BRPI0821240B1 - Formas mutantes de estreptolisina o - Google Patents

Abstract

formas mutantes de estreptolisina o. formas de gas25 (estreptolisina o) que não são tóxicas, mas que ainda mantêm a habilidade para induzir proteção contra s. pyogenes são úteis em composições de vacina para indução de proteção contra s. pyogenes.

Description

FORMAS MUTANTES DE ESTREPTOLISINA O

Este pedido reivindica o benefício de US 61/016193 depositada em 21 de dezembro de 2007 e US 61/088381 depositada em 13 de agosto de 2008, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção está relacionada aos campos da imunologia e vacinologia.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A estreptolisina O (SLO; GAS25) é um dos fatores de virulência mais importantes do patógeno humano Streptococcus pyogenes (GAS) . Por causa de sua capacidade para provocar uma resposta imune precoce e forte em seres humanos, ela é usada rotineiramente como um marcador diagnóstico de infecção por GAS.

SLO pertence à família das citolisinas ativadas por tiol altamente homólogas (TACYs), que exercem sua atividade citolítica por meio da interação com colesterol na membrana celular, auto-oligomerização, e formação de poros. Além disso, sua capacidade para ativar diretamente a via clássica do complemento por ligação à região Fc de IgG humana pode resultar em ataque direto mediado por complemento sobre as células hospedeiras. TACYs também podem interferir com a defesa do hospedeiro e com a função das células imunológicas por meio da indução de citocinas e mediadores inflamatórios.

Algumas TACYs podem proteger passiva e ativamente animais de laboratório. Veja FEMS Lett.182, 197-205, 2000. No entanto, o uso dessas toxinas como candidatos a vacina tem sido dificultado por seu padrão complexo de efeitos colaterais danosos. Há, portanto, uma necessidade na técnica de proteínas de SLO que não sejam tóxicas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

FIG. 1. Modelo computacional tridimensional de SLO. Prolinas estão representadas como espaços preenchidos. Pro427 está colorida de branco.

FIG. 2. Gráfico que mostra os resultados de ensaio hemolítico usando extratos de E. coli que contêm SLO do tipo selvagem e mutante de SLO P427L.

FIG. 3. Microfotografia de gel de SDS-poliacrilamida que mostra mutante de SLO P427L purificada.

FIG. 4. Gráfico que mostra os resultados de ensaio hemolítico usando SLO do tipo selvagem purificada e mutante de SLO P427L.

FIG. 5. Microfotografia de gel de SDS-poliacrilamida de sobrenadantes de lisado de E. coli. Raia A, controle negativo de E. coli; Raia B, rSLO do tipo selvagem, sem tag; Raia C, rSLO P427L, sem tag; e Raia D, rSLO do tipo selvagem purificada, sem tag (5 mg).

FIG. 6. Gráfico que demonstra que, sob as mesmas condições, mutante de SLO P427L é 1.000 vezes menos hemolítica do que SLO do tipo selvagem.

FIG. 7. Gráfico que demonstra os efeitos do colesterol sobre a hemólise por SLO do tipo selvagem e mutante de SLO P427L.

FIG. 8. Microfotografias de análise por SDS-PAGE de proteínas totais sem tag em extratos celulares. FIG. 8A, expressão de proteínas de SLO do tipo selvagem e P427L sem tag; FIG. 8B, expressão de proteínas sem tag SLO P427L + W535, P427L + C530G e P427L + C530G + W535F.

FIG. 9. Microfotografia de análise por SDS-PAGE de proteínas totais com tag de His em extratos celulares.

FIG. 10. Microfotografia de análise por SDS-PAGE de proteínas purificadas com tag de His.

FIG. 11. Microfotografias de análise por SDS-PAGE de proteínas purificadas sem tag. FIG. 11A, Raias: A, SLO do tipo selvagem sem tag; B, SLO P427L sem tag; marcadores de peso molecular (116-66,2-45-35-25-18,4-14,4); seta negra indica proteína de SLO purificada de clones mutantes e do tipo selvagem. FIG. 11B, Raia A, SLO do tipo selvagem sem tag (3 |ig) , Raia B, SLO P427L-W535F sem tag (3 p,g) ; marcadores de peso molecular (116-66,2-45-35-25-18,4- 14.4); seta negra indica proteína de SLO purificada de clones mutantes e do tipo selvagem.

FIG. 12. Microfotografia de análise por SDS-PAGE de proteína de SLO do tipo selvagem purificada sem tag. Amostras de diferentes lotes de purificação de SLO do tipo selvagem foram analisadas sob condições redutoras e não redutoras.

FIG. 13. Gráfico que mostra os resultados de testes de hemólise de mutantes de SLO com tag de His.

