는 면역학적 반응을 상당히 향상시킨다. 이는, 신체 메카니즘에 의한 분해에 대한 분자의 안정화 및/또는 가교에 의한 응집에서 기인한다고 여겨진다. (입자들의 면역원성은 크기에 따라 증가한다)

상기 모든 이유때문에, 파상풍 및 디프테리아 독소는 운반단백질에 대한, 프라임 후보이지만, 또한 적절할수 있는 다른 것이다. 이들 다른 것들은 디프테리아 및 파상풍과 발견된 안전을 가지지 못했다할지라도, 그들을 이용하려는 다른 압도적인 이유가 있다. 예컨대, 그들은 캐리어로서 훨씬 더 효과적이거나, 생성 경제면에 있어 중요하다. 캐리어를 위한 다른 후보는, 슈도모나스, 스타필로코커스, 스트랩토코커스, 페르투씨스 및 에쉐리시아 콜리의 독소를 포함한다.

본 발명의 특이 실시양태에서, 활성화 올리고당류는 하기와 같이 정제된 CRM단백질에 결합될 것이다.

세균성 배지를 밀리포어(Millipore)막을 통해 통과시키고, 여액으로부터 단백질을 침전시키고, 하기 단락6에 기술된 바와 같이, 이온 교환 크로마토그래피로 CRM을 정제시켜, 균주 코리네 박테리움 디프테리애(Corynebacterium Diphtheriae)에 의해 생성된 CRM을 배지로부터 분리시킬 수 있다. 대안적으로, 실질적으로 순수한 CRM은 당분야에 공지된 임의 방법에 의해 얻어질수 있다.

활성화 올리고당류는, 단백질에 대한, 활성화 올리고당류의 종결 관능기의 결합을 촉진시키기위해, 유기 용매 및 임의로, 임의의 다른 약제(예컨대, 축합제)존재하에 운반 단백질에 공유적으로 결합될 수 있다. 본 발명의 특이, 바람직한 실시양태에서, 종결 에스테르기를 함유하는 활성화 올리고당류는 하기와 같이 운반단백질 상 존재하에 유리 아미노기에 공유적으로 결합될 수 있다:

모노에스테르-활성화 올리고당류/운반 단백질의 총 아미노기의 몰비는 약 1:2이고, DMSO의 최종 농도는 약 50%v/v가 되도록, 활성화 올리고당류를 디메틸설폭시드에 용해시키고 나서, 운반 단백질(예컨대, 제한되지는 않고, 약 2mg/ml 농도에서의 CRM)의 수용액에 첨가시킬 수 있다. 콘쥬게이션 반응은 4℃에서 수행하고, 반응이 약 2시간내에 거의 완료된다할지라도, 각 타잎 특이 클리코콘쥬게이트에 대해 가장 높은 값에서 반응수율을 증가시키기 위해 밤새도록 반응시키는 것이 적절하다. 상기와 같이 얻어진 글리코콘쥬게이트는 그리고 나서, 겔크로마토그래피에 의해 정제된다.

일가 왁진 합성을 위해, 세균의 단일 혈청형으로부터 유도된 올리고당류는 단백질의 콘쥬게이팅될 수 있다. 다가 왁진의 합성을 위해, 서로 다른 종 또는 서로 다른 혈청형의 세균으로부터 유도된 올리고당류 혼합물의 운반 단백질로의 결합으로 글리코콘쥬게이트를 생성시킬 수 있다; 대안적으로, 서로 다른 올리고당류를 사용하는 분리 반응에서 단일 형태의 올리고당류를 운반단백질과 반응시켜 생성시킨 글리코콘쥬게이트는 혼합될 수 있다. 그러므로, 다가 왁진은 결합 올리고당류의 동종 또는 이종성 개체군 함유 운반 단백질로 구성될 것이다.

[글리코콘쥬게이트의 면역화학적 특성]

상기 방법에 의해 생성된 글리코콘쥬게이트의 면역원성의 검증은, 제한되지는 않고, 토끼, 돼지, 기니아 돼지, 생쥐, 쥐 또는 염소를 포함하여, 인간에 대한 투여 이전에 임의 적절한 동물시스템에서 시험될 수 있다. 본 발명의 특이 실시양태에서, 토끼(대략 중량 2Kg)는 인산 알루미늄 또는 수산화물 존재 또는 부재하에 당단백질 콘쥬게이트가 피하로 접종될 것이다. 대략 올리고당류 2.5㎍은 2Kg 토끼에 대한 적절한 투여량을 구성할 것이다. 항체 역가는 그리고 나서, 효소 결합 면역 흡수제(immunosordent)분석(ELISA) 또는 당분야에 알려진 임의의 다른 방법에 의해 평가될 수 있다. 본 발명의 글리코콘쥬게이트를 향해 생성된 항체는 항원을 면역 침전시킬 수 없기때문에, 면역 침전에 의존하는 항체 분석은 역가를 결정하기 위해 추천되지 않는다.

