NO300759B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et kovalent konjugat av et oligosakkarid og et bærerprotein - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av oligosakkaridkonjugatvaksiner.

I et ytterligere trekk ifølge oppfinnelsen fremstilles oligosakkaridvaksiner som fremkaller en monospesifikk og homogen immunrespons på kapsulært polysakkarid. En spesiell utførelse av oppfinnelsen tilveiebringer vaksiner som induserer immunitet mot alminnelig utbredte serotyper av Streptococcus <p>neumoniae som kan være spesielt viktige for anvendelse hos pediatriske pasienter så vel som eldre og dem med redusert immunitet på grunn av svake-lighet eller sykdom (omfattende f.eks. AIDS-pasienter).

Pneumococcus ( Streptococcus pneumoniae) er en gram-positiv innkapslet kokkus som vanligvis vokser i par eller korte kjeder.

I den diplokokke formen er de nærliggende marginer avrundet, og de motsatte ender noe tilspisset, hvilket gir organismene en lansett-lignende form.

Pneumokokkene kan deles opp i serotyper basert på de komplekse polysakkarider som danner deres kapsler. 84 serotyper er blitt identifisert ved eksponering for typespesifikt antiserum, den såkalte Neufeld quelling-reaksjon. Alle er patogene for mennesker, men i klinisk praksis støter man hyppigst på typene 1, 3, 4, 7, 8 og 12. Typene 6, 14-, 19 og 23 forårsaker ofte pneumoni og otitismedia hos barn, men er mindre vanlige hos voksne (Austrian, 1983, i " Harrison' s Principles of Internal Medicine", Petersdorf et al., utgivere, 10. utgave, McGraw Hill Book Co.,

New York, pp. 918-922). Det bemerkes at pneumokokkene er en av

de tre primære patogener som er ansvarlige for pneumoni, sepsis og meningitt hos barn (McMillan, 1982, i " Core Textbook of Pediatrics". Kaye et al., utgivere, 2. utgave, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, p. 498).

Individer med høyere enn gjennomsnittlig risiko for utvikling av penumokokkinfeksjoner omfatter pasienter med kroniske systemiske sykdommer såsom hjertesykdom, kronisk bronkopulmonær sykdom, hepatitt sykdom, nyresvikt og malignitet. Det anbefales at disse individer blir vaksinert mot pneumokokkinfeksjon. For dette formål er det tilgjengelig 23 vaksiner omfattende de kapsulære polysakkarider av pneumokokktypene 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F og 33F (som omfatter serotyper eller grupper ansvarlige for 90% av alvorlig pneumokokksykdom i USA og resten av verden) (Pneumovax<® >Merck, Snarpe & Dohme, og Pnulmmune<®>, Lederle Laboratories). Effektiviteten av denne vaksine hos barn er tvilsom, ettersom evnen til immunologisk respons på forskjellige kapsulære antigener hos barn som er yngre enn 6 år utvikler seg på forskjellige tider som resultat av immunsystemets modningsegenskaper, og beskyttelsen kan være av kortere varighet enn den som observeres hos voksne (Harrison et al., ibid). Selv om relativt få pneumokokkserotyper antas å være ansvarlige for majoriteten av pediatriske pneumo-kokkinfeksjoner (Gray et al., 1979, J. Infect. Disease 140:979-983), innbefatter disse noen typer for hvilke modningen av den humane antistoffrespons på rensede kapsulære polysakkarider som anvendes som vaksiner, er langsomst (Anderson og Betts, 1989, Pediatric Infec. Dis. J. 8:S50-S53; Borgono et al., 1978, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 157:148-154).

Evne til immunrespons hos barn på Haemophilus influenzae b kapsulært polysakkarid er blitt oppnådd ved kobling av det kapsulære antigen til bærerproteiner for å frembringe en "konjugat"-vaksine; det blir antatt at T-lymfocytthjelpereffekter blir indusert av bærerproteinet og er ansvarlige for utviklingen av immunitet (Robbins et al., 1984, i " Bacterial Vaccines", Germanier, utgiver Academic Press, New York, pp. 289-316) . Se også: Cruse & Lewis, 1989, i "Conjugate Vaccines" utgivere Cruse & Lewis, Karger, Base, pp. 1-10. En lignende metode er blitt forsøkt for fremstilling av pneumokokkvaksiner.

Forskjellige forskere har isolert og renset intakte kapsulære polymerer som kan være nyttige i eller som vaksiner. F.eks. beskriver U.S. patent nr. 4.220.717 en fremgangsmåte for isolering og rensing av immunologisk aktivt polyribosylribitolfosfat (PRP) fra den kapsulære polymer fra H. influenzae b. Dessuten vedrører U.S. patent nr. 4.210.641 polysakkaridekstrakter fra H. influenzae som har en tilsynelatende molekylvekt høyere enn 200.000 dalton og er sammensatt hovedsakelig av galaktose, glukose og mannose og inneholder en liten mengde osaminer.

Flere forskere har anvendt disse og andre intakte kapsulære polymerer i preparater for å oppnå bedre immunologisk respons. F.eks. beskriver U.S. patent nr. 4.196.192 en vaksine inneholdende renset intakt PRP og et helcelle Bordetella pertussis-vaksine-preparat. Denne vei til å øke immunogenisiteten førte til forhøyet nivå av anti-PRP og anti-pertussis-antisoffer hos unge pattedyr.

Bærerproteiner kan gjøre mer enn å øke immunogenisiteten for konjugerte kapsulære polymerer; de kan også gjøre haptener immunogene. Haptener defineres som molekyler som kan binde seg spesifikt til et antistoff eller en lymfocyttreseptor, men som ikke selv kan indusere en immunrespons (dvs. at de ikke er immunogene). For å fremkalle en immunrespons, må små/lavmolekylære eller dårlig immunogene molekyler, som kalles haptener, vanligvis først bli koblet til et større molekyl, eller en bærer, som vanligvis er et heterologt protein. Injeksjon av haptenbærer-komplekset i et dyr vil så gi opphav til fremstilling av antistoffer ved hjelp av B-lymfocytter, hvorav noen vil være i stand til spesifikt å binde seg til det frie, ukoblede haptenmolekyl.

Blant de tidligste haptener som ble studert, var azo-fargestoff-forbindelser såsom anilin og o-aminobenzosyre. Landsteiner og Lampl (1918, Z. Immun. Forsch 26.: 293) koblet disse forbindelser ved diazotering til serumproteiner. Når kaniner ble injisert med disse kunstig fremstilte azo-proteiner, utviklet de presipiterende antistoffer som var spesifikke for de tilknyttede kjemiske grupper.

Andre eksempler på haptenforbindelser er dinitrofenol, som blir immunogent ved kobling som dinitrofenylgruppen (DNP) til bovint serumalbumin eller til bovint gammaglobulin (BGG), og lyserginsyredietylamid. Endog fontialdehyd er blitt vist å oppføre seg som et hapten; personer eksponert for formaldehyddamper fra produkter eller i laboratorier er blitt "overfølsomme" for forbindelsen, etter formylering av sine endogene makromolekyler in vivo.

Haptenets oppførsel er ikke begrenset til små organiske molekyler, og polypeptidhormoner opp til størrelsen av insulin er ofte dårlig, om i det hele tatt immunogene. For å oppnå høy antistofftiter for disse hormoner, er det således nødvendig å konjugere dem til et bærermolekyl (eller å skape større molekyler ved kryssbinding av mange av disse polypeptider).

Medvirkningen av bærermolekylet er spesielt interessant ved at bæreren spiller mer enn utelukkende en transportrolle. Ovary og Benaceraff (1963, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 114:723) viste dette ved å injisere kaniner med DNP-BGG. Injisering av mange immunogene stoffer i dyr vil frembringe et immunologisk "minne" om eksponeringen. Når det senere blir gitt en andre injeksjon, er det således en mye kraftigere immunrespons. Når Ovary og Benaceraff injiserte DNP-BGG igjen, var det i virkeligheten en sterk, sekundær respons som førte til markert forhøyet nivå av antistoffer rettet mot både DNP og BGG. Men når den andre injeksjon isteden ble utført med DNP-eggalbumin, merket man seg en mye svakere anti-DNP antistoffrespons. Forskjellen i respons skyldtes det som er blitt kalt bærereffekten, og den synes å involvere hjelper-T-lymfocytter.

Preliminære funn antyder at ikke alle proteiner kan være like effektive bærerproteiner for et gitt hapten. Robbins et al., (Infect. Immun. 4_0:245-256) har gitt data for eksperimentelle protein-polysakkaridkonjugatvaksiner, hvori det samme poly-sakkaridhapten ble konjugert til forskjellige proteinbærere, og antistoffresponsen på haptenet ble kvantifisert. Signifikante forskjeller ble bemerket i den dannede mengde av anti-hapten-antistoff, som viser at bæreren har en hovedrolle.