FIG. 14. Gráfico que mostra inibição da atividade hemolítica induzida por SLO por antissoro anti-SLO.

FIG. 15. Gráfico que mostra a titulação de inibição por antissoro anti-SLO da hemólise por SLO.

FIG. 16. Gráfico que mostra a titulação da atividade hemolítica de SLO.

FIG. 17. Gráfico que mostra a titulação da atividade hemolítica de SLO do tipo selvagem, SLO do tipo selvagem quimicamente detoxificada e mutantes de SLO (P427L; P427L + W535F).

FIG. 18. Gráfico que mostra titulação da atividade hemolítica de SLO do tipo selvagem e de mutantes de SLO (P427L; P427L + W535F).

FIG. 19. Gráfico que mostra a titulação da atividade hemolítica de SLO do tipo selvagem e SLO do tipo selvagem quimicamente detoxifiçada.

FIG. 20. Gráfico que mostra a diluição de antissoro contra mutante de SLO P427L + W535F necessária para obter 50% de redução da atividade hemolítica de SLO (50 ng/ml de SLO) .

FIG. 21. Gráfico que mostra a diluição de antissoro contra mutante de SLO P427L + W535F necessária para obter 50% de redução da atividade hemolítica de SLO (100 ng/ml de SLO) .

FIG. 22. Curva de titulação que mostra que foram feitos ensaios de inibição de hemólise com concentrações de toxina que permitem 100% de hemólise.

FIG. 23. Alinhamento de proteínas de SLO. Ml_SF370, ID. DE SEQ. N° : 1; M12_2096, ID. DE SEQ. N° : 2; M12_9429, ID. DE SEQ. N° : 3; Ml_5005, ID. DE SEQ. N° : 4; M2, ID. DE SEQ. N°: 5; M28, ID. DE SEQ. N°: 6; M6, ID. DE SEQ. N°: 7; M18, ID. DE SEQ. N° : 8; M5, ID. DE SEQ. N° : 9; M3, ID. DE SEQ. N° : 10; M3_SSI, ID. DE SEQ. N°: 11; e M4, ID. DE SEQ. N° : 12.

FIG. 24. Alinhamento de SLO do tipo selvagem e mutantes de SLO com tag de His. SLO_MlstrainSF370, ID. DE SEQ. N°: 13; SLO WT_histagged, ID. DE SEQ. N°: 14; SLOmut.P427L_histagged, ID. DE SEQ. N°: 15; SLOmut.C530G_histagged, ID. DE SEQ. N° : 16; SLOmut .DeltaA248_histagged, ID. DE SEQ. N° : 17; SLOmut. W535F__histagged, ID. DE SEQ. N° : 18; e SLOmutW535F&D482N_histagged, ID. DE SEQ. N°: 19.

FIG. 25. Gráfico que compara a redução da atividade hemolitica de SLO por antissoro contra SLO do tipo selvagem e antissoro contra mutante de SLO P427L + W535F.

FIG. 26. Gráfico que mostra propriedades protetoras in vivo de mutante de SLO recombinante P427L + W535F usando alume ou MF59 como um adjuvante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção fornece mutantes de estreptolisina O (SLO; GAS25) que são atóxicas, mas que ainda mantêm a habilidade para induzir proteção contra S. pyogenes.As formas mutantes de SLO são úteis, inter alfa, em composições de vacina, para induzir proteção contra S. pyogenes.

Proteínas de SLO mutantes

As formas mutantes de SLO de acordo com a invenção possuem pelo menos 50% menos atividade hemolitica do que SLO do tipo selvagem (por exemplo, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%) em relação à SLO do tipo selvagem, como determinado por um ensaio hemolítico, mas são imunogênicas; por exemplo, elas conferem proteção contra ataque letal de GAS em um modelo em camundongo (por exemplo, veja o Exemplo 7). Os mutantes de SLO da invenção incluem mutantes de SLO P427L (ID. DE SEQ. N° : 20), W535F (ID. DE SEQ. N° : 21), C530G (ID. DE SEQ. N° : 22), AA248 (ID. DE SEQ. N° : 23), W535F + D482N (ID. DE SEQ. N° : 24), P427L + W535F (ID. DE SEQ. N° : 25), P427L + C530G (ID. DE SEQ. N°: 26) e P427L + C530G + W535F (ID. DE SEQ. N° : 27). A invenção também inclui versões com tag de His desses mutantes. Exemplos são mostrados na FIG. 24.

Os mutantes de SLO da invenção incluem aqueles com uma alteração de aminoácido (ou seja, uma substituição, deleção ou inserção) em um ou mais de aminoácidos P427, W535, C530, A248 e D482, numerados de acordo com a seqüência de SLO do tipo selvagem mostrada no ID. DE SEQ. N° : 1. A FIG. 23 fornece um alinhamento de seqüências de GAS25 do tipo selvagem de diferentes tipos M.

