CN101977926B - 链球菌溶血素o的突变形式 - Google Patents

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Abstract

无毒但仍保留诱导抗酿脓链球菌感染的能力的GAS25(链球菌溶血素O)可用于疫苗组合物以诱导抗酿脓链球菌感染。

Description

链球菌溶血素O的突变形式
本申请要求2007年12月21日提交的US61/016193和2008年8月13日提交的US61/088381的优先权，其内容通过引用纳入本文。
发明领域
本发明涉及免疫学和疫苗学领域。
发明背景
链球菌溶血素O(SLO；GAS25)是人病原体酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(GAS)的一种最重要的致病因子。由于它能激发人的早期且强烈的免疫应答，因此通常用作GAS感染的诊断标记物。
SLO属于高同源性巯基激活的溶细胞素(TACY)家族，该家族通过与细胞膜上的胆固醇相互作用、自发寡聚化以及形成穿孔发挥其溶细胞活性。此外，它们能够结合人IgG的Fc区从而直接激活经典补体途径，这可导致对宿主细胞的补体介导的直接攻击。TACY也通过诱导细胞因子和炎性介质从而干扰宿主的防御和免疫细胞功能。
一些TACY可被动或主动保护试验动物。参见FEMS Lett.182，197-205，2000。然而，这些毒素复杂的有害副作用模式将影响它们作为疫苗候选物的用途。也就是说，本领域需要无毒的SLO蛋白。
附图简述
图1.SLO的三维计算机模型。脯氨酸表示为空间填充。Pro427为白色。
图2.该图显示了用含有野生型SLO和SLO突变型P427L的大肠杆菌提取物进行的溶血试验的结果。
图3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶的显微照片，显示了纯化的SLO突变型P427L。
图4.该图显示了用纯化的野生型SLO和SLO突变型P427L进行的溶血试验的结果。
图5.大肠杆菌裂解上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的显微照片。泳道A，大肠杆菌阴性对照；泳道B，rSLO野生型，无标签；泳道C，rSLO P427L，无标签；和泳道D，纯化的rSLO野生型，无标签(5mg)。
图6.该图证明，在相同条件下，SLO突变型P427L的溶血能力比野生型SLO低1000倍。
图7.该图证明了胆固醇对野生型SLO和SLO突变型P427L溶血作用的影响。
图8.细胞提取物中所有无标签蛋白的SDS-PAGE分析的显微照片。图8A，SLO野生型和P427L无标签蛋白的表达；图8B，SLO P427L+W535、P427L+C530G、和P427L+C530G+W535F无标签蛋白的表达。
图9.细胞提取物中所有带His标签的蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。
图10.纯化的带His标签的蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。
图11.纯化的无标签蛋白质的SDS-PAGE分析的显微照片。图11A，泳道A，SLO野生型无标签蛋白；泳道B，SLO P427L无标签蛋白；分子量标记(116-66.2-45-35-25-18.4-14.4)；黑色箭头表示从突变型和野生型克隆纯化的SLO蛋白。图11B，泳道A，SLO野生型无标签蛋白(3μg)；泳道B，SLOP427L-W535F无标签蛋白(3μg)；分子量标记(116-66.2-45-35-25-18.4-14.4)；黑色箭头表示从突变型和野生型克隆纯化的SLO蛋白。
图12.纯化的无标签SLO野生型蛋白的SDS-PAGE分析的显微照片。在还原和非还原条件下分析野生型SLO不同纯化批次的样品。
图13.该图显示了带His标签的SLO突变体的溶血测试结果。
图14.该图显示了抗-SLO抗血清对SLO-诱导的溶血活性的抑制作用。
图15.该图显示了抗-SLO抗血清抑制SLO溶血作用的滴度。
图16.该图显示了SLO溶血活性滴度。
图17.该图显示了野生型SLO、化学去毒的野生型SLO和SLO突变体(P427L；P427L+W535F)的溶血活性滴度。
图18.该图显示了野生型SLO和SLO突变体(P427L；P427L+W535F)的溶血活性滴度。
图19.该图显示了野生型SLO和化学去毒的野生型SLO的溶血活性滴度。
图20.该图显示了使SLO溶血活性(50ng/ml SLO)降低50％所需的SLO突变体P427L+W535F抗血清的稀释度。
图21.该图显示了使SLO溶血活性(100ng/ml SLO)降低50％所需的SLO突变体P427L+W535F抗血清的稀释度。
图22.滴定曲线，显示了用100％溶血毒素浓度进行的溶血抑制试验。
图23.SLO蛋白的比对。M1_SF370，SEQ ID NO：1；M12_2096，SEQ IDNO：2；M12_9429，SEQ ID NO：3；M1_5005，SEQ ID NO：4；M2，SEQ ID NO：5；M28，SEQ ID NO：6；M6，SEQ ID NO：7；M18，SEQ ID NO：8；M5，SEQ ID NO：9；M3，SEQ ID NO：10；M3_SSI，SEQ ID NO：11；和M4，SEQ ID NO：12。
图24.野生型SLO和带His标签的SLO突变体的比对。SLO_M1株SF370(SLO_M1strainSF370)，SEQ ID NO：13；SLO野生型_带his标签(SLOWT_histagged)，SEQ ID NO：14；SLO突变型.P427L_带his标签(SLOmut.P427L_histagged)，SEQ ID NO：15；SLO突变型.C530G_带his标签(SLOmut.C530G_histagged)，SEQ ID NO：16；SLO突变型.δA248_带his标签(SLOmut.DeltaA248_histagged)，SEQ ID NO：17；SLO突变型.W535F_带his标签(SLOmut.W535F_histagged)，SEQ ID NO：18；和SLO突变型.W535F&D482N_带his标签(SLOmutW535F&D482N_histagged)，SEQ IDNO：19.
图25.该图比较了野生型SLO抗血清和SLO突变体P427L+W535F抗血清造成的ALO溶血活性的降低。
图26.该图显示了采用明矾或MF59作为佐剂的重组SLO突变体P427L+W535F的体内保护特性。
发明详述
本发明提供无毒但仍保留了诱导抵御酿脓链球菌保护能力的链球菌溶血素O的突变体(SLO；GAS25)。SLO的突变形式可用于疫苗组合物中诱导抗酿脓链球菌的保护力。
突变型SLO蛋白
通过溶血试验测得，本发明的SLO突变形式的溶血活性比野生型SLO低至少50％(例如低50、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％)，但具有免疫原性，例如能赋予小鼠模型抵御GAS致死性攻击的保护力(例如见实施例7)。本发明的SLO突变体包括SLO突变体P427L(SEQ IDNO：20)，W535F(SEQ ID NO：21)，C530G(SEQ ID NO：22)，ΔA248(SEQ IDNO：23)，W535F+D482N(SEQ ID NO：24)，P427L+W535F(SEQ ID NO：25)，P427L+C530G(SEQ ID NO：26)，和P427L+C530G+W535F(SEQ ID NO：27)。本发明还包括这些突变体的带His标签的形式。例子显示于图24。
本发明的SLO突变体包括在按照SEQ ID NO：1所示野生型SLO序列编号的氨基酸P427、W535、C530、A248和D482中的一处或多处具有氨基酸改变(即取代、缺失或插入)的那些。图23提供了不同M类型野生型GAS25序列的比对。
本发明的SLO突变体包括在P427、W535、C530、A248和/或D482位置的一个、二个或三个氨基酸改变(“单突变体”、“双突变体”、“三突变体”)。因此，SLO突变体可包括以下：
i.P427L(SEQ ID NO：20)，P427R，P427N，P427C，P427Q，P427E，P427G，P427H，P427I，P427L，P427K，P427M，P427F，P427A，P427S，P427T，P427W，P427Y，或P427V；
ii.W535F(SEQ ID NO：21)，W535R，W535N，W535D，W535C，W535Q，W535E，W535G，W535I，W535L，W535K，W535M，W535A，W535P，W535S，W535T，W535Y，或W535V；
iii.C530G(SEQ ID NO：22)，C530R，C530N，C530D，C530S，C530Q，C530E，C530A，C530H，C530I，C530L，C530K，C530M，C530F，C530P，C530T，C530W，C530Y，或C530V；
iv.D482L，D482R，D482N，D482C，D482Q，D482E，D482G，D482H，D482I，D482L，D482K，D482M，D482F，D482A，D482S，D482T，D482W，D482Y，或D482V；
v.A248L，A248R，A248N，A248C，A248Q，A248E，A248G，A248H，A248I，A248L，A248K，A248M，A248F，A248S，A248T，A248W，A248Y，或A248V；
vi.ΔP427；或ΔW535；或ΔC530；或ΔD482；或ΔA248(SEQ ID NO：23)；和
vii.它们的组合，如W535F+D482N(SEQ ID NO：24)，P427L+W535F(SEQ ID NO：25)，P427L+C530G(SEQ ID NO：26)，和P427L+C530G+W535F(SEQ ID NO：27)。
本发明的双重突变体包括P427L+W535F(SEQ ID NO25)，P427L+C530G(SEQ ID NO：26)，P427L+A248L，P427L+D482L，W535F+C530G，W535F+A248L，W535F+D482L，C530G+A248L，和A248L+D482L。三重突变体包括P427L+C530G+A248L，P427L+C530G+D482L，P427L+A248L+D482L，P427L+C530G+W535F(SEQ ID NO：27)，W535F+C530G+A248L，W535F+C530G+D482L，W535F+A248L+D482L，和C530G+A248L+D482L。
本发明的突变型SLO蛋白也包括含上述突变型SLO蛋白和另一种GAS抗原的融合多肽。GAS抗原披露于，例如，WO 02/34771，且包括但不限于：GAS39(spy0266；gi-15674446)，GAS40(spy0269；gi-15674449)，GAS42(spy0287；gi-15674461)，GAS45(M5005_spy0249；gi-71910063)，GAS57(spy0416；gi-15674549)，GAS58(spy0430；gi-15674556)，GAS84(spy1274；gi-15675229)，GAS95(spt1733；gi-15675582)，GAS117(spy0448；gi-15674571)，GAS130(spy0591；gi-15674677)，GAS137(spy0652；gi-15674720)，GAS159(spy1105；gi-15675088)，GAS193(spy2025；gi-15675802)，GAS202(spy1309；gi-15675258)，GAS217(spy0925；gi-15674945)，GAS236(spy1126；gi-15675106)，GAS253(spy1524；gi-15675423)，GAS277(spy1939；gi-15675742)，GAS294(spy1173；gi-15675145)，GAS309(spy0124；gi-15674341)，GAS366(spy1525；gi-15675424)，GAS372(spy1625；gi-15675501)，GAS384(spy1874；gi-15675693)，GAS389(spy1981；gi-15675772)，GAS504(spy1751；gi-15675600)，GAS509(spy1618；gi-15675496)，GAS290(spy1959；gi-15675757)，GAS511(spy1743；gi-15675592)，GAS527(spy1204；gi-15675169)，GAS529(spy1280；gi-15675233)，和GAS533(spy1877；gi-15675696)。进一步的GAS抗原包括但不限于：GAS68(Spy0163；gi13621456)、GAS84(Spy1274；gi13622398)、GAS88(Spy1361；gi13622470)、GAS89(Spy1390；gi13622493)、GAS98(Spy1882；gi13622916)、GAS99(Spy1979；gi13622993)、GAS102(Spy2016；gi13623025)、GAS146(Spy0763；gi13621942)、GAS195(Spy2043；gi13623043)、GAS561(Spy1134；gi13622269)、GAS179(Spy1718；gi13622773)和GAS681(Spy1152；gi1362228)。
编码突变型SLO蛋白的核酸分子
本发明包括编码突变型SLO蛋白的核酸分子。本发明也包括所含核苷酸序列与这种分子至少有50％序列相同性的核酸分子。取决于具体的序列，所述序列相同性程度优选大于50％(如60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。核苷酸序列之间的相同性优选用Smith-Waterman同源性检索算法测定，以MPSRCH程序(牛津分子公司(Oxford Molecular))进行，所用仿射空位检索的参数是：空位开放罚分＝12，空位延伸罚分＝1。
本发明也提供能与上述这些分子杂交的核酸分子。可在不同“严谨性”条件下进行杂交反应。提高杂交反应严谨性的条件是本领域广为所知和已发表的。参见例如Sambrook等“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)”1989，第7.52页。相关条件的例子包括(严谨性逐渐提高的顺序)：25℃、37℃、50℃、55℃和68℃的培育温度；10X SSC、6X SSC、1X SSC和0.1XSSC(SSC是0.15M NaCI和15mM柠檬酸缓冲液)的缓冲液浓度和与其等同的采用其它缓冲液的系统；0％、25％、50％和75％的甲酰胺浓度；5分钟至24小时的培育时间；1、2或更多次的洗涤步骤；1、2或15分钟的洗涤培育时间；6X SSC、1X SSC、0.1X SSC或去离子水的洗涤液。杂交技术及其优化是本领域熟知的，可参见例如，Sambrook，1989；Ausubel等编著的“分子生物学简短方案(Short Protocols in Molecular Biology)”第4版，1999；美国专利5,707,829；Ausubel等编著“分子生物学当前方案(Current Protocols in Molecular Biology)”，增刊30，1987。
在某些实施方式中，本发明的核酸分子能在低严谨条件下与靶分子杂交；在其它实施方式中，本发明的核酸分子能在中等严谨条件下杂交；在优选的实施方式中，本发明的核酸分子能在高严谨条件下杂交。低严谨性杂交条件的一个例子是50℃和10X SSC。中等严谨性杂交条件的一个例子是55℃和1XSSC。高严谨性杂交条件的一个例子是68℃和0.1X SSC。
突变型SLO.蛋白的制造
重组制备
