JP2017537145A

JP2017537145A - カンピロバクター・ジェジュニに対する合成抗原コンストラクト

Info

Publication number: JP2017537145A
Application number: JP2017543317A
Authority: JP
Inventors: パトリシアゲーリー，; イェニンジャオ，; マリオ，アーターモンテイロ，
Original assignee: US Department of Navy
Current assignee: US Department of Navy
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2017-12-14
Also published as: EP3215226A1; EP3215226A4; CA2966754A1; CA3004305C; US10500262B2; US20180177857A1; EP3370753A1; WO2016073773A1; US9925254B2; CA3004305A1; AU2015342943A1; US20160144017A1; AU2015342943B2; JP2018537428A; AU2016349370A1; WO2017079456A1

Abstract

本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発することができる免疫原性合成コンストラクトであって１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含むものに関する。具体的には、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発することができる免疫原性合成コンストラクトであって１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含むものに関する。また、本発明は、前記免疫原性合成コンストラクトを含む組成物、ならびに、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する方法であって前記免疫原性合成コンストラクトおよび／または前記免疫原性合成コンストラクトを含む組成物を前記被験体に投与することを含むものに関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／０７５，３９９号の利益および２０１５年３月４日に出願された米国仮特許出願第６２／１２７，９３５号の利益を主張するものであり、これらは参照によって本明細書に組み込まれている。

本発明の発明主題は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発することができる免疫原性合成コンストラクトに関する。また、本発明の発明主題は、前記免疫原性合成コンストラクトを有する組成物、および、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する方法に関する。

下痢症は、発展途上国における罹患率および死亡率の主要な原因である。細菌による下痢の主な原因の中には、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、シゲラ種、およびカンピロバクター・ジェジュニがある。実際、カンピロバクター・ジェジュニは、米国で毎年２５０万件の胃腸炎を引き起こし、世界中で４億件以上の胃腸炎を引き起こすと推定されている。発展途上国において、カンピロバクター・ジェジュニ胃腸炎は、主に小児疾患である。カンピロバクター・ジェジュニ胃腸炎の症状には、下痢、腹痛、発熱、時には嘔吐が含まれる。便は、通常、粘液、糞便白血球、および血液を含むが、水様性の下痢も観察される。この病気は、人獣共通感染症であり、野鳥および家畜化された鳥は、大きな貯水池である。カンピロバクター・ジェジュニは、食品媒介性感染症であり、ほとんどの場合汚染された家禽に関連している。しかし、主要な発生は、水または生乳の汚染に関連している。

カンピロバクター・ジェジュニは、胃腸炎を引き起こすことに加えて、炎症性腸症候群、および、ライター（Reiter）症候群として知られる脊椎関節症を含む、いくつかの望ましくない感染後の状態を引き起こす可能性がある。さらに、最近の研究では、カンピロバクター・ジェジュニの感染と、栄養失調と、資源の乏しい環境での幼児の発育阻害との関連が示されている。

カンピロバクター・ジェジュニ感染症の可能な別の消耗性合併症は、麻痺を引き起こしうる感染後の多発神経障害であるギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）の発症である（Allos, B.M., J. Infect. Dis 176 (Suppl 2): S125-128 (1997)）。カンピロバクター・ジェジュニは、哺乳動物の細胞に見られる６炭糖であるシアル酸を内因性に合成しうる限られた数の細菌の1つである。カンピロバクター・ジェジュニとＧＢＳとの関連性は、カンピロバクター・ジェジュニに存在するリポオリゴ糖類（ＬＯＳ）のシアル酸含有外側コアとヒトのガングリオシドとの間の分子擬態によるものであると報告されている（Moran et al., J. Endotox. Res. 3： 521 (1996)）。カンピロバクター・ジェジュニのＬＯＳコアに対するヒト被験体によって生成された抗体は、その被験体の神経組織に対する望ましくない自己免疫応答を引き起こすと考えられている。実際に、研究の結果、カンピロバクターにおけるＬＯＳ合成は、シアル酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を含む、多数の遺伝子によって制御されることが示されている。シアル酸は、その後、ＬＯＳに組み込まれる。これは、ＧＢＳにおけるＬＯＳおよびヒトガングリオシドの観察された分子模倣（molecular mimicry）と一致する。（Aspinall, et al., Eur. J. Biochem., 213: 1029 (1993); Aspinall, et al., Infect. Immun. 62: 2122-2125 (1994); Aspinall, et al., Biochem 33: 241 (1994); Salloway et al., Infect. Immun., 64: 2945 (1996)）。

カンピロバクター・ジェジュニは、コロニー形成および浸潤に関与しかつ血清抗体が生成される表面莢膜多糖類（ＣＰＳ）を有するグラム陰性菌である。カンピロバクターゲノム配列の最近の分析により、腸内細菌のタイプＩＩ／ＩＩＩ莢膜遺伝子座に見られるものと同様の完全な莢膜輸送遺伝子群が同定された（Parkhill et al., Nature, 403: 665 (2000); Karlyshev et al., Mol. Microbiol., 35: 529 (2000)）。いくつかの莢膜輸送遺伝子において部位特異的突然変異を引き起こしたその後の遺伝子研究は、その莢膜がＰｅｎｎｅｒの血清型決定スキームの主要な血清決定因子であることを指摘している（Karlyshev et al., Mol. Microbiol., 35: 529 (2000)）。Ｐｅｎｎｅｒのスキームは、カンピロバクターの２つの主要な血清型分類スキームの１つであり、当初はリポ多糖類Ｏ側鎖に基づくと考えられていた（Moran and Penner, J. Appl. Microbiol., 86: 361 (1999)）。以前にＯ側鎖として記載された構造は、実際には多糖類莢膜であると現在考えられている。興味深いことに、カンピロバクター・ジェジュニの莢膜部分が血清決定に重要であり、カンピロバクター・ジェジュニの４７以上のＰｅｎｎｅｒ血清型が同定されているにもかかわらず、ほとんどのカンピロバクター下痢症は限られた数のこれらの血清型によって引き起こされると考えられている。したがって、疫学研究に基づく、カンピロバクター・ジェジュニの選択された菌株のみが、潜在的なワクチン組成物の開発に適した候補株を提供しうる。

一般的なカンピロバクター・ジェジュニ血清型に関連するいくつかの免疫原性ＣＰＳ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートが作製されている（Monteiro et al., (2009) Infect. Immun. 77, 1128-1136; Bertolo, L, et al. (2012) Carbohy Res 366; 45-49）。人間以外の霊長類をカンピロバクター・ジェジュニの下痢から保護することができる免疫原性カンピロバクター・ジェジュニＣＰＳコンジュゲートワクチンが開発されている（Monteiro et al., (2009) Infect. Immun. 77, 1128-1136, 米国特許第９，０８４，８０９号）。米国特許第９，０８４，８０９号には、とりわけ、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて免疫応答を誘発することができるカンピロバクター・ジェジュニ株８１−１７６（本明細書では血清型ＨＳ２３／３６とも呼ばれる）の莢膜多糖ポリマーからなる抗カンピロバクター・ジェジュニ免疫原性組成物について記載されている。この文献は、ＨＳ２３／３６莢膜多糖が、ガラクトース、３−Ｏ−メチル−６−デオキシ−アルトロ−ヘプトース、およびＮ−アセチルグルコサミンの三糖類を有すること、具体的には、免疫原性多糖ポリマーが、ＧａｌのＯ−２位にＯ−メチル−ホスホルアミデートを含む、式［→３）−α−Ｄ−Ｇａｌ−（１→２）−６ｄ−３−Ｏ−Ｍｅ−α−Ｄ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐ−（１→３）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］で表される反復三糖類構造を有することを教示している。プロトタイプワクチンの兆しにもかかわらず、また、ヒトの疾患に対するこの微生物の重要性にもかかわらず、カンピロバクター・ジェジュニに対する認可された市販のワクチンはまだない。したがって、カンピロバクター・ジェジュニの感染に関連する疾患を予防または改善するための改良された免疫原性組成物および方法が現在なお必要とされている。

第１の態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発することができる免疫原性合成コンストラクトに関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。

さらにもう１つの態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発することができる免疫原性合成コンストラクトを含む組成物に関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。

さらなる態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する方法であって免疫原性合成コンストラクトの有効量を前記被験体に投与することを含む方法に関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。特定の実施形態において、本方法は、免疫原性合成コンストラクトの１回以上の追加用量を投与することをさらに含みうる。特定の実施形態において、前記有効量は、免疫原性合成コンストラクトの約０．１μｇ〜約１０ｍｇの量である。

さらなる態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する方法であって免疫原性合成コンストラクトを含む組成物の有効量を前記被験体に投与することを含む方法に関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。特定の実施形態において、本方法は、免疫原性合成コンストラクトの１回以上の追加用量を投与することをさらに含みうる。特定の実施形態において、前記有効量は、免疫原性合成コンストラクトの約０．１μｇ〜約１０ｍｇの量である。

さまざまな追加の態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するのに用いる免疫原性合成コンストラクトに関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。別の態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するための免疫原性合成コンストラクトの使用に関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。別の態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する薬剤の製造における免疫原性合成コンストラクトの使用に関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。

さらなる態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するのに用いる免疫原性合成コンストラクトを含む組成物に関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。別の態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するための免疫原性合成コンストラクトを含む組成物の使用に関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。別の態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する薬剤の製造における、免疫原性合成コンストラクトを含む組成物の使用に関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。

さらなる態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するのに用いる免疫原性合成コンストラクトを含む医薬組成物に関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。別の態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するための免疫原性合成コンストラクトを含む医薬組成物の使用に関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。別の態様において、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する薬剤の製造における、免疫原性合成コンストラクトを含む医薬組成物の使用に関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。

さらなる態様において、本発明は、本発明の免疫原性合成コンストラクトを合成する方法に関する。

上記態様のさまざまな実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、担体化合物、例えばキャリアタンパク質にコンジュゲートされうる。特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む。特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

上記態様のさらなる実施形態において、前記組成物は、医薬組成物である。特定の実施形態において、前記医薬組成物は、ワクチン製剤である。

特定の実施形態において、前記医薬組成物および前記ワクチン製剤は、１つ以上のアジュバントを含みうる。特定の実施形態において、前記アジュバントは、トール様受容体リガンド、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピドＡ、リポソーム、ならびにそれらの誘導体および組み合わせからなる群から選択される。さらなる実施形態において、前記医薬組成物および前記ワクチン製剤は、１つ以上の追加免疫調節剤を含む。特定の実施形態において、前記免疫調節剤は、１つ以上のカンピロバクター・ジェジュニ株の抗原、ＥＴＥＣ抗原、赤痢菌リポ多糖類構造、および非コンジュゲート状態のキャリアタンパク質からなる群から選択される物質である。

特定の実施形態において、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する方法は、タンパク質担体にコンジュゲートされたコンストラクトを投与することを含む。特定の実施形態において、前記タンパク質担体は、ＣＲＭ_１９７である。別の特定の実施形態において、この方法は、１つ以上のアジュバントと共にコンストラクトまたはコンジュゲートを投与することをさらに含む。特定の実施形態において、前記アジュバントは、トール様受容体リガンド、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピドＡ、リポソーム、ならびにそれらの誘導体および組み合わせからなる群から選択される。上記態様の特定の実施形態において、前記被検体は、ヒトである。

血清型複合体ＨＳ１、ＨＳ３、ＨＳ４、およびＨＳ２３／３６のＣＰＳ反復ブロック、株特異性のあるヘプトース単位、ならびにＯ−メチルホスホルアミデート（ＭｅＯＰＮ）結合を示す図である。略語：「±」、不定比量のＭｅＯＰＮ部分；Ｇａｌ、ガラクトース；Ｇｒｏ、グリセロール；Ｆｒｕ、フルクトース；Ｈｅｐ、ヘプトース；ＧｌｃｐＮＡｃ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン。ＨＳ２３／３６株におけるＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの存在は、本明細書に報告された発見に基づく。ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌコンストラクト（Ｏ−Ｍｅ−ホスホルアミデートガラクトシド）のｐ−メトキシフェニルグリコシド、つまり、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰ、の合成を示す図である（「スキーム１」）。本明細書に示す工程で用いる試薬および条件は、次の通りである：（ａ）ＴｒＣｌ、ピリジン、９５％；（ｂ）ＡｌｌＢｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃、８９％；（ｃ）８０％ＡｃＯＨ、８０℃、７８％；（ｄ）ＰＣｌ_２（Ｏ）ＯＭｅ、Ｅｔ_３Ｎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、その後ＮＨ_３（ｇ）、１９％；（ｅ）ＰｄＣｌ_２、ＭｅＯＨ、３９％。Ｔｒ、トリチル；Ａｌｌ、アリル；ＤＭＦ、ジメチルホルムアミド；ＯＭＰ、４−メトキシフェニル基。ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌコンストラクト（Ｏ−Ｍｅ−ホスホルアミデートガラクトシド）のアミノペンチルグリコシド、つまり、ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２、の合成を示す図である（「スキーム２」）。本明細書に示す工程で用いる試薬および条件は、次の通りである：（ａ）ＣＡＮ、ＣＨ_３ＣＮ、Ｈ_２Ｏ、０℃；その後ＣＣｌ_３ＣＮ、Ｋ_２ＣＯ_３、ＣＨ_２Ｃｌ_２、５７％、２工程にわたる；（ｂ）ＨＯ（ＣＨ_２）_５ＮＰｈｔｈ、ＴＭＳＯＴｆ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、６５％；（ｃ）８０％ＡｃＯＨ、８０℃、７８％；（ｄ）ＰＣｌ_２（Ｏ）ＯＭｅ、Ｅｔ_３Ｎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、その後ＮＨ_３（ｇ）、２７％；（ｅ）ＰｄＣｌ_２、ＭｅＯＨ、７５％；（ｆ）Ｈ_２ＮＮＨ_２、ＥｔＯＨ、８２％。ＣＡＮ、硝酸セリウムアンモニウム；ＴＭＳＯＴｆ、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート；Ｔｒ、トリチル；Ａｌｌ、アリル；ＯＭＰ、４−メトキシフェニル基；ＯＴＣＡ、トリクロロアセトイミデート。ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌコンストラクト（Ｏ−Ｍｅ−ホスホルアミデートガラクトシド）のアミノペンチルグリコシド、つまり、ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２、の合成の別のスキームを示す図である（「スキーム２ａ」）。本明細書に示す工程で用いる試薬および条件は、次の通りである：（ａ）ＴｒＣｌ、ピリジン、９５％；（ｂ）ＡｌｌＢｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃、８９％；（ｃ）ＣＡＮ、ＣＨ_３ＣＮ、Ｈ_２Ｏ、０℃；その後ＣＣｌ_３ＣＮ、Ｋ_２ＣＯ_３、ＣＨ_２Ｃｌ_２、５７％、２工程にわたる；（ｄ）ＨＯ（ＣＨ_２）_５ＮＰｈｔｈ、ＴＭＳＯＴｆ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、６５％；（ｅ）８０％ＡｃＯＨ、８０℃、７８％；（ｆ）ＰＣｌ_２Ｏ_２ＯＭｅ_２、Ｅｔ_３Ｎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、その後ＮＨ_３（ｇ）、２７％；（ｇ）ＰｄＣｌ_２、ＭｅＯＨ、７５％；（ｈ）Ｈ_２ＮＮＨ_２、ＥｔＯＨ、８２％。ＣＡＮ、硝酸セリウムアンモニウム；ＴＭＳＯＴｆ、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート；Ｔｒ、トリチル；Ａｌｌ、アリル；ＯＭＰ、４−メトキシフェニル基；ＯＴＣＡ、トリクロロアセトイミデート。ＭｅＯＰＮ→２−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの合成を示す図である（「スキーム３」）。本明細書に示す工程で用いる試薬および条件は、次の通りである：（ａ）ＡｌｌＢｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃、９５％；（ｂ）８０％ＡｃＯＨ、８０℃、９４％；（ｃ）ＢｚＣｌ、ピリジン、９７％；（ｄ）ＰｄＣｌ_２、ＭｅＯＨ、９２％；（ｅ）ＰＣｌ_２（Ｏ）ＯＭｅ、Ｅｔ_３Ｎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、その後ＮＨ_３（ｇ）、２６％；（ｆ）ＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、７３％。Ａｌｌ、アリル；Ｂｚ、ベンゾイル。考えられるＭｅＯＰＮ部分の位置および複数のコンジュゲートワクチンに対する抗体によるＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに対する莢膜交差反応性を示す図である。図６（Ａ）は、カンピロバクター・ジェジュニのＨＳ２３／３６血清型のＣＰＳにおけるＭｅＯＰＮ−６Ｇａｌ上の考えられるＭｅＯＰＮ修飾単糖類の構造を示している。存在するすべての「Ｒ」基は、ＨまたはＭｅＯＰＮのいずれかを表すことができる、つまり、修飾の各部位（Ｇａｌ−２またはＧａｌ−６）は、ＨまたはＭｅＯＰＮのいずれかと置換することができる。図６（Ｂ）は、カンピロバクター・ジェジュニの示された血清型であるＨＳ：４、ＨＳ：１、およびＨＳ：３のＣＰＳにおけるＭｅＯＰＮ修飾単糖類の構造を示している。莢膜交差反応性を試験するために、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌのスポットを、示された検出抗ＣＲＭ_１９７コンジュゲート抗血清（右側のブロットに示す）と組み合わせた。データは、カンピロバクター・ジェジュニのＨＳ２３／３６、ＨＳ４、およびＨＳ１血清型に対する抗体が合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトと反応しうることを示している。中央カラムに示された血清型ＨＳ１（１：５００）、ＨＳ３（１：５００）、ＨＳ４（１：２０００）、およびＨＳ２３／３６（１：２０００）のカンピロバクター・ジェジュニＣＰＳコンジュゲート抗血清によるＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰ（カラムＡ）およびＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ−（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２（カラムＢ）の免疫検出を示す図である。希釈は、ＴＢＳＴ（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．４２５ＮＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で行った。データは、カンピロバクター・ジェジュニのＨＳ２３／３６、ＨＳ４、およびＨＳ１の血清型に対する抗体が、添加リンカーの有無にかかわらず、合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトと反応しうることを示している。ＨＳ２３／３６多糖類−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチンに対するウサギ抗体が、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを検出したが、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌの異性体を検出しなかったことを示すイムノブロットを示す図である。これらのデータは、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類の免疫原性、および、Ｇａｌの６位におけるメチルホスホルアミデートのＧａｌの２位におけるＭｅＯＰＮに対する免疫優性を明確に示している。リンカー付きガラクトシドとキャリアタンパク質ＣＲＭ_１９７（ＣＲＭ_１９７はリボンダイアグラムとして示されている）とのコンジュゲーションを示す図である（「スキーム４」）。本明細書に示す工程で用いる試薬および条件は、次の通りである：（ａ）ジ−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルアジペートエステル、Ｅｔ_３ＮＤＭＳＯ；（ｂ）ＣＲＭ_１９７、７０ｍＭＮａＰｉ、ｐＨ７．０。リンカー付きガラクトシドとキャリアタンパク質とのコンジュゲーションの分析および確認を示す図である：（Ａ）ＣＲＭ_１９７およびＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−ＧａｌＣＲＭ_１９７（化合物１４）のゲル電気泳動；（Ｂ）ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−ＧａｌＣＲＭ_１９７（化合物１４）とカンピロバクター・ジェジュニＨＳ２３／３６全細胞抗血清とのウェスタンブロット；（Ｃ）ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−ＧａｌＣＲＭ_１９７（化合物１４）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ−ＣＲＭ_１９７ワクチンは、質量６１，７８１．２０６の大きなピークを示した。類似のＭＡＬＤＩ実験におけるＣＲＭ_１９７の質量は５７，９６７ダルトンであった（図示せず）。したがって、質量差は約３，８１４ダルトンであった。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌおよびリンカーの質量は４６１ダルトンであるため（データは示さず）、これは、ＣＲＭ_１９７分子１個当たり約８個のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ−リンカー部分が添加されたことを示している。ＨＳ２３／３６ＣＰＳコンジュゲート（約１０^３〜１０^４のピーク）および合成ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−ＧａｌＣＲＭ_１９７コンジュゲート１４（約０〜−１０_３のピーク）によって産生された抗血清を用いたカンピロバクター・ジェジュニＨＳ２３／３６細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。０のピークは、二次抗体単独の結合を表す。ＡＰＣ−Ａ、アロフィコシアニン。データは、本発明の合成コンジュゲートワクチンが、カンピロバクター・ジェジュニＨＳ２３／３６細胞の細胞表面に露出したＣＰＳＭｅＯＰＮ→６−Ｄ−Ｇａｌ結合に特異的な抗体をウサギ中に作ることができることを証明している。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類コンストラクトの合成およびキャリアタンパク質ＣＲＭ_１９７へのコンジュゲーションの概要を示す図である。Ａｃ、アセチル；ＭＰ、メトキシフェニル；Ａｌｌ、アリル；Ｔｒ、トリチル；Ｐｈｔｈ、フタルイミド。従来の方法を用いて実施したＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの^３１ＰＮＭＲ（Ａ）および^１ＨＮＭＲ（Ｂ）のスペクトルを示す図である。従来の方法を用いて実施した４−メトキシフェニル２−Ｏ−メチル−ホスホラミジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの^３１ＰＮＭＲ（Ａ）および^１ＨＮＭＲ（Ｂ）を示す図である。リンカーを有しキャリアタンパク質ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたデンプン主鎖を用いて化学的に結合した複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を含む本発明の合成ポリマーコンジュゲートの合成を示す図である。複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を含む図１５の合成ポリマーコンストラクトの１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）（Ａ）およびイムノブロット（Ｂ）を示す図である。図のように、図１６（Ａ）は、分子量マーカー、合成コンストラクト、およびキャリアタンパク質のみのレーンを含む。図１６（Ｂ）は、コンストラクトのブロットを示す。ゲルおよびブロットは、実施例７に記載した従来の方法を用いて調製した。図１５の合成ポリマーコンストラクトの^１ＨＮＭＲを示す図であって、カンピロバクター・ジェジュニＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ合成抗原の修飾された（酸化された）デンプンポリマーへの結合が成功したことを示している。Ｘ軸はｐｐｍである。約４．５ｐｐｍの矢印は、６ＭｅＯＰＮ−β−Ｄ−Ｇａｌ合成抗原のβ−アノマーシグナルを示している。残りの矢印は、リンカーのＣＨ_２シグナルを示している。デンプン主鎖を用いて他の糖類と化学的に結合した複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を含むとともに、リンカーを有しキャリアタンパク質にコンジュゲートされた、本発明の別の合成ポリマーコンストラクトを示す図である。具体的には、図のように、合成ポリマーは、複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−１−Ｆｒｕ単糖類を含む。８１−１７６莢膜トリサッカリドの２つの反復の構造を示す図である（Ａ）。ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの位置が示されている。図１９（Ｂ）は、８１−１７６の可変ＣＰＳ遺伝子座における遺伝子のカートゥーンを示す図である。８１−１７６の可変ＣＰＳ遺伝子座は、灰色で示されたｋｐｓＣ（ＣＪＪ８１１７６＿１４１３ｃ）とｋｐｓＦ（ＣＪＪ８１１７６＿１４３７ｃ）の間に位置し、２２個の遺伝子を包含する。既知の機能の遺伝子にはラベルが付されている。ＭｅＯＰＮの合成に関与する遺伝子には、ｍｐｎＡ−Ｄというラベルが付され（［２１］）、ラベルが付された残りの遺伝子は、ヘプトース合成に関与する。黒色の遺伝子は、２つの推定ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼ、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０およびＣＪＪ８１１７６＿１４３５を表している。抗コンジュゲート抗体の免疫応答を示す図である。Ａ．カンピロバクター・ジェジュニ８１−１７６のホルマリンで死滅させた全細胞に対するウサギの高度免疫血清を用いたイムノブロット。Ｂ．８１−１７６−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチン（ＣＪＣＶ１）に対するウサギの高度免疫血清を用いたイムノブロット。レーンは、次の通りである：マーカー、プレシジョンＰｌｕｓプロテインスタンダード；野生型８１−１７６；株３４６８、ｋｐｓＭ、非莢膜化突然変異体（［３４］）；株３４６９、ｋｐｓＭの補体；株３３９０、ＭｅＯＰＮを合成する能力を欠くｍｐｎＣ突然変異体（［２１］）；株３３９１、ｍｐｎＣの補体；株３４７７、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異体；株３４９８、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０突然変異体の補体；株３６３６、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異体；株３６３７、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５突然変異体の補体。Ｃ．ＥＬＩＳＡによって測定した、精製されたＣＰＳ多糖類に対する抗コンジュゲート抗体の免疫応答。使用した突然変異体の株番号を表１に示し説明する。本研究で議論した３つの異なるＭｅＯＰＮ関連共鳴（Ｘ、Ｙ、およびＺ）を示す１Ｄ^３１ＰＮＭＲスペクトルを示す図である。Ａ．１つのＭｅＯＰＮ単位のみを含むカンピロバクター・ジェジュニ８１−１７６野生型のＣＰＳ（ピークＹ）。Ｂ．２つのＭｅＯＰＮ単位を含むカンピロバクター・ジェジュニ８１−１７６野生型のＣＰＳ（ピークＹおよびＺ）。Ｃ．新しいＭｅＯＰＮＣＰＳ修飾を含むカンピロバクター・ジェジュニＣＪＪ８１１７６＿１４３５（３６３６）のＣＰＳ（ピークＸ）。２Ｄ１Ｈ−３１Ｐヘテロ核多重結合相関ＮＭＲ実験からの１Ｄスライスを示す図である。Ａ．ＭｅＯＰＮとガラクトースの２位との間の貫通結合相関を示すカンピロバクター・ジェジュニ８１−１７６野生型のＣＰＳ。Ｂ．ＭｅＯＰＮとガラクトースの６位との間の貫通結合相関を示すカンピロバクター・ジェジュニＣＪＪ８１１７６＿１４３５（３４７７）のＣＰＳ。Ｃ．ＭｅＯＰＮと未同定ＣＰＳ位置との間の貫通結合相関を示すカンピロバクター・ジェジュニＣＪＪ８１１７６＿１４２０（３６３６）のＣＰＳ。ＨＯＤは、各実験における水ピークの位置を表す。モノクローナルＤＢ３の特性評価を示す図である。Ａ．ＤＢ３を用いて検出された、野生型８１−１７６およびさまざまな突然変異体の全細胞のドットブロット。Ｂ．ＤＢ３を用いた、野生型、３３９０、および３３９１のフローサイトメトリー。Ｃ．ＤＢ３を用いた、野生型、３６３６、および３６３７のフローサイトメトリー。Ｄ．ＤＢ３を用いた、野生型、３４７７、および３４９８のフローサイトメトリー。Ｂ、Ｃ、およびＤにおいて「２^０」というラベルが付されたピークは、二次抗体単独の結合を示す。異なるコンジュゲートワクチン群のＭｅＯＰＮレベルの変化を示す図である。Ａ．３つの異なる８１−１７６−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンのＤＢ３ＥＬＩＳＡ。Ｂ．野生型８１−１７６（黒色の棒）およびｍｐｎＣ突然変異体（３３９０；灰色の棒）から精製した莢膜に対するウサギポリクローナル超免疫血清のエンドポイント力価。Ｃ−Ｅ．コンジュゲートＣＣＶ（Ｃ）、ＤＢ４（Ｄ）、およびＣＪＣＶ１（Ｅ）に対するウサギ過免疫血清の結合を、野生型８１−１７６、３３９０、ｍｐｎＣ突然変異体、および３４６９、ｋｐｓＭ突然変異体と比較したフローサイトメトリー。増加する量のＮＨＳに対するカンピロバクター・ジェジュニ株の耐性を示す図である。細菌を３７℃で１時間、増加する量のＮＨＳにさらし、生存菌を生菌数で数えた。菌株の遺伝子型を表１に示す。菌株３６３６は、ＮＨＳ（Ｐ＜０．０５）の４つの濃度すべてにおいて野生型と有意に異なっていた。菌株３４７７は、５％ＮＨＳ（Ｐ＜０．０５）、１０％（Ｐ＜０．００５）、および１５％（Ｐ＜０．０５）において野生型よりも血清耐性が有意に低かった。２つの突然変異体３４９８および３６３７の補体には、ＮＨＳのどの濃度においても野生型との有意差はなかった。二重トランスフェラーゼ突然変異体３４７９は、５％（Ｐ＜０．０００５）、１０％（Ｐ＜０．００５）、および１５％ＮＨＳ（Ｐ＜０．０５）において野生型よりも有意に低かった。ＣＪＪ８１１７６＿１４３５ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの相変化を示す図である。Ａ．ＤＢ３を用いた、８１−１７６の代表的な単一コロニーのイムノブロット。反応性の強さは、数値の得点（３＋、２＋、１＋、および負数）によって示される。ＷＴ、野生型８１−１７６の集団の反応；ネガティブコントロールは、ｍｐｎＣ突然変異体３３９０の集団である。Ｂ．ＤＢ３を用いた異なるレベルの反応性を示す集団内のコロニーの百分率。１＋、２＋、および３＋として記録されたコロニーの百分率を示す；黒色の領域は、陰性のコロニーを表す。