[왁진 배합물 및 투여]

왁진을 조제하기 위한 적절한 캐리어 매질은 pH 6 에서 인산나트륨-완충 살린에 현탁된 0.125M 인산알루미늄 겔 또는 인산 나트륨-완충 살린(pH 7.4) 및 다른 통상적인 매질을 포함한다.

대개, 올리고당류 약 5 - 약 100㎍, 바람직하게 약 10-50㎍을 함유하는 왁진은, 어린 온혈 포유동물내 협막 중합체에 대한 효과적인 수준의 항체를 유도해나가기에 적절하다. 물론, 정확한 투여량은 일상적인 투여량/반응 실험에 의해 측정될 수 있다. 어린이를 위한 왁진 제조를 위해 당단백질 콘쥬게이트의 농도는 올리고당류 약 25-200㎍ 범위내로 구성된다. 보다 많은 투여량이 체중을 기준으로 투여될 수 있다. 실질적으로 제공된 여러 개의 적은 투여량이 단일 주입으로서 제공된 콘쥬게이트 동일량에 비해 우수함이 기대될 것이다.

본 발명의 왁진은 임의 나이의 온혈 포유동물에 투여될 수 있고, 병원체 헤모필루스 인플루엔자 타잎b, 에쉐리시아 콜리, 스트렙토코커스 뉴모니애, 나이세리아 메닌기티디스 및 슈도모나스 아레루기노사에 의해 야기된 어린 포유동물에서의 전신계 감염에 대한 활성 면역화를 유도해내는데 특히 적합하다.

본 발명에 따라, 왁진은 피하로, 정맥내로, 근육내로, 복강내로, 구강으로 또는 비 내로 전달될 수 있다. 왁진은 가용성 또는 미립분말 형태로의 또는 세포내지 방입자를 포함하는 중심체 또는 마이크로베시클(microvesicles)로 혼입된 글리코콘쥬게이트로 구성된다.

[올리고당류 콘쥬게이트 왁진의 이용]

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 피낭 병원성 세균에 대해 향해있는 글리코콘쥬게이트 왁진은 이들 약제에 의해 야기된 감염으로 부터 영향을 받기쉬운 개인을 보호하기 위해 사용된다. 영향을 받기쉬운 개인은 절충 면역 시스템 또는 만성 질병 특히, 후천성 면역 결핍증(A.I.D.S), 조혈악성, 당뇨병, 만성 심장병, 만성 폐질환, 및 낫세포 빈혈증을 가진 임의의 개인뿐 아니라 미숙 면역 시스템을 가진 어린 아이, 무비장증 개인을 포함한다. 본 발명의 글리코콘쥬게이트는, 운반 단백질에 대한 그들의 콘쥬게이션 덕분으로, 그들이 운반하는 올리고당류의 면역원성을 향상시킨다.

그러므로, 본 발명의 글리코콘쥬게이트는 스트렙토코커스 뉴모니애, 헤모필루스 인플루엔자, 에쉐리시아 콜리, 나이세리아 메닌기티디스, 살모넬라 티피, 스트랩토코커스 무탄스, 크립토코커스 네오포로만스, 글렙시엘라 뉴모니애, 스타필로코커스 아우레우스, 및 슈도모나스 아에루기노사를 포함하는, 다당류 협막을 소유하는 임의 세균으로의 감염에 대한 보호를 부여하기 위해 왁진 주사에 사용될 수 있다. 어린이에게 특히 악성이고, 본 발명에 의해 특이하게 제공되는 에스 뉴모니애 균주는, 타잎 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14,15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 및 33F를 포함한다.

특히 실시양태에서, 단일특이성 및 동종 면역 반응을 유도하기 위해 본 발명의 왁진이 사용될 수 있다. 단일특이성 면역 반응은, (ⅰ) 피하로의 모든 항체가 특이 에피로프에 대해 향해지고, 동일한 친화력 일정 값에의해 특징지워지는, 균질 특이성; (ⅱ) 우수한 항-세균 활성을 가진 높은 친화력 상수 값; (ⅲ) 안전 왁진(safer vaccine)을 결과시키는, 숙주관련 항원과의 가교-반응성 부재 및 증가된 타겟 특이성; 및 (ⅳ) 또한 안전 왁진을 결과시키는, 단일특이성 항체의 증가된 침전 활성에서 기인하는 감소된 보체 활성화를 가진 항체를 제공함을 포함하는, 다수의 장점과 관련된다.

부가적인 실시양태에서, 본 발명은, 펩티드 또는 리포올리고당류 또는, 본 발명 방법에 의해, 운반단백질에 결합되는 다른 표면 올리고당류 헵텐을 인지하는 왁진을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 왁진은 예컨대, 종양 세포에 대한 면역성 유도 또는, 화학요법제 또는 생활성제에 콘쥬게이팅된 항-종양 항체의 생성에 사용될 수 있다; 상기 항-종양 활성은 본 발명 방법을 사용하여 종양-특이항원 또는 그의 에피로프를 운반 단백질에 결합시켜 유도할 수 있다.

