SK280112B6 - Spôsob prípravy kovalentného konjugátu oligosachar - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu prípravy kovalentného konjugátu oligosacharidu a nosičového proteínu. Konjugáty vyrobené spôsobom podľa vynálezu sú použiteľné ako vakcíny poskytujúce monošpecifickú a homogénnu imunitnú odpoveď na kapsuláme polysacharidy a indukujúce imunitu proti zavedeným sérotypom Streptococcus pneumoniae, ktoré môžu byť dôležité na použitie pre detských pacientov, ako aj pre pacientov starších a pacientov s oslabenou imunitou, spôsobenou slabosťou alebo chorobou (vrátane napr. pacientov s AIDS).

Doterajší stav techniky

Pneumococcus (Streptococcus pneumoniae) je gram-pozitívny kapsulujúci kok, ktorý obvykle rastie v pároch alebo krátkych reťazcoch. V diplokokovej forme sú priľahlé okraje zaoblené a opačné konce nepatrne zašpicatené a organizmus dostáva lancetovitý tvar.

Pneumokoky môžu byť rozdelené do sérotypov podľa komplexných polysacharidov, ktoré tvoria ich kapsulky. Bolo identifikovaných 84 sérotypov pôsobením typovo špecifického antiséra, Neufeldovou potláčacou reakciou. Všetky sú pre človeka patogénne, ale typy 1, 3, 4, 7, 8, 9 a 12 sú najčastejšie nachádzané v klinickej praxi. Typy 6, 14, 19 a 23 často spôsobujú pneumóniu a otitis mcdia u detí, ale sú menej bežné ako u dospelých (Austrian, 1983, Jlarrison’s Principles of Intemal Medicíne“. Petersdorf a spol., vyd., 10. vydanie, McGrawHill Book Co., New York, str. 918 - 922). Pneumokokus je jedným z troch patogénov, zodpovedajúcich za pneumóniu, sepsu a meningitídu detí (McMillan, 1982, v „CoreTextbook of Pediatrics, Kaye a spol., vyd., Second Edition, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, str. 498).

Medzi osoby s vyšším rizikom rozvinutia pneumokokovej infekcie patria pacienti s chronickými systémovými chorobami, ako sú srdcové choroby, chronické bronchopulmonálne choroby, pečeňové choroby, obličkové nedostatočnosti a nádory. Je doporučované, aby týmto osobám bola podaná vakcína proti pneumokokovej infekcii. Na tento cieľ jc vhodných 23 vakcín s obsahom kapsulámych polysacharidov pneumokokových typov 1,2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9a, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F a 33F (ktoré zahrnujú sérotypy alebo skupiny zodpovedné za 90 % vážnych pneumokokových chorôb v USA a zvyšku sveta) dostupné od Pneumovax^R Merck, Sharpe a Dohme a Pnu-ImmuneR, Lederle Laboratories). Účinnosť týchto vakcín u detí je sporná, pretože u detí mladších ako šesť rokov sa imunologické odpovede na rôzne kapsuláme antigény rozvíjajú rôzne dlhý čas ako výsledok charakteristiky zrenia imunitného systému a ochrana môže mať kratšie trvanie ako je pozorované u dospelých (Harrison a spol., ibid). Aj keď relatívne málo pneumokokovým sérotypom je pripisovaný taký význam pre väčšinu pediatrických pneumokokových infekcií (Gray a spol., 1979, J. Infect. Disease 140: 979 - 983), tieto zahrnujú typy, pre ktoré vývoj ľudskej protilátkovej odpovede na čistené kapsuláme polysacharidy použité ako vakcíny je pomalší (Anderson a Betts, 1989, Pediatrie Infec. Dis. J. 8: S50 - S53; Borgono a spol., 1978, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 157: 148- 154).

Imúnne odpovede u detí na Haemophilus Influenzae b kapsuláme polysacharidy boli dosiahnuté spojením kapsulámeho antigénu s proteínovým nosičom za vzniku „konjugátu“ vakcíny. Predpokladá sa, že helper efekt T-lymfocytov je indukovaný proteínovým nosičom a je zodpovedný za rozvinutie imunity (Robbins a spol., 1984 v „Bacterial Vaccines“, Germanier, vyd. Academic Press, New York, str. 289 - 316), pozri tiež Cruse a Lewis, 1989 v „Conjugate Vaccines“ vyd. Cruse a Lewis, Karger, Basel, str. 1 - 10). Podobný postup bol riadený smerom k produkcii pneumokokových vakcín.

Rôzni bádatelia izolovali a čistili intaktné kapsuláme polyméry, ktoré môžu byť použité v alebo ako vakcíny. Napr. US patent č. 4220717 opisuje postup na izoláciu a čistenie imunologický aktívneho polyribozyl-ribitol-fosfátu (PRP) z kapsulámeho polyméruH-influenzae b. Ďalej, US patent 4210641 sa týka polysacharidových extraktov z H. Influenzae, majúcich zrejmú molekulovú hmotnosť väčšiu ako 200 000 dalton a zložených hlavne z galaktózy, glukózy a manózy a obsahujúcich malé množstvo osamínov.

Niekoľko výskumníkov využilo tieto a iné intaktné kapsuláme polyméry pre formulácie s cieľom dosiahnuť lepšie imunologické výsledky. Napríklad US patent 4196192 uvádza vakcínu obsahujúcu čistený intaktný PR a celé buny Bordetella pertussis vo vakcinovom prípravku. Tento postup na zvýšenie imunogenicity dosiahol zvý šené hladiny anti-PRP a antipertussis protilátok pri mladých cicavcoch.

Nosičove proteiny môžu spôsobiť viac ako zvýšenie imunogenicity konjugovaných kapsulámych polymérov. Môžu tiež urobiť haptény imunogenickými. Haptény sú definované ako molekuly, ktoré sa môžu viazať špecificky na protilátku alebo lymfocytový receptor, ale nemôžu samé spôsobiť imunitnú odpoveď (to znamená samé nie sú imunogénne). Aby bola vyvolaná imunitná odpoveď, musia byť malé molekuly s nízkou molekulovou hmotnosťou a slabou imunogenicitou, nazývané haptény, spájané do väčších molekúl alebo pripájané na nosič, ktorý je obvykle heterológny proteín. Injekcia komplexu haptén-nosič vyvolá potom zvýšenie produkcie protilátok Blymfocytmi, z ktorých niektoré budú schopné viazať sa na voľné, nespojené hapténové molekuly.

Medzi prvými hapténmi, ktoré boli študované, boli azofarbivové zlúčeniny, ako je anilín alebo kyselina o-aminobenzoová. Landsteiner a Lámp (1918, Z. Immun. Forsch 26: 293) pripájali tieto zlúčeniny diazotáciou k sérovým proteínom. Po injikovaní týchto umelo pripravených azoproteínov králikom sa rozvinulo zrazenie protilátok, ktoré boli špecifické pre pripojené chemické skupiny.

Inými príkladmi haptsnových zlúčenín sú dmitrofenol, ktorý sa stáva imunogénnym pripojením ako dinitrofenylová (DNP) skupina k hovädziemu sérovému albumínu alebo k hovädziemu gamaglobulínu (BGG) a dietylamid kyseliny lysergovej. Dokonca formaldehyd sa môže chovať ako haptén, osoby vystavené formaldehydom z produktov alebo v laboratóriách sa stávajú citlivými na túto zlúčeninu, pričom nasleduje formylácia ich endogénnych makromolekúl in vivo.

Haptenické chovanie nie je obmedzené na malé organické molekuly a polypeptidové hormóny až do veľkosti inzulínu sú často slabo, ak vôbec sú, imunogénne. Aby sa získali vysoké titre protilátok proti týmto hormónom, je teda nevyhnutné ich konjugovať na nosičovú molekulu (alebo vytvoriť molekuly spájaním mnohých týchto polypeptidov' dokopy).

Voľba nosičovej molekuly je predovšetkým zaujímavá v tom, že nosič má viac ako transportnú úlohu. Ovary a

SK 280112 Β6

Benaceraff (1963, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 114: 723) toto dokázali injikovaním DNP-BGG králikom. Injekcia množstva imunogenického materiálu zvieratám vyprodukuje imunologickú „pamäť“ pôsobenia. Ak je druhá injekcia daná neskôr, potom je tu oveľa viac mohutných imunitných odpovedí. Naozaj, keď Ovary a Benaceraff injikovali DNP-BGG zasa, objavila sa silná sekundárna odpoveď, ktorá viedla k výrazne zvýšenej hladine protilátok tak proti DNP ako aj BGG. Ale keď bola uskutočnená druhá injekcia namiesto uvedenej s DNP-vaječným albumínom, bola zaznamenaná slabšia anti-DNP protilátková odpoveď. Rozdiely v odpovedi boli spôsobené tým, čo nazývame nosičový efekt a zdá sa, že zhrňuje T-helper lymfocyty.

Predbežné dôkazy ukazujú, že všetky proteíny nemôžu byť rovnako efektívnymi nosičovými proteínmi pre dané haptény. Robbins a spol. (Infect. Immun. 40: 245 - 256) predkladá dáta z experimentálnych vakcín proteín-polysacharidových konjugátov, v ktorých rovnaký polysacharidový haptén bol konjugovaný s rôznymi proteínovými nosičmi a potom bol kvantifikovaná protilátková odpoveď. Významné rozdiely boli zaznamená v množstve generovaných anti-hapténových protilátok a indikovali významnú úlohu nosičov.

Pokiaľ ide o pneumokokálne vakcíny podrobnejšie, Lin a Lea (1982, Immunology 46: 333) študovali imunitnú odpoveď dospelých a mladých myší, vystavených typu 6A a 19F polysacharidov, ako aj 19F konjugovanému na proteín. Významne vyššie IgM a IgG2 titre protilátok boli indukované pri myšiach, ktoré dostali 19F-polysacharid-proteín konjugáty, ako pri kontrolnej skupine, ktorá dostala 19F polysacharid samostatne.

Iní bádatelia študovali konjugáty v kapsulámych polyméroch s prenášačovými proteínmi s cieľom zvýšiť protilátkovú formáciu takzvaným „nosičovým efektom“. Napríklad Schneersen a spol., loumal of Experimental Medicíne 152: 361 - 376 (1980) opisujú H. Influenzae b polymér-proteín konjugáty, pri ktorých objavili, že vyvolávajú imunitu proti invazívnym chorobám vyvolaných H. influenzae b. Odkazy, dokumentujúce imunologické chovanie kapsulámych polymérov, sú vztiahnuté na vek detí a snažia sa prekonať túto závislosť od veku konjugáciou intaktných kapsulámych polymérov s rôznymi proteínmi, vrátane sérového albumínu. Limulus polyphemus homocyanínu a difterického toxínu. Metóda konjugácie zahrnuje použitie spájacieho činidla, ako je adipický dihydrazid.

Geyar a spol., Med. Microbiol. Immunol. 165: 171 288 (1979), pripravili konjugáty určitých fragmentov kapsulámych polysacharidov Klebsiella pneumoniae s nitrofenyl-etylaminovým linkérom redukčnou animáciou a derivatizovaný cukor bol potom pripojený k proteínom pri použití azo-kopulácie.

