JP2018537428A

JP2018537428A - カンピロバクター・ジェジュニに対する合成抗原コンストラクト

Info

Publication number: JP2018537428A
Application number: JP2018522007A
Authority: JP
Inventors: パトリシアゲーリー，; イェニンジャオ，; マリオ，アーターモンテイロ，; ブリタニーミシェルペクナット，
Original assignee: US Department of Navy
Current assignee: US Department of Navy
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2016-11-03
Publication date: 2018-12-20
Also published as: CA3004305A1; EP3370753A1; AU2015342943A1; CA2966754A1; AU2016349370A1; US10500262B2; CA3004305C; WO2017079456A1; AU2015342943B2; EP3215226A4; WO2016073773A1; JP2017537145A; EP3215226A1; US20180177857A1; US20160144017A1; US9925254B2

Abstract

本発明は、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を含む１つまたは複数の単糖類を含む、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ジェジュニ）に対する免疫応答を誘導することができる免疫原性合成コンストラクトに関する。具体的には、本発明は、１つもしくは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類、１つもしくは複数のＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ単糖類、および／または１つもしくは複数のＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導することができる免疫原性合成コンストラクトに関する。本発明は、免疫原性合成コンストラクトを含む組成物、ならびに免疫原性合成コンストラクトおよび／または免疫原性合成コンストラクトを含む組成物を被験体に投与することを含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する方法にも関する。１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分に対する１つまたは複数の用量の免疫グロブリンを被験体に投与することを含む、被験体におけるＣ．ジェジュニ細菌感染を治療、予防、または改善する方法も企図される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１５年１１月５日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５９３１５号の利益を主張するものであり、２０１５年１１月５日に出願された米国特許出願第１４／９３３，７９３号に関連し、この出願は、２０１４年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／０７５，３９９号の利益および２０１５年３月４日に出願された米国仮特許出願第６２／１２７，９３５号の利益を主張するものであり、これらの全体の開示は参照により本明細書に組み込まれている。

（配列表）
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して、ＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含有し、この配列表は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１６年１０月５日に作成され、「１０３２８１ＣＩＰ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と命名され、４．５２キロバイトのサイズである。

（技術分野）
本発明の発明主題は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）（Ｃ．ジェジュニ）に対する免疫応答を誘導することができる免疫原性合成コンストラクトに関する。本発明の発明主題は、免疫原性合成コンストラクトを含む組成物、ならびに被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する方法にも関する。

下痢症は、発展途上国における罹患率および死亡率の主要な原因である。細菌による下痢の主な原因の中には、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、シゲラ種、およびＣ．ジェジュニがある。実際、Ｃ．ジェジュニは、米国で毎年２５０万件の胃腸炎を引き起こし、世界中で４億件超の胃腸炎を引き起こすと推定されている。発展途上国において、Ｃ．ジェジュニ胃腸炎は、主に小児疾患である。Ｃ．ジェジュニ胃腸炎の症状には、下痢、腹痛、発熱、時には嘔吐が含まれる。便は、通常、粘液、糞便白血球、および血液を含むが、水様性の下痢も観察される。この病気は人獣共通感染症であり、野鳥および家畜化された鳥は主要な保有者を代表する。Ｃ．ジェジュニは、主要な食品媒介性感染症であり、ほとんどの場合汚染された家禽に関連している、しかし、主要な発生は、水または生乳の汚染に関連している。

Ｃ．ジェジュニは、胃腸炎を引き起こすことに加えて、炎症性腸症候群、および、ライター症候群として知られる脊椎関節症を含む、いくつかの望ましくない感染後の状態を引き起こす可能性がある。さらに、最近の研究では、Ｃ．ジェジュニの感染と、栄養失調と、資源の乏しい環境での小児の発育阻害との関連が示されている。

Ｃ．ジェジュニ感染症の可能な別の衰弱性合併症は、麻痺を引き起こし得る感染後の多発神経障害であるギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）の発症である（Ａｌｌｏｓ，Ｂ．Ｍ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ１７６（Ｓｕｐｐｌ２）：Ｓ１２５−１２８（１９９７））。Ｃ．ジェジュニは、哺乳動物の細胞に見られる九炭糖であるシアル酸を内因性に合成し得る限られた数の細菌の１つである。Ｃ．ジェジュニとＧＢＳとの関連性は、Ｃ．ジェジュニに存在するリポオリゴ糖類（ＬＯＳ）のシアル酸含有外側コアとヒトのガングリオシドとの間の分子模倣によるものであると報告されている（Ｍｏｒａｎ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘ．Ｒｅｓ．３：５２１（１９９６））。Ｃ．ジェジュニのＬＯＳコアに対するヒト被験体によって生成された抗体は、その被験体の神経組織に対する望ましくない自己免疫応答を引き起こすと考えられている。実際に、研究の結果、カンピロバクターにおけるＬＯＳ合成は、シアル酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を含む、いくつかの遺伝子によって制御されることが示唆されている。シアル酸は、その後、ＬＯＳに組み込まれる。これは、ＧＢＳにおけるＬＯＳおよびヒトガングリオシドの観察された分子模倣と一致する。（Ａｓｐｉｎａｌｌ，ｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１３：１０２９（１９９３）；Ａｓｐｉｎａｌｌ，ｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：２１２２−２１２５（１９９４）；Ａｓｐｉｎａｌｌ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ３３：２４１（１９９４）；Ｓａｌｌｏｗａｙｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６４：２９４５（１９９６））。

Ｃ．ジェジュニは、コロニー形成および侵襲に関与しかつ血清抗体が生成される表面莢膜多糖類（ＣＰＳ）を有するグラム陰性菌である。カンピロバクターゲノム配列の最近の分析により、腸内細菌のタイプＩＩ／ＩＩＩ莢膜遺伝子座に見られるものと同様の莢膜輸送遺伝子の完全なセットが同定された（Ｐａｒｋｈｉｌｌｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０３：６６５（２０００）；Ｋａｒｌｙｓｈｅｖｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５：５２９（２０００））。いくつかの莢膜輸送遺伝子において部位特異的突然変異を引き起こしたその後の遺伝子研究は、その莢膜がＰｅｎｎｅｒの血清型決定スキームの主要な血清型決定因子であることを指摘している（Ｋａｒｌｙｓｈｅｖｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３５：５２９（２０００））。Ｐｅｎｎｅｒのスキームは、カンピロバクターの２つの主要な血清型分類スキームの１つであり、当初はリポ多糖類Ｏ側鎖に基づくと考えられていた（ＭｏｒａｎａｎｄＰｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８６：３６１（１９９９））。以前にＯ側鎖として記載された構造は、実際には多糖類莢膜であると現在考えられている。興味深いことに、Ｃ．ジェジュニの莢膜部分が血清型決定に重要であり、Ｃ．ジェジュニの４７超のＰｅｎｎｅｒ血清型が同定されているにもかかわらず、ほとんどのカンピロバクター下痢症はわずかに限られた数のこれらの血清型によって引き起こされると考えられている。したがって、疫学研究に基づく、Ｃ．ジェジュニのわずかに選択された株のみが、潜在的なワクチン組成物の開発に適した候補株を提供し得る。

蔓延しているＣ．ジェジュニ血清型に関連するいくつかの免疫原性ＣＰＳ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートが作製されている（Ｍｏｎｔｅｉｒｏｅｔａｌ．，（２００９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７７，１１２８−１１３６；Ｂｅｒｔｏｌｏ，Ｌ，ｅｔａｌ．（２０１２）ＣａｒｂｏｈｙＲｅｓ３６６：４５−４９）。ヒト以外の霊長類をＣ．ジェジュニの下痢から保護することができる免疫原性Ｃ．ジェジュニＣＰＳコンジュゲートワクチンが開発されている（Ｍｏｎｔｅｉｒｏｅｔａｌ．，（２００９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７７，１１２８−１１３６、米国特許第９，０８４，８０９号）。米国特許第９，０８４，８０９号には、とりわけ、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて免疫応答を誘導することができるＣ．ジェジュニ株８１−１７６（本明細書では血清型ＨＳ２３／３６とも呼ばれる）の莢膜多糖ポリマーからなる抗Ｃ．ジェジュニ免疫原性組成物について記載されている。この文献は、ＨＳ２３／３６莢膜多糖類が、ガラクトース、３−Ｏ−メチル−６−デオキシ−アルトロ−ヘプトース、およびＮ−アセチルグルコサミンの三糖類を含むこと；具体的には、免疫原性多糖ポリマーが、ＧａｌのＯ−２位にＯ−メチル−ホスホルアミデートを含有する、式［→３）−α−Ｄ−Ｇａｌ−（１→２）−６ｄ−３−Ｏ−Ｍｅ−α−Ｄ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐ−（１→３）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］を有する反復三糖類構造を含むことを教示している。プロトタイプワクチンの見込みおよびヒトの疾患に対するこの微生物の重要性にもかかわらず、Ｃ．ジェジュニに対する認可された市販のワクチンはまだない。したがって、Ｃ．ジェジュニの感染に関連する疾患を予防または改善するための改良された免疫原性組成物および方法が現在なお必要とされている。

第１の態様において、本発明は、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ジェジュニ）に対する免疫応答を誘導することができる免疫原性合成コンストラクトに関する。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。

さらに別の一態様において、本発明は、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導することができる免疫原性合成コンストラクトを含む組成物に関する。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。

さらなる態様において、本発明は、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む免疫原性合成コンストラクトの有効量を被験体に投与することを含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する方法に関する。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。特定の実施形態において、本方法は、免疫原性合成コンストラクトの１回または複数回の追加用量を投与することをさらに含み得る。特定の実施形態において、有効量は、免疫原性合成コンストラクトの約０．１μｇ〜約１０ｍｇの量である。

さらなる態様において、本発明は、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む免疫原性合成コンストラクトを含む組成物の有効量を被験体に投与することを含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する方法に関する。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。特定の実施形態において、本方法は、免疫原性合成コンストラクトの１回または複数回の追加用量を投与することをさらに含み得る。特定の実施形態において、有効量は、免疫原性合成コンストラクトの約０．１μｇ〜約１０ｍｇの量である。

さまざまな追加の態様において、本発明は、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導するのに用いる免疫原性合成コンストラクトに関する。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。別の態様において、本発明は、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導するための免疫原性合成コンストラクトの使用に関する。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。別の態様において、本発明は、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する薬剤の製造における免疫原性合成コンストラクトの使用に関し、前記免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する単糖類を含む。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。

さらなる態様において、本発明は、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導するのに用いる免疫原性合成コンストラクトを含む組成物に関する。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。別の態様において、本発明は、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導するための免疫原性合成コンストラクトを含む組成物の使用に関し、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。別の態様において、本発明は、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する薬剤の製造における、免疫原性合成コンストラクトを含む組成物の使用に関し、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。

さらなる態様において、本発明は、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導するのに用いる免疫原性合成コンストラクトを含む医薬組成物に関する。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。別の態様において、本発明は、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導するための免疫原性合成コンストラクトを含む医薬組成物の使用に関し、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。別の態様において、本発明は、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する薬剤の製造における、免疫原性合成コンストラクトを含む医薬組成物の使用に関し、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む。

さらなる態様において、本発明は、本明細書において詳細に記載されているように、本発明の免疫原性合成コンストラクトを合成する方法を対象とする。

上記態様のさまざまな実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、担体化合物、例えばキャリアタンパク質にコンジュゲートされ得る。特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む。特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、ＣＲＭ_１９７である。

上記態様のさらなる実施形態において、組成物は、医薬組成物である。特定の実施形態において、医薬組成物は、ワクチン製剤である。

特定の実施形態において、医薬組成物およびワクチン製剤は、免疫有効量の１つまたは複数のアジュバントを含み得る。特定の実施形態において、アジュバントは、トール様受容体リガンド、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピドＡ、リポソーム、ならびにそれらの誘導体および組合せからなる群から選択される。さらなる実施形態において、医薬組成物およびワクチン製剤は、１つまたは複数の追加の免疫調節剤を含む。特定の実施形態において、免疫調節剤は、Ｃ．ジェジュニの１つまたは複数の株の抗原、ＥＴＥＣの抗原、赤痢菌リポ多糖類構造、および非コンジュゲートキャリアタンパク質からなる群から選択される物質である。

特定の実施形態において、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する方法は、タンパク質担体にコンジュゲートされたコンストラクトを投与することを含む。特定の実施形態において、タンパク質担体は、ＣＲＭ_１９７である。別の特定の実施形態において、この方法は、免疫有効量の１つまたは複数のアジュバントと共にコンストラクトまたはコンジュゲートを投与することをさらに含む。特定の実施形態において、アジュバントは、トール様受容体リガンド、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピドＡ、リポソーム、ならびにそれらの誘導体および組合せからなる群から選択される。上記態様の特定の実施形態において、被検体は、ヒトである。

別の態様において、本発明は、必要とする被験体におけるＣ．ジェジュニ細菌感染を治療、予防、または改善する方法であって、１つまたは複数の用量の免疫グロブリンを被験体に投与することを含み、前記免疫グロブリンは、前記Ｃ．ジェジュニ細菌の莢膜における１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を認識する、方法を対象とする。一実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌである。

血清型複合体ＨＳ１、ＨＳ３、ＨＳ４、およびＨＳ２３／３６のＣＰＳ反復ブロック、株特異性のあるヘプトース単位、ならびにＯ−メチルホスホルアミデート（ＭｅＯＰＮ）結合を示す図である。略語：「±」、不定比量のＭｅＯＰＮ部分；Ｇａｌ、ガラクトース；Ｇｒｏ、グリセロール；Ｆｒｕ、フルクトース；Ｈｅｐ、ヘプトース；ＧｌｃｐＮＡｃ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン。ＨＳ２３／３６株におけるＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの存在は、本明細書に報告された発見に基づく。ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌコンストラクト（Ｏ−Ｍｅ−ホスホルアミデートガラクトシド）のｐ−メトキシフェニルグリコシド、つまり、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰ、の合成を示す図である（「スキーム１」）。本明細書に示すステップで用いる試薬および条件は、次の通りである：（ａ）ＴｒＣｌ、ピリジン、９５％；（ｂ）ＡｌｌＢｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃、８９％；（ｃ）８０％ＡｃＯＨ、８０℃、７８％；（ｄ）ＰＣｌ_２（Ｏ）ＯＭｅ、Ｅｔ_３Ｎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、その後ＮＨ_３（ｇ）、１９％；（ｅ）ＰｄＣｌ_２、ＭｅＯＨ、３９％。Ｔｒ、トリチル；Ａｌｌ、アリル；ＤＭＦ、ジメチルホルムアミド；ＯＭＰ、４−メトキシフェニル基。ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌコンストラクト（Ｏ−Ｍｅ−ホスホルアミデートガラクトシド）のアミノペンチルグリコシド、つまり、ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２、の合成を示す図である（「スキーム２」）。本明細書に示すステップで用いる試薬および条件は、次の通りである：（ａ）ＣＡＮ、ＣＨ_３ＣＮ、Ｈ_２Ｏ、０℃；その後ＣＣｌ_３ＣＮ、Ｋ_２ＣＯ_３、ＣＨ_２Ｃｌ_２、５７％、２ステップにわたる；（ｂ）ＨＯ（ＣＨ_２）_５ＮＰｈｔｈ、ＴＭＳＯＴｆ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、６５％；（ｃ）８０％ＡｃＯＨ、８０℃、７８％；（ｄ）ＰＣｌ_２（Ｏ）ＯＭｅ、Ｅｔ_３Ｎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、その後ＮＨ_３（ｇ）、２７％；（ｅ）ＰｄＣｌ_２、ＭｅＯＨ、７５％、（ｆ）Ｈ_２ＮＮＨ_２、ＥｔＯＨ、８２％。ＣＡＮ、硝酸セリウムアンモニウム；ＴＭＳＯＴｆ、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート；Ｔｒ、トリチル；Ａｌｌ、アリル；ＯＭＰ、４−メトキシフェニル基；ＯＴＣＡ、トリクロロアセトイミデート。ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌコンストラクト（Ｏ−Ｍｅ−ホスホルアミデートガラクトシド）のアミノペンチルグリコシド、つまり、ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２、の合成のための別のスキームを示す図である（「スキーム２ａ」）。本明細書に示すステップで用いる試薬および条件は、次の通りである：（ａ）ＴｒＣｌ、ピリジン、９５％；（ｂ）ＡｌｌＢｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃、８９％；（ｃ）ＣＡＮ、ＣＨ_３ＣＮ、Ｈ_２Ｏ、０℃；その後ＣＣｌ_３ＣＮ、Ｋ_２ＣＯ_３、ＣＨ_２Ｃｌ_２、５７％、２ステップにわたる；（ｄ）ＨＯ（ＣＨ_２）_５ＮＰｈｔｈ、ＴＭＳＯＴｆ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、６５％；（ｅ）８０％ＡｃＯＨ、８０℃、７８％；（ｆ）ＰＣｌ_２Ｏ_２Ｍｅ_２、Ｅｔ_３Ｎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、その後ＮＨ_３（ｇ）、２７％；（ｇ）ＰｄＣｌ_２、ＭｅＯＨ、７５％、（ｈ）Ｈ_２ＮＮＨ_２、ＥｔＯＨ、８２％。ＣＡＮ、硝酸セリウムアンモニウム；ＴＭＳＯＴｆ、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート；Ｔｒ、トリチル；Ａｌｌ、アリル；ＯＭＰ、４−メトキシフェニル基；ＯＴＣＡ、トリクロロアセトイミデート。ＭｅＯＰＮ→２−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの合成を示す図である（「スキーム３」）。本明細書に示すステップで用いる試薬および条件は、次の通りである：（ａ）ＡｌｌＢｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃、９５％；（ｂ）８０％ＡｃＯＨ、８０℃、９４％；（ｃ）ＢｚＣｌ、ピリジン、９７％；（ｄ）ＰｄＣｌ_２、ＭｅＯＨ、９２％；（ｅ）ＰＣｌ_２（Ｏ）ＯＭｅ、Ｅｔ_３Ｎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２、その後ＮＨ_３（ｇ）、２６％；（ｆ）ＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、７３％。Ａｌｌ、アリル；Ｂｚ、ベンゾイル。いくつかの考えられるＭｅＯＰＮ部分の位置および複数のコンジュゲートワクチンに対する抗体によるＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに対する莢膜交差反応性を示す図である。図６（Ａ）は、Ｃ．ジェジュニのＨＳ２３／３６血清型のＣＰＳにおけるＭｅＯＰＮ−６Ｇａｌ上の考えられるＭｅＯＰＮ修飾単糖類の構造を示している。存在するすべての「Ｒ」基は、ＨまたはＭｅＯＰＮのいずれかを表すことができる、つまり、修飾の各部位（Ｇａｌ−２またはＧａｌ−６）は、ＨまたはＭｅＯＰＮのいずれかと置換することができる。図６（Ｂ）は、Ｃ．ジェジュニの示された血清型であるＨＳ：４、ＨＳ：１、およびＨＳ：３のＣＰＳにおけるＭｅＯＰＮ修飾単糖類の構造を示している。莢膜交差反応性を試験するために、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌのスポットを、示された検出抗ＣＲＭ_１９７コンジュゲート抗血清（右側のブロットに示す）と組み合わせた。データは、Ｃ．ジェジュニのＨＳ２３／３６、ＨＳ４、およびＨＳ１血清型に対する抗体が合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトと反応し得ることを示している。中央カラムに示すように、血清型ＨＳ１（１：５００）、ＨＳ３（１：５００）、ＨＳ４（１：２０００）およびＨＳ２３／３６（１：２０００）のＣ．ジェジュニＣＰＳコンジュゲート抗血清によるＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰ（カラムＡ）およびＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ−（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２（カラムＢ）の免疫検出を示す図である。希釈は、ＴＢＳＴ（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．４２５ＮＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で行った。データは、Ｃ．ジェジュニのＨＳ２３／３６、ＨＳ４、およびＨＳ１血清型に対する抗体が、添加されたリンカーの有無にかかわらず、合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトと反応し得ることを示している。ＨＳ２３／３６多糖類−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチンに対するウサギ抗体が、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを検出したが、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌの異性体を検出しなかったことを示すイムノブロットを示す図である。これらのデータは、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類の免疫原性、および、合成コンストラクトにおけるＧａｌの２位でのメチルホスホルアミデートに対するＧａｌの６位でのＭｅＯＰＮの免疫優性を明確に示している。リンカー付きガラクトシドとキャリアタンパク質ＣＲＭ_１９７（ＣＲＭ_１９７はリボンダイアグラムとして示されている）とのコンジュゲーションを示す図である（「スキーム４」）。本明細書に示すステップで用いる試薬および条件は、次の通りである：（ａ）ジ−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルアジペートエステル、Ｅｔ_３ＮＤＭＳＯ；（ｂ）ＣＲＭ_１９７、７０ｍＭＮａＰｉ、ｐＨ７．０。リンカー付きガラクトシドとキャリアタンパク質とのコンジュゲーションの分析および確認を示す図である：（Ａ）ＣＲＭ_１９７およびＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−ＧａｌＣＲＭ_１９７（化合物１４）のゲル電気泳動；（Ｂ）ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−ＧａｌＣＲＭ_１９７（化合物１４）とＣ．ジェジュニＨＳ２３／３６全細胞抗血清とのウエスタンブロット；（Ｃ）ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−ＧａｌＣＲＭ_１９７（化合物１４）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ−ＣＲＭ_１９７ワクチンが、質量６１，７８１．２０６の主要なピークを与えた。類似のＭＡＬＤＩ実験におけるＣＲＭ_１９７の質量は５７，９６７ダルトンであった（図示せず）。したがって、質量差は約３，８１４ダルトンであった。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌおよびリンカーの質量は４６１ダルトンであるため（データは示さず）、これは、１ＣＲＭ_１９７分子当たり約８個のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ−リンカー部分が添加されたことを示す。ＨＳ２３／３６ＣＰＳコンジュゲート（約１０^３〜１０^４のピーク）および合成ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−ＧａｌＣＲＭ_１９７コンジュゲート１４（約０〜−１０^３のピーク）によって惹起（ｒａｉｓｅｄ）された抗血清を用いたＣ．ジェジュニＨＳ２３／３６細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。０のピークは、二次抗体単独の結合を表す。ＡＰＣ−Ａ、アロフィコシアニン。データは、本発明の合成コンジュゲートワクチンが、Ｃ．ジェジュニＨＳ２３／３６細胞の細胞表面に露出したＣＰＳＭｅＯＰＮ→６−Ｄ−Ｇａｌ結合に特異的な抗体をウサギ中に作る（ｃｏｎｊｕｒｉｎｇ）ことができることを示している。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類コンストラクトの合成およびキャリアタンパク質ＣＲＭ_１９７へのコンジュゲーションの概要を示す図である。Ａｃ、アセチル；ＭＰ、メトキシフェニル；Ａｌｌ、アリル；Ｔｒ、トリチル；Ｐｈｔｈ、フタルイミド。従来の方法を用いて実施される、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの^３１ＰＮＭＲ（Ａ）および^１ＨＮＭＲ（Ｂ）スペクトルを示す図である。従来の方法を用いて実施される、４−メトキシフェニル２−Ｏ−メチル−ホスホラミジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの^３１ＰＮＭＲ（Ａ）および^１ＨＮＭＲ（Ｂ）を示す図である。リンカーを有しキャリアタンパク質ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたデンプン主鎖を用いて化学的に結合した複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を含む本発明の合成ポリマーコンジュゲートの合成を示す図である。複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を含む図１５の合成ポリマーコンストラクトの１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）（Ａ）およびイムノブロット（Ｂ）を示す図である。示すように、図１６（Ａ）は、分子量マーカー、合成コンストラクト、およびキャリアタンパク質のみのレーンを含む。図１６（Ｂ）は、コンストラクトのブロットを示す。ゲルおよびブロットは、実施例７に記載した従来の方法を用いて調製した。図１５の合成ポリマーコンストラクトの^１ＨＮＭＲを示す図であって、Ｃ．ジェジュニＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ合成抗原の修飾された（酸化された）デンプンポリマーへの結合が成功したことを示している。Ｘ軸はｐｐｍである。約４．５ｐｐｍの矢印は、６ＭｅＯＰＮ−β−Ｄ−Ｇａｌ合成抗原のβ−アノマーシグナルを示している；残りの矢印は、リンカーのＣＨ_２シグナルを示している。デンプン主鎖を用いて他の糖類と化学的に結合した複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を含むとともに、リンカーを有しキャリアタンパク質にコンジュゲートされた、本発明の別の合成ポリマーコンストラクトを示す図である。具体的には、示すように、合成ポリマーは、複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−１−Ｆｒｕ単糖類を含む。８１−１７６莢膜トリサッカリドの２つの反復の構造を示す図である（Ａ）。ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの位置が示されている。Ｒ＝ＨまたはＭｅＯＰＮ。図１９（Ｂ）は、８１−１７６の可変ＣＰＳ遺伝子座における遺伝子のカートゥーンを示す図である。８１−１７６の可変ＣＰＳ遺伝子座は、灰色で示されたｋｐｓＣ（ＣＪＪ８１１７６＿１４１３ｃ）とｋｐｓＦ（ＣＪＪ８１１７６＿１４３７ｃ）の間に位置し、２２個の遺伝子を包含する。既知の機能の遺伝子にはラベルが付されている。ＭｅＯＰＮの合成に関与する遺伝子には、ｍｐｎＡ−Ｄというラベルが付され（Ｍａｕｅ，ＡＣｅｔａｌ．２０１３ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．８１：６６５−６７２）、ラベルが付された残りの遺伝子は、ヘプトース合成に関与する。黒色の遺伝子は、２つの推定ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼ、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０およびＣＪＪ８１１７６＿１４３５を表している。本研究で論じた３つの異なるＭｅＯＰＮ関連共鳴（Ｘ、Ｙ、およびＺ）を示す１Ｄ ^３１ＰＮＭＲスペクトルを示す図である。Ａ．１つのＭｅＯＰＮ単位のみを含むＣ．ジェジュニ８１−１７６野生型のＣＰＳ（ピークＹ）。Ｂ．２つのＭｅＯＰＮ単位を含むＣ．ジェジュニ８１−１７６野生型のＣＰＳ（ピークＹおよびＺ）。Ｃ．新しいＭｅＯＰＮＣＰＳ修飾を含むＣ．ジェジュニＣＪＪ８１１７６＿１４３５（３６３６）のＣＰＳ（ピークＸ）。２Ｄ ^１Ｈ−^３１Ｐヘテロ核多重結合相関ＮＭＲ実験からの１Ｄスライスを示す図である。Ａ．ＭｅＯＰＮとガラクトースの２位との間の貫通結合相関（ｔｈｒｏｕｇｈｂｏｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を示すＣ．ジェジュニ８１−１７６野生型のＣＰＳ。Ｂ．ＭｅＯＰＮとガラクトースの６位との間の貫通結合相関を示すＣ．ジェジュニＣＪＪ８１１７６＿１４３５（３４７７）のＣＰＳ。Ｃ．ＭｅＯＰＮと未同定ＣＰＳ位置との間の貫通結合相関を示すＣ．ジェジュニＣＪＪ８１１７６＿１４２０（３６３６）のＣＰＳ。ＨＯＤは、各実験における水ピークの位置を表す。モノクローナルＤＢ３の特徴付けを示す図である。Ａ．ＤＢ３を用いて検出された、野生型８１−１７６およびさまざまな突然変異体の全細胞のドットブロット。Ｂ．ＤＢ３を用いた、野生型、３３９０、および３３９１のフローサイトメトリー。Ｃ．ＤＢ３を用いた、野生型、３６３６、および３６３７のフローサイトメトリー。Ｄ．ＤＢ３を用いた、野生型、３４７７、および３４９８のフローサイトメトリー。Ｂ、Ｃ、およびＤにおいて「２°」というラベルが付されたピークは、二次抗体単独の結合を示す。異なるコンジュゲートワクチンのＭｅＯＰＮレベルの変化を示す図である。Ａ．３つの異なる８１−１７６−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンのＤＢ３ＥＬＩＳＡ。Ｂ．野生型８１−１７６（黒色の棒）およびｍｐｎＣ突然変異体（３３９０；灰色の棒）から精製した莢膜に対するウサギポリクローナル超免疫血清のエンドポイント力価。Ｃ−Ｅ．コンジュゲートＣＣＶ（Ｃ）、ＤＢ４（Ｄ）、およびＣＪＣＶ１（Ｅ）に対するウサギ過免疫血清の結合を、野生型８１−１７６、３３９０、ｍｐｎＣ突然変異体、および３４６９、ｋｐｓＭ突然変異体と比較したフローサイトメトリー。増加する量の正常ヒト血清（ＮＨＳ）に対するＣ．ジェジュニ株の耐性を示す図である。細菌を３７℃で１時間、増加する量のＮＨＳにさらし、生存菌を生菌数で数えた。株のゲノタイプを表１に示す。株３６３６は、ＮＨＳ（Ｐ＜０．０５）の４つの濃度すべてにおいて野生型と有意に異なっていた。株３４７７は、５％ＮＨＳ（Ｐ＜０．０５）、１０％（Ｐ＜０．００５）、および１５％（Ｐ＜０．０５）において野生型よりも血清耐性が有意に低かった。２つの突然変異体３４９８および３６３７の補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）には、ＮＨＳのどの濃度においても野生型との有意差はなかった。二重トランスフェラーゼ突然変異体３４７９は、５％（Ｐ＜０．０００５）、１０％（Ｐ＜０．００５）、および１５％ＮＨＳ（Ｐ＜０．０５）において野生型よりも有意に低かった。８１−１７６多糖類ＣＰＳの構造上の反復の別の描写である。示すように、「ｎ」は、三糖類構造の反復数を表す。野生型８１−１７６ＣＰＳにおけるＭｅＯＰＮとＧａｌの２位（パネルＡ；２９３Ｋ）および６位（パネルＢ；２９３Ｋ）の結合を示す２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣＮＭＲ実験から得られた１Ｄスライスを示す図であり、ＭｅＯＰＮと突然変異体ＣＪＪ８１１７６＿１４３５ＣＰＳにおけるＧａｌの４位（パネルＣ；３１５Ｋ）の結合として以前に未同定のＣＰＳ位置が同定される。突然変異体３７１８由来のＣＰＳの^１Ｈおよび^１３Ｃ共鳴の割当を示す^１Ｈ−^１３ＣＨＳＱＣ実験のスペクトルを示す図である。野生型８１−１７６ならびに突然変異体３４７７、３３９０、および３６３６由来のＣＰＳに対するエンドポイントＥＬＩＳＡ力価を示す図である。突然変異体のゲノタイプを表１に示す。（Ａ）８１−１７６−ＣＲＭ_１９７および突然変異体コンジュゲートワクチンに対するウサギポリクローナル血清の力価。（Ｂ）市販（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のものを購入した５プールのヒト血清の力価。ダイアモンド型のシンボルとして示すプールは、図２４に使用されたプールである。実施例１０に記載される、４−メトキシフェニル４−Ｏ−メチル−ホスホラミジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、化合物Ｄの合成スキームを示す図である。ＰＣｌ_２Ｏ_２Ｍｅ：ジクロロリン酸メチル；Ｅｔ_３Ｎ：トリエチルアミン；ＣＨ_２Ｃｌ_２：ジクロロメタン；Ｂｚ：ベンゾイル。実施例１０に記載される、化合物Ａ、４−メトキシフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを示す図である。実施例１０に記載される、化合物Ｂ、４−メトキシフェニル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｃ_３４Ｈ_３０Ｏ_１０：５９８．１８ｇ／ｍｏｌ）を示す図である。実施例１０に記載される、化合物Ｃ、４−メトキシフェニル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−４−Ｏ−メチル−ホスホラミジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｃ_３５Ｈ_３４ＮＯ_１２Ｐ：６９１．１８ｇ／ｍｏｌ）を示す図である。実施例１０に記載される、化合物Ｄ、４−メトキシフェニル４−Ｏ−メチル−ホスホラミジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｃ_１４Ｈ_２２ＮＯ_９Ｐ：３７９．１０ｇ／ｍｏｌ）を示す図である。ＭｅＯＰＮ→４−β−Ｄ−Ｇａｌ−ＯＭＰの^３１Ｐ共鳴を示す化合物Ｄの^３１ＨＮＭＲ実験を示す図である。過ヨウ素酸酸化で最初に活性化することによる３７１８ＣＰＳのコンジュゲーション、その後、還元的なアミノ化によるＣＲＭ_１９７に対するコンジュゲーションを示す図である。３７１８ＣＰＳの過ヨウ素酸酸化に続く１Ｄ ^３１Ｐを示す図である。第１用量の３７１８−ＣＲＭ_１９７抗原コンストラクト後のウサギ免疫原性研究からのＥＬＩＳＡデータを示す図である。第２用量の３７１８−ＣＲＭ_１９７抗原コンストラクト後のウサギ免疫原性研究からのＥＬＩＳＡデータを示す図である。ＨＳ２３／３６ＣＰＳ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチンで免疫したウサギにおける血清殺菌活性を示す図である。Ｇａｌ−４でのＭｅＯＰＮ結合部位を有する、ＨＳ：２３／３６の新しい可変構造を示す図である。実施例１３に記載される、二糖類含有ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌの作製におけるガラクトシルアクセプター５の合成（スキーム１）を示す図である。ＯＭＰ：４−メトキシフェニル基；ＤＭＰ：２，２−ジメトキシプロパン；ＴｓＯＨ：ｐ−トルエンスルホン酸；ＡｌｌＢｒ：臭化アリル；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ＮａＨ：水素化ナトリウム；ＡｃＯＨ：酢酸；ＣＳＡ：カンファースルホン酸；ＭｅＣＮ：アセトニトリル。実施例１３に記載される、二糖類含有ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌの作製におけるＮＡｃ−グルコサミニルドナー９の合成（スキーム２）を示す図である。ＥｔＳＨ：エタンチオール；ＳｎＣｌ_４：塩化スズ（ＩＶ）；ＣＨ_２Ｃｌ_２：ジクロロメタン；ＳＥｔ：エチルチオール基；ＮａＯＭｅ：ナトリウムメトキシド；ＭｅＯＨ：メタノール；ＡｌｌＢｒ：臭化アリル；ＮａＨ：水素化ナトリウム；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド。実施例１３に記載される、ＭｅＯＰＮ−含有ＧｌｃＮＡｃ−（１→３）−Ｇａｌ二糖類の合成（スキーム３）を示す図である。ＳＥｔ：エチルチオール基；ＮＩＳ：Ｎ−ヨードスクシンイミド；ＴｆＯＨ：トリフルオロメタンスルホン酸（トリフル酸）；ＣＨ_２Ｃｌ_２：ジクロロメタン；ＮａＯＭｅ：ナトリウムメトキシド；ＭｅＯＨ：メタノール；ＰＣｌ_２Ｏ_２Ｍｅ：ジクロロリン酸メチル；Ｅｔ_３Ｎ：トリエチルアミン；ＮＨ３：アンモニア；ＰｄＣｌ_２：塩化パラジウム（ＩＩ）。

