HU211210B - Method for preparing immunogenic oligosaccharide-protein-conjugates - Google Patents

Description

A találmány tárgya tökéletesített eljárás bakteriális tokpoliszacharidból származó oligoszacharidok és proteinek konjugátumainak előállítására, melyek immunogén tulajdonságúak. A találmány szerinti eljárással előállított oligoszacharid-konjugátumot tartalmazó vakcinák monospecifikus és homogén immunválaszt adnak tok-poliszacharidokra. A találmány szerinti eljárás egy specifikus kiviteli módja szerint olyan oligoszacharidkonjugátumokat állítunk elő, amelyek a Streptococcus pneumoniae elterjedt szerotípusaival szemben indukálnak immunitást, aminek különös jelentősége lehet mind a gyermekgyógyászatban, mind az idős betegek gyógyításában, valamint a legyengülés vagy betegség miatt csökkent immunitással rendelkező betegek (például AIDS-es páciensek) esetében.

A pneumococcus (Streptococcus pneumoniae) egy Gram-pozitív, tokos coccus, amely rendszerint párosával vagy rövid láncokban helyezkedik el. A diplococcusok nem szabályos gömb alakúak, hanem egymás felé tekintő végük lekerekített, míg az ellenkező végük kihegyezett, ezáltal az egyes coccusok lándzsához hasonlítanak.

A pneumococcusokat a tokjukat alkotó komplex poliszacharidok alapján oszthatjuk szerotípusokra. 84 szerotípust azonosítottak, típus-specifikus antiszérummal, Neufeld-féle reakcióval. Mind patogén az emberre nézve, de az 1-es, 3-as, 4-es, 7-es, 8-as és 12-es típusok fordulnak elő leggyakrabban a klinikai gyakorlatban. A 6-os, 14-es, 19-esés 23-as típus gyakran okoz pneumóniát és középfülgyulladást gyermekekben, de felnőttekben ritkábban fordul elő [Austrian: Harrison’s Principles of Internál Medicine, szerk. Petersdorf és munkatársai, 10. kiadás, McGraw Hill Book Co., New York, 918-922. oldal (1983)]. Figyelemreméltó, hogy a pneumococcus egyike azon három elsődleges kórokozónak, amelyek gyermekekben pneumóniát, szepszist és meningitist okoznak [McMillan: Core Textbook of Pediatrics, szerk. Kaye és munkatársai, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, 498. oldal (1982)].

A krónikus szisztémikus betegségekben, például szívbetegségben, bronchopulmonáris betegségben, májbetegségben, veseelégtelenségben vagy rákban szenvedő betegek esetében az átlagosnál nagyobb a pneumococcusos fertőzések kifejlődésének veszélye. Az ilyen betegek esetében javallott a pneumococcus fertőzések elleni vakcinálás. E célra 23 vakcina kapható (Pneumovax^R, Merck, Sharpé & Dohme, és Pnulmmun^R, Lederle Laboratories), amelyek az 1-es, 2-es, 3-as, 4-es, 5-ös, 6B, 7F, 8-as, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14-es, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20-as, 22F, 23Fés 33F típusú pneumococcusok tok-poliszacharidjait tartalmazzák (ezek a szerotípusok vagy csoportok okozzák az Amerikai Egyesült Államokban és a világ többi részén is a súlyos pneumococcusos fertőzések 90%-át). A fenti vakcinák hatásossága kisgyermekek esetében kérdéses, mivel 6 évnél fiatalabb gyermekekben a különféle tok-antigénekre adott immunválaszadási képesség eltérő időkben fejlődik ki, az immunrendszer érettségi fokának megfelelően, és a védettség rövidebb ideig tarthat, mint amit felnőttekben megfigyeltek [Harrison és munkatársai, ibid.]. Noha feltehetőleg csak viszonylag kis számú pneumococcus szerotípus okozza a gyermekek pneumococcusos fertőzéseinek többségét [Gray és munkatársai, J. Infect. Disease 140, 979-983 (1979)], ezek azok közé a típusok közé tartoznak, amelyek esetében a tisztított tok-poliszacharidokat tartalmazó vakcinákra adott humán antitest-válasz kifejlődése a leglassabb [Anderson és Betts, Pediatric Infec. Dis. J. 8, 50-53 (1989); Borgono és munkatársai, Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 157, 148-154 (1978)].

Gyermekek Haemophilus influenzáé b-vel szembeni immunválaszadását úgy érték el, hogy a tok-antigén hordozó-proteinekhez kapcsolásával ún. konjugált vakcinát állítottak elő. Feltételezték, hogy a hordozó-proteinek által indukált segítő T-limfocita hatások felelősek az immunitás kifejlődéséért [Robbins és munkatársai; Bacterial Vaccines, szerk. Germanier, Academic Press, New York, 289-316. oldal (1984); valamint Cruse és Lewis: Conjugate Vaccines, szerk. Cruse és Lewis, Karger, Basel, 1-10. oldal (1989)]. Hasonló megoldást választottunk a pneumococcus elleni vakcinák előállítására is.

Többen izoláltak és tisztítottak már sértetlen tokpolimereket, amelyek vakcinákban vagy vakcinaként használhatók. így például a 4 220 717 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban eljárást ismertetnek immunológiailag aktív poliribozil-ribitolfoszfát (PRP) izolálására és tisztítására H. influenzáé b tok-polimerjéből. A 4 210 641 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban H. influenzáéból poliszacharid extraktumokat állítanak elő, amelyek látszólagos móltömege 200 000 daltonnái nagyobb, és alapvetően galaktózból, glükózból és mannózból állnak, valamint kis mennyiségben ozamint tartalmaznak.

Több kutató alkalmazta már a fenti és más sértetlen tok-polimereket különféle készítményekben, fokozott immunválasz kiváltására. így például a 4 196 192 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek egy tisztított, sértetlen PRP-t tartalmazó vakcinát és egy Bordatella pertussis teljes sejt vakcinakészítményt. Az immunogenitás fokozására irányuló fenti megoldással megnövelték fiatal állatokban az anti-PRP és anti-pertussis koncentrációját.

A hordozó-proteinek nemcsak a konjugált tokpolimerek immunogenitásának növelésére alkalmasak; a hapténeket is képesek immunogénné tenni. A haptének olyan molekulák, amelyek antitestekhez vagy limfocita receptorokhoz képesek specifikusan kötődni, de önmaguk nem indukálnak immunválaszt (azaz nem immunogének). Immunválasz kiváltásához a kis méretű vagy kis móltömegű vagy gyengén immunogén molekulákat - amelyeket hapténeknek nevezünk - először általában nagyobb molekulához, vagy hordozóhoz kell kapcsolni, ami rendszerint egy heterológ protein. A hapténhordozó-komplexet állatba injektálva megnövekedik az B-limfociták antitest-termelése, amelyek közül némelyik képes specifikusan kötődni a szabad, hordozóhoz nem kapcsolt haptén molekulával.

A legkorábban tanulmányozott haptének között említhetjük az azofestékeket, például az anilint és az

HU 211 210 Β o-amino-benzoesavat. Landsteiner és Lampl [Z. Immun. Forsch. 26, 293 (1918)] ezeket a vegyületeket diazotálással kapcsolták szérum-proteinekhez. Az így előállított, mesterséges azo-proteineket nyulakba injektálva azokban precipitáló antitestek keletkeznek, amelyek a kapcsolódó szintetikus molekularészekre specifikusak.

A haptén vegyületekre másik példa a dinitro-fenol, amely akkor válik immunogénné, ha a dinitro-fenilcsoportot (DNP) marhaszérum-albuminhoz vagy marha-gamma-globulinhoz (BGG) és lizergsav-dietilamidhoz kapcsolják. Még a formaldehid is rendelkezik haptén-tulajdonsággal; a laboratóriumokban előforduló vagy valamely termékből származó formaldehid-gőzöknek kitett személyek „érzékennyé” válnak erre a vegyületre, miután endogén makromolekuláik in vivő formileződnek.

A haptén tulajdonság nem korlátozódik a kis szerves molekulákra, a polipeptid hormonok - még az inzulin-méretűek is - gyakran csak kevéssé, vagy egyáltalán nem immunogének. Ahhoz, hogy ezekre a hormonokra magas antitest-titert kapjunk, hordozó molekulával kell kapcsolni ezeket (vagy több polipeptidet keresztkötéssel összekapcsolva kell nagyobb molekulákat kialakítani).

A hordozó molekula szerepe különösen érdekes, mivel a hordozó szerepe nem korlátozódik pusztán a transzportra. Ovaiy és Benaceraff [Proc. Soc. Bioi. Med. 114, 723 (1963)] ezt úgy mutatták ki, hogy nyulakba DNP-BGG-t injektáltak. Számos immunogén anyag állatba injektálva immunológiai „emlékezést” vált ki beavatkozásra. Ha később egy második injekciót adunk, sokkal erősebb immunválaszt fog kiváltani. Valóban azt tapasztalták, hogy ha az állatba újra DNPBGG-t injektáltak, erős, másodlagos immunválaszt kaptak, amelynek következtében mind a DNP, mind a BGG elleni antitestek szintje jelentősen megemelkedett. Azonban ha a második injektálást DNP-tojásalbuminnal végezték, sokkal gyengébb anti-DNP antitestválaszt kaptak. Az immunválaszok közötti különbség az ún. hordozó hatásnak tulajdonítható, és valószínűleg kapcsolatban van a segítő T-limoficitákkal.

Előzetes bizonyítékok vannak arra, hogy minden protein nem lehet azonosan hatásos hordozó protein egy adott haptén számára. Robbins és munkatársai [Infect. Immun. 40, 245-256 (1983)] protein-poliszacharid-konjugátum vakcinákkal kapcsolatos kísérleti adatokat közöltek, amelyekben ugyanazt a poliszacharid haptént különböző hordozó proteinekkel kapcsolták össze, és mérték a hapténre adott antitest-választ. Jelentős különbségeket észleltek a termelődött anti-haptén antitest mennyiségében, ami a hordozó fontos szerepét jelzi.

A pneumococcusok elleni vakcinákat illetően Lin és Lee [Immunology 46, 333 (1982)] tanulmányozták felnőtt és fiatal egerek immunválaszát 6A és 19F típusú poliszacharidokra, valamint proteinnel konjugált 19Fre. Jelentősen nagyobb IgM és IgG2 antitest titereket kaptak a 19F poliszacharid-protein konjugátumokkal kezelt egerekben, mint a kontrollcsoportban, amelyet csak 19F poliszachariddal kezeltek.

Más kutatók a tok-polimerek hordozó proteinekhez való kapcsolását tanulmányozták abból a célból, hogy fokozzák az antitest képződést az ún. hordozó hatás által. Például Schneerson és munkatársai [Journal of Experimental Medicine 152, 361-376 (1980)] H. influenzáé b polimer-protein konjugátumokat ismertetnek, amelyek a H. influenzáé b által okozott invazív betegségekkel szemben adnak immunitást. A tanulmányban dokumentálták a tok-polimerek életkor-függő immunológiai viselkedését is csecsemők esetében, és úgy próbálták ezt az életkor-függést kiküszöbölni, hogy a sértetlen tok-polimert különféle proteinekkel, például szérum-albuminnal, Limulus polyphemus hemocianinnal és diftéria toxinnal kapcsolták. A kapcsoláshoz kötőszert, például adipinsav-dihidrazidot használtak.

Geyer és munkatársai [Med. Microbiol. Immunoi. 165, 171-288 (1979)] bizonyos Klebsiella pneumoniae tok-poliszacharid fragmentumokból állítottak elő konjugátumokat úgy, hogy a poliszacharidot reduktív aminálással nitro-fenil-etil-amin kötőszerhez kapcsolták, és az így kapott cukorszármazékot azo-kapcsolással proteinekhez kapcsolták.