本明細書は、本発明を具体的に指摘して明確に請求する特許請求の範囲で締めくくっているが、本発明は以下の説明からよりよく理解されると考えられる。

本明細書で使用されるすべての百分率および比率は、本明細書に別段の指示がない限り、全組成物の重量による。特別の定めのない限り、すべての温度は、セ氏温度である。特に別の指定がなければ、測定はすべて２５℃、常圧で行った。本発明は、本発明の構成要素も本明細書に記載された他の成分または要素も「含む（comprise）」（開放型）または「実質的にからなる（consist essentially of）」ことができる。本明細書で使用されるように、「含む（comprise）」は、記載された要素、または構造もしくは機能におけるその同等物、および、記載されていないその他要素（複数可）を意味する。また、「有する（having）」および「含む（including）」という用語も、文脈上他の意味を示唆する場合を除き、開放型と解釈されるべきである。本明細書で使用されるように、「実質的にからなる（consist essentially of）」は、本発明が請求項に記載された成分以外の成分を含みうるが、その付加的な成分が請求項に係る発明の基本的かつ新規な特徴を実質的に変えない場合に限ることを意味する。

本明細書に記載された範囲はすべて、２つの値の「間」の範囲を示す端点を含む。「約（about）」や「一般に（generally）」、「実質的に（substantially）」などの用語は、絶対的なものではないが、従来技術には読めないように用語または値を変更するものと解釈されるべきである。このような用語は、当業者によって理解されるように、状況およびこれらが修飾する用語によって定義される。これには、最低でも、値を測定するのに用いられる与えられた方法の期待実験誤差、技術誤差、および機器誤差の程度が含まれる。別段の指示がない限り、「ａ」および「ａｎ」は複数を含む。例えば、「ａＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類」は、少なくとも１つのＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類、および、複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類、つまり、２つ以上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を意味することができる。

本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、２つ以上の項目のリストに使用される場合、記載された特徴のうちのいずれか１つが存在しうること、または、記載された特徴の２つ以上の任意の組み合わせが存在しうることを意味する。例えば、カンピロバクター・ジェジュニに対するワクチン製剤が特徴Ａ、Ｂ、および／またはＣを含むと記載されている場合、カンピロバクター・ジェジュニに対するワクチン製剤は、特徴Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢの組み合わせ、ＡとＣの組み合わせ、ＢとＣとの組み合わせ、またはＡとＢとＣの組み合わせを含むことができる。本明細書で言及したすべての特許、特許出願その他刊行物の教示内容全体は、まるで本明細書に完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み入れられている。

最近まで、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌは、カンピロバクター・ジェジュニ株８１−１７６（別名、本明細書では血清型ＨＳ２３／２６と称する）におけるＣＰＳＧａｌ上の唯一のＭｅＯＰＮ部分であると考えられた（Kanipes et al., (2006) J Bacteriol. 188, 3273-3279）。しかし、カンピロバクター・ジェジュニ株ＨＳ２３／３６の遺伝的および構造的分析を行うことにより、本発明者らは、驚くべきことに、ＣＰＳＧａｌのＯ−６位にもう１つの異なるＭｅＯＰＮを発見した。本明細書で報告されるように、本発明者らは、不定比量で存在するものの、ＭｅＯＰＮ単位を含むＣＰＳエピトープが、重要なカンピロバクター・ジェジュニ免疫原性マーカーであることを発見した。さらに、カンピロバクター・ジェジュニＨＳ２３／３６の天然ＣＰＳを用いて多価コンジュゲートワクチンの総合的な免疫学的分析を行うことにより、本発明者らは、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類がＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌおよび未修飾多糖類に対して免疫原性および免疫優性であることを発見した。

上記に鑑みて、本発明は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発することができる免疫原性合成コンストラクトを対象とする。具体的には、従来の抗カンピロバクター・ジェジュニ免疫原性多糖類コンストラクトまたはＣＰＳコンジュゲートワクチンとは対照的に、本発明は、１つ以上のメチルホスホラミジル単糖類を含むカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫原性合成コンストラクト、つまり、１つ以上のＯ−メチルホスホルアミデート（ＭｅＯＰＮ）部分（ガラクトースの６位のＭｅＯＰＮを含むがこれに限定されない）を含む免疫原性合成コンストラクトを対象とする。

特定の実施形態において、特に本明細書で詳細に記載されているように、カンピロバクター・ジェジュニに対する合成ＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌコンストラクトの免疫原性および効力の改善が意外にも発見された。したがって、さまざまな態様において、本発明は、１つ以上の合成ＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む合成糖類コンストラクト、これらの合成糖類コンストラクトを含む組成物、およびこれらの合成糖類コンストラクトを使用する方法を含む。特定の実施形態において、合成糖類コンストラクトは、キャリアタンパク質にコンジュゲートされている。合成コンストラクト（キャリアタンパク質にコンジュゲートされていないまたはコンジュゲートされている）を含む組成物、例えば、ワクチン製剤を含む医薬抗カンピロバクター・ジェジュニ製剤を含むジェジュニ製剤が、本明細書で検討されている。また、本明細書で検討されているのは、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する方法であって、前記合成コンストラクトならびに／またはコンジュゲートされたおよび／もしくはコンジュゲートされていない形態の前記合成コンストラクトを含む本発明の組成物（例えば、ワクチン製剤）の有効量を前記被験体に投与することを含む方法である。

本発明の免疫原性合成コンストラクトおよびコンジュゲートは、精製されたカンピロバクター・ジェジュニ莢膜多糖類から作製された従来のコンジュゲートワクチンよりも多数の利点をもたらすと考えられる。例えば、データは、ＭｅＯＰＮ部分がカンピロバクター・ジェジュニにおいて相可変であり、したがって、精製された莢膜から得られるワクチン製剤に通常存在するこのエピトープのレベルが可変であることを示している。この天然の可変性の結果として、カンピロバクター・ジェジュニの同じ株に由来する異なる調製物は、このＭｅＯＰＮエピトープの異なるレベル、したがって、異なる免疫原性を有しうる。対照的に、合成アプローチを用いることにより、所望レベルのＭｅＯＰＮエピトープを含む医薬製剤（例えば、ワクチン製剤）をうることができ、当該医薬製剤は、ワクチンの潜在的な免疫原性が制御されうるという利点を提供する。さらに、本明細書で提供された実施例から明らかなように、本発明の合成カンピロバクター・ジェジュニ単糖類コンストラクト抗原は、多糖類よりも広いカバレッジを有し、したがって、カンピロバクター・ジェジュニに対するワクチンに必要な原子価を潜在的に低下させるように思われる。したがって、本明細書に開示された合成コンストラクトは、単一のエピトープが２つ以上のカンピロバクター・ジェジュニ血清型にわたって交差防御するということもありうるワクチン製剤において有効な抗原として使用されうる抗原決定基であると考えられる。さらに、本発明の合成コンストラクトの使用は、カンピロバクター・ジェジュニ（潔癖な生物）を増殖させることおよび莢膜を精製することを不要にするため、合成コンストラクトは、費用効率がより高く、したがって、精製されたＣＰＳを使用する他のワクチンと比較して商業上の利益をもたらす。

上記に加えて、本発明の合成コンストラクトは、免疫原性であるのみならず、合成アプローチによって自己免疫の発達に対する懸念がなくなるという利点も持つ。なぜなら、本方法は、ヒトガングリオシドを構造的に模倣する構造であってギラン・バレー症候群をもたらす自己免疫応答を誘発しうる構造をしばしば含むカンピロバクター・ジェジュニリポオリゴ糖類（ＬＯＳ）から離れて莢膜の精製を必要としないためである。

当業者に理解されるように、「ＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ」や「ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ」、「ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクト」などの用語は、ガラクトース単糖類を指し、当該ガラクトース単糖類のＯ−６位にＯ−メチルホスホルアミデート部分を含むように修飾されたものである。本明細書で理解されるように、合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトは、ＭｅＯＰＮ部分に加えて他のさまざまな「Ｒ」基を含みうる。この用語は、さまざまな変性型、例えば、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰ、つまり、４−メトキシフェニル６−Ｏ−メチル−ホスホルアミデート−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、および、リンカーを含む活性型、例えば、ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２、つまり、５−アミノ−ペンタニル６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、のコンストラクトを包含する。同様に、「ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ」および同類の用語は、ガラクトース単糖類のＯ−２位のＯ−メチルホスホルアミデート部分を指す。

本明細書で理解されるように、「免疫原性合成コンストラクト」またはより単純に「合成コンストラクト」および同類の用語は、インビトロ、つまり、化学的に産生された非天然（「人工」）の化合物であって、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発することができる１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含むものを指す。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、被験体においてカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発しうる１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。また、ＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類は、ＭｅＯＰＮ部分に加えて他のさまざまな「Ｒ」基を含みうる。本明細書で企図されるように、特定の実施形態において、本発明の免疫原性合成コンストラクトは、単独でもしくは１つ以上の他の糖類と組み合わせて化学的に結合した、１つ以上の合成ＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類、および／または、化学リンカーを含む。例えば、本明細書において、本発明の合成コンストラクトは、１つ以上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類と組み合わせて１つ以上のさらなる単糖類を含みうると考えられる。カンピロバクター・ジェジュニのＣＰＳに存在する単糖類は、特に、本明細書において、例えば、１つ以上のフルクトース、ガラクトース、グルコース、またはヘクトース単糖類と考えられており、また、任意選択的に、１つ以上のさらなるＭｅＯＰＮ部分（ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌを含むがこれに限定されない）、またはカンピロバクター・ジェジュニに対する他の抗原と置換される。

以下で詳述されるように、本明細書において、１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む合成コンストラクトを有する合成コンストラクトを含む、本発明の合成コンストラクトを活性化しキャリアタンパク質にコンジュゲートしうること、または、非コンジュゲート型で使用しうることが考えられる。キャリアタンパク質にコンジュゲートされた場合、その合成コンストラクトを、本明細書において「コンジュゲートワクチン（conjugate vaccine）」または「コンジュゲート（conjugate）」と称しうる。

本明細書で使用されるように、「被験体（subject）」は、動物（鳥類および哺乳動物を含むがこれに限定されない）を含む。また、この言葉には、人間も含まれる。本明細書において特に企図されるように、被験体は、例えば、カンピロバクター・ジェジュニに感染しているまたは感染する危険があるあらゆる動物またはヒトを含む。被験者は、カンピロバクター・ジェジュニの暴露に関してナイーブまたは非ナイーブでありうる。特に、適切な被験体（患者）は、家畜（例えば、ニワトリ）ならびに非ヒト霊長類およびヒト患者を含むがこれに限定されない。

本明細書で理解されるように、本発明の合成コンストラクトは、被験体に免疫応答を誘発して被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに関連する１つ以上の病的状態を予防および／または改善するために、被験体に投与されうる。本明細書で理解されるように、被験体において免疫応答を「誘発する」という概念は、被験体において体液性および／または細胞性免疫応答を引き起こすことを指す。

カンピロバクター・ジェジュニに関連する１つ以上の病的状態を「予防および／または改善する」という概念は、例えば、カンピロバクター・ジェジュニの感染に関連する病的状態の発症または進行を防ぐまたは妨げること、ならびに、カンピロバクター・ジェジュニに関連する１つ以上の病的状態を治療し、治癒し、遅らせ、および／またはその重症度低下させることを包含する。

本明細書で使用されるように、「カンピロバクター・ジェジュニに関連する１つ以上の病的状態」という用語は、カンピロバクター・ジェジュニによる感染によって引き起こされる被験体における望ましくない状態（「カンピロバクター症」）を指す。本明細書で企図されるように、そのような病的状態は、カンピロバクター・ジェジュニの感染時に被験体において生じうる臨床症状および疾患、ならびに、既往のカンピロバクター症の結果として被験体において発症しうる状態を含む。これらの状態は、当業者によく知られており、カンピロバクター胃腸炎、ライター症候群、炎症性腸症候群、およびギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）を含むがこれに限定されない。

ＭｅＯＰＮの単糖（simple sugar）への制御された合成および導入、得られた合成コンストラクトの活性化、化学的リンカーの添加、ならびにキャリアタンパク質の結合を含む、本発明の合成コンストラクトの合成は、炭水化物化学者によく知られている市販の材料および方法を用いて実施しうる。特定の合成方法（合成スキーム）は、以下の実施例において詳細に説明する。本明細書において、以下の実施例および「スキーム」に開示された化合物を合成する方法は、本発明の態様に含まれると考えられる。

当業者に理解されるように、単糖類の化学合成は、炭水化物化学における十分に確立された手順を用いて達成されうる。しかし、開示された合成スキームにおいて出発化合物として使用するための単糖類は、さまざまな商業的供給業者から取得し、当業者によって化学的に修飾して、例えば、本明細書に開示された合成スキームに従って、本発明の免疫原性合成コンストラクトに到達しうる。公表された化学的修飾は、Comfort et al., Biochem. 46: 3319-3330 (2007)で提案された４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドの合成方法を含むがこれに限定されない。簡単に述べると、４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドは、Ｄ−ガラクトースから、アセチル化、４−メトキシフェノールによるグリコシド化、その後、公表された方法によるゼンプレーン脱アセチル化によって合成しうる。（Montgomery et al. (1942) J. Am. Chem. Soc. 64, 690-694）

同様に、ＭｅＯＰＮの単糖類への合成および導入のためのさまざまな方法は、当業者によく知られている。特定の方法は、C. Mara et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 6180-6183 (2011)に記載されている。この文献は、ジクロロリン酸エチルとの反応、その後、保護されたアミンとの反応を記載している。

上述したように、本発明の合成コンストラクトは、キャリアタンパク質と反応することができる１つ以上の化学結合基を付加するために化学的に活性化しうる。本明細書で企図されるように、本発明のコンストラクトの活性化は、当業者によく知られている従来の方法に従って実施しうる。このような方法は、例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボラート（ＣＤＡＰ）やカルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）などのシアン化試薬の使用を含む。また、コンストラクトの活性化は、糖類を２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）と反応させることによって達成されうる。例えば、US Pub. No. 2014/0141032を参照。

本発明の免疫原性合成コンストラクトは、非コンジュゲート型で被験体に投与しうるが、本明細書において、合成時に、免疫応答を増強するために投与前に当該コンストラクトを化学的に活性化しインビトロで１つ以上のキャリア分子（例えば、１つ以上のＴ細胞依存性キャリアタンパク質）に化学的にコンジュゲートしうることが考えられる。実際に、当業者に理解されるように、子供は、多糖抗原に直面してＩｇＭ応答のみを捉えることができ、成人はＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ応答を生成することができる。したがって、キャリアタンパク質を合成コンストラクトに結合することにより、コンストラクトによってインビボで引き起こされる免疫応答は、Ｔ細胞非依存性応答からＴ細胞依存性応答に変化する。このように、引き起こされる免疫応答は増強され、したがって、その反対の非コンジュゲート状態のコンストラクトによってインビボで産生されるであろうものと著しく異なる。

特定の実施形態において、キャリア分子は、キャリアタンパク質である。本明細書で使用されるように、「キャリアタンパク質」は、理想的には少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むタンパク質またはその類似体もしくは断片をいう。本発明での使用に適したキャリアタンパク質は、当業者によく知られており、市販されており、および／または、従来の方法を用いて当業者により作製・精製されうる。例えば、本発明で使用されるキャリアタンパク質は、免疫学的に有効な担体であり、かつ、被験体に投与する化学的または遺伝的手段によって安全にされた、細菌毒素を含む。例は、ジフテリアトキソイドやＣＲＭ_１９７、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンの結合成分（ＬＴＢ）、大腸菌付着因子および／または線毛、ならび緑膿菌由来の外毒素Ａなどの不活性化細菌毒素を含むがこれに限定されない。また、例えば、外膜複合体ｃ（ＯｍｐＣ）やポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１などの細菌外膜タンパク質も使用されうる。また、その他のタンパク質、例えば、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）や、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）なども使用されうる。

特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、不活性化細菌毒素、細菌外膜タンパク質、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン、ウシウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）からなる群から選択される。特定の実施形態において、不活性化細菌毒素は、ジフテリアトキソイド、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ_１９７）、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴＢ）の結合成分（ＬＴＢ）、大腸菌付着因子および／または線毛、ならびに緑膿菌由来の外毒素Ａからなる群から選択される。特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、不活性化細菌毒素ＣＲＭ_１９７である。別の特定の実施形態において、細菌外膜タンパク質は、外膜複合体ｃ（ＯｍｐＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ−３、および肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ−１１からなる群から選択される。このようなキャリアタンパク質は、さまざまな商業的供給業者から入手可能である。

また、本明細書において、ＥＴＥＣ由来のタンパク質をキャリア分子として使用することも企図される。考えられるＥＴＥＣタンパク質担体は、熱不安定性エンテロトキシンのＢサブユニット、および線毛サブユニットを含むがこれに限定されない。後者は、さまざまなＥＴＥＣ定着因子のサブユニット、例えば、ＣｆａＩ（ＣｆａＥおよび／またはＣｆａＢ）、ＣＳ６（ＣｓｓＢおよび／またはＣｓｓＡ）、ＣＳ３（ＣｓｔＧおよび／またはＣｓｔＨ）、ＣＳ１７（ＣｓｂＡおよび／またはＣｓｂＤ）、ならびにＣＳ１（ＣｏｏＡ）などを含む。ＥＴＥＣタンパク質のさらなる例および考えられるキャリア分子としてのＥＴＥＣタンパク質の使用に関する詳細は、例えば、US 2015/0258201 A1を参照のこと。この文献の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれている。

本明細書で企図されるように、キャリアタンパク質は、カンピロバクター・ジェジュニに対するコンストラクトの免疫原性を増強するために、２つ以上の合成コンストラクトに結合されうる。一実施形態において、複数の合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトが単一のキャリアタンパク質に結合される。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ：ＣＲＭ_１９７比（ｗ／ｗ）が少なくとも８：１以上である本発明のコンジュゲートワクチンが、本明細書において想定される。

コンジュゲーション後、遊離したコンジュゲート糖類コンストラクトは、さまざまな従来の方法を用いて分離されうる。精製方法は、当業者によく知られており、例えば、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および／または硫酸アンモニウム分画を含む。

本発明の活性化単糖類または糖類コンストラクトをキャリアタンパク質にコンジュゲートする考えられる方法は、当業者によく知られており、例えば、以下を含む：結果として生じるアミノ基をアジピン酸リンカー基の一端に結合し、その後、タンパク質をそのアジピン酸リンカー基の他端に結合することを含む単糖類の還元的アミノ化；糖類コンストラクトが、臭化シアン（ＣＮＢｒ）または１−シアノ−４−ジメチルアンモニウムピリジニウムテトラフルオロボラート（ＣＤＡＰ）のいずれかにより活性化されて、シアネート基をヒドロキシル基に導入し、もって、タンパク質成分の添加時にアミノ基またはヒドラジド基と共有結合を形成する、シアニル化コンジュゲーション：カルボジイミドが抱合反応の１つの成分上のカルボキシル基を活性化し、活性化されたカルボニル基が他の成分上のアミノ基またはヒドラジド基と反応する、カルボジイミド反応。必要に応じて、これらの反応を用いて抱合反応の前にキャリアタンパク質の成分を活性化しうる。本明細書で企図されるように、特定の実施形態において、アミノ基を単糖類に導入し（例えば、末端＝Ｏ基を−ＮＨ_２と置換することにより）、その後、アジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）による誘導体化およびキャリアタンパク質との反応を行うことを含むプロセスを使用しうる。

また、本明細書において、合成コンストラクトをキャリアタンパク質に直接結合することも企図される。タンパク質への直接結合は、従来の方法を用いた、単糖類の酸化とその後のタンパク質による還元的アミノ化とを含みうる。

本発明の合成コンストラクトは、例えば、１つ以上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を含むが、さらに、１つ以上の追加の糖類、ならびに、これの１つ以上のさらなる化合物、部分、断片、または誘導体を含みうる。さまざまな化合物は、本発明の免疫原性合成コンストラクトのさまざまな成分を結合し、および／または、合成コンストラクト全体を１つ以上のキャリアタンパク質に結合するための化学的主鎖としての役割を果たしうる。ポリマーコンストラクトまたはコンジュゲートを作製するのに使用されうる化合物は、例えば、修飾デンプン部分、シクロデキストリン、およびニゲランを含む。

本明細書で特に企図されるように、コンストラクトは、さまざまな理由で、例えば、合成コンストラクトの化学的安定性を増加させるために、および／または、コンストラクトの送達もしくはバイオアベイラビリティを増強するために加えうる追加の糖類、部分、または化合物を含みうる。特定の実施形態において、追加の糖類、部分、および化合物は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する合成コンストラクトの免疫原性を増強するために、１つ以上のリンカーまたは他の化合物を介して、直接的または間接的に、１つ以上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトと化学的に結合されうることが、本明細書で企図されている。したがって、本発明の合成コンストラクトに使用する追加の糖類は、さまざまなカンピロバクター・ジェジュニ株の莢膜に存在する単糖類、例えば、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌを含むガラクトースその他その修飾形態、フルクトース、グルコース、ヘプタースＮ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルシトール、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分（ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを含むがこれに限定されない）を有する単糖類を含むグルコースまたはその修飾形態もしくは誘導体、を含むがこれに限定されない。このような糖類は、カンピロバクター・ジェジュニに対する合成コンストラクトの免疫原性を増強しうる１つ以上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類の量でそれと組み合わせて使用されうる。例えば、図１は、カンピロバクター・ジェジュニ血清型複合体ＨＳ１、ＨＳ３、ＨＳ４、およびＨＳ２３／３６のＣＰＳ反復ブロック、特異的ヘプトース単位、およびＭｅＯＰＮ結合を列挙する。

