CZ285650B6 - Způsob přípravy kovalentního konjugátu oligosacharidu a nosičového proteinu - Google Patents

Abstract

Předložený vynález se týká zlepšeného způsobu přípravy vakcín oligosacharidových konjugátů. Z dalšího aspektu vynálezu, jsou připravovány oligosacharidové vakcíny, které vyvolávají monospecifickou a homogenní imunitní odezvu ke kapsulárnímu polysacharidu. Specifické provedení vynálezu poskytuje vakcíny, které indukují imunitu k prevalentním serotypům Streptococcus pneumoniae.ŕ

Description

(57) Anotace:

Způsob přípravy kovalentního konjugátu oligosacharidu a nosičového proteinu, který zahrnuje následující stupně:

i) reduktivní aminaci oligosacharidu, majícího terminální redukující se skupinu s dlamlnoethanem za přítomnosti pyridinboranu, při teplotě 100 °C, ii) reakci aminovaného oligosacharidového produktu z odstavce i) s molekulou, obsahující dvě funkční skupiny, z nichž jednaje schopna reakce s terminální skupinou aktivovaného oligosacharidu a druhá Je schopna reakce s uvedeným nosičovým proteinem a lil) konjugaci aktivovaného oligosacharidového produktu z odstavce 11) s uvedeným nosičovým proteinem.

Způsob přípravy kovalentního konjugátu oligosacharidu a nosičového proteinu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy kovalentního konjugátu oligosacharidu a nosičového proteinu. Konjugáty vyrobené způsobem podle vynálezu jsou použitelné jako vakcíny poskytující monospecifickou a homogenní imunitní odpověď na kapsulámí polysacharidy a indukující imunitu k zavedeným serotypům Streptococcus pneumoniae, které mohou být důležité pro použití u dětských pacientů jakož i u pacientů starších a pacientů s oslabenou imunitou, způsobenou slabostí nebo chorobou (včetně např. pacientů s AIDS).

Dosavadní stav techniky

Pneumococcus (streptococcus pneumoniae) je gram-pozitivní kapsulující krok, který obvykle roste v párech nebo krátkých řetězcích. V diplokokové formě jsou přilehlé okraje zaoblené a opačné konce nepatrně zašpičatělé a organismus dostává lancetovitý tvar.

Pneumokoky mohou být rozděleny do serotypů podle komplexních polysacharidů, které tvoří jejich kapsule. Bylo identifikováno 84 serotypů působením typově-specifického antiséra Neufeldovou potlačovací reakcí. Všechny jsou pro člověka patogenní, ale typy 1, 3, 4, 7, 8, 9 a 12 jsou nejčastěji nacházeny v klinické praxi. Typy 6, 14, 19 a 23 často způsobují pneumonii a otitis média u dětí, ale jsou méně běžné než u dospělých (Austrian, 1983, v „Harrison's Principles of Intemal Medicine“, Petersdorf a spol., vyd. 10. vydání, McGraw Hill Book Co.„ New York str. 918-922). Pneumokokus je jedním ze tří patogenů, odpovídajících ze pneumonii, sepsi a meningitidu dětí (McMillan, 1982, v „Core Textbook of Pediatrics, Kaey a spol., vyd., Second Edition, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, str. 498).

Mezi osoby s vyšším rizikem rozvinutí pneumokokové infekce patří pacienti s chronickými systémovými chorobami jako jsou choroby srdeční, chronické bronchopulmonální choroby, jatemí choroby, ledvinové nedostatečnosti a nádory. Je doporučováno, aby těmto osobám byla podána vakcína proti pneumokokové infekci. Pro tento účel jsou vhodné dvacet tři vakcíny, obsahující kapsulámí polysacharidy pneumokokových typů 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F a 33F (které zahrnují serotypy nebo skupiny odpovědné za 90 procent vážných pneumokokových onemocnění v USA a zbytku světa) dostupné od Pneumovax^R Měrek, Sharpe a Dohme, a Pnu-Immune^R, Lederle Laboratories). Účinnost těchto vakcín u dětí je sporná, protože u dětí mladších šesti let se imunologické odpovědi na různé kapsulámí antigeny rozvíjejí v různou dobu jako výsledek charakteristiky zrání imunitního systému a ochrana může mít kratší trvání než je pozorováno u dospělých (Harrison a spol., ibid). Ačkoliv relativně málo pneumokokových serotypů je přičítán takový význam pro většinu ediatrických pneumokokových infekcí (Gray a spol., 1979, J. Infect. Disease 140:979-983), tyto zahrnují typy, pro které vývoj lidské protilátkové odpovědi na čištěné kapsulámí polysacharidy použité jako vakcíny je pomalejší (Anderson a Betts, 1989, Pediatrie Infec. Dis. J. 8:S50—S53; Borgono a spol., 1978, Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 157:148-154).

Imunní odpovědi u dětí na Haemophilus Influenzae v kapsulámí polysacharidy byly dosaženy spojení kapsulámího antigenu s proteinovým nosičem za vzniku „konjugátu“ vakcíny, předpokládá se, helper efect T-lymfocytů je indukován proteinovým nosičem a je odpovědný za rozvinutí imunity (Robbins a spol., 1984 v „Bacterial Vaccines“, Germenier, vyd. Academie Press, New York, str. 289-316), viz také Cruse a Lewis, 1989 v „Conjugate Vaccines“ vyd. Cruse a Lewis, karger, Basel, str. 1-10). Podobný postup byl řízen směrem k produkci pneumokokových vakcín.

- 1 CZ 285650 B6

Různí badatelé izolovali a čistili intaktní kapsulámí polymery, které mohou být použité v nebo jako vakcíny. Např. US patent č. 4220717 popisuje postup pro izolaci a čištění imunologicky aktivního polyiybosyl-ribitol-fosfátu (PRP) z kapsulámího polymeru H-influenzae b. Dále US patent 4210641 se týká polysacharidových extraktů zH. Influenzae, majících zjevnou molekulovou hmotnost větší než 200 000 daltonů a složených hlavně z galaktózy, glukózy a mannozy a obsahujících malé množství osaminů.

Několik výzkumníků využilo těchto a jiných intaktních kapsulámích polymerů k formulacím pro dosažení lepších imunologických odpovědí. Například US patent 4196192 uvádí vakcínu, obsahující čištěný intaktní PRP a celé buňky Bordetella pertussis ve vakcínovém přípravku. Tento postup ke zvýšení imunogenicity dosáhl zvýšených hladin anti-PRP a anti-pertussis protilátek u mladých savců.

Nosičové proteiny mohou působit více než zvýšení imunogenicity konjugovaných kapsulámích polymerů. Mohou také učinit hapteny imunogenickými. Hapteny jsou definovány jako molekuly, které se mohou vázat specificky na protilátku nebo lymfocytový receptor, ale nemohou samy způsobit imunitní odpověď (tj. samy nejsou imunogenní). K vyvolání imunní odpovědi musí být malé molekuly nízké molekulové hmotnosti a slabé imunogenicity, nazývané hapteny, spojovány ve větší molekuly nebo připojovány na nosič, kterým je obvykle heterologní protein. Injekce komplexu hapten-nosič vyvolá pak zvýšení produkce protilátek B-lymfocyty, z nichž některé budou schopné vazby na volné, nespojené haptenové molekuly.

Mezi prvními hapteny, které byly studovány, byly azobarvivové sloučeniny jako je anilin nebo o-aminobenzoová kyselina. Landsteiner a Lampl (1918. Z. Immun. Forsch 26: 293) připojovali tyto sloučeniny diazolací k sérovým proteinům. Po injikaci těchto uměle připravených azeproteinů králíkům se rozvinulo srážení protilátek, které byly specifické pro připojené chemické skupiny.

Jinými příklady haptenových sloučenin jsou dinitrofenol, který se stává imunogenním připojením jako dinitrofenylová (DNP) skupina k hovězímu sérovému albuminu nebo k hovězímu gamma globulinu (BGG) a diaethylamin kyseliny lysergové. Dokonce formaldehyd se může chovat jako hapten, osoby vystavené výparům formaldehydu z produktů nebo v laboratořích se stávají citlivými na tuto sloučeninu, následující formylací jejich endogenních makromolekul in vivo.

Haptenické chování není omezeno na malé organické molekuly a polypeptidové hormony až do velikosti inzulínu jsou často slabě, pokud vůbec jsou, imunogenní. K. získání vysokých titrů protilátek k těmto hormonům je tedy nezbytné je konjugovat na nosičovou molekulu (nebo vytvořit molekuly spojováním mnoha těchto polypeptidů dohromady).

Volba nosičové molekuly je zejména zajímavá v tom, že nosič hraje více než transportní roli. Ovary a Benaceraff (1963, Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 114:723) toto prokázali injikováním DNP-BCG králíkům. Injekce množství imunogenického materiálu zvířatům vyprodukuje imunologickou „paměť“ působení. Jestliže je druhá injekce dána později, pak je zde mnohem více mohutných imunitních odpovědí. Vskutku, když Ovary a Benacefaff injikovali DNP-BCG znovu, byla zcela silná sekundární odpověď, která vedla k výrazně zvýšené hladině protilátek jak proti DNP tak BCG. Ale když byla provedena druhá injekce místo uvedené s DNP-vaječným albuminem, byla zaznamenána slabší anti-DNP protilátková odpověď. Rozdíly v odpovědi byly způsobeny tím, co nazýváme nosičový efekt a zdá se, že zahrnuje T-helper lymfocyty.

Předběžné důkazy ukazují, že všechny proteiny nemohou být stejně efektivními nosičovými proteiny pro dané hapteny. Robbins a spol., (Infect. Immun. 40:245-256) předkládá data z experimentálních vakcín protein-polysacharidových konjugátů, ve kterých stejný polysacharidový heptan byl konjugován s různými proteinovými nosiči a pak byla kvantifikována

-2CZ 285650 B6 protilátková odpověď. Významné rozdíly byly zaznamenány v množství generovaných antihaptenových protilátek, a aindikovaly významnou roli nosičů.

Pokud jde o pneumokokální vakcíny podrobněji, Lin a Lee (1982, Immunology 46:333) studovali imunní odpovědi dospělých a mladých myší, vystavených typu 6A a 19F polysacharidů jakož i 19F konjugovanému na protein. Významně vyšší IgM a IgG2 titry protilátek byly indukovány u myší, které obdržely 19F-polysacharid-protein konjugáty, než u kontrolní skupiny, která dostala 19F polysacharid samostatně.

Jiní badatelé studovali konjugáty kapsulámích polymerů s přenašečovými proteiny za účelem zvýšení protilátkové formace tak zvaným „nosičovým efektem“. Například Schneerson a spol., Joumal of Experimental Medicine 152:361-376 (1980) popisují H. influenzae b polymer-protein konjugáty, u kterých objevili, že vyvolávají imunitu k invazním chorobám vyvolaným H. influenzae b. Odkazy, dokumentující imunologické chování kapsulámích polymerů vztažené na věk dětí a snaží se překonat tuto závislost na věku konjugací intaktních kapsulámích polymerů s různými proteiny, včetně sérového albuminu, Limulus polyphemus hemocyaninu a difterického toxinu. Metoda konjugace zahrnuje použití spojovacího činidla jako je adipický dihydrazid.