A 4 057 685 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (bejelentés napja: 1974. 05. 09.) Mclntire halogén-savhalogeniddel kovalensen protein antigénhez kapcsolt, csökkent toxicitású Escherichia coli lipopoliszacharidot ismertet.

A 4 356 170 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (bejelentés napja: 1981. 05. 27., megadás napja: 1982. 10. 26.) Jennings és munkatársai poliszacharid-protein-konjugátumok előállítását ismertetik, reduktív aminálással.

Anderson [Infection and Immunity 39, 233-238 (1983)] Haemophilus influenzáé b tok-poliszacharidból származó oligoszacharidok és CRM₁₉₇ (nemtoxikus protein, amely antigén tulajdonságát tekintve azonos a diftéria toxinnal) kapcsolásával előállított konjugátumokat ismertet.

Snippe és munkatársai [Infection and Immunitiy 42, 842-844 (1983)] 3-as típusú Streptococcus pneumoniae elleni félszintetikus vakcinát ismertetnek, amelyben az S3 tok-poliszacharid részleges savas hidrolizátumából izolált hexaszacharidot reduktív aminálással sztearil-aminhoz kapcsolták, majd liposzómákba beépítették. Az így kapott konjugátum/liposzóma vakcina a vizsgálatok szerint egérben 3-as típusú S. pneumoniae elleni védelmet vált ki.

A 4 663 160 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (bejelentés napja: 1983. 03. 14., megadás napja: 1987. 05. 05.) Tsay és munkatársai olyan konjugátumokat ismertetnek, amelyekben egy Gram-negatív baktériumból származó detoxikált poliszacharidot egy ugyanezen Gram-negatív baktériumfajból származó detoxikált proteinhez kapcsolnak egy 4—12 szénatomos csoport alkalmazásával.

A 4 619 828 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (bejelentés napja: 1984. 01. 05., megadás napja: 1986. 10. 28.) Gordon és munkatársai olyan konjugátumokat ismertetnek, amelyeket patogén baktériumokból - például Haemophilus influenzáé b,

HU 211 210 Β

Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis és Escherichia coli - származó poliszacharid-molekulák és T-sejt dependens antigének, például diftéria és tetanusz toxoidok kapcsolásával nyernek.

A 4 808 700 számú amerikai egyesült államokbeli 5 szabadalmi leírásban (bejelentés napja: 1984. 10. 10., megadás napja: 1989. 02. 28.) Anderson és Clements, a 4 761 283 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (bejelentés napja: 1986. 03. 28., megadás napja: 1988. 08. 02.) Anderson ismertették a tokpolimer fragmentumok kovalens kapcsolását bakteriális toxinokhoz, toxoidokhoz, vagy kötő alegységekhez, reduktív aminálással.

A 4 711 779 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (bejelentés napja: 1986. 07. 02., megadás napja: 1987. 12. 08.) Porro és munkatársai háromféle immunogén aktivitással rendelkező glikoprotein-konjugátum vakcinákat ismertetnek, amelyek antigén meghatározói egy Gram-pozitív baktériumból és egy Gram-negatív baktériumból származó tok-poliszacharidokból valamint CRM₁₉₇-ből, tetanusz toxoidból vagy pertussis toxinból származnak.

A konjugált vakcinák előállításához - amelynek során tok-poliszacharid hapténeket hordozó proteinekhez kapcsolnak - általánosan az alábbi műveletek szükségesek:

(i) elő kell állítani a tok-poliszacharidokat, (ii) ha a poliszacharid csak egy fragmentumát akarják felhasználni, azt el kell választani a sértetlen poliszacharidtól, (iii) a szacharidot aktiválni kell, vagy a kapcsolásra alkalmassá kell tenni, azaz ki kell alakítani olyan molekularészeket, amelyek képesek proteinekkel kovalensen kötődni, (iv) a szacharidot a proteinnel össze kell kapcsolni.

A fenti négy lépés végrehajtására a szakirodalomból számos módszer ismert, amelyeket az I. táblázatban foglaltunk össze.

/. táblázat

Irodalom	Poliszacharid előállítása	Poliszacharid hasítása	Poliszacharid aktiválása	Proteinhez kapcsolás
US 4 356 170(Jennings)			peijódsavat alkalmaz aldehidcsoportok kialakítására	reduktív aminálás ciano-bórhidrid alkalmazásával
US 4 663 160(Tsay)			perjódsavat alkalmaz aldehidcsoportok kialakítására	1) 4-12 szénatomos maradékot kötnek a proteinhez, kondenzálószer, pl. karbodiimid jelenlétében 2) a poliszacharidot a 4-12 szénatomos maradékkal derivatizált proteinhez kötik Schiff-bázis reakcióval, redukálószer, pl. ciano-bór-hidrid jelenlétében
US 4 619 828 (Gordon)		poliszacharidot hőkezeléssel 200 0002 000 000 dalton móltömegűvé alakítjuk	*bróm-cián	*4-8 szénatomos „spacer” hídon keresztül kapcsolva, mintha a protein adipinsav-hidrazidszármazék formájában lenne
US 4 808 700 (Anderson és Clemens)		a legalább egy redukáló véggel rendelkező antigén-fragmenseket többféle módon állítják elő, pl. peijodátos korlátozott oxidatív hasítással, glükozidázokkal hidrolizál va vagy savas hidrolízissel	kapcsolás reduktív aminálással, ciano-bór-hidrid jelenlétében (kb. 2-3 hét)
US 4 808 700 6.5 fejezete S. pneumoniae tok-polimer fragmentum kapcsolása CRM] 97-hez	dán 6A típusú, Eli Lilly Co.	redukáló fragmetumok kialakítása savas hidrolízissel 0,1 n HCl-ban, 10 percen át, 100 ’C-on	CRMj97-tel kapcsolás foszfát pufferben, ciano-bór-hidrid alkalmazásával, 18 napon át, 37 ’C-on
US 4 711 779 (Porro és Constantino)		savas hidrolízis 100’C-on 6-40 órán át. Megfelelő haptének móltömege 1000-2000 dalton	aktiválás: primer aminocsoportok bevitele a terminális redukáló csoportokba (pl. nátrium-ciano-bór-hidridet alkalmazva), majd észterré alakítás (pl. adipinsavszármazékok jelenlétében	toxoidhoz kapcsolás szerves oldószer, pl. dimetil-szulfoxid jelenlétében
6A típusú S. pneumoniae-ra alkalmazva		savas hidrolízis 100 *C-on 39 órán át	aktiválás: ammóniás pufferben, nátrium-ciano-bór-hidrid jelenlétében (primer aminocsoportok bevitelére) 2 héten át; monofunkciós észterré alakítás adipinsav-diszukcinimidil-észtert tartalmazó vizes dimetil-szulfoxid-oldatban 4 órán át	CRM 197-hez kapcsolás dimetilszulfoxid jelenlétében, szobahőmérsékleten, 15 órán át

HU 211 210 B

A találmány tárgya új eljárás bakteriális tok-poliszacharidokból származó oligoszacharidok hordozó proteinekhez való kovalens kapcsolására.

A találmány szerinti eljárás új vonása, hogy az oligoszacharid komponens (és nem a protein komponens) aminálására diamino-etánt alkalmazunk, és ezt egy diészter kötőmolekulával kombinálva alkalmazzuk a konjugátumok kialakítására. A szakirodalomban sehol nem említik ezt a kombinációt. Ezenkívül a diészter reagens alkalmazása a diamino-etánnal kombinációban biztosítja azt, hogy a kapcsolási reakcióval a glikokonjugátumok szintézise hatékonyan, az ismert eljárásokhoz viszonyítva jelentősen nagyobb sebességgel és hozammal megy végbe. A találmány szerinti eljárással előállított glikokonjugátumok vakcina készítményekben alkalmazhatók, és vizsgálataink szerint immunogén tulajdonságúak.

A találmány értelmében a monospecifikus és homogén immunválasz kiváltására alkalmas, vakcina hatóanyagaként alkalmazható, egy bakteriális tok-poliszacharidból származó oligoszacharid és egy hordozó protein kovalens konjugátumát úgy állítjuk elő, hogy (i) egy terminális redukáló csoportot tartalmazó oligoszacharidot diamino-etánnal pH 9-9,4 értéken, 25100 °C-on 1-60 percen keresztül, majd piridin-boránnal 25-100 ’C-on 1-72 órán keresztül reagáltatva reduktívan aminálunk, (ii) a kapott aminált oligoszacharidot az aminocsoportra vonatkoztatva 5:1 mólarányban adipinsav vagy borostyánkősav diészterével, mint két funkciós csoportot tartalmazó molekulával reagáltatjuk, amely funkciós csoportok egyike az aktivált oligoszacharid terminális csoportjával, a másik a hordozó proteinnel képes reagálni, és (iii) a kapott aktivált oligoszacharidot a hordozó protein aminocsoportjára vonatkoztatva 1:2 mólarányban a proteinnel reagáltatva egy lizin-maradékon keresztül összekapcsoljuk.

A találmány szerinti eljárás egyik megvalósítási módja szerint Streptococcus pneumoniae tok-poliszacharidokból származó oligoszacharidok beépítésével állítjuk elő a glikokonjugátumokat. A találmány szerinti eljárással hatékony módon, nagy hozammal előállított S. pneumoniae glikokonjugátumok vakcina készítményekben alkalmazhatók, amelyeknek fokozott jelentősége van a gyermekgyógyászatban, mivel a gyermekbetegségek döntő többsége S. pneumoniae fertőzéssel kapcsolatos. Az immunogén konjugátumok vizsgálataink szerint kevésbé életkor-függőek, mint a tok-polimerek önmagukban, ezért igen fiatal melegvérű emlősök aktív immunizálására is alkalmazhatók a megfelelő tokos baktériumok által okozott szisztémás fertőzések ellen.

A találmány szerinti eljárással előállított glikokonjugátumok meglepő módon monospecifikus és homogén immunválaszt váltanak ki, ezáltal az autoimmun reakciók és az egyéb, vakcinálás utáni szindrómák kifejlődése előnyösen elkerülhető.

Igen fontos, hogy a találmány szerinti immunogén konjugátumok nem tartalmaznak potenciálisan toxikus kötőszereket, például adipinsav-hidrazidot vagy p-nitro-fenil-etil-amint, amelyeket korábban a szénhidrátok proteinekhez kötésére használtak.

A leírásban használt rövidítések jelentése az alábbi. CRM_I97 nemtoxikus protein, amely antigén tulajdonságait tekintve keresztreaktív a diftéria toxinnal DMSO dimetil-szulfoxid DP polimerizáció foka SD szubsztitúció foka SIDEA adipinsav-szukcinimidil-észter SIDES borostyánkősav-szukcinimidil-észter

Az ábrákat az alábbiakban ismertetjük.

1. ábra oligoszacharid-protein-konjugátumok szintézisének általános stratégiája A a nagy móltömegű poliszacharidokat savval hidrolizáiva 2,5x10³ átlagos móltömegű oligoszacharidokká alakítjuk

B az oligoszacharidokat

1) diamino-etánnal [H₂N(CH₂)₂NH₂] pH 9 értéken reagáltatva aktiváljuk és piridinbór-hidriddel (PyBH₃) redukáljuk, majd

2) adipinsav-szukcinimidil-észterrel (SIDEA) reagáltatjuk dimetil-szulfoxidban (DMSO)

C az aktivált oligoszacharidokat hordozó proteinekhez kapcsoljuk a lizin-maradékon keresztül

2. ábra .Méretes” spacer használata a kapcsolási lépésben

A Ismert módon kialakított glikokonjugátum [Porro és munkatársai Mól. Immunoi. 22, 907-919 (1985)], amelyben egy amidkötés (nyíl) van az oligoszacharid és az adipinsavból származó 4 szénatomos összekötő csoport között; a spacer teljes hossza mintegy 10,4 Á.