US patent 40578685 z 9. mája 1974 sa týka Escherichia coli lipopolysacharidov so zníženou toxicitou kovalentne naviazaných na proteínový antigén reakciou s halogénacylhalogenidom.

US patent 4356170 Jenningsa a spol., z 27. mája 1981, zver. 26. októbra 1982 sa týka prípravy' polysacharidproteínových konjugátov redukčnou amináciou.

Aiídersen (1983, Infection and Immunity 39: 233 - 238) sa týka konjugátov medzi oligosacharidmi z kapsulámeho polysacharidu Haemophilus influenzae typ b & CRM197, netoxickým, ale antigénne identickým variantom difterického toxínu.

Snippe a spol. (1983, Infection and Immunity 42: 842 - 844) sa týka semisyntetickej vakcíny pre Streptococ cus pneumoniae typ 3, v ktorej hexasacharid izolovaný z čiastočného kyslého hydrolyzátu kapsulámeho polysacharidu S3 bol naviazaný na stearylamín redukčnou amináciou a potom inkorporovaný do lipozómov. Bolo pozorované, že výsledná vakcína konjugát-lipozóm indukuje ochranu pre S. pneumoniae typ 3 pri myšiach.

US patent 4663160 Tsaya a spol., podaný 14. marca 1983, udelený 5. mája 1987, sa týka baktérie, v ktorej je detoxifikovaný polysacharid z gram-negatívnej baktérie kovalentne naviazaný na detoxifikovaný proteín z rovnakého druhu gramnegatívnej baktérie spájaním uhlíka 4-12.

US patent 4619828 Gordone, podaný 5. januára 1984, udelený 28. októbra 1986, sa týka konjugátov medzi polysacharidovými molekulami z patogénnych baktérií, ako je Haemophilus influenzae h. Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis a Escherichia coli a antigénov závislých od T buniek, ako sú difterické a tetanové toxoidy.

US patent 4808700 Andersona a Clementsa, podaný 10. augusta 1984, udelený 28. februára 1989 a US patent 4761283 Andersona, podaný 28. marca 1986, udelený 2. augusta 1988 sa týkajú kovalentného spojenia fragmentov kapsulámych polymérov s bakteriálnymi toxínmi, toxoínmi alebo väzbovými podjednotkami pomocou redukčnej aminácie.

US patent č. 4711779 Porroa a spol., podaný 2. júla 1986, udelený 8. decembra 1987, sa týka vakcín glykoproteínových konjugátov, majúcich trivalentnú imunogenickú aktivitu a zahrnujúcich antigénne determinanty z kapsulámych polysacharidov gram-pozitívnych baktérií a gram-negatívnych baktérií, ako aj buď CRM197, tetanický alebo pertusis toxín.

Príprava konjugátových vakcín, v ktorých heptány kapsulámych polysacharidov sú pripojené k nosičovým proteínom, zahrnuje tieto postupy:

i) musí byť pripravený kapsulámy polysacharid, ii) ak má byť použitý fragment polysacharidu, musí byť separovaný z intaktného polysacharidu, iii) sacharid musí byť aktivovaný alebo účinne byť schopný konjugácie, to znamená, že musia byť generované skupiny schopné kovalentnej väzby k proteínu.

Rôzne metódy známe v oblasti realizácie týchto štyroch krokov sú uvedené v tabuľke I.

Tabuľka I

Odkaz Príprava polysacharidu	Štiepenie Aktlvicla	KonJusAcla k proteínu
polyeacha- polysachai—
rldu rldu
US patent	vyu2íva k y-	redukčná amlnácia
4356170,	sellnu Jo—	využívajúca kyano-
Jennlrtge,	dlstú na	bórhydrld
pod.	generovanie
27.5.1901.	aIdehydových
údel. 25.10.1962	skupín
US patent	vyuZíva ky-	1> 4-12 uhlíkové
4663160,	eelinu Jo-	akuplny pripojené
Teay a spol..	dletd na	k proteínu za pri-
pod. 14.3.1983.	generovanie	toenoetl konden-
údel. 5.5.1987	aldehyde-	zaCnáho Činidla.
	vých skupín	napr. karbodilmldu 11> polysacharid pripojený k derlvatlzovartému pro— teínu 4-12 uhlíkovými skupinami reakciou Sci »í Ff-i. vej bázy za prítomnosti redukčn·? hu činidla, napr. kyanetborohydr f du
US patent	poly šacha— “brówtkyan	“k on j u gov a> tý soa -
4619828.	upravené	cer mostíkom 4 8
livrdon.	tepelným	atdmov uhlíku aku
pod. 5.1.1884.	sprac uvalila»	existuje v derlvá·
údel.	na moleku -	te hydrazidu adi-
28.1U.1986	lovd velkout	povej kyseliny v
	medzi 2OOOGU a 2000000 daltcm	proteíne

SK 280112 Β6

Tabuľka I - pokračovanie

US patent 4806700. Anderson a Clenents.

pod. 10.6.1684. údel.

26.2-1989 bolí použité rôzrie rwetódy na pr ípťúvu aritl9énnych fragmentov e aepoA Jedným redukovaný* koncom. napr. limitné oxidačné štiepeniu jodlstaiKwi. hydrolýza 91ykozidázou alebo kyslá hydrolýza kohjugácla redukčnou amlnáclou za prítomnosti kyanoboruhydrldu <približne 2-3 týždne) sekcia 6.5 Oanlsh typ vyššie. 6A. EL1 nazvaná Lllly Co. “Conjugatlon of

Capsular Polymér

Fragment of Streptococcus Pneumo kyslá hydlýza v 0. IM HC1 počas 1O minút pri 100 °C aby vznikli redukčné fragmenty kunjugované k vo fosfátovom pufre pri použití kyanoborohydrldu sodného počas 18 dni r<l 37 “C niae to CRH_t

US patent 4711779.

Porro a llunstaritino. p»i, 2.7.1600, údel. 8.12.1987 kyslá bydrmlýza pri. lľW ^eC počas ί»··4Π l>od. Haptú ny s mul. hmotn. 10ΓΗ až 2000 dal.ton pre

Strepto— eoccus pnetMOrtiae typ 6Λ kyslá hydralýza fri l«0 ^et: počas 39 hodín aktivované zavedením primárnych aminoskupln do terminálnych redukčných kou luguvané k Luxoidu za pritom nosti organického rozpUSťadla. napr . d i metylsulfoxldu skupín <napr. použitím kyanohuruhydrldu sodnéhu) s nasledujúcou konvtsr ziuu n.1 estery <naí>r. za ΡΓ í bCHMICISlJ. derivátov kyseliny adipuvej) aktivovaná konjugované k a atnonia- CRHi_V7 za prítomkálnom puf— nustl dimetylsulf ri za pri- oxidu pri teplote tomniisti miestnosti počas kyanoboru- 15 hodím hydridu sodi wího ť na zavedenie primárnych amlnuskupín) počac dvoch týždňov;

prevedené na príslušné Ktrtofunkčné estery vo vodnom roztoku dimetylsulfoxldu, ubNahuJticom di.sukcínlmidylester adlpovej kyseliny počas 4 hodín

Podstata vynálezu

Predložený vynález sa týka kovalentného naviazania oligosacharidov odvodených od bakteriálnych kapsulámych polysacharidov na proteínový nosič pri použití novej metódy.

Tento postup dovoľuje účinnú syntézu glykokonjugátov pri produkčnej rýchlosti aj výrazne vyššej ako predtým používané metódy. Glykokonjugáty podľa vynálezu môžu byť použité v príprave vakcín a môžu sa prejaviť ako imunogenické.

Vo výhodnej realizácii sa predložený vynález týka produkcie glykokonjugátov, ktoré inkorpovali oligosacharidy odvodené od kapsulámych polysacharidov Streptococcus pneumoníae. Metóda podľa vynálezu má za následok účinnú produkciu glykokonjugátov ó’, pneumoníae vo vysokých výťažkoch, ktoré môžu byť použité vo vakcínových prípravkoch so značnou dôležitosťou pre pediatrickú populáciu, v ktorej veľká časť najrozšírenejších chorôb je spojená s infekciou S. Pneumoníae. Bolo objavené, že imunogénne konjugáty sú menej závislé od veku ako kapsuláme polysacharidy samotné, až sú užitočné pre aktívnu imunizáciu veľmi mladých teplokrvných cicavcov proti systémovým infekciám príslušnou enkapsulovanou baktériou.

V ďalšom aspekte vynálezu bolo objavené, že glykokonjugáty podľa vynálezu prekvapivo vyvolávajú monošpecitickú a homogénnu imunitnú odpoveď, ktorá môže výhodne zabraňovať vyvolaniu autoimunitných reakcií a odvodených post-vakcínových syndrómov.

Dôležité je, že imunogénne konjugáty podľa vynálezu neobsahujú potenciálne toxické spájacie činidlá, ako je dihydrozid kyseliny adipovej alebo p-nitrofenyletylamín, ktoré boli použité v konjugácii karbohydrátu k proteínu.

Skraty a definície:

CRM197 netoxický proteín antigénne krížovo reaktívny s difterickým toxínom

DMSO dimetylsufloxid

DP stupeň polymerizácie

MIC minimálna inhibičná koncentrácia

SD stupeň substitúcie

SIDEA sukcínimidyldiester kyseliny adipovej SIDES sukcínimidyldiester kyseliny j antárovej

Predložený vynález sa týka kovalentného pripojenia oligosacharidov odvodených od bakteriálnych kapsulámych polysacharidov k proteínovým nosičom; spôsob podľa vynálezu generuje nové glykokonjugáty novými spôsobmi.

Pre zrejmosť a bez akéhokoľvek obmedzenia je detailný opis vynálezu rozdelený na tieto sekcie:

i) príprava oligosacharidov, ii) aktivácia oligosacharidov, iii) konjugácia oligosacharidov k proteínu, i v) imunochemická charakterizácia glykokonjugátov,

v) vakcínový prípravok a podanie, vi) využitie vakcín konjugátov pneumokokálnych oligosacharidov.

Príprava oligosacharidov

Kapsuláme polysacharidy s vysokou molekulovou hmotnosťou môžu byť obchodne dostupné (Američan Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD)), alebo získané metódami opísanými Poorom a spol., 1983, J. Biol. Stand. 11: 65 - 71. Môžu byť použité akékoľvek polysacharidy zahrnujúce, ale neobmedzujúce sa na ne, tie, ktoré boli objavené v puzdrách Streptococcus pneumoníae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoníae, Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa.

Antigénne fragment)' s najmenej jedným redukujúcim koncom môžu byť získané z kapsulámych polymérov rôznymi metódami, závisiacimi od štruktúrnych vlastností jednotlivých kapsulámych polymérov. Limitné oxidačné štiepenie jodistanom (alebo podobnými riedidlami) oddelí aldehydové konce; dôjde tak k obmedzeniu na polyméry, majúce vicinálne dihydroxyskupiny na necyklických zvyškoch. Hydrolýza glykozidických väzieb poskytne redukovaný cukrový· koniec. Takáto hydrolýza môže byť naj špecifickejšie uskutočnená enzymatickou cestou glykozidázami, ale toto použitie je obmedzené na relatívne malý počet kapsulámych polymérov, napr. Streptococcus pneumoníae S, pre ktoré sú glykozidázy známe. Kyslá hydrolýza je bežne používaná na hydrolýzu glykozidických väzieb. Použitie tohto postupu je obmedzené, ak polymér obsahuje proti kyseline citlivé neglykozidické väzby alebo ak polymér obsahuje na kyselinu citlivé mostíkové väzby, dôležité pre antigénmi špecifitu.