Geyer a spol., Med. Microbiol. Immunol. 165:171-288 (1979), připravili konjugáty určitých fragmentů kapsulámích polysacharidů Klebsiella pneumoniae s nitrofenyl-ethylaminovým linkerem redukční aminací a derivatizovaný cukr byl pak připojen k proteinům za použití azokopulace.

US patent 4057685 Mclntirea z 9. května 1974 se týká Escherichia coli liopolysacharidů se sníženou toxicitou kovalentně navázaných na proteinový antigen reakcí s halogenacylhalogenidem.

US patent 4356170 Jenningse a spol., ze 27. května 1981, zvěř. 26. října 1982 se týká příprava polysacharidproteinových konjugátů redukční aminací.

Andersen (1983, Infection and Immunity 39:233-238) se týká konjugátů mezi oligosacharidy z kapsulámího polysacharidů Haemophilus Influenzae typ b a CRM197, netoxickou ale antigenně identickou variantou difterického toxinu.

Snippe a spol. (1983, Infection and Immunity 42:842-844) se týká semisyntetické vakcíny pro Streptococcus pneumoniae typ 3, ve které hexasacharid izolovaný z částečného kyselého hydrolyzátu kapsulámího polysacharidů S3 byl navázán ke stearylaminu redukčního aminací a pak inkorporován do liposomů. U výsledné vakcíny konjugát /liposom bylo pozorováno, že indukuje ochranu pro S. pneumoniae typ 3 u myší.

US patent 4663160 Tsaye a spol., podaný 14. března 1983, udělený 5. května 1987, se týká bakterie, ve které je detoxifikovaný polysacharid z gram-negativní bakterie kovalentně navázán k detoxifikovanému proteinu ze stejného druhu gram-negativní bakterie spojením uhlíku 4-12.

US patent 4619828 Gordona, podaný 5. ledna 1984, udělený 28. října 1986 se týká konjugátů mezi polysacharidovými molekulami z patogenních bakterií jako je Haemophilus influenzae B, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis a Escherichia coli a antigenů závislých na T buňkách jako jsou difterické a tetanové toxoidy.

US patent 480870 Andersona a Clementse, podaný 10. srpna 1984, udělený 28. února 1989 a US patent 4761283 Andersona, podaný 28. března 1986, udělený 2. srpna 1988, se týká kovalentního spojení fragmentů kapsulámích polymerů k bakteriálním toxinům, toxoinům nebo vazebným podjednotkám pomocí redukční aminace.

-3CZ 285650 B6

US patent č. 4711779 Porroa a spol., podaný 2. července 1986, udělený 8. prosince 1987, se týká vakcín glykoproteinových konjugátů, majících trivalentní imunogenickou aktivitu a zahrnujících antigenní determinanty zkapsulámích polysacharidů gram-pozitivních bakterií a gram-negativních bakterií jakož i buď CRMi₉₇, tetanický toxoid, nebo pertusis toxin.

Příprava konjugátových vakcín, ve kterých hapteny kapsulámích polysacharidů jsou připojeny k nosičovým proteinům, zahrnuje následující postupy:

i) musí být připraven kapsulámí polysacharid, ii) jestliže má být použit fragment polysacharidů, musí být separován z intaktního polysacharidů iii) sacharid musí být aktivován nebo učiněn být schopným konjugace, tj. musí být generovány skupiny schopné kovalentní vazby k proteinu iv) sacharid je konjugován k proteinu.

Různé metody známé v oboru pro provedení těchto čtyř kroků jsou uvedeny v tabulce I.

Tabulka 1

Odkaz

US patent 4356170,

Jennings, pod. 27. 5. 1981, uděl. 25. 10. 1982

US patent 4663160, Tsay a spol., pod. 14. 3. 1983, uděl. 5. 5. 1987 příprava polysacharidů štčpení polysacharidů aktivace polysacharidů konjugace k proteinu využívá kyselinu redukční aminace jodistou ke generování využívající aldehydových skupin kyanoborohydrid využívá kyselinu jodistou ke generování aldehydových skupin

US patent 4619828, Gordon, pod. 5. 1.1984, uděl. 28.10.1986 polysacharidy upraveny tepelným zpracováním na molekulovou velikost mezi 200000 a 2000000 daltony ♦bromkyan

US patent 4808700, 4808700, Anderson a Clements, pod.

10. 8. 1984, uděl.

28. 2. 1989 sekce 6.5 výše, nazvaná „Conjugation Of Capsular Polymer Fragment of Streptococcus Pneumoniae to CRM197“

Danish typ 6A, Eli Lilly Co.

Byly použity různé metody pro přípravu antigenních fragmentů s alespoň jedním redukovaným koncem, např. limitní oxidační Štěpení jodistanem, hydrolýza glykosidázou nebo kyselá hydrolýza kyselá hydrolýza v 0,lM HC1 po 10 minut při 100 °C pro vznik redukčních fragmentů

i) 4-12 uhlíkové skupiny připojeny k proteinu za přítomnosti kondenzačního činidla, např. karbodiimidu ii) polysacharid připojen k derivatizovanému proteinu 4-12 uhlíkovými skupinami reakci Schiffovy báze za přítomnosti redukčního činidla, např. kyanoborohydridu * konjugován spacer můstkem 4 až 8 atomů uhlíku jako existuje v derivátu hydrazidu adipové kyseliny v proteinu konjugace redukčních aminací za přítomnosti kyanoborohydridu (přibližně 2 až 3 týdny) konjugováno k CRM197 ve fosfátovém pufru za použití kyanoborohydridu sodného po 18 dní při 37 °C

-4CZ 285650 B6

Tabulka 1 - pokračování

Odkaz příprava polysacharidu štěpení polysacharidu aktivace polysacharidu konjugace k proteinu

US patent 4711779, Porro a

Constantino, pod.

2.7.1986, uděl. 8.12.1987 kyselá hydrolýza při

100 °C po 6-40 hodin.

Hapteny o mol. hmotn.

1000 až 2000 daltonů.

pro Stremtococcus pneumoniae typ 6A kyselá hydrolýza při

100 °Cpo39 hodin aktivováno zavedením primárních aminoskupin do terminálních redukčních skupin (např. použitím kyanoborohydridu sodného) a následující konverzí na estery (např. za přítomnosti derivátů kyseliny adipové) aktivováno v amoniakálním pufru za přítomnosti kyanoborohydridu sodného (pro zavedeni primárních aminoskupin) po dva týdny; převedeno na odpovídající monofunkční estery ve vodném roztoku dimethylsulfoxidu, obsahujícím disukcinimidylester adipové kyseliny po 4 hodiny konjugováno k toxoidu za přítomnosti organického rozpouštědla, např. dimethylsulfoxidu konjugováno k CRM197 za přítomnosti dimethylsulfoxidu při teplotě místnosti po 15 hodin

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká způsobu přípravy kovalentního konjugátu oligosacharidu a nosičového proteinu, který zahrnuje následující stupně:

i) reduktivní aminaci oligosacharidu, majícího terminální redukující se skupinu s diaminoethanem za přítomnosti pyridinboranu, při teplotě 100 °C, ii) reakci aminovaného oligosacharidového produktu z odstavce

i) s molekulou, obsahující dvě funkční skupiny, z nichž jedna je schopna reakce s terminální skupinou aktivovaného oligosacharidu a druhá je schopna reakce s uvedeným nosičovým proteinem a iii) konjugaci aktivovaného oligosacharidového produktu z odstavce ii) s uvedeným nosičovým proteinem.

Ve výhodném provedení molekulou, obsahující dvě funkční skupiny ze stupně ii) je diester. Výhodněji molekula, obsahující dvě funkční skupiny ze skupiny ii) je diester adipové kyseliny nebo diester jantarové kyseliny.

Ve výhodném provedení oligosacharid je odvozen ze Streptococcus pneumoniae kapsulámího polysacharidu. Výhodněji oligosacharid je odvozen od Streptococcus pneumoniae, selektivního serotypu vybraného ze skupiny, zahrnující typy 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20,22F a 33F.

-5CZ 285650 B6

Ještě výhodněji oligosacharid je odvozen od kapsulámího polysacharidu z bakterií vybraných ze skupiny, zahrnující Haemophilus influenzae, Neisseria meningitis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Escherichia coli, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae a Staphylococcus aureus.

Nosičovým proteinem je výhodně CRM197. Výhodněji nosičový protein je vybrán ze skupiny, zahrnující Salmonella flagelin, Haemophilus pillin, Haemophilus 15 kDa, 28 až 30 kDa nebo 40 kDa membránový protein, Escherichia coli tepelně labilní enterotoxin LTB, difterický toxin, tetanový toxin, cholerový toxin, protein rotaviru VP7 a protein respiračního syncytiálního viru F nebo G.

Detailní popis vynálezu

Předložený vynález se týká kovalentního připojení oligosacharidů odvozených od bakteriálních kapsulámích polysacharidu k proteinovým nosičům; způsob podle vynálezu generuje nové glykokonjugáty novými způsoby.

Při zřejmost a bez jakéhokoliv omezení, je detailní popis vynálezu rozdělen na následující sekce:

i) příprava oligosacharidů ii) aktivace oligosacharidů iii) konjugace oligosacharidů k proteinu iv) imunochemická charakterizace glykokonjugátů

v) vakcínový přípravek a podání vi) využití vakcín konjugátů pneumokokálních oligosacharidů.

Příprava oligosacharidů

Kapsulámí polysacharidy vysoké molekulové hmotnosti mohou být obchodně dostupné (Američan Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD)), nebo získány metodami popsanými Perroem a spol., 1983, J. Biol. Stand. 11:65—71. Mohou být použity jakékoliv polysacharidy zahrnující, ale neomezující se na ně, ty, které byly nalezeny v pouzdrech Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa.

Antigenní fragmenty s nejméně jedním redukujícím koncem mohou být získány z kapsulámích polymerů různými metodami, závisejícími na strukturních vlastnostech jednotlivých kapsulámích polymerů. Limitní oxidační štěpení jodistanem (nebo podobnými činidly) oddělí aldehydové konce; dojde tak k omezení na polymery, mající vicinální dihydroxyskupiny na necyklických zbytcích. Hydrolýza glykosidických vazeb poskytne redukovaný cukerný konec. Taková hydrolýza může být nejspecifičtěji provedena enzymatickou cestou glykosidázami, ale toto použití je omezeno na relativně malý počet kapsulámích polymerů, např. Streptococcus pneumoniae 8, pro které jsou glykosidázy známé. Kyselá hydrolýza je běžně používána pro hydrolýzu glykosidických vazeb. Užití tohoto postupu je omezeno, jestliže polymer obsahuje vůči kyselině citlivé neglykosodické vazby nebo když polymer obsahuje na kyselinu citlivé můstkové vazby důležité pro antigenní specifitu.