遗传密码的冗余度是众所周知的。因此，可利用编码野生型SLO蛋白或编码本发明SLO突变蛋白的任何核酸分子(多核苷酸)来重组产生蛋白质。编码野生型SLO、SLO突变体P427L，W535F，C530G，ΔA248，W535F+D482N，P427L+W535F，P427L+C530G，和P427L+C530G+W535F的核苷酸序列的例子提供在序列表中(也可分别见SEQ ID NOS：28，29，30，31，32，33，34，35，和36)。也可采用标准的核酸纯化技术从合适的酿脓链球菌分离编码野生型SLO的核酸分子，或采用扩增技术，如聚合酶链式反应(PCR)或用自动化合成仪合成该核酸分子。参见Caruthers等，Nucl Acids Res SympSer.215，223，1980；Horn等，Nucl Acids Res Symp Ser.225，232，1980；Hunkapiller等，Nature 310，105-11，1984；Grantham等，Nucl Acids Res.9，r43-r74，1981。
可用标准分子生物学技术，以mRNA为模板制备cDNA分子。然后可用本领域熟知的分子生物学技术复制cDNA分子。可利用基因组DNA或cDNA作模板，以扩增技术，如PCR获得更多拷贝的本发明多核苷酸。
如果需要，可用本领域众所周知的方法为各种原因工程改造多核苷酸以改变抗原编码序列，包括但不限于导致克隆、加工和/或多肽或mRNA产物表达的修饰等的改变。可采用基因片段和合成寡核苷酸的随机片段化和PCR重装配来改组DNA，从而工程改造核苷酸序列。例如，可利用定点诱变插入新的限制性酶位点，改变糖基化模式，改变密码子偏爱，产生剪接变体，引入突变等等。
可利用序列修饰，例如加入纯化标签序列或优化密码子来促进表达。例如，用编码标签蛋白如聚组氨酸(“HIS”)或谷胱甘肽S-转移酶(“GST”)的序列替代N-末端前导序列。可利用这种标签蛋白促进表达蛋白的纯化、检测和稳定性。可选择具体的原核或真核宿主偏爱的密码子来提高蛋白表达率，或制备具有所需性能，如半寿期比天然序列产生的转录物更长的RNA转录物。这些方法是本领域熟知的，在WO 05/032582中也有描述。
表达载体
可将编码突变型SLO蛋白的核酸分子插入表达载体中，该表达载体含有转录和翻译插入的编码序列所需的元件。可采用本领域技术人员熟知的方法构建包含编码序列和合适转录和翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。
宿主细胞
能产生突变型SLO蛋白的宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选的宿主细胞是大肠杆菌，其它合适的宿主包括：乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(lactococus cremoris)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、乳酰胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseriacinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(如结核分枝杆菌(M.tuberculosis))、酵母菌、杆状病毒、哺乳动物细胞等等。
可选择能以所需方式调节插入序列的表达或加工所表达多肽的宿主细胞株。多肽的这种修饰包括但不限于：乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。也可利用切割“前蛋白(prepro)”形式多肽的翻译后加工来帮助正确插入、折叠和/或行使功能。可从美国模式培养物保藏中心(ATCC；10801，大学大道，玛娜丝，弗吉尼亚州(University Boulevard，Manassas，VA)20110-2209)获得具有翻译后活化特异性细胞机制和特征机理的不同宿主细胞，选择这些宿主细胞以确保外源蛋白的正确修饰和加工。参见WO 01/98340。
可采用已良好建立的技术将表达构建物引入宿主细胞，包括但不限于：转铁蛋白-聚阳离子介导的DNA转移，用裸核酸或包裹的核酸转染，脂质体介导的细胞融合，包裹DNA的胶乳珠的胞内转运，病毒感染，原生质体融合、电穿孔，“基因枪”方法，和DEAE-或磷酸钙介导的转染。
将表达载体转化的宿主细胞培养在适合从细胞培养表达蛋白和回收的条件下。转化细胞产生的蛋白可能分泌出来或包含在细胞内，这取决于所用的核苷酸的序列和/或表达载体。本领域技术人员知道可以设计含有信号序列的表达载体，其能引导可溶性抗原穿过原核或真核细胞膜而分泌。
纯化
可在重组产生的突变型SLO蛋白中包含信号输出序列，以便用已知方法纯化细胞培养液中的抗原。或者，可用本领域熟知的方法，从工程改造的宿主细胞中分离本发明重组产生的突变型SLO蛋白，使其与宿主细胞的其它组分，如蛋白质、糖或脂质分开。这类方法包括但不限于：分子大小排阻层析、硫酸铵分级、离子交换层析、亲和层析和制备型凝胶电泳。纯化的突变型SLO蛋白制品至少80％纯，优选该制品为90％、95％或99％纯。可用本领域已知的任何方法，例如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来评估制品的纯度。可用适当的试剂，如脲素来促进突变型SLO蛋白的溶解。
化学合成
突变型SLO蛋白的合成，例如可采用固相技术。参见，如Merrifield，J AmChem Soc.85，2149-54，1963；Roberge等，Science 269，202-04，1995。可采用手工技术或自动化技术进行蛋白质合成。实施自动化合成，例如可采用泊金艾尔默公司的应用生物系统431A肽合成仪(Applied Biosystems 431A PeptideSynthesizer，Perkin Elmer)。可任选分别合成突变型SLO蛋白的各片段，再用化学方法组合产生全长分子。
抗体
本发明提供了特异性结合本发明的突变型SLO蛋白但不结合野生型SLO蛋白的抗体。术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白分子，及其能结合抗原的片段。这些抗体片段包括：杂交(嵌合)抗体分子(如Winter等，Nature 349，293-99，1991；美国专利4,816,567)；F(ab’)2和F(ab)片段及Fv分子；非共价连接的异质二聚体(如Inbar等，Proc Natl Acad Sci.USA.69，2659-62，1972；Ehrlich等，Biochem.19，4091-96，1980)；单链Fv分子(sFv)(如Huston等，Proc Natl AcadSci.USA.85，5897-83，1988)；二聚或三聚抗体片段构建物；微小抗体(如Pack等，Biochem.31，1579-84，1992；Cumber等，J Immunology.149B，120-26，1992)；人源化抗体分子(如Riechmann等，Nature.332，323-27，1988；Verhoeyan等，Scence.239，1534-36，1988和公开的英国专利号GB2,276,169，1994/9/21公开)；获自这些分子的任何功能性片段及通过非常规方法，如噬菌体展示技术获得的抗体。抗体优选为单克隆抗体。本领域熟知获取单克隆抗体的方法。
形成表位通常需要至少6、7、8、10或12个毗连氨基酸。然而，包含非毗连氨基酸的表位可能需要更多，例如，至少15、25或50个氨基酸。可采用各种免疫测定(例如，Western印迹、ELISA、放射免疫测定、免疫组化测定、免疫沉淀或本领域已知的其他免疫化学测定)来鉴定具有所需特异性的抗体。许多竞争性结合或免疫放射测定方案是本领域熟知的。此类免疫实验通常包括检测免疫原和特异性结合该免疫原的抗体之间形成的复合物。当用于免疫化学测定时，特异性结合突变型SLO蛋白的抗体制品提供的检测信号通常比用其他蛋白质提供的检测信号高至少5-、10-或20-倍，且如果与野生型SLO蛋白结合则不提供可检测信号。优选地，在免疫化学测定中，所述抗体不检测其他蛋白质并且可从溶液中免疫沉淀特定抗原。
抗体的制备
可利用突变型SLO蛋白或非SLO多肽抗原(下文所述)免疫哺乳动物，例如小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、猴子或人来产生多克隆抗体。如果需要，可将抗原偶联于载体蛋白，如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白或匙孔血蓝蛋白。根据宿主种类，可采用不同的佐剂来增强免疫应答。这类佐剂包括但不限于：弗氏佐剂、无机胶体(如氢氧化铝)和表面活性剂(如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚)。人用佐剂中，特别采用BCG(卡介苗)和短棒杆菌。
可采用通过连续培养细胞系产生抗体分子的任何技术来制备能特异性结合抗原的单克隆抗体。这些技术包括但不限于：杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术(Kohler等，Nature 256，495-497，1985；Kozbor等，JImmunol Methods 81，31-42，1985；Cote等，Proc Natl Acad Sci.80，2026-2030；Cole等，Mol Cell Biol.62，109-120，1984)。
此外，可采用为产生“嵌合抗体”而开发的技术，该技术将小鼠抗体基因剪接于人抗体基因获得具有合适抗原特异性和生物学活性的分子(Morrison等，Proc Natl Acad Sci.USA.81，68516855；Neuberger等，Nature.312，604-608，1984；Takeda等，Nature.314，452-454，1985)。也可“人源化”单克隆抗体和其它抗体以防止病人对所用治疗抗体产生免疫反应。这类抗体的序列与直接用于治疗的人抗体应充分相似或可能需要改变几个关键残基。可通过定点诱变单个残基或移植整个互补决定区来取代不同于人序列的残基以最大程度减少啮齿类抗体与人序列之间的序列差异。
或者，可用以下所述重组方法产生人源化抗体。如美国专利5,565,332所述，特异性结合特定抗原的抗体可包含部分或完全人源化的抗原结合位点。
或者，可采取所述的产生单链抗体的技术，用本领域已知方法来产生特异性结合特定抗原的单链抗体。可从免疫球蛋白随机组合库的链改组来产生具有相关特异性但独特性组成不同的抗体(Burton等，Proc Natl AcadSci.USA.88，1112023)。
也可用DNA扩增方法，如PCR，用杂交瘤cDNA作模板构建单链抗体(Thirion等，1996，Eur J Cancer Prev.5，507-11)。单链抗体可以是单-或双-特异性，可以是二价或四价抗体。构建四价双特异性单链抗体可参见，例如Colomaand Morrison.，Nat Biotechnol.15，159-63，1997中所述。构建二价双特异性单链抗体可参见Mallender和Voss.，J Biol Chem.269，199-206，1994中所述。
可用手工或自动化核苷酸合成构建编码单链抗体的核苷酸序列，如下所述，用标准重组DNA方法将其克隆入表达构建物中，再引入细胞而表达该编码序列。或者，可采用丝状噬菌体技术直接产生单链抗体(Verhaar等，Int JCancer.61，497-501，1995；Nicholls等，J Immunol Meth.165，81-91，1993)。
也可通过体内诱导淋巴细胞群产生，或通过筛选文献所述的免疫球蛋白库或一些高特异性结合物质(Orlandi等，Proc Natl Acad Sci.USA.86，3833-37，1989；Winter等，Nature 349，293-99，1991)来制备能特异性结合特定抗原的抗体。
可按WO 93/03151所述构建嵌合抗体。也可制备免疫球蛋白衍生的多价多特异性结合蛋白，如WO 94/13804所述的“二抗体”。
可用本领域熟知方法纯化抗体。例如，可通过结合有相关抗原的层析柱来亲和纯化抗体。然后可用高盐浓度缓冲液洗脱结合的抗体。
药物组合物
本发明也提供用作药物的组合物(如免疫原性组合物或疫苗)。可用本发明的组合物预防和/或治疗酿脓链球菌感染所引起的疾病，该组合物包含至少一种活性成分，可以是多肽、核酸分子或抗体。所述疾病，例如可以是菌血症、脑膜炎、产褥期猩红热、猩红热、丹毒、咽炎、脓疱病、坏死性筋膜炎、肌炎或中毒性休克综合征。
含有突变型SLO蛋白的组合物优选是免疫原性组合物，更优选是疫苗组合物。这种组合物的pH宜在6-8之间，优选约7。可用缓冲剂维持此pH。该组合物可以无菌和/或无热原。组合物与人体等张。
本发明的疫苗可用于预防或治疗，但通常用于预防。因此，本发明包括治疗或预防性治疗酿脓链球菌感染的方法。动物优选哺乳动物，最优选人。该方法包括给予动物治疗或预防量的本发明免疫原性组合物。
本发明的某些组合物包含本文所述的多肽突变型SLO蛋白。本发明的其它组合物包含编码突变型SLO蛋白的核酸分子及任选的可包含在此组合物中的其它抗原(见下文)。参见例如Robinson和Torres(1997)Seminars inImmunology 9：271-283；Donnelly等，(1997)Ann Rev Immunol 15：617-648；Scott-Taylor & Dalgleish(2000)Expert Opin Investig Drugs 9：471-80；Apostolopoulos & plebanski(2000)Curr Opin Mol Ther 2；441-47；Ilan(1999)CurrOpin Mol Ther 1：116-20；Dubensky等，(2000)Mol Med 6：723-32；Robinson &Pertmer(2000)Adv Virus Res 55：1-74；Donnelly等，(2000)Am J Respir Crit CareMed 162(4Pt2)：S190-193；Davis(1999)Mt Sinai J Med 66：84-90。所述核酸分子通常是DNA分子，如质粒形式。
在某些实施方式中，本发明的组合物可包含一种或多种其它活性剂。这种活性剂包括但不限于：(a)本发明的另一种突变型SLO蛋白，(b)用于儿童疫苗的多肽抗原，(c)用于老年人或免疫力低下个体的疫苗的多肽抗原，(d)编码(a)-(c)的核酸分子和特异性结合(a)-(c)的抗体。
其它抗原
本发明的组合物可与用于本发明治疗或预防方法的一种或多种其他抗原一起给予。合适的抗原包括以下所列的那些。此外，可用本发明的组合物治疗或预防以下所列任何一种病原体引起的感染。除与以下所述抗原联用外，本发明组合物也可与本文所述佐剂联用。
可与本发明联用的抗原包括但不限于一种或多种以下抗原，或衍生自一种或多种以下病原体的抗原：
A.细菌抗原
适合用于本发明的细菌抗原包括可从细菌分离、纯化或衍生的蛋白质、多糖、脂多糖及外膜囊泡。此外，细菌抗原可包括细菌裂解物和灭活的细菌制剂。可重组表达产生细菌抗原。细菌抗原优选包含在细菌生命周期至少某阶段暴露在细菌表面的表位。细菌抗原优选多种血清型之间的保守性抗原。细菌抗原包括衍生自以下的一种或多种细菌及以下鉴定的特异性示范抗原中的抗原。
脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)：脑膜炎球菌抗原可包括自奈瑟氏脑膜炎球菌血清群如A、C、W135、Y和/或B纯化的或衍生的蛋白质(如参考文献1-7所鉴定的那些)、糖(包括多糖、寡糖或脂多糖)或外膜囊泡(参考文献8、9、10、11)。可从粘附蛋白、自身转运蛋白(autotransporter)、毒素、Fe获取蛋白和膜缔合蛋白(优选外膜整合蛋白)中选择脑膜炎球菌的蛋白抗原。
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)：肺炎链球菌抗原可包括肺炎链球菌的糖(包括多糖或寡糖)和/或蛋白质。可选用血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F的糖抗原。可选用WO 98/18931、WO 98/18930、美国专利号6,800,744、WO 97/43303和WO 97/37026所鉴定蛋白质的蛋白抗原。可从聚组氨酸Triad家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX-LytX截短嵌合蛋白、肺炎球菌溶酶(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125或Sp133蛋白选择肺炎链球菌蛋白。