B Találmány szerinti eljárással előállított glikokonjugátum, amelyben egy 2 szénatomos maradék (nyíl, diamino-etánból kialakítva) és egy amidkötés van az oligoszacharid és a borostyánkősavból származó 2 szénatomos összekötő csoport között (amelyet SIDES-sel reagáltatva alakítunk ki); a spacer teljes hossza mintegy 10 A.

C Találmány szerinti eljárással előállított glikokonjugátum, amelyben egy 2 szénatomos maradék (nyíl, diamino-etánból kialakítva) és egy amidkötés van az oligoszacharid és az adipinsavból származó 4 szénatomos összekötő csoport között (amelyet SIDEA-val reagáltatva alakítunk ki); a spacer teljes hossza mintegy 14,5 Á.

3. ábra CRM197 kapcsolásának hatékonysága adipinsavból származó spacert tartalmazó oligoszacharidhoz, a borostyánkősavból származó spacert tartalmazóval szemben. Az ábrák a kapcsolási reakciók termékének SDS-poli(akrilamid)-gél-elektroforetikus képét mutatják (ezüsttel festve).

A 1. sáv: móltömeg standardok (92,5 kd,

HU 211 210 Β

66,2 kd, 45,0 kd, 31,0 kd és 21,5 kd

2. sáv: CRM₁₉₇ (1 gg) kontroll

3. sáv: 6A oligoszacharid-CRM₁₉₇ konjugátum borostyánkősav spacerrel (2 gg) (monoészter/CRM₁₉₇ összes aminocsoportjának aránya 1:1, 50%-os DMSO-ban)

4. sáv: 6A oligoszacharid-CRM₁₉₇ konjugátum borostyánkősav spacerrel (2 gg) (monoészter/CRM₁₉₇ összes aminocsoportjának aránya 1:2, 50%-os DMSO-ban)

5. sáv: 6A oligoszacharid-CRM_]97 konjugátum adipinsav spacerrel (2 gg) (monoészter/CRM₁₉₇ összes aminocsoportjának aránya 1:2, 50%-os DMSO-ban)

6. sáv: 6A oligoszacharid-CRM_]97 konjugátum borostyánkősav spacerrel (2 gg) (monoészter/CRM₁₉₇ összes aminocsoportjának aránya 1:4, 50%-os DMSO-ban)

7. sáv: 6A oligoszacharid-CRM_]97 konjugátum borostyánkősav spacerrel (2 gg) (monoészter/CRM_]97 összes aminocsoportjának aránya 1:4, 50%-os DMSO nélkül)

8. sáv: 23F oligoszacharid-CRM₁₉₇ konjugátum borostyánkősav spacerrel (2 gg) (monoészter/CRM,₉₇ összes aminocsoportjának aránya 1:2, 50%-os DMSO-ban)

9. sáv: CRM₁₉₇ (1 gg) kontroll B 1. sáv: CRM_i97 (1 gg) kontroll

2. sáv: CRM_]97 kontroll (1 gg, 1. sávhoz viszonyítva eltérő helyzet)

3. sáv: 23F oligoszacharid-CRM_]97 konjugátum adipinsav spacerrel (2 gg) (monoészter/CRM₁₉₇ összes aminocsoportjának aránya 1:2, 50%-os DMSO-ban)

4. sáv: móltömeg standardok (92,5 kd,

66,2 kd, 45,0 kd, 31,0 kd és 21,5 kd

5. sáv: 23F oligoszacharid-CRM₁₉₇ konjugátum adipinsav spacerrel (2 gg) (monoészter/CRM_]97 összes aminocsoportjának aránya 1:2, 50%-os DMSO-ban)

6. sáv: CRM₁₉₇ kontroll (1 gg, 1. sávhoz viszonyítva eltérő helyzet)

7. sáv: 6A oligoszacharid-CRM|₉₇ konjugátum adipinsav spacerrel (2 gg)

C 1. sáv: móltömeg standardok (92,5 kd,

66,2 kd, 45,0 kd, 31,0 kd és 21,5 kd

2. sáv: CRM₁₉₇ (1 gg) kontroll

3. sáv: 6A oligoszacharid-CRM_t97 konjugátum adipinsav spacerrel (2 gg)

4. sáv: 14 oligoszacharid-CRM_I97 konjugátum adipinsav spacerrel (2 gg)

5. sáv: 19F oligoszacharid-CRM₁₉₇ konjugátum adipinsav spacerrel (2 gg)

6. sáv: 23F oligoszacharid-CRM₁₉₇ konjugátum adipinsav spacerrel (2 gg)

7. sáv: móltömeg standardok (92,5 kd,

66,2 kd, 45,0 kd, 31,0 kd és 21,5 kd

4. ábra Nyúl IgG válasz S. pneumoniae 6A oligoszacharid-CRMi97 konjugátumokra. A tok-poliszacharidokkal indukált IgG izotípus affinitási értékének inhibíciós ELISA analízise A 6A típusú tok-poliszacharid Β 6A típusú oligoszacharid (átlagos DP =

10) szabad formában vagy CRM₁₉₇-tel konjugálva

C. 14-es típusú oligoszacharid (átlagos DP = 10) molekuláris spacerrel aktiválva vagy CRM₁₉₇-tel konjugálva

A találmány tehát bakteriális tok-poliszacharidokból származó oligoszacharidok hordozó proteinekhez való kovalens kapcsolására vonatkozik. A találmány értelmében új glikokonjugátumokat kapunk, egy új eljárással.

A találmányt részletesen az alábbi fejezetek szerint ismertetjük:

(i) Oligoszacharidok előállítása (ii) Oligoszacharidok aktiválása (iii) Oligoszacharidok kapcsolása a proteinhez (iv) Glikokonjugátumok immunkémiai jellemzése (v) Vakcina készítmények és adagolásuk (vi) Pneumococcus oligoszacharid-konjugátum vakcinák alkalmazása

Oligoszacharidok előállítása

A nagy móltömegű tok-poliszacharidokat beszerezhetjük kereskedelmi forgalomból [American Type Culture Collection (ATCC) Rockville, MD, USA] vagy előállíthatjuk Porra és munkatársai eljárása szerint [J. Bioi. Stand. 11, 65-71 (1983)]. Bármely poliszacharid alkalmazható, például a Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzáé, Neisseria meningitidis, Escherichia coli, Salmonella typhi, Streptococcus mutáns, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus és Pseudomonas aeruginosa tok-poliszacharidjai.

A legalább egy redukáló véggel rendelkező antigén fragmentumokat különféle módszerekkel állíthatjuk elő a tok-polimerekből, az adott tok-polimer szerkezeti tulajdonságaitól függően. Perjodáttal (vagy hasonló reagenssel) végzett részleges oxidatív hasítással aldehidvéget alakíthatunk ki; ilyen módszert nem-gyűrűs maradékon vicinális dihidroxicsoportokat tartalmazó polimerek esetében alkalmazhatunk. A glükozidos kötések hidrolízisével redukáló cukor-végződést kapunk. A fenti hidrolízist legspecifikusabban enzimatikusan végezhetjük, glikozidázokkal, de ez a módszer viszonylag kis számú tok-polimerre alkalmazható csak, például a Streptococcus pneumoniae 8 tok-polimeijére, amelyre ismertek glikozidázok. A glükozidos kötést ismert módon savas körülmények között is hidrolizálhatjuk. E módszer alkalmazása abban az esetben korlátozott, ha a polimer savr-aérzékeny nem-glikozidos kötéseket is tartalmaz, vagy ha a polimer az antigén specificitása szempontjából fontos, savra érzékeny oldallánc-kötéseket tartalmaz.

A találmány szerinti eljárás egyik kiviteli formája szerint a 6A típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidot mintegy 10^-2 mól/1 koncentrációjú ecetsavban kb. 100 °C-on kb. 30 órán keresztül; a 14-es típusú S.

HU 211 210 Β pneumoniae tok-poliszacharidot mintegy 10*² mól/1 koncentrációjú ecetsavban kb. 50 ’C-on kb. 48 órán keresztül; és a 23F típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidot mintegy 0,25 mólrí koncentrációjú trifluorecetsavban kb. 70 ’C-on kb. 3 órán keresztül hidrolizáljuk.

A találmány szerinti eljárásban a proteinhez kapcsolandó oligoszacharidok 3-6 ismétlődő egységet (vagy mintegy 10-30 monoszacharid-maradékot) tartalmazhatnak, előnyösen 3-4 ismétlődő egységet (mintegy 15 monoszacharid maradékot) tartalmaznak, mivel az ilyen hosszúságú oligoszacharidok rendelkeznek optimális immunogén tulajdonságokkal glikokonjugátumokba beépítve.

Oligoszacharidok aktiválása

Az oligoszacharidokat reduktív aminálással, majd egy kétfunkciós molekulával - például egy diészterrel - való reagáltatással aktiválhatjuk. A találmány szerinti eljárást vázlatosan az 1. ábra és a Π. táblázat ismerteti, amelyben a találmány szerinti eljárást Porro és munkatársai eljárásával (Mól. Immunoi. 22, 907-919 (1985)] hasonlítjuk össze. Az aktiválás időszükséglete a fenti ismert eljárás szerint 7-14 nap, amely a találmány szerinti eljárásban 15 percre csökken. Figyelemreméltó továbbá, hogy a redukálás időszükséglete az ismert eljárásban 7-14 nap, míg a találmány szerinti eljárásban 48 óra. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárás 12-26 nappal kevesebb időt vesz igénybe, mint az ismert eljárás. Ez nagyon jelentős előny, mivel a szénhidrátok magasabb (például 50 ’C) hőmérsékletnek kitéve bomlást szenvedhetnek.

II. táblázat: S. pneumoniae oligoszacharidok terminális redukáló egységének kémiai aktiválása

Paraméterek	Ismert eljárásban	Találmány szerinti eljárásban
Bevitt csoport	-nh2	-NH(CH2)2NH2
Reagens (pH)	ammóniás puffer (9)	diamino-etán (9)
Aktiválási hőmérséklet	50 ’C	100’C
Aktiválási idő	7-14 nap	15 perc
Redukálószer	Na-ciano-bór- hidrid	piridin-borán
Redukció hőmérséklete	50’C	50’C
Redukció ideje	7-14 nap	48 óra
Termék	oligo-NH2	oligo- NH(CH2)2NH2
Aktiváló bifirnkciós spacer	SIDEA	SIDES vagy SIDEA
Reakcióhőmér- séklet	25 ’C	4’C
Reakcióidő	4 óra	2 óra
Termék	oligo-NH-mono- észter	oligo- NH(CH2)2NH- monoészter
Reakció hozama	25-30%	70%

A találmány szerinti eljárásban az oligoszacharid terminális redukáló egységének reduktív aminálását két aminocsoportot tartalmazó molekulával végezzük. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési módja szerint a reduktív aminálást úgy hajtjuk végre, hogy az oligoszacharid megadott moláris mennyiségét 10-szeres mólfeleslegben lévő diamino-etánnal reagáltatjuk 0,2 mólrí koncentrációjú KH₂PO₄ oldatban, 9 körüli pH-értéken, mintegy 25-100 ’C-on, előnyösen 100 ’C-on, mintegy 1-60 percen keresztül, előnyösen mintegy 15 percen át. Ezután az oligoszacharid moláris koncentrációjához viszonyítva 25-szörös mennyiségben piridin-boránt adunk a reakcióelegyhez, és 25100 ’C-on, előnyösen mintegy 50 ’C-on, 1-72 óra alatt, előnyösen mintegy 48 óra alatt lejátszatjuk a reakciót.