[실시예 : 다가 폐렴구균 올리고당류 콘쥬게이트 왁진의 개발]

[다당류의 제조]

American Type Culture Collection 으로부터, 에스 뉴모니애 타잎 6A 협막 다당류, 에스 뉴모니애 타잎 14 협막 다당류, 에스 뉴모니애 타입 19F 협막 다당류 및 에스 뉴모니애 타잎 23F 협막 다당류가 얻어졌다.

[다당류의 가수분해]

[에스 뉴모니애 타잎 6A 다당류의 가수분해]

타잎 6A 에스 뉴모니애 협막 다당류 2mg을 pH = 3.4 에서 아세트산 10mM을 함유하는 수용액 1ml에 용해시키고나서, 30시간동안 100℃에서 오일욕내 침지된 밀봉 앰푸울에서 가수분해시켰다. 결과되는 올리고당류를, pH 7.0, 4℃에서 NaCl 15mM 용액으로 콘디셔닝된 세파덱스(Sephadex) G15 (Pharmacia, Uppsala) 상 크로마토그래피로 반응 혼합물로부터 분리시켰다.

메틸-펜토즈, 인 및 환원기 예컨대, 알데히드기의 존재를 확인하기 위해 Kabat, (1964 in Experimental Immunochemistry, Ed, E.A. Rabat 및 Mayer, pp. 538-541), Chen 일행, (1956, Anal. Chem. 28 : 1756-1758) 및 Porro 일행 (1981, Anal. Biochem. 118 : 301-306)에 의해 보고된 바와 같은 과정에 따라 크로마토그래피 유출물을 분석했다. 분석은 메틸 펜토즈/알데히드 비율 3.96, 메틸 펜토즈/인 비율 0.96, 및 인/알데히드 비율 4.12를 나타냈다.

완충액을 사용하는, 세파덱스 G-50 슈퍼화인(Superfine) 상 겔 크로마토그래피는 대략 2,500의 분자량에 상응하는, 분포상수(Kd) 0.538 (헥소 오스에 의한)을 나타내었다.

N.M.R 기체 크로마토그래피 및 화학양론적 분석은, 면역우선(immuno dominant)당인, 갈락토즈 중 약 3-4 염기성 반복단위로 구성되는 올리고당류가 발견되었음을 지시했다.

[에스 뉴모니애 타잎 14 다당류의 가수분해]

타잎 14 에스 뉴모니애 협막 다당류 2mg을 0.5M 트리플루오로 아세트산을 함유하는 수용액 1ml에 용해시키고 나서, 7시간 동안 70℃에서 오일욕에 침지된 밀봉 앰푸울에서 가수분해시켰다. 결과되는 올리고당류를, pH 7.0, 4℃에서 NaCl 15mM 용액으로 콘디셔닝시킨 세파덱스G15 (Pharmacia, Uppsala)상 크로마토그래피로 반응혼합물로 부터 분리시켰다.

그리고나서, 크로마토그래피 유출물을 헥소사민 및 알데히드 성분에 대해 분석했고, 알데히드 비율에 대한 헥소사민 3.17을 가짐이 밝혀졌다. 기체 크로마토그래피 및 화학양론적 분석은, 3-4개 염기성 반복 단위들에 상응하는 분자크기를 지시했다. 기체 크로마토그래피에 의해 측정된바와 같은, 갈락토즈의 디브렌칭은, 10% 내었다. pH 7.0에서 15mM NaCl을 사용하는 Sephadex G-50 슈퍼화인(Pharmacia)상 겔 크로마토그래피는, 올리고당류에 대해, 총 헥소오스에 의해 측정된 바와 같은 분포 상수(Kd)0.30을 나타내었다.

[에스 뉴모니애 타잎 19F 다당류의 가수분해]

타잎 19F 에스 뉴모니애 협막 다당류 2mg을 pH = 3.4 에서 아세트산 10mM을 함유하는 수용액 1ml에 용해시키고나서, 48시간동안 50℃에서 오일욕내 침지된 밀봉 앰푸울에서 가수분해시켰다. 결과되는 올리고당류를, pH 7.0, 4℃에서 NaCl 15mM 용액으로 콘디셔닝시킨 세파덱스 G-15 (Pharmacia, Uppsala) 상 크로마토그래피로 반응 혼합물로부터 분리시켰다.

메틸-펜토오스, 인, 및 환원기 예컨대, 알데히드기의 존재를 확인하기 위해, Kabat, (1964 in Experimental Immunochemistry, Ed, E.A. Rabat 및 Mayer, pp. 538-541), Chen 일행, (1956, Anal. Chem. 28 : 1756-1758) 및 Porro 일행 (1981, Anal. Biochem. 118 : 301-306)에 의해 보고된 바와 같은 과정에 따라 크로마토그래피 유출물을 분석했다. 분석은 메틸 펜토오스/환원된 메틸 펜토오스 비율 3.5 및 메틸 펜토오스/인 비율 3.2를 나타내었다.