上記を考慮して、以下の実施例に記述のように、図１５は、２つ以上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を含む合成ポリマーコンストラクトを示し、図１８は、２つ以上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を含むとともに、追加の単糖類ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−１−Ｆｒｕをも含む、合成ポリマーコンストラクトを示す。本明細書において、本発明のコンストラクトまたはコンジュゲートにおけるこれらの追加成分の存在が、カンピロバクター・ジェジュニに対するコンストラクトまたはコンジュゲートの免疫原性を増強すると考えられる。

本明細書で理解されるように、「結合した（associated）」は、任意の態様の化学結合を含む。例えば、合成コンストラクトは、ポリマーとして鎖状に化学的に結合した、または、１つ以上の他の糖類のいくつもとさまざまに組み合わせた、数個の合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を含みうる。このようなコンストラクトは、さらに、キャリアタンパク質にコンジュゲートされうる。

本明細書で企図されるように、本発明の方法は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発することを対象にし、免疫原性合成コンストラクトの有効量を被験体に投与することを含む。特定の実施形態において、コンストラクトは、活性医薬成分、例えば医薬組成物として、より具体的には、キャリアタンパク質に結合された合成コンストラクトを含むワクチン製剤として、合成コンストラクトを有する組成物の形態で被験体に投与される。したがって、本明細書で使用されるように、「有効量（effective amound）」は、免疫原性合成コンストラクトの単独または組成物中の量を指しうる。組成物は、１つ以上の他の活性医薬品または賦形剤を有する医薬組成物を含む。

さらに、本明細書中で理解されるように、「有効量」は、被験体において免疫応答を誘発するのに適した免疫原性合成コンストラクト（コンジュゲートまたは非コンジュゲート）の免疫学的に有効な量をいう。上記のように、「免疫応答」は、被験体における体液性および／または細胞性免疫応答を引き起こすことを包含する。結果として、被験者にとって意味のある臨床的利益が提供される。このような利益は、例えば、カンピロバクター症または関連する後遺症に関連する１つ以上の病的状態を予防し、改善し、治療し、阻害し、および／または低減することでありうる。したがって、本発明の方法は、治療方法または予防方法と考えることができる。特定の実施形態において、本発明の免疫原性合成コンストラクトおよび／またはコンジュゲートを被験体に投与し、もって被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに起因する下痢を予防しうると、本明細書で企図される。

当業者は、本発明の合成コンストラクトの投与が、後でカンピロバクター・ジェジュニの感染に見舞われた場合に被験者に免疫を生み出すために、本発明のコンストラクトおよび／または組成物（例えば、ワクチン製剤）の使用を含むことを理解するであろう。しかし、さらに、本明細書において、本発明の合成コンストラクト、コンジュゲート、組成物、ワクチン製剤、および方法が、必ずしもカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫をすべて提供したりおよび／またはすべての疾患症状を完全に治癒もしくは排除したりするわけではないと理解される。

本発明の免疫原性合成コンストラクトの適切な有効量は、当業者によって容易に決定可能であり、治療する被験体の年齢、体重、種（非ヒトの場合）および医学的状態、ならびに、そのコンストラクトがコンジュゲート型または非コンジュゲート型で投与されるかどうかに依存する。例えば、初期情報は、実験室実験で収集され、ヒトに対する有効量は、その後、従来の投与試験および日常的な実験を通じて決定される。本明細書で企図されるように、カンピロバクター・ジェジュニの感染に対するワクチン接種用のコンストラクトまたはコンジュゲートの有効量は、体重１ｋｇ当たり約１μｇ以下から約１００μｇ以上でありうる。一般的な指針として、本発明のコンストラクトまたはコンジュゲートの適切な量は、アジュバントの有無にかかわらず１投与量当たり約０．１μｇから約１０ｍｇの間の量でありうる。さらに、１回以上の追加用量の投与を含む免疫付与は、アジュバントの有無にかかわらず、１用量当たり約０．１μｇから約１０ｍｇの間の量を用いて実施しうる。

本明細書において、本発明のコンストラクトおよび組成物は、従来の方法に従ってさまざまな経路で被験体に投与されることが企図される。従来の方法は、非経口（例えば、大そう内注射および注入技術による）、皮内、膜貫通、経皮（局所を含む）、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、病巣内、皮下、経口、および鼻腔内（例えば、吸入）の投与経路を含むがこれに限定されない。また、投与は、連続注入またはボーラス注入によるものでありうる。

さらに、本発明の組成物は、さまざまな剤形で投与しうる。これらは、例えば、選択されたｐＨに緩衝されうる滅菌等張水溶液や懸濁液、乳液、粘性組成物などの、非経口、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、または静脈内投与（例えば、注射可能な投与）用製剤を含む、液体調製物および懸濁液を含む。特定の実施形態において、本発明のコンストラクトおよび組成物は、注射剤として被験体に投与されることが企図される。注射剤は、筋肉内、静脈内、皮下、または経皮注射によって送達される注射用組成物を含むがこれに限定されない。このような組成物は、当業者によく知られているさまざまな医薬賦形剤、担体、または希釈剤を用いて製剤されうる。

別の特定の実施形態において、本発明の合成免疫原性コンストラクトおよび組成物は、経口投与されうる。本発明の方法による投与のための経口製剤は、さまざまな剤形、例えば、液剤、散剤、懸濁剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、カプレット、持続放出製剤、または徐放性の製剤もしくは液体が充填された製剤（例えば、ゼラチンで覆われた液体であり、それによってゼラチンが胃の中で溶けて腸に送達される）、を含みうる。このような製剤は、本明細書に記載されたさまざまな薬学的に許容される賦形剤を含みうる。このような賦形剤は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムを含むがこれに限定されない。

特定の実施形態において、本明細書では、経口投与用の組成物が液体製剤でありうることが企図される。このような製剤は、免疫原の粘膜送達を促進する（例えば、胃の内膜と普通よりも長い時間接触することにより）増強された粘度を有する組成物を生成しうる薬学的に許容される増粘剤を含みうる。このような粘性組成物は、当業者によって、従来の方法を使用し、かつ、医薬賦形剤および試薬（例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボマー）を使用して、作製されうる。

鼻腔または呼吸（粘膜）投与に適した（例えば、スクイズスプレーディスペンサー、ポンプディスペンサー、またはエアロゾルディスペンサーの形態の）他の剤形が、本明細書で企図される。また、直腸または膣送達に適した剤形も本明細書で企図される。また、本発明のコンストラクト、コンジュゲート、および組成物は、凍結乾燥もされうるし、また、従来の方法を用いて再水和の有無にかかわらず被験体に送達されうる。

本明細書で理解されるように、本発明の方法は、免疫原性合成コンストラクトを被験体に、さまざまなレジメンに従って、つまり、被験体に臨床的に有意な利益を提供するのに十分な量および方法でかつ十分な時間、投与することを含む。本発明での使用に適した投与レジメンは、従来の方法に従って当業者によって決定されうる。例えば、本明細書では、有効量を、単回投与、数日間にわたって投与される一連の複数回投与、または単回投与後の追加投与（例えば、数年後）として被験体に投与しうることが企図される。本明細書で使用される用語「投与（dose）」または「投与量（dosage）」は、被験体への投与に適した物理的に不連続な単位を指し、各投与量は、所望の応答を生じるように計算された活性医薬成分としての所定の量の合成コンストラクトおよび／またはコンジュゲートを含む。

投与レジメン（例えば、投与する量や治療の回数、単位用量当たりの有効量など）は、施術者の判断次第であり、各被験体に特有である。この点で考慮すべき要因には、被験体の身体的および臨床的状態、投与経路、治療の意図した目標、ならびに、特定のコンストラクト、コンジュゲート、または組成物の効力、安定性、および毒性が含まれる。当業者に理解されるように、「追加用量（boosting dose）」は、初期用量と同じ用量または異なる用量を含みうる。実際に、被験体において所望の免疫応答を生じさせるために一連の免疫付与が投与される場合、当業者は、この場合、「有効量」が２回分以上の投与量を含みうることを理解するであろう。

本明細書で企図されるように、本発明の組成物、特に本発明の医薬組成物およびワクチンは、好ましくは無菌であり、重量または体積の単位で被験体への投与に適した量のコンストラクトおよび／またはコンジュゲートを含む。被験体に投与される組成物の体積（容量単位）は、投与方法に依存し、当業者によって認識できる。例えば、注射剤の場合、投与される体積は、典型的には、０．１〜１．０ｍｌ、好ましくは約０．５ｍｌでありうる。

本明細書で理解されるように、本発明の「医薬組成物（pharmaceutical composition）」は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせて、免疫原性合成コンストラクト（キャリアタンパク質にコンジュゲートされていないもしくはコンジュゲートされたもの、またはこれらの組み合わせ）を含む。「薬学的に許容される（pharmaceutically acceptable）」という用語は、細胞や細胞培養、組織、生物などの生態系と適合する無毒物質を指すのに用いられる。

薬学的に許容される賦形剤、担体、および希釈剤の例は、当業者によく知られており、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (latest edition), Mack Publishing Company, Easton, PAで見られうる。例えば、薬学的に許容される賦形剤は、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、結合剤、安定剤、防腐剤、増量剤、吸着剤、消毒剤、洗浄剤、糖アルコール、ゲル化または増粘添加剤、香味剤、および着色剤を含むがこれに限定されない。薬学的に許容される担体は、タンパク質や多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、トレハロース、脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）、不活性ウイルス粒子などの巨大分子を含む。薬学的に許容される希釈剤は、水、生理食塩水、およびグリセロールを含むがこれに限定されない。

当業者に理解されるように、本発明の医薬組成物に含まれる薬学的に許容される追加の成分の種類および量は、例えば、所望の投与経路、ならびに所望の物理的状態、溶解性、安定性、および組成物のインビボ放出の速度によって変わりうる。例えば、静脈内注射、皮膚注射、皮下注射、または他の注射による投与に対して、ワクチン製剤は、典型的には、適切なｐＨおよび安定性の、発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態であり、等張賦形剤、および、薬学的に許容される安定剤、防腐剤、緩衝剤、抗酸化剤、または当業者によく知られている他の添加剤を含みうる。

特定の実施形態において、本発明の免疫原性合成コンストラクトおよび／またはコンジュゲートを単独でまたは他の活性剤および／もしくは薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、ワクチン製剤の形態の医薬組成物が、本明細書に記述の通りに被験体への投与のために企図される。単価ワクチン（例えば、単一の抗原または単一の微生物に対して免疫性を与えるように作られている）と多価ワクチン（例えば、同じ微生物の２つ以上の株に対してまたは２つ以上の微生物に対して免疫性を付与するように作られている）の両方が、本明細書で企図される。一実施形態において、本発明のワクチン製剤は、多価製剤である。特定の実施形態において、本発明のワクチン製剤は、カンピロバクター・ジェジュニの１つ以上の株（血清型ＨＳ２３／３６、ＨＳ１、ＨＳ２、ＨＳ３、ＨＳ４、およびＨＳ５／３１を含むがこれに限定されない）に対する多価製剤でありうる。また、本発明の多価製剤が、カンピロバクター・ジェジュニの１つ以上の株および／または他の細菌株（ＭｅＯＰＮ含有莢膜を有するものを含む）に対するものを対象にしうることも、本明細書で企図される。

本発明のワクチンの製剤は、当該技術分野で広く認められている方法を用いて達成しうる。例えば、免疫学的に有効な量のコンストラクトまたはコンジュゲートワクチンに加えて、本発明の「ワクチン製剤（vaccine formulation）」は、さらに、１つ以上の非免疫原性成分、例えば、上記の１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、安定剤、防腐剤、緩衝剤、および消毒剤を含みうる。この目的のために、当業者は、頑丈で安定なワクチン製剤の開発が、抗原に安定性をもたらして凝集、タンパク質構造の喪失、および／または酸化や脱アミド化などの化学的分解を防止するさまざまな賦形剤および製剤パラメータを理想的に用いることを理解するであろう。通常の実験および従来の方法を使用する当業者は、本発明の頑丈で安定なワクチン製剤の開発によく適している特定のｐＨ、緩衝剤、および安定剤を決定しうる。例えば、Morefield, G. (2011) The APPS Journal, 13: 191-200を参照。

加えて、医薬組成物、特に本発明のワクチン製剤は、さらに、１つ以上のアジュバントを含みうる。当業者に理解されるように、アジュバントは、抗原に対する被験体の免疫応答を助ける物質である。アジュバントは、ワクチンの免疫原性効力を増加させるのに使用可能であり、また、ワクチン製剤の安定性を高める能力をも有しうる。したがって、ワクチン製剤にアジュバントを添加することにより、より迅速でより長期の持続的な免疫応答がインビボで可能となりうる。本発明の組成物と共に使用するのに適したアジュバントは、当業者によく知られており、さまざまな商業的供給業者から入手可能である。これらは、例えば、糖脂質；ケモカイン；サイトカインおよびケモカインの産生を誘発する化合物；インターフェロン；ミョウバンやベントナイト、ラテックス、アクリル粒子などの不活性担体；プルロニックブロックポリマー；デポフォーマー；サポニンやリゾレシチン、レチナール、リポソーム、プルロニックポリマー製剤などの表面活性物質；細菌リポ多糖類などのマクロファージ刺激剤；インシュリンやザイモサン、エンドトキシン、レバミソールなどの代替経路補体活性剤；非イオン性界面活性剤；ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）トリ−ブロックコポリマー；トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）；細胞壁スケルトン（ＣＷＳ）；完全フロイントアジュバント；フロイント不完全アジュバント；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ；ＣｐＧオリゴヌクレオチド；ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエーテル、アルミニウム、ポリ［ジ（カルボキシフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＰＰ）、モノホスホリルリピドＡ、ＱＳ−２１、コレラ毒素、およびホルミルメチオニルペプチド、を含む。

一実施形態において、アジュバントは、抗原送達システム（例えば、アルミニウム化合物またはリポソーム）、免疫賦活剤（例えば、トール様受容体リガンド）、またはそれらの組み合わせ（例えば、ＡＳ０１またはＡＳＯ４）からなる群から選択されうる。これらの物質は、当業者によく知られている。特定の実施形態において、本発明の組成物および方法で使用するアジュバントは、トール様受容体リガンド、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピドＡ、リポソーム、ならびにそれらの誘導体および組み合わせからなる群から選択される。例えば、Alving, C. et al., 2012, Expert Rev Vaccines 11, 733-44; Alving, C. et al., (2012) Curr Opin Immunol 24, 310-5; Alving C. and Rao, M, (2008) Vaccine 26, 3036-3045; US 6,090,406; US 5,916,588を参照。

免疫原性合成コンストラクトおよび／またはコンジュゲートに加えて、本発明の組成物は、さらに、１つ以上の他の活性医薬成分（追加の免疫調節剤を含むがこれに限定されない）を含みうる。本明細書で理解されるように、免疫調節剤は、被験体の免疫系を誘発し、増強し、活性化し、または刺激することができる物質である。これらの免疫調節剤は、例えば、１つ以上のカンピロバクター・ジェジュニ株の抗原、ＥＴＥＣの抗原、赤痢菌リポ多糖類構造、および非コンジュゲートキャリアタンパク質からなる群から選択される物質を含む。（例えば、US 2015/0258201 A1を参照。）

さらに、本発明の組成物およびワクチンは、単独で、または、他のワクチンおよび／もしくは他の治療剤もしくは免疫調節剤と組み合わせて、投与されうる。このような追加のワクチンおよび薬剤は、いかなる方法によっても、例えば、本発明の免疫原性合成コンストラクトおよび組成物の前、後、または同時に、被験体に投与されうる。

また、本発明は、本発明の免疫原性合成コンストラクトおよび／または組成物を含むキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、コンジュゲートワクチンと、当該コンジュゲートワクチンを被検体に投与するための説明書とを含みうる。また、キットは、任意選択的に、１つ以上の他の治療剤または免疫調節剤も含みうる。キットは、任意選択的に、１つ以上の診断ツールおよび使用説明書を含みうる。例えば、２つ以上のワクチンを含む組成物を含みうるし、または、異なるワクチンもしくは治療剤を含有する別々の医薬組成物を含みうる。また、キットは、連続投与のためのコンジュゲートワクチンの別々の用量を含みうる。キットは、組成物を投与するための説明書と共に、適切な送達デバイス（例えば、注射器や吸入デバイスなど）を含みうる。キットは、任意選択的に、保管、再構成（該当する場合）、および含まれる任意またはすべての治療薬の投与のための説明書を含みうる。キットは、被験体に与える投与回数を反映する複数の容器を含みうる。キットが第１および第２の容器を含む場合、複数の容器が存在しうる。

本明細書では特定の実施形態を参照して本発明を説明してきたが、当然のことながら、これらの実施形態および本明細書で提供される実施例は、単に本発明の原理および適用を反映したものにすぎない。したがって、当然のことながら、説明に役立つ実施形態および実施例に対して多くの変更を行うことができ、また、添付の請求項に記載された本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の構成を考案することができる。本明細書で引用したすべての特許出願、特許、文献、および参考文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれている。

ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌコンストラクトのｐ−メトキシフェニルおよびアミノペンチルグリコシドの合成：ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰおよびＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２

以前、従来の方法および質量分析を用いて、カンピロバクター・ジェジュニ８１−１７６ＣＰＳのガラクトースの２位（ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ）で不定比ＭｅＯＰＮ単位を検出し、^３１Ｐ共鳴は図２１Ａに示すものと同様であった（ピークＹ）（Kanipes MI, et al., (2006) J. Bacteriol. 188: 3273-3279）。^１Ｈ−^３１Ｐ相関実験においてＭｅＯＰＮの^３１Ｐ共鳴Ｙ（δ_Ｐ１４．４５）とガラクトース単位のＨ−２（δ_Ｈ４．５２）との間のクロスピークを検出することにより、ＮＭＲによる当該ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ結合を確認した（図２２Ａ）。いくつかの８１−１７６ＣＰＳ製剤において、強度が比較的低いにもかかわらず、^３１ＰＮＭＲスペクトルは、δ_Ｐ１４．１５で追加の共鳴を示した（指定したピークＺ）（図２１Ｂ）。また、同様のピークが、ＭｅＯＰＮのリン酸とＣＰＳガラクトース単位のいくつかのＨ−６共鳴との間にクロスピークを示した別の８１−１７６ＣＰＳ製剤（ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異体）において観察された（ＭｅＯＰＮのメチル共鳴の非常に近くで共鳴した）（図２２Ｂ）。ＮＭＲデータは、８１−１７６のピークＺが、ガラクトースの６位のＭｅＯＰＮ（ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ）の不定比配置に対応することを示唆した。これらのデータおよびさらなる遺伝子研究は、以下の実施例８でより詳細に述べられる。

原型合成単糖類抗カンピロバクター・ジェジュニワクチンの可能性を試験するために、ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌコンストラクトのｐ−メトキシフェニルおよびアミノペンチルグリコシド、つまり、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰおよびＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２をそれぞれ合成した。具体的には、以下に示すとともに図２および図３に示すように、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐコンストラクトを、ｐ−メトキシフェニル（ＯＭＰ）グリコシドとして合成し、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰ（図２、スキーム１）、その後、キャリアタンパク質へのコンジュゲーションのために、Ｃ−１（βアノマーとして）ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２でアミノペンチルリンカーを備えうる（図３、スキーム２）。

要約ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの合成（図２、図式１）：

ＭｅＯＰＮは、弱酸性媒質で容易に除去されうるため、このような条件を回避する適切な合成方法が必要であった。出発化合物として、４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを公開された方法に従って合成した。簡単に説明すると、４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを、Ｄ−ガラクトースから、アセチル化、４−メトキシフェノールによるグリコシド化、その後、公表された方法によるゼンプレーン脱アセチル化によって合成された。（Montgomery et al. (1942) J. Am. Chem. Soc. 64, 690-694）

４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物１）から出発して、６位にトリチル基を選択的に導入した。当初は、化合物２に対してベンゾイル化を行ったが、ＭｅＯＰＮの導入中に観察された広範な移動は、より適切な保護基の解明を必要とした。したがって、移動に耐性があるＣ−２、Ｃ−３、およびＣ−４位を保護するためにアリル基を選択した。その後、アリル基を接触水素化分解で脱保護して、化合物３を得た。これは、ＭｅＯＰＮ修飾に適合することが判明した。次に、トリチル基を除去して、修飾のために６−ＯＨを露出させた化合物４を得た。

ＭｅＯＰＮの導入方法は、公表された反応と同様である（Maraet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6180-6183 (2011)を参照）。化合物４をトリエチルアミンの存在下で市販のメチルジクロロホスフェートで処理した後、アンモノリシスを行った。新たに導入したＭｅＯＰＮの二重キラル性質のために、２つのジアステレオ異性体の混合物として生成物５を集めた。^３１ＰＮＭＲは、生成物５が実際に２つのジアステレオ異性体の１：１混合物であり、１０．５ｐｐｍで２つのリンシグナルを示すことを確認できた。また、^１ＨＮＭＲは、２つのアノマーおよび２つのＯＣＨ_３シグナルを有する２組のシグナルを明らかにした（データは示さず）。

この反応により、副生成物の混合物が得られた。最も豊富なものは、第２のＮＨ_２によるＯ−メチル基の置換であった。塩化パラジウム（ＩＩ）によるアリル基の除去は、生成物６を生成した。化合物５と同様に、ジアステレオ異性体の混合物が^１Ｈおよび^３１ＰＮＭＲによって観察された（図１３）。２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣＮＭＲ実験は、ＭｅＯＰＮがＯ−６位に導入され、リンシグナルとＨ−６およびＯＣＨ_３の両シグナルとの間に相関シグナルを示すことを確認できた。

要約ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２の合成（図３、スキーム２）

ＭｅＯＰＮ修飾の方法の設計に成功した後、ワクチンコンジュゲートを作製するために、コンストラクトをリンカーに結合した。まず、４−メトキシフェニル（ＯＭＰ）をガラクトシド（図２の化合物３）から除去した。対応するヘミアセタールをトリクロロアセトイミデート供与体（化合物７）に変換した。その後、５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニルリンカーを、０℃で活性剤としてＴＭＳＯＴｆと共に導入した。化合物８を、βアノマーで６５％、αアノマーで２９％集めた。トリチル基の除去により、ＭｅＯＰＮの導入のための遊離ヒドロキシル基を有する化合物９が得られた。上記の手順を用いて、ホスホルアミダート（化合物１０）を２つのジアステレオ異性体の混合物として回収した。その後、アリルおよびフタルイミド保護基を除去して、化合物１１、それから化合物１２を得た。

材料および方法：

化合物は、従来の方法を用いて合成し、すべての化学物質は、商業的供給業者から購入し、受け取ったまま使用した。分子篩は、加熱マントルにより減圧下で加熱することによって活性化した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＴＬＣシリカゲルＦ_２５４上で実施した。糖化合物は、ＵＶ光によってまたはエタノール中の１０％Ｈ_２ＳＯ_４による炭化によって可視化した。フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲルＰ６０（４３〜６０μｍ、２３０〜４００メッシュ）で行った。^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ４００または６００ＭＨｚ分光計（ブルガーダルトニクス社、ビレリカ、マサチューセッツ州）を用いて記録した。残りの非重水素化溶媒（ＣＨＣｌ_３に対してδ７．２４ｐｐｍ）を^１Ｈスペクトルの内部基準として使用した。^１３Ｃスペクトルの場合、化学シフトが溶媒（ＣＤＣｌ_３に対してδ７７．１ｐｐｍ）に対して報告される。化学シフトは、百万分率（ｐｐｍ）で報告される。結合定数は、ヘルツ（Ｈｚ）で報告される。次の略語は、多重度を示すのに使用される：ｓ、一重項；ｄ、二重項；ｔ、三重項；ｍ、多重項。旋光度は、ルドルフリサーチオートポール３自動偏光計（ルドルフ・リサーチ・アナリティカル社、ハケッツタウン、ニュージャージー州）で測定した。濃度（ｃ）は、ｇ／１００ｍｌで表す。合成化合物の高分解能質量スペクトルは、電子スプレーイオン化質量分析（飛行時間分析器）によって記録した。

４−メトキシフェニル６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物２）：

ピリジン（４０ｍＬ）に溶解した化合物１（２．７ｇ、９．３ｍｍｏｌ）の溶液に塩化トリチル（３．１ｇ、１１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を６０℃で３日間撹拌した。その後、反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して化合物２を得た（４．７ｇ、９５％）。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ７．４４〜７．２０（ｍ、１５Ｈ、Ａｒ−Ｈ）；７．１１〜６．８３（ｍ、４Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；５．５１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ、Ｈ−１）；４．０５〜３．９３（ｍ、４Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５）；３．７９（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ_３）；３．５４〜３．３２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−６）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１５５．３、１５１．２、１５０．６、１４４．３、１４３．８、１４３．７、１４３．６、１２９．１、１２８．６、１２８．０、１２７．９、１２７．８、１２７．５、１２７．３、１２７．１、１２７．０、１１８．５、１１７．９、１１４．６、１１４．５、１１４．４（Ａｒ）；９８．４（Ｃ−１）；８７．０、７１．２、７０．０、６９．３（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−５）；６３．６（Ｃ−６）；５５．６（ＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３２Ｈ_３２Ｏ_７［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：５５１．２０４６、実測値：５５１．２０２１。