-6CZ 285650 B6

Ve specifických provedeních podle vynálezu S. pneumoniae typ 6A kapsulámí polysacharid může být hydrolyzován v přibližně ΙΟ'² M octové kyselině při 100 °C po asi 30 hodin; kapsulámí polysacharid S. pneumoniae typ 14 může být hydrolyzován v přibližně 0,5 M kyselině trifluoroctové při asi 70 °C po asi 7 hodin; polysacharid S. pneumoniae typ 19F může být hydrolyzován v přibližně 10‘² M kyselině octové při asi 50 °C po dobu asi 48 hodin; a polysacharid S. pneumoniae typ 23F může být hydrolyzován v přibližně 0,25 M kyselině trifluoroctové při asi 70 °C po asi 3 hodiny.

Podle předloženého vynálezu, oligosacharidy, které jsou konjugovány k proteinu, výhodně obsahují mezi třemi a šesti opakujícími se jednotkami (nebo mezi asi deseti a třiceti monosacharidovými zbytky) a nejvýhodněji obsahuje mezi třemi a čtyřmi opakujícími se jednotkami (nebo asi patnáct monosacharidových zbytků) jako oligosacharidy této délky inkorporované do glykokonjugátů, se projevily jako optimálně imunogenické.

Oligosacharidy mohou být aktivovány způsobem redukční aminace s následující reakcí s bifunkční molekulou jako je diester, aniž by byl považován za omezení. Znázornění metody podle vynálezu je uvedeno na obr. 1 a v tabulce II, která porovnává metodu popsanou Porroem a spol., 1985, Mol. Immunol. 22:907-919. Doba pro aktivaci za použití předchozího postupu byla 7 až 14 dnů, podle předloženého vynálezu byla zkrácena na 15 minut. Doba pro redukci podle předchozího postupu byla 7 až 14 dnů, podle předloženého vynálezu byla zkrácena na 48 hodin. Předložený vynález tedy vyžaduje o 12 až 26 dnů méně pro kompletní průběh než proces předcházející. Toto je důležitá výhoda, protože vystavení karbohydrátů zvýšené teplotě jako je 50 °C, může vést k degradaci.

Tabulka II

Chemická aktivace koncové redukční jednotky S. pneumoniae oligosacharidů

Parametry dřívější postup navrhovaný postup zaváděná skupina činidlo (pH) teplota aktivace doba aktivace redukční činidlo teplota redukce doba redukce výsledný produkt aktivační bifunkční spacer teplota reakce reakční doba výsledný produkt účinnost reakce

NH₂ amoniakální pufr °C až 14 dnů

Na kyanoborohydrid °C až 14 dnů oligo-NH₂

SIDEA (sukcinimidyldiester adipové kyseliny) °C hodiny oligo-NH-monoester až 30 %

NH(CH₂)NH₂ diaminoethan (9)

100 °C minut pyridinboran °C hodin oligo-NH(CH₂)2NH₂ SIDES nebo SIDEA (sukcinimidyl diester jantarové nebo adipové kyseliny) °C hodiny oligo-NHíCH^NH-monoester 70%

Podle metody podle vynálezu je redukční aminace koncové redukční skupiny oligosacharidů provedena za použití molekuly, obsahující dvě aminoskupiny. Ve výhodném provedení vynálezu je redukční aminace provedena reakcí daného molámího množství oligosacharidů s diaminoethanovým roztokem v 10X molámím přebytku v 0,2M KH₂PC>4 při pH asi 9 a při teplotě 25 až 100 °C a výhodně 100 °C po dobu mezi asi 1 až 60 minutami a výhodně asi 15 minut. Poté může být přidáno molámí množství pyridinboranu ekvivalentní 25násobku molámí koncentrace oligosacharidu v použitém postupu a reakce se provede při teplotě 25 až 100 °C, výhodně při 50 °C po dobu 1 až 72 hodin, výhodně přibližně 48 hodin.

Výsledný produkt redukční aminace může pak reagovat s bifunkční molekulovou, kde každá 5 funkční skupina je schopná reakce jak s koncovou aminoskupinou aktivovaného oligosacharidu tak i s aminoskupinou přítomnou ve struktuře proteinového nosiče. Tato bifunkční molekula může tak posloužit ke vzájemnému spojení oligosacharidů a proteinového nosiče. Ve výhodném provedení vynálezu je touto bifunkční skupinou diester, přesněji diester kyseliny adipové, u kterého bylo prokázáno spojení s účinnější glykosylací proteinu. Výhodně se ve specifickém 10 provedení vynálezu oligosacharid, podrobený redukční aminaci jak je popsána výše, dále podrobí reakci se sukcinimidyldiesterem kyseliny jantarové nebo výhodněji adipové. Tato reakce může být nejlépe provedena s aminovaným oligosacharidem v molámí koncentraci (jako aminoskupin) ekvivalentní asi 1 až 5 násobku molámí koncentrace SIDEA (nebo SIDES) v roztoku dimethylsulfoxidu (DMSO) při teplotě 0 až 25 °C a výhodně si 4 °C po dobu 0,5 až 5 hodin, 15 nejlépe asi 2 hodiny. Aktivovaný oligosacharid může být pak oddělen srážením za použití 1,4dioxanu (80 % obj./obj.), který také oddělí v supematantu přebytek SIDEA (nebo SIDES).

Proteiny, které mohou být použity podle vynálezu, zahrnují protein, jehož podání mladým savcům je bez rizika, a který může posloužit jako imunologicky účinný proteinový nosič. 20 V provedení podle vynálezu mohou být použity proteiny buněčného povrchu, membránové proteiny, toxiny a toxoidy. Kriteria pro bezpečnost budou zahrnovat absenci primární toxicity a minimální riziko alergické reakce. Difterické a tetanické toxoidy plně splňují tato kriteria; tyto jsou po vhodné přípravě netoxické a výskyt alergických reakcí je přijatelně nízký. Ačkoliv riziko alergické reakce může být určující pro dospělé, je minimální pro děti. V souladu s dalším 25 výhodným provedením vynálezu, vhodné proteinové nosiče zahrnují, ale nejsou na ně omezeny

Salmonella flagelin, Hemophilis pilin, Hemophilus 15 kDa, 28-30 kDa a 40 kDa membránové proteiny, tepelně labilní enterotoxin LTB Escherichia coli, cholera toxin a virové proteiny, zahrnující proteiny rotaviru VP7 a respirační synciální virus F a G.

V „nosičovém efektu“ se stává slabý antigen navázáním na silnější antigen jako nosič (tj. na heterologní protein) více imunogenickým, než když byl přítomen sám. Jestliže zvíře bylo dříve imunizováno samotným nosičem, může tím být předběžně upraveno tak, že produkuje zvýšenou imunitní odpověď nejen na nosičový antigen, ale také na navázanou haptenovou skupinu. Děti jsou pravidelně imunizovány tetanickými a difterickými toxoidy. Tak mohou být vybaveny pro 35 příští přítomnost kapsulámích antigenů konjugovaných s jedním z těchto toxoidů.

Obecně, každý heterologní protein může posloužit jako nosičový antigen. Nicméně jisté bakteriální toxiny jako tetanický a difterický, mohou mít navíc výhodu v tom, že jsou složeny ze dvou částí, z nichž jedna (vazebná podjednotka) má vysokou afinitu pro navázání na buněčné 40 povrchy buněk savců. Pochopitelně, konjugace na takový „vazebný protein“ může dovolit navázanému antigenů efektivnější iniciaci odpovědi v buňkách imunitního systému.

Proteinovými nosiči, na které jsou konjugovány kapsulámí polymery, mohou být přirozené toxiny nebo detoxifikované toxiny (toxoidy). Tak mohou být relativně novými mutačními 45 technikami produkovány geneticky změněné proteiny, které jsou antigenně podobné toxinům již netoxickým. Tyto jsou nazývány „křížově reaktivní materiály“ (cross reacting materials) nebo CRM. CRM197 je však bezcenný, neboť má jedinou změnu aminokyseliny vzhledem k nativnímu difterickému toxinu a imunologicky se od něj neliší.

Konjugace kapsulámích polymerů s přírodními toxiny může redukovat toxicitu, ale významná toxicita může být zachována. Tak další detoxifikace proteinových toxinů používá formalín (formaldehyd), který reaguje s volnou aminoskupinou proteinu. Reziduální toxicita může stále být zachována. Mimoto je možno spontánní detoxifikace jednotlivého podílu vakcíny a zachovává se výsledek spojený s tímto postupem.

-8CZ 285650 B6

Alternativně může být přírodní toxin detoxifikován formalinem za vzniku konvenčního toxoidu před konjugací s kapsulámími polymery. Nicméně prvotní zpracování formalinem redukuje počet volných aminoskupin vhodných pro reakci s redukujícími skupinami fragmentu kapsulámího polymeru. CRM tak mají významné výhody v tom, že nemají žádnou toxicitu dosud žádná z jejich aminoskupin není obsazena formalinem. Další výhodou je, že při práci s CRM neexistuje žádné bionebezpečí.

V případě CRM197, který je imunologicky identický s nativním toxinem, zpracování s formalinem (ačkoliv zde není nutná detoxifikace) značně zvyšuje imunologickou odpověď. Je zde domněnka, že je to způsobeno stabilizací molekuly proti degradaci mechanismem látky a/nebo agregace křížové vazby (imunogenicita částic se zvyšuje s velikostí).

Ze všech výše uvedených důvodů jsou tetanické a difterické toxiny prvními kandidáty pro proteinové nosiče, ještě jsou zde další, které mohou být vhodné. Ačkoliv tyto další nemusí mít průběh bezpečnosti objevený pro difterii a tetanus, mohou zde být jiné nepřekonatelné důvody kjejich použití. Například mohou být efektivnější jako nosiče, nebo může být rozhodující ekonomika produkce. Další kandidáti pro nosiče zahrnují toxiny pseudomonas, staphylococcus, streptococcus, pertussis a Escherichia coli.

Ve specifickém provedení vynálezu mohou být aktivované oligosacharidy připojeny k CRM197 proteinu, který byl čištěn následovně:

CRM197, produkovaný kmenem Corynebacterium diphteriae, může být oddělen z kultivačního média průchodem bakteriální kultury membránou Millipore, vysrážením proteinu z filtrátu a čištěním CRM197 iontovýměnnou chromatografií, jak je popsáno výše. Alternativně, v podstatě čistý CRM197 může být získán metodou známou v oboru.