세파덱스 G-50 슈퍼화인(Pharmacia) 상 겔 크로마토그래피는, 올리고당류에 대한 Kd=0.46 (총 헥소오스에 의한)을 나타내었고, 기체 크로마토그래피 및 화학양론적 양에 의한 결합 분석은 3-4 염기성 반복 단위에 상응하는 크기를 지시했다.

[에스 뉴모니애 타잎 23F 다당류의 가수분해]

타잎 23F 에스 뉴모니애 협막 다당류 2mg을 0.25M 트리플루오로 아세트산의 수용액 1ml에 용해시키고 나서, 3시간동안 70℃에서 오일욕내 침지된 밀봉 앰푸울에서 가수분해시켰다. 결과되는 올리고당류를, pH 7.0, 4℃에서 NaCl 15mM 용액으로 콘디셔닝시킨 세파덱스 G-15 (Pharmacia, Uppsala) 상 크로마토그래피로 반응 혼합물로부터 분리시켰다.

메틸-펜토오스, 인, 및 환원기 예컨대, 알데히드기의 존재를 확인하기 위해, Kabat, (1964 in Experimental Immunochemistry, Ed, E.A. Rabat 및 Mayer, pp-538-541), Chen 일행, (1956, Anal. Chem. 28 : 1756-1758) 및 Porro 일행 (1981, Anal. Biochem. 118 : 301-306)에 의해 보고된 바와 같은 과정에 따라 크로마토그래피 유출물을 분석했다. 분석은 헥소오스/알데히드 비율 4.5-4.5, 헥소오스/메틸 펜토오스 비율 2.3 및 인/알데히드 비율 2.9를 나타내었다.

기체 크로마토그래피 및 화학양론적 분석은 3.5-4.5개 염기성 반복 단위의 존재를 지시했다. 기체 크로마토그래피에 의해 측정된, 람노오스의 디브렌칭은 8%이하였다.

세파덱스 G-50 슈퍼화인(Pharmacia) 상 겔 크로마토그래피는, 분포상수(Kd) 0.38(헥소오스에 의한)을 나타내었다.

[에스 뉴모니애 올리고당류 헵텐의 면역화학적 특성]

무자 협막 다당류에 대해 향해진 항체와 상호작용 시키기 위한 에스.뉴모니애 타잎 6A, 14, 19F 및 23F 올리고당류의 능력을, 항체 면역침전 반응을 위해 균질 항원(협막 다당류)을 저해하는 헵텐(즉, 올리고당류) (저 분자량 헵텐은 균질 항체에 대해 시험될 때 면역침전을 제공하지 않는다)의 능력을 측정하는 기술을 사용하여 Porro 일행(1985, Mol. Immunol. 22 : 907-919)에 기술된 바와 같이 시험했다.

차동 면역전기영동법(differential immunoelectrophoresis)로 일컬어지는 방법을 하기와같이 수행했다 : 면역전기영동법을 위한 플라스틱 판 지지체는 세개의 1%(w/v) 아가로오스 구획 (Agarose M-LKB, Bromma, Sweden)을 포함했다. 첫번째 구획은 협막 다당류에 대한 참고 항혈청 0.05%(v/v)를 포함했다. 두번째 구획은 15분동안 37℃에서 공지된 양의 참고 협막 다당류로 앞서 배양된 협막 다당류에 대한 참고 항혈청 0.05%(v/v)를 포함했다. 세번째 구획은 공지된 양의 올리고당류 헵텐으로 앞서 배양된 협막 다당류에 대한 참고 항혈청 0.05v/v를 포함했다. 4개의 일련의 두-배 희석물내 협막 다당류의 전기영동분리는 그리고나서, 90분동안 pH=8.8, 20mM 트리스-바르비투레이트 완충액내 70v/cm에서 수행되었다. 전기영동후, 판은 은-착색되었고, 건조되고, 양이측정 되었다. 올리고당류 분자에 의한 저해는, 헵텐으로 예비-배양된 참고 항혈청을 함유하는 구획에 나타나는 높은 로케트(rocket) 면역침전물에 의해 입증되었다. 헵텐의 최소 저해농도는로서 계산되었다.

상기식에서, C_Ha= 겔내에서 조사된 헵텐의 농도

h_Ag= 참고 항원이 겔내였을때 얻어진 "로케트" 면역침전물의 높이에 의해 측정된 바와같은 직선의 절편.

h_Ha= 조사된 헵텐이 겔내였을때 얻어진 "로케트" 면역침전물의 높이에 의해 측정된 바와같은 직선의 절편.