V špecifických realizáciách S. pneumoniae typu 6A kapsulámy polysacharid môže byť hydrolyzovaný v približne 10'² M octovej kyseline pri asi 100 °C počas asi 30 hodín; kapsulámy polysacharid S. pneumoniae typ 14 môže byť hydrolyzovaný v približne 0.5 M kyseline triíluóroctovej pri asi 70 °C počas asi 7 hodín; polysacharid

S. pneumoniae typ 19F môže byť hydrolyzovaný v približne 10’² M kyseline octovej pri asi 50 °C počas asi 48 hodín; a polysacharid S. pneumoniae typ 23F môže byť hydrolyzovaný v približne 0,25 M kyseline trifluóroctovej pri asi 70 °C počas asi 3 hodín.

Podľa predloženého vynálezu oligosacharidy, ktoré sú konjugované k proteínu, výhodne obsahujú medzi troma a šiestimi opakujúcimi sa jednotkami (alebo medzi asi desiatimi a tridsiatimi monosacharidovými zvyškami) a najvýhodnejšie obsahujú medzi tromi a štyrmi opakujúcimi sa jednotkami (alebo asi pätnásť monosacharidových zvyškov) ako oligosacharidy s touto dĺžkou inkorporované do glykokonjugátov, sa prejavili ako optimálne imunogenické.

Oligosacharidy môžu byť aktivované spôsobom redukčnej aminácie s nasledujúcou reakciou s bifúnkčnou molekulou, ako je diester, bez toho, aby bol považovaný za obmedzenie. Znázornenie metódy podľa vynálezu je uvedené na obr. 1 a v tabuľke Ľ, ktorá porovnáva metódu opísanú Porrom a spol., 1985, Mol. Immunol. 22: 907 - 919. Čas na aktiváciu pri použití predchádzajúceho postupu bol 7 až 15 dní, podľa predloženého vynálezu bol skrátený na 15 minút. Čas na redukciu podľa predchádzajúceho postupu bol 7 až 14 dní, podľa predloženého vynálezu bol skrátený na 48 hodín. Predložený vynález teda vyžaduje o 12 až 26 dní menej na kompletný priebeh ako proces predchádzajúci. Toto je dôležitá výhoda, pretože vystavenie karbohydrátov zvýšenej teplote, ako je 50 °C, môže viesť k degradácii.

Tabuľka Π

Chemická aktivácia koncovej redukčnej jednotky S. pneumoniae oligosachridov

Parametre Predchádzajúci postup navrhovaný postup zavádzaná skupina Činidlo <pH> teplota aktlvácle doba aktlvácle redukCné Činidlo teplota redukcie doba redukcie výsledný produkt aktlvačný bifunkfiný spacer teplota reakcie reakSná doba výsledný produkt

UClnnosť reakcie

NH_a amonlakálny pufer “C

7-14 dní

Na kyanoborobydrld ’C

7-14 dní ollgo-NHa

SIDEA CsukcínlmldyldlSIDES alebo SIDEA fiter kyseliny adipovej <eukcíninidyl diester kyseliny jantárovej alebo adipove i) ^eC hodiny ollgo-NH—nonoester

25-30 «

NH(CH_a)_aNH_a dlaninoetán (9) 100 “C minút pyrldínbóran sa ”c hodín ollgo-NHčCH_a> »NH_a °C hodiny □119n-NH<CH_a>aNHeonoester

X

Podľa metódy podľa vynálezu je redukčná aminácia koncovej redukčnej skupiny oligosacharidu uskutočnená pri použití molekuly obsahujúcej dve aminoskupiny. Vo výhodnej realizácii vynálezu je redukčná aminácia uskutočnená reakciou daného molámeho množstva oligosacharidu s diaminoetánovým roztokom v 10 x molámom prebytku v 0,2 M KH2PO4 pri pH asi 9 a pri teplote približne 25 až 100 °C a výhodne 100 “C počas asi 1 až 60 minút a výhodne asi 15 minút. Potom môže byť pridané moláme množstvo pyridínbóranu ekvivalentné 25-násobku molárnej koncentrácie oligosacharidu v použitom postupe a re akcia sa uskutoční pri teplote 25 až 100 °C. Výhodne pri 50 °C počas 1 až 72 hodín, výhodne približne 48 hodín.

Výsledný produkt redukčnej aminácie môže potom reagovať s bifúnkčnou molekulou, kde každá funkčná skupina j c schopná reakcie tak s koncovou aminoskupinou aktivovaného oligosacharidu, ako aj s aminoskupinou prítomnou v štruktúre proteínového nosiča. Táto bifúnkčná molekula môže tak poslúžiť vzájomného spojeniu oligosacharidov a proteínového nosiča. Vo výhodnej realizácii vynálezu je touto bifúnkčnou skupinou diester, presnejšie diester kyseliny adipovej, pri ktorom bolo dokázané spojenie s účinnejšou glykozyláciou proteínu. Výhodne sa v špecifickej realizácii vynálezu oligosacharid, podrobený redukčnej aminácii, ako je opísané, ďalej podrobí reakcii so sukcínimidyldiesterom kyseliny jantárovej alebo výhodnejšie adipovej. Táto reakcia môže byť najlepšie uskutočnená s aminovaným oligosacharidom v molámej koncentrácii (ako aminoskupin) ekvivalentnej asi 1 až 5 násobku molárnej koncentrácie SIDEA (alebo SIDES) v roztoku dimetylsulfoxidu (DMSO) pri teplote 0 až 25 °C a výhodne asi 4 °C počas 0,5 až 5 hodín, najlepšie asi 2 hodín. Aktivovaný oligosacharid môže byť potom oddelený zrážaním pri použití 1,4-dioxánu (80 % obj./obj.), ktorý tiež oddelí v supematante prebytok SIDEA (alebo SIDES).

Proteiny, ktoré môžu byť použité podľa vynálezu, zahrnujú proteín, ktorého podanie mladým cicavcom je bez rizika a ktorý’ môže poslúžiť ako imunologický účinný proteínový nosič. V realizácii podľa vynálezu môžu byť použité proteiny bunkového povrchu, membránové proteiny, toxíny a toxoidy. Kritériá pre bezpečnosť budú zahrnovať absenciu primárnej toxicity a minimálne riziko alergickej reakcie. Difterické a tetanické toxoidy úplne spĺňajú tieto kritériá; tieto sú po vhodnej príprave netoxické a výskyt alergických reakcií je prijateľne nízky. Aj keď riziko alergickej reakcie môže by určujúce pre dospelých, je minimálne pre deti. V súlade s ďalšou výhodnou realizáciou vynálezu vhodné proteínové nosiče zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené. Salmonella flagelin, Haemophilus pilín, Haemophilus 15 kDa, 28 - 30 kDa a 40 kDa membránové proteiny, tepelne labilný enterotoxín LTB Escherichia coli, cholera toxín a vírusové proteiny, zahrnujúce proteiny retrovírusu VP7 a respiračný synciálny vírus F a G.

V „nosičovom afekte“ sa stáva slabý antigén naviazaným na silnejší antigén ako nosič (to znamená na heterológny proteín) viac imunogenickým, ako keď bolo prítomný sám. Ak zviera bolo predtým imunizované samotným nosičom, môže byť zviera „primed“ a produkovať zvýšenú imunitnú odpoveď na nosičový antigén, ale tiež na naviazanú hapténovú skupinu. Deti sú pravidelne imunizované tetanickými a difterickými toxoidmi. Tak môžu byť vybavené pre budúcu prítomnosť kapsulámych antigénov konjugovaných s jedným z týchto toxoidov.

Všeobecne, každý heterológny proteín môže poslúžiť ako nosičový antigén. Ale isté bakteriálne toxíny, ako tetanický a difterický, môžu mať navyše výhodu v tom, že sú zložené z dvoch častí, z ktorých jedna (väzbová podjednotka) má vysokú afinitu pre naviazanie na bunkové povrchy buniek cicavcov. Pochopiteľne, konjugácia na takýto „väzbový proteín“ môže dovoliť naviazanému antigénu efektívnejšiu iniciáciu odpovede v bunkách imunitného systému.

Proteínovými nosičmi, na ktoré sú konjugované kapsuláme polyméry, môžu byť prirodzené toxíny alebo detoxifikované toxíny (toxoidy). Tak môžu byť relatívne novými mutačnými technikami produkované geneticky zme

SK 280112 Β6 nené proteiny, ktoré sú antigénne podobné toxínom už netoxickým. Tieto sú nazývané „križovo reaktívne materiály“ (cross reacting materials) alebo CRM, CRM197 je však bezcenný, keďže má jedinú zmenu aminokyseliny vzhľadom na natívny dittencký toxín a imunoligicky sa od neho nelíši.

Konjugácia kapsulámych polymérov s prírodnými toxínmi môže redukovať toxicitu, ale významná toxicita môže byť zachovaná. Tak ďalšia detoxifikácia proteínových toxínov používa formalm, ktorý reaguje s voľnou aminoskupinou proteínov. Reziduálna toxicita môže stále byť zachovaná. Okrem toho je možná spontánna detoxifikácia jednotlivého podielu vakcíny a zachováva sa výsledok spojený s týmto postupom.

Alternatívne môže byť prírodný toxín detoxifikovaný formalínom za vzniku konvenčného toxoidu pred konjugáciou s kapsulámymi polymérmi. Ale prvotné spracovanie formalínom redukuje počet voľných aminoskupín vhodných pre reakciu s redukujúcimi skupinami fragmentu kapsulámeho polyméru, CRM tak majú významné výhody v tom, že nemajú žiadnu toxicitu dokiaľ žiadna z ich aminoskupínnieje obsadená formalínom. Ďalšou výhodou je, že pri práci s CRM neexistuje žiadne bionebezpečnstvo.

V prípade CRMi??, ktorý je imunologický identický s natívnym toxínom, spracovanie s formalínom (aj keď tu nie je nutná detoxifikácia) značne zvyšuje imunologickú odpoveď. Existuje tu domnienka, že je to spôsobené stabilizáciou molekuly proti degradácii mechanizmom látky a/alebo agregácie krížovej väzby (imunogenicita častíc sa zvyšuje s veľkosťou).

Zo všetkých uvedených dôvodov sú tetanické a diflerické toxíny prvými kandidátmi pre proteínové nosiče, ešte sú tu ďalšie, ktoré môžu byť vhodné. Aj keď tieto ďalšie nemusia mať priebeh bezpečnosti objavený pre diftériu a tetanus, môžu tu byť iné neprekonateľné dôvody pre ich použitie. Napríklad môžu byť efektívnejšie ako nosiče, alebo môže byť rozhodujúca ekonomika produkcie. Ďalší kandidáti pre nosiče zahrnujú toxíny pseudomonas, staphylococcus, Streptococcus, pertussis a Escherichia coli.