A reduktív aminálás termékét ezután egy kétfunkciős molekulával reagáltathatjuk, az egyes funkciós csoportok képesek mind az aktivált oligoszacharid terminális aminocsoportjával, mind a hordozó protein szerkezetében lévő aminocsoportokkal reagálni, fgy a kétfunkciós molekula összekötőként szolgál az oligoszacharid és a hordozó protein között. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési módja értelmében a kétfunkciós csoport egy diészter, közelebbről az adipinsav diésztere, amely vizsgálataink szerint közrejátszik a protein hatékonyabb glikozilezésében. A találmány szerinti eljárás különösen előnyös kivitelezési módja szerint a reduktív aminálásnak fenti módon alávetett oligoszacharidot borostyánkősav, még előnyösebben adipinsav szukcinimidil-diészterével reagáltatjuk; ez a reakció legelőnyösebben úgy játszatható le, ha az aminált oligoszacharid (aminocsoportra számított) moláris mennyisége a SIDEA (vagy SIDES) moláris koncentrációjának mintegy 1/5-ével egyenértékű, a reakciót dimetil-szulfoxidos oldatban, 0 és 25 ’C közötti hőmérsékleten, előnyösen 4 ’C-on játszatjuk le, 0,5-5 órán, előnyösen 2 órán keresztül. Az aktivált oligoszacharidot ezután 80 térfogat% 1,4-dioxánnal kicsapva összegyűjthetjük, a SIDEA (vagy SIDES) feleslege ily módon a felülúszóban marad.

Oligoszacharid proteinhez kapcsolása

A találmány szerinti eljárásban proteinként minden olyan protein alkalmazható, amely fiatal állatoknak biztonságosan adható, és immunológiailag hatásos hordozó proteinként szolgálhat. Közelebbről, a fenti proteinek sejtek felületi proteinjei, membránproteinek, toxinok és toxoidok lehetnek. A biztonságos adagolhatóság kritériumai az elsődleges toxicitás hiánya és az allergén reakciók minimális esélye. A diftéria és tetanusz toxoidok a fenti kritériumoknak megfelelnek, azaz megfelelően előállítva ezek nem toxikusak és az allergiás reakciók előfordulása elfogadhatóan ritka. Noha az allergiás reakciók veszélye felnőttek esetén jelentős lehet, csecsemőkben ez minimális. Atalálmány szerinti eljárás más kiviteli módjai szerint hordozó proteinként például Salmonella flagellumokat, Hemophilus pilusokat, 15 kd, 38-30 kd és 40 kd móltömegű Hemophilus membránproteineket, hőérzékeny Escherichia coli LTB enterotoxint, kolera toxint és vírus7

HU 211 210 B proteineket, például VP7 rotavírus és légzőrendszeri szinciciális F és G vírus proteineket használhatunk.

A hordozó hatás következtében egy gyenge antigén egy erősebb antigénhez, mint hordozóhoz (például egy heterológ proteinhez) kapcsolva erősebb immunogén tulajdonságúvá válik, mint ha önmagában alkalmazzuk. Ha az állatot előzetesen csak hordozóval immunizáljuk, az állatban nemcsak az antigén hordozóval, hanem az ahhoz kapcsolt haptén csoportokkal is „beindíthatjuk” az immunrendszer működését és fokozott immunválaszt kaphatunk. A csecsemőket rutinszerűen immunizálják tetanusz és diftéria toxoidokkal. Ezért a fenti toxoidokhoz kapcsolt tok-polimer antigénekkel is beindítható a későbbiekben az immunrendszer működése.

Hordozó antigénként általában bármely heterológ protein megfelel. Bizonyos bakteriális toxinok, például a tetanusz és diftéria toxinok azonban azzal az előnnyel is rendelkeznek, hogy két részből állnak, amelyek egyike (a „kötő” alegység) erős affinitást mutat az emlős sejtek felületéhez való kötődésre. Feltételezhetően az ilyen „kötő” proteinhez való kapcsolás elősegíti, hogy a hordozott antigén még hatékonyabban váltsa ki az immunválaszt az immunrendszer sejtjeiben.

A tok-polimerrel összekapcsolt hordozó proteinek natív toxinok vagy detoxikált toxinok (toxoidok) lehetnek. Viszonylag új mutációs módszerekkel olyan genetikailag megváltoztatott proteinek is előállíthatók, amelyek antigén szempontból a toxinhoz hasonlóak, mégsem toxikusak. Ezeket „keresztreakciót adó” anyagoknak (CRM-eknek) nevezzük. A CRM197 figyelemre méltó ilyen szempontból, mivel a natív diftéria toxintól csak egyetlen aminosavban különbözik, és immunológiailag attól nem különböztethető meg.

A tok-polimer natív toxinhoz való kapcsolása csökkentheti a toxicitást, de azért jelentős toxicitás megmaradhat. Ezért a protein toxinok további detoxifikálására formaiint alkalmazhatunk, amely a protein szabad aminocsoportjaival reagál. A maradék toxicitás még mindig problémát okozhat. Ezenkívül spontán detoxifikáció is végbemehet a vakcina bármely specifikus helyén, ami szintén figyelmet érdemel.

A tok-polimerrel való kapcsolás előtt a natív toxinból szokásos toxoidot is előállíthatunk, formaiinnal végzett detoxifikálással. Azonban az előzetes formalinos kezelés csökkenti azon szabad aminocsoportok számát is, amelyek a tok-polimer fragmentum redukáló csoportjaival reagálhatnak. Ezért a CRM-ek jelentős előnye, hogy önmaguk nem toxikusak, mégsem foglalja el egy aminocsoportjukat sem a formaiin. További előnyük, hogy a velük végzett munka során nincs semmi biológiai kockázat. A CRM₁₉₇ esetében - amely immunológiai szempontból azonos a natív toxinnal - a formaiinnal végzett kezelés (noha nincs szükség detoxifikálásra) erősen fokozza az immunválaszt. Feltételezések szerint ez a molekulának a szervezet mechanizmusai általi degradálódással szembeni stabilizálásának és/vagy keresztkötések általi aggregálódásnak tulajdonítható (a részecskék immunogén tulajdonsága fokozódik a méret növekedésével).

A fent ismertetett okok miatt hordozó proteinként elsősorban a tetanusz és diftéria toxinok jönnek számításba, ennek ellenére mások is megfelelők lehetnek. Noha a többiek esetében a biztonság nem olyan jól dokumentált, mint a diftéria és tetanusz toxinok esetén, más meggyőző oka is lehet alkalmazásuknak. Ilyen ok lehet például, hogy hordozóként még hatékonyabbak, vagy előállításuk lényegesen gazdaságosabb. Ilyen hordozók lehetnek például a pseudomonas, staphylococcus, streptococcus, pertussis és Escherichia coli toxinok.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési módja szerint az aktivált oligoszacharidokat CRM197 proteinnel kapcsoljuk, amelyet az alábbiak szerint tisztítunk.

A Corynebacterium diphtheriae törzs által termelt CRM_l97-et a tenyészléből úgy választhatjuk el, hogy a baktériumtenyészetet Millipore^R membránon átszűrjük, a proteint a szűrletből kicsapjuk és a CRM₁₉₇-et ioncserélő kromatográfiás eljárással tisztítjuk, a példában ismertetett módon. Lényegében tiszta CRM₁₉₇-et előállíthatunk a szakirodalomból ismert más eljárásokkal is.

Az aktivált oligoszacharid és a hordozó protein közötti kovalens kötést szerves oldószer és adott esetben egyéb szer, például kondenzálószer jelenlétében alakíthatjuk ki, amely elősegíti az aktivált oligoszacharid terminális funkciós csoportjának proteinhez való kötődését. A találmány szerinti eljárás egy speciális, előnyös kivitelezési módja szerint egy terminális észtercsoportot hordozó aktivált oligoszacharidot az alábbiak szerint kapcsolunk össze kovalens kötéssel a hordozó proteinen lévő szabad aminocsoporttal.

Az aktivált oligoszacharidot dimetil-szulfoxidban oldjuk, majd hozzáadjuk a hordozó protein vizes oldatához (például kb. 2 mg/ml koncentrációjú CRM_I97 oldathoz) olyan mennyiségben, hogy a monoészter formában aktivált oligoszacharid és a hordozó protein összes aminocsoportjainak mólaránya mintegy 1:2, és a DMSO végkoncentrációja mintegy 50 térfogat%. A kapcsolási reakciót 4 ’C-on játszatjuk le, és annak ellenére, hogy a reakció mintegy 2 óra alatt majdnem teljesen végbemegy, a reagáltatást egy éjszakán keresztül célszerű folytatni, hogy a lehető legnagyobb hozammal kapjuk az egyes specifikus glikokonjugátumokat. Az így kapott glikokonjugátumot ezután gélkromatográfiás eljárással tisztítjuk.

Egyértékű vakcina előállítására egy adott baktérium egyetlen szerotípusából származó oligoszacharidot kapcsolunk össze proteinnel. Többértékű vakcina előállítására a glikokonjugátumokat úgy állítjuk elő, hogy különböző fajhoz vagy különböző szerotípushoz tartozó baktériumokból származó oligoszacharidok elegyét kapcsoljuk hordozó proteinhez; de úgy is eljárhatunk, hogy először külön-külön előállítjuk egyetlen baktériumtípusból származó oligoszacharidból és a hordozó proteinből a glikokonjugátumot, majd az így kapott glikokonjugátumokat elegyítjük. Ennek megfelelően a többértékű vakcina kötött oligoszacharidok homogén vagy heterogén populációját hordozó hordozó proteint tartalmaz.

HU 211 210 Β

Glikokonjugátumok immunkémiai jellemzése

A fenti módon előállított glikokonjugátumok immunogén voltának bizonyítását emberi alkalmazás előtt különféle, arra alkalmas állati rendszereken vizsgálhatjuk, például nyúlon, sertésen, tengerimalacon, egéren, patkányon vagy kecskén. A találmány egy speciális kivitelezési módja szerint kb. 2 kg-os nyulaknak szubkután adhatjuk a glikoprotein-konjugátumot alumínium-foszfát vagy -hidroxid jelenlétében vagy anélkül. Közelítőleg 2,5 gg oligoszacharid jelent megfelelő dózist egy 2 kg-os nyúl részére. Az antitest-titereket ezután enzimhez kötött immunszorbens vizsgálattal (ELISA) vagy egyéb ismert módszerrel értékelhetjük ki. Mivel a találmány szerinti glikokonjugátumok ellen termelt antitestek lehet, hogy nem képesek az antigén immunkicsapására, az immunprecipitáción alapuló antitest-meghatározásokat nem javasoljuk a titerek meghatározására.

Vakcina formálása és adagolása

A vakcina előállítására megfelelő hordozórendszer például nátrium-foszfáttal pufferolt sóoldat (pH 7,4) vagy nátrium-foszfáttal pufferolt sóoldatban (pH 6) szuszpendált 0,125 mól/1 koncentrációjú alumíniumfoszfát-gél, vagy egyéb szokásos rendszer lehet.