유사하게,

특이성 =

서로다른 크기의 올리고당류 헵텐을 시험했다.

특이 항체에 의한 협막 다당류의 블럭 면역 침전에 대한 올리고당류의 능력은 또한, 방사 면역확산의 비 전기영동법에 의해 시험되었다. 본 발명에 따라, 올리고당류 분자들에 의한 저해는, 주어진 양의 저해제(올리고당류)로 앞서 배양된 특이 항체를 함유하는 1%w/v 아가로오스를 통한 항원(협막 다당류)의 확산에 의해 형성된 면역침전물의 큰 반경에 의해 입증되었다. 제공된 헵텐에 대한 최소 결합농도(MCC)가 실험적으로 밝혀질때, 특이성은 그후, 앞서 언급된 공식에 따라 계산된다 :

[에스. 뉴모니애 올리고당류의 말단-환원 단위의 활성화]

상기 단락에 기술된 바와같이 얻어진, 올리고당류 헵텐을 최종 농도 약 5mg/ml로 물에 용해시켰다. 각 용액에, 용액부피의 각 ml에 대해 0.2M KHPO0.1ml를 첨가하고, 요구되는 양의 디아미노메탄으로 pH를 9.2-9.4로 상승시켰다. (대개, 용액의 각 ml에 대해 2㎕ 디아미노메탄이 요구된다) 혼합물을 15분동안 100℃에서 유지시키고, 상기 시간동안 용액부피의 각 ml에 대해 피리딘보란 약 4㎕을 첨가했다. 1N NaOH로 pH를 9.2로 조절했다. 혼합물을 밀봉 앰푸울내, 다음 48시간동안 50℃에서 오일욕으로 옮겼다. 그후, 아미노-활성 올리고당류 용액을 1n HCl로 중화시키고, 세파덱스 G-15 슈퍼화인 (15mM NaCl, pH 7.0)상 정제시켰다. 수집 크로마토그래피 분류물을 푸울링시키고, 냉동 건조시켰다. 그리고나서, 냉동-건조 잔류물을 DMSO 내 10mg/ml로 용해시키고, 냉동-건조 화합물내에 존재하는 아미노기의 양에 대한 5:1의 몰/몰 비에 상응하는 SIDEA (또는 SIDES) 몰양에 첨가했다. 반응을 실온에서 4시간동안 진행시키고 나서, 에스테르 활성올리고당류를 침전시키기 위해 1,4 디옥산의 용액 4부피 (1,4 디옥산내 최종 농도 80%)에 첨가했다. 원심분리에 의해 수집된 침전물을 1,4 디옥산으로 세번 세척시키고, 콘쥬게이션 방법에 사용되지 않는한 -20℃ 이하에서 유지시켰다. 네개의 올리고당류 각각에 대한 활성화법의 수율은 표 4 보여진다.

[CRM단백질에 대한 활성화 올리고당류의 콘쥬게이션]

[CRM단백질의 제조]

밀리포어 XM-50 (NMWL 5 X10) 막을 사용하여 분자여과로, 코리네박테리움 디프테리애(Corynebacterium diphtheriae) C7 (B)에 의해 생성된, CRM을 배지로 부터 분리시켰다. 황산암모늄의 포화용액(65% w/v 이하)을 여액에 첨가하여 단백질을 침전시켰다. 원심분리로 침전 단백질을 수집하고, 0.01M 인산염 완충액(pH=7.2)에 용해시켰다.

용리액으로서 0.01M 인산염 완충액내 0.09M NaCl을 사용하여, pH 7.2에서 0.01M 인산염 완충액내 콘디셔닝된 2.5 S100cm DEAE - 세파로즈 6B/CL 컬럼(pharmacia, Uppsala)을 사용하는 이온-교환 크로마토그래피로 CRM의 부가적인 정제를 얻었다.

환원 조건하에 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Pappenheimer 일행, 1972, Immunochem. 9 : 891-906)은, 얻어진 CRM80%가 그의 본래 분자형이었음을 지시했다. 단백질의 순도는 대략 400 응집한계 (Lf)/mg 임이 밝혀졌다.

[활성화 올리고당류의 콘쥬게이션]

콘쥬게이션 과정은, 모노숙신이미딜 에스테르-활성화 올리고당류 헵텐의, 운반 단백질 CRM의 리신 잔기의 엡실론-아미노기로의 커플링으로 구성된다.

디메틸 설폭시드 함유 에스. 뉴모니애 타잎 6A, 14, 19F 및 23F 협막 다당류의 모노숙시날아마달 에스테르(아디프산의) 활성화 올리고당류를, CRM2mg/ml 함유 0.1M 중탄산염 용액 pH=8.0 에 첨가하여 물 내 50%인 용액을 생성시켰고, 이때, 에스테르-활성화 올리고당류 대 운반 단백질의 총 아미노기의 몰비는 1:2이다.