酿脓链球菌(A群链球菌)：A组链球菌抗原可包括：WO 02/34771或WO2005/032582中鉴定的蛋白质(包括但不限于：GAS39(spy0266；gi-15674446)，GAS40(spy0269；gi-15674449)，GAS42(spy0287；gi-15674461)，GAS45(M5005_spy0249；gi-71910063)，GAS57(spy0416；gi-15674549)，GAS58(spy0430；gi-15674556)，GAS84(spy1274；gi-15675229)，GAS95(spt1733；gi-15675582)，GAS117(spy0448；gi-15674571)，GAS130(spy0591；gi-15674677)，GAS137(spy0652；gi-15674720)，GAS159(spy1105；gi-15675088)，GAS193(spy2025；gi-15675802)，GAS202(spy1309；gi-15675258)，GAS217(spy0925；gi-15674945)，GAS236(spy1126；gi-15675106)，GAS253(spy1524；gi-15675423)，GAS277(spy1939；gi-15675742)，GAS294(spy1173；gi-15675145)，GAS309(spy0124；gi-15674341)，GAS366(spy1525；gi-15675424)，GAS372(spy1625；gi-15675501)，GAS384(spy1874；gi-15675693)，GAS389(spy1981；gi-15675772)，GAS504(spy1751；gi-15675600)，GAS509(spy1618；gi-15675496)，GAS290(spy1959；gi-15675757)，GAS511(spy1743；gi-15675592)，GAS527(spy1204；gi-15675169)，GAS529(spy1280；gi-15675233)，和GAS533(spy1877；gi-15675696))，GAS M蛋白片段融合物(包括WO 02/094851以及Dale，Vaccine(1999)17：193-200，和Dale，Vaccine 14(10)：944-948中描述的那些)，纤连蛋白结合蛋白(Sfb1)，链球菌血红素相关蛋白(Shp)以及链球菌溶血素S(SagA)。进一步的GAS抗原包括：GAS68(Spy0163；gi13621456)、GAS84(Spy1274；gi13622398)、GAS88(Spy1361；gi13622470)、GAS89(Spy1390；gi13622493)、GAS98(Spy1882；gi13622916)、GAS99(Spy1979；gi13622993)、GAS102(Spy2016；gi13623025)、GAS146(Spy0763；gi13621942)、GAS195(Spy2043；gi13623043)、GAS561(Spy1134；gi13622269)、GAS179(Spy1718；gi13622773)和GAS681(Spy1152；gi1362228)。
粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)：粘膜炎莫拉菌抗原包括WO02/18595和WO 99/58562鉴定的抗原、外膜蛋白抗原(HMW-OMP)、C-抗原和/或LPS。
百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)：百日咳菌抗原包括百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，任选也与百日咳杆菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3联用。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：金黄色葡萄球菌抗原包括任选与无毒重组铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A偶联的5型和8型金黄色葡萄球菌荚膜多糖，例如StaphVAXTM，或衍生自表面蛋白质，侵染素(杀白细胞素、激酶、透明质酸酶)，抑制吞噬细胞吞噬作用的表面因子(荚膜，A蛋白)，类胡萝卜素，过氧化氢酶产物，A蛋白，凝固酶，凝血因子，和/或裂解真核细胞膜的膜破坏性毒素(任选脱毒的)(溶血素、白细胞毒素、杀白细胞素)的抗原。
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)：表皮葡萄球菌抗原包括粘质结合抗原(SAA)。
破伤风梭菌(Clostridium tetani)(破伤风)：破伤风菌抗原包括破伤风类毒素(TT)，优选用作与本发明组合物结合/偶联的载体蛋白质。
白喉棒状杆菌(Cornynebacterium diphtheriae)(白喉)：白喉抗原包括白喉毒素，优选脱毒的，如CRM197。此外考虑将能调节、抑制ADP核糖基化或与之结合的抗原与本发明组合物联用/共同给药/偶联。所述白喉类毒素可用作运载体蛋白。
流感嗜血杆菌B(Haemophilus influenzae B)(Hib)：Hib抗原包括Hib糖抗原。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)：铜绿假单胞菌抗原包括内毒素A、Wzz蛋白、铜绿假单胞菌LPS，更具体说是分离自PAO1(O5血清型)的LPS和/或外膜蛋白，包括外膜蛋白F(OprF)(Infect Immun.2001，May；69(5)：3510-15)。3510-3515).
嗜肺军团病杆菌(Legionella pneumophila)：可以是衍生自嗜肺军团杆菌病杆菌的细菌抗原。
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B群链球菌)：B群链球菌抗原包括WO 02/34771、WO 03/093306、WO 04/041157或WO 2005/002619鉴定的蛋白或糖抗原(包括蛋白GBS80、GBS 104、GBS276和GBS322以及包括血清型Ia、Ib、Ia/c、II、III、IV、V、VI、VII和VIII产生的糖抗原)。
淋病奈瑟菌(Neiserria gonorrhoeae)：淋病奈瑟菌抗原包括Por(或膜通道蛋白)蛋白，如PorB(参见Zhu等，Vaccine(2004)22：660-669)、转移结合蛋白如TbpA和TbpB(参见Price等，Infection and immunity(2004)71(1)：277-283)、混浊蛋白(如Opa)、还原可修饰蛋白(Rmp)和外膜囊泡(OMV)制品(参见Plante等，J InfectiousDisease(2000)182：848-55)，也参见例如WO 99/24578、WO 99/36544、WO99/57280、WO 02/0792430。
砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)：砂眼衣原体抗原包括血清型A、B、Ba和C产生的抗原(砂眼致病因子，导致失明)、血清型L1、L2和L3产生的抗原(与性病性淋巴肉芽肿(Lymphogranuloma venereum)有关)和血清型D-K产生的抗原。砂眼衣原体抗原还可包括WO 00/37494、WO 03/049762、WO03/068811或WO 05/002619鉴定的抗原，包括PepA(CT045)、LcrE(CT089)、ArtJ(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH-样(CT242)、L7/L12(CT316)、OmcA(CT444)、AtosA(CT467)、CT547、Eno(CT587)、HrtA(CT823)和MurG(CT761)。
苍白密螺旋体(Treponema pallidum)(梅毒)：苍白密螺旋体抗原包括TmpA抗原。
杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)(导致软性下疳)：软性下疳抗原包括外膜蛋白(DsrA)。
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)：抗原包括三糖重复序列或美国专利号6,756,361提供的其它肠球菌衍生抗原。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)：幽门螺杆菌抗原包括Cag、Vac、Nap、HopX、HopY和/或脲酶抗原。
腐生性葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)：抗原包括160kDa腐生葡萄球菌血凝素。
小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)：抗原包括LPS(InfectImmun.2002，Augst；70(8)：4414)。4414).
大肠杆菌(E.coli)：大肠杆菌抗原可以是肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、肠聚集性大肠杆菌(EAggEC)、弥散性附性大肠杆菌(DAEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和/或肠溶血性大肠杆菌(EHEC)产生的抗原。
炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)：炭疽杆菌抗原任选是脱毒的，可选自A-组分(致死因子(LF)和水肿因子(EF))，二者具有称为保护性抗原(PA)的共同B-组分。
鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)：鼠疫抗原包括F1荚膜抗原(InfectImmun.，2003年1月；71(1)：374-383)，LPS(Infect Immun.1999年10月；67(10)：5395)，鼠疫耶尔森菌V抗原(Infect Immun.1997年11月；65(11)：4476-4482)。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)：结核菌抗原包括脂蛋白、LPS、BCG抗原、抗原85B(Ag85B)和/或ESAT-6的融合蛋白，任选配制在阳离子脂质载体中(Infect Immun.2004年10月；72(10)：6148)，结核分枝杆菌(Mtb)异柠檬酸脱氢酶相关抗原(Proc Natl Acad Sci USA.2004年8月24日；101(34)：12652)，和/或MPT51抗原(Infect Immun.2004年7月；72(7)：3829)。
立克次体(Rickettsia)：抗原包括外膜蛋白A和/或B(OmpB)(BiochimBiophys Acta.2004年11月1日；1702(2)：145)，LPS和表面蛋白抗原(SPA)(JAutoimmun.1989年6月；2增刊：81)。单核细胞增多症李斯特菌(Listeriamonocytogenes)：
单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)：细菌抗原可衍生自单核细胞增多性利斯特菌。
肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)：抗原包括WO 02/02606鉴定的那些抗原。
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)：抗原包括蛋白酶抗原、LPS、特别是霍乱弧菌II的脂多糖、O1 Inaba O-特异性多糖、霍乱弧菌O139、IEM108疫苗的抗原(InfectImmun.2003年10月；71(10)：5498-504)和/或紧密连接毒素(Zot)。
伤寒沙门菌(Salmonella typhi)(伤寒热)：抗原包括荚膜多糖，优选偶联物(Vi，即vax-TyVi)。
博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)：抗原包括脂蛋白(如OspA、OspB、OspC和OspD)，其它表面蛋白如OspE-相关蛋白(Erps)、核心蛋白多糖结合蛋白(如DbpA)和抗原性可变的VI蛋白，如与P39和P13结合的蛋白(一种膜内在蛋白，Infect Immun.2001年5月；69(5)：3323-34)、VLsE抗原可变异蛋白(J Clin Microbiol.1999年12月；37(12)：3997)。
牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)：抗原包括其牙龈卟啉单孢菌外膜蛋白(OMP)。
克雷伯菌(Klebsiella)：抗原包括OMP，包括OMPA，或任选与破伤风类毒素偶联的多糖。
本发明的其它细菌抗原可以是任何上述的荚膜抗原、多糖抗原或蛋白抗原。其它细菌抗原也可包括外膜囊泡(OMV)制品。此外，抗原包括活的、减毒的和/或纯化的任何上述细菌。本发明的抗原可以衍生自革兰-阴性菌或革兰-阳性菌。本发明的抗原可以衍生自需氧菌或厌氧菌。
此外，可将上述细菌产生的任何一种糖(多糖、LPS、LOS或寡糖)与其它物质或抗原，如运载体蛋白(如CRM197)偶联。这种偶联可以是糖上羰基部分与蛋白质氨基基团还原胺化实现的直接偶联，如美国专利5,360,897和Can JBiochem Cell Biol.1984年5月；62(5)：270-5所述。或者，糖可以通过连接基团偶联，例如采用《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)，1996和CRC，《蛋白质偶联与交联化学》(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking)，1993中提供的琥珀酸酰胺或其他连接键。
B.病毒抗原
适合本发明用的病毒抗原包括灭活(或杀伤)病毒、减毒病毒、裂解病毒制剂、纯化亚单位制剂、从病毒和病毒样颗粒(VLP)分离、纯化或衍生的病毒蛋白质。病毒抗原可以是在培养细胞或其它基质上增殖病毒产生的抗原。或者，可重组表达病毒抗原。病毒抗原优选包含在其生命周期至少某阶段暴露在病毒表面的表位。病毒抗原优选在多种血清型或分离物中为保守的抗原。病毒抗原包括衍生自以下一种或多种病毒及以下鉴定的特异性抗原例子的抗原。
正粘病毒(Orthomyxovirus)：病毒抗原可衍生自正粘病毒，例如甲型、乙型和丙型流感(病毒)。正粘病毒抗原可选自一种或多种病毒蛋白质，包括血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)、膜蛋白(M2)；一种或多种转录酶组分(PB1、PB2和PA)。优选的抗原包括HA和NA。
流感病毒抗原可以可衍生自流行病爆发间的(年度)流感毒株。或者，流感病毒抗原可以衍生自可能导致流行病爆发的毒株(即，与目前的流行毒株相比，具有新血凝素的流感毒株，或者在禽类对象中致病并可能平行转移至人群的流感毒株，或对人致病的流感毒株)。
副粘病毒科病毒：病毒抗原可以衍生自副粘病毒科病毒，如肺病毒属(RSV)、副粘病毒属(PIV)和麻疹病毒属(麻疹)。
肺病毒属：病毒抗原可以衍生自肺病毒属，如呼吸道合胞病毒(RSV)、牛呼吸道合胞病毒、小鼠肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒产生的病毒抗原。优选的肺病毒是RSV。肺病毒抗原可选自以下一种或多种蛋白，包括表面融合蛋白(F)、糖蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)、基质蛋白M1和M2、核衣壳蛋白N、P和L及非结构蛋白NS1和NS2。优选的肺病毒抗原包括F、G和M。参见J Gen Virol.2004年11月；85(部分11)：3229。肺病毒属抗原还可配制成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒可同时包含RSV和PIV的组分。