４−メトキシフェニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物３）：

臭化アリル（４．６ｍＬ、５３ｍｍｏｌ）でＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解した化合物２（４．７ｇ、８．８ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。鉱油中の水素化ナトリウム、６０％分散液（１．２ｇ、２９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。その後、反応をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で急冷し、氷冷水（１００ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濃縮した。１：７ＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、化合物３（５．１ｇ、８９％）を得た。［α］_Ｄ ^２５＝＋１３２．６°（ｃ＋０．１、ＣＨＣｌ_３）；^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ７．３８〜７．１８（ｍ、１５Ｈ、Ａｒ−Ｈ）；７．１０〜６．７５（ｍ、４Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；６．００〜５．５３（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．４２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．２Ｈｚ、Ｈ−１）；５．３３〜４．９８（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．３７〜３．７２（ｍ、１３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５、ＯＣＨ_３）；３．３８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ａ）；３．０１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ｂ）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１５５．０、１５１．０、１４３．９（Ａｒ）；１３５．２、１３５．１、１３５．０（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１２８．６、１２７．８、１２７．０、１１９．０、１１７．４、１１７．３、１１６．４、１１４．４（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ａｒ）；９７．５（Ｃ−１）；８６．８；７８．２（Ｃ−２）；７７．４（Ｃ−４；７６．１（Ｃ−５）；７３．９、７２．５、７１．９（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；７０．４（Ｃ−３）６３．３（Ｃ−６）；５５．６（ＯＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_４１Ｈ_４４Ｏ_７［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：６７１．２９８５、実測値：６７１．２９７０。

４−メトキシフェニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物４）：

８０％水性ＡｃＯＨ（５ｍＬ）中の化合物３（３００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の溶液を８０℃で１．５時間撹拌した。反応混合物を濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（１：６ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）により精製して、化合物４（１４７ｍｇ、７８％）を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣ_ｌ３）：δ７．０２〜６．７８（ｍ、４Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；５．９５〜５．８９（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．５０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、Ｈ−１）；５．３５〜５．１２（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．４２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝３．２Ｈｚ、Ｊ_２＝９．３Ｈｚ、Ｈ−３）；４．２７〜３．８９（ｍ、１０Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｈ−２、Ｈ−４、Ｈ−５、ＯＨ）；３．８１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ａ）；３．７４（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ_３）；３．７０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ｂ）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１５５．１、１５０．９（Ａｒ）；１３５．０、１３４．９（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１１８．６、１１８．０、１１７．４、１１６．６、１１４．５（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ａｒ）；９７．５（Ｃ−１）；７８．２、７５．９、７４．０、７２．６、７２．０，７１．０（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−５）；６２．７（Ｃ−６）；５５．６（ＯＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_２２Ｈ_３０Ｏ_７［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：４２９．１８９０、実測値：４２９．１８９１。

４−メトキシフェニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−メチル−ホスホルアミデート−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物５）：

分子篩でＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｍＬ）に溶解した化合物４（６５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）およびジクロロリン酸メチル（１５０μＬ、１．３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（１７５μＬ、１．３ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を室温で５時間撹拌した。ＴＬＣで判断して反応が完了したら、アンモニアガスを針を通して反応混合物に注入した。１０分後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、化合物５を得た（１５ｍｇ、１９％）。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ７．０４〜６．７７（ｍ、４Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；５．９９〜５．８５（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．４８（２ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ、Ｈ−１）；５．３６〜５．１０（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．４１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−３）；４．２９〜４．１０（ｍ、８Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｈ−２、Ｈ−４）；３．９５〜３．８６（ｍ、３Ｈ、Ｈ−５、Ｈ−６）；３．７３（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ_３）；３．５７（２ｄ、３Ｈ、Ｊ＝１１．４Ｈｚ、ＯＣＨ_３）；２．７５、２．５６（２ｄ、２Ｈ、ＮＨ_２）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１５５．２、１５５．０、１５０．９（Ａｒ）；１３５．０、１３４．９（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１２８．９、１２８．３、１１８．８、１１８．５、１１７．７、１１７．５、１１７．４、１１６．６、１１４．５、１１４．４（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ａｒ）；９７．６、９７．２（Ｃ−１）；７８．１、７５．８、７４．４、７４．０、７２．７、７１．９、７０．５、７０．４、７０．０、６９．９、６８．５、６５．５、（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−５、Ｃ−６）；５５．７、５３．３、５３．２（ＯＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_２３Ｈ_３４ＮＯ_９Ｐ［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算値：５００．２０５０、実測値：５００．２０３５。

４−メトキシフェニル６−Ｏ−メチル−ホスホルアミデート−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物６）：

ＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した化合物５（１７．０ｍｇ）の溶液にＰｄＣｌ_２（５．０ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で３時間撹拌した。その後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（純粋なＥｔＯＡｃ）で精製して、化合物６を得た（５．１ｍｇ、３９％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ６．９８〜６．８０（ｍ、４Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；５．３９（２ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ、Ｈ−１）；４．１３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−３）；４．０１〜３．８５（ｍ、４Ｈ、Ｈ−４、Ｈ−５、Ｈ−６）；３．７８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−２）；３．６３（ＯＣＨ_３）；３．４１（２ｄ、３Ｈ、Ｊ＝１１．４Ｈｚ、ＯＣＨ_３）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ１５４．６、１５０．０、１４９．９、１１９．３、１１９．１、１１４．９（Ａｒ）；９８．１、９７．９（Ｃ−１）；７０．３、７０．２、７０．０、６９．１、６８．８、６７．８、６５．８（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−５、Ｃ−６）；５５．６（ＯＣＨ_３）；５３．６、５３．５、５３．４（ＯＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１４Ｈ_２３ＮＯ_９Ｐ［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算値：３８０．１１１１；実測値３８０．１１１０。

２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−α，β−Ｄ−ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート（化合物７）：

ＣＨ_３ＣＮ（４８０ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（１２０ｍＬ）に溶解した化合物３（５．０ｇ、７．７ｍｍｏｌ）の溶液に、硝酸セリウムアンモニウム（１２．８ｇ、２３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃で２０分間撹拌した。その後、混合物をブライン（２００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（１：６ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製した。得られたヘミアセタール（３．３ｇ、６．１ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（１２０ｍｌ）に溶解し、ＣＣｌ_３ＣＮ（３１０μＬ、３０ｍｍｏｌ）およびＫ_２ＣＯ_３（４２０ｍｇ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した後、セライト（登録商標）で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（体積１％Ｅｔ_３Ｎを含む１：４ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、化合物７をα，β−混合物として得た（３．６ｇ、２段階で５７％）（化合物７Ａ、７Ｂ）。

７Ａ：^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ８．５２（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）；７．４２〜７．１８（ｍ、１５Ｈ、Ａｒ−Ｈ）；６．４６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ、Ｈ−１）；６．００〜５．６１（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．３９〜４．９８（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．３２〜３．８４（ｍ、１０Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５）；３．３５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ａ）；３．０９（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ｂ）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１６１．３、１６０．８、１４３．９、１４３．７、１３５．２、１３５．０、１３４．９、１３４．８、１３４．１、１３３．８、１２８．８、１２８．６、１２７．８、１２７．１、１２７．０（Ａｒ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１１７．９、１１７．４、１１７．３、１１６．７、１１６．５（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１０４．０（Ｃ−１）；８６．８（Ｃ−３）；８６．７（Ｃ−２）；８３．８（Ｃ−３）；８２．６；７６．７（Ｃ−４）；７５．３、７４．１、７２．５、７２．２、７１．８、７１．０（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｃ−５）；６１．９（Ｃ−６）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３６Ｈ_３８Ｃ_ｌ３ＮＯ_６［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：７０８．１６６３、実測値：７０８．１６７３。

７Ｂ：^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ８．５９（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）；７．４１〜７．１８（ｍ、１５Ｈ、Ａｒ−Ｈ）；５．９０（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．６２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−１、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．３５〜５．０１（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．３１〜３．８３（ｍ、６ＨＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；３．８３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５）；３．７６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝８．２Ｈｚ、Ｊ_２＝９．７Ｈｚ、Ｈ−３）；３．６２（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、Ｈ−２）；３．４８〜３．３９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−４、Ｈ−６ａ）；３．１２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝７．２Ｈｚ、Ｊ_２＝９．３Ｈｚ、Ｈ−６ｂ）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１６１．５、１４３．８（Ａｒ）；１３５．４、１３４．９、１３４．８（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１２８．７、１２８．６、１２８．０、１２７．９、１２７．１（Ａｒ）；１１７．３、１１７．０、１１６．８（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；９８．５（Ｃ−１）；８６．８（Ｃ−２）；８１．６（Ｃ−３）；７７．８（Ｃ−５）；７４．６（Ｃ−３）；７４．２、７３．８、７３．３、７２．０（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｃ−４）；６２．４（Ｃ−６）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３６Ｈ_３８Ｃｌ_３ＮＯ_６［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：７０８．１６６３、実測値：７０８．１６７３。

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物８）：

トリクロロアセトイミデート（化合物７、両方アノマー）（１．１ｇ、１．６ｍｍｏｌ）および５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタノール（５６０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（２５ｍＬ）に溶解し、反応混合物を０℃に冷却した。ＴＭＳＯＴｆ（１５μＬ、０．０８０ｍｍｏｌ）を滴下して加え、反応混合物を０℃で１５分間撹拌した。その後、反応物をＥｔ_３Ｎ（１５μＬ）で中和し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１：８ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、化合物８（７８３ｍｇ、６５％）を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ７．８０〜７．６７（ｍ、４Ｈ、フタルイミドプロトン）；７．４１〜７．１９（ｍ、１５Ｈ、Ａｒ−Ｈ）；５．９８〜５．５９（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．３３〜４．９４（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．３０〜３．８４（ｍ、８Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｈ−１、リンカー−ＣＨＨ）；３．７７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．９Ｈｚ、Ｈ−５）；３．６２（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、リンカー−ＣＨ_２）；３．４５〜３．３５（ｍ、４Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−４、Ｈ−６ａ、リンカー−ＣＨＨ）；３．２９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝３．０Ｈｚ、Ｊ_２＝９．８Ｈｚ、Ｈ−３）；３．１３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝９．４Ｈｚ、Ｊ_２＝１０．１Ｈｚ、Ｈ−６ｂ）；１．６５（ｍ、４Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）；１．４０（ｍ、２Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１６８．４、１４３．８（Ａｒ）；１３５．７、１３５．３、１３５．２（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１３３．９、１３２．１、１２８．７、１２７．９、１２７．１、１２３．２（Ａｒ）；１１６．８、１１６．５（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１０３．７（Ｃ−１）；８６．８；８１．５（Ｃ−１）；７９．２（Ｃ−２）；７３．９、７３．６、７３．４、７３．３（Ｃ−５、Ｃ−４、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；７１．９、６９．４（リンカー）；６２．５（Ｃ−６）；３７．９、２９．２、２８．４、２３．４（リンカー）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_４７Ｈ_５１ＮＯ_８［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：７８０．３５１３、実測値７８０．３４８９。

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物９）：

８０％水性ＡｃＯＨ（１０ｍＬ）に溶解した化合物８（４９３ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の溶液を８０℃で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して化合物９（２６０ｍｇ、７８％）を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ７．８１〜７．６６（ｍ、４Ｈ、フタルイミドプロトン）；５．９２〜５．８２（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．３０〜５．１０（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．３７〜４．０２（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．２２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、Ｈ−１）；３．８８（ｍ、２Ｈ、Ｈ−６ａ、リンカー−ＣＨＨ）；３．６９〜３．６０（ｍ、４Ｈ、Ｈ−４、Ｈ−６ｂ、リンカー−ＣＨ_２）；３．５１〜３．４２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２、リンカー−ＣＨＨ）；３．３９（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５）；３．２８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝３．０Ｈｚ、Ｊ_２＝９．８Ｈｚ、Ｈ−３）；２．０９（ｍ、１Ｈ、６−ＯＨ）；１．６５（ｍ、４Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）；１．４０（ｍ、２Ｈ、リンカー−ＣＨ２）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１６８．５（フタルイミドＣ＝Ｏ）；１３５．３、１３５．０、１３３．９（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１３２．１、１２３．２（フタルイミド）；１１７．８、１１６．７、１１６．６（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１０３．９（Ｃ−１）；８１．６（Ｃ−３）；７９．１（Ｃ−２）；７４．６（Ｃ−５）；７４．０（Ｃ−４）；７３．７、７３．６（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；７２．１、６９．６（リンカー）；６２．５（Ｃ−６）；３７．８、２９．２、２８．３、２３．３（リンカー）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_２８Ｈ_３７ＮＯ_８［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：５３８．２４１７、実測値５３８．２４０３。

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物１０）：

分子篩でＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）に溶解した化合物９（４００ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）およびジクロロリン酸メチル（０．７０ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（０．７０ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。ＴＬＣで判断して反応が完了したら、アンモニアガスを針を通して反応混合物に注入した。１０分後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（９：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）で精製して、化合物１０を得た（１２９ｍｇ、２７％）。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：７．８０〜７．６８（フタルイミドプロトン）；５．８８（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．３０〜５．１０（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．２３〜４．１０（ｍ、９Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｈ−１、リンカー−ＣＨ_２）；３．８２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５）；３．７１〜３．３９（ｍ、９Ｈ、ＯＣＨ_３、Ｈ−４、Ｈ−２、Ｈ−６ａ、Ｈ−６ｂ、リンカー−ＣＨ_２）；３．２８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−３）；２．８７（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ_１＝５．３Ｈｚ、Ｊ_２＝１３．０Ｈｚ、ＮＨ_２）；１．６６（ｍ、４Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）；１．３８（ｍ、２Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１６８．５（Ａｒ）；１３５．４、１３５．２、１３４．９（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１３３．９、１３２．１、１２３．２（Ａｒ）；１１７．５、１１７．２、１１６．８、１１６．７、１１６．６（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１０３．８（Ｃ−１）；８１．４（Ｃ−３）；７８．９（Ｃ−２）；７４．０、７３．８、７３．３、７３．２、７３．０、７２．９、７２．１（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｃ−５、Ｃ−４）；６９．８、６９．７（Ｃ−６）；６５．３、６５．０、６４．９（リンカー）；５３．４、５３．３（ＯＣＨ_３）；３７．９、２９．７、２９．２、２８．３（リンカー）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_２９Ｈ_４１Ｎ_２Ｏ_１０Ｐ［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算値：６０９．２５７８、実測値６０９．２５８５。

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物１１）：

ＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解した化合物１０（９５ｍｇ、０．１６μｍｏｌ）の溶液に、ＰｄＣｌ_２（２０ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で４時間撹拌した。その後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（９：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）による精製により、化合物１１（５７ｍｇ、７５％）を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ７．６４（ｍ、４Ｈ、フタルイミドプロトン）；４．２３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−１）；４．０１（ｍ、２Ｈ、Ｈ−６）；３．７８〜３．７０（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４、Ｈ−５、リンカー−ＣＨＨ））；３．５９〜３．４５（ｍ、７Ｈ、ＯＣＨ_３、リンカー−ＣＨ_２リンカー−ＣＨＨ、Ｈ−３）；３．３３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝８．０Ｈｚ、Ｊ_２＝９．８Ｈｚ、Ｈ−２）；１．５１（ｍ、４Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）；１．２２（ｍ、２Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：１７０．９、１３４．５、１３３．９、１３１．３、１２６．０、１２３．１（Ａｒ）；１０２．６（Ｃ−１）；７３．２（Ｃ−５）；７２．５（Ｃ−３）；７１．９（Ｃ−２）；７０．３、７０．２（リンカー）；６８．１（Ｃ−４）；６５．４（Ｃ−６）；５３．６（ＯＣＨ_３）；４８．７、３７．６（リンカー）；２８．２、２７．２、２２．３（リンカー）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_２０Ｈ_２９Ｎ_２Ｏ_１０Ｐ［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算値：４８９．１６３９、実測値４８９．１６２４。

５−アミノ−ペンタニル６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物１２）：

９５％ＥｔＯＨ（１ｍＬ）に溶解した化合物１１（２３ｍｇ、０．０４７μｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン一水和物（１６μＬ、０．３３μｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。その後、反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（３：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）で精製して化合物１２（１４ｍｇ、８２％）を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ４．２７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、Ｈ−１）；４．０３（ｍ、２Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）；３．８１〜３．７５（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４、Ｈ−５、Ｈ−６ａ）；３．６１〜３．４８（ｍ、５Ｈ、ＯＣＨ_３、Ｈ−３、Ｈ−６ｂ）；３．３６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝７．９、Ｊ２＝９．９Ｈｚ、Ｈ−２）；２．８２（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、リンカー−ＣＨ_２）；１．５２（ｍ、４Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）；１．３０（ｍ、２Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ１０２．６（Ｃ−１）；７３．２（Ｃ−５）；７２．５（Ｃ−３）；７０．５（Ｃ−２）；７０．１（Ｃ−６）；６８．１（Ｃ−４）；６０．０（リンカー）；４８．７（ＯＣＨ_３）；３９．２、２８．０、２６．３、２２．０、２１．９（リンカー）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１２Ｈ_２７Ｎ_２Ｏ_８Ｐ［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算値：３５９．１５８４、実測値３５９．１５８７。

また、構造ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２の合成も、図４のスキーム２ａに記載のように示すことができ、以下に要約する。

以前に報告された化合物（Comfort, et al., Biochem. 46: 3319-3330 (2007)）、４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物１を参照）から出発して、トリチル基をＣ−６に選択的に導入した。当初は、化合物２にベンゾイル化を行ったが（スキーム２ａ、化合物２）、ＭｅＯＰＮの導入中に観察された広範な移動が、より適切な保護基の解明をもたらした。したがって、移動に耐性があるＣ−２、Ｃ−３、およびＣ−４位を保護するためにアリル基を選択した。その後、アリル基を触媒的水素化分解で脱保護した。これは、ＭｅＯＰＮ修飾に適合することが判明した。

アリル基を導入した後、アミノ−ペンタニルリンカーを、コンジュゲーション用の部位としてアノマー位に導入した。ガラクトシド（スキーム２ａ、化合物３）から出発して、まず、硝酸セリウムアンモニウム（ＣＡＮ）を用いて４−メトキシフェニル基（ＯＭＰ）を除去した。その後、対応するヘミアセタールをトリクロロアセトイミダート供与体に変換した（スキーム２ａ、化合物４を参照）。その後、５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニルリンカーを、０℃で活性剤としてＴＭＳＯＴｆと共に導入した。化合物５を、βアノマーとして６５％、αアノマーとして２９％集めた。トリチル基の除去により、修飾用の遊離６−ヒドロキシル基を有する化合物６を得た。

ＭｅＯＰＮ基の導入方法は、C. Mara et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6180-6183 (2011)によって提案された反応と同様である。化合物６をトリエチルアミンの存在下で市販のメチルジクロロホスフェートで処理した後、アンモノリシスを行った。新たに導入したＭｅＯＰＮ（ＲおよびＳ）のキラリティ（chirality）の性質のために、２つのジアステレオ異性体の混合物として化合物７を集めた。^１ＨＮＭＲは、化合物７が実際に２つのジアステレオ異性体の１：１混合物であり、スペクトル全体にわたって２組のシグナルを示すことを確認できた。これは、アノマーおよびＯ−Ｍｅシグナルについて見られうる。この反応により、副生成物の混合物が得られた。最も豊富なものは、第２のＮＨ_２によるＯ−Ｍｅ基の置換であった。これが、この反応の低収率の主な原因である。

アリルおよびフタルイミド保護基を塩化パラジウム（ＩＩ）およびヒドラジンでそれぞれ除去して、化合物８および化合物９を生成した。化合物７と同様に、ジアステレオ異性体の混合物は、ＮＭＲによく現れている。光学的に純粋ではないものの、^３１ＰＮＭＲの結果は、天然のＭｅＯＰＮ含有多糖類と一致し、１４ｐｐｍあたりにリン信号を有する。^３１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣＮＭＲ実験は、ＭｅＯＰＮがＯ−６位に導入され、Ｏ−ＭｅシグナルおよびＨ−６シグナルとで相関シグナルを示すことを確認できた（データは示さず）。

ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２の上記合成の詳細は、以下およびスキーム２ａに提供されている。

４−メトキシフェニル６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物２）：

ピリジン（４０ｍＬ）に溶解した化合物１（２．７ｇ、９．３ｍｍｏｌ）の溶液に塩化トリチル（３．１ｇ、１１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を６０℃で３日間撹拌した。その後、反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して化合物２（４．７ｇ、９５％）を得た。［α］_Ｄ ^２５＝＋９１．２°（ｃ＝０．２１、ＣＨＣｌ_３）；^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ７．４４〜７．２０（ｍ、１５Ｈ、Ａｒ−Ｈ）；７．１１〜６．８３（ｍ、４Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；５．５１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６Ｈｚ、Ｈ−１）；４．０５〜３．９３（ｍ、４Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５）；３．７９（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ_３）；３．５４〜３．３２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−６）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１５５．３、１５１．２、１５０．６、１４４．３、１４３．８、１４３．７、１４３．６、１２９．１、１２８．６、１２８．０、１２７．９、１２７．８、１２７．５、１２７．３、１２７．１、１２７．０、１１８．５、１１７．９、１１４．６、１１４．５、１１４．４（Ａｒ）；９８．４（Ｃ−１）；８７．０、７１．２、７０．０、６９．３（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−５）；６３．６（Ｃ−６）；５５．６（ＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３２Ｈ_３２Ｏ_７［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：５５１．２０４６、実測値：５５１．２０２１。

４−メトキシフェニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物３）：

臭化アリル（４．６ｍＬ、５３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解した化合物２（４．７ｇ、８．８ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。鉱油中の水素化ナトリウム、６０％分散液（１．２ｇ、２９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。その後、反応をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）で急冷し、氷冷水（１００ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濃縮した。１：７ＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、化合物３を得た（スキーム１、構造３を参照）（５．１ｇ、８９％）。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ７．３８〜７．１８（ｍ、１５Ｈ、Ａｒ−Ｈ）；７．１０〜６．７５（ｍ、４Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；６．００〜５．５３（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．４２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．２Ｈｚ、Ｈ−１）；５．３３〜４．９８（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．３７〜３．７２（ｍ、１３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５、ＯＣＨ_３）；３．３８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ａ）；３．０１（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ｂ）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１５５．０、１５１．０、１４３．９（Ａｒ）；１３５．２、１３５．１、１３５．０（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１２８．６、１２７．８、１２７．０、１１９．０、１１７．４、１１７．３、１１６．４、１１４．４（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ａｒ）；９７．５（Ｃ−１）；８６．８；７８．２（Ｃ−２）；７７．４（Ｃ−４）；７６．１（Ｃ−５）；７３．９、７２．５、７１．９（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；７０．４（Ｃ−３）６３．３（Ｃ−６）；５５．６（ＯＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_４１Ｈ_４４Ｏ_７［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：６７１．２９８５、実測値：６７１．２９７０。

２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−α，β−Ｄ−ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート（スキーム２ａ、化合物４）：

ＣＨ_３ＣＮ（４８０ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（１２０ｍＬ）に溶解した化合物３（５．０ｇ、７．７ｍｍｏｌ）の溶液に、硝酸セリウムアンモニウム（１２．８ｇ、２３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃で２０分間撹拌した。その後、混合物をブライン（２００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（１：６ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製した。得られたヘミアセタール（３．３ｇ、６．１ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（１２０ｍｌ）に溶解し、ＣＣｌ_３ＣＮ（３１０μＬ、３０ｍｍｏｌ）およびＫ_２ＣＯ_３（４２０ｍｇ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した後、セライト（登録商標）で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（体積１％Ｅｔ_３Ｎを含む１：４ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、化合物４をα，β−混合物として得た（３．６ｇ、２段階で５７％）。

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物５）：

トリクロロアセトイミデート（化合物４）（１．１ｇ、１．６ｍｍｏｌ）および５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタノール（５６０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（２５ｍＬ）に溶解し、反応混合物を０℃に冷却した。ＴＭＳＯＴｆ（１５μＬ、０．０８０ｍｍｏｌ）を滴下して加え、反応混合物を０℃で１５分間撹拌した。その後、反応物をＥｔ_３Ｎ（１５μＬ）で中和し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１：８ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、化合物５（７８３ｍｇ、６５％）を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ７．８０〜７．６７（ｍ、４Ｈ、フタルイミドプロトン）；７．４１〜７．１９（ｍ、１５Ｈ、Ａｒ−Ｈ）；５．９８〜５．５９（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．３３〜４．９４（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．３０〜３．８４（ｍ、８Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｈ−１、リンカー−ＣＨＨ）；３．７７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．９Ｈｚ、Ｈ−５）；３．６２（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、リンカー−ＣＨ_２）；３．４５〜３．３５（ｍ、４Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−４、Ｈ−６ａ、リンカー−ＣＨＨ）；３．２９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝３．０Ｈｚ、Ｊ_２＝９．８Ｈｚ、Ｈ−３）；３．１３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝９．４Ｈｚ、Ｊ_２＝１０．１Ｈｚ、Ｈ−６ｂ）；１．６５（ｍ、４Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）；１．４０（ｍ、２Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：１６８．４、１４３．８（Ａｒ）；１３５．７、１３５．３、１３５．２（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１３３．９、１３２．１、１２８．７、１２７．９、１２７．１、１２３．２（Ａｒ）；１１６．８、１１６．５（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１０３．７（Ｃ−１）；８６．８；８１．５（Ｃ−１）；７９．２（Ｃ−２）；７３．９、７３．６、７３．４、７３．３（Ｃ−５、Ｃ−４、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；７１．９、６９．４（リンカー）；６２．５（Ｃ−６）；３７．９、２９．２、２８．４、２３．４（リンカー）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_４７Ｈ_５１ＮＯ_８［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：７８０．３５１３、実測値７８０．３４８９。