상기와 같이 얻어진 혼합물을, 15시간 동안 4℃에서 온화한 교반하에 유지시켰다. 4개의 혈청형 각각으로 부터의 올리고당류를 분리반응에서 단백질에 콘쥬게이션시켰다. 얻어진 글리코콘쥬게이트의 물리화학적 특성의 요약은 표 5에 제시된다.

[아디프산의 숙신이미딜 디에스테르 대 숙신산의 숙신이미딜 디에스테르를 링커로서 사용하는 콘쥬게이션 효율의 비교]

숙신산의 숙신이미딜디에스테르(SIDES)와의 반응에 의해 형성된 활성화 올리고당류는 하기 구조 :

를 갖는 반면, 아디프산의 숙신이미딜 디에스테르(SIDA)와의 반응에 의해 형성된 것들은 하기 구조 :

를 갖고, 이로써, 올리고당류 및 콘쥬게이티드 단백질 사이의 서로 다른 크기의 링커가 생성된다(제2도 참고). SIDES 대 SIDEA 활성화 올리고당류를 사용하는 콘쥬게이션 효율을 평가했다. 제3A, B 및 C도에 보여진 바와같이, 링커가 SIDEA 로부터 유도될때만이, 단백질이 완전하게 글리코실화 형태인 것같아 보인다(이때, CRM₁₉₇의 자유 밴드는 거의 검출되지 않았다).

[에스. 뉴모니애 글리코콘쥬게이트의 면역원성]

네개의 글리코콘쥬게이트 항원의 여러배합물을 제조하고, 토끼에서 시험했다. (표Ⅵ에 묘사된 스케쥴에 따라) : 타잎-광물 보조제(투여량 당 1mg의 다가 배합물에서만 투여되었다.)로서 수산화알루미늄[Al(OH)₃]과 그리고, 없이, 단가 배합물(투여량 당 2.5 또는 5.0㎍ 올리고당류)또는 다가 배합물(투여량 당 각 올리고당류 2.5㎍)내 특이 글리코콘쥬게이트 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 로케트 면역 전기영동에 의한 다가 배합물의 상층액의 처리가 임의 검출 가능한 양의 유리 단백질을 나타내지 않았기 때문에, Al(OH)₃에 대한 네개 글리코콘쥬게이트에 대한 완전한 흡착을 채택된 조건하에 야기시켰다. 각 글리코콘쥬게이트의 평균 투여량은 대략 2.5㎍ 올리고당류 및 13㎍의 운반단백질 CRM₁₉₇을 포함했다. (디프테리아 변독소의 평균 인간 왁진주사 투여량에 필적함) 면역 스케쥴은 프라임 투여량 및 4주간격의 두개의 부우스터 투여량을 포함했다. 출혈을 0, 4, 6 및 10주에 수행했다.

표 7는 면역화된 동물 수에 대한 반응자수 뿐아니라 RIA(FARR 방법)측정된 타잎-특이 항체양을 보여준다. 비율(R)은 각각의 면역화 투여량후 도달된 배증가(fold increase)를 지시한다.

표 8는 반응자 수 대 면역화된 동물 수 뿐아니라 IgG 중복기준 Ab로 ELISA 역가를 보여준다. -R-R-R비율은 각각의 면역화 투여후 역가에서의 배 증가를 지시하는 반면, 비율 R, -R, -R는, 예비-역가에 관한 제공된 면역화 투여량에 대한 역가에서의 배 증가를 지시한다. 표 9는 살아있는 연쇄상구균에 대한 다당류 협막의 인지에서 유도된 IgG 항체 기능성으로 정성적 결과를 보고한다(팖룽 반응(Quellung reaction) 또는 노이펠드 반응).

표 10는 베로(vero) 세포 분석에 의해 측정된 바와같은, 운반 단백질 CRM에 의해 토끼에서 유도된 디프테리아 독소-중화 역가를 보여준다. 참고 FDA 항혈청이 대조표준으로서 사용되었기 때문에, 1/mlfh 표현된 역가가 또한 포함되었다.

[사슬 길이=10-20의 올리고당류는 준최적화적으로 면역원성이다.]

글리코콘쥬게이트 왁진의 두개 기를 앞서 기술된 합성 도식에 따라 합성시켰지만, 사슬길이의 두개의 서로 다른 "범위-값", 즉=3-5 및=10-20 을 가진 타잎 6A, 14, 19F 및 23F 에스. 뉴모니애의 당류를 사용했다. 사슬길이=20 이상인 올리고당류가 훨씬 짧은 사슬길이, 예컨대=3 올리고당류와 비교된 바와같은 프라이밍 및 부우스팅 능력으로, 최적 면역원성(선택된 운반 단백질 CRM₁₉₇에 대한 콘쥬게이션 시) 인지의 여부가 문제시되었다.