Med hensyn til pneumokokkvaksiner spesielt, har Lin og Lee (1982, Immunology 4_6:333) studert immunrespons hos voksne og unge mus eksponert for type 6A- og 19F-polysakkarider så vel som 19F konjugert til protein. Signifikant høyere IgM- og IgG2-antistofftiter ble indusert hos mus som fikk 19F-polysakkaridprotein-konjugater, enn i kontrollgruppen som fikk 19F-polysakkarid alene.

Andre forskere har studert konjugasjon av kapsulære polymerer til bærerproteiner i et forsøk på å øke antistoffdannelsen ved den såkalte "bærereffekt". F.eks. beskriver Schneerson et al.,

Journal of Experimental Medicine 152:361-376 (1980) H. influenzae b polymer-proteinkonjugater som viste seg å gi immunitet mot invasive sykdommer forårsaket av H. influenzae b. Referansen dokumenterer den alders-relaterte immunologiske oppførsel av kapsulære polymerer hos barn, og søker å overvinne denne alders-avhengighet ved å konjugere den intakte kapsulære polymer med forskjellige proteiner, omfattende serumalbuminer, Limulus <p>olv<p>hemus hemocyanin og difteritoksin. Konjugeringsmetoden medfører anvendelse av et sammenbindingsmiddel såsom adipindihydrazid.

Geyer et al., Med. Microbiol. Immunol. 165:171-288 (1979) fremstilte konjugater av visse Klebsiella <p>neumoniae kapsulære polysykkaridfragmenter med en nitrofenyletylaminlinker ved reduktiv aminering, og det derivatiserte sukker ble deretter bundet til proteiner ved anvendelse av azo-kobling.

U.S. patent nr. 4.057.685 til Mclntire, registrert 9. mai 1974, vedrører et Escherichia coli-lipopolysakkarid med redusert toksisitet, kovalent koblet til et proteinantigen ved omsetning med halogenacylhalogenid.

U.S. patent nr. 4.356.170 til Jennings et al., registrert 27. mai 1981, gitt 26. oktober 1982, vedrører fremstilling av polysakkarid-proteinkonjugater ved reduktiv aminering.

Anderson (1983, Infection and Immunity 39:233-238) vedrører konjugater mellom oligosakkarider fra Haemophilus influenzae type b kapsulært polysakkarid og CRM197, en ikke-toksisk, men antigenisk identisk variant av difteritoksin.

Snippe et al., (1983, Infection and Immunity 42.:842-844) , beskriver en semisyntetisk vaksine mot Streptococcus <p>neumoniae type 3 hvori et heksasakkarid isolert fra et partielt syrehydro-lysat av det kapsulære polysakkarid S3 ble koblet til stearylamin ved reduktiv aminering, og deretter inkorporert i liposomer. Den resulterende konjugat/liposomvaksine ble observert å indusere beskyttelse mot S. pneumoniae type 3 hos mus.

U.S. patent nr. 4.663.160 til Tsay et al., registrert 14. mars 1983, gitt 5. mai 1987, vedrører bakterier hvori et detoksifisert polysakkarid fra en gram-negativ bakterie blir kovalent koblet til et detoksifisert protein fra den samme art av gram-negative bakterier, ved hjelp av en 4-12 karbongruppe.

U.S. patent nr. 4.619.828 til Gordon, registrert 5. januar 1984, gitt 28. oktober 1986, vedrører konjugater mellom poly-sakkaridmolekyler fra patogene bakterier såsom Haemophilus influenzae b, Stre<p>tococcus pneumoniae. Neisseria meninaitidis. og Escherichia coli og T-celleavhengige antigener såsom difteri- og tetanustoksoider.

U.S. patent nr. 4.808.700 til Anderson og elements, registrert 10. august 1984, gitt 28. februar 1989, og U.S.

patent nr. 4.761.283 til Anderson, registrert 28. mars 1985,

gitt 2. august 1988, vedrører den kovalente binding av kapsulære polymerfragmenter til bakterietoksiner, toksoider, eller sammenbinding av underenheter ved hjelp av reduktiv aminering.

U.S. patent nr. 4.711.779 til Porro et al., registrert

2. juli 1986, gitt 8. desember 1987, vedrører glykoprotein-konjugatvaksiner som har treverdig immunogen aktivitet og omfatter antigendeterminanter fra de kapsulære polysakkarider fra en gram-positiv bakterie og en gram-negativ bakterie, så vel som enten CRM197, tetanustoksoid, eller pertussistoksin..

Fremstillingen av konjugatvaksiner, hvori kapsulære poly-sakkaridhaptener blir bundet til bærerproteiner, omfatter følgende fremgangsmåter:

(i) kapsulært polysakkarid må fremstilles

(ii) dersom det skal anvendes et fragment av polysakkaridet, må dette separeres fra intakt polysakkarid (iii) sakkaridet må aktiveres, eller gjøres mottagelig for konjugasjon, dvs. at det må dannes grupper som er i

stand til å binde seg kovalent til protein

(iv) sakkaridet konjugeres med protein.

Forskjellige metoder som er kjent i teknologien for gjennom-føring av disse fire trinn er oppført i Tabell 1.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av et kovalent konjugat av et oligosakkarid og et bærerprotein som er karakterisert ved trinnene: (i) å omsette et oligosakkarid som har en terminal reduserende gruppe med diaminoetan i nærvær av pyridinboran slik at det foregår reduktiv aminering ved en temperatur på ca. 100°C i minst 15 minutter og at omsetningen med pyridinboran gjennomføres ved en

temperatur på ca. 50<*>C i minst 48 timer; og

(ii) å omsette det aminerte oligosakkaridprodukt fra (i) med et molekyl omfattende to funksjonelle grupper, hvorav en er i stand til å reagere med den terminale gruppe i det aktiverte oligosakkarid, og den andre som er i stand til å reagere med nevnte bærerprotein valgt fra gruppen bestående av CRM197, Salmonella flagellin, Haemo<p>hilus pilin, Haemophilus 15 kDa, 28-30 kDa eller 40 kDa membranprotein, Escherichia coli varmelabilt enterotoksin LTB, difteritoksin, tetanustoksin, koleratoksin, rotavirus VP7-protein, og respiratorisk synsytialt virus

F-eller G-protein; og

(iii) å omsette det aktiverte oligosakkaridprodukt fra (ii)

med nevnte bærerprotein slik at konjugering finner sted.

Denne fremgangsmåte tillater effektiv syntese av glykokonjugater ved produksjonshastigheter som er signifikant raskere enn de metoder som for tiden anvendes. Glykokonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes i vaksinepreparater, og er blitt vist å være immunogene.

I en spesiell utførelse vedrører den foreliggende oppfinnelse fremstilling av glykokonjugater som inkorporerer oligosakkarider avledet fra Stre<p>tococcus pneumoniae kapsulære polysakkarider. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fører til effektiv fremstilling med høyt utbytte av S. <p>neumoniae-<g>lvkokoniu<g>ater som kan anvendes i vaksinepreparater med spesiell relevans til den pediatriske befolkning, i hvilken en stor andel av de viktigste sykdommer har sammenheng med infeksjon med S. pneumoniae. Immunogene konjugater er blitt funnet å være mindre aldersavhengige enn kapsulære polymerer alene, og er nyttige for den aktive immunisering av svært unge varmblodige pattedyr mot systemiske infeksjoner med de respektive innkapslede bakterier.

I et videre trekk av oppfinnelsen har glykokonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen overraskende blitt funnet å fremkalle en monospesifikk og homogen immunrespons, som fordelaktig kan unngå dannelse av autoimmune reaksjoner og beslektede post-vaksinasj onssyndromer.

Det er viktig at de immunogene konjugater fremstilt ifølge opfinnelsen ikke inneholder potensielt toksiske sammenbindings-midler, såsom adipindihydrazid eller p-nitro-fenyletylamin, som er blitt anvendt ved konjugering av karbohydrat til protein.

CRM197 et ikke-toksisk protein antigenisk kryssreaktivt med

difteritoksin

DMSO dimetylsulfoksyd

DP polymerisasjonsgrad

MIC minimum inhiberende konsentrasjon

SD substitusjonsgrad

SIDEA suksinimidyldiester av adipinsyre

SIDES suksinimidyldiester av ravsyre

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1. Generell strategi for syntese av oligosakkarid-pro-teinkonj ugater.