Aktivované oligosacharidy mohou být kovalentně navázány na nosičový protein za přítomnosti organického rozpouštědla a popřípadě dalšího činidla (jako je kondenzační činidlo) za účelem podpory spojení terminálních funkčních skupin aktivovaného oligosacharidu k proteinu. Ve specifickém, výhodném provedení podle vynálezu, aktivovaný oligosacharid nesoucí terminální esterovou skupinu může být kovalentně navázán na volné aminoskupiny, které jsou přítomny na proteinovém nosiči následovně:

Aktivovaný oligosacharid může být rozpuštěn v dimethylsulfoxidu a pak přidán do vodného roztoku proteinového nosiče (například, ale bez omezení, do CRM197 v koncentraci asi 2 mg/ml) tak, že molámí poměr monoester-aktivovaný oligosachard/celkové aminoskupiny v proteinovém nosiči je asi 1:2 a konečná koncentrace DMSO je asi 50% obj./obj. Konjugační reakce se provádí při 4 °C a ačkoliv je reakce téměř kompletní za asi 2 hodiny, je vhodné nechat reakci probíhat přes noc za účelem zvýšení výtěžku reakce na nejvyšší hodnoty pro každý typ specifického glykokonjugátu. Takto získaný glykokonjugát se pak čistí gelovou chromatografií.

Pro syntézu monovalentní vakcíny může být k proteinu konjugován oligosacharid získaný z jednoho serotypu bakterie. Pro syntézu multivalentních vakcín, mohou být glykokonjugáty získané připojením směsi oligosacharidů, získaných s bakterií různých druhů nebo rozdílných serotypů, k proteinovému nosiči. Alternativně, glykokonjugáty získané reakcí jednoho typu oligosacharidů s proteinovým nosičem v separátních reakcích za použití různých oligosacharidů, mohou být smíseny. Multivalentní vakcíny může obsahovat proteinový nosič, nesoucí homogenní nebo heterologní populaci připojených oligosacharidů.

Ověření imunogenicity glykokonjugátů produkovaných výše uvedenou metodou může být testováno na vhodném zvířecím systému dříve, než budou podány lidem. Mezi tato zvířata patří (bez omezení na ně) králíci, prasata, morčata, myši, krysy nebo kozy. Ve specifickém provedení

-9CZ 285650 B6 vynálezu mohou být králíci (přibližně 2 kg) podkožně naočkováni glykoproteinovými konjugáty za nebo bez přítomnosti aluminiumfosfátu nebo hydroxidu. Přibližně 2,5 pg oligosacharidů vytvoří dávku pro 2 kg králíka. Titr protilátek pak může být hodnocen testem ELISA nebo jinou metodou v oboru známou. Protože protilátky, vytvářené ke glykokonjugátům podle vynálezu mohou být neschopné imunoprecipitace antigenu, nejsou doporučovány pro zjištění titrů protilátkové zkoušky, závislé na imunoprecipitaci.

Vhodným nosným médiem pro formulaci vakcín jsou salinický roztok pufrovaný fosforečnanem sodným (pH 7,4) nebo 0,125M gel fosfátu hlinitého suspendovaný v roztoku chloridu sodného pufrovaného fosforečnanem sodným na pH 6 a jiná běžné média.

Obecně, vakcíny, obsahující od asi 5 do asi 100 pg, výhodně asi 10 až 50 pg oligosacharidů, jsou vhodné pro zvýšení účinné hladiny protilátek proti kapsulámím polymerům u mladých teplokrevných savců. Pochopitelně, přesná dávka bude určena rutinními experimenty dávka/odpověď. Koncentrace glykoproteinových konjugátů pro přípravu vakcín pro děti je zahrnuta v rozmezí 25 až 200 pg oligosacharidů. Větší dávky mohou být podávány na základě tělesné hmotnosti. U několika menších dávek podávaných postupně se očekávají vyšší účinky než u stejného množství konjugátu podaného v jedné injekci.

Vakcíny podle vynálezu mohou být podávány teplokrevným savcům jakéhokoliv věku a jsou zejména přizpůsobeny k indukci aktivní imunizace proti systémovým infekcím u mladých savců, vyvolaný patogeny Haemophilus influenzae typ b, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis a Pseudomonas auruginosa.

Podle vynálezu mohou být vakcíny podávány subkutánně, intravenozně, intramuskulámě, intraperitoneálně, orálně, nebo intranasálně. Vakcíny mohou obsahovat glykokonjugát v rozpuštěné nebo mikropartikulámí formě nebo inkorporovaný do mikrokuličen nebo mikrovesikul, včetně liposomů.

Ve výhodných provedeních podle vynálezu jsou glykokonjugátové vakcíny namířené proti opouzdřeným patogenním bakteriím použity pro ochranu citlivých jedinců před rozvinutím infekcí, způsobených těmito agens. Mezi citlivé jedince jsou zařazeny děti s nezralým imunitním systémem, aspleničtí jedinci jakož i další jedinci s oslabeným imunitním systémem nebo chronickou chorobou, zejména syndromem získané imunodeficience (AIDS), hematopoetickou malignitou, diabetem, chronickými srdečními chorobami, chronickými plicními chorobami a srpkovitou anemií. Glykokonjugáty podle vynálezu, podle síly jejich konjugace na proteinový nosič, zvyšují imunogenicitu oligosacharidů, které nesou.

Tak mohou být glykokonjugáty podle vynálezu použity v očkování k získání ochrany proti infekci kteroukoliv z bakterií, která vlastní polysacharidové pouzdro, zahrnující Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus Pseudomonas aerogenusa. Kmeny S. pneumoniae zvláště virulentní u dětí, specifické pro tento vynález zahrnují typy 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 20F, 23a33F.

Vakcíny podle vynálezu mohou být použity k indukci monospecifické a homogenní imunitní odpovědi. Monospecifická imunitní odpověď je spojena s množstvím výhod, zahrnující v to poskytnutí protilátek s

i) homogenní specifitou, ve které vlastně všechny protilátky jsou namířeny proti specifickému epitopu a jsou charakterizovány stejnou afinitou konstantní hodnoty,

-10CZ 285650 B6 ii) vysokou afinitou konstantní hodnoty s vyšší antibakteriální aktivitou, iii) zvýšenou cílovou specifitou a absencí křížové reaktivity s hostitele s týkajícími antigeny a iv) sníženou aktivací komplementu způsobenou snížením srážecí aktivity monospecifických protilátek, takto vedoucí k bezpečné vakcíně.

Dále může být předložený vynález použit k produkci vakcín, které rozpoznávají peptidy nebo lipooligosacharidy nebo jiné povrchové oligosacharidové hapteny navázané, metodami podle vynálezu, na proteinový nosič. Takové vakcíny mohou být například použity k indukci imunity k nádorovým buňkám, nebo v produkci protinádorových protilátek konjugovaných na chemoterapeutické nebo bioaktivní činidlo. Anti-nádorová aktivita může být vyvolána navázáním nádor-specifického antigenu, nebo jeho epitopu, na proteinový nosič použitím metod podle vynálezu.

Zkratky a definice:

CRM197 netoxický protein antigenně křížově reaktivní s difterickým toxinem

DMSO dimethylsulfoxid

DP stupeň polymerace

MIC minimální inhibiční koncentrace

SD stupeň substituce

SIDEA sukcinimidyldiester kyseliny adipové

SIDES sukcinimidyldiester kyseliny jantarové

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 Obecná strategie syntézy konjugátů oligosacharidprotein

A. Polysacharidy o vysoké molekulové hmotnosti se kysele hydro lyžují za vzniku oligosacharidů o průměrné molekulové hmotnosti 2,5 x 10³.

B. Oligosacharidy jsou (1) aktivovány reakcí s diaminoethanem (H₂N(CH₂)₂NH₂) při pH = 9, redukovány pyridinborohydridem (PyBH₂), pak (2) reagují se sukcinimidyldiesterem adipové kyseliny (SIDEA) v dimethylsulfoxidu (DMSO).

C. Aktivované oligosacharidy jsou připojeny k proteinovému nosiči přes lysinové zbytky.

Obr. 2 Použití „na míru šitého“ spaceru ve spojovacím postupu

A. Glykokonjugát připravený dřívějším způsobem jak je popsáno Porroem a spol., (1985), Mol. Immunol. 22:907-919, s amidovým spojením (šipka) mezi oligosacharidem a linkerem čtyř atomů kyseliny adipové. Celková délka spaceru je přibližně 1,04 nm.

B. Glykokonjugát vytvořený podle předloženého vynálezu, ve kterém dva uhlíkové zbytky (šipka, formované diaminoethanem) a amidová vazba, existují mezi oligosacharidem a linkery dvou atomů kyseliny jantarové, vytvořenými reakcí se SIDES. Celková délka spaceru je přibližně 10 nm.

C. Glykokonjugát vytvořený podle předloženého vynálezu, ve kterém dva uhlíkové zbytky (šipka, vytvořené diaminoethanem) a amidová vazba, existují mezi oligosacharidem a

-11CZ 285650 B6 čtyřuhlíkatým zbytkem adipové kyseliny, vytvořeným reakcí se SIDEA. Celková délka spaceru je přibližně 14,5 nm.

Obr. 3. Schopnost konjugace CRM197 k aktivovaným oligosacharidům, obsahujícím spacery adipová kyselina versus jantarová kyselina. Elektroforéza produktů konjugačních reakcí na SDS— polyakrylamidovém gelu (vybarveno stříbrem).

A. Dráha 1 - standardy molekulové hmotnosti (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K).

Dráha 2: CRM197 (1 pg) referenční.

Dráha 3: Konjugovaný oligosacharid 6A-CRM197 s kyselinou jantarovou jako spacerem (2 pg) (poměr 1:1 monoester/celkové aminoskupiny CRM|₉₇ v 50% DMSO).

Dráha 4: Konjugovaný oligosacharid 6A-CRM197 s kyselinou jantarovou jako spacerem (2 pg) (poměr 1:2 monoester/celkové aminoskupiny CRM197 v 50% DMSO).

Dráha 5: Konjugovaný oligosacharid 6A-CRM197 s kyselinou adipovou jako spacer (2 pg) (poměr 1:2 monoester/celkové aminoskupiny 6A-CRM197 v 50% DMSO).

Dráha 6: konjugovaný oligosacharid 14-CRMi9₇ s kyselinou jantarovou jako spacerem (2 pg) (poměr 1:4 monoester/celkové aminoskupiny CRM197 v 50% DMSO).

Dráha 7: konjugovaný oligosacharid 19F-CRM197 s kyselinou jantarovou jako spacerem (2 pg) (poměr 1:4 monoester/celkové aminoskupiny CRM197 za nepřítomnosti 50% DMSO).

Dráha 8: Konjugovaný oligosacharid 23F-CRM197 s kyselinou jantarovou jako spacerem (2 pg) (poměr: 1:2 monoester/celkové aminoskupiny CRM197 v 50% DMSO).

Dráha 9: CRM_I97(1 pg) referenční.

B. Dráha 1: CRM197 (1 pg) referenční.

Dráha 2: CRM₁₉₇ referenční (1 pg, rozdílný od dráhy 1)

Dráha 3: konjugovaný oligosacharid 23F-CRM197 s kyselinou adipovou jako spacerem (2 pg) (poměr: 1:2 monoester/celkové aminoskupiny CRM197 v 50% DMSO).