표 11에 요약된 프로토콜을 사용하여 토끼를 면역화시켰다. Al(OH)₃에 흡수된, 각각=10-14 및=3-6 인 에스.뉴모니애 올리고당류에 의해 유도된 IgG 중복기준 항체 역가의 ELISA 결과와 관련되는 표 14 및 표 15에 제시된 것들뿐아니라, 각각=10-14 및=3-6 인 가용성 에스.뉴모니애 올리고당류에 의해 유도된 IgG 중복기준 항체 역가의 ELISA 결과와 관련되는 표 12 및 표 13에 제시된 결과들을 비교하여 보여진 바와 같이,=10-14는 향상된 면역원성과 관련되지 않았다. 사실,=3-5 올리고당류 콘쥬게이트의 IgG 프라이밍 및 부스팅 활성은=10-14 올리고당류 콘쥬게이트를 사용하여 관찰된 활성보다 훨씬 더 컸다. 우연하지 않게, 조사된 모든 네개의 카르보히드레이트 구조들은 유사결과와 관련되었다. 이외에,=10-14 인 글리코콘쥬게이트에 의한 디프테리아 독소의 중화는=3-6 인 글리코콘쥬게이트를 사용하여 얻어진 것보다 덜 효과적임이 밝혀졌다(표 XVI). 그러므로,=3-6의 올리고당류를 통해 본 발명의 콘쥬게이트내 관능성인 사슬길이=10-20의 올리고당류는 항체의 더 높은 역가를 유도한다.

* 역가는 반응 백그라운드의 두배인 ABS 값을 보여주는 가장높은 혈청 희석의 반비례의 기하학적 수단으로서 표현된다.

동물(주입된 것 모두에 대한 반응자) 수는 괄호에 보고된다.

* 역가는 디프테리아 독소에 대한 세포의 노출후 H-류신 혼입에 의해 측정된 바와같이, 토끼 항혈청의 푸울이 세포에 대한 50% 보호를 보여주는, 희석의 반비례로서 표현됨.

괄호안의 수치는 대조표준으로서 FDA 참고 항혈청에 의해 측정된 바와같이 ㎍/ml로의 역가를 지시한다.

인간에서 측정된 MPL : 0.01㎍/ml

[글리코 콘쥬게이트에 대한 면역 반응은 단일 특성이고 동종이다.]

방사면역 분석(RIA) 및 효소 결합 면역 흡수체 분석(ELISA)에 의해 측정된 항체 역가에 관해, 표 7 및 표 8에 묘사된 결과의 비교는, RIA 측정 역가가 ELISA -측정 역가보다 시종일관 낮았음을 나타낸다. 항-글리코콘쥬게이트 항혈청의 방사 면역 확산 및 로케트 전기영동 분석을 위해 사용된 아가로즈 겔 내 면역 침전물의 부재와 함께, 상기 관찰은, 에스.뉴모니애 올리고당류-CRM콘쥬게이트에 대한 토끼 항혈청이, 올리고당류를 생성시키기 위해 사용된 개별적인 정제된 카르보히드레이트 중합체들을 침전시킬 수 없는 매우 특이한 IgG 중복 기준 항체를 포함했음을 입증한다.

항혈청내 침전되는 항체의 부재는 단일특이성 즉, 제공된 분자의 항원성 페퍼토리내 단지 하나의 에피토프의 항체 인지를 나타낸다(Berzofsky-Schechter, 1981, Molecular Immunol. 18 : 751-763). 항원-항체 복합체의 침전은, 결합된 항원 및 항체 분자의 삼차원, 분지 네트워크를 생성시키기 위한 격자 형성을 요구한다. 이를 야기시키기 위해, 하나이상의 항체가 단일 항원 분자에 동시에 결합될 수 있음에 틀림없으므로 항원 및 항체 모두의 다가가 요구된다. 그러므로, 에스.뉴모니애 올리고당류 -DRM콘쥬게이트에 대한 토끼 항혈청 및 동종 정제된 고분자량 협막 다당류 사이에서 야기되는 현저한 면역침전 부족은, 항혈청이 카르보히드레이트 중합체에 특이한 항체를 포함(ELISA 및 저해-ELISA 분석에 의해 보여진 바와같음)하지만, 다당류의 단지 하나의 결정인자(에피토프)에 대한 것임을 강하게 나타낸다.