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物６）：

８０％水性ＡｃＯＨ（１０ｍＬ）に溶解した化合物５（４９３ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の溶液を８０℃で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して化合物６（２６０ｍｇ、７８％）を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ７．８１〜７．６６（ｍ、４Ｈ、フタルイミドプロトン）；５．９２〜５．８２（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．３０〜５．１０（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．３７〜４．０２（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．２２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、Ｈ−１）；３．８８（ｍ、２Ｈ、Ｈ−６ａ、リンカー−ＣＨＨ）；３．６９〜３．６０（ｍ、４Ｈ、Ｈ−４、Ｈ−６ｂ、リンカー−ＣＨ_２）；３．５１〜３．４２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２、リンカー−ＣＨＨ）；３．３９（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５）；３．２８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝３．０Ｈｚ、Ｊ_２＝９．８Ｈｚ、Ｈ−３）；２．０９（ｍ、１Ｈ、６−ＯＨ）；１．６５（ｍ、４Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）；１．４０（ｍ、２Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１６８．５（フタルイミドＣ＝Ｏ）；１３５．３、１３５．０、１３３．９（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１３２．１、１２３．２（フタルイミド）；１１７．８、１１６．７、１１６．６（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１０３．９（Ｃ−１）；８１．６（Ｃ−３）；７９．１（Ｃ−２）；７４．６（Ｃ−５）；７４．０（Ｃ−４）；７３．７、７３．６（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；７２．１、６９．６（リンカー）；６２．５（Ｃ−６）；３７．８、２９．２、２８．３、２３．３（リンカー）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_２８Ｈ_３７ＮＯ_８［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：５３８．２４１７、実測値５３８．２４０３。

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物７）：

分子篩でＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）に溶解した化合物６（４００ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）およびジクロロリン酸メチル（０．７０ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（０．７０ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。ＴＬＣで判断して反応が完了したら、アンモニアガスを針を通して反応混合物に注入した。１０分後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（９：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）で精製して、生成物７（１２９ｍｇ、２７％）を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：７．８０〜７．６８（フタルイミドプロトン）；５．８８（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．３０〜５．１０（ｍ、６Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．２３〜４．１０（ｍ、９Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｈ−１、リンカー−ＣＨ_２）；３．８２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５）；３．７１〜３．３９（ｍ、９Ｈ、ＯＣＨ_３、Ｈ−４、Ｈ−２、Ｈ−６ａ、Ｈ−６ｂ、リンカー−ＣＨ_２）；３．２８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−３）；２．８７（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ_１＝５．３Ｈｚ、Ｊ_２＝１３．０Ｈｚ、ＮＨ_２）；１．６６（ｍ、４Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）；１．３８（ｍ、２Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１６８．５（Ａｒ）；１３５．４、１３５．２、１３４．９（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１３３．９、１３２．１、１２３．２（Ａｒ）；１１７．５、１１７．２、１１６．８、１１６．７、１１６．６（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１０３．８（Ｃ−１）；８１．４（Ｃ−３）；７８．９（Ｃ−２）；７４．０、７３．８、７３．３、７３．２、７３．０、７２．９、７２．１（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｃ−５、Ｃ−４）；６９．８、６９．７、６５．３（Ｃ−６）；６５．０、６４．９（リンカー）；５３．４、５３．３（ＯＣＨ_３）；３７．９、２９．７、２９．２、２８．３（リンカー）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_２９Ｈ_４１Ｎ_２Ｏ_１０Ｐ［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算値：６０９．２５７８、実測値６０９．２５８５。

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物８）：

ＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解した化合物７（９５ｍｇ、０．１６μｍｏｌ）の溶液に、ＰｄＣｌ_２（２０ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で４時間撹拌した。その後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（９：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）による精製により、化合物８（５７ｍｇ、７５％）を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ７．６４（ｍ、４Ｈ、フタルイミドプロトン）；４．２３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、Ｈ−１）；４．０１（ｍ、２Ｈ、Ｈ−６）；３．７８〜３．７０（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４、Ｈ−５、リンカー−ＣＨＨ）；３．５９〜３．４５（ｍ、７Ｈ、ＯＣＨ_３、リンカー−ＣＨ_２リンカー−ＣＨＨ、Ｈ−３）；３．３３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝８．０Ｈｚ、Ｊ_２＝９．８Ｈｚ、Ｈ−２）；１．５１（ｍ、４Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）；１．２２（ｍ、２Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：１７０．９、１３４．５、１３３．９、１３１．３、１２６．０、１２３．１（Ａｒ）；１０２．６（Ｃ−１）；７３．２（Ｃ−５）；７２．５（Ｃ−３）；７１．９（Ｃ−２）；７０．３、７０．２（リンカー）；６８．１（Ｃ−４）；６５．４（Ｃ−６）；５３．６（ＯＣＨ_３）；４８．７、３７．６（リンカー）；２８．２；２７．２、２２．３（リンカー）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_２０Ｈ_２９Ｎ_２Ｏ_１０Ｐ［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算値：４８９．１６３９、実測値４８９．１６２４。

５−アミノ−ペンタニル６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物９）：

９５％ＥｔＯＨ（１ｍＬ）に溶解した化合物８（２３ｍｇ、０．０４７μｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン一水和物（１６μＬ、０．３３μｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。その後、反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（３：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）で精製して化合物９（１４ｍｇ、８２％）を得た。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ４．２７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、Ｈ−１）；４．０３（ｍ、２Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）；３．８１〜３．７５（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４、Ｈ−５、Ｈ−６ａ）；３．６１〜３．４８（ｍ、５Ｈ、ＯＣＨ_３、Ｈ−３、Ｈ−６ｂ）；３．３６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝７．９、Ｊ_２＝９．９Ｈｚ、Ｈ−２）；２．８２（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、リンカー−ＣＨ_２）；１．５２（ｍ、４Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）；１．３０（ｍ、２Ｈ、リンカー−ＣＨ_２）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ１０２．６（Ｃ−１）；７３．２（Ｃ−５）；７２．５（Ｃ−３）；７０．５（Ｃ−２）；７０．１（Ｃ−６）；６８．１（Ｃ−４）；６０．０（リンカー）；４８．７（ＯＣＨ_３）；３９．２、２８．０、２６．３、２２．０、２１．９（リンカー）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１２Ｈ_２７Ｎ_２Ｏ_８Ｐ［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算値：３５９．１５８４、実測値３５９．１５８７。

ＭｅＯＰＮ→２−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの合成

要約ＭｅＯＰＮ→２−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの合成（図５、スキーム３）：

ＭｅＯＰＮ→２−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの合成を図５のスキーム３に示す。ガラクトシド（生成物７）の合成は、既知の化合物である４−メトキシフェニル３，４−Ｏ−イソプロピリデン−６−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物１）から始めた。この生成物１は、公表された手順（スキーム１）に従ってＤ−ガラクトースから調製した（Comfort DA, et al., Biochem 2007; 46: 3319- 3330）。Ｃ−２位を区別するために、Ｏ−アリル化を行い、優れた収率で生成物２を生成した。ＭｅＯＰＮは酸性媒質によって除去可能であるため、適切な保護基を導入する必要があった。よって、Ｏ−イソプロピリデンおよびＯ−トリチル基を除去して、生成物３を得た。その後、これを過ベンゾイル化して生成物４を得た。次に、アリル基を除去して、修飾用の遊離２−ＯＨを得た。ＭｅＯＰＮ基の生成物５への導入は、まず市販のジクロロリン酸メチルでリン酸化した後でアンモノリシスを行うことを含む、以前に当研究所で開発した方法に従った（Jiao, Y. et al., Carbohydr. Res. (2015) doi: 10.1016/j.carres.2015.09.012）。生成物５の^３１ＰＮＭＲスペクトルは、２つのジアステレオ異性体の形成に起因して、約１：１比の２つのリンシグナルを示した。生成物６を脱ベンゾイル化して、Ｏ−Ｍｅ−ホスホルアミデートガラクトシドの生成物７を得た。興味深いことに、本発明者らは、フラッシュクロマトグラフィーを用いてジアステレオ異性体の１つを精製することができた。ジアステレオ異性体７^＊の^３１ＰＮＭＲスペクトルは、１４．２７ｐｐｍで単一のシグナルを示した（図１４参照）。

材料および方法：

従来の方法を用いて化合物を合成し、すべての化学物質を商業的供給業者から購入し、受け取ったまま使用した。分子篩を、加熱マントルにより減圧下で加熱することによって活性化した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＴＬＣシリカゲルＦ_２５４上で実施した。糖化合物は、ＵＶ光によってまたはエタノール中の１０％Ｈ_２ＳＯ_４による炭化によって可視化した。フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲルＰ６０（４３〜６０μｍ、２３０〜４００メッシュ）で行った。１ＨＮＭＲおよび１３ＣＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ４００または６００ＭＨｚ分光計（ブルガーダルトニクス社、ビレリカ、マサチューセッツ州）を用いて記録した。残りの非重水素化溶媒（ＣＨＣｌ_３に対してδ７．２４ｐｐｍ）を^１Ｈスペクトルの内部基準として使用した。^１３Ｃスペクトルの場合、化学シフトが溶媒（ＣＤＣｌ_３に対してδ７７．１ｐｐｍ）に対して報告される。化学シフトは、百万分率（ｐｐｍ）で報告される。結合定数は、ヘルツ（Ｈｚ）で報告される。次の略語は、多重度を示すのに使用される：ｓ、一重項；ｄ、二重項；ｔ、三重項；ｍ、多重項。旋光度は、ルドルフリサーチオートポール３自動偏光計で測定した。濃度（ｃ）は、ｇ／１００ｍｌで表す。合成化合物の高分解能質量スペクトルは、電子スプレーイオン化質量分析（飛行時間分析器）によって記録した。

４−メトキシフェニル２−Ｏ−アリル−３，４−Ｏ−イソプロピリデン−６−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物２）：

臭化アリル（０．１６ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１８ｍＬ）に溶解した生成物１（０．６８ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。鉱油中の水素化ナトリウム、６０％分散液（５７ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。その後、反応をＭｅＯＨ（２ｍＬ）で急冷し、氷冷水（４０ｍＬ）に注ぎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濃縮した。１：７ＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、生成物２（０．６９ｇ、９５％）を得た。［α］_Ｄ ^２５＝＋４０．２°（ｃ＝０．０５、ＣＨＣｌ_３）；^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ７．４６〜７．１９（ｍ、１５Ｈ、Ａｒ）；７．１０〜６．７５（ｍ、４Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；５．９２（ｍ、１Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．３４〜５．１９（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．６７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、Ｈ−１）；４．３６（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．０８（ｍ、２Ｈ、Ｈ−３、Ｈ−４）；３．７３（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ_３）；３．６１〜３．５３（ｍ、３Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−５、Ｈ−６ａ）；３．３４（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ｂ）；１．４７（ｓ、３Ｈ、ＣＨ_３）；１．２９（ｓ、３Ｈ、ＣＨ_３）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１５５．２，１５１．５，１４４．０，１４３．９（Ａｒ）；１３４．９（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１２８．８、１２７．９、１２７．８、１２７．０、１２６．９、１１８．６、１１８．３、１１７．７、１１７．４、１１４．５、１１４．４、１１０．２、１０９．３（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ａｒ）；１０２．２（Ｃ−１）；８６．８（ＣＭｅ_２）７９．４（Ｃ−２）；７９．２（Ｃ−３）；７３．８（Ｃ−４）；７２．９（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；７２．６（Ｃ−５）；６３．０（Ｃ−６）；５５．６（ＯＣＨ_３）；２７．９、２６．３（ＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３８Ｈ_４０ＮａＯ_７［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：６３１．２６７２、実測値：６３１．２６７０。

４−メトキシフェニル２−Ｏ−アリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物３）：

８０％水性ＡｃＯＨ（１０ｍＬ）中の生成物２（０．６９ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液を８０℃で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）による精製により、生成物３（０．３５ｇ、９４％）を得た。［α］_Ｄ ^２５＝＋９０．２°（ｃ＝０．２、ＣＨＣｌ_３）；^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ７．０１〜７．７８（ｍ、４Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；５．９１（ｍ、１Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．１９（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．８３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、Ｈ−１）；４．５３〜４．２５（ｍ、２Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；４．１４（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５）；３．９６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ａ）；３．８５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ｂ）；３．７６（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ_３）；３．６２（ｍ、３Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１５５．４，１５１．１（Ａｒ）；１３４．５（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１１８．５、１１８．２、１１８．０、１１４．６、１１４．６（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ａｒ）；１０２．６（Ｃ−１）；７８．４（Ｃ−３）；７５．９（Ｃ−４）；７３．７（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；７３．０（Ｃ−２）；６８．９（Ｃ−５）；６２．８（Ｃ−６）；５５．７（ＯＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１６Ｈ_２３Ｏ_７［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算値：３２７．１４４５、実測値：３２７．１４２２。

４−メトキシフェニル２−Ｏ−アリル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物４）：

ＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍＬ）およびピリジン（６５μＬ、８．３ｍｍｏｌ）中の生成物３（２７ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢｚＣｌ（１００μＬ、８．３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を加え、反応混合物を減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１：３ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）により精製して、生成物４（５１ｍｇ、９７％）を得た。［α］_Ｄ ^２５＝＋４８．６°（ｃ＝０．１、ＣＨＣｌ_３）；^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ８．０７〜７．２９（ｍ、１５Ｈ、Ａｒ）；７．０６〜６．７１（ｍ、４Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；５．８９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．７Ｈｚ、Ｈ−４）；５．７４（ｍ、１Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；５．４２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝３．５、Ｊ２＝１０．０Ｈｚ、Ｈ−３）；５．２１〜５．０１（ｍ、３Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｈ−１）；４．５７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ａ）；４．３９〜４．０６（ｍ、５Ｈ、ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２、Ｈ−６ｂ、Ｈ−５、Ｈ−２）；３．７３（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ_３）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１７１．２、１６６．０、１６５．７、１５５．６、１５１．２、１３４．３、１３３．８、１３３．５、１３３．２、１３３．１、１３２．９、１３０．６、１３０．２、１２９．８、１２９．７、１２９．６、１２９．４、１２８．８、１２８．５、１２８．４、１１８．８、１１４．６（Ａｒ）；１１７．７（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；１０２．８（Ｃ−１）；７８．７（Ｃ−２）；７４．０（Ｃ−３）；７３．６（ＣＨ_２−ＣＨ＝ＣＨ_２）；７２．２（Ｃ−５）；６９．９（Ｃ−４）；６３．５（Ｃ−６）；５５．６（ＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３７Ｈ_３４ＮａＯ_１０［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：６６１．２０５０、実測値：６６１．２０４１。

４−メトキシフェニル３，４，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物５）：

ＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した生成物４（４５ｍｇ、７０μｍｏｌ）の溶液に、ＰｄＣｌ_２（２ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で２時間撹拌した。その後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（１：３ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）により精製して、生成物５（３９ｍｇ、９２％）を得た。［α］_Ｄ ^２５＝＋７８．２°（ｃ＝０．１、ＣＨＣｌ_３）。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ８．０８〜７．２８（ｍ、１５Ｈ、Ａｒ）；７．０７〜６．７２（ｍ、４Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；５．９１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、Ｈ−４）；５．４５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ１＝３．５、Ｊ２＝１０．１Ｈｚ、Ｈ−３）；５．００（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、Ｈ−１）；４．６０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ａ）；４．４４（ｍ、１Ｈ、Ｈ−６ｂ）；４．３４（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５、Ｈ−２）；３．７３（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ_３）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１６６．０、１６５．５、１５５．７、１５０．９、１３３．７、１３３．４、１３０．０、１２９．９、１２９．８、１２９．４、１２９．２、１２９．１、１２８．５、１２８．４、１１８．６、１１４．５（Ａｒ）；１０２．６（Ｃ−１）；７３．２（Ｃ−３）；７１．６（Ｃ−５）；６９．７（Ｃ−２）；６８．１（Ｃ−４）；６２．３（Ｃ−６）；５５．６（ＯＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３４Ｈ_３０ＮａＯ_１０［Ｍ＋Ｎａ］^＋に対する計算値：６２１．１７３７、実測値：６２１．１７２３。

４−メトキシフェニル３，４，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−Ｏ−メチル−ホスホラミジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物６）：

分子篩４Åを用いてＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍＬ）に溶解した生成物５（１８ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）およびジクロロリン酸メチル（７０μＬ、０．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（８５μＬ、０．３０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を４０℃で１２時間撹拌した。ＴＬＣで判断して反応が完了したら、アンモニアガスを針を通して反応混合物に注入した。５分後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）で精製して、生成物６（５．４ｍｇ、２６％）を得た。［α］_Ｄ ^２５＝＋６８．５°（ｃ＝０．０５、ＣＨＣｌ_３）；^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＨＣｌ_３）：δ８．０６〜７．３１（ｍ、３０Ｈ、Ａｒ）；７．０７〜６．７２（ｍ、８Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；５．９４（ｍ、２Ｈ、Ｈ−４、Ｈ−４^＊）；５．５４（ｍ、２Ｈ、Ｈ−３、Ｈ−３^＊）；５．１０（ｍ、４Ｈ、Ｈ−１、Ｈ−１^＊、Ｈ−２、Ｈ−２^＊）；４．５８（ｍ、２Ｈ、Ｈ−６ａ、Ｈ−６ａ^＊）；４．４５（ｍ、２Ｈ、Ｈ−６ｂ、Ｈ−６ｂ^＊）；４．３５（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５、Ｈ−５^＊）；３．７３（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ_３）；３．６７（ｄ、３Ｈ、３ＪＰＨ＝１１．６、ＰＯＣＨ_３）；３．４１（ｄ、３Ｈ、^３Ｊ_ＰＨ＝１１．５、ＰＯＣＨ_３ ^＊）；２．９２（ｄ、２Ｈ、ＮＨ_２）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１６６．０、１６５．７、１６５．６、１６５．５、１５５．８、１５５．７、１５０．８、１５０．６、１３３．８、１３３．６、１３３．５、１３３．４、１３０．１、１３０．０、１２９．９、１２９．８、１２９．４、１２８．９、１２８．８、１２８．７、１２８．６、１２８．５、１２８．４、１１８．６、１１４．７、１１４．６（Ａｒ）；１０１．２、１０１．１（Ｃ−１）；７３．９、７３．６（Ｃ−２）；７２．５、７２．４（Ｃ−３）；７１．７、７１．５（Ｃ−５）；６８．０（Ｃ−４）；６２．１（Ｃ−６）；５５．６（ＯＣＨ_３）；５３．６、５３．３（ＰＯＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３５Ｈ_３５ＮＯ_１２Ｐ［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算値：６９２．１８９８、実測値：６９２．１８１５。

４−メトキシフェニル２−Ｏ−メチル−ホスホラミジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物７）：

生成物７（２．５ｍｇ、ｍｍｏｌ）を０．２５ＭメタノールＭｅＯＮａ（１ｍＬ）に溶解し、混合物を室温で１時間撹拌した後、酢酸で中和し、濃縮した。１：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、生成物７（１．０ｍｇ、７３％）を得た。

７：δ ^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ６．９７〜６．８３（ｍ、８Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；５．０５（２ｄ、２Ｈ、Ｈ−１、Ｈ−１^＊）；４．２８（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２、Ｈ−２）；３．９１（ｍ、２Ｈ、Ｈ−４、Ｈ−４^＊）；３．７７〜３．７２（ｍ、４Ｈ、Ｈ−３、Ｈ−３^＊、Ｈ−５、Ｈ−５^＊）；３．６７〜３．６０（ｍ、１０Ｈ、Ｈ−６、Ｈ−６^＊、ＯＣＨ^３）；３．５９（ｄ、３Ｈ、^３Ｊ_ＰＨ＝１１．５Ｈｚ、ＰＯＣＨ_３）；３．５６（ｄ、３Ｈ、^３Ｊ_ＰＨ＝１１．５Ｈｚ、ＰＯＣＨ_３ ^＊）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１５４．５、１５０．７、１１７．７、１１４．９（Ａｒ）；９９．７（Ｃ−１）；７７．０（Ｃ−２）；７５．３（Ｃ−５）；７１．６（Ｃ−３）；６８．６（Ｃ−４）；６０．５（Ｃ−６）；５５．６（ＯＣＨ_３）；５３．９（ＰＯＣＨ_３）。

７^＊：［α］_Ｄ ^２５＝−１１．０°（ｃ＝０．０１、Ｈ_２Ｏ）；^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）：δ６．９７〜６．８３（ｍ、４Ｈ、ＭｅＯＣ_６Ｈ_４）；５．０５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、Ｈ−１）；４．２８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−２）；３．９１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、Ｈ−４）；３．７７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ_１＝３．５Ｈｚ、Ｊ_２＝９．８Ｈｚ、Ｈ−３）；３．７２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５）；３．６７〜３．６０（ｍ、５Ｈ、Ｈ−６、Ｈ−６^＊、ＯＣＨ_３）；３．５６（ｄ、３Ｈ、^３Ｊ_ＰＨ＝１１．５Ｈｚ、ＰＯＣＨ_３）。^１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：δ１５４．５、１５０．７、１１７．７、１１４．９（Ａｒ）；９９．７（Ｃ−１）；７７．０（Ｃ−２）；７５．３（Ｃ−５）；７１．６（Ｃ−３）；６８．６（Ｃ−４）；６０．５（Ｃ−６）；５５．６（ＯＣＨ_３）；５３．９（ＰＯＣＨ_３）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１４Ｈ_２３ＮＯ_９Ｐ［Ｍ＋Ｈ］^＋に対する計算値：３８０．１１１１、実測値：３８０．１０８５。

カンピロバクター・ジェジュニＣＰＳコンジュゲート抗血清によるＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰおよびＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２の免疫検出

上記実施例に記載の通りに合成した、ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌコンストラクトの合成ｐ−メトキシフェニルおよびアミノペンチルグリコシド、つまり、化合物ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌ−（１→ＯＭＰおよびＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２を、血清型ＨＳ１、ＨＳ３、ＨＳ４、およびＨＳ２３／３６のカンピロバクター・ジェジュニＣＰＳコンジュゲートに対してあらかじめ生じさせた抗血清との反応性について試験した。特に、上記記載された血清型のうち、ＨＳ２３／３６のみがＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを発現する。

材料および方法

合成コンストラクトＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを１ｍｇ／ｍｌに調整し、２μｌをニトロセルロース膜の上にスポットし、乾燥させた。個々のスポットを、異なるカンピロバクター・ジェジュニ多糖類莢膜をＣＲＭ_１９７にコンジュゲートした従来の異なるコンジュゲートワクチンに対して作製された次の４つの異なるポリクローナル抗血清を用いて免疫検出した。（１）ＨＳ２３／３６コンジュゲートに対するウサギ血清（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．４２５ＮＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）における最終希釈１：１０００、Monteiro et al., (2009) Infect. Immun. 77, 1128-1136、US Patnet No. 9,084,809）、（２）ＨＳ４コンジュゲートに対するウサギ血清（最終希釈１：１０００、Monteiro et al., (2009) Infect. Immun. 77, 1128-1136、US Patnet No. 9,084,809）、（３）ＨＳ１コンジュゲートに対するマウス血清（最終希釈１：５００、準備中の原稿）、（４）ＨＳ３コンジュゲートに対するマウス血清（最終希釈１：５００、US 2015/0273037）。使用した二次抗体は、ヤギ抗ウサギ（ＨＳ２３／３６およびＨＳ４に対して）またはヤギ抗マウス（ＨＳ１およびＨＳ３（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）のいずれかであった。イムノブロットは、化学発光キット（ＰｉｅｒｃｅＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＭａｘｉｍｕｎＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＳｕｂｓｔｒａｔｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて展開し、バイオ・ラッドゲル撮影装置（バイオ・ラッドラボラトリーズ、ハーキュリーズ、カルフォルニア州）上で画像化した。同様の方法を用いて、リンカーを有するコンジュゲートを分析した。

図６に示すように、単糖類コンストラクトＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌは、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＨＳ２３／３６（ＧａｌのＣ−６でＭｅＯＰＮを有するＣＰＳ）から単離された莢膜多糖類に対する抗体によって認識された。また、予想外に、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＨＳ４（イド−ヘプトースのＣ−７でＭｅＯＰＮを有するＣＰＳ）からの多糖類に対する抗体も、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに対する抗ＨＳ２３／３６ＣＲＭ_１９７コンジュゲートに相当する応答を誘発した。また、抗ＨＳ１−ＣＲＭ_１９７（Ｃ−６Ｇａｌで少量のＭｅＯＰＮを有するＣＰＳ）も、幾分より少ない程度ではあるが、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに反応した。ＨＳ３ＣＰＳコンジュゲート抗血清（イド−ヘプトースのＣ−２でＭｅＯＰＮを有するＣＰＳ）は、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌと反応しなかった。α−Ｄ−Ｇａｌ−（１−ＯＭＰ（ＭｅＯＰＮがない）とＨＳ２３／３６ＣＰＳコンジュゲート抗血清との間で反応は観察されなかった（データは示さず）。したがって、データは、ＨＳ２３／３６、ＨＳ４、およびＨＳ１に対して産生された抗体はすべてＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ抗原と反応することを示している。対照的に、これらの抗体は、異種の莢膜と反応しない。換言すれば、抗ＨＳ２３／３６抗体の、精製されたＨＳ４またはＨＳ１莢膜との検出可能な反応性は存在しない。