V špecifickej realizácii vynálezu môžu byť aktivované oligosacharidy pripojené k CRM197 proteínu, ktorý bol čistený takto:

CRM197 produkovaný kmeňom Corynebacterium diphteriae, môže byť oddelený z kultivačného média prechodom bakteriálnej kultúry cez membránu Millipore, vyzrážaním proteínu z filtrátu a čistením CRM197 ionexovou chromatografiou, ako je opísané ďalej. Alternatívne, v podstate čistý CRM197 môže byť získaný metódou známou v odbore.

Aktivované oligosacharidy môžu byť kovalentne naviazané na nosičový proteín za prítomnosti organického rozpúšťadla a prípadne ďalšieho činidla (ako je kondenzačné činidlo) s cieľom podporiť spojenie terminálnych funkčných skupín aktivovaného oligosacharidu k proteínu. V špecifickej, výhodnej realizácii podľa vynálezu, aktivovaný oligosacharid nesúci terminálnu esterovú skupinu môže byť kovalentne naviazaný na voľné aminoskupiny, ktoré sú prítomné na proteínovom nosiči takto:

Aktivovaný oligosacharid môže byť rozpustený v dimetylsulfoxide a potom pridaný do vodného roztoku proteínového nosiča (napríklad, ale bez obmedzenia, do CRM197 v koncentrácii asi 2 mg/ml) tak, že molámy pomer monoester-aktivovaný oligosacharid/celkové aminoskupiny v proteínovom nosiči je asi 1 :2a konečná koncentrácia DMSO je asi 50 % obj./obj. Konjugačná reakcia sa usku točňuje pri 4 °C aj keď je reakcia takmer kompletná počas asi 2 hodín, j c vhodné nechať reakciu prebiehať cez nos s cieľom zvýšiť výťažok reakcie na najvyššie hodnoty pre každý typ špecifického glykokonjugátu. Takto získaný glykokonjugát sa potom čistí gélovou chromatografiou.

Pre syntézu monovalentnej vakcíny môže byť k proteínu konjugovaný oligosacharid získaný z jedného sérotypu baktérie. Pre syntézu multivalentných vakcín môžu byť glykokonjugáty získané pripojením zmesi oligosacharidov, získaných s baktériou rôznych druhov alebo rozdielnych sérotypov, k proteínovému nosiču. Alternatívne, glykokonjugáty získané reakciou jedného typu oligosacharidov s proteínovým nosičom v separátnych reakciách pri použití rôznych oligosacharidov môžu byť zmiešané. Multivalentná vakcína môže obsahovať proteínový nosič, nesúci homogénnu alebo heterológnu populáciu pripojených oligosacharidov.

Uverenie imunogenicity glykokonjugátov produkovaných uvedenou metódou môže byť testované na vhodnom zvieracom systéme skôr, ako budú podané ľuďom. Medzi tieto zvieratá patria (bez obmedzenia na ne) králiky, prasatá, morčatá, myši, potkany alebo kozy. V špecifickej realizácii vynálezu môžu byť králiky (približne 2 kg) podkožné naočkované glykoproteinovými konjugátmi v alebo bez prítomnosti alumíniumfosfátu alebo hydroxidu. Približne 2,5 pg oligosacharidov vytvorí dávku pre 2 kg králika. Liter protilátok potom môže byť hodnotený textom ELISA alebo inou metódou v odbore známou. Napriek tomu, že protilátky vytvárané proti glykokonjugátom podľa vynálezu môžu byť neschopné imunoprecipitácie antigénu, nie sú doporučované na zistenie titrov protilátkovej skúšky, kde je závislosť od imunoprecipitácie.

Vhodným nosným médiom na formulovanie vakcín sú salinický roztok pufrovaný fosforečnanom sodným (pH 7,4) alebo 0,125 M gél fosfátu hlinitého suspendovaný v salinickom roztoku pufrovanom fosforečnanom sodným na pH 6 a iné bežné médiá.

Všeobecne, vakcíny obsahujúce od asi 5 do asi 100 pg, výhodne asi 10 až 50 pg oligosacharidu, sú vhodné na zvýšenie účinnej hladiny protilátok proti kapsulámym polymérom pri mladých teplokrvných cicavcoch. Pochopiteľne, presná dávka bude určená rutinnými experimentmi dávka/odpoveď. Koncentrácia glykoproteínových konjugátov na prípravu vakcín pre deti je zahrnutá v rozmedzí 25 až 200 pg oligosacharidu. Väčšie dávky môžu byť podávané na základe telesnej hmotnosti. Očakáva sa, že niekoľko menších dávok podávaných postupne bude mať vyššie účinky ako rovnaké množstvo konjugátu podané v jednej injekcii.

Vakcíny podľa vynálezu môžu byť podávané teplokrvným cicavcom akokoľvek starým a sú predovšetkým prispôsobené na indukciu aktívnej imunizácie proti systémovým infekciám pri mladých cicavcoch, vyvolanými patogén Haemophilus influenzae typ b, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis a Pseudomonas aeruginosa.

Podľa vynálezu môžu byť vakcíny podávané subkutánne, intravenózne, intramuskuláme, intraperitoneálne, orálne alebo intranazálne. Vakcíny môžu obsahovať glykokonjugát v rozpustenej alebo mikropartikulámej ibime alebo inkorporovaný do mikroguľôčok alebo mikrovezikúl, vrátane lipozómov.

Vo výhodných realizáciách podľa vynálezu sú glykokonjugátové vakcíny namierené proti opuzdreným pato

SK 280112 Β6 génnym baktériám použité na ochranu citlivých jedincov pred rozvinutím infekcií, spôsobených týmito agens. Medzi citlivé jedince sú zaradené deti s nezrelým imunitným systémom, asplenicki jedinci, ako aj ďalší jedinci s oslabeným imunitným systémom alebo chronickou chorobou, predovšetkým syndrómom imunodeficiencie (AIDS), hematopoetickou malignitou, diabetom, chronickými srdcovými chorobami, chronickými pľúcnymi chorobami a kosáčkovitou anémiou. Glykokonjugáty podľa vynálezu, podľa sily ich konjugácie na proteínový nosič, zvyšujú iminogenicitu oligosacharidov, ktoré nesú.

Tak môžu byť glykokonjugáty podľa vynálezu použité v očkovaní s cieľom získať ochranu proti infekcii ktoroukoľvek z baktérií, ktorá vlastní polysacharidové puzdro, zahrnujúcou Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus a Pseudomonas aerugenosa. Kmene 5. pneumoniae virulentné hlavne u detí, špecifické pre tento vynález, zahrnujú typy 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F,23 a33F.

Vakcíny podľa vynálezu môžu byť použité na indukovanie monošpecifickej a homogénnej imunitnej odpovede. Monošpecifická imunitná odpoveď je spojená s množstvom výhod, zahrnujúcimi do toho poskytovanie protilátok s

i) homogénnou špecifitou, ktorej vlastne všetky protilátky sú namierené proti špecifickému epitopu a sú charakterizované afinitou s konštantnou hodnotou, ii) vysokou afinitou s konštantnou hodnotou s vyššou antibakteriálnou aktivitou, iii) zvýšenou cieľovou špecifitou a absenciou krížovej reaktivity s antigénmi týkajúcimi sa hostiteľa a iv) zníženou aktiváciou komplementu spôsobenou znížením zrážacej aktivity monošpecifických protilátok tiež vedúcou k bezpečnej vakcíne.

Ďalej môže byť predložený vynález použitý na produkciu vakcín, ktoré rozpoznávajú peptidy alebo lipooligosacharidy alebo iné povrchové oligosacharidové haptény naviazané metódami podľa vynálezu na proteínový nosič. Takéto vakcíny môžu byť napríklad použité na indukciu imunity proti nádorovým bunkám, alebo v produkcii protinádorových protilátok konjugovanýchna chemoterapeutické alebo bioaktívne činidlo. Antinádorová aktivita môže byť volaná naviazaním nádor-špecifického antigénu, alebo jeho epitopu, na proteínový nosič použitím metód podľa vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 Všeobecná stratégia syntézy konjugátov oligosacharid-proteín

A. Polysacharidy s vysokou molekulovou hmotnosťou sa kyslo hydrolyzujú za vzniku oligosacharidov s priemernou molekulovou hmotnosťou 2,5 x 10³.

B. Oligosacharidy sú (1) aktivované reakciou s diaminoetánom (FtNÍCFLÉNIty pri pH = 9, redukované pyridínborohydridom i'PyBHi), potom (2) reagujú so sukcínimidyldiesterom kyseliny adipovej (SIDEA) v dimetylsulfoxide (DMSO).

C. Aktivované oligosacharidy sú pripojené k proteínovému nosiču cez lyzínové zvyšky.

Obr. 2 Použitie „na mieru šitého“ spacera v spájacom postupe

A. Glykokonjugát pripravený predchádzajúcim spôsobom, ako je opísané Porrom a spol., (1985), Mol. Immunol. 22: 907 - 919 a amidovým spojením (šípka) medzi oligosacharidom a linkérom štyroch atómov kyseliny adipovej. Celková dĺžka spacera je približne 10,4 °A.

B. Glykokonjugát vytvorený podľa predloženého vynálezu, v ktorom dva uhlíkové zvyšky (šípka, formované diaminoetánom) a amidová väzba existujú medzi oligosacharidom a linkérmi dvoch atómov kyseliny jantárovej, vytvorenými reakciou so SIDES. Celková dĺžka spacera je približne 10 nm.

C. Glykonkonjugát vytvorený podľa predloženého vynálezu, v ktorom dva uhlíkové zvyšky (šípka, vytvorené diaminoetánom) a amidová väzba existujú medzi oligosacharidom a štvoruhlíkovým zvyškom adipovej kyseliny, vytvoreným reakciou so SIDEA. Celková dĺžka spacera je približne 14,5 nm.

Obr. 3 Schopnosť konjugácie CRM197 k aktivovaným oligosacharidom, obsahujúcim spacery kyselina adipová versus kyselina jantárová. Elektroforéza produktov konjugačných reakcií na SĎS-polyakrylamidovom géli (vyfarbené striebrom)

A. Dráha 1 - Štandardy molekulovej hmotnosti (92,5 K,

66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K).

Dráha 2 - CRM197 (1 pg) referenčný.

Dráha 3 - Konjugovaný oligosacharid GA-CRM197 s kyselinou jantárovou ako spacerom (2 g) (pomer 1:1) monoester/celkové aminoskupiny CRM197 v 50 % DMSO).

Dráha 4 - Konjugovaný oligosacharid GA-CRM197 s kyselinou jantárovou ako spacerom (2 pg) (pomer 1 : 2 monoester/celkové aminoskupiny CRM197 v 50 % DMSO).

Dráha 5 - Konjugovaný oligosacharid GA-CRM197 s kyselinou adipovou ako spacerom (2 pg) (pomer 1 : 2 monoester/celkové aminoskupiny CRM197 v 50 % DMSO).

Dráha 6 - Konjugovaný oligosacharid 14-CRM19? s kyselinou jantárovou ako spacerom (2 pg) (pomer 1 : 4 monoester/celkové aminoskupiny CRM₁₉₇ v 50 % DMSO).