Általában a mintegy 5-100 gg, előnyösen mintegy 10—50 gg oligoszacharidot tartalmazó vakcinák alkalmasak a tok-polimer elleni hatásos antitest-koncentráció indukálására fiatal melegvérű emlősökben. A pontos dózist természetesen a dózis-hatás vizsgálatra szokásosan alkalmazott kísérletekkel kell meghatározni. Gyermekek részére alkalmas vakcinák előállítására a glikoprotein-konjugátum koncentrációja közelítőleg 25-200 gg, az oligoszacharidra vonatkoztatva. A testtömegtől függően nagyobb dózisok is adagolhatók. Várhatóan több kis dózis adagolása előnyösebb, mint azonos mennyiségű konjugátum adagolása egyetlen injekcióban.

A találmány szerinti eljárással előállított vakcinákat tetszőleges életkorú melegvérű emlős állatnak adagolhatjuk, és különösen alkalmasak fiatal emlősök szisztémikus fertőzései elleni aktív immunizálásra az alábbi kórokozók esetén: Haemophilus influenzáé b típus, Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis és Pseudomonas aeruginosa.

A találmány szerinti eljárással előállított vakcinát szubkután módon, intravénásán, imtramuszkulárisan, intraperitoneálisan, orálisan vagy intranazálisan egyaránt adagolhatjuk. A vakcina a glikokonjugátumot oldott vagy mikrorészecske formájában, vagy mikrogömbökbe vagy mikrohólyagokba, például liposzómákba beépítve tartalmazhatja.

Oligoszacharid-konjugátum vakcinák alkalmazása

A találmány szerinti eljárással előállított, tokos patogén baktériumok elleni glikokonjugátum vakcinákat fogékony alanyok védelmére használhatjuk a fenti mikroorganizmusok által okozott fertőzések kifejlődése ellen. Fogékony alanyok lehetnek például a fejletlen immunrendszerrel rendelkező gyermekek, a léphiányos egyének, valamint az elégtelenül működő immunrendszerrel rendelkező vagy krónikus betegségben szenvedő egyedek, különösen szerzett immunhiány szindrómában (AIDS), vérképzőrendszeri tumorban, diabetesben, krónikus szívbetegségben, krónikus tüdőbetegségben és sarlósejtes anémiában szenvedő betegek. A találmány szerinti eljárással előállított glikokonjugátumok hordozó proteinekkel való kapcsolódásuknak köszönhetően fokozzák a hordozott oligoszacharidok immunogén sajátságát.

A találmány szerinti eljárással előállított glikokonjugátumok ennek megfelelően vakcinálásra alkalmazhatók a poliszacharid tokkal rendelkező baktériumok, például Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzáé, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Streptococcus mutáns, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus és Pseudomonas aeruginosa által okozott fertőzések ellen. A gyermekekben különösen virulens S. pneumoniae törzsek közül a találmány szerinti eljárással előállított vakcinák különösen az 1-es, 2-es, 3-as,

4-es, 5-ös, 6B, 7F, 8-as, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14-es, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20-as, 22F, 23F és 33F típusú S. pneumoniae baktériumok ellen nyújtanak hatásos védelmet.

A találmány szerinti eljárással előállított vakcinák monospecifikus és homogén immunválasz kiváltására alkalmasak. A monospecifikus immunválasz számos előnnyel jár, például olyan antitesteket ad, amelyek (i) homogén specificitással rendelkeznek, azaz lényegében az összes antitest egy specifikus epitóp ellen irányul, és azonos affinitási állandó értékkel rendelkezik; (ii) nagy affinitási állandó értékkel rendelkeznek, előnyös antibakteriális aktivitással; (iii) fokozott cél-specificitásúak és nem adnak keresztreakciót a gazdával rokon antigénnel, ami biztonságosabb vakcinát eredményez; és (iv) a monospecifikus antitestek csökkent precipitáló aktivitása következtében kisebb a komplement-aktiválás, ami szintén biztonságosabb vakcinát eredményez.

A találmány szerinti eljárással olyan vakcinák is előállíthatók, amelyek felismerik a találmány szerinti eljárással hordozó proteinekhez kötött peptideket vagy lipopoliszacharidokat vagy egyéb felületi oligoszacharid hapténeket.

A fenti vakcinák például tumorsejtekkel szembeni immunitás kiváltására, vagy egy kemoterápiás szerrel vagy biológiailag aktív anyaggal kapcsolt tumorellenes antitest előállítására alkalmazhatók; az ilyen tumorellenes aktivitás például úgy indukálható, hogy egy tumorspecifikus antigént, vagy annak epitópját a találmány szerinti eljárással egy hordozó proteinhez kapcsoljuk.

Példa

Többértékűpneumococcus oligoszacharid-konjugátum vakcina előállítása I) Poliszacharid előállítása A 6A típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidot,

14-es típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidot, 19F típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidot és 23F típusú

HU 211 210 B

S. pneumoniae tok-poliszacharidot az American Type Culture Collection-tól szereztük be.

2) Poliszacharid hidrolízise

a) 6A típusú S. pneumoniae poliszacharid hidrolízise mg 6A típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidot 1 ml 10 mmól/1 koncentrációjú vizes ecetsavoldatban (pH 3,4) oldunk, majd a mintát 100 C-os olajfürdőbe merített, leforrasztott ampullában 30 órán keresztül hidrolizáljuk. A kapott oligoszacharidokat a reakcióelegyből 4 ’C-on 15 mmól/1 koncentrációjú nátriumkloriddal (pH 7,0) kondicionált Sephadex G15-ön (Pharmacia, Uppsala) kromatográfiásan elválasztjuk.

A kromatográfiás eluátumot Kábát [Experimental Immunochemistry, szerk. Rabat és Mayer, 538-541. oldal (1964)], Chen és munkatársai [Anal. Chem. 28, 1756-1758 (1956)] és Porro és munkatársai [Anal. Biochem. 118, 301-306 (1981)] módszere szerint analizáljuk a metil-pentózok, foszfor és redukáló csoportok, például aldehidcsoport jelenlétének kimutatására. Analíziseredményeink szerint a metil-pentóz/ /foszfor arány 0,96, és a foszfor/aldehid arány 4,12.

Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) gélen, pufferrel végzett kromatográfia szerint a megoszlási állandó (KJ 0,538 (hexózzal), ami közelítőleg 2500 kd móltömegnek felel meg.

NMR, gázkromatográfiás és sztöchiometrikus analíziseredmények szerint az oligoszacharid mintegy 3-4 ismétlődő alapegységből áll, amelyek között találtunk immunológiailag domináns galaktózt is.

b) 14-es típusú S. pneumoniae poliszacharid hidrolízise mg 14-es típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidot 1 ml 0,5 mól/l koncentrációjú vizes trifluor-ecetsav-oldatban oldunk, majd a mintát 70 ’C-os olajfürdőbe merített, leforrasztott ampullában 7 órán keresztül hidrolizáljuk. A kapott oligoszacharidokat a reakcióelegyből 4 ’C-on 15 mmól/1 koncentrációjú nátriumkloriddal (pH 7,0) kondicionált Sephadex G15-ön (Pharmacia, Uppsala) kromatográfiásan elválasztjuk.

A kromatográfiás eluátumot ezután hexózamin- és aldehid-tartalma szempontjából analizáljuk. Azt találtuk, hogy a hexózamin/aldehid arány 3,17. A gázkromatográfiás és sztöchiometrikus analízis szerint a molekulaméret 3-4 ismétlődő alapegységnek felel meg. A galaktóz elágazások megszűnése gázkromatográfiás meghatározás szerint 10%-on belül van. Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) gélen, 15 mmól/1 koncentrációjú nátriumkloriddal (pH 7,0) végzett kromatográfia szerint a megoszlási állandó (KJ 0,30 az összes hexózra.

c) 19F típusú S. pneumoniae poliszacharid hidrolízise mg 19F típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidot ml 10 mmól/1 koncentrációjú vizes ecetsavoldatban (pH 3,4) oldunk, majd a mintát 50 ’C-os olajfürdőbe merített, leforrasztott ampullában 48 órán keresztül hidrolizáljuk. A kapott oligoszacharidokat a reakcióelegyből 4 ’C-on 15 mmól/1 koncentrációjú nátriumkloriddal (pH 7,0) kondicionált Sephadex G15-ön (Pharmacia, Uppsala) kromatográfiásan elválasztjuk.

A kromatográfiás eluátumot Kábát [Experimental Immunochemistry, szerk. Rabat és Mayer, 538-541. oldal (1964)], Chen és munkatársai [Anal. Chem. 28, 1756-1758 (1956)] és Porro és munkatársai [Anal. Biochem. 118,301-306 (1981)] módszere szerint analizáljuk a metil-pentózok, foszfor és redukáló csoportok, például aldehidcsoport jelenlétének kimutatására. Analíziseredményeink szerint a metil-pentóz/redukált metil-pentóz arány 3,5 és a metil-pentóz/foszfor arány 3,2.

Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) gélen, pufferrel végzett kromatográfia szerint az oligoszacharidra a megoszlási állandó (KJ 0,46 (összes hexózzal), és a kombinált gázkromatográfiás és sztöchiometrikus analízis szerint a molekulaméret 3-4 ismétlődő alapegységnek felel meg.

d) 23F típusú S. pneumoniae poliszacharid hidrolízise mg 23F típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidot 1 ml 0,25 mól/l koncentrációjú vizes trifluor-ecetsavoldatban oldunk, majd a mintát 70 ’C-os olajfürdőbe merített, leforrasztott ampullában 3 órán keresztül hidrolizáljuk. A kapott oligoszacharidokat a reakcióelegyből 4 ’C-on 15 mmól/1 koncentrációjú nátrium-kloriddal (pH 7,0) kondicionált Sephadex G15-ön (Pharmacia, Uppsala) kromatográfiásan elválasztjuk.

A kromatográfiás eluátumot Kábát [Experimental Immunochemistry, szerk. Rabat és Mayer, 538-541. oldal (1964)], Chen és munkatársai [Anal. Chem. 28, 1756-1758 (1956)] és Porro és munkatársai [Anal. Biochem. 118, 301-306 (1981)] módszere szerint analizáljuk, a metil-pentózok, foszfor és redukáló csoportok, például aldehidcsoport jelenlétének kimutatására. Analíziseredményeink szerint a hexóz/aldehid arány 4,5, a hexóz/metil-pentóz arány 2,3 és a foszfor/aldehid arány 2,9.

A gázkromatográfiás és sztöchiometrikus analízis 3,5-4,5 ismétlődő alapegységre utal. A ramnóz elágazások megszűnése gázkromatográfiás meghatározás szerint 8%-nál kisebb.

Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) gélen végzett kromatográfia szerint a megoszlási állandó (Kj) 0,38 az összes hexózra.

S. pneumoniae oligoszacharid haptének immunkémiai jellemzése

A 6A, 14, 19F és 23F típusú S. Pneumoniae oligoszacharidok sértetlen tok-poliszacharidok elleni antitestekkel való kölcsönhatását Porro és munkatársai [Mól. Immunoi. 22, 907-010 (1985)] módszere szerint vizsgáljuk, olyan módszer alkalmazásával, amely alkalmas hapténeknek (például oligoszacharidoknak) homológ antigének (tok-poliszacharidok) antitest immunprecipitációs reakcióját gátló képességének mérésére (a kis móltömegű haptének maguk nem adnak immunprecipitációs reakciót homológ antitestekre végzett vizsgálatban).

HU 211 210 Β ///. táblázat: S. pneumoniae oligoszacharid haptének immunkémiai jellemzése

A differenciál-immunelektroforézisnek nevezett eljárást az alábbiak szerint hajtjuk végre.