本明細書は、本発明を具体的に指摘して明確に請求する特許請求の範囲で締めくくっているが、本発明は以下の説明からよりよく理解されると考えられる。

本明細書で使用されるすべてのパーセンテージおよび比率は、本明細書に別段の指示がない限り、全組成物の重量による。特別の定めのない限り、すべての温度は、セ氏温度である。別の指定がなければ、測定はすべて２５℃、常圧で行った。本発明は、本発明の構成要素も本明細書に記載された他の成分または要素も「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」（オープンエンド）または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」ことができる。本明細書で使用されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載された要素、または構造もしくは機能におけるその同等物、および、記載されていないその他要素（複数可）を意味する。また、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語も、文脈上他の意味を示唆することがない限り、オープンエンドと解釈されるべきである。本明細書で使用されるように、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」は、本発明が請求項に記載された成分以外の成分を含み得るが、その付加的な成分が請求項に係る発明の基本的かつ新規な特徴を実質的に変えない場合に限ることを意味する。

本明細書に記載された範囲はすべて、２つの値の「間」の範囲を示すエンドポイントを含む。「約（ａｂｏｕｔ）」や「一般に（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ）」、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」などの用語は、絶対的なものではないが、従来技術には読めないように用語または値を変更するものと解釈されるべきである。このような用語は、当業者によって理解されるように、状況およびこれらが修飾する用語によって定義される。これには、最低でも、値を測定するのに用いられる与えられた技術の期待実験誤差、技術誤差、および機器誤差の程度が含まれる。別段の指示がない限り、本明細書で使用されるように、「ａ」および「ａｎ」は複数を含み、例えば、「ａＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ」は、少なくとも１つのＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類、および、複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類、つまり、２つ以上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を意味することができる。

本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、２つ以上の項目のリストに使用される場合、列挙された特徴のうちのいずれか１つが存在し得ること、または、列挙された特徴の２つ以上の任意の組合せが存在し得ることを意味する。例えば、Ｃ．ジェジュニに対するワクチン製剤が特徴Ａ、Ｂ、および／またはＣを含むと記載されている場合、Ｃ．ジェジュニに対するワクチン製剤は、特徴Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢの組合せ、ＡとＣの組合せ、ＢとＣの組合せ、またはＡとＢとＣの組合せを含むことができる。本明細書で言及したすべての特許、特許出願その他刊行物の教示内容全体は、まるで本明細書に完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み入れられる。

最近まで、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌは、Ｃ．ジェジュニ株８１−１７６（別名、本明細書では血清型ＨＳ２３／２６と称する）におけるＣＰＳＧａｌ上の唯一のＭｅＯＰＮ部分であると考えられた（Ｋａｎｉｐｅｓｅｔａｌ．，（２００６）ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８，３２７３−３２７９）。しかし、Ｃ．ジェジュニ株ＨＳ２３／３６の遺伝的および構造的分析を行うことにより、本発明者らは、驚くべきことに、ＣＰＳガラクトースのＯ−６位に第２の異なるＭｅＯＰＮ（ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ）を発見し、さらに最近、ガラクトースの４位に第３の異なるＭｅＯＰＮ部分（ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ）を発見した。本明細書で報告されるように、本発明者らは、不定比量で存在するものの、ＭｅＯＰＮ単位を含むＣＰＳエピトープが、重要なＣ．ジェジュニ免疫原性マーカーであることを発見した。さらに、Ｃ．ジェジュニＨＳ２３／３６の天然ＣＰＳを用いてマルチバレントコンジュゲートワクチンの総合的な免疫学的分析を行うことにより、本発明者らは、ＭｅＯＰＮ修飾多糖類が未修飾多糖類に対して免疫原性および免疫優性であることを発見した。さらに、以下に提供されたデータは、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌが、補体媒介性死滅に対する耐性に関与している主要な修飾であると思われることを示している。

上記に鑑みて、本発明は、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導することができる免疫原性合成コンストラクトを対象とする。具体的には、従来の抗Ｃ．ジェジュニ免疫原性多糖類コンストラクトまたはＣＰＳコンジュゲートワクチンとは対照的に、本発明は、１つまたは複数のメチルホスホラミジル単糖類を含むＣ．ジェジュニに対する免疫原性合成コンストラクト、つまり、１つまたは複数のＯ−メチルホスホルアミデート（ＭｅＯＰＮ）部分（ガラクトースの２位、４位、および／または６位のＭｅＯＰＮを含むがこれに限定されない）を含む免疫原性合成コンストラクトを対象とする。

特定の実施形態において、特に本明細書で詳細に記載されているように、Ｃ．ジェジュニに対する合成ＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌコンストラクトの免疫原性および効力が驚くべきことに発見された。したがって、さまざまな態様において、本発明は、１つまたは複数の合成ＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む合成糖類コンストラクト、これらの合成糖類コンストラクトを含む組成物、およびこれらの合成糖類コンストラクトを使用する方法を含む。加えて、本明細書に開示されるＣ．ジェジュニの莢膜におけるＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌエピトープの最近の予想外の発見に鑑みて、本発明は、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ→４Ｇａｌ単糖類を含む合成コンストラクト、これらの合成糖類コンストラクトを含む組成物、および、これらの合成糖類コンストラクトを使用する方法も含む。

本明細書で使用されるように、「単糖類」という用語は、その誘導体を含む、単一糖残基を指す。当業者には理解されるように、オリゴ糖の文脈内で、個々の単量体単位は、ヒドロキシル基を通して別の単糖に結合し得る、単糖である。

特定の実施形態において、本発明の合成糖類コンストラクトは、キャリアタンパク質にコンジュゲートされている。合成コンストラクト（キャリアタンパク質にコンジュゲートされていないまたはコンジュゲートされている）を含む組成物、例えば、ワクチン製剤を含む医薬抗Ｃ．ジェジュニ製剤が、本明細書で企図されている。また、本明細書で企図されているのは、合成コンストラクトならびに／またはコンジュゲートおよび／もしくは非コンジュゲート形態の合成コンストラクトを含む本発明の組成物、例えばワクチン製剤の有効量を被験体に投与することを含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する方法である。

本発明の免疫原性合成コンストラクトおよびコンジュゲートは、精製されたＣ．ジェジュニ莢膜多糖類から作製された従来のコンジュゲートワクチンよりも多数の利点をもたらすと考えられる。例えば、データは、ＭｅＯＰＮ部分がＣ．ジェジュニにおいて相可変（ｐｈａｓｅｖａｒｉａｂｌｅ）であり、したがって、精製された莢膜から得られるワクチン製剤に通常存在するこのエピトープのレベルが変わり得ることを示している。この天然の可変性の結果として、Ｃ．ジェジュニの同じ株に由来する異なる調製物は、このＭｅＯＰＮエピトープの異なるレベル、したがって、異なる免疫原性を有し得る。対照的に、合成アプローチを用いることにより、所望レベルのＭｅＯＰＮエピトープを含む医薬製剤（例えば、ワクチン製剤）を得ることができ、当該医薬製剤は、ワクチンの潜在的な免疫原性が制御され得るという利点を提供する。さらに、本明細書で提供された実施例から明らかなように、本発明の合成Ｃ．ジェジュニ単糖類コンストラクト抗原は、多糖類よりも広いカバレッジを有し、したがって、Ｃ．ジェジュニに対するワクチンに必要な結合価を潜在的に低下させ得る。したがって、本明細書に開示された合成コンストラクトは、単一のエピトープが２つ以上のＣ．ジェジュニ血清型にわたって交差防御するということもあり得るワクチン製剤において有効な抗原として使用され得る抗原決定基であることが、本明細書で企図される。さらに、本発明の合成コンストラクトの使用は、Ｃ．ジェジュニ（潔癖な生物）を増殖させることおよび莢膜を精製することを不要にするため、合成コンストラクトは、費用効率がより高く、したがって、精製されたＣＰＳを使用する他のワクチンと比較して商業上の利益および改善をもたらす。

上記に加えて、本発明の合成コンストラクトは、免疫原性であるのみならず、合成アプローチによって自己免疫の発達に対する懸念がなくなるという利点も持つ、なぜなら、本方法は、ヒトガングリオシドを構造的に模倣する構造であってギラン・バレー症候群をもたらす自己免疫応答を誘導し得る構造をしばしば含むＣ．ジェジュニリポオリゴ糖類（ＬＯＳ）から離れて莢膜の精製を必要としないためである。

当業者に理解されるように、「ＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ」、「ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ」、「ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクト」などの用語は、ガラクトース単糖類を指し、当該ガラクトース単糖類のＯ−６位にＯ−メチルホスホルアミデート部分を含むように修飾されたものである。本明細書で理解されるように、合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトは、ＭｅＯＰＮ部分に加えて他のさまざまな「Ｒ」基を含み得る。この用語は、さまざまな修飾形態、例えば、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰ、つまり、４−メトキシフェニル６−Ｏ−メチル−ホスホルアミデート−α−Ｄ−ガラクトピラノシド；および、リンカーを含む活性型、例えば、ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２、つまり、５−アミノ−ペンタニル６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、のコンストラクトを包含する。同様に、「ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ」などの用語は、ガラクトース単糖類のＯ−２位にＯ−メチルホスホルアミデート部分を含むことを指し、「ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ」などの用語は、ガラクトース単糖類のＯ−４位にＯ−メチルホスホルアミデート部分を含むことを指す。本明細書で理解されるように、合成ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌコンストラクトは、ＭｅＯＰＮ部分に加えて他のさまざまな「Ｒ」基も含み得、当該用語は、例えば、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに関して上で論じたような、さまざまな修飾形態のコンストラクトを包含する。

本明細書で理解されるように、「免疫原性合成コンストラクト」またはより単純に「合成コンストラクト」および同類の用語は、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ジェジュニ）に対する免疫応答を誘導することができる１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む、インビトロ、つまり、化学的に産生された天然に存在しない（「人工の」）化合物を指す。本明細書で使用されるように、「合成」は、単離された場合に通常付随する化合物である、成分、例えば、エンドドキシン、糖脂質、無関係のオリゴ糖などから実質的にまたは本質的に遊離されている物質を指す。特定の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、被験体においてＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘発し得る１つまたは複数のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ単糖類を含む。別の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、被験体においてＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘発し得る１つまたは複数のＭｅＯＰＮ→４Ｇａｌ単糖類を含む。さらに別の実施形態において、免疫原性合成コンストラクトは、被験体においてＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘発し得る１つまたは複数のＭｅＯＰＮ→２Ｇａｌ単糖類を含む。上で論じたように、ＭｅＯＰＮ単糖類は、ＭｅＯＰＮ部分に加えて他のさまざまな「Ｒ」基も含み得る。

本明細書で企図されるように、特定の実施形態において、本発明の免疫原性合成コンストラクトは、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される１つまたは複数の合成ＭｅＯＰＮ単糖類を含む。別の実施形態において、コンストラクトは、１つまたは複数の他の糖類および／または化学的なリンカーと組み合わせて、さらに化学的に関連させ得る。例えば、本発明の合成コンストラクトは、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単独または１つまたは複数の他の単糖類と組み合わせて含み得ることが本明細書において企図される。Ｃ．ジェジュニのＣＰＳに存在する単糖類は、特に、本明細書において、例えば、１つまたは複数のフルクトース、ガラクトース、グルコース、またはヘクトース単糖類であることが企図されており、また、任意選択的に、１つまたは複数のさらなるＭｅＯＰＮ部分、またはＣ．ジェジュニに対する他の抗原と置換される。

以下で詳述されるように、本明細書において、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ→６Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ→４Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ→２Ｇａｌ単糖類を含む合成コンストラクトを有する合成コンストラクトを含む、本発明の合成コンストラクトを活性化しキャリアタンパク質にコンジュゲートし得ること、または、非コンジュゲート形態で使用し得ることが企図される。特定の実施形態において、キャリアタンパク質にコンジュゲートされた場合、その合成コンストラクトを、本明細書において「コンジュゲートワクチン」または「コンジュゲート」と称し得る。

本明細書で使用されるように、「被験体」は、動物（鳥類および哺乳動物を含むがこれに限定されない）を含む。また、この言葉には、人間も包含される。本明細書において特に企図されるように、被験体は、例えば、Ｃ．ジェジュニに感染しているまたは感染する危険があるあらゆる動物またはヒトを含む。被験者は、Ｃ．ジェジュニの曝露に関してナイーブまたは非ナイーブであり得る。特に、適切な被験体（患者）は、家畜（例えば、ニワトリ）ならびに非ヒト霊長類およびヒト患者を含むがこれに限定されない。

本明細書で理解されるように、本発明の合成コンストラクトは、被験体に免疫応答を誘導して被験体におけるＣ．ジェジュニに関連する１つまたは複数の病的状態を予防および／または改善するために、被験体に投与され得る。本明細書で理解されるように、被験体において免疫応答を「誘導する」という概念は、被験体において体液性および／または細胞性免疫応答を引き起こすことを指す。したがって、「免疫刺激を誘発するための十分な量で」または「免疫刺激を刺激するため有効量で」（例えば、調製物に存在するＭｅＯＰＮ部分に対して）などの用語は、特定の抗原調製物の投与の前および後に測定された免疫応答インジケーターの間の検出可能な差を産生することができる量を指す。免疫応答インジケーターは、酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、殺菌アッセイ（例えば、血清殺菌抗体を検出する）、フローサイトメトリー、免疫沈降、Ｏｕｃｈｔｅｒ−Ｌｏｗｒｙ免疫拡散法；例えば、スポット、ウエスタンブロットまたは抗原アレイ；細胞毒性アッセイなどの結合検出アッセイなどのアッセイによって検出されるような、抗体価または特異性を含むが、これに限定されない。

Ｃ．ジェジュニ感染および／またはＣ．ジェジュニに関連する１つまたは複数の病的状態を「治療、予防、および／または改善する」という概念は、例えば、Ｃ．ジェジュニ感染に関連する病的状態の発症または進行を防ぐまたは妨げること、ならびに、Ｃ．ジェジュニに関連する１つまたは複数の病的状態を治癒し、遅らせ、および／またはその重症度を低下させることを包含する。

本明細書で使用されるように、「Ｃ．ジェジュニに関連する１つまたは複数の病的状態」という用語は、Ｃ．ジェジュニによる感染によって引き起こされる被験体における望ましくない状態（「カンピロバクター症」）を指す。本明細書で企図されるように、そのような病的状態は、Ｃ．ジェジュニの感染時に被験体において生じ得る臨床症状および疾患、ならびに、既往のカンピロバクター症の結果として被験体において発症し得る状態を含む。これらの状態は、当業者によく知られており、カンピロバクター胃腸炎、ライター症候群、炎症性腸症候群、およびギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）を含むがこれに限定されない。

例えば、ＭｅＯＰＮの単糖（ｓｉｍｐｌｅｓｕｇａｒ）への制御された合成および導入、得られた合成コンストラクトの活性化、化学的リンカーの添加、ならびにキャリアタンパク質の結合を含む、本発明の合成コンストラクトの合成は、当業者、例えば、炭水化物化学者によく知られている市販の材料および方法を用いて実施し得る。化合物合成の特定の方法（合成スキーム）は、以下の実施例において詳細に説明する。本明細書において、以下の実施例および合成スキームに開示された化合物を合成する方法は、本発明の態様に含まれることが企図される。

当業者に理解されるように、単糖類の化学合成は、炭水化物化学における十分に確立された手順を用いて達成され得る；しかし、開示された合成スキームにおいて出発化合物として使用するための単糖類は、さまざまな商業的供給業者から取得し、当業者によって化学的に修飾して、例えば、本明細書に開示された合成スキーム（しかし、これに限定されない）に従って、本発明の免疫原性合成コンストラクトに到達し得る。公開された化学的修飾は、Ｃｏｍｆｏｒｔ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：３３１９−３３３０（２００７）で提案された４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドの合成方法を含むがこれに限定されない。簡単に述べると、４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドは、Ｄ−ガラクトースから、アセチル化、４−メトキシフェノールによるグリコシド化、その後、公開された方法によるゼンプレーン脱アセチル化によって合成し得る（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｅｔａｌ．（１９４２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６４，６９０−６９４）。

同様に、ＭｅＯＰＮの単糖類への合成および導入のためのさまざまな方法は、当業者によく知られている。例えば、特定の方法は、Ｍａｒａｅｔａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６１８０−６１８３（２０１１）に記載されている。この文献は、ジクロロリン酸エチルとの反応、その後、保護されたアミンとの反応を記載している。

上で論じたように、本発明の合成コンストラクトは、キャリアタンパク質と反応することができる１つまたは複数の化学結合基を付加するために化学的に活性化し得る。本明細書で企図されるように、本発明のコンストラクトの活性化は、当業者によく知られている従来の方法に従って実施し得る。このような方法は、例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボラート（ＣＤＡＰ）やカルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）などのシアン化試薬の使用を含む。また、コンストラクトの活性化は、糖類を２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）と反応させることによって達成され得る。例えば、ＵＳＰｕｂ．Ｎｏ．２０１４／０１４１０３２を参照されたい。

本発明の免疫原性合成コンストラクトは、非コンジュゲート形態で被験体に投与し得るが、本明細書において、合成時に、免疫応答を増強するために投与前に当該コンストラクトを化学的に活性化しインビトロで１つまたは複数のキャリア分子、例えば１つ以上のＴ細胞依存性キャリアタンパク質に化学的にコンジュゲートし得ることが企図される。実際に、当業者に理解されるように、小児は、多糖抗原に直面してＩｇＭ応答のみをマウントすることができ；成人はＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ応答を生成することができる。したがって、キャリアタンパク質を合成コンストラクトに結合することにより、コンストラクトによってインビボで引き起こされる免疫応答は、Ｔ細胞非依存性応答からＴ細胞依存性であるものに変化する。このように、引き起こされる免疫応答は増強され、したがって、その反対の非コンジュゲートコンストラクトによってインビボで産生されるであろうものと著しく異なる。

特定の実施形態において、キャリア分子は、キャリアタンパク質である。本明細書で使用されるように、「キャリアタンパク質」は、特定の実施形態において、理想的には少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むタンパク質またはその類似体もしくは断片を指す。本発明での使用に適したキャリアタンパク質は、当業者によく知られており、市販されており、および／または、従来の方法を用いて当業者により作製および精製され得る。例えば、本発明で使用されるキャリアタンパク質は、免疫学的に有効な担体であり、かつ、被験体に投与する化学的または遺伝的手段によって安全にされた、細菌毒素を含む。例は、ジフテリアトキソイドやＣＲＭ_１９７、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンの結合成分（ＬＴＢ）、大腸菌アドヘシンおよび／または線毛、ならび緑膿菌由来の外毒素Ａなどの不活性化細菌毒素を含むがこれに限定されない。また、例えば、外膜複合体ｃ（ＯｍｐＣ）やポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ−３およびＢＶＨ−１１などの細菌外膜タンパク質も使用され得る。また、その他のタンパク質、例えば、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）や、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）なども使用され得る。

特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、不活性化細菌毒素、細菌外膜タンパク質、炭疽菌の防御抗原（ＰＡ）、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、およびツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）からなる群から選択される。特定の実施形態において、不活性化細菌毒素は、ジフテリアトキソイド、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ_１９７）、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンの結合成分（ＬＴＢ）、大腸菌アドヘシンおよび／または線毛、ならびに緑膿菌由来の外毒素Ａからなる群から選択される。特定の実施形態において、キャリアタンパク質は、不活性化細菌毒素ＣＲＭ_１９７である。別の特定の実施形態において、細菌外膜タンパク質は、外膜複合体ｃ（ＯｍｐＣ）、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ−３、および肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ−１１からなる群から選択される。このようなキャリアタンパク質は、さまざまな商業的供給業者から入手可能である。

また、本明細書において、ＥＴＥＣ由来のタンパク質をキャリア分子として使用することも企図される。考えられるＥＴＥＣタンパク質担体は、熱不安定性エンテロトキシンのＢサブユニット、および線毛サブユニットを含むがこれに限定されない。後者は、さまざまなＥＴＥＣ定着因子のサブユニット、例えば、ＣｆａＩ（ＣｆａＥおよび／またはＣｆａＢ）、ＣＳ６（ＣｓｓＢおよび／またはＣｓｓＡ）、ＣＳ３（ＣｓｔＧおよび／またはＣｓｔＨ）、ＣＳ１７（ＣｓｂＡおよび／またはＣｓｂＤ）、ならびにＣＳ１（ＣｏｏＡ）などを含む。ＥＴＥＣタンパク質のさらなる例および考えられるキャリア分子としてのＥＴＥＣタンパク質の使用に関する詳細は、例えば、ＵＳ２０１５／０２５８２０１Ａ１を参照のこと（この文献の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれている）。

本明細書で企図されるように、キャリアタンパク質は、Ｃ．ジェジュニに対するコンストラクトの免疫原性を増強するために、２つ以上の合成コンストラクトに結合され得る。一実施形態において、複数の合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトが単一のキャリアタンパク質に結合される。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ：ＣＲＭ_１９７比（ｗ／ｗ）が少なくとも８：１以上である本発明のコンジュゲートワクチンが、本明細書において想定される。別の実施形態において、複数の合成ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌおよび／またはβ−ＧｌｃＮＡｃ−（１−３）−［ＭｅＯＰＮ−４］−Ｇａｌコンストラクトが単一のキャリアタンパク質に結合される。特定の実施形態において、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ：ＣＲＭ_１９７比（ｗ／ｗ）が少なくとも８：１以上である本発明のコンジュゲートワクチンが、本明細書において想定される。

コンジュゲーション後、遊離したものとコンジュゲートした糖類コンストラクトは、さまざまな従来の方法を用いて分離され得る。精製方法は、当業者によく知られており、例えば、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および／または硫酸アンモニウム分画を含む。

本発明の活性化単糖類または糖類コンストラクトをキャリアタンパク質にコンジュゲートする考えられる方法は、当業者によく知られており、例えば、以下を含む：結果として生じるアミノ基をアジピン酸リンカー基の一端に結合し、その後、タンパク質をそのアジピン酸リンカー基の他端に結合することを含む単糖類の還元的アミノ化；糖類コンストラクトが、臭化シアン（ＣＮＢｒ）または１−シアノ−４−ジメチルアンモニウムピリジニウムテトラフルオロボラート（ＣＤＡＰ）のいずれかにより活性化されて、シアネート基をヒドロキシル基に導入し、もって、タンパク質成分の添加時にアミノ基またはヒドラジド基と共有結合を形成する、シアニル化コンジュゲーション：カルボジイミドがコンジュゲーション反応の１つの成分上のカルボキシル基を活性化し、活性化されたカルボニル基が他の成分上のアミノ基またはヒドラジド基と反応する、カルボジイミド反応。必要に応じて、これらの反応を用いてコンジュゲーション反応の前にキャリアタンパク質の成分を活性化し得る。本明細書で企図されるように、特定の実施形態において、アミノ基を単糖類に導入し（例えば、末端＝Ｏ基を−ＮＨ_２と置換することにより）、その後、アジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）による誘導体化およびキャリアタンパク質との反応を行うことを含むプロセスを使用し得る。

また、本明細書において、合成コンストラクトをキャリアタンパク質に直接結合し得ることも企図される。タンパク質への直接結合は、従来の方法を用いた、単糖類の酸化とその後のタンパク質による還元的アミノ化とを含み得る。

例えば、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ単糖類、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含む本発明の合成コンストラクトは、さらに、１つまたは複数の追加の糖類、ならびにこれらの１つまたは複数のさらなる化合物、部分、断片、または誘導体を含み得る。さまざまな化合物は、本発明の免疫原性合成コンストラクトのさまざまな成分を結合し、および／または、合成コンストラクト全体を１つまたは複数のキャリアタンパク質に結合するための化学的主鎖としての役割を果たし得る。ポリマーコンストラクトまたはコンジュゲートを作製するのに使用され得る化合物は、例えば、修飾デンプン部分、シクロデキストリン、およびニゲランを含む。

本明細書で特に企図されるように、コンストラクトは、さまざまな理由で、例えば、合成コンストラクトの化学的安定性を増加させるために、および／または、コンストラクトの送達もしくはバイオアベイラビリティを増強するために加え得る追加の糖類、部分、または化合物を含み得る。特定の実施形態において、追加の糖類、部分、および化合物は、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する合成コンストラクトの免疫原性を増強するために、１つまたは複数のリンカーまたは他の化合物を介して、直接的または間接的に、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌコンストラクトと化学的に結合され得ることが、本明細書で企図される。したがって、本発明の合成コンストラクトに使用する追加の糖類は、さまざまなＣ．ジェジュニ株の莢膜に存在する単糖類、例えば、フルクトース、グルコース、ヘプトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルシトールを含む、ガラクトースまたはその他のその修飾形態、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを含むがこれに限定されない１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を有する単糖類を含む、グルコースまたはその修飾形態もしくは誘導体を含むがこれに限定されない。このような糖類は、Ｃ．ジェジュニに対する合成コンストラクトの免疫原性を増強し得る１つまたは複数の他のＭｅＯＰＮ単糖類の量でそれと組み合わせて使用され得る。例えば、図１は、Ｃ．ジェジュニ血清型複合体ＨＳ１、ＨＳ３、ＨＳ４、およびＨＳ２３／３６のＣＰＳ反復ブロック、特異的ヘプトース単位、およびＭｅＯＰＮ結合を列挙する。

上記に鑑みて、以下の実施例に記述のように、図１５は、２つ以上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を含む合成ポリマーコンストラクトを示し、図１８は、２つ以上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類を含むとともに、追加の単糖類ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−１−Ｆｒｕをも含む、合成ポリマーコンストラクトを示す。本明細書において、本発明のコンストラクトまたはコンジュゲートにおけるこれらの追加成分の存在が、Ｃ．ジェジュニに対するコンストラクトまたはコンジュゲートの免疫原性を増強することが企図される。特定の実施形態において、本発明のこれらのおよび他の合成コンストラクトが修飾されて、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌエピトープを含め得ることが、本明細書で企図される。

本明細書で理解されるように、「結合した」は、任意の様式の化学結合を含み、例えば、合成コンストラクトは、ポリマーとして鎖状に化学的に結合した、または、１つもしくは複数の他の糖類のいくつもとさまざまに組み合わせた、数個の合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、および／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ単糖類を含み得る。このようなコンストラクトは、さらに、キャリアタンパク質にコンジュゲートされ得る。

本明細書で企図されるように、本発明の方法は、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導することを対象とし、免疫原性合成コンストラクトの有効量を被験体に投与することを含む。特定の実施形態において、コンストラクトは、活性医薬成分、例えば医薬組成物として、より具体的には、キャリアタンパク質に結合された合成コンストラクトを含むワクチン製剤として、合成コンストラクトを含む組成物の形態で被験体に投与される。したがって、本明細書で使用されるように、「有効量」は、免疫原性合成コンストラクトの単独または組成物中の量を指し得、組成物は、１つまたは複数の他の活性医薬品または賦形剤を有する医薬組成物を含む。

さらに、本明細書中で理解されるように、「有効量」は、被験体において免疫応答を誘発するのに適した免疫原性合成コンストラクト（コンジュゲートまたは非コンジュゲート）の免疫学的に有効な量を指す。上で論じたように、「免疫応答」は、被験体における体液性および／または細胞性免疫応答を引き起こすことを包含する。結果として、被験者にとって意味のある臨床的利益が提供される。このような利益は、例えば、カンピロバクター症または関連する後遺症に関連する１つまたは複数の病的状態を予防し、改善し、治療し、阻害し、および／または低減することであり得る。したがって、本発明の方法は、治療方法、予防および／または防止方法と考えることができる。特定の実施形態において、本発明の免疫原性合成コンストラクトおよび／またはコンジュゲートを被験体に投与して、被験体におけるＣ．ジェジュニに起因する下痢および／または他の形態の胃腸炎を予防し得ることが、本明細書で企図される。

当業者は、本発明の合成コンストラクトの投与が、後でＣ．ジェジュニの感染に見舞われた場合に被験者に免疫を生み出すために、本発明のコンストラクトおよび／または組成物（例えば、ワクチン製剤）の使用を包含することを理解するであろう。しかし、さらに、本明細書において、本発明の合成コンストラクト、コンジュゲート、組成物、ワクチン製剤、および方法が、必ずしもＣ．ジェジュニに対する免疫をすべて提供したりおよび／またはすべての疾患症状を完全に治癒もしくは排除したりするわけではないと理解される。

本発明の免疫原性合成コンストラクトの適切な有効量は、当業者によって容易に決定可能であり、治療する被験体の年齢、体重、種（非ヒトの場合）および医学的状態、ならびに、そのコンストラクトがコンジュゲートまたは非コンジュゲート形態で投与されるかどうかに依存する。当業者には、用量が、経験的に決定され得ることおよび使用されるアジュバントに応じて変わり得ることも理解される。例えば、初期情報は、実験室での実験で収集され、ヒトに対する有効量は、その後、従来の投与試験および日常的な実験を通じて決定される。

本明細書で企図されるように、特定の実施形態において、Ｃ．ジェジュニの感染に対するワクチン接種用のコンストラクトまたはコンジュゲートの有効量は、体重１ｋｇ当たり約１μｇ以下から約１００μｇ以上であり得る。一般的な指針として、本発明のコンストラクトまたはコンジュゲートの適切な量は、アジュバントの有無にかかわらず１投与量当たり約０．１μｇから約１０ｍｇの間の量であり得る。さらに、１回または複数回の追加用量の投与を含む免疫は、アジュバントの有無にかかわらず、１用量当たり約０．１μｇから約１０ｍｇの間の量を用いて実施し得る。