Dráha 4: Standardy mol. hmotnosti (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K).

Dráha 5: Konjugovaný oligosacharid 23F-CRMi₉7 s kyselinou adipovou jako spacerem (2 pg) (poměr: 1:2 monoester/celkové aminoskupiny CRM:M₁₉₇ v 50% DMSO).

Dráha 6: CRM197 (1 pg) referenční

CRM197 referenční (1 pg, rozdílný od srovnávací dráhy 1)

Dráha 7: Konjugovaný oligosacharid 6A-CRM197 s kyselinou adipovou jako spacerem (2 pg).

C. Dráha 1: Standardy molekulové hmotnosti (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K)

Dráha 2: CRM197 (1 pg) referenční.

-12CZ 285650 B6

Dráha 3: konjugovaný oligosacharid 6A-CRM197 s kyselinou adipovou jako spacerem (2 pg)

Dráha 4: konjugovaný oligosacharid 14-CRMi₉₇ s kyselinou adipovou jako spacerem (2 pg)

Dráha 5: Konjugovaný oligosacharid 19F-CRM]9₇ s kyselinou adipovou jako spacerem (2 pg)

Dráha 6: Konjugovaný oligosacharid 23F-CRM197 s kyselinou adipovou jako spacerem (2 pg)

Dráha 7: Markéry molekulové hmotnosti (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K)

Obr. 4 Králičí IgG odpověď na konjugáty S. pneumoniae oligosacharid 6A-CRM197. Inhibiční ELISA analýza hodnoty afinity IgG isotypu indukované kapsulámími polysacharidy.

A. Typ 6A kapsulámího polysacharidu

B. Typ 6A oligosacharidů (DP = 10) ve volné formě nebo konjugovaný k CRM197

C. Typ 14 oligosacharidů (DP = 12) aktivovaný molekulovým spacerem nebo konjugovaný k CRM197.

Příklad provedení vynálezu

Vývoj multivalentní vakcíny pneumokokálních oligosacharidových konjugátů

1. Příprava polysacharidu

Kapsulámí polysacharid S. pneumoniae typ 6A, kapsulámí polysacharid S. pneumoniae typ 14, kapsulámí polysacharid S. pneumoniae typ 19F a kapsulámí polysacharid S. pneumoniae typ 23F byly získány z Američan Type Culture Collection.

2. Hydrolýza polysacharidu

21. Hydrolýza polysacharidu S. pneumoniae typ 6A

Dva miligramy kapsulámího polysacharidu typu 6A S. pneumoniae byly rozpuštěny v 1 ml vodného roztoku, obsahujícího lOmM kyseliny octové o pH = 3,4, pak hydrolyzovány v zatavených ampulích ponořených do olejové lázně při teplotě 100 °C po dobu 30 hodin. Výsledné oligosacharidy byly pak odděleny z reakční směsi chromatografií přes Sephadex G15 (Pharmacie, Uppsala) kondiciovaný 15 mM roztokem NaCl při 7,0 a 4 °C.

Chromatografické eluenty pak byly analyzovány postupem podle Kabata (1964 v „Experimental Immunochemistry“, vyd. E. A. Rabat a Mayer, str. 538-541), Chen a spol. (1956, Anal. Chem. 28:1756-1759) a Porro a spol. (1981, Anal. Biochem. 118: 301-306) pro zjištění přítomnosti methyl-pentóz, fosforu a redukujících skupin, např. aldehydových skupin. Anazou byl zjištěn poměr methylpentoza/aldehyd 3,96, methylpentoza/fosfor 0,96 a fosfor aldehyd 4,12.

Gelová chromatografie na Sephadexu G-50 Superfine (Pharmacia) za použití pufru potvrdila distribuční konstantu (Kd) 0,538 (hexozou), odpovídající molekulové hmotnosti přibližně 2,500. NMR, plynová chromatografie a stechiometrická analýza indikují, že oligosacharidy obsahují asi 3 až 4 základní opakující se jednotky, mezi kterými byla nalezena galaktóza, která je imunodominantním cukrem.

-13CZ 285650 B6

2.2. Hydrolýza polysacharidů S. pneumoniae typ 14

Dva miligramy kapsulámího polysacharidů typu 14S. pneumoniae byly rozpuštěny v 1 ml vodného roztoku, obsahujícího 0,5 M trifluoroctové kyseliny, pak byly hydrolyzovány v zatavených ampulích ponořených do olejové lázně při teplotě 70 °C po sedm hodin. Výsledné oligosacharidy pak byly odděleny z reakční směsi chromatografíí na Sephadexu G15 (Pharmacie, Uppsala), kondiciovaném 15 mM roztokem NaCl při pH 7,0 při 4 °C.

Chromatografícké eluenty pak byly analyzovány na obsah hexosaminu a aldehydu a bylo zjištěno, že poměr hexosmaminu k aldehydu je 3,17. Plynová chromatografie a stechiometrická analýza indikují molekulovou velikost odpovídající třem až čtyřem základním opakujícím se jednotkám. Odstranění větvení galaktózy podle plynové chromatografie bylo pod 10%. Gelová chromatografie na Sephadexu G-50 Superfíne (Pharmacia) za použití 15 mM NaCl při pH 7,0 zjistila pro oligosacharidy, distribuční konstantu (Kd) 0,30 definovanou jako celková hexoza.

2.3 Hydrolýza polysacharidů S. pneumoniae typ 19F

Dva miligramy kapsulámího polysacharidů typu 19F S. pneumoniae byly rozpuštěny v 1 ml vodného roztoku, obsahujícího kyselinu octovou (10 mM), pH = 3,4, pak byly hydrolyzovány v zatavených ampulích ponořených do olejové lázně při teplotě 50 °C po dobu třicetdevět hodin. Výsledné oligosacharidy pak byly odděleny z reakční směsi chromatografíí na Sephadexu G-15 (Pharmacia, Uppsala), kondiciovaném 15 mM roztokem NaCl při pH 7,0 při 4 °C.

Chromatografícké eluenty pak byly analyzovány postupy podle Kabeta (1964, v „Esperimental Immunochemistry“, vyd E.A. Rabat a Mayer, str. 538-541), Chen a spol. (1956, Anal. Chem. 28:1756—1758) a Porroa spol. (1981), Anal. Biochem. 118:301-306) pro zjištění přítomnosti methyl-pentoz, fosforu a redukujících skupin, např. aldehydových skupin. Analýza zjistila poměr methyl-pentoza/redukovaná methylpentoza 3,5 a poměr methyl-pentoza/fosfor 3,2.

Gelová chromatografie na Sephadexu G-50 Superfíne (Pharmacia) zjistila oligosacharidovou Kd=0,46 (celková hexoza) a kombinovaná analýza plynová chromatografie a stechiometrie potvrzují velikost odpovídající třem až čtyřem opakujícím se jednotkám.

2.4. Hydrolýza polysacharidů S. pneumoniae typ 23F

Dva miligramy kapsulámího polysacharidů S. pneumoniae typ 23F bylo rozpuštěno v 1 ml vodného roztoku 0,25M kyseliny trifluoroctové, pak hydrolyzováno v zatavených ampulích ponořených v olejové lázni při teplotě 70 °C po dobu tří hodin. Vzniklé oligosacharidy byly pak z reakční směsi odděleny chromatografíí přes Sephadex G15 (Pharmacia, Uppsala) kondiciovaný 15 mM roztokem NaCl při pH = 7,0 při 4 °C.

Chromatografícké eluenty pak byly analyzovány postupy podle Kabata (1964, v „Experimental Immunochemistry,“, vyd. E.A. Rabat a Mayer, str. 538-541), Chena a spol. (1956, Anal. Chem. 28:1756-1758) a Porroa a spol. (1981, Anal. Biochem. 118 301-306), pro zjištění přítomnosti methylpentoz, fosforu a redukčních skupin, např. aldehydových skupin. Analýza zjistila poměr hexoza/aldehyd 4,5 až 4,5, poměr hexoza/methylpentoza 2,3 a poměr fosfor/aldehyd 2,9.

Plynověchromatografícká a stechiometrická analýza potvrzují přítomnost mezi 3,5 a 4,5 základními opakujícími se jednotkami. Odstranění rozvětvení rhamnozy bylo podle plynové chromatografie menší než devět procent.

Gelová chromatografie na Sephadexu G-50 Superfíne (Pharmacia) stanovila distribuční konstantu (Kd) 0,38 (jako hexoza).

-14CZ 285650 B6

Imunochemická charakteristika oligosacharidových haptenů S. pneumoniae

Schopnost oligosacharidů typu 6A, 14, 19F a 22F S. pneumoniae reagovat s protilátkami namířenými proti intaktním kapsulámím polysacharidům byla testována, jak je popsáno Porroem a spol. (1985, Mol. Immunol. 22:907-919), použitím techniky, která měří schopnost haptenu (tj. oligosacharidů) inhibovat homologní antigeny (kapsulámí polysacharidy) v protilátkové imunoprecipitační reakci (nízká molekulová hmotnost haptenů nedává imunoprecipitační reakci při testování na homologní protilátky).

Metoda nazývaná „diferenciální elektroforéza“ byla provedena následovně: destičkový nosič z plastické hmoty pro imunoelektroforézu obsahuje tři 1% (hmotn./obj.) agarozové kompartmenty (Agaroza M-LKB, Bromma, Švédsko). První kompartment obsahuje 0,05 % (obj./obj.) referenčního antiséra ke kapsulámímu polysacharidů. Druhý kompartment obsahuje 0,05 % (obj./obj.) referenčního antiséra ke kapsulámímu polysacharidů, který byl před tím inkubován se známým množstvím referenčního kapsulámího polysacharidů při 37 °C po 15 minut. Třetí kompartment obsahuje 0,05 % (obj./obj.) referenčního antiséra ke kapsulámímu polysacharidů, který byl dříve inkubován se známým množstvím oligosacharidového haptenu. Pak byla provedena elektroforetická separace kapsulámího polysacharidů ve čtyřech pokusech dvojnásobně ředěných roztoků při 70 V/cm ve 20 mM tris-barbiturátovém pufru, pH = 8,8 po dobu 90 minut. Po elektroforéze byly destičky vybarveny stříbrem, sušeny a vyhodnoceny. Inhibice oligosacharidovými molekulami byla zjištěna při vyšším „raketovém“ imunosrážení, které se objevilo v kompartmentu, obsahujícím referenční antisérum pre-inkubované s haptenem. Minimální inhibiční koncentrace haptenu byla vypočtena jako hAg

MlCna ⁼ Cha---hHa kde

C_ha ⁼ koncentrace haptenu zkoušená v gelu h_Ag = úsek na přímce stanovený jako výška získaných „raketových“ imunoprecipitátů, jestliže byl v gelu referenční antigen a h_Ha = úsek na přímce determinovaný výškou „raketových“ imunoprecipitátů, získaných, jestliže byl zkoušený heptan v gelu.