Dráha 7 - Konjugovaný oligosacharid 19F-CRM197 s kyselinou jantárovou ako spacerom (2 pg) (pomer 1 : 4 monoester/celkové aminoskupiny CRM197 za neprítomnosti DMSO).

Dráha 8 - Konjugovaný oligosacharid 23F-CRM197 s kyselinou jantárovou ako spacerom (2 pg) (pomer 1 : 2 monoester/celkové aminoskupiny CRM197 v 50 % DMSO).

Dráha 9 - -CRM197 (1 pg) referenčný.

B. Dráha 1 - CRM197 (1 pg) referenčný.

Dráha 2 - CRM197 referenčný (1 pg, rozdielny od dráhy 1).

Dráha 3 - Konjugovaný oligosacharid 23F-CRM197 s kyselinou adipovou ako spacerom (2 pg) (pomer 1 : 2 monoester/celkové aminoskupiny v CRM197 v 50 % DMSO).

Dráha 4 - Štandardy mol. hmotnosti (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K).

Dráha 5 - Konjugovaný oligosacharid 23F-CRM197 s kyselinou adipovou ako spacerom (2 pg) (pomer 1 : 2 monoester/celkové aminoskupiny CRM:M_W7 v 50 % DMSO).

Dráha 6 - CRM197 (Ί pg) referenčný

CRM197 referenčný (1 pg, rozdielny od porovnávacej dráhy 1).

Dráha 7 - Konjugovaný oligosacharid GA-CRM197 s kyselinou adipovou ako spacerom (2 pg).

C. Dráha 1 - Štandardy mol. hmotnosti (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K).

Dráha2 - CRM^U pg) referenčný.

Dráha 3 - Konjugovaný oligosacharid GA-CRM197 s kyselinou adipovou ako spacerom (2 pg).

Dráha 4 - Konjugovaný oligosacharid 14-CRM19? s kyselinou adipovou ako spacerom (2 pg).

Dráha 5 - Konjugovaný oligosacharid 19F-CRMio₇ s kyselinou adipovou ako spacerom (2 pg).

Dráha 6 - Konjugovaný oligosacharid 23F-CRMi₉₇ s kyselinou adipovou ako spacerom (2 pg).

Dráha 7 - Markéry molekulovej hmotnosti (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K, 31,0 K, 21,5 K).

Obr. 4 Králičia IgG odpoveď na konjugáty S. pneumoniae oligosacharid GA-CRM197. Inhibičná ELISA analýza hodnoty afinity IgG izotypu indukovanej kapsulámymi polysacharidmi.

A. Typ GA kapsulámeho polysacharidu

B. Typ GA oligosacharidu (DP= 10) vo voľnej forme alebo konjugovaný k CRMls,?.

C. Typ 14 oligosacharidu (DP = 12) aktivovaný molekulovým spacerom alebo konjugovaný k CRM197.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vývoj multivalentnej vakcíny pneumokokálnych oligosacharidových konjugátov.

1. Príprava polysacharidu

Kapsulámy polysacharid S. pneumoniae typ 14, kapsulámy polysacharid S. pneumoniae typ 19F a kapsulámy polysacharid S. pneumoniae typ 23F boli získané z Američan Type Culture Collection.

2. Hydrolýza polysacharidu

2.1. Hydrolýza polysacharidu S. pneumoniae typ GA

Dva miligramy kapsulámeho polysacharidu typu GA X. pneumoniae boli rozpustené v 1 ml vodného roztoku, obsahujúceho 10 mM kyseliny octovej s pH = 3,4, potom hydrolyzované v zatavených ampulkách ponorených do olejového kúpeľa pri teplote 100 °C počas 30 hodín. Výsledné oligosacharidy boli potom oddelené z reakčnej zmesi chromatografiou cez Sephadex G15 (Pharmacia Uppsala) kondicionovaný 15 mM roztokom NaCl pri pH 7,0 a 4 °C.

Chromatografické eluenty potom boli analyzované postupom podľa Kabata (1964 v „Experimental Immunochemistry“, vyd. Ľ. A. Rabata a Mayer, st. 538 - 541), Chena a spol. (1956, Anál. Chem. 28: 1756 - 1758) a Porroa a spol. (1981, Anál. Biochem. 118: 301 - 306) s cieľom zistiť prítomnosť metyl-pentóz, fosforu a redukujúcich skupín, napr. aldehydových skupín. Analýzou bol zistený pomer metylpentóza/aldehyd 3,96, metylpentóza/fosfor 0,96 a fosfor/aldehyd 4,12.

Gélová chromatografia na Sephadexe G-50 Superfine (Pharmacia) pri použití putra potvrdila distribučnú kon štantu (kd) 0,538 (hexózou), ktorá zodpovedá molekulovej hmotnosti približne 2,500.

NMR, plynová chromatografia a stechiometrická analýza indikujú, že oligosacharidy obsahujú asi 3 až 4 základné opakujúce sa jednotky, medzi ktorými bola nájdená galaktóza, ktorá je imunodominantným cukrom.

2.2. Hydrolýza polysacharidu S. pneumoniae typ 14

Dva miligramy kapsulámeho polysacharidu typu 14 S. pneumoniae boli rozpustené v 1 ml vodného roztoku, obsahujúceho 0,5 M kyseliny trifluóroctovej, potom boli hydrolyzované v zatavených ampulkách ponorených do olejového kúpeľa pri teplote 70 °C počas 7 hodín. Výsledné oligosacharidy boli potom oddelené z reakčnej zmesi chromatografiou na Sephadexe G15 (Pharmacia, Uppsala) kondicionovanom 15 mM roztokom NaCl pri pH 7,0 a 4 °C.

Chromatografické eluenty potom boli analyzované na obsah hexozamínu a aldehydu a zistilo sa, že pomer hexozamínu k aldehydu je 3,17. Plynová chromatografia a stechiometrická analýza indikujú molekulovú veľkosť zodpovedajúcu trom až štyrom základným opakujúcim sa jednotkám. Odstránenie rozvetvenia galaktózy podľa plynovej chromatografie bolo pod 10 %. Gélová chromatografia na Sephadexe G-50 Superfine (Pharmacia) pri použití 15 mM NaCl pri pH 7,0 zistila pre oligosacharidy distribučnú konštantu (kd) 0,30 definovanú ako celková hexóza.

2.3. Hydrolýza polysacharidu S. pneumoniae typ 19F

Dva miligramy kapsulámeho polysacharidu typu 19F

S. pneumoniae boli rozpustené v 1 ml vodného roztoku, obsahujúceho 10 mM kyseliny octovej s pH = 3,4, potom hydrolyzované v zatavených ampulkách ponorených do olejového kúpeľa pn teplote 100 °C počas 39 hodín. Výsledné oligosacharidy boli potom oddelené z reakčnej zmesi chromatografiou na Sephadexe G-15 (Pharmacia, Uppsala) kondicionovanom 15 mM roztokom NaCl pri pH 7,0 a 4 °C.

Chromatografické eluenty potom boli analyzované postupom podľa Kabata (1964 v „Experimental Immunochemistry“, vyd. E. A. Rabat a Mayer, st. 538 - 541), Chena a spol. (1956, Anál. Chem. 28: 1756 - 1758) a Porroa a spol. (1981, Anál. Biochem. 118: 301 - 306) s cieľom zistiť prítomnosť metyl-pentóz, fosforu a redukujúcich skupín, napr. aldehydových skupín. Analýzou bol zistený pomer metylpentóza/redukovaná metylpentóza 3,5 a pomer metylpentóza/fosfor 3,2.

Gélová chromatografia na Sephadexe G-50 Superfine (Pharmacia) zistila oligosacharidovú Kd = 0,46 (celková hexóza) a kombinovaná analýza plynovej chromatografie a stechiometrie potvrdzuje veľkosť zodpovedajúcu trom až štyrom opakujúcim sa jednotkám.

2.4. Hydrolýza polysacharidu S. pneumoniae typ 23F

Dva miligramy kapsulámeho polysacharidu S. pneumoniae typ 23F boli rozpustené v 1 ml vodného roztoku 0,25 M kyseliny trifluóroctovej, potom hydrolyzované v zatavených ampulkách ponorených do olejového kúpeľa pri teplote 70 °C počas 3 hodín. Výsledné oligosacharidy boli potom oddelené z reakčnej zmesi chromatografiou cez Sephadex G15 (Pharmacia, Uppsala) kondicionovaný 15 mM roztokom NaCl pri pH 7,0 a 4 °C.

Chromatografické eluenty potom boli analyzované postupom podľa Kabata (1964 v „Experimental Immunochemistry“, vyd. E. A. Rabat a Mayer, st. 538 - 541), Chena a spol. (1956, Anál. Chem. 28: 1756 - 1758) a Porroa a

SK 280112 Β6 spol. (1981, Anál. Biochem. 118: 301 - 306) s cieľom zistiť prítomnosť metylpentóz, fosforu a redukčných skupín, napr. aldehydových skupín. Analýzou bol zistený pomer hexóza(aldehyd 4,5 - 4,5, pomer hexóza/metylpentóza 2,3 a pomer fosfor/aldehyd 2,9.

Plynovochromatografická a stechioinetrická analýza potvrdzujú prítomnosť medzi 3,5 a 4,5 základnými opakujúcimi sa jednotkami. Odstránenie rozvetvenia rhamnózy bolo podľa plynovej chromatografie menšie ako 9 %.

Gélová chromatografia na Sephadexe G-50 Súperíme (Pharmacia) zistila distribučnú konštantu (Kd) 0,38 (ako hexóza).

Imunochemická charakteristika oligosacharidových hapténov S. pneumoniae.

Schopnosť oligosacharidov typu GA, 14, 19F a 22F S. pneumoniae reagovať s protilátkami namierenými proti intaktným kapsulámym polysacharidom bola testovaná, ako je opísané Porrom a spol. (1985, Mol. Immunol. 22: 907 - 919) použitím techniky, ktorá meria schopnosť hapténu (to znamená oligosacharidu) inhibovať homológne antigény (kapsuláme polysacharidy) v protilátkovej imunoprecipitačnej reakcii (nízka molekulová hmotnosť hapténov nedáva imunoprecipitačnú reakciu pri testovaní na homológne protilátky).