면역침전 활성을 나타내는 것이외에, 항체의 이종개체균은 또한, 대개 하기 성질과 관련된다 : 항체 반응을 유도하기 위해 사용된 항원의 단일 에피토프는 항원을 완료시키기 위한 항체의 총 개체군의 결합을 완전하게 저해할 수 없지만, 완전한 항원상 존재하는 잔류하는 에피토프에 대한 결합을 위한 유리된 다른 저해할 것이다. 항체의 개체군은 ELISA-저해 분석에 의해 이질성에 대해 평가될 것이다. 상기 분석에서, 완전한 항원에 대한 결합을 위한 항체의 개체군의 능력은 항원의 단리된 에피토프 같은, 항원/항체 결합의 저해제 존재하에 측정될 수 있다. 라벨링된 완전한 항원에 대한 항체의 결합이 증가되는 농도의, 라벨링되지 않은 완전한 항원 존재하에 측정될 때 도표로 나타내어진 바와같이, 항체/항원 결합에 대한 표준 커브로서 사용될 수 있는 S자형 커브가 생성된다. 항체 개체군이 이종이라면, 항체와 완전한 항원사이의 결합은 단일 항원성 에피토프의 첨가에 의해 완전하게 저해될수 있고, 항체/항원 결합의 표준 커브는, 시험될 에피로프와 관련된 것들과 다른, 다른 항원/항체 상호작용이 우세하기 때문에 단지 부분적으로 대치된다(부분적으로 겹치거나 부분적으로 평행함). 반대로, 항원에 대한 항체의 동종 개체군의 결합은 단리된 에피로프의 첨가에 의해 완전하게 저해될 수 있다; 항체의 동종 개체군에 대한 표준 S자형 항원/항체 결합 커브는, 개체군의 특이성에 상응하는 단리된 에피로프의 첨가에 의해 생성된 커브에 의해 겹쳐지거나 평행할 것이다.

실험적으로, 상기 방식으로, 에스.뉴모니애 글리코콘쥬게이트 유도된 토끼 IgG의 시험에 의해, 항체의 동종 개체군에 대해 예측된 것에 상응하는 친화력 패턴이 관찰되었다(제4도). 에스.뉴모니애 6A 올리고당류 (비-콘쥬게이트 또는 콘쥬게이트형으로)는, 혈청형 6A 고 분자량 협막 다당류를 사용하여 유도된 것과 대개 평행한 결합 저해 S자형 커브와 관련되었다. 예측되었듯이, 유리(링커-활성화된) 또는 콘쥬게이티드형으로의 이종(타잎 14) 올리고당류는 타잎 6A 항원에 대해 특이한 IgG 혈청형 개체군을 저해하지 않았다.

Claims

하기 (ⅰ)-(ⅲ) 단계들로 구성되는 , 올리고당류 및 운반 단백질의 공유결합 콘쥬게이트를 생성시키기 위한 방법 : (ⅰ) 말단 환원기를 갖는 올리고당류를, 피리딘 보란 존재하에 디아미노메탄과 반응시켜 환원성 아민화를 야기시키는 단계; 및 (ⅱ) (ⅰ)의 아민화 올리고당류 생성물을, 하나는 활성화 올리고당류의 말단기와 반응할 수 있고 다른 하나는 상기 운반 단백질과 반응할 수 있는 두개의 관능기로 구성되는 분자와 반응시키는 단계; 및 (ⅲ) (ⅱ)의 활성화 올리고당류 생성물을 상기 운반 단백질과 반응시켜 콘쥬게이션을 야기시키는 단계.
제1항에 있어서, 단계 (ⅲ)의 두개의 관능기로 구성되는 분자가 디에스테르인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (ⅱ)의 두개의 관능기로 구성되는 분자가 아디프산의 디에스테르 또는 숙신산의 디에스테르인 방법.
하기 (ⅰ)-(ⅳ) 단계들로 구성되는 방법에 의해 생성된 운반 단백질 및 올리고당류 사이의 공유결합 콘쥬게이트 : (ⅰ) 다당류를 가수분해시켜 하나 이상의 말단 환원기를 갖는 올리고당류를 생성시키는 단계; 및 (ⅱ) 상기 올리고당류를 피리딘 보란 존재하에 디아미노에탄과 반응시켜 환원성 아민화를 야기시키는 단계; 및 (ⅲ) (ⅱ)의 아민화 올리고당류 생성물을, 하나는 활성화 올리고당류의 말단기와 반응할 수 있고, 다른 하나는 상기 운반 단백질과 반응할 수 있는 두개의 관능기로 구성되는 분자와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) (ⅲ)의 활성화 올리고당류 생성물을 상기 운반 단백질과 반응시켜 콘쥬게이션을 야기시키는 단계.
제4항에 있어서, 단계(ⅲ)의 두개의 관능기로 구성되는 분자가 디에스테르인 공유결합 콘쥬게이트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고당류가 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae) 협막 다당류로부터 유도되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 운반 단백질이 CRM₁₉₇인 방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 올리고당류가 스트렙토코커스 뉴모니에 협막 다당류로부터 유도되는 올리고당류와 운반 단백질 사이의 공유결합 콘쥬게이트.
제8항에 있어서, 올리고당류가 타잎 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 20, 22F, 23F 및 33F로 구성되는 군으로부터 선택된 혈청형을 갖는 스트렙토코커스 뉴모니에로부터 유도되는 공유결합 콘쥬게이트.
제4항의 공유결합 콘쥬게이트와 제약학적으로 허용가능한 캐리어 매질을 포함하는 왁진.