Az immunelektroforézisre használt műanyag hordozólemez három 1 vegyes%-os agaróz (Agarose MLKB, Bromma, Svédország) részt tartalmaz. Az első részben 0,05 térfogat% tok-poliszachariddal szembeni referencia antiszérum van. A második rész 0,05 térfogatié olyan tok-poliszachariddal szembeni referencia antiszérumot tartalmaz, amelyet előzőleg 37 °C-on 15 percen keresztül ismert mennyiségű referencia tok-poliszachariddal inkubáltunk. A harmadik rész 0,05 térfogatié olyan tok-poliszachariddal szembeni referencia antiszérumot tartalmaz, amelyet előzőleg 37 ’C-on 15 percen keresztül ismert mennyiségű oligoszacharid hapténnel inkubáltunk. A tok-poliszacharidot ezután négy kétszeres sorozathígításban, 70 V/cm-rel, 20 mmól/1 koncentrációjú Tris-barbiturát-pufferben (pH 8,8) 90 perc alatt elektroforézissel elválasztjuk. Az elektroforézis után a lemezeket ezüsttel megfestjük, szárítjuk és kiértékeljük. Az oligoszacharid molekulák általi gátlás nagyobb, gyors immunprecipitátumban nyilvánul meg a hapténnel előinkubált referencia antiszérumot tartalmazó részben. A haptén minimális gátló koncentrációját az alábbi képlettel számítjuk ki:

^MK„. = ^ Γ¹ .ahol ^hHa c_Ha a haptén koncentrációját jelenti a vizsgált gélben, h_Ag az egyenes metszete, a gyors immunprecipitátum magasságával meghatározva, amelyet akkor kapunk, ha a referencia antigén van a gélben, és h_Haaz egyenes metszete, a gyors immunprecipitátum magasságával meghatározva, amelyet akkor kapunk, ha a vizsgált haptén van a gélben Hasonlóképpen, az antigén minimális gátló koncentrációja:

Különféle méretű oligoszacharid hapténeket vizsgáltunk.

Az oligoszacharidoknak a tok-poliszacharidok specifikus antitestek általi immunprecipitációját gátló képességét nem elektroforetikus, radiális immundiffuziós módszerrel is meghatároztuk. A fenti eljárás értelmében az oligoszacharid molekulák általi gátlást az antigén (tok-poliszacharid) diffúziójával képződött immunprecipitátum nagyobb sugara jelenti, az inhibitor (oligoszacharid) meghatározott mennyiségével előzetesen inkubált specifikus antigént tartalmazó 1 vegyes%-os agarózban. Ha kísérletileg meghatároztuk az adott hapténre a minimális kapcsolódási koncentrációt (MCC), a specificitást az alábbi képlet segítségével számíthatjuk ki:

Oligoszacharid típusa	DP	M (kD)	(MICPs/ MICHp) DIEP- vel	(MCCPs/ MCCHp) IRID-del
6A	2 3,5 10	1.5, 2,5 7,0	103 10-3 10'	103
14	5 15	3,5 10,4	n. v. n. v.	ítr1 I0'!
19F	3,5	2,2	10'3	ΙΟ-4
23FCH3COOH (hidr.) TFA (hidr.)	3 6 4.5 9.5	2.3 4,5 3.4 7,2	10-3 ΚΓ1 10-4 10'	102 101 5x10-3 101

n. v. = nem vizsgált

DIEP = differenciál immunelektroforézis

IRID = radiális immundiffúzió gátlása

MIC = minimális gátló koncentráció

MCC = minimális kapcsolódási koncentráció

M = átlagos móltömeg

DP = átlagos polimerizációs fok

S. Pneumoniae oligoszacharidok terminális redukáló egységének aktiválása A fenti módon előállított oligoszacharid hapténeket vízben oldjuk, közelítőleg 5 mg/ml végkoncentrációban. Az egyes oldatokhoz milliliterenként 0,1 ml 0,2 mól/1 koncentrációjú kálium-dihidrogén-foszfát-oldatot adunk, a pH 9,2-9,4-re emelkedik a szükséges mennyiségű diamino-etán hozzáadásával (általában milliliterenként 2 μΐ diamino-etánt kell adni az oldathoz). Az elegyet 15 percen keresztül 100 ’C-on tartjuk, és ezalatt az oldathoz milliliterenként mintegy 4 μΐ piridin-boránt adunk. A pH-értéket 1 n nátrium-hidroxid-oldattal 9,2-re állítjuk. Az elegyet ezután ampullába visszük át az ampullát leforrasztjuk és olajfürdőn 50 ’C-on 48 órán keresztül melegítjük. Ezután az amino-aktivált oligoszacharid-oldatot 1 n sósavoldattal semlegesítjük és Sephadex G-15 Superfine gélen kromatografálva tisztítjuk (15 mmól/1 NaCl, pH 7,01). Az összegyűjtött kromatográfiás frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. A fagyasztva szárított maradékot 10 mg/ml koncentrációban DMSO-ban oldjuk és a fagyasztva szárított anyagban lévő aminocsoportokra vonatkoztatva 5:1 mől/mól aránynak megfelelő moláris mennyiségben SIDEA-t (vagy SIDES-t) adunk az oldathoz. A reakcióelegyet 4 órán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk, majd az oldathoz 4 térfogat 1,4-dioxánt adva (az 1,4-dioxán végkoncentrációja 80%) az aktivált oligoszacharid-észtert kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük, 1,4-dioxánnal háromszor mossuk és a kapcsolási reakció lejátszatásáig

HU 211 210 Β

-20 °C-on tartjuk. Az aktiválási reakció hozama a négy oligoszacharid esetén a IV. táblázatban látható.

IV. táblázat: S. pneumoniae oligoszacharid aktiválási eljárás hozama (tömeg%)

Szerotípus	Oligo- NH(CH2)NH2	Oligo- NH(CH2)NH- monoészter	Összhozam
6A	75	93	70
14	73	90	66
19F	100	100	100
23F	50	90	45
Xg (±s. d.)	74,5 (±20)	93,3 (±4,7)	70 (±23)

Aktivált oligoszacharid kapcsolása CRM_m proteinhez

A Corynebacterium diphtheriae C7 (B“~¹⁹⁷) által termelt CRM₁₉₇-et Millipore XM-50 (NMWL 5X10-⁴) membránnal végzett molekulaszűréssel választjuk el a tenyészléből. A szűrlethez telített (65 vegyes%-os) ammónium-szulfátot adva kicsapjuk a proteint. A kicsapott proteint centrifugálással összegyűjtjük és 0,001 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferben (pH 7,2) újra feloldjuk.

A CRM_]97D további tisztítását ioncserélő kromatográfiás eljárással végezzük, 0,001 mól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,2) kondicionált, 2,5x100 cm-es DEAE-Sepharose 6B/CL oszlopot (Pharmacia, Uppsala) használva, az eluálást 0,09 mól/1 NaCl-ot tartalmazó, 0,01 mól/1 koncentrációjú foszfátpuffen-el végezzük.

Redukáló körülmények között végzett SDS-poli(akril-amid)-gél-elektroforézis [Pappenheimer és munkatársai, Immunochem. 9, 891-906 (1972)] szerint a kapott CRM₁₉₇ 80%-a natív molekula formájában van. A protein tisztasága mintegy 400 flokkulációs határ (Lf)/mg.

Aktivált oligoszacharid kapcsolása

A kapcsolási eljárás abból áll, hogy a monoszukcinimidil-észter-aktivált oligoszacharid haptént a CRM₁₉₇ hordozó protein lizin-maradékának ε-aminocsoportjához kötjük.

mg/ml CRM|₉₇-et tartalmazó 0,1 mól/1 koncentrációjú hidrogén-karbonát-oldathoz (pH 8,0) a 6A, 14, 19F vagy 23F típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidjából előállított, adipinsav-monoszukcinimidilészter-aktivált oligoszacharidot tartalmazó dimetilszulfoxid-oldatot adva 50% vizet tartalmazó oldatot kapunk, amelyben az észter-aktivált oligoszacharid mólaránya a hordozó protein összes aminocsoportjához viszonyítva 1:2.

A kapott elegyet enyhe keverés közben 15 órán keresztül 4 °C-on tartjuk. A négy szerotípusból származó oligoszacharidokat külön-külön kapcsoljuk a hordozó proteinhez. Az így kapott glikokonjugátumok fizikai-kémiai tulajdonságait az V. táblázatban foglaljuk össze.

V. táblázat

Glikokonjugátumok jellemzői

Szerotí- pus	DPoiigo	^oligo (kD)	M|conj (kd) (SDS- PAGE)	SD (móloli. nrálprote- in)	K. p. (t%)
6A	3	2,1	77,6	7	100
14	5	3,5	85,1	6	100
19F	3	1,9	69,2	4	100
23F	6	4,5	85,0	5	100

K. p.: konjugált protein

Kapcsolás hatékonyságának összehasonlítása adipinsav-szukcinimidil-diészter és borostyánkősav-szukcinimidil-diészter alkalmazása esetén

Az aktivált oligoszacharid és a borostyánkősavszukcinimidil-diészter (SIDES) reakciójának terméke az (1), míg az adipinsav-szukcinimidil-diészterrel (SIDEA) való reakciójának terméke a (2) képlet szerinti, vagyis az oligoszacharid és a kapcsolódó protein közötti összekötő csoport mérete különböző (lásd 2. ábrát). Kiértékeltük a SIDES-sel aktivált oligoszacharidok kapcsolásának hatékonyságát a SIDEA-val aktivált oligoszacharidokéval szemben. A 3. ábra A, B és C része azt mutatja, hogy ha az összekötő csoport SIDEA-ból származik, a protein láthatólag teljesen glikozilált formában van (a szabad CRM₁₉₇ sávja nem, vagy csak kis mértékben detektálható).

5. pneumoniae glikokonjugátumok immunogén tulajdonsága

A négy glikokonjugátum antigénből különböző készítményeket állítottunk elő, és azokat nyúlon vizsgáltuk (a VI. táblázatban ismertetett kísérleti elrendezés szerint): típus-specifikus glikokonjugátumok monovalens készítményben (2,5 vagy 5,0 pg oligoszacharid/dózis) vagy multivalens készítményben (2,5 pg mindegyik oligoszacharidból dózisonként), alumínium-hidroxid [A1(OH)₃] mint szervetlen adjuváns jelenlétében vagy anélkül (csak a multivalens készítményben 1 mg/dózis mennyiségben alkalmazva). A négy glikokonjugátum Al(OH)₃-on való adszorpciója az alkalmazott körülmények között teljes, mivel a multivalens készítmény felülúszójának feldolgozása SDS-poli(akril-amid)-gél-elektroforézissel vagy gyors immunelektroforézissel nem mutat detektálható mennyiségű szabad proteint. Az egyes glikokonjugátumok átlagos dózisa mintegy 2,5 pg oligoszacharidot és 13 pg CRM|₉₇ hordozó proteint tartalmaz (összemérhető a diftéria toxoid átlagos humán vakcinálási dózisával). Az immunizálás egy indító dózisból és két emlékeztető dózisból áll, a dózisok között 4-4 hét szünettel. A 0., 4., 6. és 10. héten vesszük a vérmintákat.