A. Høymolekylære polysakkarider blir syrehydrolysert for å gi oligosakkarider med en gjennomsnittlig molekylvekt på

2,5 x IO<3>.

B. Oligosakkarider blir (1) aktivert ved omsetning med diaminoetan [H2N (CH2) 2NH2] ved pH = 9, redusert med pyridinborhydrid (PyBH3) , deretter (2) omsatt med suksinimidyldiesteren og adipinsyren (SIDEA) i

dimetylsulfoksyd (DMSO).

C. Aktiverte oligosakkarider blir koblet til bærerprotein via

lysinrester.

Figur 2. Anvendelse av en "skreddersydd" spacer i koblings-fremgangsmåten.

A. Glykokonjugat dannet ved tidligere fremgangsmåte som beskrevet av Porro et al., (1985), Mol. Immunol. 22:907-919, med amidbinding (pil) mellom oligosakkarid og adipinsyre fire karbonlinker. Samlet lengde av spacer er ca. 10,4 Å.

B. Glykokonjugat dannet ifølge den foreliggende oppfinnelse hvori en to karbonrest (pil, dannet med diaminoetan), og en amidbinding, eksisterer mellom oligosakkarid og ravsyre to karbonlinkere dannet ved omsetning med SIDES. Samlet lengde

av spacer er ca. 10 Å.

C. Glykokonjugat dannet ifølge den foreliggende oppfinnelse hvori en to karbonrest (pil, dannet med diaminoetan), og en amidbinding, eksisterer mellom oligosakkarid og adipinsyre fire karbonrest dannet ved omsetning med SIDEA.

Samlet lengde av spacer er ca. 14,5 Å.

Figur 3. Effektivitet av konjugering av CRM197 til aktiverte oligosakkarider inneholdende adipinsyre versus ravsyrederivat-spacere. SDS-polyakrylamidgelelektroforese av produkter fra konjugeringsreaksjoner (sølvfarget).

A. Spor 1: Molekylvektstandarder (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K,

31,0 K, 21,5 K).

Spor 2: CR<M>197 (1 jug) referanse.

Spor 3: Konjugert oligosakkarid 6A-CRM197 med ravsyre som spacer (2 jug) (forhold 1:1 monoester/samlede aminogrupper av CRM197 i 50% DMSO) .

Spor 4: Konjugert oligosakkarid 6A-CRM197 med ravsyre som spacer (2 ^g) (forhold: 1:2 monoester/samlede aminogrupper av CRM197 i 5 0% DMSO) .

Spor 5: Konjugert oligosakkarid 6A-CRM197 med adipinsyre som spacer (2 jug) (forhold: 1:2 monoester/samlede aminogrupper i CR<M>197 i 50% DMSO) .

Spor 6: Konjugert oligosakkarid 14-CRM197 med ravsyre som spacer (2 ug) (forhold: 1:4 monoester/samlede aminogrupper i CR<M>197 i 50% DMSO) .

Spor 7: Konjugert oligosakkarid 19F-CRM197 med ravsyre som spacer (2 tzg) (forhold: 1:4 monoester/totale aminogrupper i CR<M>197 i fravær av 50% DMSO) .

Spor 8: Konjugert oligosakkarid 23F-CRM197 med ravsyre som spacer (2 /xg) (forhold: 1:2 monoester/samlede aminogrupper i CR<M>197 i 50% DMSO) .

Spor 9: CRM197 (1 Mg) referanse.

B. Spor 1: CR<M>197 (1 ^g) referanse.

Spor 2: CRM197 referanse (1 fig, forskjellig parti sammenlignet med spor 1).

Spor 3: Konjugert oligosakkarid 23F-CRM197 med adipinsyre som spacer (2 fig) (forhold: 1:2 monoester/ samlede aminogrupper i CRM197 i 50% DMSO) .

Spor 4: Molekylvektstandarder (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K,

31,0 K, 21,5 K).

Spor 5: Konjugert oligosakkarid 2 3F-CRM197 med adipin syre som spacer (2 fig) (forhold: 1:2 monoester/samlede aminogrupper i CRM:M197 i 50%

DMSO).

Spor 6: CRM197 (1 fig) referanse.

CRM197 referanse (1 fig, forskjellig parti sammenlignet med spor 1).

Spor 7: Konjugert oligosakkarid 6A-CRM197 med adipinsyre som spacer (2 jig) . C. Spor 1: Molekylvektstandarder (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K,

31,0 K, 21,5 K).

Spor 2: CR<M>197 (1 iig) referanse.

Spor 3: Konjugert oligosakkarid 6A-CRM197 med adipinsyre

som spacer (2 fig) .

Spor 4: Konjugert oligosakkarid 14-CRM197 med adipinsyre

som spacer (2 ug).

Spor 5: Konjugert oligosakkarid 19F-CRM197 med adipinsyre

som spacer (2 fig) .

Spor 6: Konjugert oligosakkarid 23F-CRM197 med adipinsyre

som spacer (2 fig) .

Spor 7: Molekylvektmarkører (92,5 K, 66,2 K, 45,0 K,

31,0 K, 21,5 K).•

Figur 4. Kanin IgG-respons på S. <p>neumoniae-oligosakkarid 6A-CRM197-konjugater. Inhiberings-ELISA-analyse av affinitetsverdi av IgG-isotype indusert til de kapsulære polysakkarider.

A. Type 6A kapsulært polysakkarid.

B. Type 6A oligosakkarid (DP = 10) i fri form eller konjugert

til CRM197.

C. Type 14 oligosakkarid (DP = 12) aktivert med molekylspacer eller konjugert til CR<M>197.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for kovalent binding av oligosakkarider avledet fra bakterielle kapsulære polysakkarider til bærerproteiner; metoden ifølge oppfinnelsen danner nye glykokonjugater via en ny fremgangsmåte.

For klargjøring av beskrivelsen, og ikke for begrensning, er den detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen oppdelt i følgende avsnitt:

Fremstilling av oligosakkarider.

Aktivering av oligosakkarider.

Konjugering av oligosakkarider til protein.

Immunokjemisk karakterisering av glykokonjugater. Vaksineformulering og administrasjon.

Brukbarhet av oligosakkaridkonjugatvaksiner mot pneumokokker.

FREMSTILLING AV OLIGOSAKKARIDER

Høymolekylært kapsulært polysakkarid kan anskaffes kommersielt (American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD)), eller oppnås ved fremgangsmåtene beskrevet av Porro et al., 1983, J. Biol. Stand. 11:65-71. Et hvilket som helst polysakkarid kan anvendes, omfattende, men ikke begrenset til dem som finnes i kapslene av Streptococcus <p>neumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meninaitidis. Escherichia coli. Salmonella typhi, Streptococcus mutans, Cry<p>tococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae, Staphvococcus aureus, og Pseudomonas aeruginosa.

Antigenfragmenter med minst en reduserende ende kan dannes ut i fra kapsulære polymerer ved forskjellige metoder, avhengig av den spesielle kapsulære polymerens strukturelle trekk. Begrenset oksydativ spalting med periodat (eller beslektede reagenser) vil etterlate aldehydtermini; en slik metode vil være begrenset til polymerer som har dihydroksynabogrupper på en ikke-syklisk rest. Hydrolyse av en glykosidbinding frembringer en reduserende sukkerterminus. Slik hydrolyse kan mest spesifikt gjennomføres enzymatisk ved glykosidaser, men denne anvendelse ville være begrenset til relativt få kapsulære polymerer, f.eks. Streptococcus pneumoniae 8, som det er kjent glykosidaser for. Sur hydrolyse anvendes vanligvis for hydrolyse av glykosid-bindinger. Anvendbarheten av denne metode ville være begrenset dersom polymeren inneholder syrefølsomme, ikke-glykosidiske bindinger, eller dersom polymeren inneholder syrefølsomme grenbindinger som er viktige for den antigene spesifisitet.

I spesielle utførelser kan S. <p>neumoniae type 6A kapsulært polysakkarid hydrolyseres i ca. 10"<2>M eddiksyre ved ca. 100°C i ca. 3 0 timer; S. pneumoniae type 14 kapsulært polysakkarid kan hydrolyseres i ca. 0,5 M trifluoreddiksyre ved ca. 70°C i ca. 7 timer; S. pneumoniae type 19F polysakkarid kan hydrolyseres i ca. 10"<2>M eddiksyre ved ca. 50°C i ca. 4 8 timer; og S. pneumoniae type 23F polysakkarid kan hydrolyseres i ca. 0,25 M trifluoreddiksyre ved ca. 70°C i ca. 3 timer.