本明細書において、本発明のコンストラクトおよび組成物は、従来の方法に従ってさまざまな経路で被験体に投与されることが企図され、従来の方法は、非経口（例えば、大そう内注射および注入技術による）、皮内、膜貫通、経皮（局所を含む）、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、病巣内、皮下、経口、および鼻腔内（例えば、吸入）の投与経路を含むがこれに限定されない。また、投与は、連続注入またはボーラス注入によるものであり得る。

さらに、本発明の組成物は、さまざまな剤形で投与し得る。これらは、例えば、選択されたｐＨに緩衝され得る滅菌等張水溶液や懸濁液、乳液、粘性組成物などの、非経口、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、または静脈内投与（例えば、注射可能な投与）用製剤を含む、液体調製物および懸濁液を含む。特定の実施形態において、本発明のコンストラクトおよび組成物は、注射剤として被験体に投与されることが企図され、注射剤は、筋肉内、静脈内、皮下、または経皮注射によって送達される注射用組成物を含むがこれに限定されない。このような組成物は、当業者によく知られているさまざまな医薬賦形剤、担体、または希釈剤を用いて製剤され得る。

別の特定の実施形態において、本発明の合成免疫原性コンストラクトおよび組成物は、経口投与され得る。本発明の方法による投与のための経口製剤は、さまざまな剤形、例えば、液剤、散剤、懸濁剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、カプレット、持続放出製剤、または徐放性の製剤もしくは液体が充填された製剤（例えば、ゼラチンで覆われた液体であり、それによってゼラチンが胃の中で溶けて腸に送達される）を含み得る。このような製剤は、当業者によく知られている、さまざまな薬学的に許容される賦形剤を含み得、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムを含むがこれに限定されない。

特定の実施形態において、本明細書では、経口投与用の組成物が液体製剤であり得ることが企図される。このような製剤は、免疫原の粘膜送達を促進する（例えば、胃の内膜と普通よりも長い時間接触することにより）増強された粘度を有する組成物を生成し得る薬学的に許容される増粘剤を含み得る。このような粘性組成物は、当業者によって、従来の方法を使用し、かつ、医薬賦形剤および試薬（例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボマー）を使用して、作製され得る。

鼻腔または呼吸（粘膜）投与に適した（例えば、スクイズスプレーディスペンサー、ポンプディスペンサー、またはエアロゾルディスペンサーの形態の）他の剤形が、本明細書で企図される。また、直腸または膣送達に適した剤形も本明細書で企図される。また、本発明のコンストラクト、コンジュゲート、および組成物は、凍結乾燥もされ得る、また、従来の方法を用いて再水和の有無にかかわらず被験体に送達され得る。

本明細書で理解されるように、本発明の方法は、免疫原性合成コンストラクトを被験体に、さまざまなレジメンに従って、つまり、被験体に臨床的に有意な利益を提供するのに十分な量および方法でかつ十分な時間、投与することを含む。本発明での使用に適した投与レジメンは、従来の方法に従って当業者によって決定され得る。例えば、本明細書では、有効量を、単回用量、数日間にわたって投与される一連の複数回用量、または単回用量とその後の追加用量（例えば、数年後）として被験体に投与し得ることが企図される。本明細書で使用される用語「用量（ｄｏｓｅ）」または「投与量（ｄｏｓａｇｅ）」は、被験体への投与に適した物理的に不連続な単位を指し、各投与量は、所望の応答を生じるように計算された活性医薬成分としての所定の量の合成コンストラクトおよび／またはコンジュゲートを含む。

投与レジメン（例えば、投与する量や治療の回数、単位用量当たりの有効量など）は、施術者の判断次第であり、各被験体に特有である。この点で考慮すべき要因には、被験体の身体的および臨床的状態、投与経路、治療の意図した目標、ならびに、特定のコンストラクト、コンジュゲート、または組成物の効力、安定性、および毒性が含まれる。当業者に理解されるように、「追加用量（ｂｏｏｓｔｉｎｇｄｏｓｅ）」は、初期投与量と同じ投与量または異なる投与量を含み得る。実際に、被験体において所望の免疫応答を生じさせるために一連の免疫が投与される場合、当業者は、この場合、「有効量」が２回分以上の投与量を包含し得ることを理解する。

本明細書で企図されるように、本発明の組成物、特に本発明の医薬組成物およびワクチンは、好ましくは無菌であり、重量または体積の単位で被験体への投与に適した量のコンストラクトおよび／またはコンジュゲートを含む。被験体に投与される組成物の体積（投与量単位）は、投与方法に依存し、当業者によって認識できる。例えば、注射剤の場合、投与される体積は、典型的には、０．１〜１．０ｍｌ、好ましくは約０．５ｍｌであり得る。

当業者に理解されるように、本明細書で使用される「組成物」という用語は、医薬組成物を包含する。本明細書で理解されるように、本発明の「医薬組成物」は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせて、活性剤、例えば、免疫原性合成コンストラクト（キャリアタンパク質にコンジュゲートされていないもしくはコンジュゲートされたもの、またはこれらの組合せ）または抗体調製物を含む。「薬学的に許容される」という用語は、細胞や細胞培養、組織、生物などの生態系と適合する無毒物質を指すのに用いられる。

薬学的に許容される賦形剤、担体、および希釈剤の例は、当業者によく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ｌａｔｅｓｔｅｄｉｔｉｏｎ）、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡで見られ得る。例えば、薬学的に許容される賦形剤は、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、結合剤、安定剤、防腐剤、増量剤、吸着剤、消毒剤、洗浄剤、糖アルコール、ゲル化または増粘添加剤、香味剤、および着色剤を含むがこれに限定されない。薬学的に許容される担体は、タンパク質や多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、トレハロース、脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）、不活性ウイルス粒子などの巨大分子を含む。薬学的に許容される希釈剤は、水、生理食塩水、およびグリセロールを含むがこれに限定されない。

当業者に理解されるように、本発明の医薬組成物に含まれる薬学的に許容される追加の成分の種類および量は、例えば、所望の投与経路、ならびに所望の物理的状態、溶解性、安定性、および組成物のインビボ放出の速度によって変わり得る。例えば、静脈内注射、皮膚注射、皮下注射、または他の注射による投与に対して、ワクチン製剤は、典型的には、適切なｐＨおよび安定性の、発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態であり、等張性ビヒクル、および、薬学的に許容される安定剤、防腐剤、緩衝剤、抗酸化剤、または当業者によく知られている他の添加剤を含み得る。

特定の実施形態において、本発明の免疫原性合成コンストラクトおよび／またはコンジュゲートを単独でまたは他の活性剤および／もしくは薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、ワクチン製剤の形態の医薬組成物が、本明細書に記述のように被験体への投与のために企図される。モノバレントワクチン（例えば、単一の抗原または単一の微生物に対して免疫するため設計される）とポリバレント（またはマルチバレント）ワクチン（例えば、同じ微生物の２つ以上の株に対してまたは２つ以上の微生物に対して免疫するため設計される）の両方が、本明細書で企図される。一実施形態において、本発明のワクチン製剤は、ポリバレント製剤である。特定の実施形態において、本発明のワクチン製剤は、Ｃ．ジェジュニの１つまたは複数の株（血清型ＨＳ２３／３６、ＨＳ１、ＨＳ２、ＨＳ３、ＨＳ４、およびＨＳ５／３１を含むがこれに限定されない）に対するポリバレント製剤であり得る。また、本発明のポリバレント製剤が、Ｃ．ジェジュニの１つまたは複数の株および／または他の細菌株（ＭｅＯＰＮ含有莢膜を有するものを含む）に対するものを対象とし得ることも、本明細書で企図される。

例えば、本明細書に提供されたデータは、Ｃ．ジェジュニのＨＳ２３／３６、ＨＳ４、およびＨＳ１株に対する抗体が、合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトと反応し得ることを示している。したがって、一実施形態において、当業者は、従来の方法を用い、かつ過度の実験をすることなく、Ｃ．ジェジュニの少なくともこれら３つの主要な莢膜型をカバーするべき本明細書に開示された合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトを含むマルチバレントワクチン製剤を開発し得ることが、本明細書で企図される。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを含むマルチバレント合成コンストラクトがＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌおよび／またはＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ部分をさらに含み得ることが、本明細書で企図される。

本発明のマルチバレントワクチン製剤が、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分（例えば、本明細書に開示された）を含む複数の合成コンストラクトを含み得ることも企図される。具体的には、本明細書において、カンピロバクター症の世界的症例の大部分を占めるＣ．ジェジュニの株をカバーする本発明の１つまたは複数の免疫原性合成コンストラクトを含む追加のマルチバレント製剤を開発し得ることがさらに企図される。このような製剤は、例えば、この点に関連するＣ．ジェジュニ株に由来の莢膜単糖類を含むさらなるコンストラクトを合成し、この合成コンストラクトの、そのようなＣ．ジェジュニ株に対する免疫原性（あり得る交差反応性を含む）を検査することによって生成され得る。特定の実施形態において、そのような合成コンストラクトは、例えば、１つもしくは複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ部分、１つもしくは複数のＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ部分、および／または１つもしくは複数のＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ部分を含む、１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を含む１つまたは複数の単糖類を含み得る。本明細書において、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌを含む合成コンストラクトが企図される。

本発明のマルチバレントワクチン製剤は、Ｃ．ジェジュニの２つ以上の株をカバーするため設計された単一の合成コンストラクト、および／または、Ｃ．ジェジュニの単一の特定の株に対して特別に設計された合成コンストラクトを含み得る。さらに、当業者であれば、２つ以上のＣ．ジェジュニ株に対してのみならず２つ以上の細菌の種類（例えば、ＥＴＥＣまたは赤痢菌）に対しても免疫原性である合成コンストラクトを、Ｃ．ジェジュニに対する免疫原性コンストラクトに、それらの追加の細菌に対するさまざまな異なる抗原成分を連結することによって産生し得ることを理解するであろう。例えば、ＵＳ２０１５／０２５８２０１を参照されたい。

本発明のワクチンの製剤は、当該技術分野で広く認められている方法を用いて達成し得る。例えば、免疫学的に有効な量のコンストラクトまたはコンジュゲートワクチンに加えて、本発明の「ワクチン製剤」は、さらに、１つまたは複数の非免疫原性成分、例えば、上で論じたような、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、安定剤、防腐剤、緩衝剤、および消毒剤を含み得る。この目的のために、当業者は、頑強で安定なワクチン製剤の開発が、抗原に安定性をもたらして凝集、タンパク質構造の喪失、および／または酸化や脱アミド化などの化学的分解を防止するさまざまな賦形剤および製剤パラメータを理想的に用いることを理解するであろう。通常の実験および従来の方法を使用する当業者は、本発明の頑強で安定なワクチン製剤の開発によく適している特定のｐＨ、緩衝剤、および安定剤を決定し得る。例えば、Ｍｏｒｅｆｉｅｌｄ，Ｇ．（２０１１）ＴｈｅＡＰＰＳＪｏｕｒｎａｌ，１３：１９１−２００を参照されたい。

加えて、医薬組成物、特に本発明のワクチン製剤は、さらに、免疫有効量の１つまたは複数のアジュバントを含み得る。当業者に理解されるように、アジュバントは、抗原に対する被験体の免疫応答（つまり、体液性および／または細胞性免疫応答）を助ける物質である。アジュバントは、ワクチンの免疫原性効力を増加させるのに使用可能であり、また、ワクチン製剤の安定性を高める能力をも有し得る。したがって、ワクチン製剤にアジュバントを添加することにより、より迅速でより長期の持続的な免疫応答がインビボで可能となり得る。例えば、Ｓｔｉｌｌｓ，ＩＬＡＲＪ（２００５）４６：２８０−２９３（その内容を参照により本明細書に組み込む）を参照されたい。

本明細書で理解されるように、アジュバントの「免疫有効量」は、例えば、ワクチンの有効性を増加させること、および／またはワクチン製剤の安定性を増加させることによって。抗原に対して免疫応答の誘発を助ける量であると理解される。必要とされる量は、アジュバントおよび抗原に応じて変わり得る、かつ過度の実験をすることなく当業者によって認識され得る。

本発明の組成物と共に使用するのに適したアジュバントは、当業者によく知られており、さまざまな商業的供給業者から入手可能である。これらは、例えば、糖脂質；ケモカイン；サイトカインおよびケモカインの産生を誘導する化合物；インターフェロン；ミョウバンやベントナイト、ラテックス、アクリル粒子などの不活性担体；プルロニックブロックポリマー；デポフォーマー；サポニンやリゾレシチン、レチナール、リポソーム、プルロニックポリマー製剤などの表面活性物質；細菌リポ多糖類などのマクロファージ刺激剤；インスリンやザイモサン、エンドトキシン、レバミソールなどの代替経路補体活性剤；非イオン性界面活性剤；ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）トリ−ブロックコポリマー；トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）；細胞壁スケルトン（ＣＷＳ）；完全フロイントアジュバント；フロイント不完全アジュバント；マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ；ＣｐＧオリゴヌクレオチド；ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエーテル、アルミニウム、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（ＰＣＰＰ）、モノホスホリルリピドＡ、ＱＳ−２１、コレラ毒素、およびホルミルメチオニルペプチドを含む。

一実施形態において、アジュバントは、抗原送達システム（例えば、アルミニウム化合物またはリポソーム）、免疫賦活剤（例えば、トール様受容体リガンド）、またはそれらの組合せ（例えば、ＡＳ０１またはＡＳＯ４）からなる群から選択され得る。これらの物質は、当業者によく知られている。特定の実施形態において、本発明の組成物および方法で使用するアジュバントは、トール様受容体リガンド、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピドＡ、リポソーム、ならびにそれらの誘導体および組合せからなる群から選択される。例えば、Ａｌｖｉｎｇ，Ｃ．ｅｔａｌ．，２０１２，ＥｘｐｅｒｔＲｅｖＶａｃｃｉｎｅｓ１１，７３３−４４；Ａｌｖｉｎｇ，Ｃ．ｅｔａｌ．（２０１２）ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ２４，３１０−５；ＡｌｖｉｎｇＣ．ａｎｄＲａｏ，Ｍ，（２００８）Ｖａｃｃｉｎｅ２６，３０３６−３０４５；ＵＳ６，０９０，４０６；ＵＳ５，９１６，５８８を参照されたい。

免疫原性合成コンストラクトおよび／またはコンジュゲートに加えて、本発明の組成物は、さらに、１つまたは複数の他の活性医薬成分（追加の免疫調節剤を含むがこれに限定されない）を含み得る。本明細書で理解されるように、免疫調節剤は、被験体の免疫系を誘導し、増強し、活性化し、または刺激することができる物質である。これらの免疫調節剤は、例えば、Ｃ．ジェジュニの１つまたは複数の株の抗原、ＥＴＥＣの抗原、赤痢菌リポ多糖類構造、および非コンジュゲートキャリアタンパク質からなる群から選択される物質を含む。（例えば、ＵＳ２０１５／０２５８２０１Ａ１を参照されたい）。それらは、過度の実験をすることなく当業者によって容易に認識される免疫有効量において使用し得る。

さらに、本発明の組成物およびワクチンは、単独で、または、他のワクチンおよび／もしくは他の治療剤もしくは免疫調節剤と組み合わせて、投与され得る。このような追加のワクチンおよび薬剤は、任意の様式で、例えば、本発明の免疫原性合成コンストラクトおよび組成物の前、後、または同時に、被験体に投与され得る。それらは、過度の実験をすることなく当業者によって容易に認識される免疫有効／治療有効量において使用し得る。

本明細書に記載の免疫原性合成コンストラクトは、Ｃ．ジェジュニに対する免疫原性製剤（例えば、ワクチン製剤）に含めることができ、また、Ｃ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導するために被験体に投与することができる。したがって、本発明は、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する方法であり、特に、カンピロバクター腸炎に関連する胃腸障害および他の衰弱作用からの防御免疫を提供する、被験体において免疫応答を誘導する方法を企図している。

一例として、本発明の方法は、本発明の１つまたは複数の合成コンストラクトを含む免疫原性組成物を投与することを含み、当該コンストラクトは、任意選択的に、キャリア分子、好ましくは、ＣＲＭ_１９７のようなキャリアタンパク質分子にコンジュゲートされていることが本明細書で企図される。この方法は、さらに、第１のステップで投与されたのと同じ免疫原を含む組成物の１回または複数回の追加用量を投与することを含む１つまたは複数の後続するステップをさらに有し得る。

当業者に理解されるように、ヒトにおいて防御免疫を誘導する最適な方法の前に、マウスやサルなどの動物における研究が先行する。したがって、本発明の合成コンストラクトを含む各ワクチン製剤に対して、限られた量の実験が、最適な有効用量範囲を確認するのに必要である。例えば、一実施形態において、免疫原性合成コンストラクトの単位用量の範囲は、さまざまな緩衝液で、１用量あたり約０．１μｇ〜１０ｍｇであり得ることが、本明細書で企図される。任意選択的に、初回用量（ｐｒｉｍｉｎｇｄｏｓｅ）に続いて、緩衝水溶液中約０．１μｇ〜１０ｍｇの免疫原の単位用量範囲で、１回または複数回、例えば２〜４回の追加用量を投与し得る。

したがって、Ｃ．ジェジュニに対する被験体における免疫応答を誘導する方法は：（ａ）本発明の１つまたは複数の合成コンストラクトを含む免疫原性組成物を投与するステップであって、コンストラクトは、キャリア分子、好ましくはキャリアタンパク質分子にコンジュゲートされており、組成物は、アジュバントの有無にかかわらず１用量当たり約０．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で投与される、ステップと、（ｂ）任意選択的に、アジュバントの有無にかかわらず、１用量当たり約０．１．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で、ステップ（ａ）に記載された組成物の追加用量を投与するステップとを含む。

投与経路に応じて、本明細書に記載されたものなどのいくつかのアジュバントのいずれかの有無にかかわらずワクチン製剤を投与し得ることが、本明細書で企図される。投与される免疫有効量のアジュバントの量は、特定のアジュバントに応じて変わり得る、かつ過度の実験をすることなく当業者によって確認され得る。

さらに、本明細書で論じたように、本方法は、キャリアタンパク質にコンジュゲートされている合成コンストラクトを用いて、または、非コンジュゲート合成コンストラクトを用いて実施され得る。本方法は、上で論じたいくつかのキャリア分子のいずれかの使用を含み得る。一例として、ＣＲＭ_１９７を使用し得る。また、ＥＴＥＣタンパク質を、上で論じたように、例えばＵＳ２０１５／０２５８２０１Ａ１に開示されているように、キャリアタンパク質として使用し得る。

コンストラクト：キャリアタンパク質比（ｗ／ｗ）は、１：１、または、２つ以上のコンストラクトが、単一のキャリアタンパク質に、例えば、２：１から１０：１以上、特に少なくとも８：１で結合するようなものであり得る。当業者には理解されるように、単一キャリア分子は、多数の合成コンストラクト、例えば、１キャリア分子当たり数百または数千のコンストラクトにコンジュゲートされ得る。過度の実験を行うことなく、当業者であれば、被験体における免疫応答を誘導および／または増強するのに最適な適切な比率を認識し得る。

実際、本明細で企図されるように、当業者は、２つ以上のＭｅＯＰＮ修飾単糖類を含むコンストラクトおよびコンジュゲートを有する合成コンストラクト、アジュバント、キャリアタンパク質、追加の免疫調節剤、および投与経路の異なる組合せを使用することによって、本発明の方法に使用する合成コンストラクトの免疫原性を最適化し得る。例えば、Ｃ．ジェジュニのみならず他の細菌病原体に対しても免疫原性が増強されたコンストラクトを産生するために、異なるＥＴＥＣタンパク質を、本発明の免疫原性合成コンストラクトとさまざまに組み合わせて使用し得ることが、本明細書で企図される。この目的のために、ＵＳ２０１５／０２５８２０１Ａ１の教示内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれている。さらに、本発明の組成物、例えば、医薬製剤、特に本発明のワクチン製剤は、さまざまな様式で投与、例えば、経口投与、経鼻投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、筋肉内投与、または直腸投与し得る。被験体において免疫応答を生成するのに最も適した投与方法および投与レジメンは、従来の方法を用い、かつ過度の実験をすることなく、当業者によって認識され得る。

本発明は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを含むがこれに限定されない、Ｃ．ジェジュニの莢膜に見られる１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分に対する抗体調製物をさらに提供する。さまざまな実施形態において、抗体調製は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、マウスモノクローナルＩｇＧ抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、その断片、またはその組合せからなる群からの任意のメンバーを含み得る。本発明は、本明細書に記載された任意のＭｅＯＰＮ部分に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞をさらに企図する。特定の実施形態において、本発明は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、またはＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに対するモノクローナル抗体を対象とする。

別の実施態様において、本発明は、１つまたは複数の抗−ＭｅＯＰＮ抗体またはその機能的断片、および生理的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物を提供する。特定の実施態様において、本発明は、１つまたは複数のＣ．ジェジュニ血清型に対する受動免疫または治療を提供する方法における使用のための、抗体および生理的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用されるように、「受動免疫」は、被験体に対する抗体の投与を指し、それによって抗体が異なる被験体（同じおよび異なる種の被験体を含む）中に生成され、抗体が細菌の表面に結合し、細菌の貪食または死滅が引き起こされる。

本発明の医薬組成物および組成物は、従来の方法を用いて当業者によって調製され得る。例えば、本発明の１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分および／または合成コンストラクトに対する抗血清は、１３週にわたる３〜４皮下注射によってニュージーランドホワイトウサギにおいて生成され得る。免疫前に放血させることにより、各ウサギから約５ｍＬのベースライン血清を生成し得る。例えば、抗原の初回注射は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のエマルジョンとして投与し得る。続く注射は、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）において３週間隔で与え得る。ウサギは、３回目の免疫後の１週目から始めて２週ごとに放血させ得る。ウサギ１個体当たり約２５〜３０ｍＬの血清を、各放血イベントから生成し、−８０℃で凍結し得る。血清は、従来の方法を用いて、対応するＭｅＯＰＮ／合成コンストラクトまたはＭｅＯＰＮを含有する精製された多糖類莢膜に対してＥＬＩＳＡによって分析し得る。加えて、後の放血からの抗血清は、従来の方法を用いて親和性精製され得る。

本発明の薬学的な抗体組成物が、それを必要とする被験体におけるＣ．ジェジュニ感染に対して受動免疫を提供する方法に使用し得ることが、本明細書で企図される。したがって、特定の実施形態において、本発明は、本発明の薬学的な抗体組成物の有効量を被験体に投与することによって、被験体におけるＣ．ジェジュニの１つまたは複数の株または血清型による感染を予防し、治療し、または改善する方法を含む。本明細書で理解されるように、有効量は、被験体の年齢、体重、および種などの因子に応じて変わり得る。一般に、抗体の投与量は、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。特定の実施形態において、抗体は、ＩｇＧまたはＩｇＡクラスのヒト化抗体である。

本発明の医薬組成物および抗体の投与が、予防（Ｃ．ジェジュニ感染に対する予測される曝露の前）または治療（感染の開始後、例えば、症状の発症時または直後）のいずれかであり得ることが当業者には理解される。投与は、例えば、上で論じたような投与の経口または全身性の方法、例えば、皮下、筋肉内または静脈内法を含み得る。

また、本発明は、免疫有効量の本発明の免疫原性合成コンストラクトおよび／または組成物を含むキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、コンジュゲートワクチンと、当該コンジュゲートワクチンを被検体に投与するための説明書とを含み得る。別の実施形態において、キットは、本明細書に記載されるような、抗体組成物を含み得る。また、キットは、任意選択的に、有効量の１つまたは複数の他の治療剤または免疫調節剤も含み得る。キットは、任意選択的に、１つまたは複数の診断ツールおよび使用説明書を含み得る。例えば、２つ以上のワクチンを含む組成物を含み得る、または、異なるワクチン、抗体もしくは治療剤を含有する別々の医薬組成物を含み得る。また、キットは、段階または連続投与のためのコンジュゲートワクチンおよび／または抗体の別々の用量を含み得る。キットは、組成物を投与するための説明書と共に、適切な送達デバイス（例えば、注射器や吸入デバイスなど）を含み得る。キットは、任意選択的に、保管、再構成（該当する場合）、および含まれる任意またはすべての治療薬の投与のための説明書を含み得る。キットは、被験体に与える投与回数を反映する複数の容器を含み得る。キットが第１および第２の容器を含む場合、複数の容器が存在し得る。

本明細書では特定の実施形態を参照して本発明を説明してきたが、当然のことながら、これらの実施形態および本明細書で提供される実施例は、単に本発明の原理および適用を反映したものにすぎない。したがって、当然のことながら、説明に役立つ実施形態および実施例に対して多くの変更を行うことができ、また、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の構成を考案することができる。本明細書で引用したすべての特許出願、特許、文献、および参考文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれている。

ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌコンストラクトのｐ−メトキシフェニルおよびアミノペンチルグリコシド：ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰおよびＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２の合成
以前、従来の方法および質量分析を用いて、Ｃ．ジェジュニ８１−１７６ＣＰＳのガラクトースの２位（ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ）で不定比ＭｅＯＰＮ単位を検出し、^３１Ｐ共鳴は図２０Ａに示すものと同様であった（ピークＹ）（ＫａｎｉｐｅｓＭＩ，ｅｔａｌ．（２００６）．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：３２７３−３２７９）。^１Ｈ−^３１Ｐ相関実験におけるＭｅＯＰＮの^３１Ｐ共鳴Ｙ（δ_Ｐ１４．４５）とガラクトース単位のＨ−２（δ_Ｈ４．５２）との間のクロスピークの検出により、このＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ結合をＮＭＲにより確認した（図２１Ａ）。いくつかの８１−１７６ＣＰＳ調製物において、より低い強度ではあるが、^３１ＰＮＭＲスペクトルは、δ_Ｐ１４．１５（指定ピークＺ）で追加の共鳴を提示した（図２０Ｂ）。また、同様のピークが、ＭｅＯＰＮのリンとＣＰＳガラクトース単位のいくつかのＨ−６共鳴との間にクロスピークを示した別の８１−１７６ＣＰＳ調製物（遺伝子ＣＪＪ８１１７６＿１４２０における突然変異体）において観察された（ＭｅＯＰＮのメチル共鳴の非常に近くで共鳴した）（δ_Ｈ３．７５から３．８１）（図２１Ｂ）。ＮＭＲデータは、８１−１７６のピークＺが、ガラクトースの６位のＭｅＯＰＮ（ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ．）の不定比配置に対応することを示唆した。これらのデータおよびさらなる遺伝子研究は、以下の実施例８でより詳細に述べられる。

プロトタイプ合成単糖類抗Ｃ．ジェジュニワクチンの可能性を試験するために、ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌコンストラクトのｐ−メトキシフェニルおよびアミノペンチルグリコシド、つまり、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰおよびＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２をそれぞれ合成した。具体的には、以下に示すとともに図２および図３に示すように、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐコンストラクトを、ｐ−メトキシフェニル（ＯＭＰ）グリコシド、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰ（図２、スキーム１）として合成し、その後、キャリアタンパク質へのコンジュゲーションのために、Ｃ−１でアミノペンチルリンカーを備えさせて、（βアノマーとして）ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２としてもよい（図３、スキーム２）。

要約ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの合成（図２、スキーム１）：
ＭｅＯＰＮは、弱酸性媒質で容易に除去され得るため、このような条件を回避する適切な合成方法が必要であった。出発化合物として、４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドを公開された方法に従って合成した。（Ｃｏｍｆｏｒｔ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：３３１９−３３３０（２００７）を参照されたい）。簡単に述べると、４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドは、Ｄ−ガラクトースから、アセチル化、４−メトキシフェノールによるグリコシド化、その後、公開された方法によるゼンプレーン脱アセチル化によって合成された（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｅｔａｌ．（１９４２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６４，６９０−６９４）。

４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物１）から出発して、６位にトリチル基を選択的に導入した。当初は、化合物２に対してベンゾイル化を行ったが、ＭｅＯＰＮの導入中に広範な移動が観察されたことから、より適切な保護基の解明が必要とされた。こうして、Ｃ−２、Ｃ−３、およびＣ−４位を保護するためにアリル基を選択した（これは移動に耐性があった）。その後、アリル基を接触水素化分解で脱保護して化合物３を得、これがＭｅＯＰＮ修飾に適合することが判明した。次に、トリチル基を除去して、修飾のために６−ＯＨを露出させた化合物４を得た。

ＭｅＯＰＮの導入のための戦略は、公開された方法に類似する（Ｍａｒａｅｔａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６１８０−６１８３（２０１１）を参照されたい）。化合物４をトリエチルアミンの存在下で市販のジクロロリン酸メチルで処理した後、アンモノリシスを行った。新たに導入したＭｅＯＰＮの二重キラル性質（ｄｕａｌｃｈｉｒａｌｎａｔｕｒｅ）のために、２つのジアステレオ異性体の混合物として生成物５を集めた。^３１ＰＮＭＲは、生成物５が実際に２つのジアステレオ異性体の１：１混合物であり、１０．５ｐｐｍで２つのリンシグナルを示すことを確認できた。また、^１ＨＮＭＲは、２つのアノマーおよび２つのＯＣＨ_３シグナルを有する二組のシグナルを明らかにした（データは示さず）。

この反応により、副生成物の混合物が得られ、最も豊富なものは、第２のＮＨ_２によるＯ−メチル基の置換であった。塩化パラジウム（ＩＩ）によるアリル基の除去は、生成物６を生成した。化合物５と同様に、ジアステレオ異性体の混合物が^１Ｈおよび^３１ＰＮＭＲによって観察された（図１３）。従来の方法を用いて実施される、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの^３１ＰＮＭＲ（Ａ）および^１ＨＮＭＲ（Ｂ）スペクトルを示す図１３を参照されたい。

２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣＮＭＲ実験は、ＭｅＯＰＮがＯ−６位に導入され、リンシグナルとＨ−６およびＯＣＨ_３の両シグナルとの間に相関シグナルを示すことを確認できた。

要約ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２の合成（図３、スキーム２）：
ＭｅＯＰＮ修飾の方法の設計に成功した後、ワクチンコンジュゲートを作製するために、コンストラクトをリンカーに結合した。まず、４−メトキシフェニル（ＯＭＰ）をガラクトシド（図２の化合物３）から除去した。対応するヘミアセタールをトリクロロアセトイミデート供与体（化合物７）に変換した。その後、５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニルリンカーを、０℃で活性剤としてＴＭＳＯＴｆと共に導入した。化合物８を、βアノマーで６５％、αアノマーで２９％集めた。トリチル基の除去により、ＭｅＯＰＮの導入のための遊離ヒドロキシル基を有する化合物９が得られた。上記の手順を用いて、ホスホルアミデート（化合物１０）を２つのジアステレオ異性体の混合物として回収した。その後、アリルおよびフタルイミド保護基を除去して、化合物１１、それから化合物１２を得た。

材料および方法
化合物は、従来の方法を用いて合成し、すべての化学物質は、商業的供給業者から購入し、受け取ったまま使用した。分子篩は、加熱マントルにより減圧下で加熱することによって活性化した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＴＬＣシリカゲルＦ_２５４上で実施した。糖化合物は、ＵＶ光によってまたはエタノール中の１０％Ｈ_２ＳＯ_４による炭化によって可視化した。フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲルＰ６０（４３〜６０μｍ、２３０〜４００メッシュ）で行った。^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ４００または６００ＭＨｚ分光計（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓＩｎｃ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて記録した。残りの非重水素化溶媒のプロトンシグナル（ＣＨＣｌ_３に対してδ７．２４ｐｐｍ）を^１Ｈスペクトルの内部基準として使用した。^１３Ｃスペクトルに関して、化学シフトは溶媒（ＣＤＣｌ_３に関してδ７７．１ｐｐｍ）と比較して報告される。化学シフトは、百万分率（ｐｐｍ）で報告される。結合定数は、ヘルツ（Ｈｚ）で報告される。次の略語は、多重度を示すのに使用される：ｓ、一重項；ｄ、二重項；ｔ、三重項；ｍ、多重項。旋光度は、ルドルフリサーチオートポール３自動偏光計（ＲｕｄｏｌｐｈＲｅｓｅａｒｃｈＡｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｈａｃｋｅｔｔｓｔｏｗｎ、ＮＪ）で測定し、また濃度（ｃ）は、ｇ／１００ｍｌで表す。合成化合物の高分解能質量スペクトルは、電子スプレーイオン化質量分析（飛行時間分析器）によって記録した。

４−メトキシフェニル６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物２）：
ピリジン（４０ｍＬ）に溶解した化合物１（２．７ｇ、９．３ｍｍｏｌ）の溶液に塩化トリチル（３．１ｇ、１１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を６０℃で３日間撹拌した。その後、反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して化合物２を得た（４．７ｇ、９５％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.44-7.20 (m, 15H, Ar-H); 7.11-6.83 (m, 4H, MeOC₆H₄); 5.51 (d, 1H, J = 3.6 Hz, H-1); 4.05-3.93 (m, 4H, H-2, H-3, H-4, H-5); 3.79 (s, 3H, OCH₃); 3.54-3.32 (m, 2H, H-6.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 155.3, 151.2, 150.6, 144.3, 143.8, 143.7, 143.6, 129.1, 128.6, 128.0, 127.9, 127.8, 127.5, 127.3, 127.1, 127.0, 118.5, 117.9, 114.6, 114.5, 114.4 (Ar); 98.4 (C-1); 87.0, 71.2, 70.0, 69.3 (C-2, C-3, C-4, C-5); 63.6 (C-6); 55.6 (CH₃.)HRMS (ESI): C₃₂H₃₂O₇ [M+Na]⁺の計算値: 551.2046, 実測値: 551.2021.