副粘病毒属：病毒抗原可衍生自副粘病毒属，如1-4型副流感病毒(PIV)、腮腺炎病毒、仙台病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒和新城疫病毒。副粘病毒优选PIV或腮腺炎病毒。副粘病毒抗原可以选自以下一种或多种蛋白：血凝素-神经氨酸酶(HN)、融合蛋白F1和F2、核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)和基质蛋白(M)。优选的副粘病毒属蛋白包括HN、F1和F2。副粘病毒属抗原还可配制成或衍生自嵌合病毒。例如，嵌合型RSV/PIV病毒可同时包含RSV和PIV的组分。可商品化购得的腮腺炎病毒疫苗包括单价形式或与麻疹和风疹疫苗联用(MMR)的减毒活腮腺炎病毒。
麻疹病毒属：病毒抗原可以衍生自麻疹病毒属如麻疹病毒。麻疹病毒属抗原可选自以下一种或多种蛋白：血凝素(H)、糖蛋白(G)、融合因子(F)、大蛋白(L)、核蛋白(NP)、聚合酶磷蛋白(P)和基质(M)。可商品化购得的麻疹病毒疫苗包括通常与腮腺炎和风疹病毒组成联合减毒活疫苗(MMR)。
微小RNA病毒：病毒抗原可衍生自微小RNA病毒，如肠病毒、鼻病毒、嗜肝RNA病毒(Heparnavirus)、心病毒和口蹄疫病毒。优选衍生自肠病毒，如脊髓灰质炎病毒的抗原。
肠道病毒：病毒抗原衍生自肠病毒，如1、2或3型脊髓灰质炎病毒、1-22型和24型柯萨奇A病毒、B1-6型柯萨奇病毒、1-9型、11-27型和29-34型艾柯病毒(ECHO)，及68-71型肠病毒。优选的肠病毒是脊髓灰质炎病毒。肠病毒抗原宜选自以下VP1、VP2、VP3和VP4衣壳蛋白的一种或多种。可商品化购得的脊髓灰质炎疫苗包括灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)和口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)。
嗜肝RNA病毒：病毒抗原可衍生自可以是嗜肝RNA病毒，如甲肝病毒(HAV)。可商品化购得的HAV疫苗包括灭活的HAV疫苗。
披膜病毒：病毒抗原可衍生自披膜病毒，如风疹病毒、α病毒或动脉炎病毒。优选衍生自风疹病毒属，如风疹病毒的抗原。披膜病毒抗原可选自E1、E2、E3、C、NSP-1、NAPO-2、NSP-3或NSP-4。优选的披膜病毒抗原是E1、E2或E3。可商品化购得的风疹病毒疫苗包括通常与腮腺炎和麻疹疫苗联用的冷适应的活病毒(MMR)。
黄病毒属：病毒抗原可衍生自黄病毒属，如蜱传脑炎(病毒)(TBE)、登革热(病毒)(1、2、3或4型)、黄热病(病毒)、日本脑炎(病毒)、西尼洛河脑炎(病毒)、圣露易斯脑炎(病毒)、俄罗斯春夏型脑炎(病毒)、波瓦桑脑炎病毒。黄病毒属抗原可选自：PrM、M、C、E、NS-1、NS-2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。优选的黄病毒属抗原是PrM、M和E。可商品化购得的TBE疫苗包括病毒灭活疫苗。
鼠疫病毒：病毒抗原可衍生自鼠疫病毒，如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、经典猪瘟病毒(CSFV)或边界病病毒(BDV)。
嗜肝DNA病毒：病毒抗原可衍生自嗜肝DNA病毒，如乙肝病毒。嗜肝DNA病毒抗原选自：表面抗原(L、M和S)、核心抗原(HBc、HBe)。可商品化购得的HBV疫苗包括含表面抗原S蛋白的亚单位疫苗。
丙型肝炎病毒：病毒抗原可衍生自丙肝病毒(HCV)。HCV抗原可选自E1、E2、E1/E2、NS345糖蛋白、NS345-核心多蛋白和/或非结构区肽中的一种或多种(Houghton等，Hepatology(1991)14：381)。
杆状病毒：病毒抗原可衍生自杆状病毒，如如莱萨病毒(狂犬病病毒)和水泡病毒(VSV)。杆状病毒抗原可选自：糖蛋白(G)、核蛋白(NP)、大蛋白(L)、非结构蛋白(NS)。可商品化购得的狂犬病毒疫苗包含在人二倍体细胞或恒河猴胎肺细胞上培养的杀伤病毒。
杯状病毒科：病毒抗原可衍生自杯状病毒科，如诺瓦克病毒，和诺瓦克样病毒如夏威夷病毒和雪山病毒。
冠状病毒：病毒抗原可衍生自冠状病毒，SARS、人呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎病毒(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。冠状病毒抗原可选自：突刺(S)、包膜(E)、基质(M)、核衣壳(N)和血凝素-脂酶糖蛋白(HE)。冠状病毒抗原优选衍生自SARS病毒。SARS病毒抗原参见WO 04/92360中的描述。
逆转录病毒：病毒抗原可衍生自逆转录病毒，如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。肿瘤病毒抗原可衍生自HTLV-1、HTLV-2和HTLV-5。慢病毒抗原可衍生自HIV-1或HIV-2。逆转录病毒抗原选自：gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu和vpr。HIV抗原选自：gag(p24gag和p55gag)、env(gp160和gp41)、pol、tat、nef、rev、vpu、微小蛋白(优选p55gag和gp140v缺失)。HIV抗原可衍生自以下一种或多种毒株：HIVIIIb，HIVSF2，HIVLAV，HIVLAI，HIVMN，HIV-1CM235，HIV-1US4。
呼肠孤病毒：病毒抗原可衍生自呼肠孤病毒，如正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗拉多蜱传热病毒(Coltivirus)。呼肠孤病毒抗原可选自：结构蛋白λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、σ1、σ2或σ3或非结构蛋白σNS、μNS或σ1s。优选的呼肠孤病毒抗原可衍生自轮状病毒。轮状病毒抗原选自：VP1、VP2、VP3、VP4(或切割产物VP5和VP8)、NSP1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4或NSP5。优选的轮状病毒抗原包括VP4(或切割产物VP5和VP8)及VP7。
细小病毒：病毒抗原可衍生自细小病毒，如细小病毒B19。细小病毒抗原选自：VP-1、VP-2、NS-1和NS-2。优选的细小病毒抗原是衣壳蛋白VP-2。
δ-肝炎病毒(HDV)：病毒抗原可以是衍生的HDV，特别是HDV的δ-抗原(参见例如美国专利号5,378,814)。
戊肝病毒(HEV)：病毒抗原可衍生自HEV。
庚肝病毒(HGV)：病毒抗原可衍生自HGV。
人疱疹病毒：病毒抗原可衍生自人疱疹病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、人疱疹病毒6(HHV6)、人疱疹病毒7(HHV7)和人疱疹病毒8(HHV8)。人疱疹病毒抗原可选自：立即早期蛋白(α)、早期蛋白(β)和晚期蛋白(γ)。HSV抗原可衍生自HSV-1或HSV-2毒株。HSV抗原选自：糖蛋白gb、gC、gD和gH、融合蛋白(gB)或免疫逃避蛋白(gC、gE或gI)。VZV抗原可选自核心、核衣壳、外被膜或包膜蛋白。可商品化购得VZV减毒活疫苗。EBV抗原可选自早期抗原(EA)蛋白、病毒衣壳抗原(VCA)和膜抗原(MA)的糖蛋白。CMA抗原可选自衣壳蛋白、包膜糖蛋白(如gB和gH)和外被膜蛋白。
乳多空病毒：抗原可衍生自乳多空病毒，如乳头瘤病毒和多瘤病毒。乳头瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。HPV抗原优选衍生自血清型6、11、16或18。HPV抗原选自：衣壳蛋白(L1)和(L2)或E1-E7或其融合蛋白。优选将HPV抗原配制成病毒样颗粒(VLP)。多瘤病毒包括BK病毒和JK病毒。多瘤病毒抗原选自VP1、VP2或VP3。
《疫苗》(Vaccines)，第四版，(Plotkin和Orenstein编，2004)；《医学微生物》(Medical Microbiology)，第四版，(Murray等编，2002)；《病毒学》(Virology)，第三版，(W.K.Joklik编，1988)；《基础病毒学》(Fundamental Virology)，第二版，(B.N.Fields和D.M.Knipe编，1991)也描述其它抗原、组合物、方法和微生物，本发明的组合物涵盖了这些抗原。
C.真菌抗原
可用于本发明的真菌抗原是以下一种或多种真菌产生的抗原。
真菌抗原可衍生自皮肤真菌，包括：絮状表皮癣菌(Epidermophytonfloccusum)、头癣小孢子菌(Microsporum audouini)、犬小孢子菌、扭曲小孢子菌(Microsporum distortum)、马小孢子菌(Microsporum equinum)、石膏样小孢子菌、矮小孢子菌(Microsporum nanum)、同心发癣菌(Trichophyton concentricum)、马发癣菌、鸡发癣菌(Trichophyton gallinae)、石膏样发癣菌(Trichophytongypseum)、麦格发癣菌(Trichophyton megnini)、须发癣菌、昆克努发癣菌(Trichophyton quinckeanum)、红色发癣菌(Trichophyton rubrum)、舍恩莱发癣菌(Trichophyton schoenleini)、断发癣菌(Trichophyton tonsurans)、疣状发癣菌(Trichophyton verrucosum)、疣状发癣菌album变种(var.album)、discoides变种(var.discoides)、ochraceum变种(var.ochraceum)、堇色发癣菌(Trichophytonviolaceum)和/或蜜块状发癣菌(Trichophyton faviforme)。
真菌病原体可衍生自：烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowi)、黄麴菌(Aspergillus flavatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、头状芽生裂殖酵母(Blastoschizomyces capitatus)、白色念珠菌(Candida albicans)、烯醇酶假丝酵母(Candida enolase)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克鲁斯念珠菌(Candidakrusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、类星形念珠菌(Candidastellatoidea)、克鲁斯念珠菌、(Candida parakwsei)、葡萄牙念珠菌(Candidalusitaniae)、假热带念珠(Candida pseudotropicalis)、吉利蒙德念珠菌(Candidaguilliermondi)、卡里翁分支孢子菌(Cladosporium carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、棒地霉(Geotrichum clavatum)、夹膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)、巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、腐霉菌(Pythiumn insidiosum)、瓶形酵母(Pityrosporum ovale)、酿酒酵母(Sacharomycescerevisae)、布拉第酵母菌(Saccharomyces boulardii)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiosperum)、申克(氏)孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、白色毛孢子菌(Trichosporon beigelii)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、马尼弗(氏)青霉菌(Penicillium marneffei)、鳞斑霉属(Malassezia spp.)、产色芽生菌属(Fonsecaea spp.)、万吉拉菌属(Wangiella spp.)、孢子丝菌属(Sporothrix spp.)、担子菌团属(Basidiobolus spp.)、耳霉属(Conidiobolus spp.)、根霉菌属(Rhizopus spp)、毛霉属(Mucor spp)、犁头霉属(Absidia spp)、被孢霉属(Mortierella spp)、小克银汉霉属(Cunninghamella spp)、瓶霉属(Saksenaea spp)、链格孢属(Alternaria spp)、弯孢霉属(Curvularia spp)、长蠕孢属(Helminthosporium spp)、镰孢菌属(Fusarium spp)、曲霉菌属(Aspergillus spp)、青霉菌属(Penicillium spp)、褐腐病菌属(Monolinia spp)、丝核菌属(Rhizoctonia spp)、拟青霉属(Paecilomyces spp)、皮司霉属(Pithomyces spp)和分支孢子菌属(Cladosporium spp)。
制备真菌抗原的方法是本领域熟知的(参见美国专利号6,333,164)。在一优选方法中，提取溶解组分，将其与真菌细胞的不可溶组分分开，其中基本上除去或至少部分除去了细胞壁，该方法的特征在于包括以下步骤：获得活的真菌细胞；获得基本上除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞；使基本上除去或至少部分除去细胞壁的真菌细胞破裂；获得不可溶组分；和提取溶解的组分并将其与不可溶组分分开。
D.STD抗原
本发明的组合物可包含衍生自性传播疾病(STD)的一种或多种抗原。这种抗原可供预防或治疗STD，如衣原体、生殖器疱疹、肝炎(如丙肝)、生殖器疣、淋病、梅毒和/或软下疳(参见WO 00/15255)。抗原可衍生自一种或多种病毒或细菌性STD。用于于本发明的病毒STD抗原可衍生自，例如，HIV、单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、人乳头瘤病毒(HPV)和肝炎(HCV)病毒。用于于本发明的细菌STD抗原可衍生自，例如，淋病奈瑟球菌、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、砂沙眼衣原体、苍白密螺旋体、杜克雷嗜血杆菌、大肠杆菌和无乳链球菌。上文描述了这些病原体产生的特定抗原的例子。
E.呼吸性抗原
本发明的组合物可包含一种或多种衍生自引起呼吸道疾病的病原体的抗原。例如，呼吸道抗原可衍生自呼吸道病毒，如正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、VZV和冠状病毒(SARS)。呼吸道抗原可衍生自引起呼吸道疾病的细菌，如肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、百日咳博德特菌、结核分支杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、炭疽杆菌和粘膜炎莫拉菌。上文描述了这些病原体产生的特定抗原的例子。
F.儿科疫苗抗原