Ifølge oppfinnelsen består oligosakkarider som skal konjugeres til protein fortrinnsvis av mellom tre og seks repeterende enheter (eller mellom 10 og 30 monosakkaridrester), og mere fortrinnsvis består de av mellom tre og fire repeterende enheter (eller ca. 15 monosakkaridrester) ettersom oligosakkarider av denne lengde, inkorporert i glykokonjugater, er blitt vist å være optimalt immunogene.

AKTIVERING AV OLIGOSAKKARIDER

Oligosakkarider kan aktiveres ved en fremgangsmåte med reduktiv aminering etterfulgt av omsetning med et bifunksjonelt molekyl, såsom, men ikke begrenset til, en diester. En skisse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er vist i Figur 1 og Tabell II, som sammenligner fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse med den fremgangsmåte som er beskrevet i Porro et al., 1985, Mol. Immunol. 22.: 907-919. Bemerk at aktiveringstiden ved anvendelse av den førstnevnte fremgangsmåte var 7-14 døgn; denne er blitt avkortet, ifølge den foreliggende oppfinnelse, til 15 minutter. Bemerk også at reduksjonstiden ved anvendelse av den førstnevnte fremgangsmåte var 7-14 døgn; denne er blitt avkortet, ifølge den foreliggende oppfinnelse, til 48 timer. Den foreliggende oppfinnelse krever følgelig 12-26 færre døgn for gjennomføring enn den førstnevnte fremgangsmåte. Dette er en viktig fordel ettersom eksponering av karbohydrater til forhøyet temperatur, såsom 50°C, kan føre til nedbrytning.

I samsvar med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gjennomføres reduktiv aminering av den endereduserende enhet i et oligosakkarid ved anvendelse av et molekyl inneholdende to aminogrupper. I en foretrukket utførelse ifølge oppfinnelsen gjennomføres reduktiv aminering ved omsetning av en gitt molar mengde av oligosakkarid med en diaminoetanløsning i 10X molart overskudd i 0,2 M KH2P04 ved ca. pH = 9 ved en temperatur på ca. 100 °C i fortrinnsvis ca. 15 minutter. Etter dette kan det tilsettes en molar mengde av pyridinboran tilsvarende 25 ganger den molare konsentrasjon av oligosakkarid i preparatet, og reaksjonen gjennomføres ved mellom ca. 50°C i fortrinnsvis ca. 48 timer.

Det resulterende produkt av den reduktive amineringsreaksjon kan deretter omsettes med et bifuksjonelt molekyl, idet hver funksjonell gruppe er i stand til å reagere med enten den terminale aminogruppe i det aktiverte oligosakkarid eller aminogrupper som er tilstede i bærerproteinets struktur, slik at det bifunksjonelle molekyl kan tjene til å binde sammen oligosakkaridet og bærerproteinet. I en foretrukket utførelse ifølge oppfinnelsen er den bifunksjonelle gruppe en diester, og er mere spesielt en diester av adipinsyre, som er blitt vist å ha sammenheng med mer effektiv glykosylering av protein. I en foretrukket spesiell utførelse ifølge oppfinnelsen blir et oligosakkarid, som er blitt underkastet reduktiv aminering som beskrevet ovenfor, videre omsatt med en suksinimidyldiester av ravsyre eller mer fortrinnsvis, adipinsyre; denne omsetning kan best gjennom-føres med det aminerte oligosakkarid ved en molar konsentrasjon (som aminogrupper) tilsvarende ca. 1/5 av den molare konsentrasjon av SIDEA (eller SIDES) i en løsning av dimetylsulfoksyd (DMSO) ved mellom 0 og 25°C, og fortrinnvis ca. 4'C i mellom 0,5 og 5 timer og fortrinnsvis ca. 2 timer. Det aktiverte oligosakkarid kan deretter oppsamles ved utfelling ved anvendelse av 1,4 dioksan (80% v/v), som også etterlater overskuddet av SIDEA (eller SIDES) i supernatanten.

KONJUGERING AV OLIGOSAKKARIDER TIL PROTEIN

Ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er egnede bærerproteiner valgt fra gruppen bestående av: CRM197, Salmonella flagellin, Hemophilus pilin, Hemorjhilus 15 kDa, 28-30 kDa og 40 kDa membranproteiner, Escherichia coli varmelabilt enterotoksin LTB, difteritoksin, tetanustoksin, koleratoksin, og virusproteiner omfattende rotavirus VP7 og respiratorisk syncytial virus F- og G-proteiner.

I "bærereffekten" blir et svakt antigen, ved å bli bundet til et sterkere antigen som bærer (dvs. et heterologt protein), mere immunogent enn om det ble presentert alene. Dersom et dyr er blitt immunisert tidligere med bæreren alene, kan dyret være "primet" og frembringe en forsterket immunrespons ikke bare på bærerantigen, men også på tilknyttede haptengrupper. Barn immuniseres rutinemessig med tetanus- og difteritoksoider.

De ville således være primet for påfølgende presentasjon av et kapsulært polymert antigen konjugert til hvilket som helst av disse toksoider.

Generelt kan et hvilket som helst heterologt protein tjene som bærerantigen. Visse bakterietoksiner såsom tetanus og difteri kan imidlertid ha en ytterligere fordel ved at de er sammensatt av to deler, hvorav en (den "bindende"-underenhet) har sterk affinitet for binding til celleoverflater hos pattedyr. Konjugering til et slikt "bindings"-protein ville forståelig nok tillate det bårede antigen mere effektivt å initiere respons i immunsystemets celler.

Bærerproteinene som den kapsulære polymer er konjugert med, kan være naturlig toksin eller detoksifisert toksin (toksoid). Ved relativt nye mutasjonsteknikker kan man også fremstille genetisk forandrede proteiner som antigenisk ligner på toksinet, men som allikevel er ikke-toksiske. Disse kalles "kryssreagerende stoffer", eller CRM'er. CRM197 er bemerkelsesverdig siden det har en enkelt aminosyreforandring i forhold til det naturlige difteritoksin og er immunologisk umulig å adskille fra dette.

Konjugering av kapsulær polymer til naturlig toksin kan redusere toksisiteten, men signifikant toksisitet kan fremdeles være tilbake. Ytterligere detoksifisering av proteintoksiner anvender således formalin, som reagerer med proteinets frie aminogrupper. Resttoksisiteten kan fremdeles være et problem. Dessuten er spontan detoksifisering mulig med et hvilket som helst parti av vaksine, og forblir et bekymringsfullt punkt ved denne metode.

Alternativt kan naturlig toksin detoksifiseres med formalin for å frembringe konvensjonelt toksoid før konjugering med kapsulær polymer. Den tidligere formalinbehandling reduserer imidlertid det antall frie aminogrupper som er tilgjengelige for reaksjon med de reduserende grupper på det kapsulære polymer-fragment. CRM'er har således signifikante fordeler ved at de ikke har noen iboende toksisitet, enda ingen av deres aminogrupper er opptatt av formalinet. En ytterligere fordel er at ingen bio-risiko eksisterer ved arbeid med CRM'er.

Når det gjelder CRM197, som er immunologisk identisk med naturlig toksin, vil behandling med formalin (selv om det ikke er noe behov for å detoksifisere) betydelig forsterke den immunologiske respons. Man forestiller seg at dette skyldes stabilis-ering av molekylet mot nedbrytning ved mekanismer i kroppen og/eller aggregasjon ved kryssbinding (partiklenes immunogenisitet øker med størrelsen).

Av alle grunnene ovenfor er tetanus- og difteritoksiner hovedkandidater for bærerproteiner, men allikevel er det andre som også kan være egnet. Selv om disse andre kanskje ikke har den sikkerhetshistorie man finner hos difteri og tetanus, kan det være andre overveiende grunner til å anvende dem. F.eks. kan de være enda mer effektive som bærere, eller produksjonsøkonomien kan være betydelig. Andre kandidater for bærere kan omfatte toksiner av pseudomonas, staphylococcus, streptococcus, pertussis og Eschrichia coli.

I en spesiell utførelse av oppfinnelsen kan aktiverte oligosakkarider bindes til CRM197-protein som er blitt renset på følgende måte: CRM197, fremstilt av stammen Corvnebacterium di<p>htheriae, kan separeres fra kulturmediet ved å lede bakterie-kulturen gjennom en Millipore-membran, utfelling av protein fra filtratet, og rensing av CRM197 ved ionebyttekromatografi, som beskrevet i avsnitt 6, nedenfor. Alternativt kan i alt vesentlig rent CRM197 oppnås ved en hvilken som helst fremgangsmåte som er kjent i teknologien.