４−メトキシフェニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物３）：
臭化アリル（４．６ｍＬ、５３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解した化合物２（４．７ｇ、８．８ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。鉱油中の水素化ナトリウム、６０％分散液（１．２ｇ、２９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。その後、反応をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）でクエンチし、氷冷水（１００ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濃縮した。１：７ＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、化合物３（５．１ｇ、８９％）を得た。［α］_Ｄ ^２５＝＋１３２．６°（ｃ＋０．１、ＣＨＣｌ_３）；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.38-7.18 (m, 15H, Ar-H); 7.10-6.75 (m, 4H, MeOC₆H₄); 6.00-5.53 (m, 3H, CH₂-CH=CH₂); 5.42 (d, 1H, J = 3.2 Hz, H-1); 5.33-4.98 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.37-3.72 (m, 13H, CH₂-CH=CH₂, H-2, H-3, H-4, H-5, OCH₃); 3.38 (m, 1H, H-6a); 3.01 (m, 1H, H-6b.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 155.0, 151.0, 143.9 (Ar); 135.2, 135.1, 135.0 (CH₂-CH=CH₂); 128.6, 127.8, 127.0, 119.0, 117.4, 117.3, 116.4, 114.4 (CH₂-CH=CH₂, Ar); 97.5 (C-1); 86.8; 78.2 (C-2); 77.4 (C-4); 76.1 (C-5); 73.9, 72.5, 71.9 (CH₂-CH=CH₂); 70.4 (C-3) 63.3 (C-6); 55.6 (OCH₃.)HRMS (ESI): C₄₁H₄₄O₇ [M+Na]⁺の計算値: 671.2985, 実測値: 671.2970.

４−メトキシフェニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物４）：
８０％水性ＡｃＯＨ（５ｍＬ）中の化合物３（３００ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の溶液を８０℃で１．５時間撹拌した。反応混合物を濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（１：６ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して化合物４（１４７ｍｇ、７８％）を得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.02-6.78 (m, 4H, MeOC₆H₄); 5.95-5.89 (m, 3H, CH₂-CH=CH₂); 5.50 (d, 1H, J = 3.5 Hz, H-1); 5.35-5.12 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.42 (dd, 1H, J₁ = 3.2 Hz, J₂ = 9.3 Hz, H-3); 4.27-3.89 (m, 10H, CH₂-CH=CH₂, H-2, H-4, H-5, OH); 3.81 (m, 1H, H-6a); 3.74 (s, 3H, OCH₃); 3.70 (m, 1H, H-6b.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 155.1, 150.9 (Ar); 135.0, 134.9 (CH₂-CH=CH₂); 118.6, 118.0, 117.4, 116.6, 114.5 (CH₂-CH=CH₂, Ar); 97.5 (C-1); 78.2, 75.9, 74.0, 72.6, 72.0, 71.0 (CH₂-CH=CH₂, C-2, C-3, C-4, C-5); 62.7 (C-6); 55.6 (OCH₃.)HRMS (ESI): C₂₂H₃₀O₇ [M+Na]⁺の計算値: 429.1890, 実測値: 429.1891.

４−メトキシフェニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−メチル−ホスホルアミデート−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物５）：
分子篩でＣＨ_２Ｃｌ_２（３ｍＬ）に溶解した化合物４（６５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）およびジクロロリン酸メチル（１５０μＬ、１．３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（１７５μＬ、１．３ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を室温で５時間撹拌した。ＴＬＣで判断して反応が完了したら、アンモニアガスを針を通して反応混合物に注入した。１０分後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、化合物５を得た（１５ｍｇ、１９％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.04-6.77 (m, 4H, MeOC₆H₄); 5.99-5.85 (m, 3H, CH₂-CH=CH₂); 5.48 (2d, 1H, J = 3.6 Hz, H-1); 5.36-5.10 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.41 (m, 1H, H-3); 4.29-4.10 (m, 8H, CH₂-CH=CH₂, H-2, H-4); 3.95-3.86 (m, 3H, H-5, H-6); 3.73 (s, 3H, OCH₃); 3.57 (2d, 3H, J = 11.4 Hz, OCH₃); 2.75, 2.56 (2d, 2H, NH₂.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 155.2, 155.0, 150.9 (Ar); 135.0, 134.9 (CH₂-CH=CH₂); 128.9, 128.3, 118.8, 118.5, 117.7, 117.5, 117.4, 116.6, 114.5, 114.4 (CH₂-CH=CH₂, Ar); 97.6, 97.2 (C-1); 78.1, 75.8, 74.4, 74.0, 72.7, 71,9, 70.5, 70.4, 70.0, 69.9, 68.5, 65.5, (CH₂-CH=CH₂, C-2, C-3, C-4, C-5, C-6); 55.7, 53.3, 53.2 (OCH₃.)HRMS (ESI): C₂₃H₃₄NO₉P [M+H]⁺の計算値: 500.2050, 実測値: 500.2035.

４−メトキシフェニル６−Ｏ−メチル−ホスホルアミデート−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物６）：
ＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した化合物５（１７．０ｍｇ）の溶液にＰｄＣｌ_２（５．０ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で３時間撹拌した。その後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（純粋なＥｔＯＡｃ）で精製して、化合物６を得た（５．１ｍｇ、３９％）。¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 6.98-6.80 (m, 4H, MeOC₆H₄); 5.39 (2d, 1H, J = 3.6 Hz, H-1); 4.13 (m, 1H, H-3); 4.01-3.85 (m, 4H, H-4, H-5, H-6); 3.78 (m, 1H, H-2); 3.63 (OCH₃); 3.41 (2d, 3H, J = 11.4 Hz, OCH₃.) ¹³C NMR (100 MHz, D₂O): δ 154.6, 150.0, 149.9, 119.3, 119.1, 114.9 (Ar); 98.1, 97.9 (C-1); 70.3, 70.2, 70.0, 69.1, 68.8, 67.8, 65.8 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-6); 55.6 (OCH₃); 53.6, 53.5, 53.4 (OCH₃.)HRMS (ESI): C14H23NO9P [M+H]⁺の計算値380.1111; 実測値 380.1110.

２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−−α，β−Ｄ−ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート（化合物７）：
ＣＨ_３ＣＮ（４８０ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（１２０ｍＬ）に溶解した化合物３（５．０ｇ、７．７ｍｍｏｌ）の溶液に、硝酸セリウムアンモニウム（１２．８ｇ、２３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃で２０分間撹拌した。その後、混合物をブライン（２００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（１：６ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製した。得られたヘミアセタール（３．３ｇ、６．１ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（１２０ｍｌ）に溶解し、ＣＣｌ_３ＣＮ（３１０μＬ、３０ｍｍｏｌ）およびＫ_２ＣＯ_３（４２０ｍｇ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した後、セライト（登録商標）で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（体積１％Ｅｔ_３Ｎを含む１：４ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、化合物７をα，β−混合物として得た（３．６ｇ、２ステップで５７％）（化合物７Ａ、７Ｂ）。

７Ａ：¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.52 (s, 1H, NH); 7.42-7.18 (m, 15H, Ar-H); 6.46 (d, 1H, J = 3.6 Hz, H-1); 6.00-5.61 (m, 3H, CH₂-CH=CH₂); 5.39-4.98 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.32-3.84 (m, 10H, CH₂-CH=CH₂, H-2, H-3, H-4, H-5); 3.35 (m, 1H, H-6a); 3.09 (m, 1H, H-6b); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 161.3, 160.8, 143.9, 143.7, 135.2, 135.0, 134.9, 134.8, 134.1, 133.8, 128.8, 128.6, 127.8, 127.1, 127.0 (Ar, CH₂-CH=CH₂); 117.9, 117.4, 117.3, 116.7, 116.5 (CH₂-CH=CH₂); 104.0 (C-1); 86.8 (C-3); 86.7 (C-2); 83.8 (C-3); 82.6; 76.7 (C-4); 75.3, 74.1, 72.5, 72.2, 71.8, 71.0 (CH₂-CH=CH₂, C-5); 61.9 (C-6.)HRMS (ESI): C₃₆H₃₈Cl₃NO₆ [M+Na]⁺の計算値: 708.1663, 実測値: 708.1673.

７Ｂ：¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.59 (s, 1H, NH); 7.41-7.18 (m, 15H, Ar-H); 5.90 (m, 2H, CH₂-CH=CH₂); 5.62 (m, 2H, H-1, CH₂-CH=CH₂); 5.35-5.01 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.31-3.83 (m, 6H CH₂-CH=CH₂); 3.83 (m, 1H, H-5); 3.76 (dd, 1H, J₁ = 8.2 Hz, J₂ = 9.7 Hz, H-3); 3.62 (t, 1H, J = 5.9 Hz, H-2), 3.48-3.39 (m, 2H, H-4, H-6a); 3.12 (dd, 1H, J₁ = 7.2 Hz, J₂ = 9.3 Hz, H-6b.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 161.5, 143.8 (Ar); 135.4, 134.9, 134.8 (CH₂-CH=CH₂); 128.7, 128.6, 128.0, 127.9, 127.1 (Ar); 117.3, 117.0, 116.8 (CH₂-CH=CH₂); 98.5 (C-1); 86.8 (C-2); 81.6 (C-3); 77.8 (C-5); 74.6 (C-3) 74.2, 73.8, 73.3, 72.0 (CH₂-CH=CH₂, C-4); 62.4 (C-6.)HRMS (ESI): C₃₆H₃₈Cl₃NO₆ [M+Na]⁺の計算値: 708.1663, 実測値: 708.1673.

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物８）：
トリクロロアセトイミデート（化合物７、両方アノマー）（１．１ｇ、１．６ｍｍｏｌ）および５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタノール（５６０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（２５ｍＬ）に溶解し、反応混合物を０℃に冷却した。ＴＭＳＯＴｆ（１５μＬ、０．０８０ｍｍｏｌ）を滴下して加え、反応混合物を０℃で１５分間撹拌した。その後、反応物をＥｔ_３Ｎ（１５μＬ）で中和し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１：８ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、化合物８（７８３ｍｇ、６５％）を得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.80-7.67 (m, 4H, フタルイミドのプロトン); 7.41-7.19 (m , 15H, Ar-H); 5.98-5.59 (m, 3H, CH₂-CH=CH₂); 5.33-4.94 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.30-3.84 (m, 8H, CH₂-CH=CH₂, H-1, リンカー-CHH); 3.77 (d, 1H, J = 2.9 Hz, H-5); 3.62 (t, 2H, J = 7.3 Hz, リンカー-CH₂); 3.45-3.35 (m, 4H, H-2, H-4, H-6a, リンカー-CHH); 3.29 (dd, 1H, J₁ = 3.0 Hz, J₂ = 9.8 Hz, H-3); 3.13 (dd, 1H, J₁ = 9.4 Hz, J₂ = 10.1 Hz, H-6b); 1.65 (m, 4H, リンカー-CH₂); 1.40 (m, 2H, リンカー-CH₂.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 168.4, 143.8 (Ar); 135.7, 135.3, 135.2 (CH₂-CH=CH₂); 133.9, 132.1, 128.7, 127.9, 127.1, 123.2 (Ar); 116.8, 116.5 (CH₂-CH=CH₂); 103.7 (C-1); 86.8; 81.5 (C-1); 79.2 (C-2); 73.9, 73.6, 73.4, 73.3 (C-5, C-4, CH₂-CH=CH₂); 71.9, 69.4 (リンカー); 62.5 (C-6); 37.9, 29.2, 28.4, 23.4 (リンカー.) HRMS (ESI): C₄₇H₅₁NO₈ [M+Na]⁺の計算値: 780.3513, 実測値 780.3489.

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物９）：
８０％水性ＡｃＯＨ（１０ｍＬ）中に溶解した化合物８（４９３ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の溶液を８０℃で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して化合物９（２６０ｍｇ、７８％）を得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.81-7.66 (m, 4H, フタルイミドのプロトン); 5.92-5.82 (m, 3H, CH₂-CH=CH₂); 5.30-5.10 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.37-4.02 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.22 (d, 1H, J = 7.7 Hz, H-1); 3.88 (m, 2H, H-6a, リンカー-CHH); 3.69-3.60 (m, 4H, H-4, H-6b, リンカー-CH₂); 3.51-3.42 (m, 2H, H-2, リンカー-CHH); 3.39 (m, 1H, H-5); 3.28 (dd, 1H, J₁= 3.0 Hz, J₂= 9.8 Hz, H-3); 2.09 (m, 1H, 6-OH); 1.65 (m, 4H, リンカー-CH₂); 1.40 (m, 2H, リンカー-CH₂.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 168.5 (フタルイミド C=O); 135.3, 135.0, 133.9 (CH₂-CH=CH₂); 132.1, 123.2 (フタルイミド); 117.8, 116.7, 116.6 (CH₂-CH=CH₂); 103.9 (C-1); 81.6 (C-3); 79.1 (C-2); 74.6 (C-5) 74.0 (C-4); 73.7, 73.6 (CH₂-CH=CH₂); 72.1, 69.6 (リンカー); 62.5 (C-6); 37.8, 29.2, 28.3, 23.3 (リンカー.)HRMS (ESI): C₂₈H₃₇NO₈ [M+Na]⁺の計算値: 538.2417, 実測値 538.2403.

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物１０）：
分子篩でＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）に溶解した化合物９（４００ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）およびジクロロリン酸メチル（０．７０ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（０．７０ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。ＴＬＣで判断して反応が完了したら、アンモニアガスを針を通して反応混合物に注入した。１０分後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（９：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）で精製して、化合物１０を得た（１２９ｍｇ、２７％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 7.80-7.68 (フタルイミドのプロトン); 5.88 (m, 3H, CH₂-CH=CH₂); 5.30-5.10 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.23-4.10 (m, 9H, CH₂-CH=CH₂, H-1, リンカー-CH₂); 3.82 (m, 1H, H-5); 3.71-3.39 (m, 9H, OCH₃, H-4, H-2, H-6a, H-6b, リンカー-CH₂); 3.28 (m, 1H, H-3); 2.87 (dd, 2H, J₁ = 5.3 Hz J₂= 13.0 Hz, NH₂); 1.66 (m, 4H, リンカー-CH₂); 1.38 (m, 2H, リンカー-CH₂.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 168.5 (Ar); 135.4, 135.2, 134.9 (CH₂-CH=CH₂); 133.9, 132.1, 123.2 (Ar); 117.5, 117.2, 116.8, 116.7, 116.6 (CH₂-CH=CH₂); 103.8 (C-1); 81.4 (C-3); 78.9 (C-2); 74.0, 73.8, 73.3, 73.2, 73.0, 72.9, 72.1 (CH₂-CH=CH₂, C-5, C-4); 69.8, 69.7 (C-6) 65.3; 65.0, 64.9 (リンカー) 53.4, 53.3 (OCH₃); 37.9, 29.7, 29.2, 28.3 (リンカー.)HRMS (ESI): C₂₉H₄₁N₂O₁₀P [M+H]⁺の計算値: 609.2578, 実測値 609.2585.

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物１１）：
ＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解した化合物１０（９５ｍｇ、０．１６μｍｏｌ）の溶液に、ＰｄＣｌ２（２０ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で４時間撹拌した。その後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（９：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）による精製により、化合物１１（５７ｍｇ、７５％）を得た。¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 7.64 (m, 4H, フタルイミドのプロトン); 4.23 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H-1); 4.01 (m, 2H, H-6); 3.78-3.70 (m, 3H, H-4, H-5, リンカー-CHH)); 3.59-3.45 (m, 7H, OCH₃, リンカー-CH₂ リンカー-CHH, H-3); 3.33 (dd, 1H, J₁= 8.0 Hz, J₂= 9.8 Hz, H-2); 1.51 (m, 4H, リンカー-CH₂); 1.22 (m, 2H, リンカー-CH₂.) ¹³C NMR (100 MHz, D₂O): 170.9, 134.5, 133.9, 131.3, 126.0, 123.1 (Ar); 102.6 (C-1); 73.2 (C-5); 72.5 (C-3); 71.9 (C-2); 70.3, 70.2 (リンカー); 68.1 (C-4); 65.4 (C-6); 53.6 (OCH₃); 48.7; 37.6 (リンカー); 28.2; 27.2, 22.3 (リンカー.)HRMS (ESI): C₂₀H₂₉N₂O₁₀P [M+H]⁺の計算値: 489.1639, 実測値 489.1624.

５−アミノ−ペンタニル６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物１２）：
９５％ＥｔＯＨ（１ｍＬ）に溶解した化合物１１（２３ｍｇ、０．０４７μｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン一水和物（１６μＬ、０．３３μｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。その後、反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（３：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）で精製して化合物１２（１４ｍｇ、８２％）を得た。¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 4.27 (d, 1H, J = 7.1 Hz, H-1); 4.03 (m, 2H, リンカー-CH₂); 3.81-3.75 (m, 3H, H-4, H-5, H-6a); 3.61-3.48 (m, 5H, OCH₃, H-3, H-6b); 3.36 (dd, 1H, J₁ = 7.9, J₂ = 9.9 Hz, H-2); 2.82 (t, 2H, J = 7.5 Hz, リンカー-CH₂); 1.52 (m, 4H, リンカー-CH₂); 1.30 (m, 2H, リンカー-CH₂.) ¹³C NMR (100 MHz, D₂O): δ 102.6 (C-1); 73.2 (C-5); 72.5 (C-3); 70.5 (C-2); 70.1 (C-6); 68.1 (C-4); 60.0 (リンカー); 48.7 (OCH₃); 39.2, 28.0, 26.3, 22.0, 21.9 (リンカー.) HRMS (ESI): C₁₂H₂₇N₂O₈P [M+H]⁺の計算値: 359.1584, 実測値 359.1587.

また、構造ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２の合成も、図４のスキーム２ａに記載のように示すことができ、以下に要約する：

以前に報告された化合物（Ｃｏｍｆｏｒｔ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：３３１９−３３３０（２００７））、４−メトキシフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物１を参照されたい）から出発して、トリチル基をＣ−６に選択的に導入した。当初は、化合物２にベンゾイル化を行ったが（スキーム２ａ、化合物２）、ＭｅＯＰＮの導入中に広範な移動が観察されたことから、より適切な保護基を解明することへと導かれた。こうして、Ｃ−２、Ｃ−３、およびＣ−４位を保護するためにアリル基を選択した（これは移動に耐性があった）。その後、アリル基を接触水素化分解で脱保護し、これがＭｅＯＰＮ修飾に適合することが判明した。

アリル基を導入した後、アミノ−ペンタニルリンカーを、コンジュゲーションのための部位としてアノマー位に導入した。ガラクトシド（スキーム２ａ、化合物３）から出発して、まず、硝酸セリウムアンモニウム（ＣＡＮ）を用いて４−メトキシフェニル基（ＯＭＰ）を除去した。その後、対応するヘミアセタールをトリクロロアセトイミデート供与体に変換した（スキーム２ａ、化合物４を参照されたい）。その後、５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニルリンカーを、０℃で活性剤としてＴＭＳＯＴｆと共に導入した。化合物５を、βアノマーとして６５％、αアノマーとして２９％集めた。トリチル基の除去により、修飾用の遊離６−ヒドロキシル基を有する化合物６を得た。

ＭｅＯＰＮ基の導入方法は、Ｍａｒａｅｔａｌ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６１８０−６１８３（２０１１）によって提案された反応と同様である。化合物６をトリエチルアミンの存在下で市販のジクロロリン酸メチルで処理した後、アンモノリシスを行った。新たに導入したＭｅＯＰＮ（ＲおよびＳ）のキラリティの性質のために、２つのジアステレオ異性体の混合物として化合物７を集めた。^１ＨＮＭＲは、化合物７が実際に２つのジアステレオ異性体の１：１混合物であり、スペクトル全体にわたって２組のシグナルを示すことを確認でき、これは、アノマーおよびＯ−Ｍｅシグナルについて見られ得る。この反応により、副生成物の混合物が得られ、最も豊富なものは、第２のＮＨ_２によるＯ−Ｍｅ基の置換であった、これが、この反応の低収率の主な原因である。

アリルおよびフタルイミド保護基を塩化パラジウム（ＩＩ）およびヒドラジンでそれぞれ除去して、化合物８および化合物９を生成した。化合物７と同様に、ジアステレオ異性体の混合物は、ＮＭＲに現れている。光学的に純粋ではないものの、^３１ＰＮＭＲの結果は、天然のＭｅＯＰＮ含有多糖類と一致し、１４ｐｐｍあたりにリンシグナルを有する。^３１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣＮＭＲ実験は、ＭｅＯＰＮがＯ−６位に導入され、Ｏ−ＭｅシグナルおよびＨ−６シグナルとで相関シグナルを示すことを確認できた（データは示さず）。

ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２の上記合成の詳細は、以下およびスキーム２ａに提供されている：

４−メトキシフェニル６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物２）：
ピリジン（４０ｍＬ）に溶解した化合物１（２．７ｇ、９．３ｍｍｏｌ）の溶液に塩化トリチル（３．１ｇ、１１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を６０℃で３日間撹拌した。その後、反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して化合物２を得た（４．７ｇ、９５％）。［α］_Ｄ ^２５＝＋９１．２°（ｃ＝０．２１、ＣＨＣｌ_３）；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.44-7.20 (m, 15H, Ar-H); 7.11-6.83 (m, 4H, MeOC₆H₄); 5.51 (d, 1H, J = 3.6 Hz, H-1); 4.05-3.93 (m, 4H, H-2, H-3, H-4, H-5); 3.79 (s, 3H, OCH₃); 3.54-3.32 (m, 2H, H-6.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 155.3, 151.2, 150.6, 144.3, 143.8, 143.7, 143.6, 129.1, 128.6, 128.0, 127.9, 127.8, 127.5, 127.3, 127.1, 127.0, 118.5, 117.9, 114.6, 114.5, 114.4 (Ar); 98.4 (C-1); 87.0, 71.2, 70.0, 69.3 (C-2, C-3, C-4, C-5); 63.6 (C-6); 55.6 (CH₃.)HRMS (ESI): C₃₂H₃₂O₇ [M+Na]⁺の計算値: 551.2046, 実測値: 551.2021.

４−メトキシフェニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物３）：
臭化アリル（４．６ｍＬ、５３ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解した化合物２（４．７ｇ、８．８ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。鉱油中の水素化ナトリウム、６０％分散液（１．２ｇ、２９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。その後、反応をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）でクエンチし、氷冷水（１００ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濃縮した。１：７ＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、化合物３を得た（スキーム１、構造３を参照されたい）（５．１ｇ、８９％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.38-7.18 (m, 15H, Ar-H); 7.10-6.75 (m, 4H, MeOC₆H₄); 6.00-5.53 (m, 3H, CH₂-CH=CH₂); 5.42 (d, 1H, J = 3.2 Hz, H-1); 5.33-4.98 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.37-3.72 (m, 13H, CH₂-CH=CH₂, H-2, H-3, H-4, H-5, OCH₃); 3.38 (m, 1H, H-6a); 3.01 (m, 1H, H-6b.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 155.0, 151.0, 143.9 (Ar); 135.2, 135.1, 135.0 (CH₂-CH=CH₂); 128.6, 127.8, 127.0, 119.0, 117.4, 117.3, 116.4, 114.4 (CH₂-CH=CH₂, Ar); 97.5 (C-1); 86.8; 78.2 (C-2); 77.4 (C-4); 76.1 (C-5); 73.9, 72.5, 71.9 (CH₂-CH=CH₂); 70.4 (C-3) 63.3 (C-6); 55.6 (OCH₃.) HRMS (ESI): C₄₁H₄₄O₇ [M+Na]⁺の計算値: 671.2985, 実測値: 671.2970.

２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−−α，β−Ｄ−ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート（スキーム２ａ、化合物４）：
ＣＨ_３ＣＮ（４８０ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（１２０ｍＬ）に溶解した化合物３（５．０ｇ、７．７ｍｍｏｌ）の溶液に、硝酸セリウムアンモニウム（１２．８ｇ、２３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃で２０分間撹拌した。その後、混合物をブライン（２００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（１：６ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製した。得られたヘミアセタール（３．３ｇ、６．１ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（１２０ｍｌ）に溶解し、ＣＣｌ_３ＣＮ（３１０μＬ、３０ｍｍｏｌ）およびＫ_２ＣＯ_３（４２０ｍｇ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した後、セライト（登録商標）で濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（体積１％Ｅｔ３Ｎを含む１：４ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、化合物４をα，β−混合物として得た（３．６ｇ、２ステップで５７％）。

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物５）：
トリクロロアセトイミデート（化合物４）（１．１ｇ、１．６ｍｍｏｌ）および５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタノール（５６０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（２５ｍＬ）に溶解し、反応混合物を０℃に冷却した。ＴＭＳＯＴｆ（１５μＬ、０．０８０ｍｍｏｌ）を滴下して加え、反応混合物を０℃で１５分間撹拌した。その後、反応物をＥｔ_３Ｎ（１５μＬ）で中和し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１：８ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、化合物５（７８３ｍｇ、６５％）を得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.80-7.67 (m, 4H, フタルイミドのプロトン); 7.41-7.19 (m , 15H, Ar-H); 5.98-5.59 (m, 3H, CH₂-CH=CH₂); 5.33-4.94 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.30-3.84 (m, 8H, CH₂-CH=CH₂, H-1, リンカー-CHH); 3.77 (d, 1H, J = 2.9 Hz, H-5); 3.62 (t, 2H, J = 7.3 Hz, リンカー-CH₂); 3.45-3.35 (m, 4H, H-2, H-4, H-6a, リンカー-CHH); 3.29 (dd, 1H, J₁ = 3.0 Hz, J₂ = 9.8 Hz, H-3); 3.13 (dd, 1H, J₁ = 9.4 Hz, J₂ = 10.1 Hz, H-6b); 1.65 (m, 4H, リンカー-CH₂); 1.40 (m, 2H, リンカー-CH₂.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): 168.4, 143.8 (Ar); 135.7, 135.3, 135.2 (CH₂-CH=CH₂); 133.9, 132.1, 128.7, 127.9, 127.1, 123.2 (Ar); 116.8, 116.5 (CH₂-CH=CH₂); 103.7 (C-1); 86.8; 81.5 (C-1); 79.2 (C-2); 73.9, 73.6, 73.4, 73.3 (C-5, C-4, CH₂-CH=CH₂); 71.9, 69.4 (リンカー); 62.5 (C-6); 37.9, 29.2, 28.4, 23.4 (リンカー.)HRMS (ESI): C₄₇H₅₁NO₈ [M+Na]⁺の計算値: 780.3513, 実測値 780.3489.

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物６）：
８０％水性ＡｃＯＨ（１０ｍＬ）中に溶解した化合物５（４９３ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）の溶液を８０℃で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して化合物６（２６０ｍｇ、７８％）を得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.81-7.66 (m, 4H, フタルイミドのプロトン); 5.92-5.82 (m, 3H, CH₂-CH=CH₂); 5.30-5.10 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.37-4.02 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.22 (d, 1H, J = 7.7 Hz, H-1); 3.88 (m, 2H, H-6a, リンカー-CHH); 3.69-3.60 (m, 4H, H-4, H-6b, リンカー-CH₂); 3.51-3.42 (m, 2H, H-2, リンカー-CHH); 3.39 (m, 1H, H-5); 3.28 (dd, 1H, J₁= 3.0 Hz, J₂= 9.8 Hz, H-3); 2.09 (m, 1H, 6-OH); 1.65 (m, 4H, リンカー-CH₂); 1.40 (m, 2H, リンカー-CH₂.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 168.5 (フタルイミド C=O); 135.3, 135.0, 133.9 (CH₂-CH=CH₂); 132.1, 123.2 (フタルイミド); 117.8, 116.7, 116.6 (CH₂-CH=CH₂); 103.9 (C-1); 81.6 (C-3); 79.1 (C-2); 74.6 (C-5) 74.0 (C-4); 73.7, 73.6 (CH₂-CH=CH₂); 72.1, 69.6 (リンカー); 62.5 (C-6); 37.8, 29.2, 28.3, 23.3 (リンカー.)HRMS (ESI): C₂₈H₃₇NO₈ [M+Na]⁺の計算値: 538.2417, 実測値 538.2403.

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル２，３，４−トリ−Ｏ−アリル−６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物７）：
分子篩でＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）に溶解した化合物６（４００ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）およびジクロロリン酸メチル（０．７０ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（０．７０ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。ＴＬＣで判断して反応が完了したら、アンモニアガスを針を通して反応混合物に注入した。１０分後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（９：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）で精製して、生成物７を得た（１２９ｍｇ、２７％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 7.80-7.68 (フタルイミドのプロトン); 5.88 (m, 3H, CH₂-CH=CH₂); 5.30-5.10 (m, 6H, CH₂-CH=CH₂); 4.23-4.10 (m, 9H, CH₂-CH=CH₂, H-1, リンカー-CH₂); 3.82 (m, 1H, H-5); 3.71-3.39 (m, 9H, OCH₃, H-4, H-2, H-6a, H-6b, リンカー-CH₂); 3.28 (m, 1H, H-3); 2.87 (dd, 2H, J₁ = 5.3 Hz J₂= 13.0 Hz, NH₂); 1.66 (m, 4H, リンカー-CH₂); 1.38 (m, 2H, リンカー-CH₂.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 168.5 (Ar); 135.4, 135.2, 134.9 (CH₂-CH=CH₂); 133.9, 132.1, 123.2 (Ar); 117.5, 117.2, 116.8, 116.7, 116.6 (CH₂-CH=CH₂); 103.8 (C-1); 81.4 (C-3); 78.9 (C-2); 74.0, 73.8, 73.3, 73.2, 73.0, 72.9, 72.1 (CH₂-CH=CH₂, C-5, C-4); 69.8, 69.7 (C-6) 65.3; 65.0, 64.9 (リンカー) 53.4, 53.3 (OCH₃); 37.9, 29.7, 29.2, 28.3 (リンカー.) HRMS (ESI): C₂₉H₄₁N₂O₁₀P [M+H]⁺の計算値: 609.2578, 実測値 609.2585.

５−アミノ−Ｎ−フタルイミド−ペンタニル６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物８）：
ＭｅＯＨ（４ｍＬ）に溶解した化合物７（９５ｍｇ、０．１６μｍｏｌ）の溶液に、ＰｄＣｌ_２（２０ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で４時間撹拌した。その後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（９：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）による精製により、化合物８（５７ｍｇ、７５％）を得た。¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 7.64 (m, 4H, フタルイミドのプロトン); 4.23 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H-1); 4.01 (m, 2H, H-6); 3.78-3.70 (m, 3H, H-4, H-5, リンカー-CHH)); 3.59-3.45 (m, 7H, OCH₃, リンカー-CH₂ リンカー-CHH, H-3); 3.33 (dd, 1H, J₁= 8.0 Hz, J₂= 9.8 Hz, H-2); 1.51 (m, 4H, リンカー-CH₂); 1.22 (m, 2H, リンカー-CH₂.) ¹³C NMR (100 MHz, D₂O): 170.9, 134.5, 133.9, 131.3, 126.0, 123.1 (Ar); 102.6 (C-1); 73.2 (C-5); 72.5 (C-3); 71.9 (C-2); 70.3, 70.2 (リンカー); 68.1 (C-4); 65.4 (C-6); 53.6 (OCH₃); 48.7; 37.6 (リンカー); 28.2; 27.2, 22.3 (リンカー.)HRMS (ESI): C₂₀H₂₉N₂O₁₀P [M+H]⁺の計算値: 489.1639, 実測値 489.1624.