本发明的组合物可包含适合用于儿科对象的一种或多种抗原。儿科对象一般年龄小于约3岁，或小于约2岁，或小于约1岁。儿科抗原可在6个月、1年、2年或3年的时间中多次给予。儿科抗原可衍生自靶向儿科群体的病毒和/或儿科群体易受感染的病毒。儿科病毒抗原包括衍生自以下一种或多种病毒的抗原：正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)和水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)。儿科细菌抗原衍生自以下一种或多种细菌的抗原：肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黄色葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒状杆菌(白喉)、流感嗜血杆菌B(Hib)、铜绿假单胞菌、无乳链球菌(B群链球菌)和大肠杆菌。上文描述了这些病原体产生的特定抗原的例子。
G.适合用于老年人和免疫力低下个体的抗原
本发明的组合物可包含适合用于老年人和免疫力低下个体的一种或多种抗原。所述个体可能需要更经常接种疫苗，用较高剂量或含佐剂的制剂以增强对靶抗原的免疫反应。用于老年人和免疫力低下个体的抗原包括衍生自以下一种或多种病原体的抗原：脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌(A群链球菌)、粘膜炎莫拉菌、百日咳博德特菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破伤风梭菌(破伤风)、白喉棒状杆菌(白喉)、流感嗜血杆菌B(Hib)、铜绿假单胞菌、嗜肺军团病杆菌、无乳链球菌(B群链球菌)、粪肠球菌、幽门螺杆菌、肺炎衣原体、正粘病毒(流感)、肺病毒(RSV)、副粘病毒(PIV和腮腺炎)、麻疹病毒(麻疹)、披膜病毒(风疹)、肠病毒(脊髓灰质炎)、HBV、冠状病毒(SARS)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)。上文描述了这些病原体产生的特定抗原的例子。
H.适合用于青少年疫苗的抗原
本发明的组合物可包含合用于青少年对象的一种或多种抗原。青少年可能需要以前给予的儿科抗原的加强免疫。上文描述了适合用于青少年的儿科抗原。此外，青少年可能需要接受衍生自STD病原体的抗原以在开始性活动前确保具有保护性或治疗性免疫力。上文描述了适合用于青少年的STD抗原。
I.抗原制剂
本发明的其它方面，提供了吸附抗原微粒的生产方法。该方法包括：(a)将含有以下成分的混合物分散来提供乳液：(i)水，(ii)洗涤剂，(iii)有机溶剂和(iv)生物可降解的聚合物，所述聚合物选自：聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯。与有机溶剂相比，混合物中存在的所述聚合物浓度通常约1％-约30％，而根据洗涤剂-聚合物的重量比，混合物中存在的洗涤剂通常约为0.00001∶1-约0.1∶1(更常见是约0.0001∶1-约0.1∶1，约0.001∶1-约0.1∶1，或约0.005∶1-约0.1∶1)；(b)除去乳液中的有机溶剂；和(c)将抗原吸附到微粒表面。在一些实施方式中，与有机溶剂相比，所述生物可降解聚合物的存在浓度是约3％-约10％。
可以用可灭菌、无毒和生物可降解的材料制备本文所用的微粒。这些材料包括但不限于：聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐、PACA和聚氰基丙烯酸酯。本发明所用的微粒优选源自聚(α-羟酸)，特别是聚(丙交酯)(“PLA”)或D，L丙交酯和乙交酯或乙醇酸的共聚物，例如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”或“PLGA”)或D，L-丙交酯和己内酯的共聚物。微粒可源自分子量不同的任何聚合起始材料，以共聚物，例如PLG为例，各种丙交酯∶乙交酯的比例(其选择在很大程度上是个选择问题)部分取决于共同给予的大分子。下文将更详细地讨论这些参数。
其它抗原还包括外膜囊泡(OMV)制品。
其它配制方法和抗原(特别是肿瘤抗原)参见美国专利序列号09/581,772。
J.抗原参考文献
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5555Conjugate Vaccines(偶联物疫苗)(Cruse等编)ISBN 3805549326，特卷10：48-114.
5656Hermanson(1996)Bioconjugate Techniques(生物偶联技术)ISBN：012323368和012342335X.
57欧洲专利申请0372501.
58欧洲专利申请0378881.
59欧洲专利申请0427347.
60国际专利申请WO93/17712.
61国际专利申请WO98/58668.
62欧洲专利申请0471177.
63国际专利申请WO00/56360.
64国际专利申请WO00/67161.
以上引用的所有专利、专利申请和杂志论文的内容通过引用全文纳入本文。
当采用糖或碳水化合物抗原时，优选将其与载体蛋白偶联以增强免疫原性。参见Ramsay等(2001)Lancet 357(9251)：195-196；Lindberg(1999)Vaccine 17增刊2：S28-36；Buttery和Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34：163-168；Ahmad和Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13：113-133，vii；Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47：563-567；欧洲专利0 477 508；美国专利5,306,492；WO98/42721；Conjugate Vaccines(偶联物疫苗)(Cruse等编)ISBN 3805549326，具体是10：48-114；Hermanson(1996)Bioconjugate Techniques(生物偶联技术)ISBN：0123423368或012342335X。优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。特别优选CRM197白喉类毒素。
其它载体多肽包括：脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白(EP-A-0372501)、合成肽(EP-A-0378881和EP-A 0427347)、热激蛋白(WO 93/17712和WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668和EP A 0471177)、流感嗜血杆菌蛋白D(WO00/56360)、细胞因子(WO 91/01146)、淋巴因子、激素、生长因子、艰难梭菌毒素A或B(WO 00/61761)、铁摄取蛋白(WO 01/72337)等等。当混合物包含血清群A和C的荚膜糖时，优选MenA糖∶MenC糖的比例(w/w)大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。可将不同糖与相同或不同类型的载体蛋白偶联。需要时可采用任何适合的偶联反应，和任何适合的接头。
如需要可脱毒有毒性的蛋白抗原，如用化学和/或遗传方法脱毒百日咳毒素。
药学上可接受的运载体
本发明的组合物除了上述组分外，通常包含一种或多种“药学上可接受的运载体”。包含的这些运载体本身不会诱导产生对接受此组合物个体有害的抗体。合适的运载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集物(如油滴或脂质体)。这类运载体是本领域技术人员熟知的。所述组合物也可包含稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，可存在辅助剂，如湿润或乳化剂、pH缓冲剂等。可从Gennaro(2000)“Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：药物科学与实践)”第20版ISBN：0683306472一书中获得关于药学上可接受组分的全面论述。
免疫调节剂
佐剂
本发明的疫苗可与其它免疫调节剂联合给予。具体说，该组合物通常包含佐剂。本发明可用的佐剂包括但不限于以下的一种或多种：
A.含矿物质的组合物
适合用作本发明佐剂的含矿物质组分包括矿物盐，如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟基磷酸盐，正磷酸盐)、硫酸盐等(例如参见Powell和Newman主编的“疫苗设计(Vaccine Design…)”，第8和9章，ISBN：030644867X普莱纳姆出版社(Plenum.))或不同矿物质化合物的混合物(如磷酸盐与氢氧化物佐剂的混合物，任选磷酸盐过量)，这些化合物可采取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，这些盐优选(具有)吸附性。也可将含矿物质的组合物配制成金属盐颗粒(WO 00/23105)。
本发明疫苗中可包含铝盐，Al3+的剂量在0.2-1.0mg/剂之间。
在一实施方式中，本发明所用的铝盐佐剂是明矾(硫酸钾铝AlK(SO4)2)，或者，例如通过在磷酸缓冲液中混合抗原与铝盐，再用碱如氢氧化铵或氢氧化钠滴定和沉淀原位形成的明矾衍生物。
本发明疫苗制剂可用的另一种铝佐剂是氢氧化铝(Al(OH)3)或结晶碱式氢氧化铝(AlOOH)，这是一种极佳吸附剂，表面积约500m2/g。或者，可用含有磷酸基团替代了氢氧化铝佐剂中的一些或全部羟基的磷酸铝佐剂(AlPO4)或羟基磷酸铝。本文提供的优选磷酸铝佐剂是无定形的并可溶于酸性、碱性和中性介质。
在另一实施方式中，本发明的佐剂包含磷酸铝和氢氧化铝。在一更具体的实施方式中，此佐剂的磷酸铝含量高于氢氧化铝，例如以重量计，磷酸铝与氢氧化铝之比为2∶1、3；1、4∶1、5；1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或高于9∶1。更具体说，该疫苗所含的铝盐为：每疫苗剂量0.4-1.0mg、或每疫苗剂量0.4-0.8mg、或每疫苗剂量0.5-0.7mg或每疫苗剂量约0.6mg。
一般通过优化分子间的静电吸引使抗原在所需pH时携带与佐剂相反的电荷，从而能选择优选的铝佐剂或多种铝佐剂，例如磷酸铝与氢氧化铝之比。例如，pH 7.4时磷酸铝佐剂(iep＝4)吸附溶菌酶，但不吸附白蛋白。如果白蛋白是靶标，则应选择氢氧化铝佐剂(iep 11.4)。或者，用磷酸预处理氢氧化铝可降低其等电点，使其成为碱性更高的抗原的优选佐剂。
B.油-乳剂
适合用作本发明佐剂的油-乳剂包括角鲨烯-水乳剂，如MF59(5％角鲨烯、0.5％吐温TM 80和0.5％司盘85，用微流化器制成亚微米颗粒)。参见WO90/14837。也参见Podda，Vaccine(2001)19：2673-2680；Frey等，Vaccine(2003)21：4234-4237。MF59已用作FLUADTM流感病毒三价亚单位疫苗中的佐剂。
本发明组合物中所用的特别优选佐剂是亚微米水包油乳剂。本文所用的优选亚微米水包油乳剂是任选含有不同含量的MTP-PE的角鲨烯/水乳剂，例如含4-5％w/v角鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80TM(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)和/或0.25-1.0％司盘85TM(失水山梨醇三油酸酯)和任选的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂，例如称为“MF59”的亚微米水包油乳剂(国际公布号WO90/14837；美国专利号6,299,884和6,451,325；和Ott等，“MF59-人用疫苗的一种安全而强效佐剂的设计与评估”(MF59--Design andEvaluation of a Safe and Potent Adiuvant for Human Vaccines)，刊于《疫苗设计：亚单位和佐剂方法》(Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach)(Powell，M.F.和Newman，M.J.编)，普莱纳姆出版社(Plenum Press)，纽约，1995，第277-296页)。MF59含有4-5％w/v角鲨烯(如4.3％)、0.25-0.5％w/v吐温TM80和0.5％w/v司盘85TM，并任选含有各种含量的MTP-PE，用微流化仪，例如110Y型微流化仪(微射流公司(Microfluidics)，牛顿市，马萨诸塞州)配制成亚微米颗粒。例如，MTP-PE的含量可以是约0-500μg/剂，更优选0-250μg/剂，最优选0-100μg/剂。本文所用的术语“MF59-0”指不含MTP-PE的以上亚微米水包油乳剂，而术语“MF59-MTP”表示含有MTP-PE的制剂。例如，“MF59-100”含有100μg MTP-PE/剂，等等。MF69是本文所用的另一种亚微米水包油乳剂，其含有4.3％w/v角鲨烯、0.25％w/v吐温TM80和0.75％w/v司盘85TM和任选的MTP-PE。还有另一种亚微米水包油乳剂是MF75，也称为SAF，其含有10％角鲨烯、0.4％吐温TM80、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，也微流化成亚微米乳剂。MF75-MTP表示含有MTP的MF75制剂，例如100-400μgMTP-PE/剂。
国际公布号WO90/14837；美国专利号6,299,884和美国专利6,451,325详细描述了用于组合物中的亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂，例如胞壁酰肽。
弗氏完全(CFA)和不完全佐剂(IFA)也可用作本发明的佐剂。
C.皂苷制剂
皂苷制剂也适用作本发明佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶、茎、根、甚至花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物(heterologous group)。皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮中分离的皂苷是广泛研究的佐剂。皂苷也可商品化购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophilla paniculata)(婚纱花(brides veil))和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根(soap root))。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。
已利用高效薄层色谱(HP-LC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化皂苷组合物。已经鉴定了用这些技术专门纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。美国专利号5,057,540披露了QS21的制备方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇(参见WO96/33739)。
可联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒。ISCOM一般还含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用在ISCOM中。ISCOM优选含有QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。EP0109942、WO96/11711和WO96/33739进一步描述了ISCOM。ISCOM任选不含其它洗涤剂。参见WO00/07621。
开发皂苷佐剂的综述可参见Barr等，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32：247-271。也可参见Sjolander等，Advanced Drug Delivery Reviews(1998)32：321-338。