Aktivert oligosakkarid kan bindes kovalent til bærerprotein i nærvær av et organisk løsningsmiddel, og eventuelt et hvilket som helst annet middel (såsom et kondenseringsmiddel) for å befordre bindingen av den terminale funksjonelle gruppe i det aktiverte oligosakkarid til proteinet. I en spesiell, foretrukket utførelse ifølge oppfinnelsen kan aktivert oligosakkarid som bærer en terminal estergruppe bindes kovalent til frie aminogrupper som er tilstede på bærerproteinet på følgende måte: Aktivert oligosakkarid kan løses i dimetylsulfoksyd og deretter tilsettes til en vandig løsning av bærerprotein (f.eks., men ikke begrenset til CRM197 ved en konsentrasjon på ca. 2 mg/ml) slik at molforholdet monoester-aktivert oligosakkarid/samlede aminogrupper på bærerproteinet er ca. 1:2, og sluttkonsentrasjonen av DMSO er ca. 50% v/v. Konjugeringsreaksjonen gjennomføres ved 4°C, og selv om omsetningen er nesten fullstendig på ca. 2 timer, er det beleilig å la omsetningen gå videre over natten for å øke reaksjonsutbyttet til de høyest mulige verdier for hver type spesifikt glykokonjugat. De således oppnådde glykokonjugater blir deretter renset ved gelkromatografi.

For syntese av en enverdig vaksine kan oligosakkarider avledet fra en enkelt serotype av bakterie konjugeres til protein. For syntese av en flerverdig vaksine kan det fremstilles glykokonjugater ved binding av en blanding av oligosakkarider avledet fra bakterier av forskjellige arter eller forskjellige serotyper til et bærerprotein; alternativt kan det blandes sammen glykokonjugater fremstilt ved omsetning av en enkelt type oligosakkarid med bærerprotein i separate reaksjoner ved anvendelse av forskjellige oligosakkarider. En flerverdig vaksine kan således omfatte et bærerprotein som bærer en homogen eller en heterogen populasjon av bundede oligosakkarider.

IMMUNOKJEMISK KARAKTERISERING AV GLYKOKONJUGATER

Verifikasjon av immunogenisiteten for de glykokonjugater som er fremstilt ved fremgangsmåten ovenfor, kan testes i et hvilket som helst egnet animalsk system før administrasjon til mennesker, omfattende, men ikke begrenset til kaniner, griser, marsvin, mus, rotter eller geiter. I en spesiell utførelse kan kaniner (med en vekt på ca. 2 kg) inokuleres subkutant med glykoproteinkonjugat i nærvær eller fravær av aluminiumfosfat eller -hydroksyd.

Ca. 2,5 y. q oligosakkarid ville være en egnet dose for en 2 kg kanin. Antistofftitere kan deretter evalueres ved "enzymelinked immunosorbent assay" (ELISA) eller en hvilken som helst annen fremgangsmåte kjent i teknologien. Siden de dannede antistoffer mot glykokonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kanskje kan være ute av stand til å immunopresipitere antigen, anbefales ikke antistoffundersøkelser som er avhengige av immunopresipitering for bestemmelse av titer.

VAKSINEFORMULBRING OG ADMINISTRASJON

Egnede bærermedier for formulering av en vaksine omfatter natriumfosfat-bufret saltløsning (pH 7,4) eller 0,125 M alu-miniumfosfatgel oppslemmet i natriumfosfat-bufret saltløsning ved pH 6 og andre konvensjonelle medier.

Vanligvis er vaksiner inneholdende fra 5 til 100 /ig, fortrinnsvis 10 til 50 jiq oligosakkarid, passende for å fremkalle et effektivt antistoffnivå mot den kapsulære polymer i unge varmblodige pattedyr Naturligvis ville den nøyaktige dosering bli bestemt ved rutinemessige dose/responseksperimenter. Konsentrasjonen av glykoproteinkonjugatene for fremstilling av vaksiner for barn ligger innenfor området 25 til 200 jug oligosakkarid. Høyere doser kan administreres på basis av kroppsvekt. Flere små doser gitt i rekkefølge ville forventes å være overlegne sammenlignet med samme konjugatmengde gitt som en enkelt injeksjon.

Vaksinene kan administreres til varmblodige pattedyr av en hvilken som helst alder, og er spesielt tilpasset til å indusere aktiv immunisering mot systemiske infeksjoner hos unge pattedyr, forårsaket av patogenene Haemo<p>hilus influenzae type b, Escherichia coli. Streptococcus pneumoniae, Neisseria meninaitidis og Pseudomonas aeruginosa.

Vaksinen avgis subkutant, intravenøst, intramuskulært, intraperitonealt, oralt eler intranasalt. Vaksinen kan omfatte glykokonjugat i løselig eller mikropartikkelform, eller inkorpo-reres i mikrokuler eller mikrovesikler, inbefattet liposomer.

ANVENDBARHET AV OLIGOSAKKARIDKONJUGATVAKSINER

I foretrukne utførelser anvendes glykokonjugatvaksiner fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse rettet mot innkapslede patogene bakterier til å beskytte mottagelige individer mot utvikling av infeksjoner forårsaket av disse agenser. Mottagelige individer omfatter små barn med umodent immunsystem, individer uten milt, så vel som et hvilket som helst individ med et kompromitert immunsystem eller kronisk sykdom, spesielt ervervet immunsviktsyndrom (A.I.D.S.), hematopoietisk malignitet, diabetes, kronisk hjertesykdom, kronisk lungesykdom og sigdcelleanemi. Glykokonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen, i kraft av sin konjugasjon til et bærerprotein, forsterker immunogenisiteten til de oligosakkarider som de bærer.

Glykokonjugatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan således anvendes ved vaksinasjoner for å gi beskyttelse mot infeksjon med en hvilken som helst bakterie som har en polysakkaridkapsel, omfattende Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmonella tvphi, Streptococcus mutans, Crv<p>tococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae . Staphvlococcus aureus, og Pseudomonas aeru<g>inosa. Stammer av S. pneumoniae som er spesielt virulente hos barn, og som tilveiebringes spesielt av den foreliggende oppfinnelse, omfatter typene 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23 og 33F.

I spesielle utførelser kan vaksinene fremstilt ifølge oppfinnelsen anvendes til å indusere en monospesifikk og homogen immunrespons. En monospesifikk immunrespons medfører flere fordeler, omfattende tilveiebringelse av antistoffer med (i) homogen spesifisitet, hvori i alt vesentlig alle antistoffer er rettet mot en spesifikk epitop og karakteriseres ved den samme konstante affinitetsverdi; (ii) en høy konstant affinitetsverdi med overlegen antibakteriell aktivitet; (iii) øket målspesifisitet og fravær av kryssreaktivitet med vertsrelaterte antigener, hvilket fører til en sikrere vaksine; og (iv) redusert komple-mentaktivering på grunn av redusert presipiteringsaktivitet for monospesifikke antistoffer, hvilket også fører til en sikrere vaksine.

I ytterligere utførelser kan den foreliggende oppfinnelse anvendes til fremstilling av vaksiner som anerkjenner peptider eller lipooligosakkarid- eller andre overflateoligosakkarid-haptener som er bundet, ved fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen, til bærerproteiner. Slike vaksiner kan anvendes f.eks. ved induksjon av immunitet mot tumorceller, eller ved fremstilling av antitumor-antistoffer konjugert med et kjemoterapeutikum eller bioaktivt agens; slik antitumoraktivitet kunne induseres ved binding av et tumorspesifikt antigen, eller en epitop derav, til et bærerprotein ved anvendelse av fremgangsmåter ifølge denne oppfinnelse.

EKSEMPEL:

UTVIKLING AV EN FLERVERDIG PNEUMOKOKK OLIGOSAKKARIDKONJUGATVAKSINE FREMSTILLING AV POLYSAKKARID

S. pneumoniae type 6A kapsulært polysakkarid, S. <p>neumoniae type 14 kapsulært polysakkarid, S. pneumoniae type 19F kapsulært polysakkarid, og S. pneumoniae type 23F kapsulært polysakkarid ble levert fra the American Type Culture Collection.

HYDROLYSE AV POLYSAKKARID

HYDROLYSE AV S. PNEUMONIAE TYPE 6A- P0LYSAKKARID

2 mg av type 6A S. pneumoniae kapsulært polysakkarid ble løst i 1 ml vandig løsning inneholdende 10 mM eddiksyre ved pH = 3,4, fikk deretter hydrolysere i forseglede ampuller dyppet i oljebad ved en temperatur på 100°C i 30 timer. De resulterende oligosakkarider ble deretter adskilt fra reaksjonsblandingen ved kromatografi over Sephadex G15 (Pharmacia, Uppsala) kondisjonert med en 15 mM løsning av NaCl ved pH 7,0 ved 4°C.