ＨＳ２３／３６およびＨＳ４抗体に対して示されるＭｅＯＰＯＮ−６−Ｇａｌとの強い交差反応性は、ＭｅＯＰＮ−６−ＧａｌがＨＳ２３／３６およびＨＳ４莢膜多糖類とエピトープ構造を共有するという事実によって説明されうる。１つの説明は、ＨＳ２３／３６およびＨＳ４の両方におけるＭｅＯＰＮ基が第１級ヒドロキシル基に対するものであることでありうる。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ（ＨＳ２３／３６）とＨＳ４（ＭｅＯＰＮ−７−６ｄ−β−Ｄ−イド−ヘプトースを含む）との交差反応は、予想外であったが、両方の糖上の第一ヒドロキシ位置へのＭｅＯＰＮの結合に起因しうる。実際に、図６に示すように、ＨＳ２３／３６、ＨＳ４、およびＨＳ１に対して産生された抗体はすべて合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ抗原と反応する。対照的に、これらの抗体は、異種の莢膜と反応しない。換言すれば、抗ＨＳ２３／３６抗体の、精製されたＨＳ４またはＨＳ１莢膜との検出可能な反応性は存在しない。

図７は、指示されたコンジュゲート抗血清を用いて、カラムＡにおけるコンストラクトＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰ（図６Ｂと同じデータ）の認識と、コンストラクトＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２）を用いたカラムＢのデータとを比較する。図７に示すように、両方のコンストラクトは、ＨＳ２３／３６ＣＰＳコンジュゲート抗血清（このＣＰＳは、不定比量のＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌ結合を含む）、ＨＳ４ＣＰＳコンジュゲート抗血清（このＣＰＳは、不定比のＭｅＯＰＮ→７−６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ結合を有する）、および、強度は比較的弱いものの、ＨＳ１ＣＰＳコンジュゲート抗血清（非常に少量のＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌを含む）によって、強く認識された。上述のように、ＨＳ２３／３６、ＨＳ４、およびＨＳ１ＣＰＳコンジュゲート抗血清による合成ＭｅＯＰＮ→６−Ｄ−Ｇａｌの検出は、これらのポリクローナル調製物が、第一位でＭｅＯＰＮ単位に対する特異的な抗体を含有するという事実を示している。ＨＳ３ＣＰＳコンジュゲート抗血清（ＣＰＳの６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２にＭｅＯＰＮを有する）は、いずれの合成コンストラクトＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰまたはＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２）（データは示さず）とも反応しなかった。ＧａｌＯＭＰおよびアミノペンチルグリコシド（ＭｅＯＰＮを欠く）とＨＳ２３／３６ＣＰＳコンジュゲートまたは全細胞抗血清との間の反応は観察されなかった（データは示さず）。

図７に示すように、検出限界内では、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰとＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２との間に抗血清反応性の差は観察されなかった。これは、Ｇａｌの環外Ｃ−６位でのＭｅＯＰＮの認識が、アノマー配置に依存していなかったことを示唆する。ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌがコンジュゲート形態でアクセス可能であることは、ＨＳ２３／３６全細胞血清とＭｅＯＰＮ→６−ＧａｌＣＲＭ_１９７コンジュゲートとの反応によって確認された。これらのデータは、合成ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌエンティティ（アノマー配置にかかわらず）が、同種カンピロバクター・ジェジュニＨＳ２３／３６ＣＰＳコンジュゲートによって産生された抗血清と反応するだけでなく、第一位にＭｅＯＰＮも有する（例えば、図１参照）血清型ＨＳ１およびＨＳ４によって産生された抗血清とも反応することを示す。

ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌは免疫優勢エピトープである

本明細書に報告されたＧａｌ−Ｏ−６での第二のＭｅＯＰＮ結合の発見まで、ＭｅＯＰＮは、単にガラクトースのＯ−２位についてのみ報告されていた（Kanipes et al., (2006) J Bacteriol. 188, 3273-3279）。ＣＰＳコンジュゲートワクチンを利用する以下の実験は、Ｇａｌ−Ｏ−６でのＭｅＯＰＮ結合が、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌよりも免疫優性であることを示している。

材料および方法

合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ（上記のように調製された）およびＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌの２つの異性体（「Ａ」および「Ｂ」）（本明細書に記載のように調製された）の１ｍｇ／ｍｌ溶液２μｌを、従来の方法を用いてニトロセルロースフィルターの上にスポットし、乾燥させた。フィルターを、ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＭａｘｉｍｕｍＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＳｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）を備えた遮断剤でブロックした。フィルターを、カンピロバクター・ジェジュニ株８１−１７６のホルマリン死滅全細胞に対して作製した一次ウサギポリクローナル抗体（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．４２５ＮＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）（Bacon et al., (2001) Mol. Microbiol. 40, 769-777）、または、ＨＳ２３／３６多糖類−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンに対するウサギ抗体（最終希釈１：１０００）（Monteiro et al., (2009) Infect. Immun. 77, 1128-1136）と混合した。フィルタは、一次抗体と一晩反応させた後、洗浄した。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（最終希釈１：５０，０００）（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）であった。洗浄後、フィルターをＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＭａｘｉｍｕｍＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＳｕｂｓｔｒａｔｅで検出し、画像をバイオ・ラッドゲル画像システム（バイオ・ラッドラボラトリーズ、ハーキュリーズ、カルフォルニア州）で記録した。

図８に示すように、結果は、ＨＳ２３／３６多糖類−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンに対するウサギ抗体は、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを検出したものの、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌのいずれの異性体も検出しなかったことを明らかに示している。同様の結果が、ウサギポリクローナル抗体を用いて得られたが、ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌＢ異性体に対していくらかの反応性が検出された。これらのデータは、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類の免疫原性、および、Ｇａｌの２位でのメチルホスホルアミデートに対するＧａｌの６位でのＭｅＯＰＮの免疫優性を明確に示している。また、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌに対するＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの免疫優性は、カンピロバクター・ジェジュニのさまざまな突然変異株を用いた研究を含むさらなる実験においても実証されており、結果は、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌのレベルが免疫応答を調節しうることを示唆している（下記の実施例８参照）。これらのデータは、本明細書で企図されるＭｅＯＰＮ−糖エピトープの化学合成に加えて、カンピロバクター・ジェジュニに対するＣＰＳベースのワクチンが、ＭｅＯＰＮ修飾糖の免疫優位性を利用することによって、例えば、莢膜の精製およびワクチンの製造のために免疫優勢のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌエピトープを過剰発現させる株を使用することによって、改善されうることを示唆している。

ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２のタンパク質ＣＲＭ_１９７へのコンジュゲーション

コンジュゲートを形成するための、タンパク質担体に結合した合成コンストラクトの合成を図９に示す（スキーム４）。リンカー付きガラクトシド（図３の化合物１２または図４の化合物９）（４．５ｍｇ）および過剰のアジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル（１０当量）をＤＭＳＯ（１ｍｌ）に溶解した。トリエチルアミン（６０μｌ）を滴下して加え、反応混合物を室温で４時間撹拌した。減圧下で濃縮した後、残渣をＨ_２Ｏで抽出し、その後、カラムクロマトグラフィー（３：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して活性化単糖類である化合物１３を得た。その後、この得られた半エステル（化合物１３）をリン酸緩衝液（ＮａＰｉ緩衝液、ｐＨ７）中のタンパク質ＣＲＭ_１９７のアミノ基と縮合させて、化合物１４を得た。具体的には、７０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０においてＣＲＭ_１９７を有する活性化単糖類を１００：１のモル比（タンパク質１モル当たりの活性エステルのモル数）でコンジュゲーションを実施した。室温で３日間撹拌した後、コンジュゲート（化合物１４）を流水に対して透析した。

コンジュゲーションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびｍＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて分析し、確認した。具体的には、従来の方法に従って、ゲル電気泳動（図１０Ａ）、ウェスタンブロット（図１０Ｂ）、および質量分析（ｍＡＬＤＩ−ＴＯＦ）（図１０Ｃ）によって、ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２のＣＲＭ_１９７へのコンジュゲーションを分析し、確認した。

材料および方法

ＣＲＭ_１９７に連結したＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトを、従来の方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングによって分析し、特性決定した。ＣＲＭ_１９７（重量で２．５μｇおよび５μｇ）に結合した合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの試料を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、ＧｅｌＣｏｄｅＢｌｕｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）で染色するかまたはニトロセルロースに移して、カンピロバクター・ジェジュニ８１−１７６（ＨＳ２３／３６）の全細胞に対してウサギポリクローナル抗体で免疫検出した（Baconet al., (2001) Mol. Microbiol. 40, 769-777）。染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ワクチンコンジュゲートは大きさが不均一であり、非コンジュゲート型ＣＲＭ_１９７よりも少し大きいものから＞２５０Ｋｄまでの範囲にあることを示した（図１０Ａ）。イムノブロットの結果は、ワクチンコンジュゲートが、カンピロバクター・ジェジュニ株８１−１７６の全細胞に対するウサギポリクローナル抗体と反応して、莢膜とコンジュゲートとの交差反応を示したことを示している（データは示さず）。最終生成物（当該コンジュゲート）がＭｅＯＰＮのジアステレオ異性体を含んでいたという事実のために、ＭｅＯＰＮ→６−Ｄ−Ｇａｌｐエピトープの単に半分のみが天然のＣＰＳのものを反映した。たとえそうであっても、ＨＳ２３／３６全細胞抗血清を用いたウェスタンブロット分析は、当該コンジュゲートが、ＭｅＯＰＮの立体構造および細胞表面上の結合を模倣するＭｅＯＰＮ→６−Ｄ−Ｇａｌエピトープを露出していることを示した（図１０Ｂ）。

また、当該コンジュゲートを、従来の方法を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析して、当該コンジュゲートの質量をより正確に決定した。簡単に説明すると、シナピン酸（シグマアルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）を、マトリックスとして水中の３０：７０（ｖ／ｖ）アセトニトリル（ＡＣＮ）：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）において飽和させた。マトリクスと試料（１ｍｇ／ｍＬ）を等体積で予混合し、分析用に１μＬを接地鋼板に被着させた。ＭｉｃｒｏｆｌｅｘＬＲＴマトリックス支援レーザー脱離法およびイオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計（ブルガー・ダルトニクス社、ビルリカ、マサチューセッツ州）を、陽イオン検出による線形モードに設定し、質量スペクトルを得た。結果は、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチンが、質量６１，７８１の主要なピークを与えたことを示している。類似のＭＡＬＤＩ実験におけるＣＲＭ１９７の質量は５７，９６７ダルトンであった（図示せず）。したがって、質量差は３，８１４ダルトンである。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌおよびリンカーの質量は４６１ダルトンであるため（データは示さず）、これは、１ＣＲＭ_１９７分子当たり約８個のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ−リンカー部分が添加されたことを示す。より大きな形態は検出されなかったが、これは、分子が大きくなるほどブルガー・ダルトニクス社製の機器を用いた検出が困難になるという事実に起因しうる。

ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−ＧａｌＣＲＭ_１９７コンジュゲート抗体はカンピロバクター・ジェジュニＨＳ２３／３６細胞表面を認識し、殺菌作用を有する

本発明者らは、以前、カンピロバクター・ジェジュニに対する免疫原性莢膜多糖類コンジュゲートワクチン（「従来の」ワクチン）が血清殺菌抗体（ＳＢＡ）を誘発することを実証した（原稿は準備中）。換言すれば、従来のワクチンに対して産生された抗体は、補体の存在下で細菌と結合し、細菌溶解を誘発しうる。上記の実施例で論じたように、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌは、合成されて、ＨＳ２３／３６およびＨＳ４の両方に基づく従来のＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチンに対する抗体と反応することが示されている。１タンパク質当たり約８個のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ部分を有するＣＲＭ_１９７に結合されたＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌから成るワクチンコンジュゲートを、上記のように合成し、ウサギの免疫原性に対して試験した。

材料および方法

従来の方法および市販の試薬を用いて、ウサギを、フロイントアジュバントを含むＣＲＭ_１９７ワクチンコンジュゲート（それぞれ２５０μｇ）に結合した４回用量のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌで免疫化した。最終血清を、ＢＳＡにコンジュゲートしたカンピロバクター・ジェジュニ８１−１７６莢膜が検出抗原であるＥＬＩＳＡで使用した。血清の終点力価は、１：２００であった。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに対して産生したウサギ血清を、３０分間５６℃に加熱することにより熱失活させて、内因性補体を不活性化した。対照（control）として、同じウサギの前出血（免疫化前）も熱失活させた。血清をマイクロタイタープレートで連続希釈し、カンピロバクター・ジェジュニ８１−１７６および仔ウサギ補体と混合した。そのプレートは、３７℃で微好気的条件下でインキュベートした。各ウェルからのアリコートをミューラー・ヒントン寒天培地プレート上にプレーティングして、生き残った細菌細胞を数え上げた。結果は、免疫したウサギの前出血と最終出血との間の死滅の倍数増加として報告される。

ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチンで免疫したウサギの結果は、血清殺菌活性の１６倍の増加を示した。フローサイトメトリーからの結果を図１１に示す。データは、コンジュゲートワクチン（例えば、図９の化合物１４）が、ジェジュニ（カンピロバクター・ジェジュニ）ＨＳ２３／３６細胞の細胞表面に露出したＣＰＳＭｅＯＰＮ→６−Ｄ−Ｇａｌ結合に特異的なウサギにおいて抗体を誘発することができることを示す。カンピロバクター・ジェジュニＨＳ２３／３６細胞への結合強度は、天然のＣＰＳコンジュゲートによって産生された抗体を用いる場合よりも高かった。カンピロバクター・ジェジュニＨＳ２３／３６細胞への結合強度は、合成ワクチンに惹起された抗体では少なかったが、細胞の一部は、ＭｅＯＰＮ→６−Ｄ−Ｇａｌ抗体と全く反応しなかった。しかし、これらの抗体の、ＨＳ２３／３６細胞の表面への結合は、上記のＳＢＡ力価の観察された上昇と一致する。

カンピロバクター・ジェジュニ合成抗原を含むポリマーコンストラクトの合成

１つ以上の合成ＭｅＯＰＮ−単糖類を含み、任意選択的に１つ以上の他の糖類と会合した免疫原性合成コンストラクトが、本明細書において企図される。合成されたそのようなポリマーコンストラクトの例が、本明細書において図１５および図１８に示されている。

材料および方法

図１５のマルチＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌポリマーコンジュゲートは、従来の方法、市販の試薬、および本明細書および前述の実施例に開示された単糖類を用いて合成した。リントナーデンプン（１００ｍｇ）を、０．１ＭＮａＯＡｃ緩衝液（１００ｍｌ）ｐＨ４中の０．０４ＭＮａＩＯ_４により、４℃で３日間活性化した。水（１０００ダルトン分子カットオフ）に対して２日間透析した後、生成混合物を遠心分離した。上清を凍結乾燥し、バイオゲルＰ−２カラムでさらに精製した。

活性化されたデンプン（８ｍｇ）を、０．１Ｍホウ酸塩緩衝液（５ｍｌ）、ｐＨ９中で、ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２（４ｍｇ）に化学的にコンジュゲートした。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４０ｍｇ）を添加し、反応混合物を室温で１日間、３７℃で２日間攪拌した。その後、コンジュゲートを流水（１０００Ｄａ）に対して２日間透析した後、凍結乾燥した。

デンプン−糖コンジュゲート生成物（４ｍｇ）を、０．１Ｍホウ酸塩緩衝液（５ｍｌ）、ｐＨ９中のＣＲＭ_１９７（４ｍｇ）とコンジュゲートした。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４０ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で１日、３７℃で２日間撹拌した。その後、コンジュゲートを流水（１０００Ｄａ）に対して２日間透析した後、凍結乾燥した。得られた合成コンジュゲートを、図１６および１７にそれぞれ示すように、ウエスタンゲルおよびイムノブロッティングおよび１ＨＮＭＲを用いて特性決定した。簡単に説明すると、イムノブロットでは、合成コンジュゲートを１２．５％ポリアクリルアミドゲルで２回電気泳動させた。トランスブロットＴｕｒｂｏシステム（バイオ・ラッド社、ハーキュリーズ、カルフォルニア州）を用いてゲルの一部を染色し他の部分をニトロセルロースに移し、カンピロバクター・ジェジュニ株８１−１７６のホルマリン死滅全細胞にウサギ過免疫血清で免疫検出した（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．４２５ＮＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０であるＴＢＳＴ中の最終希釈１：５００）。このフィルターを一次抗体と一晩反応させた後、洗浄した。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧであった（ＴＢＳＴ中の最終希釈１：５０，０００）。洗浄後、フィルターをＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＭａｘｉｍｕｍＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＳｕｂｓｔｒａｔｅで検出し、画像をバイオ・ラッドゲル画像システムで記録した。

図１８に示す合成ポリマーコンジュゲートを、従来の方法および試薬を用いて同様に調製し、タンパク質担体にコンジュゲートした。図１５に示すコンジュゲートとは対照的に、図１８に示す合成コンストラクトは、複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類だけでなく、複数のＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−１−Ｆｒｕ単糖類をも含む。上記のように、さまざまな単糖類は、デンプン骨格を使用して化学的に会合（コンジュゲート）される。糖（sugar）は、糖（sugar）とデンプンとの間の橋渡しをすることができるリンカーを化学的に備えている。キャリアタンパク質は、コンストラクトに付加される。

カンピロバクター・ジェジュニにおけるメチルホスホルアミデートトランスフェラーゼをコードする遺伝子の相変化は、莢膜構造およびカンピロバクター・ジェジュニの補体媒介性殺滅に対する耐性を調節する

ＭｅＯＰＮの生合成のための遺伝子は、カンピロバクター・ジェジュニ株の間で高度に保存されている。一方で、ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、当該遺伝子の５’末端で高度に保存されているが、３’末端では分岐している。また、保存された５’末端は、複製中にスリップ鎖ミスマッチ修復によって相変化（ＰＶ）を受けるホモポリマー性Ｇトラクトの存在によって特徴付けられる［１２］。したがって、集団は、カンピロバクター・ジェジュニの複数の表面抗原をコードする遺伝子に特徴的な形質である「オン」または「オフ」配置のいずれかの遺伝子を有する細胞の混合物から成りうる［１２〜１７］。ＰＶの頻度が高いのは、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）酵素の欠如によるものである［１２、１８］。

上述のように、カンピロバクター・ジェジュニＣＰＳは、発病に重要であることが示されている。無莢膜突然変異体は、下痢症のフェレットモデルでは弱毒化され、ニワトリ、マウス、および子豚に定着する能力が低下したが［１９〜２２］、疾患ハチノスツヅリガモデルの発病におけるＭｅＯＰＮの役割に関して相反する報告がある［２２、２３］。

莢膜は、補体媒介性殺滅に対する耐性の主要因子であり、カンピロバクター・ジェジュニ８１−１７６（ＨＳ２３／３６）の場合、ＭｅＯＰＮは、補体耐性にとって必須である。したがって、ＭｅＯＰＮを欠く多糖類ＣＰＳを発現する突然変異体は、ＣＰＳを欠く突然変異体と同じくらい補体媒介性殺滅に対して感受性があった［２１、２２］。また、２つの血清型ＨＳ２およびＨＳ２３／３６の多糖類ＣＰＳもインビトロで免疫調節効果を有することが示されており［２１、２４］、８１−１７６の免疫調節効果はマウスモデルにおいてインビボで確認されている［２５］。また、ＭｅＯＰＮは、ファージ受容体としても機能することが示されている［２６、２７］。

８１−１７６ＣＰＳは、ガラクトース、３−Ｏ−メチル−６−デオキシ−アルトロ−ヘプトース、およびＮ−アセチルグルコサミンの反復三糖類である（図１９Ａ参照）。株８１−１７６は、２つの推定ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼ、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０およびＣＪＪ８１１７６＿１４３５（図１９Ｂ）をコードすると予想される遺伝子を含む［２２］。ＭｅＯＰＮは、ガラクトース（ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ）の２位の両方で報告されており、本明細書に提供されたデータは、ＭｅＯＰＮ部分がガラクトースの６位にも存在し、かつ、抗コンジュゲート抗体が合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを認識したことを示している。ここで、本発明者らは、ＭｅＯＰＮ−６−ＧａｌおよびそれほどではないにせよＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌが、コンジュゲートワクチンによって認識される無傷のＣＰＳ上の免疫優性エピトープであることのみならず、ＭｅＯＰＮエピトープの相変化が、ＣＰＳ構造および補体媒介性殺滅に対する耐性のレベルを調節しうることを確認する。

方法と材料

株および増殖条件：すべての作業は、カンピロバクター・ジェジュニの８１−１７６株で行った。この株の突然変異体を表１に示す。

カンピロバクター・ジェジュニは、ミューラー・ヒントン寒天培地上、３７℃、微好気的条件下で日常的に培養した。培地には必要に応じて抗生物質を補充した。莢膜抽出のために、細胞をブタブレインハートインフュージョン培地またはプレート（ディフコ社）中で増殖させた。

オリゴヌクレオチドプライマー：使用したすべてのオリゴヌクレオチドプライマーを表２に列記する。これらは、ライフテクノロジーズ社によって合成された。

コンジュゲートワクチン合成：莢膜多糖の単離およびＣＲＭ１９７（Ｐｆｅｎｅｘ社）へのコンジュゲーションは、Monteiro et al.［３０］に記載の通りに行った。３種のワクチンは、ＣＣＶ［３０］、ＤＢ４、およびＣＪＣＶ１と呼ばれた。

ウサギポリクローナル抗血清：３つのバッチのＨＳ２３／３６−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチン、つまり、ＣＣＶ１［３０］、ＤＢ４、およびＣＪＣＶ１（ＨａｒｌａｎＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓｆｏｒＳｃｉｅｎｃｅ社）に対して、ウサギの高度免疫ポリクローナル抗体を作製した。８１−１７６のホルマリン固定全細胞に対するウサギポリクローナル血清が、これまでに報告されている［３４］。

ＰＣＲ：クローニングまたは配列分析のために産生されたすべてのＰＣＲ生成物を、Ｐｈｕｓｉｏｎハイフィデリティーポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）を用いて増幅した。他のすべてのＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ／ライフテクノロジーズ社）を使用した。

ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異：ＣＪＪ８１１７６＿１４２０を、ＥｃｏＲおよびＸｈｏＩ部位をそれぞれ導入したプライマーｐｇ１２．１３およびｐｇ１２．１４を用いてｐＣＲＳｃｒｉｐｔにクローニングした。このプラスミドを、ＴｎｐＫｍ（カナマイシン耐性またはａｐｈ３；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いてトランスポゾン突然変異誘発に付し、個々のＫｍ^ｒトランスポゾン挿入をトランスポゾン内部のプライマーで配列して挿入部位を決定した。１７７９ｂｐ遺伝子のｂｐ３６７での非極性トランスポゾン挿入を用いて、上述した方法によりＫｍ^ｒに８１−１７６を電気穿孔した。推定突然変異は、カナマイシン遺伝子の挿入点を囲むプライマーｐｇ１２．２５およびｐｇ１２．２６を用いたＰＣＲによって確認された。この突然変異体は、株３４７７と呼ばれた。

ＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異：ＣＪＪ８１１７６＿１４３５を、プライマーｐｇ１０．０７およびｐｇ１０．０８を用いてｐＣＲＳｃｒｉｐｔにクローニングした。ｐＲＹ１０９［３５］由来のクロラムフェニコール耐性（ｃａｔ）カセットを、１８１３ｂｐ遺伝子のｂｐ７４７に位置する特異的なＮｃｏＩ部位にクローニングした。クローンを部分的に配列してｃａｔカセットの配向を決定し、遺伝子がＣＪＪ８１１７６＿１４３５と同じ配向で挿入されたものを用いてＣｍ^ｒに８１−１７６を電気穿孔した。挿入のＮｃｏＩ部位を囲むｐｇ１４．６７およびｐｇ１４．６８を用いたＰＣＲによって推定クローンを確認し、得られた突然変異体を株３６３６と呼んだ。

両方の推定上のＭｅＯＰＮトランスフェラーゼにおける二重突然変異体の構築：菌株３４７７、つまり、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０：：ａｐｈ３を、菌株３６３６を産生するのに使用したのと同じプラスミドを用いてＣｍｒに電気穿孔し、もって二重突然変異株３４７９を産生した（表１参照）。

ｈｉｐＯ（馬尿酸塩）挿入ベクターの構築：８１−１７６のｈｉｐＯ遺伝子（ＣＪＪ８１１７６＿１００３）を、プライマーセットｐｇ１２．３１およびｐｇ１２．３２を用いてｐＣＲＳｃｒｉｐｔにクローニングした。特異的なＸｂａＩ部位を、プライマーセットｐｇ１２．３３およびｐｇ１２．３４を有する逆ＰＣＲによってｈｉｐＯ遺伝子の中心に導入した。このプラスミドは、ｐＣＰＥ３４９０と呼ばれた。