D.病毒体和病毒样颗粒(VLP)
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也适用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多种任选与磷脂混合或用磷脂配制的病毒蛋白质。它们通常无致病性、不能复制，通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于病毒体或VLP中的这些病毒蛋白包括源自以下的蛋白质：流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白p1)。WO03/024480、WO03/024481；Niikura等，(2002)，Virology 293：273-280；Lenz等，(2001)，J.Immunol 166(9)：5246-5355；Pinto等，(2003)，J.Infect.Dis.188：327-338；和Gerber等，(2001)，J.Virol.75(10)：4752-4760进一步讨论了VLP。例如，Gluck等，(2002)，Vaccine 20：B10-B16进一步讨论了病毒体。鼻内三价INFLEXALTM产品(Mischler和Metcalfe，(2002)Vaccine 20，增刊5：B17-B23)和INFLUVACPLUSTM产品中使用免疫增强型重建流感病毒体(IRIV)作为亚单位抗原递送系统。
E.细菌或微生物衍生物
适合用于本发明的佐剂包括细菌和微生物衍生物，如：
(1)肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物
这种衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是含有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。EP 0 689 454公开了3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的优选“小颗粒”形式。3dMPL的这种“小颗粒”足够小从而可经0.22μm膜无菌过滤(参见EP 0 689 454)。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529。参见Johnson等，(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2273-2278。
(2)脂质A衍生物
脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A衍生物，例如OM-174。OM-174描述于，例如Meraldi等(2003)Vaccine 21：2485-2491；和Pajak等(2003)Vaccine 21：836-842。
(3)免疫刺激寡核苷酸
适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(含有通过磷酸键与随后的鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的序列)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。
CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰并且可以是双链或单链。可任选用类似物，例如2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。可能的类似物取代可参见Kandimalla等，(2003)，Nucleic Acids Research.31(9)：2393-2400；WO02/26757和WO99/62923。Krieg，(2003)，Nat.Med.9(7)：831-835；McCluskie等，(2002)，FEMS Immunology and Medical Microbiology.32：179-185；WO98/40100；美国专利号6,207,646；美国专利号6,239,116和美国专利号6,429,199进一步讨论了CpG寡核苷酸作为佐剂的作用。
CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT。参见Kandimalla等(2003)Biochemical Society Transactions.31(部分3)：654-658。654-658.CpG序列，例如CpG-A ODN可特异性诱导Th1免疫应答，或者，例如CpG-B ODN可更特异地诱导B细胞应答。Blackwell等(2003)J.Immunol.170(8)：4061-4068；Krieg(2002)TRENDS in Immunol.23(2)：64-65；和WO 01/95935讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。
优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易于为受体识别。任选将两条CpG寡核苷酸序列在它们的3’端相连以形成“免疫聚体”(immunomer)。参见，例如Kandimalla等(2003)BBRC 306：948-953；Kandimalla等(2003)BiochemicalSociety Transactions.31(部分3)：664-658；Bhagat等(2003)BBRC 300：853-861；和WO03/035836。
(4)ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选源自大肠杆菌(即，大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)、霍乱(弧菌)(“CT”)或百日咳(杆菌)(“PT”)。WO95/17211中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，WO98/42375中描述了将其用作胃肠道外佐剂。佐剂优选脱毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LTR192G。ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见以下参考文献：Beignon等，Infection and Immunity(2002)70(6)：3012-3019；Pizza等，Vaccine(2001)19：2534-2541；Pizza等，Int.J.Med.Microbiol(2000)290(4-5)：455-461；Scharton-Kersten等，Infection and Immunity(2000)68(9)：5306-5313；Ryan等，Infection and Immunity(1999)67(12)：6270-6280；Partidos等，Immunol.Lett.(1999)67(3)：209-216；Peppoloni等，Vaccines(2003)2(2)：285-293和Pine等，(2002)J.Control Release(2002)85(1-3)：263-270。氨基酸取代的数字基准优选以Domenighini等，Mol.Microbiol(1995)15(6)：1165-1167所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基排列对比为基础。
F.生物粘合剂和粘膜粘合剂
生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球(Singh等，(2001)J.Cont.Release.70：267-276)，或者粘膜粘合剂，例如聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂。参见WO99/27960。
G.微粒
微粒也可用作本发明的佐剂。可从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选用聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即，直径约100nm到150μm，优选约200nm到约30μm，最优选约500nm到约10μm的颗粒)，任选将这些微粒处理成带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。
H.脂质体
适合用作本发明佐剂的脂质体制剂例子描述于美国专利6,090,406；美国专利5,916,588和EP 0 626 169。
I.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂
适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯(参见，例如WO99/52549)。WO99/52549.这种制剂还包括聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇(WO01/21207)以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇(WO 01/21152)的混合物。
优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
J.聚磷腈(PCPP)
PCPP制剂描述于，例如Andrianov等，“Preparation of hydrogel microspheresby coacervation of aqueous polyphophazene solutions(通过凝聚聚磷腈水溶液制备水凝胶微球)”，Biomaterials(1998)19(1-3)：109-115和Payne等，“ProteinRelease from Polyphosphazene Matrices(聚磷腈基质的蛋白质释放)”，Adv.Drug.Delivery Review(1998)31(3)：185-196。
K.胞壁酰肽
适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(去甲-MDP)和N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
L.咪唑并喹啉化合物
适合用作本发明佐剂的咪唑并喹啉化合物的例子包括咪喹莫特(Imiquimod)及其类似物，其描述参见Stanley，Clin Exp Dermatol(2002)27(7)：571-577；Jones，Curr Opin Investig Drugs(2003)4(2)：214-218和美国专利4,689,338、5,389,640、5,268,376、4,929,624、5,266,575、5,352,784、5,494,916、5,482,936、5,346,905、5,395,937、5,238,944和5,525,612。
M.缩氨基硫脲化合物
所有适合用作本发明佐剂的缩氨基硫脲化合物的例子以及配制、制备和筛选这种化合物的方法包括WO 04/60308所述的。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子，例如TNF-α中特别有效。
N.色胺酮化合物
所有适合用作本发明佐剂的色胺酮化合物的例子以及配制、制备和筛选这种化合物的方法包括WO 04/64759所述的。色胺酮化合物在刺激人外周血单核的细胞产生细胞因子，例如TNF-α中特别有效。
本发明还包括以上鉴定和一种或多种佐剂的组合。例如，以下佐剂组合物可用于本发明：
(1)皂苷和水包油乳剂(WO99/11241)；
(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)(参见WO94/00153)；
(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；
(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)(WO98/57659)；
(5)联用3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂混合物(参见欧洲专利申请0 835 318；0 735 898和0 761 231)；
(6)SAF，含10％角鲨烷、0.4％吐温80、5％普流罗尼嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化形成亚微米乳剂或涡旋形成较大粒径的乳剂。
(7)RIBITM佐剂系统(RAS)，(Ribi免疫化学公司(Ribi Immunochem))，其含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种由单磷酸酰脂质A(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)组成的细菌细胞壁组分；和
(8)一种或多种无机盐(例如铝盐)+无毒性LPS衍生物(例如3dMPL)。
(9)一种或多种无机盐(例如铝盐)+免疫调节性寡核苷酸(例如包含CpG基序的核苷酸序列)。
O.人免疫调节剂
适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
可注射的流感疫苗采用的优选佐剂是铝盐和MF59。粘膜递送疫苗采用的优选佐剂是细菌毒素和生物粘合剂。
以上引用的所有专利、专利申请和杂志论文的内容通过引用全文纳入本文。
治疗方法
本发明提供的上述组合物可用于治疗。本发明提供的上述组合物可诱导或增强对酿脓链球菌的免疫反应。本发明提供用上述组合物诱导或增强对酿脓链球菌的免疫反应的方法。免疫反应优选为保护性，包括抗体和/或细胞介导免疫力(包括全身和粘膜免疫力)。免疫反应包括增强反应。
青少年和儿童，包括学步儿童和婴儿可接受预防用疫苗，而治疗疫苗通常给予青少年和成人。儿童疫苗也可给予成人，例如评估其安全性、剂量、免疫原性等。
可按照本发明预防或治疗酿脓链球菌引起的疾病，包括但不限于：咽炎(如链球菌扁桃体炎)、猩红热、小脓疱疹、丹毒、蜂窝组织炎、败血症、中毒性休克综合征、坏死性筋膜炎和后遗症，如风湿热和急性肾小球肾炎。该组合物对其它链球菌，如GBS也有效。
检测免疫反应效果的试验
一种评估治疗性治疗效果的方法涉及给予本发明组合物后监测GSA感染。一种评估预防性治疗效果的方法涉及在给予本发明组合物后监测对该组合物中突变型SLO蛋白的免疫反应。
另一种评估本发明免疫原性组合物中组分蛋白的免疫原性的方法是重组表达突变型SLO蛋白并通过免疫印迹筛检患者的血清或粘膜分泌物。该蛋白与患者血清之间发生阳性反应表明该患者已对所述蛋白产生了免疫反应，即所述蛋白为免疫原。也可用此法鉴定免疫优势蛋白和/或抗原表位。
另一种核查治疗性治疗效果的方法涉及给予本发明组合物后监测GSA感染。一种核查预防性治疗效果的方法涉及给予本发明组合物后全身性(如监测IgG1和IgG2a的产生水平)和粘膜性(如监测IgA的产生水平)监测抗SLO的免疫反应。血清特异性抗体反应通常在免疫后但攻击前检测，而粘膜特异性抗体反应在免疫后和攻击后检测。
可在给予宿主，如人前用体外和体内动物模型评价本发明疫苗组合物。特别有用的小鼠模型包括先腹膜内免疫小鼠，然后腹膜内攻击或经鼻攻击的那些。
也可在体内确定本发明免疫原性组合物的功效，方法是用免疫原性组合物免疫动物模型(如豚鼠或小鼠)并确定GAS攻击后获得的保护水平。
体内效力模型包括但不限于：(i)采用人GAS血清型的小鼠感染模型；(ii)采用小鼠适应GAS菌株，如在小鼠中特别有毒性的M23菌株的小鼠患病模型；(iii)采用人GAS分离株的灵长动物模型。
免疫反应可以是TH1免疫反应和TH2免疫反应之一或两者。免疫反应可能是改善的或增强的或改变的免疫反应。免疫反应可以是全身和粘膜免疫反应之一或二者。优选的免疫反应是增强的全身和/或粘膜反应。