５−アミノ−ペンタニル６−Ｏ−メチルホスホルアミデート−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（スキーム２ａ、化合物９）：
９５％ＥｔＯＨ（１ｍＬ）に溶解した化合物８（２３ｍｇ、０．０４７μｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン一水和物（１６μＬ、０．３３μｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。その後、反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（３：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ）で精製して化合物９（１４ｍｇ、８２％）を得た。¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 4.27 (d, 1H, J = 7.1 Hz, H-1); 4.03 (m, 2H, リンカー-CH₂); 3.81-3.75 (m, 3H, H-4, H-5, H-6a); 3.61-3.48 (m, 5H, OCH₃, H-3, H-6b); 3.36 (dd, 1H, J₁ = 7.9, J₂ = 9.9 Hz, H-2); 2.82 (t, 2H, J = 7.5 Hz, リンカー-CH₂); 1.52 (m, 4H, リンカー-CH₂); 1.30 (m, 2H, リンカー-CH₂.) ¹³C NMR (100 MHz, D₂O): δ 102.6 (C-1); 73.2 (C-5); 72.5 (C-3); 70.5 (C-2); 70.1 (C-6); 68.1 (C-4); 60.0 (リンカー); 48.7 (OCH₃); 39.2, 28.0, 26.3, 22.0, 21.9 (リンカー.) HRMS (ESI): C₁₂H₂₇N₂O₈P [M+H]⁺の計算値: 359.1584, 実測値 359.1587.

ＭｅＯＰＮ→２−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの合成
要約ＭｅＯＰＮ→２−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの合成（図５、スキーム３）：
ＭｅＯＰＮ→２−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰの合成は、図５、スキーム３に示される。ガラクトシド（生成物７）の合成は、既知の化合物である４−メトキシフェニル３，４−Ｏ−イソプロピリデン−６−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物１）から始めた、この生成物は、公開された手順（スキーム１）に従ってＤ−ガラクトースから調製した。（ＣｏｍｆｏｒｔＤＡ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ２００７；４６：３３１９−３３３０）。Ｃ−２位を区別するために、Ｏ−アリル化を行い、優れた収率で生成物２を生成した。ＭｅＯＰＮは酸性媒質によって除去可能であるため、適切な保護基を導入する必要があった。よって、Ｏ−イソプロピリデンおよびＯ−トリチル基を除去して、生成物３を得て、その後、これを過ベンゾイル化して生成物４を得た。次に、アリル基を除去して、修飾用の遊離２−ＯＨを得た。ＭｅＯＰＮ基の生成物５への導入は、まず市販のジクロロリン酸メチルでリン酸化した後でアンモノリシスを行うことを含む、当研究所で開発した戦略に従った。（Ｊｉａｏ，Ｙ．ｅｔａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．（２０１５）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃａｒｒｅｓ．２０１５．０９．０１２）。生成物５の^３１ＰＮＭＲスペクトルは、２つのジアステレオ異性体の形成に起因して、約１：１比の２つのリンシグナルを示した。生成物６を脱ベンゾイル化して、Ｏ−Ｍｅ−ホスホルアミデートガラクトシドの生成物７を得た。興味深いことに、本発明者らは、フラッシュクロマトグラフィーを用いてジアステレオ異性体の１つを精製することができた。ジアステレオ異性体７^＊の^３１ＰＮＭＲスペクトルは、１４．２７ｐｐｍで単一のシグナルを示した。従来の方法を用いて実施される、４−メトキシフェニル２−Ｏ−メチル−ホスホラミジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの^３１ＰＮＭＲ（Ａ）および^１ＨＮＭＲ（Ｂ）を示す図１４を参照されたい。

材料および方法
従来の方法を用いて化合物を合成し、すべての化学物質を商業的供給業者から購入し、受け取ったまま使用した。分子篩は、加熱マントルにより減圧下で加熱することによって活性化した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、ＴＬＣシリカゲルＦ_２５４上で実施した。糖化合物は、ＵＶ光によってまたはエタノール中の１０％Ｈ_２ＳＯ_４による炭化によって可視化した。フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲルＰ６０（４３〜６０μｍ、２３０〜４００メッシュ）で行った。^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ４００または６００ＭＨｚ分光計（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓＩｎｃ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて記録した。残りの非重水素化溶媒のプロトンシグナル（ＣＨＣｌ_３に対してδ７．２４ｐｐｍ）を^１Ｈスペクトルの内部基準として使用した。^１３Ｃスペクトルに関して、化学シフトは溶媒（ＣＤＣｌ_３に関してδ７７．１ｐｐｍ）と比較して報告される。化学シフトは、百万分率（ｐｐｍ）で報告される。結合定数は、ヘルツ（Ｈｚ）で報告される。次の略語は、多重度を示すのに使用される：ｓ、一重項；ｄ、二重項；ｔ、三重項；ｍ、多重項。旋光度は、ルドルフリサーチオートポール３自動偏光計（ＲｕｄｏｌｐｈＲｅｓｅａｒｃｈＡｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｈａｃｋｅｔｔｓｔｏｗｎ、ＮＪ）で測定し、また濃度（ｃ）は、ｇ／１００ｍｌで表す。合成化合物の高分解能質量スペクトルは、電子スプレーイオン化質量分析（飛行時間分析器）によって記録した。

４−メトキシフェニル２−Ｏ−アリル−３，４−Ｏ−イソプロピリデン−６−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物２）：
臭化アリル（０．１６ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（１８ｍＬ）に溶解した生成物１（０．６８ｇ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。鉱油中の水素化ナトリウム、６０％分散液（５７ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。その後、反応をＭｅＯＨ（２ｍＬ）でクエンチし、氷冷水（４０ｍＬ）に注ぎ、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濃縮した。１：７ＥｔＯＡｃ−ヘキサンで溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、生成物２（０．６９ｇ、９５％）を得た。［α］_Ｄ ^２５＝＋４０．２^ｏ（ｃ＝０．０５、ＣＨＣｌ_３）；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.46-7.19 (m, 15H, Ar); 7.10-6.75 (m, 4H, MeOC₆H₄); 5.92 (m, 1H, CH₂-CH=CH₂); 5.34-5.19 (m, 2H, CH₂-CH=CH₂); 4.67 (d, 1H, J = 8.1 Hz, H-1); 4.36 (m, 2H, CH₂-CH=CH₂); 4.08 (m, 2H, H-3, H-4); 3.73 (s, 3H, OCH₃); 3.61-3.53 (m, 3H, H-2, H-5, H-6a); 3.34 (m, 1H, H-6b); 1.47 (s, 3H, CH₃); 1.29 (s, 3H, CH₃.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 155.2, 151.5, 144.0, 143.9 (Ar); 134.9 (CH₂-CH=CH₂); 128.8, 127.9, 127.8, 127.0, 126.9, 118.6, 118.3, 117.7, 117.4, 114.5, 114.4, 110.2, 109.3 (CH₂-CH=CH₂, Ar); 102.2 (C-1); 86.8 (CMe₂) 79.4 (C-2); 79.2; (C-3); 73.8 (C-4); 72.9 (CH₂-CH=CH₂); 72.6 (C-5); 63.0 (C-6); 55.6 (OCH₃); 27.9, 26.3 (CH₃.) HRMS (ESI): C₃₈H₄₀NaO₇ [M+Na]⁺の計算値: 631.2672, 実測値: 631.2670.

４−メトキシフェニル２−Ｏ−アリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物３）：
８０％水性ＡｃＯＨ（１０ｍＬ）中の生成物２（０．６９ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液を８０℃で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）による精製により、生成物３（０．３５ｇ、９４％）を得た。［α］_Ｄ ^２５＝＋９０．２^ｏ（ｃ＝０．２、ＣＨＣｌ_３）；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.01-7.78 (m, 4H, MeOC₆H₄); 5.91 (m, 1H, CH₂-CH=CH₂); 5.19 (m, 2H, CH₂-CH=CH₂); 4.83 (d, 1H, J = 7.5 Hz, H-1); 4.53-4.25 (m, 2H, CH₂-CH=CH₂); 4.14 (m, 1H, H-5); 3.96 (m, 1H, H-6a); 3.85 (m, 1H, H-6b); 3.76 (s, 3H, OCH₃); 3.62 (m, 3H, H-2, H-3, H-4.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 155.4, 151.1 (Ar); 134.5 (CH₂-CH=CH₂); 118.5, 118.2, 118.0, 114.6, 114.6 (CH₂-CH=CH₂, Ar); 102.6 (C-1); 78.4 (C-3); 75.9 (C-4); 73.7 (CH₂-CH=CH₂); 73.0 (C-2); 68.9 (C-5); 62.8 (C-6); 55.7 (OCH₃.) HRMS (ESI): C₁₆H₂₃O₇ [M+H]⁺の計算値: 327.1445, 実測値: 327.1422.

４−メトキシフェニル２−Ｏ−アリル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物４）：
ＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍＬ）およびピリジン（６５μＬ、８．３ｍｍｏｌ）中の３（２７ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢｚＣｌ（１００μＬ、８．３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１８時間撹拌した。ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を加え、反応混合物を減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１：３ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、生成物４（５１ｍｇ、９７％）を得た。［α］_Ｄ ^２５＝＋４８．６^ｏ（ｃ＝０．１、ＣＨＣｌ_３）；¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 8.07-7.29 (m, 15H, Ar); 7.06-6.71 (m, 4H, MeOC₆H₄); 5.89 (d, 1H, J = 2.7 Hz, H-4); 5.74 (m, 1H, CH₂-CH=CH₂); 5.42 (dd, 1H, J₁= 3.5, J₂= 10.0 Hz, H-3); 5.21-5.01 (m, 3H, CH₂-CH=CH₂, H-1); 4.57 (m, 1H, H-6a); 4.39-4.06 (m, 5H, CH₂-CH=CH₂, H-6b, H-5, H-2); 3.73 (s, 3H, OCH₃.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ 171.2, 166.0, 165.7, 155.6, 151.2, 134.3, 133.8, 133.5, 133.2, 133.1, 132.9, 130.6, 130.2, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 128.8, 128.5, 128.4, 118.8, 114.6 (Ar); 117.7 (CH₂-CH=CH₂); 102.8 (C-1); 78.7 (C-2); 74.0 (C-3); 73.6 (CH₂-CH=CH₂); 72.2 (C-5); 69.9 (C-4); 63.5 (C-6); 55.6 (CH₃.) HRMS (ESI): C₃₇H₃₄NaO₁₀ [M+Na]⁺の計算値: 661.2050, 実測値: 661.2041.

４−メトキシフェニル３，４，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物５）：
ＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解した生成物４（４５ｍｇ、７０μｍｏｌ）の溶液に、ＰｄＣｌ_２（２ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で２時間撹拌した。その後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（１：３ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）により精製して、生成物５（３９ｍｇ、９２％）を得た。［α］_Ｄ ^２５＝＋７８．２^ｏ（ｃ＝０．１、ＣＨＣｌ_３）；¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 8.08-7.28 (m, 15H, Ar); 7.07-6.72 (m, 4H, MeOC₆H₄); 5.91 (d, 1H, J = 3.5 Hz, H-4); 5.45 (dd, 1H, J₁ = 3.5, J₂= 10.1 Hz, H-3); 5.00 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1); 4.60 (m, 1H, H-6a); 4.44 (m, 1H, H-6b); 4.34 (m, 2H, H-5, H-2); 3.73 (s, 3H, OCH₃); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.0, 165.5, 155.7, 150.9, 133.7, 133.4, 130.0, 129.9, 129.8, 129.4, 129.2, 129.1, 128.5, 128.4, 118.6, 114.5 (Ar); 102.6 (C-1); 73.2 (C-3); 71.6 (C-5); 69.7 (C-2); 68.1 (C-4); 62.3 (C-6); 55.6 (OCH₃.) HRMS (ESI): C₃₄H₃₀NaO₁₀ [M+Na]⁺の計算値: 621.1737, 実測値: 621.1723.

４−メトキシフェニル３，４，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−Ｏ−メチル−ホスホラミジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物６）：
分子篩４ÅでＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍＬ）に溶解した生成物５（１８ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）およびジクロロリン酸メチル（７０μＬ、０．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（８５μＬ、０．３０ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。反応混合物を４０℃で１２時間撹拌した。ＴＬＣで判断して反応が完了したら、アンモニアガスを針を通して反応混合物に注入した。５分後、反応混合物を濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）で精製して、生成物６を得た（５．４ｍｇ、２６％）。［α］_Ｄ ^２５＝＋６８．５^ｏ（ｃ＝０．０５、ＣＨＣｌ_３）；¹H NMR (400 MHz, CHCl₃): δ 8.06-7.31 (m, 30H, Ar); 7.07-6.72 (m, 8H, MeOC₆H₄); 5.94 (m, 2H, H-4, H-4^*); 5.54 (m, 2H, H-3, H-3^*); 5.10 (m, 4H, H-1, H-1^*, H-2, H-2^*); 4.58 (m, 2H, H-6a, H-6a^*); 4.45 (m, 2H, H-6b, H-6b^*); 4.35 (m, 2H, H-5, H-5^*); 3.73 (s, 3H, OCH₃); 3.67 (d, 3H, ³J_PH = 11.6, POCH₃); 3.41 (d, 3H, ³J_PH =11.5, POCH₃ ^*); 2.92 (d, 2H, NH₂); 2.51 (d, 2H, NH₂ ^*.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.0, 165.7, 165.6, 165.5, 155.8, 155.7, 150.8, 150.6, 133.8, 133.6, 133.5, 133.4, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.4, 128.9, 128.8, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 118.6, 114.7, 114.6 (Ar); 101.2, 101.1 (C-1); 73.9, 73.6 (C-2); 72.5, 72.4 (C-3); 71.7 71.5 (C-5); 68.0 (C-4); 62.1 (C-6); 55.6 (OCH₃); 53.6, 53.3 (POCH₃.) HRMS (ESI): C₃₅H₃₅NO₁₂P [M+H]⁺の計算値: 692.1898, 実測値: 692.1815.

４−メトキシフェニル２−Ｏ−メチル−ホスホラミジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（生成物７）：
生成物７（２．５ｍｇ、ｍｍｏｌ）を０．２５ＭメタノールＭｅＯＮａ（１ｍＬ）に溶解した後、混合物を室温で１時間撹拌した後、酢酸で中和し、濃縮した。１：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、生成物７（１．０ｍｇ、７３％）を得た。

７：δδ ¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 6.97-6.83 (m, 8H, MeOC₆H₄); 5.05 (2d, 2H, H-1, H-1^*); 4.28 (m, 2H, H-2, H-2); 3.91 (m, 2H, H-4, H-4^*); 3.77-3.72 (m, 4H, H-3, H-3^*, H-5, H-5^*); 3.67-3.60 (m, 10H, H-6, H-6^*, OCH₃); 3.59 (d, 3H, ³J_PH = 11.5 Hz, POCH₃.) 3.56 (d, 3H, ³J_PH = 11.5 Hz, POCH₃ ^*.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 154.5, 150.7, 117.7, 114.9 (Ar); 99.7 (C-1); 77.0 (C-2); 75.3 (C-5); 71.6 (C-3); 68.6 (C-4); 60.5 (C-6); 55.6 (OCH₃); 53.9 (POCH₃.)

７^＊：［α］_Ｄ ^２５＝−１１．０^ｏ（ｃ＝０．０１、Ｈ_２Ｏ）；¹H NMR (400 MHz, D₂O): δ 6.97-6.83 (m, 4H, MeOC₆H₄); 5.05 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1); 4.28 (m, 1H, H-2); 3.91 (d, 1H, J =3.5 Hz, H-4); 3.77 (dd, 1H, J₁ =3.5 Hz, J₂= 9.8 Hz, H-3); 3.72 (m, 1H, H-5); 3.67-3.60 (m, 5H, H-6, H-6’, OCH₃); 3.56 (d, 3H, ³J_PH = 11.5 Hz, POCH₃.) ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 154.5, 150.7, 117.7, 114.9 (Ar); 99.7 (C-1); 77.0 (C-2); 75.3 (C-5); 71.6 (C-3); 68.6 (C-4); 60.5 (C-6); 55.6 (OCH₃); 53.9 (POCH₃.) HRMS (ESI): C₁₄H₂₃NO₉P [M+H]⁺の計算値: 380.1111, 実測値: 380.1085.

Ｃ．ジェジュニＣＰＳコンジュゲート抗血清によるＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰおよびＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２の免疫検出
上記実施例に記載される通り合成した、ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌコンストラクトの合成ｐ−メトキシフェニルおよびアミノペンチルグリコシド、化合物ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰおよびＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２を、血清型ＨＳ１、ＨＳ３、ＨＳ４およびＨＳ２３／３６のＣ．ジェジュニＣＰＳコンジュゲートに対して以前に惹起された抗血清との反応性に対して試験した。特に、上記列挙された血清型のうち、ＨＳ２３／３６のみがＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを発現する。

材料および方法
合成コンストラクトＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを１ｍｇ／ｍｌに調整し、２μｌをニトロセルロース膜の上にスポットし、乾燥させた。個々のスポットを、異なるＣ．ジェジュニ多糖類莢膜をＣＲＭ_１９７にコンジュゲートした従来の異なるコンジュゲートワクチンに対して作製された次の４つの異なるポリクローナル抗血清を用いて免疫検出した：（１）ＨＳ２３／３６コンジュゲートに対するウサギ血清（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．４２５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）中の最終希釈１：１０００；Ｍｏｎｔｅｉｒｏｅｔａｌ．，（２００９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７７，１１２８−１１３６；米国特許第９，０８４，８０９号）；（２）ＨＳ４コンジュゲートに対するウサギ血清（最終希釈１：１０００；Ｍｏｎｔｅｉｒｏｅｔａｌ．，（２００９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７７，１１２８−１１３６；米国特許第９，０８４，８０９号）；（３）ＨＳ１コンジュゲートに対するマウス血清（最終希釈１：５００；未公開データ）；および（４）ＨＳ３コンジュゲートに対するマウス血清（最終希釈１：５００；ＵＳ２０１５／０２７３０３７）。使用した二次抗体は、ヤギ抗ウサギ（ＨＳ２３／３６およびＨＳ４に対して）またはヤギ抗マウス（ＨＳ１およびＨＳ３（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のいずれかであった。ウサギ抗体はハーランラボラトリーズ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から得られ、マウス抗体は従来の方法を用いて組織内で生成された。イムノブロットは、化学発光キット（ＰｉｅｒｃｅＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＭａｘｉｍｕｎＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＳｕｂｓｔｒａｔｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて発色させ、バイオ・ラッドゲル撮影装置（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で画像化した。同様の方法を用いて、リンカーを有するコンジュゲートを分析した。

図６（Ｂ）に示すように、単糖類コンストラクトＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌは、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＨＳ２３／３６（ＧａｌのＣ−６でＭｅＯＰＮを有するＣＰＳ）から単離された莢膜多糖類に対する抗体によって認識された。また、予想外に、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＨＳ４（イド−ヘプトースのＣ−７でＭｅＯＰＮを有するＣＰＳ）からの多糖類に対する抗体も、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに対する抗ＨＳ２３／３６ＣＲＭ_１９７コンジュゲートに相当する応答を誘発した。また、抗ＨＳ１−ＣＲＭ_１９７（Ｃ−６Ｇａｌで少量のＭｅＯＰＮを有するＣＰＳ）も、幾分より少ない程度ではあるが、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに反応した。ＨＳ３ＣＰＳコンジュゲート抗血清（イド−ヘプトースのＣ−２でＭｅＯＰＮを有するＣＰＳ）は、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌと反応しなかった。α−Ｄ−Ｇａｌ−（１−ＯＭＰ（ＭｅＯＰＮがない）とＨＳ２３／３６ＣＰＳコンジュゲート抗血清との間で反応は観察されなかった（データは示さず）。したがって、データは、ＨＳ２３／３６、ＨＳ４、およびＨＳ１に対して産生された抗体はすべて合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ抗原と反応することを示している。対照的に、これらの抗体は、異種の莢膜と反応しない。換言すれば、抗ＨＳ２３／３６抗体の、精製されたＨＳ４またはＨＳ１莢膜との検出可能な反応性は存在しない。

ＨＳ２３／３６およびＨＳ４抗体に対して示されるＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌとの強い交差反応性は、ＭｅＯＰＮ−６−ＧａｌがＨＳ２３／３６およびＨＳ４莢膜多糖類とエピトープ構造を共有するという事実によって説明され得る。１つの説明は、ＨＳ２３／３６およびＨＳ４の両方におけるＭｅＯＰＮ基が第１級ヒドロキシル基に対するものであることであり得る。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ（ＨＳ２３／３６）とＨＳ４（ＭｅＯＰＮ−７−６ｄ−β−Ｄ−イド−ヘプトースを含む）との交差反応は、予想外であったが、両方の糖上の第１ヒドロキシ位置へのＭｅＯＰＮの結合に起因し得る。

図７は、指示されたコンジュゲート抗血清を用いて、カラムＡにおけるコンストラクトＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰ（図６Ｂと同じデータ）の認識と、コンストラクトＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２を用いたカラムＢのデータとを比較する。図７に示すように、両方のコンストラクトは、ＨＳ２３／３６ＣＰＳコンジュゲート抗血清（このＣＰＳは、不定比量のＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌ結合を含む）、ＨＳ４ＣＰＳコンジュゲート抗血清（このＣＰＳは、不定比のＭｅＯＰＮ→７−６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ結合を有する）、および、強度は比較的弱いものの、ＨＳ１ＣＰＳコンジュゲート抗血清（非常に少量のＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌを含む）によって、強く認識された。上述のように、ＨＳ２３／３６、ＨＳ４、およびＨＳ１ＣＰＳコンジュゲート抗血清による合成ＭｅＯＰＮ→６−Ｄ−Ｇａｌの検出は、これらのポリクローナル調製物が、第１位でＭｅＯＰＮ単位に対する特異的な抗体を含有するという事実を示している。ＨＳ３ＣＰＳコンジュゲート抗血清（ＣＰＳの６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２にＭｅＯＰＮを有する）は、いずれの合成コンストラクトＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰまたはＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２とも反応しなかった（データは示さず）。ＧａｌＯＭＰおよびアミノペンチルグリコシド（ＭｅＯＰＮを欠く）とＨＳ２３／３６ＣＰＳコンジュゲートまたは全細胞抗血清との間の反応は観察されなかった（データは示さず）。

図７に示すように、検出限界内では、ＭｅＯＰＮ→６−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→ＯＭＰとＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２との間に抗血清反応性の差は観察されず、これは、Ｇａｌの環外Ｃ−６位でのＭｅＯＰＮの認識が、アノマー配置に依存していなかったことを示唆する。ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌがコンジュゲート形態でアクセス可能であることは、ＨＳ２３／３６全細胞血清とＭｅＯＰＮ→６−ＧａｌＣＲＭ_１９７コンジュゲートとの反応によって確認された。これらのデータは、合成ＭｅＯＰＮ→６−Ｇａｌエンティティ（アノマー配置にかかわらず）が、同種Ｃ．ジェジュニＨＳ２３／３６ＣＰＳコンジュゲートによって惹起された抗血清と反応するのみならず、第１位にＭｅＯＰＮも有する（例えば、図１参照）血清型ＨＳ１およびＨＳ４によって産生された抗血清とも反応することを示す。

ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌは、合成コンジュゲートワクチンにおける免疫優性エピトープである。
本明細書に報告されたＧａｌ−Ｏ−６での第２のＭｅＯＰＮ結合が発見されるまで、ＭｅＯＰＮは、ガラクトースのＯ−２位についてのみ報告されていた。（Ｋａｎｉｐｅｓｅｔａｌ．，（２００６）ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８，３２７３−３２７９）。合成ＣＰＳコンジュゲートワクチンを利用する以下の実験は、Ｇａｌ−Ｏ−６でのＭｅＯＰＮ結合が、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌよりも免疫優性であることを示している。

材料および方法
合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ（上記のように調製された）およびＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌの２つの異性体（「Ａ」および「Ｂ」）（本明細書に記載のように調製された）の１ｍｇ／ｍｌ溶液２マイクロリットルを、従来の方法を用いてニトロセルロースフィルターの上にスポットし、乾燥させた。フィルターを、ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＭａｘｉｍｕｍＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＳｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を備えたブロッキング剤でブロックした。フィルターを、Ｃ．ジェジュニ株８１−１７６のホルマリン死滅全細胞に対して作製した一次ウサギポリクローナル抗体（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．４２５ＮＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中の最終希釈１：５００）（Ｂａｃｏｎｅｔａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０，７６９−７７７）、または、ＨＳ２３／３６多糖類−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンに対するウサギ抗体（最終希釈１：１０００）（Ｍｏｎｔｅｉｒｏｅｔａｌ．，（２００９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７７，１１２８−１１３６）と混合した。フィルターは、一次抗体と一晩反応させた後、洗浄した。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（最終希釈１：５０，０００）（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）であった。洗浄後、フィルターをＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＭａｘｉｍｕｍＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＳｕｂｓｔｒａｔｅで検出し、画像をバイオ・ラッドゲル画像システム（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で記録した。

図８に示すように、結果は、ＨＳ２３／３６多糖類−ＣＲＭ１９７コンジュゲートワクチンに対するウサギ抗体は、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを検出したものの、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌのいずれの異性体も検出しなかったことを明らかに示している。同様の結果が、ウサギポリクローナル抗体を用いて得られたが、ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌＢ異性体に対していくらかの反応性が検出された。これらのデータは、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類の免疫原性、および、Ｇａｌの２位でのメチルホスホルアミデートに対するＧａｌの６位でのＭｅＯＰＮの免疫優性を明確に示している。本明細書で企図されるＭｅＯＰＮ−糖エピトープの化学合成に加えて、Ｃ．ジェジュニに対するＣＰＳベースのワクチンが、ＭｅＯＰＮ修飾糖の免疫優位性を利用することによって、例えば、莢膜の精製およびワクチンの製造のために免疫優勢のエピトープおよび／または生物学的に重要なエピトープを過剰発現させる株を使用することによって、改善され得る。

ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２のタンパク質ＣＲＭ_１９７へのコンジュゲーション
コンジュゲートを形成するための、タンパク質担体への合成コンストラクトの結合を図９に示す（スキーム４）。リンカー付きガラクトシド（図３の化合物１２または図４の化合物９）（４．５ｍｇ）および過剰のアジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル（１０当量）をＤＭＳＯ（１ｍｌ）に溶解した。トリエチルアミン（６０μｌ）を滴下して加え、反応混合物を室温で４時間撹拌した。減圧下で濃縮した後、残渣をＨ_２Ｏで抽出し、その後、カラムクロマトグラフィー（３：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して活性化単糖類である化合物１３を得た。その後、この得られた半エステル（化合物１３）をリン酸緩衝液（ＮａＰｉ緩衝液、ｐＨ７）中のタンパク質ＣＲＭ_１９７のアミノ基と縮合させて、化合物１４を得た。具体的には、７０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０においてＣＲＭ_１９７を有する活性化単糖類を１００：１のモル比（タンパク質１モル当たりの活性エステルのモル数）でコンジュゲーションを実施した。室温で３日間撹拌した後、コンジュゲート（化合物１４）を流水に対して透析した。コンジュゲートの合成およびタンパク質担体への結合の概要も図１２に示す。

コンジュゲーションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびｍＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて分析し、確認した。具体的には、従来の方法に従って、ゲル電気泳動（図１０Ａ）、ウエスタンブロット（図１０Ｂ）、および質量分析（ｍＡＬＤＩ−ＴＯＦ）（図１０Ｃ）によって、ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２のＣＲＭ_１９７へのコンジュゲーションを分析し、確認した。

材料および方法
ＣＲＭ_１９７に連結したＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌコンストラクトを、従来の方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングによって分析し、特徴付けた。ＣＲＭ_１９７（重量で２．５μｇおよび５μｇ）に結合した合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの試料を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し、ＧｅｌＣｏｄｅ（商標）ＢｌｕｅＳｔａｉｎＲｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色するかまたはニトロセルロースに転写して、Ｃ．ジェジュニ８１−１７６（ＨＳ２３／３６）の全細胞に対してウサギポリクローナル抗体で免疫検出した（Ｂａｃｏｎｅｔａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０，７６９−７７７）。染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ワクチンコンジュゲートは大きさが不均一であり、非コンジュゲートＣＲＭ_１９７よりもわずかに大きいものから＞２５０Ｋｄまでの範囲にあることを示した（図１０Ａ）。イムノブロットの結果は、ワクチンコンジュゲートが、Ｃ．ジェジュニ株８１−１７６の全細胞に対するウサギポリクローナル抗体と反応し、莢膜とコンジュゲートとの交差反応を示したことを示している（データは示さず）。最終生成物（当該コンジュゲート）がＭｅＯＰＮのジアステレオ異性体を含んでいたという事実のために、ＭｅＯＰＮ→６−Ｄ−Ｇａｌｐエピトープの半分のみが天然のＣＰＳのものを反映した。それでも、ＨＳ２３／３６全細胞抗血清を用いたウエスタンブロット分析は、当該コンジュゲートが、ＭｅＯＰＮの立体化学構造および細胞表面上の結合を模倣するＭｅＯＰＮ→６−Ｄ−Ｇａｌエピトープを露出していることを示した（図１０Ｂ）。

また、当該コンジュゲートを、従来の方法を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析して、当該コンジュゲートの質量をより正確に決定した。簡単に説明すると、シナピン酸（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、マトリックスとして水中の３０：７０（ｖ／ｖ）アセトニトリル（ＡＣＮ）：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）において飽和させた。マトリックスと試料（１ｍｇ／ｍＬ）を等体積で予混合し、分析用に１μＬを乾燥液滴法により接地鋼板に被着させた。ＭｉｃｒｏｆｌｅｘＬＲＴマトリックス支援レーザー脱離法およびイオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計（ＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓＩｎｃ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を、陽イオン検出でのリニアモードに設定し、質量スペクトルを得た。結果は、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチンが、質量６１，７８１の主要なピークを与えたことを示している。類似のＭＡＬＤＩ実験におけるＣＲＭ_１９７の質量は５７，９６７ダルトンであった（図示せず）。したがって、質量差は３，８１４ダルトンである。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌおよびリンカーの質量は４６１ダルトンであるため（データは示さず）、これは、１ＣＲＭ_１９７分子当たり約８個のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ−リンカー部分が添加されたことを示す。より大きな形態は検出されなかったが、これは、分子が大きくなるほどＢｒｕｋｅｒＤａｌｔｏｎｉｃｓの機器を用いた検出が困難になるという事実に起因し得る。

ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−ＧａｌＣＲＭ_１９７コンジュゲート抗体は、Ｃ．ジェジュニＨＳ２３／３６細胞の細胞表面を認識し、殺菌活性を有する
本発明者らは、以前、Ｃ．ジェジュニに対する免疫原性莢膜多糖類コンジュゲートワクチン（「従来の」ワクチン）が血清殺菌抗体（ＳＢＡ）を誘発することを実証した（データは示さず）。換言すれば、従来の多糖類ワクチンに対して産生された抗体は、補体の存在下で細菌と結合し、細菌溶解を誘導し得る。上記の実施例で論じたように、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌは、合成されて、ＨＳ２３／３６およびＨＳ４の両方に基づく従来のＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチンに対する抗体と反応することが示されている。１タンパク質当たり約８個のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ部分を有するＣＲＭ_１９７に結合されたＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなるワクチンコンジュゲートを、上記のように合成し、ウサギの免疫原性に対して試験した。