ＣＪＪ８１１７６＿１４２０およびＣＪＪ８１１８７＿１４３５の修復対立遺伝子を発現する株の構築：ＣＪＪ１４２０：：ａｐｈ３突然変異体を、以下のように、修復された対立遺伝子で補完した。野生型ＣＪＪ８１１７６＿１４２０遺伝子を、ＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲ１部位をそれぞれ導入したプライマーｐｇ１２．２９およびｐｇ１２．３０を用いてＰＣＲ増幅し、得られたアンプリコンを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＣＰＥ１０８にクローニングした。プラスミドｐＣＰＥ１０８は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位の間にクローニングされたｆｌａＡ由来のσ２８プロモーターを含む［３６］。ＣＪＪ８１１７６＿１４２０内の相可変Ｇ９区域を、Ｇ９がプライマーｐｇ１２．３７およびｐｇ１２．３８を用いてＧＧＡＧＧＡＧＧＡに変更されるようにＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（ライフテクノロジーズ社）突然変異誘発によって修復した。挿入物全体をＥｃｏＲ１−ＮｏｔＩ断片としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに移し、ｐＲＹ１０９［３５］由来のＳｍａＩ末端ｃａｔカセットを、修復したＣＪＪ８１１７６＿１４２０遺伝子のＥｃｏＲＶ部位３’に挿入した。全体構造（σ２８−ＣＪＪ８１１７６＿１４２０＋ｃａｔ）を順方向および逆方向プライマーでＰＣＲ増幅し、平滑末端化した（上記の）ｐＣＰＥ３４９０のｈｉｐＯ遺伝子内の特異的なＸｂａＩ部位にクローニングした。この構造を使用して、３４７７（ＣＪＪ８１−１７６＿１４２０：：ｃａｔ突然変異体）をＫｍ^ｒに電気穿孔し、株３４９８株を産生した。

ＣＪＪ１４３５：：ｃａｔ突然変異体を同様の方法で補完した。プラスミドｐＣＰＥ１０８を、ポリリンカーのＸｈｏＩ部位にａｐｈ３遺伝子を含むように修飾して、ｐＣＰＥ３５８３を産生した。ＣＪＪ８１１７６＿１４３５を、ＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位をそれぞれ導入したプライマーｐｇ１４．３５およびｐｇ１４．０３を用いてＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲ１で消化したｐＣＰＥ３５８３にクローニングした。ＣＪＪ８１１７６＿１４３５のコード領域内に位置する相可変Ｇ９区域を、プライマーｐｇ１４．０９およびｐｇ１４．１０を用いて上記のように部位特異的突然変異誘発に供した。修復されたＣＪＪ８１１７６＿１４３５遺伝子および隣接するａｐｈ３遺伝子を、順方向および逆方向プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、上述したように、株８１−１７６のａｓｔＡを含むプラスミド上のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした［３６、３７］。このプラスミドを用いて、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５突然変異体つまり３６３６をＫｍ^ｒに電気穿孔し、株３６３７を産生した。

ＣＰＳイムノブロット：カンピロバクター・ジェジュニの全細胞を、上記のようにプロテイナーゼＫで消化した［３０、３４］。調製物を１６％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（インビトロジェン社）で電気泳動させ、銀（バイオラッド社）で染色してＬＯＳコアを可視化した。同等のコア量を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動させ、ニトロセルロースに移した。全細胞抗８１−１７６血清を最終希釈１：５００で使用し、抗コンジュゲート抗血清を最終希釈１：１００で使用した。イムノブロットを化学発光（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＭａｘｉｍｕｍＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＳｕｂｓｔｒａｔｅ、サーモフィッシャー社）を用いて展開し、バイオ・ラッドゲル画像システムで記録した。

ＮＭＲ分析：^３１ＰＮＭＲスペクトルは、ＢｒｕｋｅｒＡＭＸ４００分光計を用いて記録した。１Ｄ３１Ｐおよび^１Ｈ−^３１Ｐ２Ｄ実験は、Ｂｒｕｋｅｒソフトウェアを用いて行った。試料は、スペクトルを記録する前に、Ｄ２Ｏ（９９．９％）で３回凍結乾燥した。オルトリン酸（δｐ０．０）を^３１Ｐのすべての実験の外部基準として用いた。

抗ＣＰＳＥＬＩＳＡ：高度免疫ウサギにおける抗ＣＰＳ応答を決定するために、Ｃａｒｂｏ−ＢＩＮＤプレート（コーニング社、コーニング、ニューヨーク州）を、メーカーの説明書に従って、野生型、３３９０、３４７７、または３６３６株（酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中２μｇ／ｍｌ）由来の酸化ＣＰＳの１００μｌで、室温で１時間コーティングした。プレートは、１×ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、ＰＢＳＴ（５％ＦＣＳ−ＰＢＳＴ）中の５％ウシ胎仔血清で、３７℃で１．５時間ブロックし、再度ＰＢＳＴで洗浄した。すべてのウサギ過免疫血清を、５％ＦＣＳ−ＰＢＳＴで２回連続希釈し、３７℃で１．５時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマアルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）を５％ＦＣＳ−ＰＢＳＴで希釈し、洗浄前に１ウェル当たり１００μｌで、３７℃で１時間添加した。検出試薬として、２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）（ＡＢＴＳ）−ペルオキシダーゼ基質を使用して、ＯＤ４０５を測定した。ネガティブコントロールウェル（コーティングバッファーのみ）＋３標準偏差の平均ＯＤ４５０を用いて終点力価を決定した。

３つのＣＰＳ−ＣＲＭ１９７コンジュゲート上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌのレベルを決定するために、コンジュゲートを、総ＣＰＳ含量に基づいて標準化し、カーボネートコーティング緩衝液中、ＭａｘｉＳｏｒｐＮｕｎｃ（登録商標）プレート（シグマアルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）上で、４℃で一晩連続希釈した。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳＴ中のＢＳＡで、３７℃で１時間ブロックした。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを検出するために、プレートを洗浄し、ＤＢ３モノクローナルをブロッキング緩衝液で希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後にヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（サーモ・サイエンティフィック社）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌのテトラメチレンベンジジン（ＴＭＢ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、サンディエゴ、カルフォルニア州）基質を１０分間添加した後、１００μｌの１ＭＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。ＯＤを４５０ｎｍで読み取った。

ハイブリドーマの産生：［３８］に従って、４週間間隔で３回ＣＰＳ８１−１７６−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートで皮下免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞をＳＰ２／Ｏ骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを作製した。簡単に説明すると、脾臓細胞およびＳＰ２／Ｏ細胞をポリエチレングリコールの存在下で融合させ、ハイブリドーマ培地［２０％ＦＢＳ、２×ＨＡＴ（２００ｍＭヒポキサンチン、０．８ｍＭアミノプテリン、３２ｍＭチミン）、ＯＰＩ（１ｍＭオキサロ酢酸、０．４５ｍＭピルビン酸、および０．２Ｕ／ｍＬインスリン）、４ｍＭグルタミン、ならびにＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有するイスコフ培地］において非免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の腹腔マクロファージと混合した。融合した細胞を直ちに８枚の９６ウェル細胞培養プレート上にプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中で２週間インキュベートした。ハイブリドーマは、抗原標的として８１−１７６およびｍｐｎＣ突然変異体の両方に由来するＣＰＳのＢＳＡコンジュゲートを用いて、ＥＬＩＳＡによって各ウェルから培養上清をスクリーニングすることによって選択した。

モノクローナル（ｍＡｂ）ＤＢ３の産生および精製：単一細胞ハイブリドーマクローンを、イスコフ培地中で２．５％ＦＢＳまで離乳しながら、１６個のＴ−１５０フラスコに徐々に増殖させた。細胞を１Ｌの無血清培地（ＳＦＭ）を含有する２Ｌローラーボトルに移し、３７℃、５％ＣＯ_２で４週間培養した。ＳＦＭ中のｍＡｂＤＢ３を、メーカーの説明書（ポールライフサイエンス社）に従って、ＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌカラムで精製した。溶出した抗体をＴＢＳ（０．０５ＭＴｒｉｓ／０．１５ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）に透析し、タンパク質含量をＢＣＡアッセイによって決定した。アリコートは、さらなる特徴付けおよび使用のために−８０℃で保存した。アイソタイプは、アイソタイピングキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。

ドットブロットアッセイ：カンピロバクター・ジェジュニ細胞を、ｐＨ７．４のＰＢＳにおいてＯＤ_６００＝０．５に設定し、ニトロセルロース上に３連で（２マイクロリットル）スポットし、乾燥させた。膜は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度でのｍＡｂＤＢ３を用いた後、抗ウサギヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（シグマアルドリッチ社）を用いて免疫検出し、その後、上記のように化学発光検出を行った。

補体殺滅：プールされた正常ヒト血清（ＮＨＳ）をシグマから購入し、１つのロットをすべての実験に使用した。アッセイは、ＮＨＳの範囲を使用した点を除き、Maue et al.［２１］に記載された通りに行った。アッセイは、各株について２〜９回繰り返した。統計は、グラフパッドプリズム（Graphpad Prism）を使用して行った。

抗コンジュゲート抗体反応性を有するコロニーブロット：８１〜１７６個の個々のコロニーをＭＨ寒天プレート上で４８時間増殖させた。個々のコロニーをＰＢＳに再懸濁し、最終希釈１０μｇ／ｍＬでＤＢ３抗体による免疫検出のために２μｌをニトロセルロース上にスポットした。

フローサイトメトリー：８１−１７６菌株をＭＨ寒天上で２０時間増殖させ、細胞を５ｍＬのＰＢＳに回収し、１．２ミクロンフィルターで濾過した。得られた懸濁液をＯＤ_６０００．１に調整し、１ｍｌを１２０００ｇで２分間スピンダウンした。ペレットを０．５ｍｌの４％ホルムアルデヒドに再懸濁し、室温で１０分間回転子上でインキュベートした。細胞を遠心分離し、氷冷ＰＢＳＴで２回洗浄し、最終濃度１１２μｇ／ｍｌのコンジュゲート抗体またはＤＢ３モノクローナル抗体で免疫した超免疫ウサギ由来の血清の１：５０希釈液１００μｌに再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。懸濁液を氷冷ＰＢＳＴで２回洗浄した後、過免疫血清またはラット抗マウスＩｇＧ１ＰＥ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、バーミングハム、アラバマ州）に対するロバ抗ウサギＩｇＧＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（バイオレジェンド社、サンディエゴ、カルフォルニア州）と共にインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートした。懸濁液を氷冷ＰＢＳＴ中で２回洗浄し、０．５ｍｌＰＢＳＴに再懸濁し、ＣａｎｔｏＦＡＣＳ上で読み取った。データは、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社、アシュランド、オレゴン州）を用いて分析した。

ワクチンＤＢ４およびＣＪＣＶ１は、ＤａｌｔｏｎＰｈａｒｍａ社、トロントにより製造された。

結果

ＭｅＯＰＮは、抗コンジュゲート抗体によって認識される免疫優性の莢膜エピトープである。カンピロバクター・ジェジュニ８１−１７６のプロテイナーゼＫ消化全細胞および突然変異体を、８１−１７６のホルマリンで死滅させた全細胞（図２０Ａ、［３４］）および８１−１７６−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンＣＪＣＶ１（図２０Ｂ）に対するウサギポリクローナル抗体で免疫検出した。図２０Ａは、全細胞抗血清が野生型莢膜とは反応したが、非莢膜化突然変異体ｋｐｓＭ株３４６８とは反応しなかったことを示す［３４］。ｋｐｓＭをトランス（株３４６９）で補完すると［３４］、反応性が回復した。また、図２０Ａは、全細胞血清が、ＭｅＯＰＮを欠くＣＰＳを発現するｍｐｎＣ突然変異体（株３３９０）およびその補体である株３３９１と反応したことを示す［２１］。対照的に、ＣＰＳコンジュゲートワクチンに対するウサギポリクローナル血清（ＣＪＣＶ１；図２Ｂ）は、野生型８１−１７６と反応したが、ＣＰＳ欠損ｋｐｓＭ突然変異体またはＭｅＯＰＮ欠損ｍｐｎＣ突然変異体のいずれとも反応しなかった。両方の突然変異体が補完されたときに、反応性が回復した（それぞれ株３４６９および３３９１）。同様の反応性が、８１−１７６−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンの２つの他のバッチに対するウサギポリクローナル抗血清で見られた。

各ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの突然変異体に対する抗コンジュゲート抗血清の反応性。株８１−１７６は、２つの推定ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼ遺伝子であるＣＪＪ８１１７６＿１４２０およびＣＪＪ８１１７６＿１４３５を含む（図１９Ｂ）。本発明者らは、材料および方法の項目に記載したように各遺伝子に突然変異を生じさせ、また、８１−１７６−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチンに対して産生された抗体の、ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼ遺伝子のそれぞれにおける突然変異体と反応する能力を比較した。図２０Ａは、８１−１７６の全細胞に対する抗血清が、推定トランスフェラーゼ突然変異体３４７７および３６３６の両方のプロテイナーゼＫ消化全細胞と反応し、多糖類ＣＰＳの発現を確認したことを示す。株３４７７、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０突然変異体に由来するＣＰＳ調製物に対する抗全細胞血清と抗コンジュゲート血清との反応性には明確な差異があった。抗コンジュゲート血清の場合（図２０Ｂ）、明らかに低質量のＣＰＳ材料でのみ反応が見られ、一方、全細胞血清では（図２０Ａ）より広い反応性が観察された。抗コンジュゲート血清との反応の強度およびパターンは、補体３４９８において回復した（図２０Ｂ）。全細胞に対する抗血清は、３６３６（図２０Ａ）由来のＣＰＳおよび補体と反応した。しかし、抗コンジュゲート血清と３６３６由来のＣＰＳ、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異体との間に検出可能な反応はなかった（図２０Ｂ）。抗コンジュゲート血清との反応性は、補体、株３６３７において回復した（図２０Ｂ）。

同様の結果が、２つの他のバッチのコンジュゲートワクチンに対する追加のウサギ抗血清を用いて観察された。まとめると、これらのデータは、８１−１７６のホルマリンで死滅した全細胞に対して産生された抗体は多糖類鎖と反応したが、コンジュゲートに対して産生された抗体は、主に、ＭｅＯＰＮ−６−ＧａｌおよびそれほどではないにせよＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌに向けられていたことを示した。

また、コンジュゲート中のＭｅＯＰＮの免疫優性もＥＬＩＳＡによって調べた。抗ＣＪＣＶ１抗体を連続的に希釈し、野生型８１−１７６由来のＣＰＳまたは突然変異体に反応させた。結果は、図２０Ｃに示してあり、ＣＪＣＶ１の反応が野生型ＣＰＳに対して最も強い（力価：５．９×１０^６）ことを示した。３４７７から精製されたＣＰＳ、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異体に対する反応もあったが、終点力価は野生型よりも低かった（力価：６．６×１０^５）。ＣＪＣＶ１血清の反応は、３６３６由来のＣＰＳ、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異体と、すべてのＭｅＯＰＮを欠く３３９０（ｍｐｎＣ）由来のＣＰＳの両方に対して低下した（それぞれ力価：６００および８１００）。本明細書に報告された、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌよりも合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌのほうに対する抗コンジュゲート抗体の反応性が強いことに基づいて、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５トランスフェラーゼは、Ｇａｌの６位へのＭｅＯＰＮの付加に関与し、また、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０によってコードされるトランスフェラーゼは、Ｇａｌの２位へのＭｅＯＰＮの付加に関与している可能性が高い。これは、以下、ＮＭＲによってさらに研究された。

８１−１７６ＣＰＳに対するＭｅＯＰＮ修飾。以前に、質量分析を用いて、８１−１７６ＣＰＳのガラクトース（ＭｅＯＰＰＮ−２−Ｇａｌ）の２位に、図２１Ａと同様の^３１Ｐ共鳴（ピークＹ）を有する不定比ＭｅＯＰＮ単位を検出した［３１］。ここでは、^１Ｈ−^３１Ｐ相関実験におけるＭｅＯＰＮの^３１Ｐ共鳴Ｙ（δ_Ｐ１４．４５）とガラクトース単位のＨ−２（δ_Ｈ４．５２）との間のクロスピークの検出により、このＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ結合をＮＭＲにより確認した（図２２Ａ）。

いくつかの８１−１７６ＣＰＳ調製物において、より低い強度ではあるが、^３１ＰＮＭＲスペクトルは、δ_Ｐ１４．１５（指定ピークＺ）で追加の共鳴を示した（図２１Ｂ）。また、同様のピークが、ＭｅＯＰＮのリンとＣＰＳガラクトース単位のいくつかのＨ−６共鳴との間にクロスピーク（図２２Ｂ）を示した、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異体（３４７７と呼ばれる）の^３１ＰＮＭＲにおいても観察された。これは、ＭｅＯＰＮのメチル共鳴（δ_Ｈ３．７５〜３．８１）の非常に近くで共鳴した。３４７７由来のＣＰＳでは、有意なピークＹは観察されなかった。ＮＭＲデータは、８１−１７６および３４７７（ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異体）のピークＺが、ガラクトースの６位のＭｅＯＰＮ（ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ）の不定比配置に対応することを示唆した。これは、本明細書に記載の合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを用いるデータと一致する。

ＣＹＪ８１１７６＿１４３５の突然変異体である３６３６の^３１ＰＮＭＲスペクトル（図２１Ｃ）は、ピークＹまたはピークＺのいずれも示さなかったが、δ_Ｐ１４．７９（指定ピークＸ）で以前には見られないリン共鳴を生じた。２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＮＭＲ実験は、ピークＸとδ_Ｈ４．８５でのプロトン共鳴との間の結合を示した（図２２Ｃ）。株３６３６由来のＣＰＳのＮＭＲデータは、以前に８１−１７６ＣＰＳで観察されなかったＭｅＯＰＮ修飾を提供するＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異体における新たな活性を示唆した。この新たなＣＰＳ修飾は、進行中の研究の対象である。

両方のトランスフェラーゼ（株３４７９）における突然変異体の^３１ＰＮＭＲスペクトルは、ＭｅＯＰＮ関連の共鳴を示さなかった（データは示さず）。

モノクローナルＤＢ３。マウスモノクローナル抗体（アイソタイプＩｇＧ１）を、８１−１７６−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンで免疫した動物から単離した。図２３Ａに示すように、モノクローナルを、野生型８１−１７６の全細胞およびさまざまな突然変異体を有するドットブロットで使用した。モノクローナルは、ｍｐｎＣ突然変異体（３３９０）または８１１７６＿ＣＪＪ１４３５突然変異体（３６３６）のいずれとも反応しなかったが、両方の突然変異体が補完されたときに（それぞれ３３９１および３６３７）、反応性が回復した。ＤＢ３は、８１１７６＿ＣＪＪ１４２０突然変異体（３４７７）に結合しているため、モノクローナルの特異性は、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌである可能性が高いＣＪＪ８１１７６＿１４３５によってコードされるトランスフェラーゼによって修飾された部位に対するものであった。さらに、ＤＢ３は、他のＭｅＯＰＮ含有莢膜（ＨＳ１、ＨＳ２、ＨＳ３、ＨＳ４、およびＨＳ１５）に反応しなかった［３９−４４］。これは、特異性がＭｅＯＰＮ単独に対してではなく、糖結合を含んでいたことを再確認する（データは示さず）。

ＤＢ３を用いたフローサイトメトリー分析。図２３Ｂは、モノクローナルＤＢ３が、フローサイトメトリーにより測定されたように、野生型８１−１７６の表面に結合していたが、ドットブロッティング研究から予想されたように、ｍｐｎＣ突然変異体には結合していなかったことを示す。結合は、ｍｐｎＣ突然変異体の補体である株３３９１で部分的に回復した。同様に、ＤＢ３は、たぶんＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを欠く突然変異体である３６３６には結合せず、結合は、補体である３６３７で部分的に回復した（図２３Ｃ）。しかし、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌを欠くがＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを保持する突然変異体である３４７７へのＤＢ３結合は減少した。結合は、補体である株３４９８で増強された（図２３Ｄ）。

コンジュゲートワクチン上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌのレベルが免疫応答を調節する。３つの独立して生成されたコンジュゲートワクチン上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌのレベルを測定するためにＤＢ３をＥＬＩＳＡで使用したとき、結合の差異を検出することができた（図２４Ａ）。ＣＣＶは、ヒト以外の霊長類を下痢症から守ることが示されたワクチンであり［３０］、最も高い結合性を示し、ＤＢ４は中間であり、ＣＪＣＶ１が最も低かった。図２４Ｂに示すように、３つのワクチンのそれぞれに対するウサギ過免疫抗血清に対して野生型８１−１７６およびｍｐｎＣ突然変異体から精製した莢膜に対して、ＥＬＩＳＡによってエンドポイント力価を測定した。各ワクチンは、無傷の野生型莢膜に対する抗体の高力価を誘発したが（ＣＣＶ：６．６×１０^５、ＤＢ４：４．０×１０^６、ＣＪＣＶ１：５．９×１０^６）、各ワクチンのＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの量が減少すると（ＣＣＶ：１００、ＤＢ４：５４００、ＣＪＣＶ１：８１００）、ｍｐｎＣ莢膜に対する力価は増加した。したがって、抗多糖類応答は、ＣＣＶに対して最も低く、ＤＢ４に対しては中間であり、ＣＪＣＶ１に対しては最も高かった。図２４Ｃ〜Ｅは、野生型およびｍｐｎＣ突然変異体の表面に対する各ウサギ過免疫血清の反応性を示す。ＣＣＶは、最高量のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを有し、野生型８１−１７６の表面に結合しているが、ｍｐｎＣ突然変異体３３９０には結合が検出されなかった（図２４Ｃ）。結合は、株３３９１である補体で増強された。ＤＢ４をコンジュゲートする抗体は、野生型８１−１７６の表面に結合し、ＣＣＶと比較してｍｐｎＣ突然変異体への結合の増強を示した（図２４Ｄ）。最後に、ＣＪＣＶ１に対する抗体は、野生型およびｍｐｎＣ突然変異体に等しく良好に結合した（図２４Ｅ）。いずれの抗体もｋｐｓＭ突然変異体には結合しなかった。したがって、ｍｐｎＣ突然変異体に対する表面結合は、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌのレベルがワクチンにおいて減少するにつれて増強された。

補体抵抗性におけるＭｅＯＰＮの役割。ＶａｎＡｌｐｈｅｎら［２２、３１］は、両方の推定トランスフェラーゼ遺伝子に二重突然変異体を構築し、得られた突然変異体が補体殺滅に対して感受性があることを示した。これは、ｍｐｎＣ突然変異体を用いた以前の研究と一致する［２１、２２］。本発明者らは、３４７７（ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異体）、３６３６（ＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異体）、および両方のトランスフェラーゼを欠く二重突然変異体（３４７９）の血清抵抗性を、ＮＨＳの量を増加させながら比較した。結果は、図２５に示してあり、すべての血清濃度において、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５突然変異体３６３６が、野生型よりも有意に耐性があり、また、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０突然変異体３４７７が、５〜１５％のＮＨＳ濃度において野生型８１−１７６よりも有意に感受性があることを示した。両方の突然変異体が修復された対立遺伝子で補完された場合、血清耐性のレベルは野生型のものと有意に異ならないレベルに戻った。しかし、両方のＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの突然変異（株３４７９）は、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０突然変異体（３４７７）よりも感受性が高くなり、以前に別の二重トランスフェラーゼ突然変異体［２２］およびｍｐｎＣ突然変異体［２１］に対して報告したのと同様の感受性レベルを示した。

ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの相変化。株８１−１７６をＭＨ寒天上の単一コロニーに対してプレーティングし、６０個の個々のコロニーをＤＢ３モノクローナル抗体でドットブロットしてＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの発現レベルを測定した。結果は、図２６Ａの代表的なコロニーによって示されるように、集団内のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの発現にかなりの異種性があることを示した。図に示すように、コロニーには強度に対して主観的に得点を付した。興味深いことに、図２６Ａにおいて「ＷＴ」と表示した集団は、大部分の単一コロニーよりも少ない抗体に結合した。これは、集団の異種性の反映である。まとめると、図２６Ｂに示すように、単一コロニーの５４％が「３＋」、１６％が「２＋」、２６％が「１＋」、４％がマイナスであった。