Podobně, MIC_Ag = C_Ag. h_Ag

MIC_Ag

Specifita =-----MlCna

Byly testovány oligosacharidové hapteny různé velikosti.

Schopnost oligosacharidů blokovat imunoprecipitaci kapsulámích polysacharidů specifickými protilátkami byla také testována neelektroforetickou metodou radiální imunodifúze. Podle této metody inhibice oligosacharidovou molekulou byla zřejmá z většího poloměru imunoprecipitátů vytvořeného difúzí antigenu (kapsulámího polysacharidů) 1 % hmotn./obj. agarozou, obsahující specifickou protilátku předem inkubovanou s daným množstvím inhibitoru (oligisacharidu). Jakmile je experimentálně nalezena minimální slučovací koncentrace (Minimal Combining Concentration - MCC), vypočte se specifita podle uvedeného vzorce:

-15CZ 285650 B6

MCC_Ag(p_S)

Specifita =----------MCCHa(oligo)

Tabulka III

Imunochemická charakterizace oligosacharidových haptenů S. pneumoniae

Oligosacharid--(MIC_Ps/MIC_Hp) (MCC_Ps/MCC_Hp)

typ	DP	MH	DIEP	IRID
6A	2	1,5K	10'3
	3,5	2,5K	10'3	10’3
	10	7,OK	10'1
14	5	3,5K	n.t.	10’’
	15	10,4K	n.t.	10’1
19F	3,5	2,2K	10'3	10·4
23F CH3COOH(hyd)	3	2,3K	10’3	10'2
	6	4,5K	10'1	10’1
TFA(hyd)	4,5	3,4K	ío·4	5x10'3
	9,5	7,2K	10'1	10’1
n.t. = netestované
DIEP = diferenciální imunoelektroforéza
IRID = inhibice radiální imunodifuze
M1D = minimální inhibiční koncentrace

MCC = minimální spojovací koncentrace K = xlOOO

Aktivace koncové redukující jednotky oligosacharidů S. pneumoniae.

Oligosacharidové hapteny, získané výše, byly rozpuštěny ve vodě na konečnou koncentraci asi 5 mg/ml. Ke každému roztoku byl na každý mililitr objemu roztoku přidán 0,1 ml 0,2 M dihydrogenfosforečnanu draselného a pH bylo zvýšeno na 9,2 až 9,4 potřebným množstvím diaminomethanu (obecně je vyžadován objem 2 μΐ diaminomethanu na každý mililitr roztoku). Směs byla udržována na 100 °C 15 minut, po této době bylo přidáno množství asi 4 μΐ pyridinboranu na každý mililitr objemu roztoku. pH bylo upraveno na 9,2 1M hydroxidem sodným. Směs pak byla přenesena v zatavené ampuli do olejové lázně udržované na 50 °C pro příštích 48 hodin. Potom byl aminoaktivovaný oligosacharidový roztok neutralizován 1M HC1 a čištěn na Sephadexu G-15 Superfine (15 mM NaCl, pH 7,01). Oddělené chromatografické frakce byly spojeny a lyofilizovány. Pak byl lyofilizovaný zbytek rozpuštěn vDMSO na koncentraci 10 mg/ml a přidán k molámímu množství SIDEA (nebo SIDES), odpovídajícímu 5:1 mol/mol poměru s ohledem na množství aminoskupin přítomných v lyofilizované sloučenině. Reakce probíhala při teplotě místnosti po 4 hodiny a pak byla přidána k roztoku 4 objemu 1,4dioxanu (konečná koncentrace 80 % v 1,4-dioxanu) za účelem vysrážení esteru aktivovaného oligosacharidů. Sraženina oddělená odstředěním byla promyta třikrát 1,4-dioxanem a udržována při -20 °C nebo nižší než byla použita teplota v konjugačním procesu. Výtěžek aktivačního procesu pro každý ze čtyř oligosacharidů je uveden v tabulce IV.

-16CZ 285650 B6

Tabulka IV

Aktivace oligosacharidu S. pneumoniae: výtěžek procesu (% hmotn./hmotn.)

Serotyp	oIigo-NH(CH2)2NH2	oligo-NH(CH2)2NH-monoester	obecně
6A	75	93	70
14	73	90	66
19F	100	100	100
23F	50	90	45
Xg(±s.od.)	74,5 (±20)	93,3 (±4,7)	70(+23)

Konjugace aktivovaného oligosacharidu k CRM197 proteinu

Příprava CRM197 proteinu

CRM197, produkovaný Corynebacterium diphtheriae C7 (B^tx_l97), byl oddělen z kultivačního média molekulární filtrací za použití membrány Millipore XM-50 (NMWL 5x1 θ'⁴). Protein byl pak vysrážen přidáním nasyceného roztoku síranu amonného k filtrátu (až 65% hmotn./obj.). Vysrážený protein byl oddělen odstředěním a znovu rozpuštěn v 0,01M fosfátovém pufru (pH = 7,2).

Další čištění CRM197 bylo provedeno iontovýměnnou chromatografií za použití 2,5 x 100 cm DEAE-Sepharose 6B/CL sloupce (Pharmacia, Uppsala) kondiciovaného v 0,01M fosfátovém pufru při pH 7,2, za použití 0,09M NaCl v 0,01M fosfátovém pufru jako elučním činidle.

SDS elektroforéza na polyakrylamidovém gelu za redukčních podmínek (Pappenheimer a spol., 1972, Immunochem. 9: 891-906) indikuje, že 80% získaného CRM197 bylo ve své nativní molekulární formě. Čistota proteinu byla přibližně 400 flokulačního limitu (Lf) na miligram.

Konjugace aktivovaných oligosacharidu

Konjugační proces spočívá ve spojování; monosukcinimidylesterem aktivovaným oligosacharidových haptenů k epsilon-aminoskupině lysinových zbytků nosičového proteinu CRM197.

Dimethylsulfoxid, obsahující monosukcinimidylesterem (adipové kyseliny) aktivované oligosacharidy S. pneumoniae typ A, 14, 19F a 23F kapsulámích polysacharidů byl pak přidán k 0,lM hydrogenuhličitanovému roztoku pH = 8,0, obsahujícímu 2 mg/ml CRM₁₉₇ pro přípravu, který byl 50% ve vodě a ve kterém je molámí poměr esterem aktivovaného oligosacharidu k nosičovému proteinu 1:2.

Takto získaná směs byla udržována za mírného míchání při 4 °C po 15 hodin. Oligosacharidy každého ze čtyř serotypů byly konjugovány na protein v oddělených reakcích. Shrnutí fyzikálněchemických charakteristik získaných oligosacharidů je uvedeno v tabulce V.

-17CZ 285650 B6

Tabulka V

Charakteristika glukokonjugátů

Serotyp	DP oligo	MHoligo	Mhkonjugátu (SDS-PAGE)	SD (mol oligo) mol protein % (hmotn ./hmotn.)	konj. prot.
6A	3	2,1K	77,6K	7	100
14	5	3,5K	85,1K	6	100
19F	3	1,9K	69,2K	4	100
23F	6	4,5K	85,OK	5	100

K = x 1000

Porovnání účinnosti konjugace používající jako linkeru sukcinimidyldiesteru adipové kyseliny a sukcinimidyldiesteru jantarové kyseliny

Aktivované oligosacharidy vzniklé reakcí se sukcinimidyldiesterem jantarové kyseliny (SIDES) měly strukturu

O OO^ II II / ohgosachand- NH(CH₂)₂NH-C(CH2)2C- O- N >

zatímco oligosacharidy vzniklé reakcí se sukcinimidyldiesterem adipové kyseliny /SIDE/ měly strukturu

O

O O

Η II / ohgosachand - NH(CH₂)₂NH- Č(CH₂)₄C- O- N >

a získávají se tak vazby různé velikosti mezi oligosacharidem a konjugovaným proteinem (viz obr. 2). Byla hodnocena účinnost konjugace používající SIDES a SIDEA aktivované oligosacharidy. Jak je uvedeno na obr. 3A, B a C, jedině když vazba byla odvozena od SIDEA zdál se být protein v plně glykosylované formě (nebyly detegovány žádné nebo málo volných vazeb CRM197).

Imunogenicita glykokonjugátů S. pneumoniae

Bylo připraveno několik přípravků ze čtyř glykokonjugátů antigenů a testováno na králících (podle seznamu uvedeného v tabulce VI): typově specifické glykokonjugáty v monovalentním přípravku (2,5 nebo 5,0 pg oligosacharidu na dávku) nebo multivalentním přípravku (2,5 pg každého oligosacharidu na dávku) s a bez hydroxidu hlinitého jako minerálního adjuvans (pouze v multivalentním přípravku v dávce 1 mg byl podáván). Kompletní absorpce čtyř glykokonjugátů k hydroxidu hlinitému se vyskytla za zvolených podmínek, poněvadž zpracování supematantu multivalentního přípravku buď elektroforézou SDS na polyakrylamidovém gelu, nebo raketovým imunoelektroforézou nezjistilo žádné detegovatelné množství volného proteinu. Průměrná dávka každého glykokonjugátů, obsahuje přibližně 2,5 pg oligosacharidu a 13 pg nosičového proteinu

-18CZ 285650 B6

CRM197 (srovnatelné s průměrnou dávkou lidské vakcinace difterickým toxoidem). Imunizační soubor zahrnuje primární dávku a dvě posilovači dávky po 4 týdnech. Odběry krve byly provedeny v týdnu 0, 4, 6 a 10.

Tabulka VI

Imunizační soubor pro králíky a myši a dávky vakcín

Imunizace v týdnu 0,4, 8 odběr krve v týdnu 0,4, 6, 10

A. Rozpustný monovalentní (jeden typ) přípravek dávka (0,5 ml): 2,5 pg oligosacharid a pg(5 Lg)CRMi₉₇) dávka (0,5 ml): 5,0 pg oligosacharid a

26pg(10Lf) CRM_l97

B. Rozpustný polyvalentní (směs 4 typů) přípravek dávka (0,5 ml): 2,5 p typově specifický oligo (Tot - 10 pg oligos) a celkem 52 pg (20 Lf) CRM197

C. A1(OH)₃ -ads polyvalentní (směs 4 typů) přípravek dávka (0,5 ml): 2,5 pg typově specifický oligo (Tot = 10 pg oligo) a celkem 52 pg (20 Lf) CRM₁₉₇ s 1 mg A1(OH)₃

Tabulka VII představuje RIA (FARR metoda) hodnocené množství typově specifických protilátek jakož i počet odpovědí na počet imunizovaných zvířat. Poměr (R) indikuje násobek zvýšení dosažený pro každé imunizační dávce.