提高的全身和/或粘膜免疫表现为提高的TH1和/或TH2免疫反应。增强的免疫反应优选包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA产生增多。
粘膜免疫反应优选是TH2免疫反应。粘膜免疫反应优选包括IgA产生增多。
活化的TH2细胞提高抗体产量，因而在应对胞外感染时有价值。活化的TH2细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10中的一种或多种。TH2免疫反应可导致产生IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞，用于将来的保护作用。
TH2免疫反应可包括与TH2免疫反应相关的一种或多种细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)增加，或者IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞产量增加中的一种或多种现象。增强的Th2免疫反应优选包括IgG1产生增加。
TH1免疫反应可包括CTL中的一种或多种增加，与TH1免疫反应相关的细胞因子(例如IL-2、IFNγ和TNFβ)中一种或多种的增加，活化巨噬细胞的增加，NK活性增加，或IgG2a产量增加。增强的TH1免疫反应优选包括IgG2a产量的增加。
本发明的免疫原性组合物，具体说，含本发明一种或多种突变型SLO蛋白的免疫原性组合物可单独使用或与其它GAS抗原联用，任选与能引发Th1和/或Th2反应的免疫调节剂联用。
本发明还包括含有一种或多种免疫调节剂，如矿物盐(如铝盐)和含CpG基序的寡核苷酸的免疫原性组合物。最优选，该免疫原性组合物同时包含铝盐和含CpG基序的寡核苷酸。或者，该免疫原性组合物包含ADP核糖基化毒素(如脱毒的ADP核糖基化毒素)和含CpG基序的寡核苷酸。优选的一种或多种免疫调节剂包括佐剂。佐剂可选用TH1佐剂和TH2佐剂中的一种或多种。
本发明的组合物优选能引发细胞介导免疫反应和体液免疫反应二者，以有效应对GAS感染。这种免疫应答宜诱导产生长效(如中和性)抗体和在接触一种或多种GAS抗原后能快速反应的细胞介导免疫力。
在一特别优选的实施方式中，该免疫原性组合物包含能引发中和抗体反应的一种或多种突变型SLO蛋白，和能引发细胞介导免疫反应的一种或多种突变型SLO蛋白。以此方法，中和抗体能防止或抑制最初的GAS感染，而细胞介导免疫反应能引发增强的Th1细胞反应以防止GAS感染进一步扩散。
通常将本发明的组合物直接给予患者。可通过各种不同途径单独或作为组合物的一部分给予本发明组合物。某些途径对某些组合物可能更有利益，因为可产生更有效的免疫反应，优选CMI反应，或诱导副作用可能性较低，或较容易给药。
递送方法包括：胃肠外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙注射)和经直肠、口服(如药片、喷雾)、经阴道、局部、经皮(如参见WO99/27961)、透皮(如参见WO02/074244和WO02/064162)、鼻内(如参见WO03/028760)、眼部、耳部和肺部或其它粘膜途径给予。
例如，本发明的组合物可通过全身途径或粘膜途径或经皮途径给予，或可直接给予特定组织。本文所用的术语“全身给予”包括但不限于任何胃肠外途径给药。具体说，胃肠道外给药包括但不限于：皮下、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内或胸骨内注射，静脉内、动脉内或肾透析灌注技术。优选的全身性、胃肠外给药是肌肉内注射。本文所用的术语“粘膜给予”包括但不限于：口服、鼻内、阴道内、直肠内、气管内、肠和眼部给药。
治疗剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。初次免疫方案和/或加强免疫方案可采用多剂量。在多剂量方案中，通过相同或不同途径给予不同剂量，例如胃肠外初免和粘膜加强，粘膜初免和胃肠外加强，等等。
可将本发明组合物制成各种剂型。例如，可将组合物制成可注射的液体溶液或悬浮液。还可以制备适合在注射前用液体运载体配制成溶液或悬浮液的固体剂型(如冻干的组合物)。可制备口服给药的组合物，如片剂或胶囊、喷雾剂，或糖浆(任选加入调味剂)。可制备肺部给药的组合物，如吸入剂，采用细粉或喷雾剂。可将组合物制备成栓剂或阴道栓。可制备鼻部、耳部或眼部给药的组合物，例如滴剂。组合物可以是试剂盒形式，如此设计使得在给予患者之前可重建成合并的组合物。这种试剂盒装有液体形式的一种或多种突变型SLO和其它抗原及一种或多种冻干抗原。
用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的突变型SLO或其它抗原(或编码该抗原的核酸分子)，以及需要的其它组分，如抗生素。“免疫有效量”是以单剂量或一系列剂量的一部分给予个体时能增强可测定的免疫反应或防止或减少临床症状的用量。
本发明的免疫原性组合物可与抗生素治疗方案组合给予。在一实施方式中，给予抗生素然后给予本发明的抗原，或包含本发明的一种或多种突变型SLO蛋白的组合物。
在另一实施方式中，先给予本发明的突变型SLO蛋白然后给予抗生素。适合用于治疗GAS感染的抗生素包括但不限于：青霉素或其衍生物，或克林霉素、先锋霉素、糖肽类(如万古霉素)和环丝氨酸。
然而，该组合物中活性药物的含量可以不同，取决于所治疗个体的健康和生理状况、年龄、所治疗个体的物种分类(如非人灵长动物，灵长动物等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗制剂、治疗医师对医学状况的评估和其它相关的因素。此用量落在可通过常规试验确定的较广泛范围内。
试剂盒
本发明还提供装有本发明组合物的一个或多个容器的试剂盒。组合物可以是液体形式或冻干形式，可以是各个抗原。组合物的合适容器包括，例如瓶子，小药瓶，针筒和试管。可用各种材料，包括玻璃或塑料制备容器。容器可配备无菌的入口(例如，容器可以是装有皮下注射针头可刺破塞子的静脉内输液袋或小药瓶)。
该试剂盒也可装有包含药学上可接受的缓冲液，如磷酸缓冲盐水、林格液或葡萄糖液的第二容器。也可装有终末用户所用的其它物质，包括其它缓冲液、稀释液、过滤器、针头和针筒。该试剂盒还可装有含另一活性药物，如抗生素的第二或第三容器。
该试剂盒也可装有书面的包装插页，说明诱导抗酿脓链球菌免疫力或治疗酿脓链球菌感染的方法。该包装说明书可以是未经批准的草稿插页或可以是经食品药物管理局(FDA)或其它管理当局批准的包装插页。
本文引用的所有专利、专利申请和参考文献专门通过引用纳入本文。以上公开内容已总体上描述了本发明。参考以下具体实施例可获得更全面的理解，提供实施例的目的只是说明而非限制本发明的范围。
实施例1.
野生型和突变型SLO蛋白的克隆
用表1所示SF370基因组的引物通过PCR扩增野生型和突变型SLO蛋白的编码基因。
用NheI-XhoI消化PCR产物，再与用相同酶切割的pet24b+(诺瓦基公司(Novagen))载体连接。用连接反应转化大肠杆菌DH5α电感受态细胞。加入LBPTK培养基，以250rpm振荡在37℃培育1小时后将细菌铺放到含50μg/ml卡那霉素的LBPTK平板上。通过集落PCR鉴定阳性菌落。
在含50μg/ml卡那霉素的LBPTK培养基中培养一夜，从其中制备阳性菌落的质粒，并通过DNA测序分析，分析证实了在T7聚合酶启动子控制下的预期的插入基因。克隆基因的最终DNA序列和蛋白质序列显示在序列表中。参见表2。
表1.
表2.
用正确的构建物转化大肠杆菌BL21(DE3)诺瓦基公司(Novagen)电感受态细胞。加入LBPTK培养基，以250rpm振荡在37℃培育1小时后将细菌铺放到含50μg/ml卡那霉素的LBPTK平板上。BL21(DE3)pet24b+SLO野生型无标签细胞在25℃生长并用1mM IPTG诱导。通过SDS PAGE验证克隆表达(无标签，图8A和8B；带His标签，图9)。
实施例2.
带His标签的蛋白质的纯化
将大肠杆菌团粒悬浮于裂解缓冲液并室温混合30-40分钟。将裂解液30-40000xg离心20-25分钟，将上清液加载于用洗涤缓冲液A平衡的柱(Poly-Prep，含1ml Ni活化的螯合琼脂糖速流树脂(Ni-Activated ChelatingSepharose Fast Flow resin))。加载的树脂用洗涤缓冲液A洗涤三次，用洗涤缓冲液B洗涤三次。用洗脱缓冲液将蛋白质洗脱在含2mM终浓度DTT的离心管中。总洗脱蛋白质用Bradford试剂量化，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(图8和9)。
缓冲液
裂解缓冲液：
10ml B-PERTM(细菌蛋白质提取试剂(Bacterial-Protein ExtractionReagent)，皮尔斯公司(Pierce)，编号78266)
MgCl2终浓度0.1mM
DNAsi I(西格玛公司(Sigma)，编号D-4263)100单位
溶菌酶(西格玛公司，编号L-7651)终浓度1mg/ml
洗涤缓冲液A：50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 8,0
洗涤缓冲液B：20mM咪唑，50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 8.0
洗脱缓冲液：250mM咪唑，50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 8.0
实施例3.
无标签蛋白的纯化
制备裂解物
将约80-110g细菌培养物团粒悬浮于200-280ml B-PERTM试剂(皮尔斯公司)，加入6片COMPLETE蛋白酶抑制剂、10ml 0.2M EDTA pH 7.5(5mM终浓度)、10ml 100mg/ml溶菌酶溶液，8ml 10000K单位/ml DNA酶I溶液和1ml 50mM MgCl2溶液。将细菌悬浮液振荡60分钟直到获得均一悬浮液从而得到细菌裂解液。
然后13000rpm(25400xg)离心60分钟，上清液用0.22μm滤器过滤并用水稀释直到电导率达到1.8-1.9mS。将pH调整为8.0。通过Bradford法确定蛋白质浓度。
阴离子交换层析
将上述处理得到的裂解液的上清液部分加载于HP 50/10Q琼脂糖柱(约200ml)，该柱之前已经用30mM TRIS，pH 8.0平衡。收集流出液。收集含GAS25蛋白的流分并用10mM磷酸钠，pH 6.8透析。通过Bradford法确定蛋白质浓度。
缓冲液A：30mM TRIS，pH 8.0
缓冲液B：30mM TRIS，1M NaCl，pH 8.0
平衡和加载：0％B
梯度：0-25％B 5CV-25％B 2CV
洗涤：100％B 2CV+3CV
流速：20毫升/分钟
流分体积：14ml
羟基磷灰石层析
将之前获得的收集物加载到用10mM磷酸钠，pH 6.8平衡过的CHT20柱上。收集流出液。
缓冲液A：10M磷酸钠，pH 6.8
缓冲液B：500M磷酸钠，pH 6.8
洗涤：8CV
洗涤：30％B 6CV
梯度：30-100％B(10CV)
洗涤：100％B
流速：5毫升/分钟。
流分体积：5ml
在还原和非还原条件下将等分流分加载到12％Criterion凝胶上。收集含GAS25蛋白的流分并通过Bradford法确定蛋白质浓度。
凝胶过滤层析
用Amicon滤器浓缩收集物以使体积＜10ml。将浓缩材料加载到用至少3-4柱体积PBS平衡的HiLoad Superdex 20026/60上。
缓冲液：PBS
洗脱：等度洗脱
流速：2.5毫升/分钟。
流分体积：5ml
收集含GAS25蛋白的流分并通过Bradford法确定蛋白质浓度。还通过UV测量估算蛋白质浓度，吸光度0.1％(＝1g/l)1.119。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质纯度(图11)。
实施例4.
溶血试验
定量溶血试验方案
用PBS+0.5％BSA在U形底96孔板中制备毒素的连续稀释液。用PBS将1ml绵羊血洗涤三次(在3000x g离心)，并将血细胞悬浮于5ml PBS。在50μl各毒素稀释液中加入等体积悬浮液并在37℃培育30分钟。用2％曲通(Triton)水溶液得到100％溶血，并将+0.5％BSA用作阴性对照。平板然后在1,000x g离心5分钟，并将上清液小心转移到96孔平底板中。在540nm读取吸光度。
比较含有野生型SLO和SLO突变体P427L的大肠杆菌提取物
采用PCR从SF370M1基因组扩增SLO P427L编码基因并克隆入能够在大肠杆菌BL21DE3中表达带His标签的蛋白质的载体pET21b+。用表达类似量的野生型和突变型链球菌溶血素O蛋白的大肠杆菌可溶性提取物(见图5)进行溶血试验以比较两种抗原的溶胞特性。实验结果示于图2，该图证明，突变蛋白的毒性比野生型低至少100倍。
比较纯化的野生型SLO和SLO突变体P427L
按照带His标签的重组蛋白的标准纯化方法纯化SLO P427L突变体(图3)。用不同浓度的纯化野生型和突变型蛋白质重复溶血试验以证实溶胞活性的降低(图4)。
含有带His标签的和无标签的野生型SLO和SLO突变体P427L的大肠杆菌提取物的溶血活性
我们比较了用不带His标签(BL21DE3，诺瓦基公司，编号71382-pET24)的野生型重组SLO(rSLO)和不带His标签(BL21DE3，诺瓦基公司，编号71382-pET24)的P427L突变rSLO转化的大肠杆菌裂解物的溶血活性。用不带插入物的pET24转化的大肠杆菌BL21DE3(诺瓦基公司，编号71382)用作阴性对照。阳性对照为含2％曲通水溶液的低渗溶液。阴性对照为蛋白质稀释缓冲液(PBS，含0.5％BSA，pH 7.4)，
测量上清液在540nm的吸光度(A540nm)确定溶血作用。以50％最大A540nm的稀释度计算为滴度。
结果见表3、4和图6。这些数据证明，在相同条件下，突变体P427L的溶血能力比野生型SLO低1000倍。
表3.
大肠杆菌 CFU/ml
阴性对照 3.9x108
野生型rSLO(无标签) 1.2x109
P427L rSLO(无标签) 1.03x109
表4.
rSLO野生型(无标签) rSLO P427L无标签
滴度(OD＝50％溶血) 50,000 48
滴度Wt/P427L 1042
比较野生型SLO和各种SLO突变体
将野生型SLO的溶血活性与几种不同SLO突变体的溶血活性进行比较。结果示于下面的图13和表5。1溶血单位(HU)定义为获得用2％曲通处理血细胞所得最大裂解的50％所需的毒素量。
表5.
蛋白质 HU/mg HU/mg-SLO/突变体
rSLO WT 22760 1
C530G 620 37
W535F 160 146
W535F-D482N ＜＜20 ＞＞1000
P427L 约20 约1000
ala248 ＜＜20 ＞＞1000
阴性对照 ＜＜20 ＞＞1000
由于蛋白质纯度不同，用黑体表示的每毫克突变体的溶血单位是高出预计的；然而，显然的是，(1)突变体W535F的溶血低于突变体C530G；(2)突变体P427L的溶血比野生型低大约1000倍，并比其他两种突变体W535F和C530G低大约6-25倍；和(3)突变体ΔA248的溶血显然低于野生型。
胆固醇的作用
使细胞在30℃生长，并用1mM IPTG在25℃诱导，OD600nm约为0.4-0.6，之后用PBS-BSA 0.5％将大肠杆菌裂解物或含200mg/ml胆固醇的大肠杆菌裂解物连续稀释2-5倍，测定其溶血活性。50微升2％绵羊红细胞PBS溶液用等体积裂解细菌获得的蛋白质制品处理，诱导3小时后用裂解缓冲液(B-PER溶液-PIERCE-1mM MgCl2、100K单位/ml DNA酶(西格玛公司)和溶菌酶(西格玛公司)处理30-40分钟。然后将不溶性部分离心(15分钟，21000xg，4℃)，并将上清液(大肠杆菌裂解物)转移到含终浓度5mM DTT的新的离心管中。
在该条件下，在稀释因子达到100倍之前胆固醇不抑制野生型或突变型SLO；因此对突变体诱导的裂解没有影响。相反，野生型诱导的裂解大大降低。阴性对照诱导的裂解不受胆固醇影响，说明胆固醇诱导的抑制是特异性的。参见表6和图7。
表6.
rSLO野生型(无标签) rSLO P427L无标签
滴度(OD＝50％溶血) 400 40
滴度Wt/P427L 10
实施例5.