Metóda nazývaná „diferenciálna elektroforéza“ bola uskutočnená takto: doštičkový nosič z plastickej hmoty pre imunoelektroforézu obsahuje tri 1 % (hmotn./obj.) agarózové kompartmenty (Agaroza M-LKB, Bromma, Švédsko). Prvý kompartment obsahuje 0,05 % (obj./obj.) referenčného antiséra ku kapsulámemu polysacharidu. Druhý kompartment obsahuje 0,05 % (obj./obj.) referenčného antiséra ku kapsulámemu polysacharidu, ktorý' bol predtým inkubovaný so známym množstvom referenčného kapsulámeho polysacharidu pri 37 °C počas 15 minút. Tretí kompartment obsahuje 0,05 % (obj./obj.) referenčného antiséra ku kapsulámemu polysacharidu, ktorý bol predtým ínkubovaný so známym množstvom oligosacharidového hapténu. Potom bola uskutočnená elektroforetická separácia kapsulámeho polysacharidu v štyroch pokusoch dvojnásobne riedených roztokov pri 70 V/cm v 20 mM trisbarbiturátovom pufre, pH = 8,8 počas 90 minút Po elektroforéze boli doštičky vyfarbené striebrom, sušené a vyhodnotené. Inhibícia oligosacharidovými molekulami bola zistená pri vyššom „raketovom“ imunozrážaní, ktoré sa objavilo v kompartmente obsahujúcom referenčné antisérum preinkubované s hapténom. Minimálna inhibičná koncentrácia hapténu bola vypočítaná ako h

MIC_Ha =C_Hah_Ha kde C Ha = koncentrácia hapténu skúšaná v géli.

hA_g = úsek na priamke stanovený ako výška získaných ..raketových“ imunoprecipitátov. ak bol v géli referenčný antigén a

h.Ha = úsek na priamke determinovaný výškou „raketových“ imunoprecipitátov, získaných ak bol skúšaný haptén v géli.

Podobne

MICAg ~ Cxg hAg špecifita =

MIC_Hj

Boli testované oligosacharidové haptény s rôznou veľkosťou.

Schopnosť oligosacharidov blokovať imunoprecipitáciu kapsulámych polysacharidov špecifickými protilátkami bola tiež testovaná neelktroforetickou metódou radiálnej imunodefúzie. Podľa tejto metódy inhibícia oligosacharidovou molekulou bola zrejmá z väčšieho polomeru imunoprecipitálu vytvoreného difúziou antigénu (kapsulámeho polysacharidu) 1 % hmotn./obj. agarózou, obsahujúcou špecifickú protilátku dopredu inkubovanú s daným množstvom inhibítora (oligosacharidu). Hneď ako je experimentálne zistená minimálna zlučovacia koncentrácia (Minimal Combining Concentration - MCC), vypočíta sa špecifita podľa uvedeného vzorca:

špecifita = ^MCCa^'

Tabuľka ΠΙ

Imunochemická charakterizácia oligosacharidových hapténov 5. pneumoniae

Ollgosacharld OP HH typ (mc^./nrc_w^j

DIEP

IRIO

6A 2 1.5K lO’^a

3,5 2. 5K 10-^a XQ-»

7. OK W¹

10-⁴

19F

3. 5 2. 2K 10-’

1O-*

23F CH₃C(*)H<hyd> 3

2, 3K 10-’

1Ο-»

4, 5K 1010TFAÍhyd)

4,5 3, 4K 105x10-®

9.5 7. 2K 1O-*

10-»

n. t. = netestované

DIEP = diferenciálna imunoelektroforéza

IRID = inhibícia radiálnej imunodifuzie

MIC = minimálna inhibičná koncentrácia

MCC = minimálna spájacia koncentrácia

Aktivácia koncovej redukujúcej jednotky oligosacharidov S. pneumoniae

Oligosacharidové haptény, získané vyššie, boh rozpustené vo vode na konečnú koncentráciu asi 5 mg/ml. Ku každému roztoku bol na každý mililiter objemu roztoku pridaný 0,1 ml 0,2 M dihydrogenfosforečnanu draselného a pH bolo zvýšené na 9,2 až 9,4 potrebným množstvom diaminometánu (všeobecne je vyžadovaný objem 2 μΐ diaminometánu na každý mililiter roztoku). Zmes bola udržiavaná na 100 °C 15 minút. Po tomto čase bolo pridané množstvo asi 4 pl pyridmbóranu na každý mililiter objemu roztoku. pH bolo upravené na 9,2 IN hydroxidom sodným. Zmes potom bola prenesená v zatavenej ampulke do olejového kúpeľa udržiavaného na 50 °C počas nasledujúcich 48 hodín. Potom bol aminoaktivovaný oligosacharidový roztok neutralizovaný IN HC1 a čistený na Sephadexe G-15 Súperíme (15 mM NaCl. pH 7,01). Oddelené chromatografické frakcie boli spojené do DMSO na koncentráciu 10 mg/ml a pridaný k molámemu množstvu SIDEA (alebo SIDES), zodpovedajúcemu 5 : 1 mol/mol pomeru vzhľadom na množstvo aminoskupín prítomných v lyofilizovanej zlúčenine. Reakcia prebiehala pri teplote miestnosti počas 4 hodín a potom bola pridaná k roztoku 4 objemu 1,4-dioxánu (konečná koncentrácia 80 %) v 1,4-dioxáne) s cieľom vyzrážať ester aktivovaného oligosacharidu. Zrazenina oddelená odstre dením bola premytá trikrát 1,4-dioxánom a udržiavaná pri teplote -20 °C alebo nižšej ako bola použitá teplota v konjugačnom procese. Výťažok aktivačného procesu pre každý zo štyroch oligosacharidov je uvedený v tabuľke IV.

Tabuľka IV

Aktivácia oligosacharidu S. pneumoniae: výťažok procesu (% hmotn./hmotn.)

Serotyp	ollgo-NH(CHa:	oHqa-NHCCHaJJVHa- -nionoester	všeobecne
6A	75	93	70
14	73	90	E7E
19F	1DO	100	1OO
23F	50	90	45
Xg(is.od.:	> 74.5(+20)	9.3. 3<±4. 7)	7O(±23>

Konjugácia aktivovaného oligosacharidu k CRM197 proteínu.

Príprava proteínu

CRM_W7 produkovaný Corynebacterium diphteriae C7 (B**'¹⁹⁷), bol oddelený z kultivačného média molekulárnou filtráciou pri použití membrány Millipore XM-50 (NMWL 5 x 10“⁴). Proteín bol potom vyzrážaný pridaním nasýteného roztoku síranu amónneho k filtrátu (až 65 % hmotn./obj.). Vyzrážaný proteín bol oddelený odstredením a opäť rozpustený v 0,01 M fosfátovom pufre (pH = 7,2).

Ďalšie čistenie CRM497 bolo uskutočnené ionexovou chromatografiou pri použití 2,5 x 100 cm DEAE - Sepharose GB/CL stĺpca (Pharmacia, Uppsala) kondiciovaného v 0,01 M fosfátovom pufre pri pH 7,2, pri použití 0,09 M NaCl v 0,01 M fosfátovom pufre ako elučnom činidle.

SDS elektroforéz na polyakrylamidovom géli pri redukčných podmienkach (Pappenheimer a spol., 1972, Immunochem, 9: 891 - 906) indikuje, že 80 % získaného CRMi r bolo vo svojej natívnej molekulárnej forme. Čistota proteínu bola približne 400 flukulačného limitu (Lf) na miligram.

Konjugácia aktivovaných oligosacharidov

Konjugačný proces spočíva v spájaní monosukcínimidylesterom aktivovaných oligosacharidových hapténov k epsilon-aminoskupine lyzínových zvyškov nosičového proteínu CRM197.

Dimetylsulfoxid, obsahujúci monosukcínimidylesterom (adipovej kyseliny) aktivované oligosacharidy S. pneumoniae typ GA, 14, 19F a 23F kapsulámych polysacharidov, bol potom pridaný k 0,1 M hydrogenuhličitanovému roztoku pH = = 8,0, obsahujúcemu 2 mg/ml CRMi»? pre prípravu, ktorý bol 50 % vo vode a v ktorom je molámy pomer esterom aktivovaného oligosacharidu k nosičovému proteínu 1:2.

Takto získaná zmes bola udržiavaná pri miernom miešaní pri 4 °C počas 15 minút. Oligosacharidy každého zo štyroch sérotypov boli konjugované na proteín v oddelených reakciách. Zhrnutie iýzikálno-chemických charakteristík získaných oligosacharidov je uvedené v tabuľke V.

Tabuľka V

Charakteristika glykokonjugátov

Šerotyp	DP oligci	ΙΊΗ ctllyn	MU konjugáfcu (SDS-PAGE)	50 (mol c»ll<jo/ niril proteín % (hmotn./ hmotn.)	kou j pr ot
	---------.----	—	—------------------------
6A	3	2, ::t.<	77, 6K	7	100
14	5	3. 5K	es. ik	6	1OO
19F	3	1, 9K	09. 2K	4	LDIJ
23F	O	4. 5K	es. čík	5	1OO

Porovnanie účinnosti konjugácie používajúcej ako linkér sukcínimidyldiester kyseliny adipovej a sukcínimidyldiester kyseliny jantárovej.

Aktivované oligosacharidy vzniknuté reakciou so sukcínimidyldiesterom kyseliny jantárovej (SIDES) mali (J o υ w

Štruktúru CI -,ΝΗ-CC CH_a> t) N | ZOtíaľ x // II čo oligosacharidy vzniknuté reakciou so sukcínimídyldiesterom kyseliny adipovej (SIDEA) mali štruktúru o o w / I a získavajú sa nlľi9Osachar:Ld-NHCCH_íD₁.NW-Ci;CH_;?>_<,C..EI-..N __| ^J \’ O tak väzby s rôznymi veľkosťami medzi oligosacharidom a konjugovaným proteínom (pozri obr. 2). Bola hodnotená účinnosť konjugácie používajúcej SIDES a SIDEA aktivované oligosacharidy. Ako je uvedené na obr. 3A, B a C, jedine ak väzba bola odvodená od SIDEA zdal sa byť proteín v úplne glykozylovanej forme (neboli detegované žiadne alebo málo voľných väzieb CRM197).

Imunogenicita glykokonjugátov S. pneumoniae

Bolo pripravených niekoľko prípravkov zo štyroch glykokonjugátov antigénov a testovaných na králikoch (podľa zoznamu uvedeného v tabuľke VI): typovo špecifické glykokonjugáty v monovalentnom prípravku (2,5 pg oligosacharidu na dávku) alebo multivalentnom prípravku (2,5 alebo 5,0 pg každého oligosacharidu na dávku) s a bez hydroxidu hlinitého ako minerálneho adjuvans (len v multivalentnom prípravku bol podávaný v dávke 1 mg). Kompletná absorpcia štyroch glykokonjugátov k hydroxidu hlinitému sa vyskytla pri zvolených podmienkach, keďže spracovanie supematantu multivalentného prípravku buď elektroforézou SDS na polyakrylamidovom géli alebo raketovou imunoelektroforézou nezistilo žiadne detegovateľné množstvo voľného proteínu. Priemerná dávka každého glykokonjugátu obsahuje približne 2,5 pg oligosacharidu a 13 pg proteínu CRM197 toxoidom). Imunizačný súbor zahrnuje primárnu dávku a dve boosterové dávky po 4 týždňoch. Odber}¹ krvi boli uskutočnené v týždni 0., 4., 6. a 10.

Tabuľka VI

Imunizačný súbor pre králiky a myši a dávky vakcín

Imunizácia m týždni O., 4 a R.

odber krvi v týždni U., 4.. ii. .» 111.

A. Rozpustný inunuvalttrniný Cjeden typ) prípravok dávka CO. ň ml); 2,5 jjg olVjoeacliar'ld a ug (S Lf) CRM_ITZ· dávka Cti. S ml) > 5.(1 ug <jllgossachar-i n n |i9 CIC) Lf) CR*1,_W5.