Tabulka VIII představuje ELIS A titry vyjádřené jako IgG isotyp Ab jakož i počet odezev na počet imunizovaných zvířat. Poměr -Ri -R₂ -R₃ znamenají násobek zvýšení titrů po každé imunizační dávce, zatímco poměiy R_b -R₂, -R₃ indikují násobek zvýšení v titrech pro danou imunizační dávku vzhledem k pre-titru. Tabulka IX uvádí kvalitativní výsledky jako funkčnost indukovaných IgG protilátek při poznávání polysacharidové kapsule na žijících streptokocích (Quellungova reakce nebo Nuefeldův test).

Tabulka X ukazuje neutralizační titry difterického toxinu indukované u králíků protiteinovým CRM197 nosičem, podle zkoušky Věro buňkami. I když jako kontrola bylo použito referenční FDA antisérum, mohou být také titry vyjádřeny v pg/ml.

-19CZ 285650 B6

Tabulka VII

RIA-hodnocené titry* králíků imunizovaných** oligosacharidy*** S. Pneumoniae typ 6A, 14, 19F, 23F kovalentně vázaných na nosičový protein CRM_]97

Rozpustná forma forma s přid. A1(OH)₃

Týden 4 6 11 týden 0 4 6 11

typ 6A	n.d.	n.d.	150(2/6)	495(6/6)	n.d.	538(5/5)	3,190	4,064
							(5/5)	(5/5)
							R = 6,0	R= 1,3
typ 14	n.d.	n.d.	230(1/6)	195(2/6)	n.d.	77(3/6)	203 (4/5)	216(5/5)
							R = 2,6	R= 1,1
typ 19F	n.d.	n.d.	n.d.	75 (6/6)	n.d.	72 (6/6)	108 (5/5)	188 (5/5)
							R=1,5)	R= 1,7
typ 23F	n.d.	n.d.	400 (1/6)	140 (1/5)	n.d.	283(3/6)	n.d.	246 (5/5)

* Data vyjádřena jako geometrický průměr titrů v ngN_Ab/ml. Respondenti vs. Celkový počet zvířat jsou v závorkách.

** Multivalentní přípravky čtyř glykokonjugátů v rozpustné a Al(OH)₃-adsorbované formě (1 mg/dávka forma). Každý glykokonjugát obsahuje průměrně 2,5 pg oligosacharidu a průměrně 13 pg proteinu CRM197. Imunizace v týdnu 0, 4 a 9. Vykrvácení v týdnu 0, 4, 6 a 11.

*** typ 6A a 19F oligosacharidů má průměr DP = 3 typ 14 a 23F oligosacharidů má průměr DP = 5 ****Glykokonjugát typ 6A má průměrný stupeň substituce (SD) oligosacharidů na jednotku nosičového proteinu (mol/mol) rovný 7.

SD pro typ 14 glykokonjugátu je 6, pro typ 19F 4 a pro typ 23F ř.

n.d. = nestanoveno

Tabulka VIR

ELISA výsledky IgG isotypu Ab titrů* indukovaných multivalentní vakcínou, obsahující glykokonjugáty S. pneuminiae

DP = 3+6 kapsulámích oligosacharidů typ 6A, 1, 19F, 23F, adsorbované na minerální přísadu A1(OH)₃

	Pre-titr (týden 0)	počátek (týden 4)	1. posilovači dávka 2. posilovači dávka (týden 6) (týden 11)
typ 6A	< 50 (0/5)	4,800 (5/5)	51,200(5/5) 130,000(5/5)
	Ri > 96,0	R2 = 10,7	(a<0,01) R3 = 2,5 (a< 0,01)
		R’2> 1,027	R'3 > 2,600
typ 14	< 50 (0/5)	360 (5/5)	4,480 (5/5) 19,000 (5/5)
	Ri>7,2	r2=	12,4 (a< 0,01) R3 = 4,4 (a< 0,01)
		R’2 > 89,3	R'3 > 396,0
typ 19F	< 50 (0/5)	2,080 (5/5)	18,560(5/5) 35,200(5/5)

-20CZ 285650 B6

Tabulka VIII - pokračování

Pre-titr počátek 1. posilovači dávka 2. posilovači dávka (týden 0)___________(týden 4)___________(týden 6)___________(týden 11)

Ri >41,6 R₂ = 9,0 (a< 0,01) R₃ = 1,9 (a< 0,01) typ 23F <50 (0/5)

Ri> 17,6

R’₂> 371,2 R'₃> 704,0

880(5/5) 1,280(5/5) 11,880**

R₂ = 1,5 (a< 0,01) R₃ = 9,3 (a< 0,01)

R'₂ > 25,6 R'₃ > 237,6 * Titry vyjádřeny jako geometrický průměr reciproční hodnoty nej vyššího ředění séra vykazující ABS hodnotu dvojnásobnou vzhledem k reakčnímu základu. V závorkách je uváděn počet zvířat (respondenti k celkově injektovaným).

** Hodnota představuje titr neobvykle vysokých respondujících králíků. Vyřazením dvou z pěti imunizovaných králíků, nejlepšího a nejhoršího respondenta, jsou získány výsledky zbylých tří králíků pro serotyp 23F:

Pokračování v tabulce VIII:

týden 0 týden 4 týden 6 týden 11 <50(0/5) 667(3/3) 1,333 (3/3) 2,667(3/3

Rj > 13,3 R₂ = 2,0 (a< 0,01) R₃ = 2,0 (a< 0,01)

R'₂ > 26,7 R'₃ > 53,3

Tabulka IX

Imunologická funkčnost králičího séra Ab k DP = 3-6 oligokonjugovaným k CRM197

Kvalitativní analýza (Quellungova reakce* pro rozpoznávání kapsulí) typ 6A S. pneumoniae: pozitivní reakce typ 14 S. pneumoniae: pozitivní reakce typ 19F S. pneumoniae: pozitivní reakce typ 23F S. pneumoniae: pozitivní reakce * Provedeno podle metody Austriana (1976), Mt. Sinai J. Med. 43: 699-709.

-21CZ 285650 B6

Tabulka X

Antidifterické titry* ve zkoušce věru buňkami, indukované u králíků imunozovaných multivalentními glykokonjugáty syntetizovanými s oligosacharidy S. pneumoniae kovalentně připo5 jenými k nosičovému proteinu CRM₁₉₇

	Pre-titr (týden 0)	počátek (týden 4)	1. posilovači dávka (týden 6)	2. posilovači dávka (týden 11)
Rozpustná	< 10	< 10	25 (0,019 pg/ml)	1,920 (1,4 pg/ml)
		R = 2,5	R = 77,0
Al(OH)3-ads	< 10	20	1,280	3,840
		(0,015 gg/ml)		(2,9 pg/ml)
		R = 64,0	R = 3,0

FDA ref. antisérum obsahuje 6 pg/ml a poskytuje 50% ochranu při ředění 1/8000.

ío * Titry vyjádřeny jako reciproká hodnota ředění, ke kterému pool antiséra vykazuje 50% ochranu k buňkám, jak je hodnoceno ³H-leucinovou inkorporací po vystavení buněk difterickému toximu.

Čísla v závorkách znamenají titry v pg/ml stanovené za použití FDA referenčního antiséra jako 15 kontroly.

Oligosacharidy délky řetězce DP = 10 až 20 jsou suboptimálně imunogenní.

Byly syntetizovány dvě skupiny vakcín glykokonjugátů v souladu se schématem syntézy, 20 popsaným výše, ale za použití sacharidů typu 6A, 14, 19F a 23F S. pneumoniae se dvěma různými „rozsahy hodnot“ délka řetězce a to DP = 3 až 5 a DP = 10 až 20. Otázkou pak je, zda oligosacharid s délkou řetězce DP = 20 nebo více, bude také optimálně imunogenní (při konjugaci na selektovaný CRMi₉₇ proteinový nosič) ve vztahu k počátku a zvýšení schopnosti ve srovnání s mnohem kratšími řetězci, jako jsou DP = 3 oligosacharidy.

Králíci byli imunizováni podle protokolu popsaného v tabulce VI. Jak vyplývá ze srovnání výsledků uvedených v tabulkách XII a XIII, které se týkají výsledků ELIS A IgG isotypových antigenních titrů, indukovaných rozpustnými oligosacharidy S. pneumoniae sDP = 10 až 14 a DP = 3 až 6, jakož i těmi, které jsou uvedeny v tabulkách XIV a XV, které se týkají výsledků 30 ELISA IgG titrů isotypových protilátek indukovaných oligosacharidy S. pneumoniae s DP =10 až 14 a DP = 3 až 6, adsorbovaných na A1(OH)₃, DP = 10 až 14 nebylo spojeno se zvýšením imunogenity. Faktem je, že vyvolání a zvýšení aktivity IgD DP = 3 až 5 oligosacharidovými konjugáty bylo mnohem větší, než aktivita pozorovaná při použití oligosacharidových konjugátů DP = 10 až 14. Ne náhodou byly všechny čtyři zkoumané karbohydrátové struktury spojeny se 35 stejnými výsledky. Dále, neutralizace difterického toxinu glykokonjugáty sDP= lOaž 14 byla shledána méně efektivní než ta, která byla dosažena použitím glykokonjugátů s DP = 3 až 6 (tabulka XVI). Tak oligosacharidy délky řetězce DP = 10 až 20 jsou funkční v konjugátech podle předkládaného vynálezu, ačkoliv oligosacharidy DP = 3 až 6 vyvolávají vyšší titry protilátek.

-22CZ 285650 B6

Tabulka XI

Imunizační soubor pro králíky

Modely glykokonjugátů byly injektovány v dávce 2,5 pg karbohydrátu. Poněvadž testované modely se liší pouze v délce řetězce kovalentně spojených oligosacharidů, bylo odpovídající množství proteinového nosiče:

dávka karbohydrátu dávka proteinového hmotn. Poměr _______________________________(pg)________________nosiče (pg)_________(hmotn./hmotn.)

DP=3-6 2,5 12,5 0,2 ollgO—CRMj97

DP=10-14 2,5 2,5 1,0

Imunizace v týdnech 0,4 a 8.

Odběr krve v týdnech 0,4 a 10.