材料および方法
ウサギを、フロイントアジュバント（ＢＤＤｉｆｃｏブランド１０ｍｌに５ｍｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍを含有し、抗原と１：１で投与される（Ｂｅｃｔｏｎ、ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏ．、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ））を含む合成ＣＲＭ_１９７ワクチンコンジュゲート（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）に結合した４回用量（それぞれ２５０μｇ）のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌで免疫化した。最終血清を、ＢＳＡにコンジュゲートしたＣ．ジェジュニ８１−１７６莢膜が検出抗原であるＥＬＩＳＡで使用した。血清のエンドポイント力価は、１：２００であった。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌに対して産生したウサギ血清を、３０分間５６℃に加熱することにより熱失活させて、内因性補体を不活性化した。対照として、同じウサギの前出血（免疫前）も熱失活させた。血清をマイクロタイタープレートで連続希釈し、Ｃ．ジェジュニ８１−１７６および仔ウサギ補体と混合した。そのプレートを、３７℃で微好気的条件下でインキュベートした。各ウェルからのアリコートをミューラー・ヒントン寒天培地プレート上にプレーティングして、生き残った細菌細胞を数え上げた。結果は、免疫したウサギの前出血と最終出血との間の死滅の倍数増加として報告される。

合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチンで免疫したウサギの結果は、血清殺菌活性の１６倍の増加を示した。フローサイトメトリーからの結果を図１１に示す。データは、コンジュゲートワクチン（例えば、図９の化合物１４）が、Ｃ．ジェジュニＨＳ２３／３６細胞の細胞表面に露出したＣＰＳＭｅＯＰＮ→６−Ｄ−Ｇａｌ結合に特異的なウサギにおける抗体を誘導することができることを示す。Ｃ．ジェジュニＨＳ２３／３６細胞への結合強度は、天然のＣＰＳコンジュゲートによって惹起された抗体を用いる場合よりも高かった。Ｃ．ジェジュニＨＳ２３／３６細胞への結合強度は、合成ワクチンに惹起された抗体では少なかったが、細胞の一部は、ＭｅＯＰＮ→６−Ｄ−Ｇａｌ抗体と全く反応しなかった。しかし、これらの抗体の、ＨＳ２３／３６細胞の表面への結合は、上記のＳＢＡ力価の観察された上昇と一致する。

カンピロバクター・ジェジュニ合成抗原を含むポリマーコンストラクトの合成
１つまたは複数の合成ＭｅＯＰＮ−単糖類を含み、任意選択的に１つまたは複数の他の糖類と関連させた免疫原性合成コンストラクトが、本明細書において企図される。合成されたそのようなポリマーコンストラクトの例が、本明細書において図１５および図１８に示されている。

材料および方法
図１５のマルチＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌポリマーコンジュゲートを、従来の方法、市販の試薬、および本明細書および前述の実施例に開示された単糖類を用いて合成した。リントナーデンプン（１００ｍｇ）を、０．１ＭＮａＯＡｃ緩衝液（１００ｍｌ）ｐＨ４中の０．０４ＭＮａＩＯ_４により、４℃で３日間活性化した。水に対して２日間透析（１０００ダルトン分子カットオフ）した後、生成混合物を遠心分離した。上清を凍結乾燥し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｐ−２カラム（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でさらに精製した。

活性化されたデンプン（８ｍｇ）を、０．１Ｍホウ酸塩緩衝液（５ｍｌ）、ｐＨ９中で、ＭｅＯＰＮ→６−β−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→Ｏ（ＣＨ２）_５ＮＨ_２（４ｍｇ）に化学的にコンジュゲートした。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４０ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で１日、３７℃で２日間撹拌した。その後、コンジュゲートを流水に対して２日間透析（１０００Ｄａ）した後、凍結乾燥した。

デンプン−糖コンジュゲート生成物（４ｍｇ）を、０．１Ｍホウ酸塩緩衝液（５ｍｌ）、ｐＨ９中のＣＲＭ_１９７（４ｍｇ）とコンジュゲートした。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４０ｍｇ）を加え、反応混合物を室温で１日、３７℃で２日間撹拌した。その後、コンジュゲートを流水に対して２日間透析（１０００Ｄａ）した後、凍結乾燥した。得られた合成コンジュゲートを、図１６および１７にそれぞれ示すように、ウエスタンゲルおよびイムノブロッティングおよび１ＨＮＭＲを用いて特徴付けた。簡単に説明すると、イムノブロットでは、合成コンジュゲートを１２．５％ポリアクリルアミドゲルで二通り電気泳動した。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）システム（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてゲルの一部を染色し他の部分をニトロセルロースに転写し、Ｃ．ジェジュニ株８１−１７６のホルマリン死滅全細胞に対するウサギ過免疫血清で免疫検出した（２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．４２５ＮＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０であるＴＢＳＴ中の最終希釈１：５００）。このフィルターを一次抗体と一晩反応させた後、洗浄した。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧであった（ＴＢＳＴ中の最終希釈１：５０，０００）。洗浄後、フィルターをＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＷｅｓｔＦｅｍｔｏＭａｘｉｍｕｍＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＳｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で検出し、画像をバイオ・ラッドゲル画像システムで記録した。

図１８に示す合成ポリマーコンジュゲートを、従来の方法および試薬を用いて同様に調製し、タンパク質担体にコンジュゲートした。図１５に示すコンジュゲートとは対照的に、図１８に示す合成コンストラクトは、複数のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ単糖類のみならず、複数のＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−１−Ｆｒｕ単糖類をも含む。上記のように、さまざまな単糖類は、デンプン骨格を使用して化学的に関連（コンジュゲート）させられる。糖は、糖とデンプンとの間の橋渡しをすることができるリンカーを化学的に備えている。キャリアタンパク質は、コンストラクトに付加される。

カンピロバクター・ジェジュニ株８１−１７６の多糖類莢膜におけるＯ−メチルホスホルアミデート修飾の位置における相可変の変化による血清耐性のＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌおよびモジュレーションの同定。
図１９（Ａ）は、示したＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの位置（Ｒ＝ＨまたはＭｅＯＰＮ）での８１−１７６莢膜トリサッカリドの２つの反復の構造を示す。図１９（Ｂ）は、８１−１７６の可変ＣＰＳ遺伝子座における遺伝子のカートゥーンを示す図である。８１−１７６の可変ＣＰＳ遺伝子座は、灰色で示されたｋｐｓＣ（ＣＪＪ８１１７６＿１４１３ｃ）とｋｐｓＦ（ＣＪＪ８１１７６＿１４３７ｃ）の間に位置し、２２個の遺伝子を包含する。既知の機能の遺伝子にはラベルが付されている。ＭｅＯＰＮの合成に関与する遺伝子には、ｍｐｎＡ−Ｄというラベルが付され（Ｍａｕｅ，ＡＣｅｔａｌ．２０１３ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．８１：６６５−６７２）、ラベルが付された残りの遺伝子は、ヘプトース合成に関与する。黒色の遺伝子は、２つの推定ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼ、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０およびＣＪＪ８１１７６＿１４３５を表している。

以下に提示されるデータは、ガラクトースの４位でのカンピロバクター・ジェジュニ株８１−１７６ＣＰＳにおけるＭｅＯＰＮ修飾（ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ）の第３の部位の存在を確認し、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０遺伝子が、この活性に関与しているトランスフェラーゼをコードすることを示している。ＣＪＪ８１１７６＿１４２０遺伝子が、インビトロ培養の中に主に「ＯＦＦ」配置であると思われるにもかかわらず、ＭｅＯＰＮが、正常ヒト血清（ＮＨＳ）に存在する抗グリカン抗体の結合を遮断することによって補体に対する耐性を媒介すると思われること、およびＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌが、補体媒介性死滅に対する耐性に関与している主要な修飾であると思われることもデータは示す。

材料および方法
株および増殖条件：すべての作業は、Ｃ．ジェジュニの８１−１７６株で行った。この実施例に使用される、この株の突然変異体を表１に列挙する。^＊Ｒ、相変化（ｐｈａｓｅｖａｒｉａｔｉｏｎ）を受けるＧのホモポリマー性トラクトは、本明細書に記載されるように、修復された。

株の構築のためＣ．ジェジュニを、３７℃、微好気的条件下で市販のミューラー・ヒントン（ＭＨ）寒天で日常的に培養した。培地には、抗生物質耐性マーカーを有する突然変異体に対する必要に応じて抗生物質を補充した（Ｙａｏ，Ｒ．ｅｔａｌ．１９９３Ｇｅｎｅ１３０：１２７−１３０）。莢膜抽出に関して細菌細胞は、３７℃、微好気的環境で、ブタブレインハートインフュージョン培地（Ｄｉｆｃｏ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ）中で増殖される。細菌細胞塊は、ＣＰＳ／ＬＯＳの続く抽出および精製のため、集められ、凍結され、凍結乾燥され得る。

細胞全体の塊からの炭水化物の抽出には、熱水／フェノール抽出を使用する（ＷｅｓｔｐｈａｌＯ，ＪａｎｎＫ．ＧｅｎｅｒａｌＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９６５；５：８３−９１；ＣｈｅｎＹ−Ｈｅｔａｌ．，ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ．２００８；３４３：１０３４−１０４０）。凍結乾燥された細胞全体のペレットを破砕した後に、得られた粉末が、丸底フラスコに加えられる。所定の量の水が、その後、反応フラスコに加えられる。フェノールが、７０〜７５℃で一時間撹拌後に、フラスコに加えられる。溶液は、その後、７０〜７５℃で追加の６〜７時間撹拌し、規定時間後に、氷に直ちに移される（ＷｅｓｔｐｈａｌＯ，ＪａｎｎＫ．ＧｅｎｅｒａｌＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９６５；５：８３−９１；ＣｈｅｎＹ−Ｈｅｔａｌ．，ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ．２００８；３４３：１０３４−１０４０）。反応混合物は、水およびフェノールの二層に分離する。炭水化物は水層に見られ、細胞の親油性成分はフェノール中に残る。水層は、集められ、新鮮な脱イオン水（ｄＨ_２Ｏ）で置換される。反応は、追加の２日繰り返される。集められた水層は少量のフェノールをなおも含有し、これらの分子は透析の使用により除去することができる。水層は、１ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）バギング（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）、ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＲａｎｃｈｏＤｏｍｉｎｇｕｅｚ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で一晩ｄＨ_２Ｏの流水下に配置される。ＣＰＳは、そのより大きな分子量に起因して１ｋＤａＭＷＣＯバギングの内側に保持される。透析した層は、凍結され、さらなる精製および分析のため凍結乾燥される。凍結乾燥された水層からの生成物は、さらに精製される。Ｃ．ジェジュニの場合、回収された塊が１５０００ｒｐｍで６時間超遠心分離され、水性ＣＰＳからＬＯＳが除去される。ＬＯＳのペレットおよび水性ＣＰＳは、両方とも凍結され、凍結乾燥される。水性ＣＰＳ生成物は、その後、分離にサイズ排除を使用する、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ（登録商標）ポリアクリルアミドＰ２カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）の使用によってさらに精製される。集められた画分は、続く実験に使用し得る。

オリゴヌクレオチドプライマー。使用したすべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、表２に列記され、これらはＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）によって合成された。

ＮＭＲおよびガスクロマトグラフ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）分析：^１Ｈ、^１３Ｃおよび^３１ＰＮＭＲ実験を、ＣｒｙｏＰｒｏｂｅ（商標）（ＢｒｕｋｅｒＣｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を備えたＢｒｕｋｅｒＡＭＸ４００分光計を用いて記録した。実験を、２９３Ｋまたは３１５Ｋで実行した。ヘテロ核単一量子相関分光法（ＨＳＱＣ）およびヘテロ核多重結合相関分光法（ＨＭＢＣ）実験は、ＢｒｕｋｅｒＴｏｐＳｐｉｎ（商標）３．０ソフトウェアを用いて行った。分析の前に、試料は、Ｄ_２Ｏ（９９．９％）で３回凍結乾燥した。δ_Ｈ４．８２１でのＨＯＤ共鳴は、^１Ｈ実験に対する内部標準として使用された。Ｄ_２Ｏ中のＴＳＰの標準を使用して、ＨＯＤシグナルに対する基準を確立した。オルトリン酸（δ_Ｐ０．０）を、すべての^３１Ｐの実験の外部基準として使用した。

単糖の特徴付け：単糖を、酢酸アルジトール誘導体として特徴付けた。ＣＰＳを１０５℃で４Ｍトリフルオロ酢酸で最初に消化し、その後、モノマーを水中で一晩室温でＮａＢＤ_４で還元した。アルジトールを、１０５℃で無水酢酸でアセチル化した。得られた酢酸アルジトールをジクロロメタンを用いて抽出し、ＤＢ−１７キャピラリーカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を備えたＴｈｅｒｍｏＦｉｎｉｇａｎＰｏｌａｒｉｓＱＩｏｎＴｒａｐにおいてＧＣ−ＭＳによって分析した。

ウサギポリクローナル抗血清：３つのバッチのＨＳ２３／３６−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチン、つまり、ＣＣＶ（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，ＭＡｅｔａｌ．２００９Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７７：１１２８−１１３６）、ＤＢ４、およびＣＪＣＶ１（ＤａｌｔｏｎＰｈａｒｍａ、ＴｏｒｏｎｔｏＣａｎａｄａ）に対して、ウサギの高度免疫ポリクローナル抗体を作製した。コンジュゲートワクチンＣＣＶを、Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，ＭＡｅｔａｌ．２００９Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７７：１１２８−１１３６に記述のように産生した。簡単に説明すると、Ｃ．ジェジュニ株８１−１７６を増殖させ、莢膜を上で記載されるように単離した。８１−１７６の単離されたＣＰＳを、ＣＰＳの非還元端で戦略的に作製させたアルデヒドとＣＲＭ_１９７のアクセス可能なアミンとの間の還元的なアミノ化によって、キャリアタンパク質ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートした。使用したＣＰＳ：ＣＲＭ_１９７比は、重量比で２：１であった。８１−１７６のホルマリン固定全細胞に対するウサギポリクローナル血清が、これまでに報告されている（Ｂａｃｏｎ，ＤＪｅｔａｌ．２００１Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：７６９−７７７）。

ＰＣＲ：クローニングまたは配列分析のために産生されたすべてのＰＣＲ生成物を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ハイフィデリティーポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて増幅した。他のすべてのＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を使用した。

ＣＰＳ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートにおけるＭｅＯＰＮのレベルを決定するための抗−ＣＰＳＥＬＩＳＡ：３つのＣＰＳ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート上のＭｅＯＰＮの相対レベルを決定するために、コンジュゲートを、総ＣＰＳ含量に基づいて標準化し、カーボネートコーティング緩衝液中、ＭａｘｉＳｏｒｐＮｕｎｃ（登録商標）プレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）上で、４℃で一晩連続希釈した。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳＴ中のＢＳＡで、３７℃で１時間ブロックした。ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを検出するために、プレートを洗浄し、ＤＢ３モノクローナル抗体をブロッキング緩衝液で希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後にヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌのテトラメチレンベンジジン（ＴＭＢ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）基質を１０分間添加した後、１００μｌの１ＭＨ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させた。ＯＤを４５０ｎｍで読み取った。

ハイブリドーマの産生：（Ｎｙａｍｅ，ＡＫｅｔａｌ．２００３Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１０４：１−１３）に従って、（４週間間隔で３回）ＣＰＳ８１−１７６−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートで皮下免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞をＳＰ２／Ｏ骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４；ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８１、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）と融合させて、ハイブリドーマを作製した。簡単に説明すると、脾臓細胞およびＳＰ２／Ｏ細胞をポリエチレングリコールの存在下で融合させ、ハイブリドーマ培地（２０％ＦＢＳ、２ｘＨＡＴ（２００ｍＭヒポキサンチン、０．８ｍＭアミノプテリン、３２ｍＭチミン）、ＯＰＩ（１ｍＭオキサロ酢酸、０．４５ｍＭピルビン酸、および０．２Ｕ／ｍＬインスリン）、４ｍＭグルタミン、ならびにＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有するイスコフ培地）において非免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の腹腔マクロファージと混合した。融合した細胞を直ちに８枚の９６ウェル細胞培養プレート上にプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中で２週間インキュベートした。ハイブリドーマを、抗原標的として８１−１７６およびｍｐｎＣ突然変異体の両方に由来するＣＰＳのＢＳＡコンジュゲートを用いて、ＥＬＩＳＡによって各ウェルから培養上清をスクリーニングすることによって選択した。

モノクローナル（ｍＡｂ）ＤＢ３の産生および精製：単一細胞ハイブリドーマクローンを、イスコフ培地中で２．５％ＦＢＳまでウィーニングしながら、１６個のＴ−１５０フラスコに徐々に増殖させた。細胞を１Ｌの無血清培地（ＳＦＭ）を含有する２Ｌローラーボトルに移し、３７℃、５％ＣＯ_２で４週間培養した。ＳＦＭ中のｍＡｂＤＢ３を、メーカーの説明書（ＰａｌｌＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＣｏｒｐ．、ＰｏｒｔＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）に従って、ＭＥＰ−ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）カラムで精製した。溶出した抗体をＴＢＳ（０．０５ＭＴｒｉｓ／０．１５ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）に透析し、タンパク質含量をＢＣＡアッセイによって決定した。アリコートは、さらなる特徴付けおよび使用のために−８０℃で保存した。アイソタイプは、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＲａｐｉｄＩｓｏｔｙｐｉｎｇＫｉｔ（カタログ番号２６１７８；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて決定した。

フローサイトメトリー：８１−１７６株をＭＨ寒天上で２０時間増殖させ、細胞を５ｍＬのＰＢＳに回収し、１．２ミクロンフィルターで濾過した。得られた懸濁液をＯＤ_６０００．１に調整し、１ｍｌを１２０００ｇで２分間スピンダウンした。ペレットを０．５ｍｌの４％ホルムアルデヒドに再懸濁し、室温で１０分間回転子上でインキュベートした。細胞を遠心分離し、氷冷ＰＢＳＴで２回洗浄し、最終濃度１１２μｇ／ｍｌのコンジュゲート抗体またはＤＢ３モノクローナル抗体で免疫した超免疫ウサギ由来の血清の１：５０希釈液１００マイクロリットルに再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。懸濁液を氷冷ＰＢＳＴで２回洗浄した後、過免疫血清またはラット抗マウスＩｇＧ１ＰＥ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）に対するロバ抗ウサギＩｇＧＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）と共にインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートした。懸濁液を氷冷ＰＢＳＴ中で２回洗浄し、０．５ｍｌＰＢＳＴに再懸濁し、ＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）で読み取った。データは、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて分析した。

ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異：ＣＪＪ８１１７６＿１４２０を、ＥｃｏＲおよびＸｈｏＩ部位をそれぞれ導入したプライマーｐｇ１２．１３およびｐｇ１２．１４を用いてｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）にクローニングした。このプラスミドを、ＴｎｐＫｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてトランスポゾン突然変異誘発に付し、個々のＫｍ^ｒトランスポゾン挿入をトランスポゾン内部のプライマーで配列決定して挿入部位を決定した。１７７９ｂｐ遺伝子のｂｐ３６７での非極性トランスポゾン挿入を用いて、上述した方法によりＫｍ^ｒに８１−１７６を電気穿孔した（Ｙａｏ，Ｒ．ｅｔａｌ．１９９３Ｇｅｎｅ１３０：１２７−１３０）。推定突然変異は、カナマイシン遺伝子の挿入点を囲むプライマーｐｇ１２．２５およびｐｇ１２．２６を用いたＰＣＲによって確認され、この突然変異体は、株３４７７と呼ばれた。

ＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異：ＣＪＪ８１１７６＿１４３５を、プライマーｐｇ１０．０７およびｐｇ１０．０８を用いてｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）にクローニングした。ｐＲＹ１０９（Ｙａｏ，Ｒ．ｅｔａｌ．１９９３Ｇｅｎｅ１３０：１２７−１３０）由来のｃａｔカセットを、１８１３ｂｐ遺伝子のｂｐ７４７に位置するユニークなＮｃｏＩ部位にクローニングした。クローンを部分的に配列決定してｃａｔカセットの配向を決定し、遺伝子がＣＪＪ８１１７６＿１４３５と同じ配向で挿入されたものを用いてＣｍ^ｒに８１−１７６を電気穿孔した。挿入のＮｃｏＩ部位を囲むｐｇ１４．６７およびｐｇ１４．６８を用いたＰＣＲによって推定クローンを確認し、得られた突然変異体を株３６３６と呼んだ。

両方の推定上のＭｅＯＰＮトランスフェラーゼにおける二重突然変異体の構築：株３４７７、つまり、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０：：ａｐｈ３を、株３６３６を産生するのに使用したのと同じプラスミドを用いてＣｍ^ｒに電気穿孔し、二重突然変異株３４７９を産生した（表１参照）。

ｈｉｐＯ挿入ベクターの構築：８１−１７６のｈｉｐＯ遺伝子（ＣＪＪ８１１７６＿１００３）（非必須酵素ベンゾイルグリシンアミドヒドロラーゼをコード）を、プライマーセットｐｇ１２．３１およびｐｇ１２．３２を用いてｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）にクローニングした。ユニークなＸｂａＩ部位を、プライマーセットｐｇ１２．３３およびｐｇ１２．３４を有する逆ＰＣＲによってｈｉｐＯ遺伝子の中心に導入した。このプラスミドは、ｐＣＰＥ３４９０と呼ばれた。

ＣＪＪ８１１７６＿１４２０およびＣＪＪ８１１８７＿１４３５の修復対立遺伝子を発現する株の構築：ＣＪＪ１４２０：：ａｐｈ３突然変異体を、以下のように、修復された対立遺伝子で補完した。野生型ＣＪＪ８１１７６＿１４２０遺伝子を、それぞれＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲ１部位を導入する、プライマーｐｇ１２．２９およびｐｇ１２．３０を用いてＰＣＲ増幅し、得られた単位複製配列を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＸｂａＩとＢａｍＨＩ部位の間にクローニングされたｆｌａＡからのσ^２８プロモーターを含有する、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ消化したｐＣＰＥ１０８にクローニングした（Ｅｗｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．，ｅｔａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９１：７０８６−７０９３）。ＣＪＪ８１１７６＿１４２０内の相可変Ｇ９トラクトを、Ｇ９がプライマーｐｇ１２．３７およびｐｇ１２．３８を用いてＧＧＡＧＧＡＧＧＡに変更されるように突然変異誘発（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ；ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）によって修復した。挿入物全体をＥｃｏＲ１−ＮｏｔＩ断片としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）に移し、ｐＲＹ１０９（Ｙａｏ，Ｒ．ｅｔａｌ．１９９３Ｇｅｎｅ１３０：１２７−１３０）由来のＳｍａＩ末端ｃａｔカセットを、修復したＣＪＪ８１１７６＿１４２０遺伝子に対して３’のＥｃｏＲＶ部位に挿入した。全体構造（σ^２８−ＣＪＪ８１１７６＿１４２０＋ｃａｔ）を順方向および逆方向プライマーでＰＣＲ増幅し、平滑末端化した（上記の）ｐＣＰＥ３４９０のｈｉｐＯ遺伝子内のユニークなＸｂａＩ部位にクローニングした。この構造（ｐＣＰＥ３４９４と呼ばれる）を使用して、３４７７（ＣＪＪ８１−１７６＿１４２０：：ｃａｔ突然変異体）をＫｍ^ｒに電気穿孔し、株３４９８を産生した。

ＣＪＪ１４３５：：ｃａｔ突然変異体を、同様のアプローチを用いて補完した。プラスミドｐＣＰＥ１０８を、ポリリンカーのＸｈｏＩ部位にａｐｈ３遺伝子を含むように修飾して、ｐＣＰＥ３５８３を生成した。ＣＪＪ８１１７６＿１４３５を、ＢａｍＨＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位をそれぞれ導入したプライマーｐｇ１４．３５およびｐｇ１４．０３を用いてＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲ１で消化したｐＣＰＥ３５８３にクローニングした。ＣＪＪ８１１７６＿１４３５のコード領域内に位置する相可変Ｇ９トラクトを、プライマーｐｇ１４．０９およびｐｇ１４．１０を用いて上記のように部位特異的突然変異誘発に供した。修復されたＣＪＪ８１１７６＿１４３５遺伝子および隣接するａｐｈ３遺伝子を、順方向および逆方向プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、上述したように、株８１−１７６のａｓｔＡを含むプラスミド上のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした（Ｅｗｉｎｇ，Ｃ．Ｐ．，ｅｔａｌ．（２００９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９１：７０８６−７０９３；Ｙａｏ，Ｒ．ａｎｄＧｕｅｒｒｙ，Ｐ．（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３３３５−３３３８）。このプラスミドを用いて、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５突然変異（株３６３６）をＫｍ^ｒに電気穿孔し、株３６３７を産生した。

また、ＮＭＲ研究のため、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５突然変異体のバックグラウンドでＣＪＪ８１１７６＿１４２０を過剰発現させたＣ．ジェジュニ株を構築した。ＣＪＪ８１１７６＿１４２０突然変異体（上記）の補体を構築するため使用されたプラスミドｐＣＰＥ３４９４を、野生型８１−１７６に電気穿孔して、株３５０１を産生した。プラスミドｐＡＣ１（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ａ．ａｎｄＧａｙｎｏｒ，Ｅ．Ｃ．（２０１４）ＰｌｏｓＯｎｅ９，ｅ９５０８４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９５０８４）からのアプラマイシンカセットを、上記ＣＪＪ８１１７６＿１４３５のクローン中のユニークなＮｃｏＩ部位に挿入した。このクローンを、株３５０１に電気穿孔して、株３７１８を産生した（表１を参照されたい）。

高度免疫ウサギまたは正常ヒト血清（ＮＨＳ）における抗ＣＰＳ応答を決定するための抗ＣＰＳＥＬＩＳＡ：高度免疫ウサギまたはＮＨＳにおける抗ＣＰＳ応答を決定するために、Ｃａｒｂｏ−ＢＩＮＤ（商標）プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を、メーカーの説明書に従って、野生型、３３９０、３４７７、または３６３６株（酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中２μｌ／ｍｌ）からの酸化ＣＰＳの１００μｌで、室温で１時間コーティングした。プレートを１ｘＰＢＳ−（ＮＨＳに対して０．０５％カゼイン）で１時間３７℃洗浄し、ＰＢＳＴで再度洗浄した。すべての血清を、ブロッキング緩衝液で二通り連続希釈し、３７℃で１．５時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を５％ＦＣＳ−ＰＢＳＴで希釈し、洗浄前に１ウェル当たり１００μｌで、３７℃で１時間添加した。ウサギに対してＡＢＴＳ−ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）またはＮＨＳに対して３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を検出試薬として使用し、それぞれＯＤ_４０５またはＯＤ_４５０を測定した。陰性対照ウェル（コーティングバッファーのみ）＋３標準偏差の平均ＯＤを用いてエンドポイント力価を決定した。

ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの相変化：２つのＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの可変領域を、保存領域に位置するｐｇ１２．１７およびＣＪＪ８１１７６＿１４２０に特異的であるｐｇ１５．１３またはＣＪＪ８１１７６＿１４３５に特異的であるｐｇ１５．１４でＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ生成物を、精製し、ｐｇ．１２．１７で配列決定した。

補体死滅：血清耐性アッセイに対して、細菌株は、二相性のＭＨ培養で１８から２０時間、３７℃で増殖された。プールされた正常ヒト血清（ＮＨＳ）をＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、１つのロットをすべての実験に使用した。アッセイを、Ｍａｕｅ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１３）ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．８１：６６５−６７２に記載のように実施した（但し、一範囲のＮＨＳが使用された）。簡単に説明すると、ＭＨ二相性培地で増殖させたＣ．ジェジュニの培養物（１８時間培養）を洗浄し、最小必須培地（ＭＥＭ）中に０．１のＯＤ_６００に調整した。アリコート（１００μｌ）を、異なるパーセンテージのＮＨＳを補充した９００μｌの予熱したＭＥＭを含有している２４ウェルプレートのウェルに添加し、３７℃で微好気的条件下でインキュベートした。生存菌のパーセンテージを、ＭＨ寒天プレート上での段階希釈によって決定した。アッセイを、各株について２〜９回繰り返した。統計は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して行った。

結果
８１−１７６ＣＰＳに対するＭｅＯＰＮ修飾：質量分析を用いて、本発明者らは、８１−１７６ＣＰＳのガラクトースの２位（ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ）で不定比ＭｅＯＰＮ単位を以前に検出（Ｋａｎｉｐｅｓ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：３２７３−３２７９）したが、^３１Ｐ共鳴は図２０Ａにおけるものと同様であった（ピークＹ）。^１Ｈ−^３１Ｐ相関実験におけるＭｅＯＰＮの^３１Ｐ共鳴Ｙ（δ_Ｐ１４．４５）とガラクトース単位のＨ−２（δ_Ｈ４．５２）との間のクロスピークの検出により、このＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ結合をＮＭＲにより確認した（図２６Ａ）。

いくつかの８１−１７６ＣＰＳ調製物において、より低い強度ではあるが、^３１ＰＮＭＲスペクトルは、δ_Ｐ１４．１５（指定ピークＺ）で追加の共鳴を提示した（図２０Ｂ）。また、同様のピーク（データは示さず）が、ＭｅＯＰＮのリンとＣＰＳガラクトース単位のいくつかのＨ−６共鳴との間にクロスピーク（図２６Ｂ）を示した、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異体（株３４７７と呼ばれる、表１を参照されたい）の^３１ＰＮＭＲにおいても観察され、これは、ＭｅＯＰＮのメチル共鳴（δＨ３．７５〜３．８１）の非常に近くで共鳴した。ＮＭＲデータは、８１−１７６野生型および株３４７７（ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異体）のピークＺが、ガラクトースの６位のＭｅＯＰＮ（ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ）の不定比配置に対応することを示唆し、これは、合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを用いるデータと一致する。ＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異体である、株３６３６の^３１ＰＮＭＲスペクトル（図２０Ｃ）は、ピークＹまたはピークＺのいずれも示さなかったが、δＰ１４．７３（図２０Ｃ中の指定ピークＸ）で以前には見られないリン共鳴を生じた。

２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＮＭＲ実験は、ピークＸとδ_Ｈ４．８８でのプロトン共鳴との間の結合を示した（図２７）。両方のトランスフェラーゼにおける二重突然変異体（株３４７９）からの^３１ＰＮＭＲスペクトルは、ＭｅＯＰＮ共鳴を示さなかった（データ示さず）ため、この活性はＣＪＪ８１１７６＿１４２０によってコードされなければならない。追加の構造分析において使用するための、株３７１８と呼ばれる新しい株を構築し、ここで、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の修復され、過剰発現された対立遺伝子は、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５突然変異体である株３６３６に導入された（材料および方法および表１を参照されたい）。

Ｃ．ジェジュニ株３７１８の莢膜およびＭｅＯＰＮ結合の特徴付け：株３７１８ＣＰＳの糖組成および結合解析は、８１−１７６野生型ＣＰＳにおけるように、３−置換Ｇａｌおよび３−置換ＧｌｃＮＡｃが、トリサッカリド反復ブロックの一部であることを示した。しかしながら、８１−１７６野生型ＣＰＳにおいて典型的に見られる２−置換６−デオキシ−３−Ｏ−メチル−アルトロ−ヘプトース誘導体の代わりに、大多数の３７１８ＣＰＳ中のヘプトースは、非メチル化２−置換６−デオキシ−アルトロ−ヘプトース（６ｄ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐ）として存在した。