De kromatografiske avløp ble deretter analysert ifølge fremgangsmåtene rapportert av Kabat (1964 i "Experimental Immunochemistry", utgiver E.A. Rabat og Mayer, pp. 538-541), Chen et al., (1956, anal. Chem. 28:1756-1758), og Porro et al. (1981, Anal. Biochem. 118:301-306) for å bestemme tilstedeværelsen av metylpentoser, fosfor og reduserende grupper, f.eks. aldehyd-grupper. Analysen viste et forhold pentose/aldehyd på 3,96, et forhold metylpentose/fosfor på 0,96, og et forhold fosfor/aldehyd på 4,12.

Gelkromatografi på Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) ved anvendelse av buffer, ga en fordelingskonstant (kd) på 0,538 (med heksose), tilsvarende en molekylvekt på ca. 2500.

N.M.R., gasskromatografi og støkiometrisk analyse viste at oligosakkaridene besto av ca. 3-4 repeterende basisenheter, hvorav ble funnet galaktose, som var det immunodominerende sukker.

HYDROLYSE AV S. PNEUMONIAE TYPE 14 POLYSAKKARID

2 mg av type 14 S. pneumoniae kapsulært polysakkarid ble lost i 1 ml vandig løsning inneholdende 0,5 M trifluoreddiksyre, og fikk deretter hydrolysere i forseglede ampuller dyppet i oljebad ved en temperatur på 7 0°C i 7 timer. De resulterende oligosakkarider ble deretter separert fra reaksjonsblandingen ved kromatografi over Sephadex G15 (Pharmacia, Uppsala) kondisjonert med en 15 mM løsning av NaCl ved pH 7,0 ved 4°C.

De kromatografiske avløp ble deretter analysert på heksosamin- og aldehydinnhold, og funnet å ha et heksosamin til aldehydforhold på 3,17. Gasskromatografi og støkiometrisk analyse viste en molekylstørrelse tilsvarende tre til fire repeterende basisenheter. Avgreningen av galaktose, som bestemt ved gasskromatografi, var innenfor 10%. Gelkromatografi på Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) ved anvendelse av 15 mM NaCl ved pH 7,0, viste for oligosakkaridet en fordelingskonstant (Kd) på 0,30 som bestemt ved total heksose.

HYDROLYSE AV S. PNEUMONIAE TYPE 19F POLYSAKKARID

2 mg av type 19F S. pneumoniae kapsulært polysakkarid ble løst i 1 ml vandig løsning inneholdende 10 mM eddiksyre ved pH = 3,4, og fikk deretter hydrolysere i forseglede ampuller dyppet i oljebad ved en temperatur på 50°C i 48 timer. De resulterende oligosakkarider ble deretter adskilt fra reaksjonsblandingen ved kromatografi over Sephadex G-15 (Pharmacia, Uppsala) kondisjonert med en 15 mM løsning av NaCl ved pH = 7,0 ved 4°C.

De kromatografiske avløp ble deretter analysert ifølge fremgangsmåten rapportert av Kabat (1964, i "Experimental Immunochemistry", utgivere E.A. Rabat og Mayer, pp. 538-541), Chen et al., (1956, Anal. Chem. 28:1756-1758), 0g Porro et al., (1981, Anal. Biochem. 118:301-306) for å bestemme tilstedeværelsen av metylpentoser, fosfor og reduserende grupper, f.eks. aldehyd-grupper. Analysen ga et metylpentose/redusert metylpentoseforhold på 3,5, og et metylpentose/fosforforhold på 3,2.

Gelkromatografi på Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) ga for oligosakkaridet en Kd = 0,46 (ved total heksose) og kombinert analyse ved gasskromatografi og støkiometri, viste en størrelse tilsvarende tre til fire repeterende basisenheter.

HYDROLYSE AV S. PNEUMONIAE TYPE 23F POLYSAKKARID

2 mg av type 23F S. pneumoniae kapsulært polysakkarid ble løst i 1 ml vandig løsning av 0,25 M trifluoreddiksyre, og fikk deretter hydrolysere i forseglede ampuller dyppet i oljebad ved en temperatur på 70°C i 3 timer. De resulterende oligosakkarider ble deretter adskilt fra reaksjonsblandingen ved kromatografi over Sephadex G-15 (Pharmacia, Uppsala) kondisjonert med en 15 mM løsning av NaCl ved pH = 7,0 ved 4°C.

De kromatografiske avløp ble deretter analysert ifølge fremgansmåtene rapportert av Kabat (1964, i "Experimental Immunochemistry", utgivere E.A. Rabat og Mayer, pp. 538-541), Chen et al., (1956, Anal. Chem. 28:1756-1758), og Porro et al., (1981, Anal. Biochem. 118:301-306) for å bestemme tilstedeværelsen av metylpentoser, fosfor og reduserende grupper, f.eks. aldehyd-grupper. Analysen åpenbarte et heksose/aldehydforhold på 4,5-4,5, et heksose/metylpentoseforhold på 2,3, og et fosfor/aldehydforhold på 2,9.

Gasskromatografi og støkiometrisk analyse viste tilstede-værelse av mellom 3,5 og 4,5 repeterende basisenheter. Avgrening av ramnose, som bestemt ved gasskromatografi, var mindre enn 8%.

Gelkromatografi på Sephadex G-50 Superfine (Pharmacia) ga en fordelingskonstant (Kd) på 0,38 (ved heksose).

IMMUNOKJEMISK KARAKTERISERING

AV S. PNEUMONIAEOLIGOSAKKARIDHAPTENER

Evnen til S. pneumoniae type 6A, 14, 19F og 23F oligosakkarider til å samvirke med antistoffer rettet mot intakte kapsulære polysakkarider ble testet som beskrevet hos Porro et al.

(1985, Mol. Immunol. ,22:907-919) ved anvendelse av en teknikk som måler evnen til et hapten (dvs. oligosakkaridet) til å inhibere den homologe antigen (kapsulært polysakkarid) til antistoff-immunopresipiteringsreaksjon (lavmolekylære haptener gir ingen immunopresipiteringsreaksjon når de testes mot homologe antistoffer) .

Denne fremgangsmåte som betegnes "differensial immunoelektroforese", ble gjennomført som følger: et plastplateunderlag for immunoeleketroforese inneholdt tre 1% (w/v) agarosekammere (Agarose M-LKB, Bromma, Sverige). Det første kammer inneholdt

0,05% (v/v) av referanseantiserum mot kapsulært polysakkarid.

Det andre kammer inneholdt 0,05% (v/v) av referanseantiserum mot kapsulært polysakkarid som tidligere var blitt inkubert med en kjent mengde av referansekapsulært polysakkarid ved 37°C i 15 minutter. Det tredje kammer inneholdt 0,05% (v/v) av referanseantiserum mot kapsulært polysakkarid som tidligere var blitt inkubert med en kjent mengde oligosakkaridhapten. Elektroforese-separasjon av kapsulært polysakkarid i fire to gangers serie-fortynninger ble deretter gjennomført ved 70 V/cm i 20 mM Tris-barbituratbuffer, pH = 8,8, i 90 minutter. Etter elektroforesen ble platene sølvfarget, tørket og kvantifisert. Inhibering ved oligosakkaridmolekylene ble tydeliggjort ved at det fremkom høyere "rakett"-immunopresipitater i det kammer som inneholdt referanseantiserum forinkubert med hapten. Den minimalt inhiberende konsentrasjon av et hapten ble beregnet som

hvor CHa = konsentrasjonen av haptenet undersøkt i gelen hAg = avskjæringen av den rette linje bestemt ved høyden av "rakett"-immunopresipitatene oppnådd når referanseantigenet var i gelen, og hjja = avskjæringen av den rette linje bestemt ved høyden av "rakett"-immunopresipitatene oppnådd når det undersøkte hapten var i gelen. På lignende måte,

Oligosakkaridhaptener av forskjellige størrelser ble testet.