考察

カンピロバクター・ジェジュニ株の約７５％は、そのＣＰＳ遺伝子座にＭｅＯＰＮをコードする遺伝子を含むが、修飾された糖および修飾の部位は、限られた数のＣＰＳ型において決定されている。ほとんどの株は、単一のＭｅＯＰＮトランスフェラーゼを含むが、ＮＣＴＣ１１１６８および８１−１７６を含むいくつかの株は、２つのトランスフェラーゼを含み、両方の莢膜は、２つの部位［３１、４０］で、本明細書に開示されるように修飾される。野生型８１−１７６における両方のＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの存在下で、ＭｅＯＰＮは、Ｇａｌの２位と６位の両方に結合している。ＣＪＪ８１１７６＿１４２０が突然変異した場合、ＭｅＯＰＮは、おそらくＣＪＪ８１１７６＿１４３５によってコードされたＭｅＯＰＮトランスフェラーゼによって６位にのみ結合した。また、これは、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０によってコードされるトランスフェラーゼが、ＭｅＯＰＮの２−Ｇａｌへの付加に関与していることを示す。しかし、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５が突然変異した場合、Ｇａｌの２位または６位のいずれにおいてもＭｅＯＰＮは検出されず、未知の位置に新たな結合部位があった。この結合は、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０によってコードされるトランスフェラーゼによって媒介されなければならない。なぜなら、新しい結合（図２１ＣのピークＸ）は、二重ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼ突然変異体３４７９において観察されなかったからである。これは、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０によってコードされる酵素が、多糖類鎖の二次構造に依存する緩和された特異性を有することを示唆する。本発明らの研究室では、ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの特異性に関するさらなる研究が進行中である。

８１−１７６ＣＰＳ上のＭｅＯＰＮ修飾は、コンジュゲートワクチンにおいて免疫優性であり、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに対する応答は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌに対する応答よりも強かった。また、これは、本明細書に記載された、抗コンジュゲート抗体の合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌとの観察された反応性とも一致する。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの免疫優性は、ＣＰＳ上での当該修飾のレベルがより高いことに起因するものでありうる、または、一次ヒドロキシル上での、Ｇａｌの６位の修飾が、より免疫原性であることに起因する可能性がある。ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーのより感度の高い方法によってさまざまなレベルの抗多糖類抗体を検出しうるであろうが、コンジュゲートワクチンに対する任意のウサギ超免疫血清を用いた粗ＣＰＳ調製物のイムノブロッティングによって、ｍｐｎＣ突然変異体の多糖鎖に対する抗体を検出することはできない。しかし、ＤＢ３結合によって測定されたように、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌのレベルが減少するほど、多糖類鎖に対する反応性のレベルは増加した。コンジュゲートワクチンに対する応答とは対照的に、８１−１７６のホルマリン死滅全細胞に対して作製されたウサギ過免疫血清は、イムノブロッティングによってｍｐｎＣ多糖類と反応した。この抗血清を産生するために抗原として使用された細胞は、他の調製物ほどＭｅＯＰＮを発現しなかったか、または、ホルマリン処理により一部のＭｅＯＰＮが失われたため、細胞がより多くの露出した多糖類を含んでいた可能性がある。

モノクローナルＤＢ３は、全細胞ドットブロットにより決定されるようにＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌエピトープに特異的であるように見え、また、これと一致して、フローサイトメトリーにより、野生型８１−１７６の表面には結合しているが、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５またはｍｐｎＣ突然変異体には結合していないように見える。興味深いことに、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異によってＤＢ３の表面結合が妨害された。これは、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌの消失がＣＰＳの二次および／または三次構造を変化させ、ＤＢ３の細胞表面への接近可能性（accessibility）を低下させることを示唆している。研究はまだ報告されていないが、多糖類鎖は、細胞質で合成されているため、ＭｅＯＰＮで修飾されている可能性が高い。ＭｅＯＰＮを用いた糖の修飾は、多糖類の折り畳みの変化に影響を及ぼす可能性があり、細胞表面上へのアセンブリ後に、隣接する多糖鎖間の相互作用にも影響を与え、もって、多糖類の、抗体および／または補体カスケードの成分への接近可能性にも影響を与えうる。これは、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０突然変異体におけるＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌの喪失が、補体媒介性殺滅に対する耐性の有意な低下をもたらしたという本発明者らの観察と一致する。

ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異とは対照的に、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異は、補体媒介性死滅に対する耐性を高めた。^３１Ｐ−ＮＭＲ研究は、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５突然変異体が、ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの両方を失っており、未知の部位に新しいＭｅＯＰＮ修飾を得ていることを示した。おそらく、この新しい修飾部位は、補体カスケードからの保護を強化すると思われる。この仮説は、ｍｐｎＣ突然変異体と比較して、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５突然変異体（３６３６）に対して見られるより低い終点力価と一致する。したがって、新しいＭｅＯＰＮ修飾は、多糖類鎖に対する抗ＣＪＣＶ１抗体の接近可能性をブロックしうる。

補体媒介性殺滅に対するこれらの異なる感受性のメカニズムを理解するためには、さらなる研究が必要である。しかし、野生型８１−１７６の個々のコロニーをＤＢ３モノクローナルでイムノブロッティングすることにより、集団内におけるＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌレベルの広範な不均一性が明らかになった。これは、今度は、集団が環境の変化に容易に適応できることを示唆する。同様に、ＭｅＯＰＮは、いくつかのファージの結合に必要であることが示されており、ＭｅＯＰＮのレベルを変化させる能力は、いくつかの環境で生存に決定的に重要である可能性がある［２６、２７］。したがって、ＰＶは、これらの環境変化、および、恐らくこの人獣共通病原体によって遭遇する他のもの、に適応するための新たなメカニズム機構を提供するように思われる。カンピロバクター・ジェジュニの表面抗原のみならず［１２〜１７、３４、４６］、ストレス応答に影響を与えるプリン生合成遺伝子においても［４７、４８］、同様の不均一性が観察されている。まとめると、これらのデータは、カンピロバクター・ジェジュニが、異種集団内の既存の突然変異体のサブセットの選択によって生存する準種であるという考えを支持する［４７］。

コンジュゲートワクチン中のＭｅＯＰＮの免疫優性は、他の細菌病原体に基づく多糖類コンジュゲート上のＯ−アセチル基の免疫優性に匹敵するように見える［４９〜５１］。重要なことに、異なる糖上にＭｅＯＰＮを発現する他の血清型に由来するＣＰＳと抗コンジュゲート血清との反応は検出されなかった（データは示さず）。これは、当該反応が８１−１７６に存在するＧａｌ結合に特異的であり、ＭｅＯＰＮそれ自体には特異的でないことを示唆する。糖に対する不定比修飾は、多糖類鎖にかなりの異種性を与え、免疫原性に影響を与えうる［４０、５２］。これらのデータは、カンピロバクター・ジェジュニに対するＣＰＳベースのワクチンが、ＭｅＯＰＮ修飾糖のこの免疫優位性を利用することによって改善されうることを示唆している。本明細書において、１つのアプローチは、莢膜の精製およびワクチンの製造のために免疫優性エピトープを過剰発現する株を使用することであると考えられる。別の代替的なアプローチは、ＭｅＯＰＮ−糖エピトープの化学合成および本明細書で企図されているようなキャリアタンパク質へのコンジュゲーションである。

カンピロバクター・ジェジュニの補体媒介性殺滅は、主として古典経路によって起こることが報告されており［２２、５３］、ＣＰＳは、恐らく、表面タンパク質と交差反応するＮＨＳ中の天然に存在する抗体から細胞を保護する働きをする。しかし、ＭｅＯＰＮ装飾は、交差反応性抗体から表面タンパク質および多糖類を保護しうる。これは、ＮＨＳが、カンピロバクター・ジェジュニの表面タンパク質と交差反応し、かつ、複数の株の、低レベルの補体媒介性殺滅を誘発しうる、低レベルの抗体を含むこと、しかし、カンピロバクター・ジェジュニによる感染の４８時間以内に、患者が、株特異的であるより高レベルの血清殺菌力価を発生させたこと［５３］、という以前の観察、つまり、ＣＰＳ特異的抗体応答に関連しうる観察と一致する。他のいくつかのグラム陰性病原体に対するコンジュゲートワクチンは、保護と相関する殺菌抗体を誘導し［５４〜５６］、本発明者らは、カンピロバクター・ジェジュニコンジュゲートワクチンに対する当該可能性を探求している。カンピロバクター・ジェジュニは、一般に、比較的血清感受性があると考えられているが［５７］、本発明者らは、本明細書において、生物は、ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼをコードする遺伝子のＰＶを介してその耐性レベルを調節する能力を有すること、集団は、これらの修飾のさまざまなレベルを表す細胞からなることを示した。よって、集団に対するインビトロで測定される血清耐性のレベルは、インビボで達成されうる耐性のレベルを反映しない場合がある。

したがって、上記のデータに基づいて、本発明者らは、カンピロバクター・ジェジュニ株８１−１７６の多糖類莢膜が、ガラクトース（ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ）の２位（ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ）および６位（ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ）においてメチルホスホルアミデート（ＭｅＯＰＮ）で不定比的に修飾されており、これらが、８１−１７６莢膜コンジュゲートワクチンに対する抗体によって認識される免疫優性エピトープであることを示した。野生型８１−１７６の表面に結合した（しかし、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌを欠く突然変異体に結合する）ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに特異的なマウスモノクローナル抗体は減少したが、これは、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌの欠損が莢膜の二次／三次構造の変化をもたらすことを示唆している。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに特異的なモノクローナル抗体を用いて、本発明者らは、集団が、ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの相変化の結果として異なるレベルのＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを発現する細胞の異種混合物からなることを示した。ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌの結合に関与していると思われるＣＪＪ８１１７６＿１４２０によってコードされるＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの突然変異体は、５％、１０％、および１５％の正常ヒト血清（ＮＨＳ）において野生型よりも補体媒介性殺滅に対して有意に感受性が高かった。対照的に、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの付加に関与していると思われるトランスフェラーゼであるＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異体は、５％、１０％、１５％、および２０％のＮＨＳにおいて野生型よりも有意に耐性があった。ＣＪＪ８１１７６＿１４３５突然変異体においては、ＭｅＯＰＮ−６−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌの両方が失われ、ＭｅＯＰＮ修飾の新たな未同定部位が観察された。この未同定部位は、この突然変異体における血清耐性の増強に関与している可能性が高い。したがって、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５によってコードされるトランスフェラーゼが存在しない場合、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０トランスフェラーゼは、莢膜上の二次部位を修飾することができたように思われる。このように、ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの相変化は、莢膜の構造および補体媒介性殺滅に対する耐性のレベルを調節する。

実施例８の参考文献：

1. Epps, SVR et al. 2013 Int. J. Environ Res. Public Health 10:6292-6304.

2. Coker, AO et al. 2002 Emerg. Infect. Dis. 8:237-244.

3. Oberhelman, R and Taylor, DN 2000 Campylobacter infections in developing countries, pp 139-154. In: I. Nachamkin and M. J. Blaser, Campylobacter, 2nd ed., pp. 139-154, ASM Press, Washington, DC.

4. Kotloff, KL et al. 2013 Lancet 382:209-222.

5. Platts-Mills, J et al. 2015 Lancet Glob Health 3(9): e564-567. Doi: 10.1016/S2214-109X (15)00151-5.

6. Lee G, et al. 2013 PLOS Neglected Tropical Dis. 7:e2036. Doi:10.1371/journal.pntd.002036.

7. Nachamkin, I et al. 2000 Campylobacter jejuni infection and the association with Guillain-Barre syndrome. In I. Nachamkin and M. J. Blaser (ed.), Campylobacter, 2nd ed. ASM Press, Washington, DC.

8. Molbak, K and Havelaar, A. Burden of illness of Campylobacteriosis and sequelae. In: I. Nachamkin, Christine Szymanski and M. J. Blaser (ed.), 2008. Campylobacter, third edition. (American Society for Microbiology, Washington, D.C.).

9. Karlyshev, AV et al. 2000. Mol. Microbiol. 35:529-541.

10. Penner, JL and Hennesey, JNH 1980 J. Clin. Microbiol. 12:732-737.

11. Guerry, P et al. 2012 Fronteirs Microbiol. 2: article 7. doi: 10.3389/fcimb.2012.00007.

12. Parkhill, J et al. 2000 Nature 403:665-668.

13. Linton, D et al. 2000 Mol. Microbiol. 37:501-514.

14. Guerry, P et al. 2001. Infect. Immun. 70:787-793.

15. Hendrixson, DR 2006. Mol. Microbiol. 61:1646-1659.

16. Thomas, DK et al. 2014 Plos One 9:e88229. Doi:10.1371/journal.pone.0088229.

17. Jerome, JP et al. 2011 Plos One 6:e16399. doi:10.1371/journal.pone.0016399.

18. Gaasbeek, EJ et al. 2009 J. Bacteriol. 191:3785-3793.

19. Bachtiar, BM et al. 2007 FEMS Immunol. Med. Microbiol. 49:149-154.

20. Grant, AJ et al. 2005 Appl. Environ. Microbiol.71:8031-8041.

21. Maue, AC et al. 2013 Infect Immun. 81:665-672.

22. van Alphen LB, et al. 2014 Plos One, 2014. 9:e87051. Doi: 10.1371/journal.pone.0087051.

23. Champion, OL et al. 2010 J. Infect. Dis. 201: 776-782.

24. Rose, A et al. 2011 Med. Microbiol. Immunol. 201:137-144.

25. Stahl, M et al. 2014 PLOS Pathog., 10(7):e1004264. Doi:10.1371/journal.ppat.1004264.

26. Sorensen, MCH et al. 2012 J. Bacteriol. 193:6742-6749.

27. Sorensen, MCH et al. Fronteirs Cell Infect Microbiol. 2:11. Doi:10.3389/fcimb.2012.00011.

28. Lesinski, GB and Westerink, MA. 2001 Curr Drug Targets Disord 1:325-334.

29. Knuf, M et al. 2011 Vaccine 29:4881-4890.

30. Monteiro, MA et al. 2009 Infect. Immun.77:1128-1136.

31. Kanipes, MI et al. 2006 J. Bacteriol. 188:3273-3279.

34. Bacon, DJ et al. 2001 Mol. Microbiol. 40:769-777.

35. Yao, R. et al. 1993 Gene 130:127-130.

36. Ewing, CP et al. 2009. J. Bacteriol. 191:7086-7093.

37. Yao, R. and Guerry, P. 1996 J. Bacteriol. 178:3335-3338.

38. Nyame, AK et al. 2003 Exp. Parasitol. 104:1-13.

39. McNally, D. et al. 2005 FEBS J. 272:4407-4422.

40. McNally, DJ et al. 2007 J. Biol. Chem.282: 28566-28576.

41. Karlyshev, AV et al. 2005 Mol. Microbiol.55:90-103.

42. Aspinall, GO et al. 1995 Eur J. Biochem. 231:570-578.

43. Bertolo, L et al. 2013 Carbohy. Res.366:45-49.

44. Chen, YH et al. 2008 Carbohydr. Res. 343:1034-1040.

46. Mohawk, KLet al. 2014 Plos One, 9(e88043.). doi:10.1371/journal/pone.008043.

47. Cameron, A et al. 2015 mBio 6(5):e00612-15. Doi:10.1128/mBio.00612-15.

48. Cameron, A et al. 2012 J. Bacteriol. 194:6116-6130.

49. Calix, J. et al. 2011 J. Bacteriol. 193:5271-5278.

50. Szu, SC et al. 1991 Infect Immun. 59:4555-4561.

51. Fattom, AI et al. 1998 Infect. Immun. 66:4588-4592.

52. King, MR et al. 2007 Trends Microbiol. 15:196-202.

53. Pennie, RA, et al. 1986 Infect. Immun. 52:702-706.

54. Gill, CJ et al. 2011 Vaccine 30:29-34.

55. Townsend, K et al. 2014 Vaccine 32:5650-5660.

56. Bash, MC et al. 2014 Clin. Vaccine Immunol.21:755-761.

57. Blaser, MJ et al. 1985 J. Infect Dis. 151:227-235.

被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する予言的方法

先行する実施例に記載の免疫原性合成コンストラクトは、カンピロバクター・ジェジュニに対する免疫原性製剤（例えば、ワクチン製剤）に含めることができ、また、カンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するために被験体に投与することができる。したがって、本実施例は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する予言的方法であり、特に、カンピロバクター腸炎に関連する胃腸障害および他の衰弱作用からの防御免疫を提供する、被験体において免疫応答を誘発する方法が、本明細書で企図される。

一例として、そのような方法は、本発明の１つ以上の合成コンストラクトを含む免疫原性組成物を投与することを含みうる。このコンストラクトは、任意選択的に、キャリア分子、好ましくは、ＣＲＭ_１９７のようなキャリアタンパク質分子にコンジュゲートされている。この方法は、さらに、第１の工程で投与されたのと同じ免疫原を含む組成物の１回以上の追加用量を投与することを含む１つ以上の後続する工程をさらに有しうる。

当業者に理解されるように、ヒトにおいて防御免疫を誘発する最適な方法の前に、マウスやサルなどの動物における研究が先行する。本発明の合成コンストラクトを含む各ワクチン製剤に対して、限られた量の実験が、最適な有効用量範囲を確認するのに必要である。例えば、一実施形態において、免疫原性合成コンストラクトの単位用量の範囲は、さまざまな緩衝液で、１用量あたり約０．１μｇ〜１０ｍｇでありうることが、本明細書で企図される。また、任意選択的に、初回用量（priming dose）に続いて、緩衝水溶液中約０．１μｇ〜１０ｍｇの免疫原の単位用量範囲で、１回以上（例えば、２〜４回）の追加用量を投与しうる。

したがって、カンピロバクター・ジェジュニに対する被験体における免疫応答を誘発する方法は、（ａ）本発明の１つ以上の合成コンストラクトを含む免疫原性組成物を投与する工程と、前記コンストラクトは、キャリア分子、好ましくはキャリアタンパク質分子にコンジュゲートされており、前記組成物は、アジュバントの有無にかかわらず１用量当たり約０．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で投与される、（ｂ）任意選択的に、アジュバントの有無にかかわらず、１用量当たり約０．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で、工程（ａ）に記載された組成物の追加用量を投与する工程を有しうる。

本明細書において、投与経路に応じて、詳しく上述した多数のアジュバントのいずれかの有無にかかわらずワクチン製剤を投与しうると考えられる。

さらに、上記のように、本方法は、キャリアタンパク質にコンジュゲートされている合成コンストラクトを用いて、または、非コンジュゲート合成コンストラクトを用いて実施されうる。本方法は、上記した多数のキャリア分子のいずれかの使用を含みうる。一例として、ＣＲＭ_１９７を使用しうる。また、ＥＴＥＣタンパク質を、上記のように、例えばUS 2015/0258201 A1に開示されているように、キャリアタンパク質として使用しうる。

コンストラクト：キャリアタンパク質比（ｗ／ｗ）は、１：１、または、２つ以上のコンストラクトが、単一のキャリアタンパク質に、例えば、２：１から１０：１以上、特に少なくとも８：１で結合するようなものでありうる。当業者には理解されるように、単一キャリア分子は、多数の合成コンストラクト、例えば、１キャリア分子当たり数百または数千のコンストラクトにコンジュゲートされうる。過度の実験を行うことなく、当業者であれば、被験体における免疫応答を誘発しおよび／または増強するのに最適な適切な比率を認識しうる。

実際、本明細で企図されるように、当業者は、２つ以上のＭｅＯＰＮ修飾単糖類を含むコンストラクトおよびコンジュゲートを有する合成コンストラクト、アジュバント、キャリアタンパク質、追加の免疫調節剤、および投与経路の異なる組み合わせを使用することによって、本発明の方法に使用する合成コンストラクトの免疫原性を最適化しうる。例えば、カンピロバクター・ジェジュニのみならず他の細菌病原体に対しても免疫原性が増強されたコンストラクトを産生するために、異なるＥＴＥＣタンパク質を、本発明の免疫原性合成コンストラクトとさまざまに組み合わせて使用しうることが、本明細書で企図される。この目的のために、US 2015/0258201 A1の教示内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれている。さらに、本発明の組成物、例えば、医薬製剤、特に本発明のワクチン製剤は、経口投与、経鼻投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、筋肉内投与、または直腸投与しうる。被験体において免疫応答を生成するのに最も適した投与方法および投与レジメンは、従来の方法を用い、かつ過度の実験をすることなく、当業者によって認識されうる。

カンピロバクター・ジェジュニまたは他の生物に対する多価ワクチン製剤

本明細書に提供されたデータは、カンピロバクター・ジェジュニのＨＳ２３／３６、ＨＳ４、およびＨＳ１株に対する抗体が、合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトと反応しうることを示している。したがって、一実施形態において、当業者は、従来の方法を用い、かつ過度の実験をすることなく、カンピロバクター・ジェジュニの少なくともこれら３つの主要な莢膜型をカバーするべき本明細書に開示された合成ＭｅＯＰＮ−６Ｇａｌコンストラクトを含む多価ワクチン製剤を開発しうることが、本明細書で企図される。

さらに、本明細書において、カンピロバクター症の世界的症例の大部分を占めるカンピロバクター・ジェジュニの菌株をカバーする本発明の１つ以上の免疫原性合成コンストラクトを含む追加の多価製剤を開発しうることが企図される。このような製剤は、例えば、この点に関連するカンピロバクター・ジェジュニ株に由来の莢膜単糖類を含むさらなるコンストラクトを合成し、この合成コンストラクトの、そのようなカンピロバクター・ジェジュニ株に対する免疫原性（ありうる交差反応性を含む）を検査することによって生成されうる。特定の実施形態において、そのような合成コンストラクトは、例えば、１つ以上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ部分および／または１つ以上のＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ部分を有する、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含みうる。本明細書において、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌを含む合成コンストラクトが企図される。

本発明の多価ワクチン製剤は、カンピロバクター・ジェジュニの２つ以上の株をカバーするように作られた単一の合成コンストラクト、および／または、カンピロバクター・ジェジュニの単一の特定の株に対して特別に作られた合成コンストラクトを含むことができる。さらに、当業者であれば、２つ以上のカンピロバクター・ジェジュニ株に対してのみならず２つ以上の細菌の種類（例えば、ＥＴＥＣまたは赤痢菌）に対しても免疫原性である合成コンストラクトを、カンピロバクター・ジェジュニに対する免疫原性コンストラクトに、それらの追加の細菌に対するさまざまな異なる抗原成分を連結することによって産生しうることを理解するであろう。例えば、US 2015/0258201を参照。

これまで本発明を説明してきたが、当業者であれば、上記の教示に照らして本発明の多くの変更および変形が可能であることを理解するであろう。したがって、当然のことながら、添付の特許請求の範囲内において、本発明は、具体的に記載されたもの以外に実施されうる。

Claims

被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニ(C.jejuni)に対する免疫応答を誘発することができる免疫原性合成コンストラクトであって、１つ以上のＭｅＯＰＮ部分を有する１つ以上の単糖類を含む、免疫原性合成コンストラクト。
１つ以上のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む、請求項１に記載の免疫原性合成コンストラクト。
キャリアタンパク質にコンジュゲートされている、請求項２に記載の免疫原性合成コンストラクト。
前記キャリアタンパク質は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む、請求項３に記載の免疫原性合成コンストラクト。
前記キャリアタンパク質は、ＣＲＭ_１９７である、請求項４に記載の免疫原性合成コンストラクト。
前記被験体は、ヒトである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性合成コンストラクト。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性合成コンストラクトを含む組成物。
前記組成物は、医薬組成物である、請求項７に記載の組成物。
前記医薬組成物は、ワクチン製剤である、請求項８に記載の医薬組成物。
前記製剤は、１つ以上のアジュバントをさらに含む、請求項９に記載のワクチン製剤。
前記アジュバントは、トール様受容体リガンド、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピドＡ、リポソーム、ならびにそれらの誘導体および組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載のワクチン製剤。
１つ以上の追加免疫調節剤をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
前記免疫調節剤は、１つ以上のカンピロバクター・ジェジュニ株の抗原、ＥＴＥＣ抗原、赤痢菌リポ多糖構造、および非コンジュゲート状態のキャリアタンパク質からなる群から選択される物質である、請求項１２に記載の組成物。
前記被験体は、ヒトである、請求項７に記載の組成物。
前記被験体は、ヒトである、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性合成コンストラクトの有効量を前記被験体に投与することを含む、方法。
前記被験体は、ヒトである、請求項１６に記載の方法。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項７に記載の組成物の有効量を前記被験体に投与することを含む、方法。
前記被験体は、ヒトである、請求項１８に記載の方法。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物の有効量を前記被験体に投与することを含む、方法。
前記被験体は、ヒトである、請求項２０に記載の方法。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する方法であって、
（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性合成コンストラクトの有効量を前記被験体に投与する工程と、
（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で投与した免疫原性合成コンストラクトの１回以上の追加用量を前記被験体に投与する工程と、
を含む方法。
工程（ａ）で投与する前記有効量は、前記免疫原性合成コンストラクトの約０．１μｇ〜約１０ｍｇである、請求項２２に記載の方法。
工程（ａ）および／または工程（ｂ）において前記コンストラクトと共にアジュバントを投与する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する方法であって、
（ａ）請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物の有効量を前記被験体に投与する工程と、
（ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で投与した組成物の１回以上の追加用量を前記被験体に投与する工程と、
を含む方法。
工程（ａ）で投与する前記有効量は、前記免疫原性合成コンストラクトの約０．１μｇ〜約１０ｍｇである、請求項２５に記載の方法。
工程（ａ）および／または工程（ｂ）において前記コンストラクトと共にアジュバントを投与する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性合成コンストラクトの使用。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するのに用いる請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性合成コンストラクト。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する薬剤の製造における請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性合成コンストラクトの使用。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するのに用いる請求項７に記載の組成物。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するための請求項７に記載の組成物の使用。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する薬剤の製造における請求項７に記載の組成物の使用。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するのに用いる請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発するための請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニに対する免疫応答を誘発する薬剤の製造における請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組成物の使用。