溶血的抑制
方案
在U形底96孔板中用PBS+0.5％BSA制备野生型或突变型SLO蛋白免疫(不含佐剂或含Alum或MF59TM作为佐剂)的小鼠的连续2倍稀释血清。仅用PBS或仅用佐剂适当免疫的小鼠血清用作阴性对照。加入等体积的用PBS+0.5％BSA配制的50-100ng/ml(3.5-7HU)毒素溶液，并在搅拌下将平板室温培育20分钟(800rpm)。培育后将50ml该溶液转移到新的96孔板，加入等体积绵羊红细胞悬液(用PBS洗涤三次)并在37℃培育30分钟。平板然后在1,000xg离心5分钟，并将上清液小心转移到96孔平底平板中，并在540nm阅读吸光度。在下述结果中，抑制滴度表示为使曲通诱导的溶血作用降低50％的血清稀释度。
野生型SLO抗血清对SLO溶血作用的抑制
抗野生型SLO抗血清对SLO溶血作用的抑制显示于图14、图15、图16和表7-9。抗SLO血清的滴度介于1/7,000和1/14,000之间(算术平均值，1/12,167±2,714)。阴性对照血清(弗氏佐剂)的滴度介于1/375和1/4,000之间(算术平均值，1/1,854±1,384)。
表7(显示于图15)。
表8.
表9(显示于图16)
ng/ml SLO ％溶血
1.6 4
3.1 3
6.3 6
12.5 30
25 94
50 100
100 100
200 100
野生型SLO、化学去毒的野生型SLO和SLO突变体的溶血活性的滴定
野生型SLO、化学去毒的野生型SLO和SLO突变体(P427L；P427L+W535F)的溶血活性的滴定显示于图17-19以及表10。
表10(显示于图18)。
蛋白质 HU/mg HU/mg-SLO/突变体
SLO野生型 无标签 728,307 1
SLO P427L 无标签 711 1,024
SLO P427L+W535F 无标签 ＜22(刺激10) ＞33.000
SLO野生型 无标签 45,511
SLO野生型 无标签，去毒 ＜＜89 ＞＞511
突变型SLO蛋白抗血清对SLO溶血作用的抑制
突变型SLO蛋白抗血清对SLO溶血作用的抑制显示于图20-22以及表11-13。使用50ng/ml(3.5HU)毒素，使SLO突变体W535-P427L的SLO溶血活性降低50％所需的血清稀释度分别为，使用明矾佐剂为1/17,860，使用MF59TM佐剂为1/7991。阴性对照(仅佐剂)的滴度为1/1,000(Alum)和1/125(MF59TM)。
表11(显示于图20)。
表12(显示于图21)
表13(显示于图22)
ng/ml SLO ％溶血
1.6 3.5
3.1 5.8
6.3 13
12.5 42
25 86
50 100
100 100
200 100
都采用明矾佐剂，使野生型和SLO突变体W535-P427L的SLO溶血活性降低50％所需的血清稀释度的比较显示于图25。使用100ng/ml(7HU)毒素，使SLO突变体W535-P427L的SLO溶血活性降低50％所需的血清稀释度分别为1/12000，对比的血清稀释度为1/8750+/-1500。阴性对照(仅佐剂)的稀释度约为1/50。
实施例6.
体内保护实验
给40只小鼠腹膜内施用纯化的SLO P427L蛋白和弗氏佐剂。然后用3348M1 GAS毒株鼻内攻击小鼠。表14报道了三次独立实验的数据，显示所有实验都始终获得100％保护。
表14.小鼠的感染存活率
在第0、21和35天用20μg重组蛋白免疫每组10-20只小鼠。阴性对照组的小鼠仅用GST或用大肠杆菌污染物免疫，这取决于所用GAS重组蛋白的形式。第三次免疫两周后取血样。之前数天用108cfu(50μl)M1 3348GAS毒株攻击免疫的小鼠。监测小鼠存活情况10-14天。检测从不同组获得的免疫血清对完整SLO重组蛋白的免疫原性(蛋白质印迹分析)。结果列于表15和表16。
表15.
蛋白质 小鼠数 存活％ 阴性对照存活％
GAS25_Pro247Leu His 10 90 30
GAS25_Pro247Leu His 10 100 20
GAS25_Pro247Leu His 10 80 30
GAS25_WT 20 95 15
GAS25_WT 10 100 40
表16.
蛋白质 小鼠数 存活％ 阴性对照存活％
rSLO WT带有his标签 20 100 45
C530G带有his标签 20 100 45
W535F带有his标签 20 100 45
W535F-D482N带有his标签 20 100 45
P427L带有his标签 20 95 45
Δala248带有his标签 20 100 45
SLO突变体P427L-W535F对GAS M1毒株鼻内攻击的保护
用SLO突变体P427L-W535F(有明矾或MF59作为佐剂)腹膜内免疫30只小鼠，并用GAS M1毒株鼻内攻击。结果见图26。用SLO突变体P427L-W535F和明矾免疫的小鼠对GAS M1毒株鼻内攻击的保护作用为77％，相比之下阴性对照小鼠(仅用佐剂免疫)为3％。用SLO突变体P427L-W535F和MF59免疫的小鼠对GAS M1毒株鼻内攻击的保护作用为90％，相比之下阴性对照小鼠(仅用佐剂免疫)为10％。这些保护水平与用野生型SLO免疫的小鼠的保护水平相当。
实施例7.
方案
静脉注射SLO.将野生型或突变型SLO的PBS溶液稀释于PBS+2mMDTT溶液，然后取100μl注射入小鼠的尾静脉。观察小鼠2-3天。注射野生型SLO通常导致在数分钟内死亡。
体内致死率抑制实验.对于免疫血清介导的致死率抑制作用，将10μg/小鼠野生型SLO(100μg/ml，PBS溶液，2mM DTT)与抗SLO血清或对照血清(从仅用佐剂免疫的小鼠获得)室温旋转培育20分钟。培育后通过尾静脉静脉内注射将样品接种到小鼠体内。观察小鼠2-3天。
野生型SLO和突变型SLO P427L-W535F的结果示于表17。
表17.
用剂量为10μg/小鼠的野生型SLO作为阳性对照，以仅注射弗氏佐剂的作为阴性对照，评价急性体内毒性。将10μg/小鼠野生型SLO与野生型SLO抗血清或与对照血清一起培育并如上所述接种到小鼠体内。结果见表18。
表18.
如上所述进行的另一组实验的结果示于表19和20。用5或10μg/小鼠野生型SLO评价体内急性毒性。具体地说，将10μg/小鼠野生型SLO与从GAS25P427L-W535F免疫小鼠获得的血清或仅PBS(无血清)一起预培育。此外，将5μg/小鼠野生型SLO与从GAS25 P427L-W535F免疫小鼠获得的血清或从PBS+佐剂(明矾)免疫小鼠获得的血清(作为阴性对照血清)一起预培育。
这些结果证明，野生型SLO的致死剂量被抗-SLO P427L-W535F血清中和，但相同稀释度的阴性对照血清无此效果。
表19.
表20.
实施例8.
用SLO P427L-W535F免疫使小鼠能抵抗静脉内注射野生型SLO
用使用明矾作为佐剂的野生型SLO或SLO突变体P427L-W535F(用2mg/ml氢氧化铝调配20μg蛋白)腹膜内免疫5周龄小鼠三次(第0天、第21天和第35天)。仅用佐剂免疫的小鼠作为阴性对照。在第55天给小鼠静脉内注射不同浓度的用PBS，2mM DTT配制的野生型SLO溶液并监测至少72小鼠。结果见表21。
表21.
5μg/小鼠的野生型SLO对于仅用佐剂免疫的小鼠是致死的；这些小鼠在注射SLO后数分钟内死亡。然而，即便20μg/小鼠的相同的野生型SLO制品也不会杀死用野生型SLO或用P427L-W535F SLO突变体免疫的小鼠。

Claims (22)

1.一种纯化的突变型链球菌溶血素O（SLO）蛋白，其在P427和W535位置包含氨基酸取代，其中所述P427位置的取代为P427L、P427G、P427K和P427E中任一种，其中所述W535位置的取代为W535F，其中所述氨基酸的位置按SEQ ID NO:1编号，且其中所述突变型SLO蛋白的溶血活性相比野生型SLO降低至少50%。
2.如权利要求1所述的纯化的突变型SLO蛋白，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。
3.如权利要求1所述的纯化的突变型SLO蛋白，其特征在于，该蛋白偶联于载体蛋白。
4.如权利要求3所述的纯化的突变型SLO蛋白，其特征在于，所述载体蛋白选自：细菌毒素、细菌类毒素、脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白、热激蛋白、百日咳蛋白、流感嗜血杆菌蛋白D、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B和铁摄取蛋白。
5.编码权利要求1或2所述的突变型SLO蛋白的核酸分子。
6.如权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，该分子包含选自SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:33所示编码序列的核苷酸序列。
7.一种疫苗组合物，其包含：
(a)选自以下的活性剂:
(i)权利要求1或2中定义的纯化的突变型链球菌溶血素O（SLO）蛋白；和
(ii)编码权利要求1或2中定义的纯化的突变型链球菌溶血素O（SLO）蛋白的核酸分子；和
(b)药学上可接受的运载体。
8.如权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，该组合物还包含一种或多种选自下组的活性剂：
(a)GAS抗原；和
(b)编码GAS抗原的核酸分子。
9.如权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，该组合物还包含儿童疫苗所用的活性剂。
10.如权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述活性剂选自：
(a)选自以下的病原体的多肽抗原：脑膜炎奈瑟球菌、肺炎链球菌、百日咳博德特菌、粘膜炎莫拉菌、破伤风梭菌、白喉棒状杆菌、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒和轮状病毒多肽抗原；和
(b)编码所述多肽抗原的核酸分子。
11.如权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，该组合物还包含用于老年人或免疫力低下个体疫苗的第二种活性剂。
12.如权利要求11所述的疫苗组合物，其特征在于，所述第二种活性剂选自下组：
(a)选自以下的病原体的多肽抗原：粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团病杆菌、单核细胞增多症李斯特菌、流感病毒和副流感病毒多肽抗原；和
(b)编码所述多肽抗原的核酸分子。
13.有效量的疫苗组合物在制备治疗或预防酿脓链球菌感染的药物中的应用，该疫苗组合物包含：
(a)选自以下的活性剂:
(i)权利要求1或2中定义的纯化的突变型链球菌溶血素O（SLO）蛋白；和
(ii)编码权利要求1或2中定义的纯化的突变型链球菌溶血素O（SLO）蛋白的核酸分子；和
(b)药学上可接受的运载体。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述疫苗组合物还包含一种或多种选自下组的活性剂：
(a)GAS抗原；和
(b)编码GAS抗原的核酸分子。
15.一种试剂盒，其包括：
(a)含有如权利要求7-12中任一项所述疫苗组合物的容器；和
(b)用所述组合物治疗或预防酿脓链球菌感染的说明书。
16.一种制备预防或治疗酿脓链球菌感染的疫苗的方法，所述方法包括混合：
(a)选自以下的活性剂:
(i)权利要求1或2中定义的纯化的突变型链球菌溶血素O（SLO）蛋白；和
(ii)编码权利要求1或2中定义的纯化的突变型链球菌溶血素O（SLO）蛋白的核酸分子；和
(b)药学上可接受的运载体。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述活性剂是纯化的突变型SLO蛋白，所述突变型SLO蛋白通过以下方法制备，该方法包括：
(a)培养含编码所述突变型SLO蛋白的表达构建物的宿主细胞；和
(b)回收突变型SLO蛋白。
18.如权利要求16所述的方法，还包括将药学上可接受的运载体与一种或多种选自下组的活性剂组合：
(a)GAS抗原；和
(b)编码GAS抗原的核酸分子。
19.活性剂在制造治疗或预防酿脓链球菌感染的药物中的应用，所述活性剂选自：
（a）权利要求1或2中定义的纯化的突变型链球菌溶血素O（SLO）蛋白；和
(b)编码权利要求1或2中定义的纯化的突变型链球菌溶血素O（SLO）蛋白的核酸分子。
20.如权利要求1-4中任一项所述的纯化的突变型SLO蛋白或如权利要求5-6中任一项所述的核酸分子在制备作为疫苗的药物中的应用。
21.如权利要求1-4中任一项所述的纯化的突变型SLO蛋白、如权利要求5-6中任一项所述的核酸分子、或如权利要求8-12中任一项所述的疫苗组合物在制备治疗或预防酿脓链球菌感染的药物中的应用。
22.如权利要求1-4中任一项所述的纯化的突变型SLO蛋白或如权利要求8-12中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述突变型SLO蛋白还包括以下一种或多种：
(a)C530取代为甘氨酸；
(b)缺失A248；和/或
(c)D482取代为天冬酰胺。
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