Tabulka XII

ELIS A výsledky IgG isotypu Ab titrů indukovaných multivalentní vakcínou, obsahující glykokonjugáty S. pneumoniae DP = 10 až 14 kapsulámích oligosacharidů typ 6A, 14, 19F, 23F v rozpustné formě

	Pre-titr (týden 0)	počátek (týden 4)	1. posilovači dávka (týden 6)	2. posilovači dávka (týden 10)
typ 6A	< 100	< 100	< 100	500 (2/5)
typ 14	< 100	300	2400 (3/5)	4600 (3/5)
typ 19F	< 100	< 100	< 100	< 100
typ 23F	< 100	< 100	< 100	< 100

Tabulka ΧΠΙ

ELIS A výsledky IgG isotyp Ab titrů indukovaných multivalentní vakcínou, obsahující glykokonjugáty S. pneumoniae DP = 3 až 6 kapsulámích oligosacharidů typ 6A, 14, 19F, 23F v rozpustné formě

	Pre-titr (týden 0)	počátek (týden 4)	1. posilovači dávka (týden 6)	2. posilovači dávka (týden 10)
typ 6A	<50	<200	967 (6/6)	8500 (6/6)
			R3 = 8,8 (a< 0,01)
typ 14	<50	1800	3266 (3/6)	3650 (4/6)
typ 19F	<50	<50	675 (4/6)	1750 (6/6)
typ 23F	<50	<50	<50	<50

-23CZ 285650 B6

Tabulka XIV

ELIS A výsledky IgG isotyp Ab titrů indukovaných multivalentní vakcínou, obsahující glykokonjugáty S. pneumoniae typ 6A, 14, 19F, 23F adsorbované na minerální přísahu A1(OH)₃ počátek

Pre-titr 'týden 0)

1. posilovači dávka 2. posilovači dávka (týden 6) (týden 10)

typ 6A	< 100	240 (5/5)	900 (5/5)	500 (5/5)
	Ri > 3,0	R2 = 3,5 (a<0,01)R'3 = R'2 > 10,4	8,2 (a< 0,01) R'3 > 84,9
typ 19F	< 100	< 100	400 (1/5)	800 (1/5)
typ 23F	< 100	< 100	< 100	200 (1/5)

Tabulka XV

Tabulka IV. ELISA výsledky IgG isotyp Ab titrů* indukovaných multivalentní vakcínou, obsahující glykokonjugáty S. pneumoniae DP = 3 až 6 kapsulámích oligosacharidů typ 6A, 14, 19F, 23F adsorbované na minerální přísadu A1(OH)₃ typ 6A typ 14 typ 19F typ 23F

Pre-titr (týden 0) < 50 (0/5) Ri > 96,0 < 50 (0/5)

Ri>7,2 (0/5) Ri>41,6 (0/5) Ri > 17,6 počátek 1. posilovači dávka 2. posilovači dávka (týden 4)___________(týden 6)___________(týden 11)

4800 (5/5) 51200 (5/5) 130 000 (5/5)

R₂ = 10,7 (a< 0,01) R₃ = 2,5 (a< 0,01)

R'₂> 1,027 R'₃> 2,600

360 (5/5) 4480 (5/5) 19800 (5/5)

R₂ = 12,4 (a< 0,01) R₃ = 4,4 (a< 0,01)

R'₂ > 89,3 R'₃ > 396,0

2080(5/5) 18560(5/5) 35200(5/5)

R₂ = 9,0 (a< 0,01) R₃ = 1,9 (a< 0,01)

R'₂> 371,2 R'₃> 704,0

880 (5/5) 1280 (5/5) 11880 (5/5)

R₂ = 1,5 (a< 0,01) R₃ = 9,3 (a< 0,01)

R'₂ > 25,6 R'₃ > 237,6

Titry vyjádřeny jako geometrický průměr reciproké hodnoty nejvyššího ředění séra, vykazují ABS hodnotu dvojnásobnou k reakčnímu základu. V závorkách je uveden počet zvířat (respondenti k celkem injektovaným).

Tabulka XVI

In vitro neutralizace* difterického toxinu sérem králíků imunizovaných S. pneumoniae oligosachari-CRMi9₇ glykokonjugáty

Pre-titr	počátek	1. posilovači dávka	2. posilovači dávka
(týden 0)	(týden 4)	(týden 6)	(týden 10)

< 1/10

DP = 3-6 oligo-CRMig?: rozpustný

Al(OH)₃ads < 1/10 (0,016 0/ml) < 1/10 1,20 1/1,280 (0,03 0/ml) (2,05 0/ml)

1/10 1/640 1/2,560

-24CZ 285650 B6

Tabulka XVI - pokračování

Pre-titr počátek 1. posilovači dávka 2. posilovači dávka ___________________(týden 0)___________(týden 4)___________(týden 6)___________(týden 10) (1,02 0/ml) (4,10 0/ml)

DP= 10-14 oligo-CRM₁₉₇:

Rozpustný	<1/10	<1/10	< 1/10 (0,016 0/ml)	1/10
Al(OH)3ads	< 1/10	< 1/10	1/40	1/80

(0,06 0/ml) (0,13 0/ml) * Titry vyjádřeny jako reciproké hodnoty ředění, jejichž pool králičího antiséra vykazuje 50% ochranu k buňkám, hodnoceno podle ³H—leucinové inkorporace po vystavení buněk difiterického toxinu. Čísla v závorkách vyjadřují titry v pg/ml jak je stanoveno FDA referenčním antisérem jako kontrolou.

MPL hodnoceno u lidí: 0,01 pg/ml

Imunní odpověď na glykokonjugáty je monospecifická a homogenní.

Porovnání výsledků uvedených v tabulce VII a VIII, které se týkají protilátkových titrů určených pomocí radioimunoanalýzy (RLA) a pomocí testu ELISA odhaluje, že RIA hodnocené titry byly nižší než ELISA hodnocené titry. Toto pozorování společně s absencí imunoprecipitátů vagarozovém gelu, užitém pro radiální imunodifuzi a „raketovou“ elektroforézovou analýzu antiglykokonjugátového antiséra, dokázaly, že králičí antiséra k S. pneumoniae oligosacharidCRM197 konjugáty, obsahují vysoce specifické IgG isotypové protilátky, které byly nevhodné ke srážení vlastních čištěných karbohydrátových polymerů, použitých ke generování oligosacharidů.

Absence srážení protilátek vantiséru je indikací monospecificity, tj. protilátka poznává pouze jeden epitop vantogenním repertoáru dané molekuly (Berzofsky-Schechter, 1981, Molecular Immunol. 18:751-763). Srážení antigen-protilátkových komplexů potřebuje mřížkovou formaci ke generování trojrozměrné, větvené sítě spojených molekul protilátky a antigenu. Pro výskyt tohoto je požadována multivalenčnost jak protilátky tak antigenu, více než jedna protilátka musí být schopna se nevázat na jednu antigenní molekulu současně. Nedostatek pozorovatelné imunoprecipitace, vyskytující se mezi králičím antisérem kS. pneumoniae oligosacharidCRMw konjugátům a homologním čištěným kapsulámím polysacharidem vysoké molekulární hmotnosti je výrazným indikátorem, že antiséra obsahovala protilátky specifické pro karbohydrátové polymery, jak ukazuje ELISA a inhibiční ELISA analýzy, ale řízené pouze na jeden determint (epitop) polysacharidu.

Kromě projevování imunoprecipitační aktivity je heterogenní populace protilátek také obyčejně spojena s následujícími vlastnostmi: jednotlivý epitop antigen užitý na vyvolání protilátkové odpovědi nemůže kompletně inhibovat vazbu celé populace protilátek na kompletní antigen, ale bude inhibovat pouze ty protilátky, které jsou navázány na jeden epitop, nechávaje ostatní protilátky volně se navázat na zbývající epitopy přítomné na kompletním antigenu. Populace protilátek může být hodnocena díky heterogenitě ELISA-inhibiční zkouškou. V této zkoušce je měřena schopnost populace protilátek vázat se na kompletní antigen za přítomnosti inhibitoru vazby antigen/protilátky tak, jak izoluje epitopy antigenu. Znázorněno graficky, když vazba protilátky na značený kompletní antigen je měřena za přítomnosti zvýšené koncentrace neznačeného kompletního antigenu a je generována sigmoidální křivka, která může být použita jako standardní křivka pro vazbu antigen/protilátka. Jestliže je populace protilátek heterogenní, vazba mezi protilátkou a kompletním antigenem může být plně inhibována přidáním jednoho antigenního epitopu a standardní křivka vazby antigen/protilátka je pouze částečně posunuta

-25CZ 285650 B6 (částečně přesahující nebo částečně paralelní) jako jiné interakce antigen/protilátka, zřejmé ze spojení s testovanými epitopy, převažuje. Opačně, vazba homologní populace protilátek na antigen může být plně inhibována přidáním izolovaného epitopu; standardní vazebná křivka antigen/protilátka pro homologní populaci protilátek bude přesahující nebo paralelní ke křivce generované přidáním izolovaného epitomu, odpovídajícímu populační specifitě.

Experimentálně, testováním S. pneumoniae glykokonjugáty indukovaly IgG tímto způsobem, byla pozorována afinita vzorku, odpovídající té, která byla předpokládána na homogenní populaci protilátek (obr. 4). Oligosacharid 6A S. pneumoniae (buď v konjugované, nebo v nekonjugované formě) byl spojen sigmoidální křivkou vazebné inhibice přibližně paralelně s křivkou získanou použitím serotypu 6A kapsulámího polysacharidu s vysokou molekulovou hmotností. Jak bylo očekáváno, heterologní (typ 14) ligosacharid, v buď volné (linkeraktivované), nebo konjugované formě, neinhiboval IgG isotypovou populaci specifickou pro typ 6A antigenu.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (8)

1. Způsob přípravy kovalentního konjugátu oligosacharidu a nosičového proteinu, vyznačující se tím, že zahrnuje následující stupně:

i) reduktivní aminaci oligosacharidu, majícího terminální redukující se skupinu sdiaminoethanem za přítomnosti pyridinboranu, při teplotě 100 °C, ii) reakci aminovaného oligosacharidového produktu z odstavce i) s molekulou, obsahující dvě funkční skupiny, z nichž jedna je schopna reakce s terminální skupinou aktivovaného oligosacharidu a druhá je schopna reakce s uvedeným nosičovým proteinem a iii) konjugaci aktivovaného oligosacharidového produktu z odstavce ii) s uvedeným nosičovým proteinem.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že molekulou, obsahující dvě funkční skupiny ze stupně ii) je diester.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že molekulou, obsahující dvě funkční skupiny ze stupně ii) je diester adipové kyseliny nebo diester jantarové kyseliny.

4. Způsob podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že oligosacharid je odvozen ze Streptococcus pneumoniae kapsulámího polysacharidu.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že oligosacharid je odvozen od Streptococcus pneumoniae, selektivního serotypu vybraného ze skupiny, zahrnující typy 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20,22F, 23F a 33F.

6. Způsob podle nároků 1, 2, 3, 4, nebo 5, vy z n ač uj íc í se tím, že oligosacharid je odvozen od kapsulámího polysacharidu z bakterií vybraných ze skupiny, zahrnující Haemophilus influenzae, Neisseria meningitis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Escherichia coli, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae a Staphylococcus aureus.

-26CZ 285650 B6

7. Způsob podle nároků 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6, vyznačující se tím, že nosičovým proteinem je CRM197.

8. Způsob podle nároků 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7, vyznačující se tím, že nosičový 5 protein je vybrán ze skupiny, zahrnující Salmonella flagelin, Haemophilus pillin, Heamophilus

15 kDa, 28 až 30 kDA nebo 40 kDa membránový protein, Eschirichia coli tepelně labilní enterotoxin LTB, difterický toxin, tetanový toxin, cholerový toxin, protein rotaviru VP7 a protein respiračního syncytiálního viru F nebo G.