株３７１８ＣＰＳのより注目すべき構造上の偏りが^３１ＰＮＭＲ分光法によって示され、δ_Ｐ１４．７２での共鳴Ｘを提示した（図２０Ｃ）。この^３１Ｐ共鳴は、Ｇａｌの２および６位での以前に特徴付けたＭｅＯＰＮ置換に属さず、したがって、株３７１８が別のＭｅＯＰＮ置換を有するＣＰＳを産生するという事実が指摘された。この新しいＭｅＯＰＮ部分（ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ）の特徴付けは、実施例９に詳細に記載される。簡単に説明すると、付随的な２Ｄ ^１Ｈ−^３１Ｐヘテロ核相関（ＨＭＢＣ）実験は、１４．７２ｐｐｍでの新しいＭｅＯＰＮ ^３１Ｐ共鳴と４．９２ｐｐｍでのＣＰＳ ^１Ｈ共鳴との間の新しい相互接続性を示した（図２６Ｃ；図２１Ｃとの比較）。１Ｄ ^１Ｈ−^１Ｈ選択的な全相関分光学（ＴＯＣＳＹ）法（実施例９に記載される）を用いて、δ_Ｈ４．９２でのピークが照射を受けて、そのδ_Ｈ３．９３２およびδ_Ｈ４．２０３での２つの環プロトン共鳴に対するおよびδ_Ｈ５．０５７でのアノマー共鳴に対する結合が示された。δ_Ｈ５．０５７でのアノマー共鳴も順に照射を受けて、そのδ_Ｈ４．９２０、δ_Ｈ４．２０３およびδ_Ｈ３．９３２での環共鳴に対する関連性が確認された。これらのデータが、２Ｄ ^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹ実験（実施例９に記載される）と組み合わされて、環プロトンの割当をもたらした：δ_Ｈ−１５．０５７、δ_Ｈ−２３．９３２、δ_Ｈ−３４．２０３、δ_Ｈ−４４．９２０およびδ_Ｈ−５４．２５０。したがって、新しいＭｅＯＰＮ結合は、この環系の４位に関与する。

ＣＰＳトリサッカリド反復と関連した単糖環炭素を、２Ｄ ^１Ｈ−^１３ＣＨＳＱＣにより割当てた。図２７は、「Ａ」が６ｄ−α−ａｌｔｒｏ−ＨｅｐのＨ−１／Ｃ−１を表し、「Ｂ」がα−ＧａｌのＨ−１／Ｃ−１を表し、「Ｃ」がβ−ＧｌｃＮＡｃのＨ−１／Ｃ−１を表す、３つのアノマーのクロスピークを示す。環系Ａ（６ｄ−α−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐ）炭素は、δ１０１．６（Ａ−１）、８５．２（Ａ−２）、７２．６（Ａ−３）、７４．０（Ａ−４）、７０．１（Ａ−５）、３６．４（Ａ−６）、３６．５（Ａ−６’）、および６１．０（Ａ−７）に位置した。δ８５．２でのＡ−２の低磁場炭素シフトは、２−置換６ｄ−α−ａｌｔｒｏ−ＨｅｐのＨ−２の割当と一致した。環系Ｂ（α−Ｇａｌ）炭素は、δ９９．６（Ｂ−１）、７０．２（Ｂ−２）、７９．２（Ｂ−３）、７９．０（Ｂ−４）、および７１．６（Ｂ−５）に割当てられた。ここで、δ_Ｃ７９．２の低磁場位置で、３−置換α−ＧａｌのＣ−３が、以前に記載されているＭｅＯＰＮを含有している環系のＨ−３（δ_Ｈ−３４．２０３）とマッチすることもまた観察することができた。さらに、環Ｂ（α−Ｇａｌ）のδ_Ｃ７９．０（δ_Ｈ−４４．９２０）での関連したＣ−４は、３７１８ＣＰＳ中でＭｅＯＰＮを保持するとして特徴付けられた。３−置換β−ＧｌｃＮＡｃ（環系Ｃ）のものである、β−配置におけるトリサッカリド反復の単独単位は、δ１０５．０でＣ−１、δ５９．７でＣ−２、δ７８．０でＣ−３、およびＮ−アセチル部分δ２５．１のＣＨ_３基を含有した。

ＭｅＯＰＮは、抗−８１−１７６コンジュゲートワクチンによって認識される免疫優性エピトープである：データは、抗−コンジュゲート抗体が、合成ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌと反応することを示す。野生型８１−１７６または突然変異体に由来するＣＰＳに対して、ＥＬＩＳＡによって８１−１７６−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチン（ＣＪＣＶ１）に対するウサギ過免疫血清の反応性を調べた。結果は、図２８（Ａ）に示してあり、抗ＣＪＣＶ１抗体の反応が野生型ＣＰＳに対して最も強い（力価：５．９ｘ１０^６）ことを示した。ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを発現するＣＪＪ８１１７６＿１４２０における突然変異体である、株３４７７から精製されたＣＰＳに対する力価における顕著な低下（力価：６．６ｘ１０^５）ならびにＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌのみを発現するＣＪＪ８１１７６＿１４３５における突然変異体である、株３６３６から精製されたＣＰＳに対するさらに大きな低下（エンドポイント力価６００）が存在した。これらの後者２つの力価における差は、免疫コンジュゲートワクチン中に存在する非常にわずかなＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌが存在したことまたはエピトープが不十分に免疫原性であったことを示唆する。興味深いことに、すべてのＭｅＯＰＮを欠く３３９０（ｍｐｎＣ）に由来するＣＰＳに対するエンドポイント力価（８１００）が３６３６のものよりも高く、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌの存在が多糖類鎖に対する抗体の結合を防止することを示唆している。したがって、どちらかと言えば一般的なβ−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１−３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ結合に向かうことが最も起こりそうな（ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐは稀少な糖である）、ＮＨＳ中の莢膜多糖に対する既存の抗体が存在する。ＭｅＯＰＮ部分の存在により、多糖に対するこれらの抗体の結合が防止され、したがって、古典経路による補体媒介性死滅が防止される。コンジュゲートワクチンがＭｅＯＰＮ糖部分に対する抗体を誘導するため、これらの抗体が侵襲性病原体による感染の制御に関して重要である可能性がある補体媒介性死滅を誘導すると予想される。Ｃ．ジェジュニは侵襲性生物であるため、腸における上皮細胞の侵襲後に、高レベルのＮＨＳに遭遇する可能性が予想される。したがって、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０およびＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌを発現する亜集団は、補体媒介性死滅に対してより耐性である可能性がある。

補体媒介性死滅に対する耐性におけるＭｅＯＰＮの役割：ｖａｎＡｌｐｈｅｎらは、彼らの８１−１７６の株の集団が、「ＯＦＦ」配置においてＣＪＪ８１１７６＿１４２０遺伝子を有していたことについて報告していたが（ｖａｎＡｌｐｈｅｎ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＰｌｏｓＯｎｅ９，ｅ８７０５１）、彼らは、両方の推定上のトランスフェラーゼ遺伝子における二重突然変異体を構築し、得られた突然変異体が、補体死滅に感受性であり、ｍｐｎＣ突然変異体での初期の仕事と一致したことを示した（Ｍａｕｅ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１３）ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．８１：６６５−６７２）。両方のＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの可変領域が、本発明者らのバージョンの株８１−１７６の集団から配列決定された場合に、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０も「ＯＦＦ」配置にあったが、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５は「ＯＮ」であった。しかしながら、本発明者らが、８１−１７６の５０の個々のコロニーから両方のトランスフェラーゼの可変領域の配列を決定した場合に、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０を発現する細胞の２４％が「ＯＮ」配置にあったが（１２／５０）、ＣＪＪ８１−１７６＿１４３５を発現する細胞の８２％が「ＯＮ」配置にあった（４１／５０）。細胞の６％（３／５０）のみが、「ＯＮ」配置において両方の遺伝子を発現していた。

本発明者らは、株３４７７（ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異体）、株３６３６（ＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異体）、および両方のトランスフェラーゼを欠く二重突然変異体（株３４７９）の補体死滅（血清耐性）を、血清生存アッセイにおいてＮＨＳの量を増加させながら用いて比較した（表１を参照されたい）。結果は、図２４に示してあり、すべての血清濃度において、株３６３６（ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌを発現するＣＪＪ８１１７６＿１４３５突然変異体）が、野生型よりも有意に耐性があり、また、株３４７７（ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを発現するＣＪＪ８１１７６＿１４２０突然変異体）が、５〜１５％のＮＨＳ濃度において野生型８１−１７６よりも有意に感受性があったことを示す。両方の突然変異体が、それらのそれぞれの修復された対立遺伝子（株３６３７および３４９８）で補完された場合、血清耐性は野生型のものと匹敵するレベルに戻った。図２４を参照されたい。しかし、両方のＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの突然変異（株３４７９）は、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０突然変異（株３４７７）よりも感受性が高くなり、以前に別の二重トランスフェラーゼ突然変異体（ｖａｎＡｌｐｈｅｎ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＰｌｏｓＯｎｅ９，ｅ８７０５１）およびｍｐｎＣ突然変異体（Ｍａｕｅ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．（２０１３）ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．８１：６６５−６７２）に対して報告したのと同様の感受性レベルを示した。

ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの相変化：血清死滅データは、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌの発現が血清耐性を増強させることを示唆した。８１−１７６の一晩の培養物のアリコートを、ミューラー・ヒントン（ＭＨ）寒天に単一コロニーをプレーティングし、別のアリコートを、単一コロニーをプレーティング前に１時間２０％ＮＨＳに露出した。ＣＪＪ８１１７６＿１４２０およびＣＪＪ８１１７６＿１４３５の可変領域を、これらの個々のコロニーから配列決定した。結果は、ＮＨＳへの曝露なしで、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０遺伝子が４２コロニーの９．５％において「ＯＮ」配置にあったことおよびＣＪＪ８１１７６＿１４３５がコロニーの９０．５％において「ＯＮ」にあったことを示し、上記データと一致した。対照的に、ＮＨＳへの曝露後、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０が配列決定した４３コロニーの１００％において「ＯＮ」であったことおよびＣＪＪ８１１７６＿１４３５が配列決定した４３コロニーの５３．５％において「ＯＮ」であった。ＮＨＳへの曝露なしで、４．８％のコロニーが両方の遺伝子に対して「ＯＮ」であり、ＮＨＳへの曝露後に、５３．５％のコロニーが両方の遺伝子に対して「ＯＮ」であった。コロニーは、両方の遺伝子に対して「ＯＦＦ」ではなかった。

正常なヒト血清は、８１−１７６多糖類鎖に対する抗体を含有する：ＥＬＩＳＡを、８１−１７６野生型および突然変異体から精製されたＣＰＳに対する上記の血清死滅実験において使用される血清試料を含む、５つの市販のヒト血清試料（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて行った。結果は、図２８（Ｂ）に示してあり、８１−１７６ＣＰＳに対してＮＨＳ中に既存の抗体（平均力価８００）が存在するが、ｍｐｎＣ突然変異体に由来するＣＰＳに対する力価が有意に高い（２６，４００）ことを示し、ＭｅＯＰＮがＣＰＳに対する既存の抗グリカン抗体の結合をブロックすることを示唆している。コンジュゲートワクチンにおけるＭｅＯＰＮに対する抗体の産生は、血清殺菌抗体（ＳＢＡ）も誘導することができる。突然変異体株３４７７に由来するＣＰＳに対する反応性は、野生型ＣＰＳよりも有意に高かった、このことは集団中の少数の細胞において発現するＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌの欠損と一致した。株３６３６ＣＰＳに対する反応性は、株３４７７ＣＰＳのものよりも有意に高く、ｍｐｎＣ突然変異体（株３３９０）に由来するＣＰＳのものよりもわずかに低かった、このことは集団中の大多数の細胞において発現するＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ修飾の欠損と一致する。

ＤＢ３を用いるフローサイトメトリー分析：図２２（Ｂ）は、モノクローナルＤＢ３が、フローサイトメトリーにより測定されたように、野生型８１−１７６の表面に結合していたが、ドットブロッティング研究から予想されたように、ｍｐｎＣ突然変異体には結合していなかったことを示す（図２２（Ａ））。結合は、ｍｐｎＣ突然変異体の補体である株３３９１で部分的に回復した。同様に、ＤＢ３は、たぶんＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを欠く突然変異体である３６３６には結合せず、結合は、補体である３６３７で部分的に回復した（図２２（Ｃ））。しかし、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌを欠くがＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを保持する突然変異体である３４７７へのＤＢ３の結合は減少した。結合は、補体である株３４９８で増強された（図２２（Ｄ））。

コンジュゲートワクチン上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌのレベルが免疫応答を調節する：３つの独立して生成されたコンジュゲートワクチン上のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌのレベルを測定するためにＤＢ３をＥＬＩＳＡで使用したとき、結合の差異を検出することができた（図２３Ａ）。ＣＣＶは、ヒト以外の霊長類を下痢症から守ることが示されたワクチンであり（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，ＭＡｅｔａｌ．２００９Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７７：１１２８−１１３６）、最も高い結合性を示し、ＤＢ４は中間であり、ＣＪＣＶ１が最も低かった。図２３Ｂに示すように、３つのワクチンのそれぞれに対するウサギ過免疫抗血清に対して野生型８１−１７６およびｍｐｎＣ突然変異体から精製した莢膜に対して、ＥＬＩＳＡによってエンドポイント力価を測定した。各ワクチンは、無傷の野生型莢膜に対する抗体の高力価を誘発したが（ＣＣＶ：６．６ｘ１０^５、ＤＢ４：４．０ｘ１０^６、ＣＪＣＶ１：５．９ｘ１０^６）、各ワクチンのＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの量が減少すると、ｍｐｎＣ莢膜に対する力価は増加した（ＣＣＶ：１００、ＤＢ４：５４００、ＣＪＣＶ１：８１００）。したがって、抗多糖類応答は、ＣＣＶに対して最も低く、ＤＢ４に対しては中間であり、ＣＪＣＶ１に対しては最も高かった。図２３Ｃ〜Ｅは、野生型およびｍｐｎＣ突然変異体の表面に対する各ウサギ過免疫血清の反応性を示す。ＣＣＶは、最高量のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを有し、野生型８１−１７６の表面に結合しているが、ｍｐｎＣ突然変異体３３９０には結合が検出されなかった（図２３Ｃ）。結合は、株３３９１である補体で増強された。ＤＢ４をコンジュゲートする抗体は、野生型８１−１７６の表面に結合し、ＣＣＶと比較してｍｐｎＣ突然変異体への結合の増強を示した（図２３Ｄ）。最後に、ＣＪＣＶ１に対する抗体は、野生型およびｍｐｎＣ突然変異体に等しく良好に結合した（図２３Ｅ）。いずれの抗体もｋｐｓＭ突然変異体には結合しなかった。したがって、ｍｐｎＣ突然変異体に対する表面結合は、ＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌのレベルがワクチンにおいて減少するにつれて増強された。

考察
上記データは、８１−１７６ＣＰＳが、ＭｅＯＰＮ修飾の２つの以前に報告された部位に加えて、第３の部位（ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ）で修飾され得ることを示している。Ｇａｌ−２での修飾が^３１Ｐ−ＮＭＲシグナルとの比較に基づいて好ましい部位であるように思われるが、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５によってコードされるトランスフェラーゼは、二機能性であり、Ｇａｌの２および６位の両方へのＭｅＯＰＮの付加に関与しているように思われる。これは、本発明者らの知識では、二機能性ＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの最初の報告である。ＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異は、ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌの欠損をもたらすのみならず、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０によってコードされるＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌに対応する新しい^３１Ｐ−ＮＭＲシグナルの出現をもたらした。インビトロで増殖させた場合、ほとんどの８１−１７６細胞はＣＪＪ８１１７６＿１４３５を発現し、集団のわずかなサブセット（９．５〜２４％）がＣＪＪ８１１７６＿１４２０を発現した。ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ ^３１−ＰＮＭＲシグナルは、株３６３６（ＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異体）において最初に観察され、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０トランスフェラーゼが、この突然変異体バックグラウンドにおいて過剰発現された株（株３７１８）において特徴付けられた。したがって、２−Ｇａｌおよび６−Ｇａｌに対してＭｅＯＰＮを転移させることができないことは、おそらくは細胞中のＭｅＯＰＮのプールの増加に起因して、Ｇａｌの４−位の修飾を増強すると思われる。興味深いことに、３７１８ＣＰＳはまた、８１−１７６に通常見られる典型的な３−Ｏ−メチル−６ｄ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐの代わりに、大多数の６ｄ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐを含有する。この変化の理由は、不確かなままであるが、８１−１７６ＣＰＳのＨｅｐ組成における類似のシフトは、ディープラフＬＯＳ突然変異体（Ｋａｎｉｐｅｓ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８：３２７３−３２７９）において以前に観察されていた。

モノクローナルＤＢ３は、全細胞ドットブロットにより決定されるようにＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌおよび／またはＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌエピトープに特異的であるように見え、また、これと一致して、フローサイトメトリーにより、野生型８１−１７６の表面には結合しているが、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５またはｍｐｎＣ突然変異体には結合していないように見える。（図２２を参照されたい）。興味深いことに、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０の突然変異によってＤＢ３の表面結合が妨害され、これは、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌの消失がＣＰＳの二次および／または三次構造を変化させ、ＤＢ３の細胞表面へのアクセス可能性を低下させることを示唆している。研究はまだ報告されていないが、多糖類鎖は、細胞質で合成されているため、ＭｅＯＰＮで修飾されている可能性が高い。ＭｅＯＰＮを用いた糖の修飾は、多糖類の折り畳みの変化に影響を及ぼす可能性があり、細胞表面上へのアセンブリ後に、隣接する多糖類鎖間の相互作用にも影響を与え、多糖類の、抗体および／または補体カスケードの成分へのアクセス可能性にも影響を与え得る。これは、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０突然変異体におけるＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌの喪失が、補体媒介性死滅に対する耐性の有意な低下をもたらしたという本発明者らの観察と一致する。

Ｃ．ジェジュニの補体媒介性死滅は、主として古典経路によって起こることが報告されており（ｖａｎＡｌｐｈｅｎ，Ｌ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，（２０１４）ＰｌｏｓＯｎｅ９，ｅ８７０５１；Ｐｅｎｎｉｅ，Ｒ．Ａ．，ｅｔａｌ．，．（１９８６）ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．５２：７０２−７０６）、ＣＰＳは、おそらく、表面タンパク質と交差反応するＮＨＳ中の天然に存在する抗体から細胞を保護する働きをすることが考えられる。しかしながら、上記に考察されるように、本明細書において提示されるデータは、ＭｅＯＰＮ部分が、ＮＨＳにおける既存の抗グリカン抗体から多糖類鎖を保護するため機能することも示唆する。野生型ＣＰＳにおけるＭｅＯＰＮの存在は、すべてのＭｅＯＰＮを欠く株３３９０に由来するＣＰＳと比較して、ＥＬＩＳＡにより測定されたように、これらの抗体の結合を阻害した。したがって、Ｇａｌの２および６位での主要な修飾を欠く株３６３６は、少数のＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ修飾を欠く株３４７７突然変異体でなされるよりも多くの抗体に結合した。しかしながら、株３４７７（ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌを欠く）は、野生型よりも補体媒介性死滅に対してより感受性があり、ＭｅＯＰＮ−２−ＧａｌおよびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを欠く株３６３６は、野生型よりもより血清耐性であった。これは、ＣＪＪ８１１７６＿１４３５の突然変異体において、より多くのＭｅＯＰＮが、Ｇａｌの４位に置かれるとの本発明者らの観察と一致する。ＮＨＳ中の８１−１７６多糖類鎖に対する既存の抗体は、どちらかと言えば一般的なβ−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ−（１−３）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ結合に対し向かうことが起こりそうである（ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐは稀少な糖である）。

血清耐性に対するＧａｌの４位での修飾の重要性は、それがＧｌｃＮＡｃ−（１−３）−Ｇａｌ結合に対する修飾の最も近い部位であり、交差反応する抗グリカン抗体の結合を妨げることに、より有効であり得るとの事実に関連し得る（図２５）。同様に、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌのみを発現する、株３６３６のＣＰＳは、すべてのＭｅＯＰＮを欠く株３３９０よりも、８１−１７６−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートに対して産生されたウサギ過免疫血清に対して、より低いＥＬＩＳＡ力価を有していた。これは、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌが、これらの抗体の多糖に対するアクセスをブロックしたことも示唆する。

ＭｅＯＰＮ修飾は、８１−１７６−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチンにおける免疫優性エピトープであると思われる。したがって、図２８Ａに示すように、コンジュゲートに対するウサギ過免疫血清のエンドポイント力価は、ｍｐｎＣ突然変異体（株３３９０）に由来するＣＰＳと比較して、野生型ＣＰＳに対して＞２ｌｏｇ高い。コンジュゲートワクチン中のＭｅＯＰＮの免疫優性は、他の細菌病原体に基づく多糖類コンジュゲート上のＯ−アセチル基の免疫優性に匹敵するように見える（Ｃａｌｉｘ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，（２０１１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９３：５２７１−５２７８；Ｓｚｕ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔａｌ．（１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９，４５５５−４５６１；Ｆａｔｔｏｍ，Ａ．Ｉ．，ｅｔａｌ．（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：４５８８−４５９２；Ｂｅｒｒｙ，Ｄ．，ｅｔａｌ．（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：３７０７−３７１３）。糖に対する不定比修飾は、多糖類鎖にかなりの異種性を与え、免疫原性に影響を与え得る（Ｋｉｎｇ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔａｌ．（２００７）ＴｒｅｎｄｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：１９６−２０２）。この不均一性はＣ．ジェジュニに関してより複雑であり、その理由は、相変化が、ＭｅＯＰＮ修飾のレベルおよび位置の両方を調節するからである。Ｃ．ジェジュニとの感染の早期に、患者血清が、複数のＣ．ジェジュニ株の補体媒介性死滅の低いレベルを誘導することができるが、感染の４８時間後に、患者が、ＭｅＯＰＮ糖特異的な抗体応答に関連し得る観察である、株特異的な高レベル血清殺菌力価を発生したことが報告されている（Ｐｅｎｎｉｅ，Ｒ．Ａ．，ｅｔａｌ．，．（１９８６）ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．５２：７０２−７０６）。本発明者らは、コンジュゲートワクチン中のＭｅＯＰＮ糖部分に対する抗体が、血清殺菌死滅を誘導できるとの可能性を探求している（以下の実施例１４を参照されたい）。

Ｃ．ジェジュニは、表面抗原の可変性によって特徴付けられる（Ｐａｒｋｈｉｌｌ，Ｊ．，ｅｔａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ４０３，６６５−６６８）。リポオリゴ糖類、ＣＰＳ、および鞭毛に影響を与える遺伝子の相変化は、よく記録されている（Ｌｉｎｔｏｎ，Ｄ．，ｅｔａｌ（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：５０１−５１４；Ｇｕｅｒｒｙ，Ｐ．，ｅｔａｌ．（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：７８７−７９３；Ｈｅｎｄｒｉｘｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：１６４６−１６５９；Ｂａｃｏｎ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０：７６９−７７７）。最近の研究は、相変化に加えて、高頻度の突然変異が、運動性に影響を与える遺伝子において起こり得ることも示している（Ｈｅｎｄｒｉｘｓｏｎ，Ｄ．Ｒ．（２００８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：５１９−５３６；Ｍｏｈａｗｋ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔａｌ．（２０１４）ＰｌｏｓＯｎｅ９：２（ｅ８８０４３）．ｄｏｉ：１０．１３７／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８８０４３）。さらに最近、Ｃ．ジェジュニのストレス応答に関与する、２つの遺伝子ａｐｔおよびｐｕｒＦの挿入、欠失、およびミスセンス突然変異を含む、広範な変化が、報告されている（Ｃａｍｅｒｏｎ，Ａ．，ｅｔａｌ．（２０１５）ｍＢｉｏ６，ｅ００６１２−００６１５）。これらの２つの遺伝子の異なる対立遺伝子は、異なるストレス条件下でさまざまな生存能力と関連した。まとめると、これらの観察は、Ｃ．ジェジュニが、特定の環境におけるそれらの相対適応度に基づいて選択することができる複数のゲノタイプを有する準種であるという示唆を支持する。Ｃ．ジェジュニ８１−１７６におけるＭｅＯＰＮトランスフェラーゼの相変化は、このベット−ヘッジ現象の別の例を提供する。その生物は、相対的に血清感受性（Ｂｌａｓｅｒ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔａｌ．（１９８５）Ｊ．ＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．１５１：２２７−２３５）であると一般に考えられ、インビトロで増殖させた場合、株８１−１７６のＭｅＯＰＮトランスフェラーゼが、最大の補体耐性を許容しない配置にあり、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌトランスフェラーゼが優勢に「ＯＦＦ」配置にあることを意味する。本明細書において提供されたデータは、ＮＨＳへの曝露が、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌを発現した細胞の少数の集団について選択され、したがって、高いレベルのＮＨＳへの曝露を生存できたことを示している。よって、集団に対するインビトロで測定された血清耐性のレベルは、インビボで達成され得る耐性のレベルを反映しない場合がある。Ｃ．ジェジュニは侵襲性生物であり、それが腸管上皮を通して浸潤した際に、ＮＨＳの増加したレベルに曝露されるであろう。したがって、細胞のわずかな亜集団が、侵襲後に、生存する能力があることがあり得る。

ＨＳ：２３／３６ＣＪＪ１４３５：：ｃｍ突然変異体（株３７１８）におけるＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ部分の特徴付け
上で論じたように、Ｃ．ジェジュニ突然変異体株ＣＪＪ１４３５：：ｃｍ（株３７１８）は、δ_Ｐ１４．４８および１４．２０での２つの予想されたＭｅＯＰＮシフトのみならず、δ_Ｐ１４．７２（Ｘ）での新しいシフトも示す（図２０）。さらなる研究を、新しく観察されたＭｅＯＰＮ（Ｘ）の結合部位を決定するため以下の詳細のように行った。

２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣ：
集められた最初の追加のＮＭＲスペクトルは、２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣであった。これは、ＮＭＲおよびＧＣ−ＭＳによるＣＰＳの完全な分析を行う前に、Ｇａｌ−２およびＧａｌ−６結合について点検するためであった。２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣは、Ｇａｌ−２またはＧａｌ−６ＭｅＯＰＮ結合のいずれかについて以前に観察されなかった新しいクロスピークを示した。クロスピークは、２９５ＫでのＨＯＤピークの下にあり、これは３２０Ｋで二度目に集められたスペクトルをもたらした（データ示さず）。δ４．９２（^１Ｈ）およびδ１４．７２（^３１Ｐ）でのより強いクロスピークは、目的の共鳴になり、標識ピークＸであった。完全な特徴付けが必要とされること、ならびにＧＣ−ＭＳおよびＮＭＲ実験を実施することが決定された。

１Ｄ−^１Ｈ：
１Ｄ−^１Ｈスペクトルが、株３７１８について集められ、以前に公開されたスペクトル（Ｋａｎｉｐｅｓｅｔａｌ．，（２００６）ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８，３２７３−３２７９）と比較された。ＣＰＳが、２９５Ｋで視覚化される１または２アノマーシフトを有し、より高い温度で実施されることが要求されるβ−アノマーＮＭＲが観察されることが注意された。第２の１Ｄ−^１Ｈスペクトルは、３１５Ｋで集められ、これはアノマー共鳴に関して低磁場範囲において２つのさらなる共鳴を示した（データ示さず）。以前に公開された８１−１７６ｗａａＣＣＰＳから、アノマー共鳴が、６ｄ−ＤＤ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐについてδ５．１２、α−Ｇａｌについてδ４．９８およびβ−ＧｌｃＮＡｃについてδ４．７５で観察された（Ｋａｎｉｐｅｓｅｔａｌ．，（２００６）ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８，３２７３−３２７９）。類似のアノマーシフトが、株３７１８においてδ５．０６（Ａ）、５．０５（Ｂ）および４．８０（Ｃ）で観察された（データ示さず）。アノマー領域に観察された追加の共鳴は、δ４．９２（Ｘ）であった（データ示さず）。他の匹敵する共鳴は、ＭｅＯＰＮのＣＨ_３に関してδ３．７８、ＧｌｃＮＡｃのＣＨ_３に関してδ２．０４、６−デオキシプロトンの１つのδ１．７４で観察された（データ示さず）。追加の２ＤＮＭＲ実験を行って、アノマー領域中の共鳴の同一性を決定し、それらの対応する環系の割当を試みた。

２Ｄ ^１Ｈ−^１３ＣＨＳＱＣ−アノマー領域：
ＣＰＳに関与する残基の数を決定するため、２Ｄ ^１Ｈ−^１３ＣＨＳＱＣを行った。アノマー領域での^１Ｈ方向における高磁場を見ると、４つの視覚化されたクロスピークが存在した（データ示さず）。δ４．９２でのプロトンシフトが、δ７９．０４で^１３Ｃクロスピークを有し、これはアノマー炭素の予想された範囲（δ９０−１１２）を超えることが注意された。その結果、この異常なクロスピークが、２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣからのピークＸで同じプロトンシフトに由来することが注意された。残りのクロスピークは、それぞれ系Ａ、ＢおよびＣとして標識された（データ示さず）。注意される他のクロスピークは、６ｄ−ＤＤ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐからの６−デオキシ、ＧｌｃＮＡｃからのＣＨ_３、およびＭｅＯＰＮからのＣＨ_３のものであった。Ｘの同一性を含む残りのプロトンおよびそれらのそれぞれの炭素を割当てるため、追加の１Ｄおよび２Ｄ実験を必要とした。

２Ｄ ^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹ：
２Ｄ ^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹを、Ａ、ＢおよびＣの環系の割当の試みにおいてＣＰＳにおいて行った。^１Ｈ−^１３ＣＨＳＱＣからの環領域はオーバーラップを示し、これは^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹの環領域において繰り返された（データ示さず）。込み合った環領域でさえも、３つの系のＨ−１とそれらのそれぞれのＨ−２との間の結合を割当てることができた。Ａ−１がδ３．７９でクロスピークを有し（Ａ−２）、Ｂ−１がδ３．９２でクロスピークを有し（Ｂ−２）、およびＣ−１がδ３．８９でクロスピークを有する（Ｃ−２）ことが観察された（データ示さず）。さらなるプロトン割当を支援するため、２Ｄおよび選択的な１ＤＴＯＣＳＹ実験を実施した。

２Ｄ−ＴＯＣＳＹ：
２Ｄ−ＴＯＣＳＹにより、同系内のプロトンを磁化の転移を通して互いに見ることが可能となる。２Ｄ−ＴＯＣＳＹおよびＣＯＳＹを重ね合せることにより、環系のさらなる情報および見識が得られた。特に、ピークＸをアノマー共鳴に結合させることができ、残基の同一性が明らかにされた。

プロトンＢ−１およびＢ−２の位置がわかっているので、ＣＯＳＹを利用してδ４．２１でＢ−３をさらに示すことができた（データ示さず）。その後、２スペクトルの重ね合せは、δ４．９８でピークＸに対してＢ−３が結合するＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹの両方からのクロスピークを示した（データ示さず）。ピークＸは、Ｂ−４として再割当された。これらの割当は、２ＤＴＯＣＳＹスペクトルにおけるプロトンＢ−１とＢ−４の割当によって確認された（データ示さず）。２ＤＴＯＣＳＹからの１Ｄスライスが、アノマー共鳴Ｂ−１に関して抽出された（データ示さず）。このスライスは３つの追加のピークを示し、δ４．２５でのピークを、２Ｄスペクトルに戻って参照し、Ｂ−４に対する結合を見つけることによって、Ｂ−５として割当てることができた。δ３．７７およびδ３．９３での残りの２つの共鳴は、このデータ単独を使用して割当てることができなかった。

系Ａおよび系Ｃを、同様の様式で分析した。このことにより、δ４．３４でのＡ−３の割当およびδ３．５０でのＣ−３の割当がもたらされた（データ示さず）。加えて、アノマー共鳴から出発して、６−デオキシ共鳴を評価した。Ｈ−６／６’で出発して、強い接続性が、ＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹの両方においてδ３．７９で観察された；これはＨ−７に対応した（データ示さず）。Ｈ−６／６’に対する別のクロスピーク（ＴＯＣＳＹのみ）は、δ４．１５に通知された（データ示さず）。これは、６ｄ−ＤＤ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐ系のＨ−５として割当てられた。２つの２Ｄ実験の重ね合せ、およびＨ−５共鳴（δ４．１５）に対応する列の１Ｄスライスも使用して、Ｈ−４がδ３．８５に割当てられた（データ示さず）。この新しい結合を使用して、重ね合せた２Ｄスペクトルを再確認して、δ３．８５（Ｈ−４）とδ４．３４（Ａ−３）との間のクロスピークが観察された。これは、６ｄ−ＤＤ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐとして割当てられる系Ａをもたらした。系Ｃは、この技術によって過去に分析することができなかったが、プロトンＣ−３情報を、その同一性に関してアノマープロトンの化学シフトによって集めることができた。ＧｌｃＮＡｃはＣＰＳ中の唯一のβアノマーであるため、最も高磁場にシフトしたアノマーが、β構成糖に対応することが推測できた。この仮定は、このδ４．７６でのＣＰＳと比較して、δ４．７５でのβ−ＧｌｃＮＡｃの以前に報告されたアノマーシフトによってもバックアップされる（Ｋａｎｉｐｅｓｅｔａｌ．，（２００６）ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８，３２７３−３２７９）。