B. Rozpustný pulyvalentný C zines) prípravok dávok <0,5 ml) > 2,5 ug typovo špecifický allgo

CTot « 10 ug ciligo) a celkuvci 52 ug <20 Lf) cRrUv..

C. AlCClH>3-a<lB polyvalnntný (zmes 4 typov) prípravok dávka CU, 5 ml)» 2, Ei ug typovo špecifický oligo

CTot = 1.0 ug oligo) a celkovo 52 U9 <2U Lf)

CRI1_1V> e 1 mg AI COH),,

Tabuľka VH predstavuje RIA (FARR metóda) hodnotené množstvo typovo špecifických protilátok, ako aj počet odpovedí na počet imunizovaných zvierat. Pomer (R) indikuje násobok zvýšenia dosiahnutý pri každej imunizačnej dávke.

Tabuľka VEI predstavuje ELISA titre vyjadrené ako IgG izotyp Ab, ako aj počet odpovedi na počet imunizovaných zvierat. Pomery - R1-R2-R3 znamenajú násobok zvýšenia titrov po každej imunizačnej dávke, zatiaľ čo pomery Ri, -R2, -R3 indikujú násobok zvýšenia v titroch pre danú imunizačnú dávku vzhľadom na pre-titer. Tabuľka IX uvádza kvalitné výsledky ako funkciu indukovaných IgG protilátok v poznávaní polysacharidovej kapsulkv žijúcich streptokokov (Quellung reakcia alebo Nuefeldov test).

Tabuľka X ukazuje neutralizačné titre difterického toxínu indukované pri králikoch proteínovým C'RM.j? nosičom, počas skúšky Vero bunkami. Aj keď ako kontrola bolo použité reľerenčné FDA antisérum, môžu byť tiež titre vyjadrené v μ/ml.

Tabuľka VH

RIA-hodnotené titre* králikov imunizovaných** oligosacharidmi*** S. pneumoniae typ GA, 14, 19F, 23F kovalentne viazaných na nosičový proteín CRM197

Rozpiistná forma forma s prld. AlCllH), týždeň

O 4 6

1.1 βΑ n.d. n.d. 150 4A5 (2/6) <6/6)

n. d. n. d.· 230 195 (1/6) (2/6)

1.91- n.d. ri.d. n.d. 75

C 6/6)

23H n,d. n.d. 400 1411

C L/ίί) C 1/5)

n. d. 536 3.1904,064

C 6/5) (5/6) C 5/5)

R-0 R -1.3

n. d. 77 203216 (3/6) (4/5)C5/5)

R«2. 6 R=l. 1

n.d. 72 10R169 (6/6) (5/5)(5/5)

R»l. 5 R-.1, 7 n-d. 263 n.d.246 (3/6)<5/5) * Dáta vyjadrené ako geometrický priemer titrov v ngNWml. Respondenti vs. celkový· počet zvierat sú v zátvorkách ** Multivalentné prípravky štyroch glykokonjugátov v rozpustnej a Al(OH)3-adsorbovanej fonne (1 mg/dávka forma). Každý glykokonjugát obsahuje priemerne 2,5 pg oligosacharidu s priemerne 13 pg proteinu CRM197. Imunizácia v týždni 0.,

4. a 9. Vykrvácanie v týždni 0., 4., 6. a 11.

*** Typ GA a 19F oligosacharidov má priemer DP = = 3 Typ 14 a23F oligosacharidov má primer DP = 5 **** Glykokonjugát typ GA má priemerný stupeň substitúcie (SD) oligosacharidov na jednotku nosičového proteínu (mol/mol) = 7. SD pre typ 14 glykokonjugátu je 6, pre typ 19F 4 a pre typ 23F 5.

Tabuľka VIH

ELISA výsledky IgG izotypu Ab titrov* indukovaných multivalentnou vakcínou, obsahujúcou glykokonjugáty

5. pneumoniae DP = 3 + 6 kapsulámych oligosacharidov typ GA, 14, 19F, 23F, adsorbované na minerálnu prísadu Al(OH)j

typ	Fre-tl.ter(týždeň 0.	začiatok 1. bijuster > (týždeň 4.) Ct.ýždeň 6.)	2. boast.er C týždeň 11.)
6 A	<50(0/5) Rx>96, Cl	4, 800( 5/5) 51. 200C 5/5) Ra=in. 7 (d<0. Dl) R'»>1,027	130.000(5/5) R3—2, 5 («<0.01> R -3>2. 50(1
14	<50(0/5) R*>7. 2	360(5/5) 4.481X5/5) RÄ=12.4 («<0. 01) R'»>89. 3	19, 000(5/5) R3“4. 4 («<0.01) R'a>39S, 0
19 F	<50(0/5) Ri>41, 6	2,060<5/5> 18,560(5/5) R®=9, 0 («<!), 01) R' a>371.2	35, 200(5/5) Ra-1,9 <«<0. 01) R' ,>704, 0
23F	<50(0/5) Rx>17, 6	880(5/5) 1.280(5/5) R»“l, 5 CoKO.OL) R' »>25, 6	11. «80— R-3-9. 3 (α<0,01) R'»>237.6

* Titre vyjadrené ako geometrický primer recipročnej hodnoty najvyššieho riedenia séra, kde hodnota ABS je dvojnásobná vzhľadom na reakčný základ. V zátvorkách je uvádzaný počet zvierat (respondenti proti celkovo injektovaným).

** Hodnota predstavuje titer, kde neobvykle vysoko respondujú králiky. Vyradením dvoch z piatich imunizovaných králikov, najlepšieho a najhoršieho respondenta, sú získané výsledky zvyšných troch králikov pre sérotyp 23F:

(týždeň 0.) (týždeň 4.) (týždeň 6.) (týždeň 11.)

23F <S(J<Cl/ň) €.87(3/3) 1.33:3(3/3) 2.6(37(3/3)

R»>13, 3 R_a-2. 0 («<0.01) R₃-2.0 <«<O, 01)

R’ _a>26. 7 R^- 3,253. 3

Tabuľka IX

Imunologická funkčnosť králičieho séra Ab proti DP =3-6 oligokonjugovaným k CRM197

Kxívalentná analýza

C potlačenie reakcie* pre kapsulárne zistenie) typ 6A S. pneumoniae t pozitívna reakcia typ 14 S. pneumoniaet pozitívna reakcia typ 19F .S. pneumanlaei pozitívna reakcia typ 23F S. pneumoniaet pozitívna reakcia * Uskutočnené podľa metódy Austriana (1976), Mt. Sinai J. Med. 43:699-709

Tabuľka X

Antidifterické titre* v skúške vero bunkami; indukcia pri králiko imunizovaných multivalentnými glykokonjugátmi syntetizovanými s oligosacharidmi S. pneumoniae kovalentne pripojenými k nosičovému proteínu CRM197

Tabuľka XI

Imunizačný súbor pre králiky

Modely glykokurí jugätou boli lnjektované v dávke 2,5 ug karhahydrátu. Keďže testované modely sa líšia len v dĺžke reťaaá koualentne opojených oligoňacharidav, bolo príslušné množstvo proteínového nosiča»

Pre-tlter zaňiatnk L.booeter 2.t>oociti!r (týždeň D.) (týždeň 4.9 (týždeň 6. > (týždeň U.) dávka kar-- cávka protedncbohydrátu vého nosiča hmotn. pomer < hmotn./hmotn.) (pg) <. M3>

rozpustná forma <10

AlCOH),-ad« <10 <líl

R-2,5

25( (l. 01'3 1. S20( 1. 4

Li/nl) u/ml)

R~77, □

1, 28C 3. «40

DP

3-6

2, 5

12. 5 ollgo-CRTU (Π, 015 n/ml) (2, H u/ml.)

DP - 10-14

R-9. O

2. 5

O. 2

1. □

FDA ref. antisérum obsahuje 6 μ/ml a poskytuje 50 % ochranu pri riedení 1/8000.

* Titre vyjadrené ako recipročná hodnota riedenia, ku ktorému pool antiséra má 50 % ochranu k bunkách, ako je hodnotené ³II-leucínovou inkorporáciou po vystavení buniek difterickému toxínu.

Čísla v zátvorkách znamenajú titre v μ/ml stanovené pri použití FDA referenčného antiséra ako kontroly.

Oligosacharidy s dĺžkou reťazca DP = 10 - 20 sú suboptimálne imunogénne.

Boli syntetizované dve skupiny vakcín glykokonjugátov v súlade so schémou syntézy, opísanou, ale pri použití sacharidov typu GA, 14, 19F a 23F S. pneumoniae s dvoma rôznymi „rozsahmi hodnôt“ dĺžky reťazca a to DP = = 3 - 5 a DP = 10 - 20. Otázkou potom je, či oligosacharid s dĺžkou reťazca DP = 20 alebo viac, bude tiež optimálne imunogénny (pri konjugácii na selektovaný CRM197 proteínový nosič) vo vzťahu k začiatku a zvýšeniu schopnosti v porovnaní s oveľa kratšími reťazcami, ako sú DP = 3 0ligosacharidom.

Králiky boli imunizované podľa protokolu opísaného v tabuľke VI. Ako vyplýva z porovnania výsledkov uvedených v tabuľkách XII a ΧΠΙ, ktoré sa týkajú výsledkov ELISA IgG izotyových antigénnych titrov, indukovaných rozpustnými oligosacharidmi S. pneumoniae s DP = 10 - 14 a DP = 3 - 6, ako aj tými, ktoré sú uvedené v tabuľkách XIV a XV, ktoré sa týkajú výsledkov ELISA IgG titrov izotypových protilátok indukovaných oligosacharidmi S. pneumoniae s DP = = 10 - 14 a DP = 3 - 6, adsorbovaných na A1(OH)3, DP= 10 - 14 nebolo spojené so zvýšením imunogenicity. Faktom je, že vyvolanie a zvýšenie aktivity IgG DP = 3 - 5 oligosacharidovými konjugátmi bolo oveľa väčšie ako aktivita pozorovaná pri použití oligosacharidových konjugátov DP =10-14. Nie náhodou boli všetky štyri skúmané karbohydrátové štruktúry spojené s rovnakými výsledkami. Ďalej, o neutralizácii difterického toxínu glykokonjugátmi s DP = 10 - 14 sa zistilo, že je menej efektívna ako tá, ktorá bola dosiahnutá použitím glykokonjugátov s DP =3-6 (tabuľka XVI). Tak oligosacharidy s dĺžkou reťazca DP = 10 - 20 sú funkčné v konjugátoch podľa predkladaného vynálezu, aj keď oligosacharidy DP =3-6 vyvolávajú vyššie titre protilátok.

Imunizácia v týždňoch 0., 4. a 8.

Tabuľka ΧΠ

Odber krvi v týždňoch 0., 4. a 10.