Oligosakkaridenes evne til å blokkere immunopresipitering av kapsulære polysakkarider med spesifikt antistoff ble også testet ved ikke-elektroforesefremgangsmåten for radioimmunodiffusjon. Ifølge denne fremgangsmåte ble inhiberingen av oligosakkarid-molekyler tydeliggjort ved en større radius på det immuno-presipitat som ble dannet ved diffusjon av antigen (kapsulært polysakkarid) gjennom 1% w/v agarose inneholdende det spesifikke antistoff tidligere inkubert med en gitt mengde inhibitor (oligosakkarid) . Når den minimale kombinasjonskonsentrasjon (MCC) for det gitte hapten er funnet eksperimentelt, beregnes spesifisiteten ifølge den tidligere nevnte formel:

AKTIVERING AV DEN ENDEREDUSERENDE ENHET

PÅ S. PNEUMONIAE- OLIGOSAKKARIPENE

Oligosakkaridhaptener, oppnådd som beskrevet i avsnittet om hydrolyse av polysakkarider ovenfor, ble løst i vann til en slutt-konsentrasjon på ca. 5 mg/ml. Til hver løsning ble tilsatt 0,1 ml av 0,2 M KH2P04 for hver milliliter løsningsvolum, og pH hevet til 9,2-9,4 med den nødvendige mengde diaminometan (vanligvis kreves det et volum på 2 iil diaminometan for hver milliliter løsning) . Blandingen ble holdt ved 100°C i 15 minutter, hvoretter en mengde på ca. 4 fil pyridinboran ble tilsatt for hver milliliter løsnings-volum. pH ble justert på 9,2 med IN NaOH. Blandingen ble deretter overført i forseglet ampulle til et oljebad ved 50'C for de neste 48 timer. Deretter ble den aminoaktiverte oligosakkaridløsning nøytralisert med IN HCl og renset på Sephadex G-15 Superfine (15 mM NaCl, pH 7,01). De oppsamlede kromatografiske fraksjoner ble slått sammen og frysetørket. Deretter ble den frysetørkede rest løst ved 10 mg/ml i DMSO og tilsatt til en molar mengde av SIDEA (eller SIDES) tilsvarende et 5:1 mol/molforhold med hensyn til den mengde av aminogrupper som er tilstede i den frysetørkede forbindelse. Omsetningen foregikk ved romtemperatur i 4 timer, og deretter ble det tilsatt til løsningen 4 volumer av 1,4 dioksan (sluttkonsen-trasjon 80% i 1,4 dioksan) for å felle ut det esteraktiverte oligosakkarid. Bunnfallet, oppsamlet ved sentrifugering, ble vasket tre ganger med 1,4 dioksan og holdt ved -2 0°C eller lavere, dersom det ikke ble anvendt i konjugasjonsprosessen. Utbyttet av aktiverings-prosessen for hvert av de fire oligosakkarider er vist i Tabell IV.

KONJUGERING AV AKTIVERT OLIGOSAKKARID TIL CRM1?7- PROTEIN FREMSTILLING AV CRMr7- PROTEIN

CR<M>197, fremstilt av Corvnebacterium diphteriae C7 (Btx"197) , ble utskilt fra kulturmediet ved molekylfiltrering ved anvendelse av en Millipore XM-50 membran (NMWL 5 x IO"4) . Proteinet ble deretter utfelt ved tilsetting til filtratet av en mettet løsning av ammoniumsulfat (opp til 65% vekt/volum). Utfelt protein ble oppsamlet ved sentrifugering, og løst igjen i 0,01 M fosfatbuffer (pH = 7,2).

Ytterligere rensing av CRM197 ble oppnådd ved ionebyttekromatografi ved anvendelse av en 2,5 x 100 cm DEAE-Sepharose 6B/CL-kolonne (Pharmacia, Uppsala) kondisjonert i 0,01 M fosfatbuffer ved pH 7,2, ved anvendelse av 0,09 M NaCl i 0,01 M fosfatbuffer som elueringsmiddel.

SDS-polyakrylamidgelelektroforese under reduserende betingelser (Pappenheimer et al., 1972, Immunochem. 9:891-906) viste at 80% av det oppnådde CRM197 var i sin naturlige molekylform. Renheten av proteinet ble funnet å være en flokkuleringsgrense (Lf) på ca. 400 pr. mg.

KONJUGASJON AV AKTIVERTE OLIGOSAKKARIDER

Konjugeringsfremgangsmåten besto av kobling av de monosuksinimidylester-aktiverte oligosakkaridhaptener til epsilon-aminogruppen på lysinrestene i bærerproteinet CRM197.

Dimetylsulfoksydholdige monosuksinimidylester (av adipinsyre) aktiverte oligosakkarider av S. <p>neumoniae type 6A, 14, 19F og 23F kapsulære polysakkarider ble deretter tilsatt til en 0,1 M hydrogenkarbonatløsning pH = 8,0 inneholdende 2 mg/ml av CRM197 for å frembringe en løsning som var 50% i vann, og hvori molforholdet av esteraktivert oligosakkarid til totale aminogrupper i bærer-proteinet er 1:2.

Den således oppnådde blanding ble holdt under forsiktig omrøring ved 4°C i 15 timer. Oligosakkarider fra hver av de fire serotyper ble konjugert til protein i separate reaksjoner. En sammenstilling av den fysiokjemiske karakterisering av de oppnådde glykokonjugater er gitt i Tabell V.

SAMMENLIGNING AV KONJUGERINGSEFFEKTIVITETEN

VED ANVENDELSE SOM LINKER AV SUKSINIMIDYLDIESTEREN

AV ADIPINSYRE VERSUS SUKSINIMIDYLDIESTEREN AV RAVSYRE

De aktiverte oligosakkarider dannet ved omsetning med suksinimidyldiesteren av ravsyre (SIDES) hadde strukturen

mens de som ble dannet ved omsetning med suksinimidyldiesteren av adipinsyre (SIDEA) hadde strukturen

og frembringer derved linkere av forskjellige størrelser mellom oligosakkarid og konjugert protein (se Fig. 2). Konjugeringseffektiviteten ved anvendelse av SIDES- versus SIDEA-aktiverte oligosakkarider ble evaluert. Som vist i Fig. 3A, B og C syntes proteinet å være i fullstendig glykosylert form bare når linkeren var avledet fra SIDEA (hvor lite eller intet fritt bånd av CRM197 var påvisbart) .

IMMUNOGENISITET AV S. PNEUMONIAE- GLYKOKONJUGATER

Flere preparater av de fire glykokonjugatantigenene ble fremstilt og testet på kaniner (ifølge det detaljerte program i Tabell VI): typespesifikke glykokonjugater i enverdig preparat (2,5 eller 5,0 fig oligosakkarid pr. dose) eller flerverdig preparat (2,5 /xg av hvert oligosakkarid pr. dose) med og uten aluminiumhydroksyd [A1(0H)3] som mineralhjelpemiddel (bare i det flerverdige preparat ved 1 mg pr. dose) ble administrert. Full-under de angitte betingelser siden bearbeiding av supernatanten over det flerverdige preparat med enten SDS-polyakrylamidgelelektroforese eller rakett-immunoelektroforese ikke åpenbarte noen påvisbar mengde av fritt protein. En gjennomsnittlig dose av hvert glykokonjugat inneholdt ca. 2,5 fig oligosakkarid og 13 fig bærerprotein CRM197 (som er sammenlignbar med den gjennomsnittlige humane vaksinasjonsdose av difteritoksoid). Immuniseringsprogrammet innbefattet en priming-dose og to booster-doser med fire ukers mellomrom. Avblødning ble gjennomført ved uke 0, 4, 6 og 10.

Tabell VII viser den RIA (FARR-metoden) estimerte mengde av typespesifikke antistoffer, samt antallet respondere over det antall dyr som ble immunisert. Forholdet (R) angir det antall gangers økning som ble oppnådd etter hver immuniseringsdose.

Tabell VIII viser ELISA-titerne i form av igG-isotype Ab samt antallet respondere versus antallet av immuniserte dyr. Forholdene R1 og R2 og R3 angir antallet gangers økning i titerne etter hver immuniseringsdose, mens forholdene R2' og R3' angir antallet gangers økning i titerne for en gitt immuniseringsdose i forhold til pre-titeren. Tabell IX gjengir de kvalitative resultater i form av funksjonalitet av de induserte IgG-antistoffer i gjenkjenningen av polysakkaridkapselen på levende streptokokker (Quellung-reaksjon eller Neufeld-test).

Tabell X viser de difteritoksinnøytraliserende titere indusert i kaniner med bærerproteinet CRM197, som anslått ved Vero-celleundersøkelse. Siden det ble anvendt et referanse FDA-antiserum som kontroll, er titerne uttrykt i /i/ml også tatt med.

OLIGOSAKKARIDER MED KJEDELENGDE DP = 10- 20

ER SUBQPTIMALT IMMUNOGENE

To grupper av glykokonjugatvaksiner ble syntetisert ifølge det synteseskjema som er beskrevet ovenfor, men ved anvendelse av sakkarider av type 6A, 14, 19F og 23F S. pneumoniae med to forskjellige "områdeverdier" for kjedelengden, nemlig DP = 3-5 og DP =

10-20. Spørsmålet ble da hvorvidt et oligosakkarid med en kjedelengde på DP = 20 eller større også ville være det optimale immunogen (etter konjugering med det valgte bærerprotein CRM197) med hensyn til priming- og boosting-evne sammenlignet med en mye kortere kjedelengde, såsom en DP = 3 oligosakkarider.