６ｄ−ＤＤ−α−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐに割当てられた系Ａおよびβ−ＧｌｃＮＡｃに割当てられた系Ｃを考慮して、系Ｂをα−Ｇａｌとして割当てた。環炭素の割当は、系Ａ〜Ｃの同一性の確認として機能するであろう。

２Ｄ ^１Ｈ−^１３ＣＨＳＱＣ−アノマー領域（再確認）：
関連した炭素を、その環に関してこれ以降は割当てることができ、Ｇａｌ（Ｂ）およびＧｌｃＮＡｃ（Ｃ）の残りのプロトンを、割当てできた。アノマーのクロスピークは、今回：Ａ＝６ｄ−ＤＤ−α−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐ、Ｂ＝α−ＧａｌおよびＣ＝β−ＧｌｃＮＡｃと知られるものに割当てられた。すべてのプロトンシフトが知られているため、系Ａ炭素は、その全体が最初に割当てられた；δ１０１．６（Ａ−１）、８５．２（Ａ−２）、７２．６（Ａ−３）、７４．０（Ａ−４）、７０．１（Ａ−５）、３６．４（Ａ−６）、３６．５（Ａ−６’）、および６１．０（Ａ−７）（表３、図２７）。２−位で結合し、これが結合した炭素の低磁場シフトをもたらすため、δ８５．２でのＡ−２の低磁場炭素シフトは、６ｄ−ＤＤ−α−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐとして系Ａの割当と一致した。

その後、系Ｂの炭素は、プロトン１−５；δ９９．６（Ｂ−１）、７０．２（Ｂ−２）、７９．２（Ｂ−３）、７９．０（Ｂ−４）、および７１．６（Ｂ−５）に関して割当てられた（表３、図２７）。再び、α−Ｇａｌの結合は３−位であり、その炭素は、δ７９．２まで低磁場にシフトし、Ｂ−４は、ＭｅＯＰＮ部分の結合部位であることから、その炭素のδ７９．０までの低磁場シフトが同様に予想される。α−Ｇａｌ系に関して割当てられる残りのプロトンは、Ｂ−６／６’である。同じ炭素シフトを有する２つのプロトンシフトは、δ３．９３／δ６３．４およびδ３．７７／δ６３．３で見られ（図２７）、これは、ヘキソピラノースの６−位でのジェミナルプロトンの特徴である。

最終的に、系Ｃの炭素１、２および３は、δ１０５．０（Ｃ−１）、５９．７（Ｃ−２）、および７８．０（Ｃ−３）に割当てられた（表３、図２７）。δ７８．０での低磁場シフトは、β−ＧｌｃＮＡｃの３−位にある結合と一致し、割当が確認される。系Ｃに関して割当てられる残りは、プロトン／炭素４、５および６／６’であった。以前に特徴付けられたＨＳ：２３／３６ＣＰＳ（Ｋａｎｉｐｅｓｅｔａｌ．，（２００６）ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８，３２７３−３２７９）との比較に基づいて、Ｃ−４はδ７７．８に割当てられおよびＣ−５はδ７０．５に割当てられた。以前のデータとの比較に基づいたＣ−６／６’は、Ｂ−６／６’プロトンおよび炭素に対する非常に類似のシフトがおそらくあり、これは、ＨＳＱＣにおいて視覚化されていないクロスピークをもたらし、というのも、それらはオーバーラップするからである。β−ＧｌｃＮＡｃに帰属する付加クロスピークはδ２．０５／δ２５．１であり、これはＮ−アセチル置換基のＣＨ_３基に由来する。

ＧＣ−ＭＳ分析：
単糖組成および結合解析もＣＰＳにおいて実施して、ＮＭＲによって観察された結果を確認した。組成分析から、以前に特徴付けられたＨＳ：２３／３６構造と異なり、３−ＯＭｅ−６ｄ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐが非常にわずかに存在することが最初に注意された。大多数のａｌｔｒｏ−Ｈｅｐは、６−デオキシ形態にあり、追加で少量の未修飾Ｈｅｐがあった（データ示さず）。ヘプトース変化に加えて、ＧａｌおよびＧｌｃＮＡｃも組成分析において観察された。すべてのピーク同一性は、相対的保持時間の比較ならびに断片化パターンの分析によって確認された（データ示さず）。

結合解析も、情報が豊富であった。−３）Ｇａｌ（１−、−２）６ｄ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐ（１−、および−３）ＧｌｃＮＡｃ（１−の以前に見られた主要な結合が、予想されたように、すべて観察された（データ示さず）。これらの結合に加えて、末端Ｇａｌ、−２）ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐ（１−（これは、以前に少量で見られた）、および−３，４）Ｇａｌ（１−に対応する新しく観察されたピークも存在した（データ示さず）。再び、すべてのピーク同一性は、相対的保持時間の比較ならびに断片化パターンの分析によって確認された（データ示さず）。存在する−３，４）Ｇａｌ（１−により、ＣＰＳ構造における３−結合Ｇａｌの４−位にあるＭｅＯＰＮに対する結合部位の割当が確認された。

最終的な構造：
２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣにおいて観察された結合に戻って、今回ピークＸを明確（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ）に割当てることができた。この割当は、α−Ｇａｌの４−位でのＨＳ：２３／３６構造においてＭｅＯＰＮの新しい結合をもたらした。これは、ＨＳ：２３／３６血清型に新しい可変ＣＰＳ構造を与える（図４０）。

ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ抗原の合成
ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ抗原、メトキシフェニル４−Ｏ−メチル−ホスホラミジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを調製する合成スキーム（以下「化合物Ｄ」または「ガラクトシドＤ」と呼ばれる）は、図２９に示され、以下に詳細に記載される。簡単に説明すると、ガラクトシドＤの合成は、公開された手順（Ｍｏｎｔｅｌ，Ｅ．ｅｔａｌ．；Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．２００９，６２，５７５−５８４）から得られた、既知の化合物４−メトキシフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（「化合物Ａ」または「ガラクトシドＡ」）から始めた。図３０を参照されたい。ガラクトシドＡにおける約３当量の塩化ベンゾイルでの選択的なベンゾイル化により、２，３，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル化された生成物Ｂ（「化合物Ｂ」）が得られた。（図３１を参照されたい）。選択性は、ガラクトシド中の４つのヒドロキシル基の間の反応性における差によって説明することができる。軸の配向におけるヒドロキシル基は、立体的な障害が低く、はるかによりアクセス可能である、エカトリアル配向におけるＯＨ基よりも低速にアシル化を受けると予想される。加えて、４−ＯＨは、Ｃ−５位におけるより大きなヒドロキシメチル基によって、さらに立体的に障害され、したがって、最低の反応性を有する。しかしながら、ここで実現された収率は、当初の予測よりも予想外に低く、有意な量の３，４，６−トリ−Ｏ−ベンゾイル化されたおよび完全にベンゾイル化された生成物を生成する。

化合物ＢにおけるＭｅＯＰＮ修飾の導入は、上記のＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌ（およびＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ）の合成で用いるものと類似の戦略に従った。Ｅｔ_３Ｎ（４０ｅｑ．）存在下で４８時間、３５℃でメチルジクロロリン酸で糖を撹拌後、出発原料を、ＴＬＣによって示されるように、完全に消費させた。４−ＯＨはガラクトシドにおいて最小の反応性を有し、電子吸引性のＯ−Ｂｚ基によってさらに減少するので、低い反応性が予想される。フラッシュクロマトグラフィーによる精製後、ＭｅＯＰＮ生成物Ｃ（「化合物Ｃ」）を、^３１Ｐおよび^１ＨＮＭＲによって示されるように、約２：１の比で２つのジアステレオマーとして集めた（図３２）。

化合物Ｃの脱保護を、ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ／Ｅｔ_３Ｎの７：２：１混合物中で試みた。化合物Ｃを、望まれないＯ−メチルホスフェート生成物を約５時間産生させることで、ＴＬＣによって示されるように、完全に消費させた。低収率（１４％）であるが、脱保護されたＭｅＯＰＮ生成物（化合物Ｄ）が得られた。この脱保護された化合物Ｄを、１４．６５ｐｐｍでの単一のリンシグナルを産生する、単一のジアステレオマーとして集めた（図３３）。合成の詳細を、以下に詳細を提供する。

ＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）、ＤＭＦ（４ｍＬ）およびピリジン（２．１５ｍＬ、２６８ｍｍｏｌ）に溶解した４−メトキシフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（「化合物Ａ」）（１．９２ｇ、６７．１ｍｍｏｌ）の溶液に、その後、ＢｚＣｌ（２．３１ｍＬ、２０１ｍｍｏｌ）を１時間、−２０℃で加えた。反応混合物を０℃で３時間撹拌し、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）を加え、反応混合物を減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１：４ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、生成物「化合物Ｂ」（１．５３ｇ、３８％）を得た（図３１を参照されたい）。［α］_Ｄ ^２５＝＋１２４．０^ｏ（ｃ＝０．１、ＣＨＣｌ_３）；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.04-7.32 (m, 15H, Ar); 7.00-6.66 (m, 4H, MeOC₆H₄); 6.00 (dd, 1H, J₁ = 8.0 Hz, J₂ = 10.3 Hz, H-2); 5.39 (dd, 1H, J₁ = 3.2 Hz, J₂ = 10.3 Hz, H-3); 5.12 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H-1); 4.71 (m, 1H, H-6a); 4.61 (m, 1H, H-6b); 4.39 (m, 1H, H-4); 4.13 (m, 1H, H-5); 3.69 (s, 3H, OCH₃); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.4, 165.8, 165.4, 155.7, 151.2, 133.6, 133.4, 133.3, 129.9, 129.8, 129.6, 129.4, 128.9, 128.6, 128.5, 128.4, 119.0, 114.4 (Ar); 101.2 (C-1); 74.1 (C-3); 72.6 (C-5); 69.3 (C-2); 67.3 (C-4); 62.8 (C-6); 55.6 (OCH₃). HRMS (ESI): C₃₄H₃₀NaO₁₀ [M+Na]⁺の計算値: 621.1737, 実測値: 621.1733.

破砕した分子篩４Åで無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（４ｍＬ）に溶解した化合物Ｂ（９４．１ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）およびジクロロリン酸メチル（０．５７ｍＬ、４．６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ_３Ｎ（０．６４ｍＬ、４．６ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して加えた。反応混合物を３５℃で４８時間撹拌した。ＴＬＣで判断して反応が完了したら、アンモニアガスを針を通して反応混合物に注入した。３分後、反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（１：１ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）で精製して、ＭｅＯＰＮ生成物「化合物Ｃ」を得た（図３２）（１６．１ｍｇ、１５％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.10-7.36 (m, 30H, Ar); 6.92-6.60 (m, 8H, MeOC₆H₄); 6.00 (m, 2H, H-2, H-2^*); 5.15 (dd, 1H, J₁ = 2.3 Hz, J₂ = 10.6 Hz, H-3); 5.12 (dd, 1H, J₁ = 2.3 Hz, J₂ = 10.6 Hz, H-3^*); 5.19 (2dd, 2H, J₁ = 3.1 Hz, J₂ = 10.0 Hz, H-4, H-4^*); 5.15 (2d, 2H, J = 8.0 Hz, H-1, H-1^*); 4.70 (m, 4H, H-6a, H-6a^*, H-6b, H-6b^*); 4.35 (m, 2H, H-5, H-5^*); 3.72 (d, 3H, ³J_PH = 11.4, POCH₃); 3.68 (s, 6H, OCH₃); 3.52 3.50 (d, 3H, ³J_PH = 11.4 Hz, POCH₃ ^*); 2.87 (d, 2H, J = 4.7 Hz, NH₂); 2.71 (d, 2H, J = 4.6 Hz, NH₂ ^*). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.1, 165.7, 165.5, 155.7, 151.1, 133.5, 133.4, 133.3, 130.1, 129.8, 129.7, 129.6, 129.3, 129.2, 128.7, 128.5, 128.4, 126.3, 119.0, 118.9, 114.4 (Ar); 101.1 (C-1); 72.7 (C-5); 72.1, 72.0 (C-3); 71.5 71.4 (C-4); 69.0, 68.9 (C-2); 62.8, 62.7 (C-6); 55.6 (OCH₃); 53.8, 53.7 (POCH₃). ³¹P NMR (162 MHz, CDCl₃): δ 11.27, 10.79. HRMS (ESI): C₃₅H₃₅NO₁₂P [M+H]⁺の計算値: 692.1897, 実測値: 692.1868.

化合物Ｃ（４．０ｍｇ、５．８μｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ−Ｈ_２Ｏ−Ｅｔ_３Ｎの７：２：１混合物の溶液（１．５ｍＬ）に溶解した。混合物を室温で６時間撹拌した後、酢酸で中和し、濃縮した。５：１ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨで溶出するフラッシュクロマトグラフィーで精製して、生成物「化合物Ｄ」を単一のジアステレオマーとして得た（図３３）（０．３ｍｇ、１４％）。δ ¹H NMR (600 MHz, D₂O): δ 7.02-6.83 (m, 4H, MeOC₆H₄); 4.81 (d, 1H, H-1); 4.11 (m, 1H, H-4); 3.92 (m, 2H, H-3, H-5); 3.75-3.65 (m, 5H, H-2, H-6a, OCH₃); 3.61-3.55 (m, 4H, H-6b, POCH₃) ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃): δ 118.0, 115.0 (Ar); 101.3 (C-1); 73.6 (C-3); 72.4 (C-2); 70.4 (C-5); 68.1 (C-4); 58.9 (C-6); 55.7 (OCH₃); 53.9 (POCH₃). ³¹P NMR (243 MHz, CDCl₃): δ 14.65. HRMS (ESI): C₁₄H₂₁NO₉P [M-H]^-の計算値: 378.0954, 実測値: 378.0954.ＭｅＯＰＮ→４−β−Ｄ−Ｇａｌ−ＯＭＰの^３１Ｐ共鳴を示す化合物Ｄの^３１ＨＮＭＲ実験の結果を図３４に示す。

コンジュゲートＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌワクチンの合成
過ヨウ素酸酸化および還元的なアミノ化を使用するＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌを過剰発現するＣ．ジェジュニ株３７１８から単離された莢膜多糖類（ＣＰＳ）を含有するコンジュゲートワクチンの合成（実施例８に記載される）は、図３５に示され、以下に詳細に記載される。

Ｃ．ジェジュニ株３７１８細菌を、増殖させ、莢膜多糖類を従来の方法に従って単離した。簡単に説明すると、Ｃ．ジェジュニ株３７１８細菌を、非動物ベースの液体培地：トリプトン代用物アソレート（ｔｒｙｐｔｏｎｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅａｔｈｏｌａｔｅ）、１３ｇ／リットル（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓａｌｅｍ、ＭＡ；カタログ番号Ｔ８７５０−１）；非動物ベースの酵母抽出物、２．５ｇ／リットル（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＨｏｒｎｓｂｙＷｅｓｔｆｉｅｌｄ、ＮＳＷ１６３５、Ａｕｓｔｒａｌｉａ；カタログ番号７１２７０−３）；ピルビン酸ナトリウム、１．２５ｇ／リットル（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；カタログ番号Ｐ８５７４）；ＣａＣｌ２、０．２ｇ／リットル（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；カタログ番号Ｃ５０８０）；およびＮａＣｌ、３．２ｇ／リットル（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ；カタログ番号Ｓ６４０−３）中で３７℃、微好気的環境下で増殖させた。ＣＰＳの抽出を、実施例８に記載のように達成した。

過ヨウ素酸塩を使用して、６ｄ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐの近接するジオール（３および４位）で２つのアルデヒドを産生させることによって単離されたＣＰＳを活性化した。ＣＰＳを、０．０４Ｍヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）および０．１ＭＮａＯＡｃを含有する溶液中４．００のｐＨで可溶化した（ＭｏｎｔｅｉｒｏＭＡ，ｅｔａｌ．ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，２００９；７７：１１２８−１１３６を参照されたい）。反応を室温で２時間撹拌し、その後、断続的に撹拌しながら、５℃で７２時間維持した。３日後、反応を、エチレングリコールでクエンチし、透析（１ＫＤａＭＷＣＯ）に２４時間配置した。試料を、その後、凍結し、ＮＭＲ分析のため凍結乾燥した。酸化型ＣＰＳが、ＮＭＲによって分析され、１Ｄ−１Ｈおよび２Ｄ１Ｈ−１３ＣＨＳＱＣ実験に基づいて無傷であることが見出された（データ示さず）。ＭｅＯＰＮがＣＰＳになおもに結合することが、１Ｄ３１Ｐによって示された（図３６）。

酸化型ＣＰＳを、その後、以下のように、２つの異なるキャリアタンパク質ＣＲＭ_１９７（図３５）およびＢＳＡでの還元的なアミノ化に供した。過ヨウ素酸塩−酸化型−ＣＰＳを、０．１Ｍホウ酸緩衝液にｐＨ９．００のｐＨで可溶化した。キャリアタンパク質を、同体積の緩衝液に可溶化し、ゆっくりと撹拌することによって活性化ＣＰＳに加えた。シアノホウ化水素ナトリウム（ＮａＢＨ_３ＣＮ）を反応バイアルに加え、溶液をゆっくりと室温で２４時間撹拌した。（ＬａｎｅＣ．，Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ．１９７５；８：３−１０を参照されたい）。温度を、その後、４８時間３７℃に増大した。反応物を、透析（２５ＫＤａＭＷＣＯ）に７２時間配置した。試料を、凍結し、ＮＭＲ分析のため凍結乾燥した。２つのコンジュゲート（ＣＲＭ_１９７およびＢＳＡ）が、１Ｄ ^１Ｈおよび^３１ＰＮＭＲによって分析され、ＣＰＳの劣化のいかなる徴候も示されなかった（データ示さず）。

ウサギ免疫原性研究
上で論じたように、Ｃ．ジェジュニ株３７１８は、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌトランスフェラーゼ（ＣＪＪ８１１７６＿１４２０トランスフェラーゼ）を過剰発現し、ＭｅＯＰＮ−２およびＭｅＯＰＮ−６−トランスフェラーゼ（ＣＪＪ８１１７６＿１４３５）に関して突然変異した株である。表現型的に、それはＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌのみを発現する。実施例１１において調製された３７１８−ＣＲＭ_１９７ワクチンコンジュゲートの免疫原性を試験するため、ウサギを従来の方法に従って３７１８−ＣＲＭ_１９７ワクチンコンジュゲート（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）で免疫した。具体的には、３００μｇのワクチンコンジュゲートを、３月の期間にわたって月ごとに投与した。ワクチンコンジュゲートを、フロイント完全アジュバント（ＢＤＤｉｆｃｏブランド１０ｍｌに５ｍｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍを含有し、抗原と１：１で投与される（Ｂｅｃｔｏｎ、ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏ．、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、ＮＪ））とともに与えた。血清試料を、エンドポイントＥＬＩＳＡ分析のため採取した。

図３７中のＥＬＩＳＡデータは、野生型Ｃ．ジェジュニおよびｍｐｎＣ突然変異体（株３３９０）からの莢膜に対する四用量のワクチンの２週後のエンドポイント力価を示す。データは、多糖類鎖（エンドポイント〜１０００）に対する低レベル応答およびＭｅＯＰＮを含有する野生型莢膜に対する高力価が存在することを示す。これらのデータにより、野生型のＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌの存在が確認され、ウサギが株３７１８における唯一の修飾であるＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌに対する抗体を産生することを示している。

第２の用量の３７１８−ＣＲＭ_１９７ワクチンコンジュゲートの２週後に得られた血清もＥＬＩＳＡに使用された。図３８に示すデータは、二用量の３７１８−ＣＲＭ_１９７ワクチンコンジュゲート後のウサギからの血清のエンドポイントＥＬＩＳＡ力価を示す。まとめると、これらのＥＬＩＳＡデータは、野生型にいくつかのＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌエピトープが存在することを示している（エンドポイント〜１０ｅ５）。多糖類鎖に対する応答が、株３３９０（これは、生合成経路における突然変異に基づいてすべてのＭｅＯＰＮを欠く）に対するおよび突然変異体３４７７（これは、ＣＪＪ８１１７６＿１４２０、ＭｅＯＰＮ−４−トランスフェラーゼを欠く）に対する応答によって測定されたように、弱い（約１０ｅ３）こともデータは示している。株３４７７はＭｅＯＰＮ−２−およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌを発現し、免疫応答は株３３９０のものに類似する。重要なことに、データは、ＣＪＪ８１１８７６＿１４３５トランスフェラーゼにおける突然変異体である株３６３６（約１０ｅ６）に対する応答によって見られたように、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌエピトープに対する強い応答が存在することも示す。株３６３６は、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌのみを発現する。したがって、データは、ＭｅＯＮ−４−Ｇａｌがウサギにおいて免疫原性であることを示している。

ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌを含む合成コンストラクトの作製
ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌエピトープを含む合成コンストラクトの合成に関する詳細は、以下に提供されおよび図４１〜４３に詳細が記載される。簡単に説明すると、図４１に示すように、ガラクトシルアクセプター５に向けた合成は、α−ガラクトシド１で開始される。イソプロピリデンを使用して、Ｏ−３およびＯ−４位を選択的に保護して、化合物２を生成する。Ｏ−２およびＯ−６位の両方は、その後、アリル基で保護されて、化合物３が生成される。Ｏ−３およびＯ−４位を区別するために、イソプロピリデンが最初に除去されて、化合物４が生成される。４位は、その後、オルソ酢酸化学によってＯ−Ａｃで保護され、グリコシル化のため３−ＯＨが残される。

図４２に示すように、ドナー９の合成は、過アセチル化ＧｌｃＮＡｃ６で出発する。アノマー位置をエタンチオールで置換して、チオグリコシド７を生成することができる。二糖類生成物の脱保護の容易さのため、Ｏ−Ａｃ基が除去されて８が生成され、アリル基で置換して９が生成される。

図４３に示すように、アクセプター５とドナー９との間のグリコシル化は、プロモーターとしてのＮＩＳ／ＴｆＯＨで達成される。Ｏ−アセチル基は、その後、二糖類１０から選択的に除去されて、ＭｅＯＰＮ導入用の遊離４−ＯＨを有する化合物１１を得た。最終的に、化合物１２中のアリル保護基が除去されて、ＭｅＯＰＮ含有二糖類１３が生成される。図４１〜４３で見られる略語は、以下の通りである：ＤＭＰ：２，２−ジメトキシプロパン；ＴｓＯＨ：ｐ−トルエンスルホン酸；ＡｌｌＢｒ：臭化アリル；ＮａＨ：水素化ナトリウム；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ＡｃＯＨ：酢酸；ＣＳＡ：カンファースルホン酸；ＭｅＣＮ：アセトニトリル；ＥｔＳＨ：エタンチオール；ＳｎＣｌ_４：塩化スズ（ＩＶ）；ＣＨ_２Ｃｌ_２：ジクロロメタン；ＮａＯＭｅ：ナトリウムメトキシド；ＭｅＯＨ：メタノール；ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド；ＮＩＳ：Ｎ−ヨードスクシンイミド；ＴｆＯＨ：トリフルオロメタンスルホン酸（トリフル酸）；ＰＣｌ_２Ｏ_２Ｍｅ：ジクロロリン酸メチル；Ｅｔ_３Ｎ：トリエチルアミン；ＮＨ３：アンモニア；ＰｄＣｌ_２：塩化パラジウム（ＩＩ）。

コンジュゲートワクチン中のＭｅＯＰＮ糖部分に対する抗体の使用を含む血清殺菌死滅を誘導する方法
本発明者らは、Ｃ．ジェジュニにおける莢膜多糖類と交差反応する、正常ヒト血清（ＮＨＳ）中の天然に存在する抗体が、補体カスケードを誘導することができることを示した（図２４を参照されたい）。莢膜におけるＭｅＯＰＮ部分の存在により、細胞表面に対するこれらの抗多糖類抗体の結合が防止されるように思われる。本発明者らは、エピトープ含有ＭｅＯＰＮが、ＨＳ２３／３６莢膜コンジュゲートワクチン中の免疫優性エピトープであることも決定した。これらのデータに鑑みて、本発明者らは、莢膜コンジュゲートワクチンに対して産生された、これらの抗ＭｅＯＰＮ抗体が、血清殺菌抗体を誘導することができるかどうかを決定する、血清殺菌アッセイを開発した。

材料および方法
カンピロバクター−ジェジュニの調製：細菌株８１−１７６を、ＭｕｌｌｅｒＨｉｎｔｏｎ寒天プレート（ＭＨＰ；ＭｕｌｌｅｒＨｉｎｔｏｎブロス２１ｇ／リットルおよびＢａｃｔｏ寒天１５ｇ／リットル［ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ］）において３７℃で微好気的（窒素８５％、二酸化炭素１０％、および酸素５％）環境で２０時間一晩増殖させた。細胞は、デキストロース−ゼラチン−ベロナール（ＤＧＶ；Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）に回収され、３ｘ１０^８ＣＦＵ／ｍｌの濃度に等しい０．１（０．０９５〜０．１０５）のＯＤ_６００に設定される。

血清試料：使用した血清試料は、ＣＣＶ（上記）として知られるＨＳ２３／３６ＣＰＳ−ＣＲＭ_１９７ワクチンの調製物で過免疫されたウサギからであった。各ウサギからの免疫前および免疫後血清を、５６℃ウォーターバス中で３０分間熱失活（ＨＩ）して、天然の補体を不活性化し、−２０℃で保存した。

血清殺菌アッセイ：熱失活（ＨＩ）させた免疫前および免疫後血清試料を、５０μｌＤＧＶに希釈し、試料が採取された日に基づいて多数の希釈物に対して外挿した。２７００μｌＤＧＶおよび８００μｌ仔ウサギ補体（ＢＲＣ、Ｃ’；ＣｅｄａｒｌａｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）の混合物を作製し、７０μｌのこの混合物を各ウェルに加えた（いずれかのＢＲＣまたは血清も受け取っていないおよびいずれかの血清も受け取っていない、対照ウェルを除く）。２０μｌの各血清希釈を、その後、試料ウェルに加えた。０．１のＯＤ_６００での１００μｌの１：１０００希釈したＣ．ジェジュニ８１−１７６細胞を、その後、各ウェルに加え、混合した。プレートを、その後、微好気条件で３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、２５μｌの各ウェルを、ＭＨＰプレートに二通りにプレーティングした。プレートを、微好気条件で３７℃で４８時間インキュベートした。その後、ＣＦＵを数え、死滅パーセンテージを計算し、力価を規定した。

死滅のパーセンテージの計算：各ウェルを二通りにプレーティングし、これらの２つのプレートの平均を取った。血清を含有する各ウェルに対して、平均を、補体のみを含有するウェルの平均によって除算した。その後、この数を１００で乗算して得られたものが、細胞の生存度のパーセンテージであった。生存度パーセンテージが１００％から減算されると、これにより、そのウェルにおける死滅のパーセンテージが得られた。

血清殺菌アッセイ力価規定：血清殺菌アッセイ抗体力価は、補体対照と比較されたときに、５０％死滅以上をもたらす血清希釈の逆数として規定される。

ＨＳ２３／３６ＣＰＳ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートワクチンで免疫したウサギにおける血清殺菌抗体活性：免疫前または免疫後血清を血清殺菌アッセイによって分析し、各時点の力価を図３９に棒グラフとして示す。図３９に示すように、免疫前と免疫後血清との間のＳＢＡ力価の８５倍上昇が、観察された。

結果
免疫前のウサギの血清（図３９中に「免疫前」というラベルが付された）を、ワクチンで３回の免疫後の血清（「免疫後」）と比較した。免疫前の血清において既存のわずかな力価が存在したが、ワクチンの投与後の血清殺菌抗体価において８５倍増加が存在した。

これらのデータは、抗コンジュゲート抗体が、血清殺菌抗体を誘導する能力があることを示している。ＭｅＯＰＮ含有エピトープが免疫優性であり、ＳＢＡを誘導する能力があるとの観察は、本明細書に記載されるように、合成ＭｅＯＰＮ糖エピトープに対する抗体がＳＢＡも誘導し得ることも示唆している。

これまで本発明を記載してきたが、当業者は、上記の教示に照らして本発明の多くの変更および変形が可能であることを理解する。したがって、当然のことながら、添付の特許請求の範囲の範囲内において、本発明は、具体的に記載されたもの以外に実施され得る。

Claims

１つまたは複数のＯ−メチルホスホルアミデート（ＭｅＯＰＮ）部分を有する１つまたは複数の単糖類を含む、被験体におけるカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ジェジュニ）に対する免疫応答を誘導することができる免疫原性合成コンストラクト。
ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を含む、請求項１に記載の免疫原性合成コンストラクト。
キャリアタンパク質にコンジュゲートされている、請求項２に記載の免疫原性合成コンストラクト。
キャリアタンパク質は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含有する、請求項３に記載の免疫原性合成コンストラクト。
キャリアタンパク質は、ＣＲＭ_１９７である、請求項４に記載の免疫原性合成コンストラクト。
被験体は、ヒトである、請求項１に記載の免疫原性合成コンストラクト。
請求項１に記載の免疫原性合成コンストラクトを含む組成物。
医薬組成物である、請求項７に記載の組成物。
前記医薬組成物は、ワクチン製剤である、請求項８に記載の組成物。
ワクチン製剤は、免疫有効量の１つまたは複数のアジュバントをさらに含む、請求項９に記載の組成物。
１つまたは複数のアジュバントは、トール様受容体リガンド、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピドＡ、リポソーム、ならびにそれらの誘導体および組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
１つまたは複数の追加の免疫調節剤をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
１つまたは複数の追加の免疫調節剤は、Ｃ．ジェジュニの１つまたは複数の株の抗原、ＥＴＥＣの抗原、赤痢菌リポ多糖構造、および非コンジュゲートキャリアタンパク質からなる群から選択される物質である、請求項１２に記載の組成物。
被験体は、ヒトである、請求項７に記載の組成物。
請求項１に記載の免疫原性合成コンストラクトの有効量を被験体に投与することを含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する方法。
被験体は、ヒトである、請求項１５に記載の方法。
請求項７に記載の組成物の有効量を被験体に投与することを含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する方法。
被験体は、ヒトである、請求項１７に記載の方法。
請求項８に記載の組成物の有効量を被験体に投与することを含む、被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する方法。
前記被験体は、ヒトである、請求項１９に記載の方法。
被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の免疫原性合成コンストラクトの有効量を被験体に投与することと、
（ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）で投与した免疫原性合成コンストラクトの１回または複数回の追加用量を被験体に投与することと
を含む方法。
ステップ（ａ）で投与する有効量は、免疫原性合成コンストラクトの約０．１μｇ〜約１０ｍｇである、請求項２１に記載の方法。
ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）においてコンストラクトと共に１つまたは複数のアジュバントの免疫有効量を投与することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
被験体におけるＣ．ジェジュニに対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）請求項８に記載の組成物の有効量を被験体に投与することと、
（ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）で投与した組成物の１回または複数回の追加用量を被験体に投与することと
を含む方法。
ステップ（ａ）で投与する有効量は、免疫原性合成コンストラクトの約０．１μｇ〜約１０ｍｇである、請求項２４に記載の方法。
ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）においてコンストラクトと共に１つまたは複数のアジュバントの免疫有効量を投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
組成物は、ワクチン製剤である、請求項１９に記載の方法。
組成物は、ワクチン製剤である、請求項２４に記載の方法。
必要とする被験体におけるＣ．ジェジュニ細菌感染を治療、予防、または改善する方法であって、１つまたは複数の用量の免疫グロブリンを被験体に投与することを含み、前記免疫グロブリンは、前記Ｃ．ジェジュニ細菌の莢膜における１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分を認識する、方法。
１つまたは複数のＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−２−Ｇａｌ、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌ、およびＭｅＯＰＮ−６−Ｇａｌからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
ＭｅＯＰＮ部分は、ＭｅＯＰＮ−４−Ｇａｌである、請求項３０に記載の方法。