HU 211 210 Β

VI. táblázat

Immunizálás menetrendje nyúl és egér esetében, és a vakcinák dózisai

Immunizálás:	0., 4. és 8. héten
Vérvétel:	0., 4., 6. és 10. héten
A. Oldható monovalens (egyetlen típust tartalmazó) készítmény
1 dózis (0,5 ml):	2,5 pg oligoszacharid és 13 μ (5 Lf) CRM197
1 dózis (0,5 ml):	5,0 pg oligoszacharid és 26 pg (10 Lf) CRM,97
B. Oldható polivalens (4 típust keverten tartalmazó) készítmény
1 dózis (0,5 ml):	2,5 pg típus-specifikus oligo (összesen 10 pg oligo) és összesen 52 pg (20 Lf) CRM197
C. Al(OH)3-on adszorbeált polivalens (4 típust keverten tartalmazó) készítmény
1 dózis (0,5 ml):	2,5 pg típus-specifikus oligo (összesen 10 pg oligo) és összesen 52 pg (20 Lf) CRM197, 1 mg Al(OH)3-dal

A VII. táblázatban láthatók a típus-specifikus anti- hoz viszonyítva a reagáló állatok száma. Az arány (R) testek mennyiségei RIA (FARR módszer) szerint meg- 20 jelzi az egyes immunizáló dózisok után elért fokozódás határozva, valamint az összes immunizált állat számá- szorzószámát.

VII. táblázat

CRM^-j hordozó proteinhez kovalensen kötött**** 6A, 14, 19F és 23F típusú S. pneumoniae oligoszacharidokkal*** immunizált** nyulak titere* RIA-meghatározás szerint

	Oldható forma	Al(OH)3-on adszorbeált forma
O.hét	4. hét	6. hét	11. hét	O.hét	4. hét	6. hét	11. hét
6A	n. v.	n. v.	150(2/6)	495 (6/6)	n. v.	538 (5/5)	3190(5/5) R = 6,0	4064 (5/5) R = l,3
14	n. v.	n. v.	230(1/6)	195 (2/6)	n. v.	77 (3/6)	203 (4/5) R = 2,6	216(5/5) R = 1,1
19F	n. v.	n. v.	n. v.	75 (6/6)	n. v.	72 (6/6)	108 (5/5) R = l,5	188 (5/5) R = l,7
23F	n. v.	n. v.	400(1/6)	140(1/5)	n. v.	283 (3/6)	n. v.	246 (5/5)

* az adatok a ngN_Ab/mI-ben kifejezett titeiek geometriai állagát jelentik. Zárójelben megadtuk az immunválaszt adó/összes állat számát ** a négy glikokonjugátumot tartalmazó multivalens készítmények, oldható és alumínium-hidroxidon abszorbeált formában (1 mg/dózis). Az egyes konjugátumok átlagos oligoszacharid tartalma 2,5 μg, átlagos CRM197 protein tartalma 13 pg. Az immunizálást a 0., 4. és 9. héten végezzük. A vérmintát a 0., 4., 6. és 11. héten vesszük.

*** a 6A és 19F típusú oligoszacharidok átlagos polimerizációs foka (DP) 3 a 14 és 23F típusú oligoszacharidok átlagos polimerizációs foka (DP) 5 **** a 6A típusú glikonkonjugátumokban az oligoszacharidok átlagos szubsztitúciós foka (SD) egységnyi hordozó proteinre vonatkoztatva 7 (mól/mól) a 14-es típusú glikokonjugátum SD értéke 6; a 19F-é 4 és a 23F-é 5 n. v.: nem vizsgált

A VIII. táblázat tartalmazza az ELISA titereket IgG Ab izotípusban kifejezve, valamint az összes immunizált állat számához viszonyítva a reagáló állatok számát. Az Rj, R₂ és R₃ arányok a titer növekedésének szorzószámát jelentik az adott immunizáló dózis beadása után, az immunizálás előtti titerhez viszonyítva.

Vili. táblázat

IgG Ab izotípus titerek* 6A, 14,19F és 23F S. pneumoniae tok-oligoszacharidok (DP = 3-6) glikokonjugátumait tartalmazó multivalens vakcinával indukálva

	Előtiter (0. hét)	Indító (4. hét)	1. emlékeztető (6. hét)	2. emlékewztető 11. hét
6A	<50 (0/5)	4800 (5/5)	51 200(5/5)	130000(5/5)
Rj>96,0	R2 = 10,7 (a<0,01) R3 = 2,5 (a<0,01)
	R2'>l,027 R3'>2600
14	<50 (0/5)	360 (5/5)	4480(5/5)	19 000(5/5)
R,>7,2	R2= 12,4 (tx<0,01) R3 = 4,4 (α<0,01)
	R2'>89,3 R3'>396,0

HU 211 210 Β

	Előtiter (0. hét)	Indító (4. hét)	1. emlékeztető (6. hét)	2. emlékewztető 11. hét
19F	<50 (0/5)	2 080 (5/5)	18 560(5/5)	35 200 (5/5)
R]>7,2	R2 = 9,0 (a<0,01) R3 = 1,9 (a<0,01)
	R/>371,2	R3'>704,0
23F	<50 (0/5)	880 (5/5)	1 280 (5/5)	11 800**
R]>17,6	R2 = 1,5 (οκΟ,ΟΙ) R3 = 9,3 (a<0,01)
	R2'>25,6	R3'>237,6

* a reakcióközeg ABS értékének kétszeresét mutató legnagyobb szérum-hígítás reciprokának geometriai átlagában kifejezett literek egy rendkívül nagy immunválaszt adó nyúl titerének értéke; az öt immunizált állatból kettőt, a legjobb és legrosszabb immunválaszt adót kivéve a megmaradt 3 nyúllal az alábbi értékeket kapjuk a 23F szerotípusra:

(0. hét)	(4. hét)	(6. hét)	(11. hét)
<50 (0/5)	667 (3/3)	1333 (3/3)	2667 (3/3)
Rí 13,3	R2 = 2,0 (a<0,01) R3 = 2,0 (a<0,01)
	R/>26,7	R3'>53,3

AIX. táblázat mutatja a kvalitatív eredményeket az indukált IgG antitesteknek az élő streptococcusok tok-poliszacharidjainak felismerésével mért működőképességében kifejezve (Quellung-reakció vagy Neufeld-teszt).

IX. táblázat

Nyúl szérum Ab immunológiai működőképessége CRM^-tel kapcsolt oligoszacharid-konjugátumokkal (DP = 3—6) szemben

Kvalitatív analízis (Quellung-reakció* tok felismerésre)
6A típusú S. pneumoniae	pozitív reakció
14-es típusú S. pneumoniae	pozitív reakció

Kvalitatív analízis (Quellung-reakció* tok felismerésre)
19F típusú S. pneumoniae	pozitív reakció
23F típusú S. pneumoniae	pozitív reakció

* Austrian [Mt. Sinai J. Med. 43, 699-709 (1976)] módszerével

A X. táblázat mutatja a CRM_]97 hordozó proteinnel nyúlban indukált diftéria-toxint semlegesítő titereket, Verő sejteken végzett vizsgálat szerint. Mivel kontrollként FDA antiszérumot használtunk, a gg/ml-ben kifejezett titereket is feltüntetjük.

X. táblázat

Verő sejt vizsgálattal meghatározott antidiftéria titerek* S. pneumoniae oligoszacharidok CRM_m proteinhez való kovalens kapcsolásával kapott multivalens glikokonjugátumokkal immunizált nyúlban

	Előtiter (0. hét)	Indító (4. hét)	1. emlékeztető (6 hét)	2. emlékeztető (11. hét)
Oldható forma	<10	<10	25 (0,019pg/ml)	1920 (1,4 pg/ml)
	R = 2,5	R = 77,0
Al(OH)3-adsz.	<10	20 (0,015 pg/ml)	1280 (0,96 pg/ml)	33 840 (2,9 pg/ml)

FDA összehasonlító antiszérum koncentrációja 6 gg/ml és 50% védelmet ad 1/8000 hígításban * a titereket azon hígítások reciprokában adjuk meg, amelyben az antiszérumok 50% védelmet adnak a sejteknek, amit a ³H-leucin beépülésből határozunk meg, miután a sejteket diftéria toxin hatásának tettük ki.

A zárójelbe tett számok a titereket jelentik μ g/ml-ben, kontrollként FDA összehasonlító antiszérummal végzett meghatározás szerint.

10-20 átlagos polimerizációs fokú oligoszacharidláncok szuboptimális immunogén tulajdonságai Két csoport glikokonjugátum vakcinát szintetizálunk a fent ismertetett módon, de két különböző polimerizációs fok tartományba tartozó 6A, 14, 19F és 23F

S. pneumoniae poliszacharidot alkalmaztunk, mégpedig 3-5 és 10-20 átlagos polimerizációs fokú oligoszacharidokat. Ezután megvizsgáltuk azt a kérdést, hogy a 20, vagy annál nagyobb átlagos polimerizációs fokú oligoszacharidok is optimális immunogén tulajdonsággal rendelkeznek-e (a választott CRM₎₉₇ hordozó proteinhez való kapcsolás után) indító és emlékeztető kapacitásukat tekintve a sokkal rövidebb láncú, például a DP = 3 oligoszacharidokkal összehasonlítva.

Nyulakat immunizáltunk a XI. táblázatban ismertetett módszer szerint. A XII. és ΧΠΙ. táblázatban közölt eredményekből - amelyek az oldható, DP = 10-14 illetve DP = 3-6 S. pneumoniae oligoszacharidokkal indulóit IgG izotípusú antitest-titerekre vonatkoznak -, valamint a XIV. és XV. táblázatok eredményeiből - amelyek Al(OH)₃-on adszorbeált DP = 10-14 illetve DP = 3-6 S. pneumoniae oligoszacharidokkal indulált IgG izotípusú antitest-titerekre vonatkoznak - látható, hogy a DP = ΙΟΙ 4 hosszúságú oligoszacharid nem rendelkezik fokozott

HU 211 210 Β

XIV. táblázat: 6A, 14, 19F és 23F típusú S.

pneumoniae tok-poliszacharidot (DP = 10-14)

Al(OH)₃ szervetlen adjuvánson adszorbeálva tartalmazó multivalens vakcinával indukált IgG Ab izotípus titerek ELISA eredményei immunogén tulajdonsággal. Ténylegesen a DP = 3-6 oligoszacharid konjugátumok indító és emlékeztető aktivitása sokkal nagyobb, mint a DP= 10-14 oligoszacharid konjugátumok esetén kapott aktivitás. Mind a négy vizsgált szénhidrát szerkezet esetén hasonló eredményeket kaptunk. Ezenkívül azt találtuk, hogy a DP = 10-14 glikokonjugátumokkal kevésbé hatásos a diftéria toxin semlegesítése, mint DP = 3-6 glikokonjugátumok alkalmazása esetén (XVI. táblázat). így a DP= 10-20 lánchosszúságú oligoszacharidok felhasználhatók ugyan a találmány szerinti glikokonjugátumok előállítására, de a DP = 3-6 lánchosszúságú oligoszacharidokkal magasabb antitest-titerek érhetők el.