ELISA výsledky IgG izotypu Ab titrov indukovaných multivalentnou vakcínou, s obsahom glykokonjugátov 5. pneumoniae DP = 10-14 kapsulámych oligosacharidov typ GA, 14,19F, 23F v rozpustnej forme t v r-»

Ej A

1.4

29F

Pre-tlter začiatok

l.boosrter 2.booeter (týždeň 0.) (.týždeň 4.) (týždeň Ľ.) (týždeň 10.) <100 <1OD <100 <100 <1DO

3ťW <100 <100 <100

2400(3/5) <100 <100

500(2/5)

4601X3/5) <100 <100

TabuľkaΧΙΠ

ELISA výsledky IgG izotypu Ab titrov indukovaných multivalentnou vakcínou, s obsahom glykokonjugátov S. pneumoniae DP = 3-6 kapsulámych oligosacharidov typ GA, 14,19F, 23F v rozpustnej forme typ Pre-tlter začiatok l.booster 2.baoster (týždeň D.) (týždeň 4.) (týždeň 6.) (týždeň 11.)

6 A	<50	<200	967<6/6)	8500C6/G)
			R3 =8. Θ ( uŕ	< 0, 01)
14	<50	1800	3266(3/6)	3650(4/6)
1ĎF	<50	<50	675C 4/6)	1750C6/6)
23F	<50	<50	<50	<50

Tabuľka XTV

ELISA výsledky IgG izotypu Ab titrov indukovaných multivalentnou vakcínou, s obsahom glykokonjugátov S. pneumoniae typ GA, 14, 19F 23F adsorbovaných na minerálnu prísadu Α1(ΟΗ μ typ.

Pre-tlter začiatok

l.booster 2.booster (týždeň o.) (týždeň 4.) (týždeň 6.) (týždeň 10.)

6 A	<100	240(5/5)	900(5/5) 500(5/5)
	R t >2. 4	Ra-3. 8 (cŕ	< 0, 01)
		R' a>9, 0
14	<1.00	300(5/5)	1040(5/5) 0460(5/5)
	R L >3. U	Ra-3, 5 (d	< 0. 01) Ra- B, 2 (« < 0, 01)
		R's-žlO, 4	R's>04, 9
19F	<100	<100	400(1/53 800(1/5)
2'3 P	<100	<100	<100 200(1/5)

Tabuľka XV

ELISA výsledky IgG izotyp Ab titrov* indukovaných multivalentnou vakcínou, s obsahom glykokonjugátov S. pneumoniae DP =3-6 kapsulámych oligosacharidov typ GA, 14,19F, 23F, adsorbovaných na minerálnu prísadu A1(OH)₃

typ	Pre-tlter (týždeň 0.:	zaGiatok l.buoster I (týždeň 4.) (týždeň K.)	2 .booSitnr (týždeň 1.1.)
6A	<sn(íi/5) Rx>‘3b. D	4800(.5/5) fil2ÍJ0(S/E> Ka-ll), 7 (a<0. 01) R' -.>1. 027	130000(5/5) 5 (<ť<n, 01.) K' 3>2. tiUO
14	<50<0/5) Ri>7. 2	360(5/5) 441)0(5/5) Ra-12.4 (rt<O, 01) n· *>0’1» g	3.9800(5/5) Ra=4, 4 C«<Ľ1. 01) R' ,>396. 0
19F	<60(0/5) R x >41, 6	2080(5/5) L85S0<5/5) Ri-9,0 (<XO. 01) R' „>371. 2	35200(5/5) 8-,= 1.9 («<□,□!) R'„>704. 0
23l·	<50<0/S) R x >17. 6	1ÄK5/5) 1280(5/5) Ra·!. b <«<□. 01) R'*,>25. 6	11880(5/5) 3 (*<0. 01) R'»>237.6

* Titre vyjadrené ako geometrický priemer recipročnej hodnoty najvyššieho riedenia séra, kde hodnota ABS je dvojnásobná vzhľadom na reakčný základ. V zátvorkách je uvádzaný počet zvierat (respondenti proti celkovo injektovaným).

Tabuľka XVI

In vitro neutralizácia* difterického toxínu sérom králikov imunizovaných S. pneumoniae oligosacharid-CRMi97 glykokonjugátmi typ Pre-tl-t.isr- začiatok l.lioogiter 2 .btitjKtwr (týždeň Cl.) (týždeň 4.) (týždeň 6.) (týždeň 10.)

DP - 3-ŕi oligo-CRH

rozpustný	<1/10	<1/10 (í), 03	<1./20 z/rnl·)	1/1. 20í <2.05 íi/ml)
Al(f)H) „ads	<1/10	1/líl	3/610	1/2, 36'
	<0,016	0/nl)
		(1. 02	pi/ml)	<4.10 0/nú.)
OR «· 111-14
rozpustný	<1/10	<1/10	<1/10	1/10

CC. 016 tf/ml)

Al(()H)„ads	<1/10	<1/10 1/40	1./BC
		<0,06 0/«l)	<0.13 ιβ/ml)

* Titre vyjadrené ako recipročné hodnoty riedenia, ktorých pool králičieho antiséra majú 50 % ochranu k bunkám, hodnotené podľa ’H-leucinovej inkorporácie po vystavení buniek difterickému toxínu. Čísla v zátvorkách vyjadrujú titre v Mg/ml, ako je stanovené FDA referenčným antisérom ako kontrolou.

HPL hodnotené u ľudi: 0,01 pg/ml.

Imunitná odpoveď na glykokonjugáty je monošpecifická a homogénna.

Porovnanie výsledkov uvedených v tabuľke VH a VHI, ktoré sa týkajú protilátkových titrov určených pomocou rádioimunoanalýzy (RIA) a pomocou testu ELISA, odhaľuje, že RIA hodnotené titre boli nižšie ako ELISA hodnotené titre. Tieto pozorovania spoločne s absenciou imunoprecipitátov v agarózovom géli, použitom pre radiálnu imunodifúziu a ,.raketovú” elektroforézovú analýzu anti glykokonjugátového antiséra dokázali, že králičie antiséra k S. pneumoniae oligosacharid-CRMw? konjugáty obsahujú vysokošpecifické IgG izotypové protilátky, ktoré boli nevhodné pre zrážanie vlastných čistených karbohydrátových polyesterov, použitých na generovanie oligosacharidov.

Absencia zrážania protilátok v antisére je indikáciou monošpecifity, to znamená protilátka poznáva len jeden epitop v antigénnom repertoáre danej molekuly (Berzofsky-Schechter, 1981, Molecular lmmunol. 18: 751 - 763). Zrážanie antigén-protilátkových komplexov potrebuje mriežkovú formáciu na generovanie trojrozmernej, rozvetvenej siete spojených molekúl protilátky a antigénu. Kvôli výskytu tohto je požadovaná multivalenčnosť tak protilátky ako aj antigénu, viac ako jedna protilátka musí byť schopná sa naviazať na jednu antigénnu molekulu súčasne. Nedostatok pozorovateľnej imunoprecipitácie, vyskytujúci sa medzi králičím antisérom k S. pneumoniae oligosacharid-CRMi97 konjugátom a homológnym čisteným kapsulámym polysacharidom s vysokou molekulovou hmotnosťou je výrazným indikátorom, že antiséra obsahovali protilátky špecifické pre karbohydrátové polyméry, ako ukazuje ELISA a inhibičná ELISA analýzy, ale riadené len na jeden determint (epitop) polysacharidu.

Okrem prejavovania imunoprecipitačnej aktivity je heterogénna populácia protilátok tiež obyčajne spojená s nasledujúcimi vlastnosťami: jednotlivý epitop antigénu použitý na vyvolanie protilátkovej odpovede nemôže kompletne inhibovať väzbu celej populácie protilátok na kompletný antigén, ale bude inhibovať len tie protilátky', ktoré sú naviazané na jeden epitop, nechávajúc ostatné protilátky voľne sa naviazať na zvyšné epitopy prítomné na kompletnom antigéne. Populácia protilátok môže byť hodnotená vďaka heterogenite ELISA-inhibičnou skúškou. V tejto skúške je meraná schopnosť populácie protilátok viazať sa na kompletný antigén za prítomnosti inhibítora väzby antigén/protilátka tak, ako izoluje epitopy antigénu. Znázornené graficky, keď väzba protilátky na značený kompletný antigén je meraná za prítomnosti zvýšenej koncentrácie neznačeného kompletného antigénu a je generovaná sigmoidálna krivka, ktorá môže byť použitá ako štandardná krivka pre väzbu antigén/protilátka. Keď je populácia protilátok heterogénna, väzba medzi protilátkou a kompletným antigénom môže byť úplne inhibovaná pridaním jedného antigénneho epitopu a štandardná krivka väzby antigén/protilátka je len čiastočne posunutá (čiastočne presahujúca alebo čiastočne paralelná) ako iné interakcie antigén/protilátka, zrejmé zo spojenia s testovanými epitopmi, prevažuje. Opačne, väzba homológnej populácie protilátok na antigén môže byť úplne inhibovaná pridaním izolovaného epitopu; štandardná väzbová krivka antigén/protilátka pre homológnu populáciu protilátok bude presahujúca alebo paralelná ku krivke generovanej pridaním izolovaného epitopu, zodpovedajúcemu populačnej špecifite.

Experimentálne, testovaním S. pneumoniae glykokonjugáty indukovali IgG týmto spôsobom, bola pozorovaná afinita vzorky, zodpovedajúcej tej, ktorá bola predpokladaná pre homogénnu populáciu protilátok (obr. 4). Oligosacharid GA S. pneumoniae (buď v konjugovanej alebo v nekonjugovanej forme) bol spojený sigmoidálnou krivkou väzbovej inhibicie približne paralelnou s krivkou získanou použitím sérotypu GA kapsulámeho polysacharidu s vysokou molekulovou hmotnosťou. Ako bolo očakávané, hete13 rológny (typ 14) oligosacharid, v buď voľnej (linkéraktivovaná), alebo konjugovanej forme, neinhiboval IgG izotypovú populáciu špecifickú pre typ GA antigénu.

Claims (7)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob prípravy kovalentného konjugátu oligosacharidu a nosičového proteínu, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje nasledujúce stupne: i) reakciu oligosacharidu, majúceho terminálnu redukujúcu sa skupinu s diaminoetánom za prítomnosti pyridínbóranu, takže prebieha reduktívna aminácia a ii) reakciu animovaného oligosacharidového produktu z odseku i) s molekulou obsahujúcou dve funkčné skupiny, z ktorých jedna je schopná reakcie s terminálnou skupinou aktivovaného oligosacharidu a druhá je schopná reakcie s uvedeným nosičovým proteínom a iii) reakciu aktivovaného oligosacharidového produktu z odseku ii) s uvedeným nosičovým proteínom, takže dochádza k spojeniu.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že reduktívna aminácia sa uskutočňuje pri teplote asi 100 °C.

3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že reakcia s pyridínbóranom sa uskutočňuje pri teplote asi 50 °C.

4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že molekula obsahujúca dve funkčné skupiny zo stupňa ii) je diester.

5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že molekula obsahujúca dve funkčné skupiny zo stupňa ii) je diester kyseliny adipovej alebo diester kyseliny j antárovej.

6. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3, 4 alebo 5, vyzná č u j ú c i sa tým, že oligosacharid je odvodený od Streptococcus pneumoniae kapsulámeho polysacharidu.

7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že oligosacharid je odvodený od Sirepíococcus pneumoniae, selektívneho sérotypu vybraného zo skupiny zahrnujúcej typy 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F,. 18C, 19A, 19F, 20,22F, 23F a 33F.