Kaniner ble immunisert ved anvendelse av den protokoll som er gjengitt i Tabell XI. Som vist ved sammenligning av resultatene gitt i Tabellene XII og XIII, som vedrører ELISA-resultaer av IgG-isotype antistofftitere indusert med løselige S. <p>neumoniae-oli<g>o-sakkarider med henholdsvis DP = 10-14 og DP = 3-6, samt de som er vist i Tabellene XIV og XV, som vedrører ELISA-resultater av IgG-isotype antistofftitere indusert med S. pneumoniae-oli<g>o-sakkarider med henholdsvis DP = 10-14 og DP = 3-6, adsorbert til A1(0H)3, var en DP = 10-14 ikke forbundet med økt immunogenisitet. I virkeligheten var IgG priming- og boosting-aktivitetene for DP = 3-5 oligosakkaridkonjugater langt høyere enn aktivitetene observert ved anvendelse av DP = 10-14 oligosakkaridkonjugater. Ikke til-feldigvis var alle fire undersøkte karbohydratstrukturer forbundet med lignende resultater. Videre ble det funnet at nøytralisering av difteritoksin med glykokonjugater med DP = 10-14 var mindre effektiv enn den som ble oppnådd ved anvendelse av glykokonjugater med DP = 3-6 (Tabell XVI). Oligosakkarider med kjedelengde DP = 10-20 er således funksjonelle i konjugater ifølge den foreliggende oppfinnelse selv om oligosakkarider med DP = 3-6 fremkaller høyere titere av antistoff.

IMMUNRESPONSEN PÅ GLYKOKONJUGATENE ER MONOSPESIFIKK OG HOMOGEN

Sammenligning av de resultater som er gjengitt i Tabellene VII og VIII, som vedrører antistofftitere bestemt ved radio-immunoassay (RIA) og enzyme linked immunosorbant assay (ELISA), viser at de RIA-estimerte titere var konsistent lavere enn ELISA-estimerte titer. Denne observasjon, sammen med fraværet av immunopresipitater i agarosegel anvendt for radioimmunodiffusjon-og rakettelektroforeseanalyse av antiglykokonjugatantiserum, viser at kanin-antisera mot S. <p>neumoniae-oli<q>osakkarid-CRM197-konjugater inneholdt høyt spesifikke IgG-isotype-antistoffer som var ute av stand til å presipitere de respektive rensede karbohydratpolymerer som ble anvendt til å danne oligosakkaridene.

Fraværet av presipiterende antistoffer i et antiserum er en indikasjon på monospesifisitet, dvs. antistoffgjenkjenning av bare en epitop i antigenrepertoaret i et gitt molekyl (Berzofsky-Schechter, 1981, Molecular Immunol. 18:751-763). Presipitering av antigenantistoffkomplekser krever gitterdannelse for å skape et tredimensjonalt, forgrenende nettverk av sammenbundede antigen- og antistoffmolekyler. For at dette skal foregå kreves flerverdighet av både antigen og antistoff, ettersom mer enn ett antistoff må være i stand til å binde seg til et enkelt antigenmolekyl samtidig. Mangelen på obsrverbar immunopresipitering som foregår mellom kaninantiserum mot S. pneumoniae-oligosakkarid-CRM1?7-koniugater og homologt renset høymolekylært, kapsulært polysakkarid er således en sterk indikasjon på at disse antisera inneholdt antistoffer spesifikke for karbohydratpolymeren (som vist ved ELISA- og hemmings-ELISA-analyser), men rettet mot bare en av polysakkaridets determinanter (epitoper).

I tillegg til å vise immunopresipiterende aktivitet er en heterogen populasjon av antistoffer også vanligvis forbundet med følgende egenskap: en enkelt epitop av det antigen som anvendes til å fremkalle antistoffresponsen kan ikke fullstendig inhibere bindingen av hele antistoffpopulasjonen til fullstendig antigen, men vil bare inhibere de antistoffer som binder seg til denne ene epitop, og etterlate de andre antistoffer til fritt å binde seg til de gjenværende epitoper som er tilstede på fullstendig antigen. En populasjon av antistoffer kan evalueres for heterogenitet ved en ELISA-inhiberingsundersøkelse. I denne undersøkelse kan man måle evnen hos en populasjon av antistoffer til å binde seg til fullstendig antigen i nærvær av inhibitorer for antigen/antistoff-binding, såsom isolerte epitoper av antigenet. Fremstilt grafisk, når bindingen av antistoff til merket fullstendig antigen blir målt i nærvær av økende konsentrasjoner av umerket fullstendig antigen, fremkommer en sigmoidal kurve som kan anvendes som standardkurve for antistoff/antigenbinding. Dersom antistoffpopulasjonen er heterogen, kan bindingen mellom antistoff og fullstendig antigen ikke inhiberes fullstendig ved tilsetning av en enkelt antigenepitop, og standardkurven for antistoff/antigen-bindingen blir bare delvis forskjøvet (delvis overlappet eller delvis parallellisert) ettersom andre antigen/antistoff-interaksjoner, forskjellige fra dem i forbindelse med den epitop som blir testet, dominerer. Motsatt, kan binding av en homogen populasjon av antistoffer til antigen inhiberes fullstendig ved tilsetning av en isolert epitop; standard sigmoidal antigen/ antistoffbindingskurven for en homogen populasjon av antistoffer vil bli overlappet eller parallellisert av den kurve som dannes ved tilsetning av isolert epitop tilsvarende populasjonens spesifisitet.

Eksperimentelt, ved testing av det S. penumoniae-glvko-konjugatinduserte kanin-IgG på denne måte ble det observert et affinitetsmønster tilsvarende det som ble forutsett for en homogen populasjon av antistoffer (Figur 4). S. <p>neumoniae 6A-oligosakkaridet (enten i ikke-konjugert eller konjugert form), ble forbundet med den sigmoidale bindingsinhiberingskurve omtrent parallell med en som ble avledet ved anvendelse av serotype 6A høymolekylært kapsulært polysakkarid. Som ventet ville et heterologt (type 14) oligosakkarid, i enten fri (linkeraktivert) eller konjugert form, ikke inhibere IgG-isotypepopulasjonen som er spesifikk for type 6A antigenet.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et kovalent konjugat av et oligosakkarid og et bærerprotein, karakterisert ved følgende trinn: (i) å omsette et oligosakkarid som har en terminal reduserende gruppe med diaminoetan i nærvær av pyridinboran slik at det foregår reduktiv aminering ved en temperatur på ca. 100°C i minst 15 minutter og at omsetningen med pyridinboran gjennomføres ved en temperatur på ca. 50"C i minst 48 timer; og (ii) å omsette det aminerte oligosakkaridprodukt fra (i) med et molekyl omfattende to funksjonelle grupper, hvorav en er i stand til å reagere med den terminale gruppe i det aktiverte oligosakkarid, og den andre som er i stand til å reagere med nevnte bærerprotein valgt fra gruppen bestående av CRM197, Salmonella flagellin, Haemophilus pilin, Haemophilus 15 kDa, 28-30 kDa eller 40 kDa membranprotein, Escherichia coli varmelabilt enterotoksin LTB, difteritoksin, tetanustoksin, koleratoksin, rotavirus VP7-protein, og respiratorisk synsytialt virus F-eller G-protein; og (iii) å omsette det aktiverte oligosakkaridprodukt fra (ii) med nevnte bærerprotein slik at konjugering finner sted.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et molekyl omfattende to funksjonelle grupper i trinn (ii) som er en diester.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et molekyl omfattende to funksjonelle grupper i trinn (ii) som er en diester av adipinsyre eller en diester av ravsyre.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2, eller 3, karakterisert ved at det anvendes et oligosakkarid som stammer fra Streptococcus pneumoniae kapselpoly-sakkarid.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det anvendes et oligosakkarid som er avledet fra Streptococcus pneumoniae med en utvalgt serotype valgt fra gruppen bestående av typene 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F og 33F.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2, 3, 4 eller 5, karakterisert ved at det anvendes et oligosakkarid som er avledet fra kapsulært polysakkarid fra en bakterie valgt fra gruppen bestående av Haemophilus influenzae. Neisseria menin<q>itidis. Pseudomonas aeru<q>inosa. Salmonella tvphi. Escherichia coli, Streptococcus mutans, Cryptococcus neoformans, Klebsiella pneumoniae og Staphylococcus aureus.