XI. táblázat Nyúlok immunizálása

A vizsgált glikokonjugátumokat 2,5 gg szénhidrát dózisban injektáljuk. Mivel a vizsgált anyagok csak a kovalensen kötött oligoszacharidok lánchosszában különböznek, a hordozó protein megfelelő mennyiségei az alábbiak:

	Szénhidrát dózisa (gg)	Hordozó protein dózisa (gg)	Tömeg- arány
DP = 3-6 oligo-CRM197	2,5	12,5	0,2
DP= 10-14 oligo-CRMl97	2,5	2,5	1,0

Immunizálás: 0., 4. és 8. héten Vérvétel: 0., 4. és 10. héten

XII. táblázat

6A, 14, 19F és 23F típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidot (DP = 10-14) oldható formában tartalmazó multivalens vakcinával indukált IgG Ab izotípus titerek ELISA eredményei

	Előtiter (0. hét)	Indító (4. hét)	1. emlékeztető (6. hét)	2. emlékeztető (10. hét)
6A	<100	<100	<100	500 (2/5)
14	<100	300	2400 (3/5)	4600 (3/5)
19F	<100	<100	<100	<100
23F	<100	<100	<100	<100

XIII. táblázat

6A,I4,I9F és 23F típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidot (DP = 3-6) oldható formában tartalmazó multivalens vakcinával indukált IgG Ab izotípus titerek ELISA eredményei

	Előtiter (0. hét)	Indító (4. hét)	1. emlékeztető (6. hét)	2. emlékeztető (10. hét)
6A	<50	<200	967 (6/6) R3 = 8,8 (ct<0,01)	8500 (6/6)
14	<50	1800	3266 (3/6)	3650 (4/6)
19F	<50	<50	675 (4/6)	1750 (6/6)
23F	<50	<50	<50	<50

Előtiter (0. hét)	Indító	(4. hét)	1. emlékeztető (6. hét)	2. emlékeztető (10. hét)
6A	<100 R|>2,4	240 (5/5) R2=3,8 (a<0,01) R2'>9,0	900(5/5)	500 (5/5)
14	<100 R)>3,0	300 (5/5) R2-3.5 (a<0,01) R2'>10,4	1040 (5/5) R3 = 8,2 (a<0,01) R3'>84,9	8480 (5/5)
19F	<100	<100	400(1/5)	800(1/5)
23F	,100	<100	<100	200(1/5)

XV táblázat

6A, 14, 19F és 23F típusú S. pneumoniae tok-poliszacharidot (DP = 3-6) Al(OH)₃ szervetlen adjuvánson adszorbeálva tartalmazó multivalens vakcinával indukált IgG AB izotípus titerek* ELISA eredményei

	Előtiter (0. hét)	Indító (4. hét)	1. emlékeztető (6. hét)	2. emlékeztető (10. hét)
6A	<50 (0/5) R]>96,0	4800 (5/5) R2= 10,7 (a<0,01) R2'>1027	51 200 (5/5) R3 = 2,5 (a<0,01) R3'>2600	130000 (5/5)
14	<50 (0/5) R,>7,2	360 (5/5) R2=12,4 (a<0,01) R2'>89,3	4 480 (5/5) R3 = 4,4 (a<0,01) R,'>396,0	19 800 (5/5)
19F	<50 (0/5) R,>41,6	2080 (5/5) R2 = 9,0 (a<0,01) R/>371,2	18 560 (5/5) R3=l,9 (a<0,01) R3'>704,0	35 200 (5/5)
23F	<50 (0/5) Ri>17,6	880 (5/5) R2= 1,5 (a<0,01) R2'>25,6	1280 (5/5) R3 = 9,3 (a<0,01) R3'>237,6	11 800 (5/5)

* A titereket azon legnagyobb szérumhígítás reciprokának geometriai középértékeként adjuk meg, amely a reakcióközeghez képest kétszeres AB énéket mutat. Zárójelben feltüntettük az állatok számát (immunválaszt adó/összes)

XVI. táblázat

Diftéria toxin in vitro semlegesítése* S. pneumoneae oligoszacharid-CRM_m glikokonjugátumokkal immunizált nyulak szérumával

	Előtiter (0. hét)	Indító (4. hét)	1. emlékeztető (ó. hét)	2. emlékeztető (10. hét)
DP = 3-6 oligo-CRMi97:
oldható	<1/10	<1/10 0,03 gg/ml	1/20 (0,03 gg/ ml)	1/1280 (2,05 gg/ ml)

HU 211 210 Β

	Előtiter (0. hét)	Indító (4. hét)	1. emlékeztető (6. hét)	2. emlékeztető (10. hét)
A1(OH)3- adsz.	<1/10 0,016 gg/m 1)	1/10	1/640 (1,02 gg/ ml)	1/2560 (4,10 gg/ ml)
DP= 10-14 oligo-CRMl97
oldható	<1/10	<1/10	<1/10	<1/10 (0,016 gg/ ml)
A1(OH)3- adsz.	1/10	<1/10	1/40 (0,06 gg/ ml)	1/80 (0,13 gg/ ml)

* A titcreket azon hígítások reciprokában adjuk meg, amelyben a nyúl antiszérumok 50% védelmet adnak a sejteknek, amit a ³H-leuctn beépülésből határozunk meg, miután a sejteket diftéria toxin hatásának tettük ki. A zárójelbe tett számok a titereket jelentik gg/ml-ben, kontrollként FDA összehasonlító antiszérummal végzett meghatározás szerint.

MPL becsült értéke emberben: 0,01 pg/ml

Glikokonjugátumokkal szembeni immunválasz monospecifikus és homogén voltának kiértékelése A VII. és Vm. táblázat eredményeinek - amelyek a radioimmunvizsgálattal (RIA) és enzim-kötött immunszorbens vizsgálattal (ELISA) meghatározott antitest titerekre vonatkoznak - összehasonlításából kitűnik, hogy a RIA módszenei kapott titerek következetesen alacsonyabbak, mint az ELISA módszerrel mért titerek. Ez a megfigyelés - azzal együtt, hogy az anti-konjugátum antiszérum radiális immundiffúziójára és gyors elektroforézis analízisére alkalmazott agaróz gélben nincs immunprecipitátum - azt bizonyítja, hogy a S. pneumoniae oligoszacharid-CRM|₉₇ konjugátumokkal szembeni nyúl antiszérumok nagyspecificitású IgG izotípusos antitesteket tartalmaznak, amelyek nem tudják precipitálni az oligoszacharidok előállítására használt megfelelő tisztított szénhidrát polimereket.

A precipitáló antitestek hiánya egy antiszérumban a monospecificitásra jellemző, azaz arra, hogy egy adott molekula antigén-készletéből csupán egyetlen epitópot ismer fel az antitest [Berzofsky-Schechter, Molecular Immunoi. 18, 751-763 (1981)]. Az antigén-antitest komplexek precipitálásához rácsképződés szükséges, hogy kialakulhasson az összekapcsolódó antigén és antitest molekulák háromdimenziós, elágazó hálózata. Ennek végbemeneteléhez mind az antitestnek, mind az antigénnek többértékűnek kell lennie, mivel egyetlen antigén molekulához egyszerre egynél több antitestnek kell kötődnie. Ezért az a tény, hogy nincs észlelhető mértékű precipitálódás a S. pneumoniae oligoszacharid-CRMi₉₇ konjugátumokkal szembeni nyúl antiszérum és a homológ, tisztított, nagy móltömegű tok-poliszacharid között arra utal, hogy az antiszérumok tartalmaznak a szénhidrát-polimerre specifikus antitesteket (amint azt az ELISA és inhibíciós ELISA vizsgálatok mutatják), de az a poliszacharidnak csak egyetlen determinánsa (epitópja) ellen irányul.

A heterogén antitest-populáció az immunprecipitáló aktivitás mellett általában az alábbi tulajdonságokkal is rendelkezik: az antitest-válasz kifejtésére használt antigén egyetlen epitópja nem képes teljesen gátolni az antitestek teljes populációjának kötődését a teljes antigénhez, hanem csak az egy epitóphoz kötődő antitestek kötődését gátolja, míg a többi antitest szabadon kötődhet a komplett antigénen lévő többi epitóphoz. Az antitest-populáció heterogenitását inhibíciós ELISA vizsgálattal lehet kiértékelni. Ebben a vizsgálatban mérhetjük egy antitest-populáció teljes antigénhez való kötődési képességét, antigén/antitest kötődést gátló anyagok (inhibitorok), például az antigén izolált epitópjai jelenlétében. Ha grafikusan ábrázoljuk az antitest kötődését jelzett komplett antigénhez, jelzetlen komplett antigén növekvő koncentrációi jelenlétében, szigmoid görbét kapunk, amelyet standard görbeként használhatunk az antitest/antigén kötődésre. Ha az antitest-populáció heterogén, az antitest és a komplett antigén közötti kötődést nem lehet teljesen gátolni egyetlen antigén epitóp hozzáadásával, és az antitest/antigén kötődés standard görbéje csak részben tolódik el (részben átlapolódva, vagy részben párhuzamosan) mivel egyéb, a vizsgált epitóppal kapcsolatos antigén/antitest kölcsönhatásoktól eltérő antitest/antigén kölcsönhatások dominálnak. Ezzel szemben egy homogén antitest-populáció antigénhez való kötődése teljesen meggátolható egy izolált epitóp hozzáadásával; a homogén antitest-populációra kapott standard szigmoid antigén-antitest kötődési görbét átfedi vagy párhuzamosan eltolja a populáció specificitásának megfelelő, izolált epitóp hozzáadásával kapott görbe.

Kísérletileg megvizsgálva ily módon a S. pneumoniae glikokonjugátummal indukált nyúl IgG-t, homogén antitest-populációra jellemző affinitási görbét kapunk (4. ábra). A S. pneumoniae 6A oligoszacharid (akár nem-konjugált, akár konjugált formában) olyan szigmoid kötődés-gátlási görbét ad, amely közelítőleg párhuzamos a nagy móltömegű 6A szerotípus tok-poliszacharidjával kapott görbével. Amint várható volt, a heterológ (14-es típusú) oligoszacharid sem szabad (összekötőcsoporttal aktivált), sem konjugált formában nem gátolja a 6A típusú antigénre specifikus IgG izotípus populációt

Claims (8)

1. Eljárás monospecifikus és homogén immunválasz kiváltására alkalmas, vakcina hatóanyagaként alkalmazható, egy bakteriális tok-poliszacharidból származó oligoszacharid és egy hordozó protein kovalens konjugátumának előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) egy terminális redukáló csoportot tartalmazó oligoszacharidot diamino-etánnal pH 9-9,4 értéken, 25100 ’C-on 1-60 percen keresztül, majd piridin-boránnal 25-100 ’C-on 1-72 órán keresztül reagáltatva reduktívan aminálunk, (ii) a kapott aminált oligoszacharidot az aminocsoportra vonatkoztatva 5:1 mólarányban adipinsav vagy borostyánkősav diészterével, mint két funkciós cso16

HU 211 210 Β portot tartalmazó molekulával reagáltatjuk, amely funkciós csoportok egyike az aktivált oligoszacharid terminális csoportjával, a másik a hordozó proteinnel képes reagálni, és (iii) a kapott aktivált oligoszacharidot a hordozó protein aminocsoportjára vonatkoztatva 1:2 mólarányban a proteinnel reagáltatva egy lizin-maradékon keresztül összekapcsoljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reduktív aminálást 100 'C-on végezzük.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a piridin-boránnal való reagáltatást 50 ’C-on végezzük.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oligoszacharidként Streptococcus pneumoniae tok-poliszacharidból származó oligoszacharidot alkalmazunk.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oligoszacharidként Streptococcus pneumoniae 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F vagy 33F szerotípusú törzs tok-poliszacharidjából származó oligoszacharidot alkalmazunk.

6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oligoszacharidként Haemophilus influenzáé, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Escherichia coli, Streptococcus mutáns, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae vagy Staphylococcus aureus tokpoliszacharidjából származó oligoszacharidot alkalmazunk.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozó proteinként a diftéria toxinból származó CRM_I97-et alkalmazzuk.

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hordozó proteinként Salmonella flagellint, Haemophilus pilust, Haemophilus 15 kd, 28-30 kd vagy 40 kd membrán-proteint, Escherichia coli hőérzékeny enterotoxin LTB-t, diftéria toxint, tetanusz toxint, kolera toxint, rotavírus VP7 proteint vagy légzőrendszeri szinciciális F vagy G vírus proteint alkalmazunk