Os mutantes de SLO da invenção incluem alterações de aminoácidos únicas, duplas ou triplas ("mutantes únicos", "mutantes duplos", "mutantes triplos") nas posições P427, W535, C530, A248 e/ou D482. Dessa forma, os mutantes de SLO podem compreender os seguintes: i. P427L (ID. DE SEQ. N° : 20), P427R, P427N, P427C, P427Q, P427E, P427G, P427H, P4271, P427L, P427K, P427M, P427F, P427A, P427S, P427T, P427W, P427Y ou P427V; Ü. W535F (ID. DE SEQ. N° : 21), W535R, W535N, W535D, W535C, W535Q, W535E, W535G, W535I, W535L, W535K, W535M, W535A, W535P, W535S, W535T, W535Y ou W535V; iii. C530G (ID. DE SEQ. N° : 22), C530R, C530N, C530D, C530S, C530Q, C530E, C530A, C530H, C5301, C530L, C530K, C530M, C530F, C530P, C530T, C530W, C530Y ou C530V; iv. D482L, D482R, D482N, D482C, D482Q, D482E, D482G, D482H, D482I, D482L, D482K, D482M, D482F, D482A, D482S, D482T, D482W, D482Y ou D482V; V. A248L, A248R, A248N, A248C, A248Q, A248E, A248G, A248H, A248I, A248L, A248K, A248M, A248F, A248S, A248T, A248W, A248Y OU A248V; vi. ΔP427; ou ΔW535; ou ΔC530; ou ΔD482; ou ΔA248 (ID. DE SEQ. N° : 23); e vii. Combinações destes, por exemplo, W535F + D482N (ID. DE SEQ. N° : 24), P427L + W535F (ID. DE SEQ. N° : 25), P427L + C530G (ID. DE SEQ. N°: 26) e P427L + C530G + W535F (ID. DE SEQ. N°: 27).

Os mutantes duplos da invenção incluem P427L + W535F (ID. DE SEQ. N° : 25), P427L + C530G (ID. DE SEQ. N° : 26), P427L + A248L, P427L + D482L, W535F + C530G, W535F + A248L, W535F + D482L, C530G + A248L, e A248L + D482L. Os mutantes triplos incluem P427L + C530G + A248L, P427L + C530G + D482L, P427L + A248L D482L, P427L + C530G + W535F (ID. DE SEQ. N°: 27), W535F + C530G + A248L, W535F + C530G + D482L, W535F + A248L + D482L, e C530G + A248L + D482L.

As proteínas mutantes de SLO da invenção também incluem polipeptídeos de fusão que compreendem uma proteína de SLO mutante, como revelada acima, e outro antígeno de GAS. Antígenos de GAS são revelados, por exemplo, em WO 02/34771, e incluem, sem limitação, GAS39 (spy0266; gi- 15674446), GAS40 (spy0269; gi-15674449), GAS42 (spy0287; gi-15674461), GAS45 (M5005_spy0249; gi-71910063), GAS57 (spy0416; gi-15674549), GAS58 (spy0430; gi-15674556), GAS84 (spyl274; gi-15675229), GAS95 (sptl733; gi-15675582), GAS117 (spy0448; gi-15674571), GAS130 (spy0591; gi- 15674677), GAS137 (spy0652; gi-il5674720) , GAS159 (spyll05; gi-15675088), GAS193 (spy2025; gi-15675802), GAS202 (spyl309; gi-15675258) , GAS217 (spy0925; gi-15674945) , GAS236 (spyll26; gi-15675106), GAS253 (spyl524; gi- 15675423), GAS277 (spyl939; gi-15675742), GAS294 (spyll73; gi-15675145), GAS309 (spy0124; gi-15674341), GAS366 (spyl525; gi-15675424), GAS372 (spyl625; gi-15675501), GAS384 (spyl874; gi-15675693), GAS389 (spyl981; gi- 15675772), GAS504 (spyl751; gi-15675600) , GAS509 (spyl618; gi-15675496), GAS290 (spyl959; gi-15675757), GAS511 (spyl743; gi-15675592), GAS527 (spyl204; gi-15675169), GAS529 (spyl280; gi-15675233), e GAS533 (spyl877; gi- 15675696). Further antigenos de GAS incluem, sem limitação, GAS68 (Spy0163; gil3621456), GAS84 (Spyl274; gil3622398), GAS88 (Spyl361; gil3622470), GAS89 (Spyl390; gil3622493), GAS98 (Spyl882; gil3622916), GAS99 (Spyl979; gil3622993), GAS102 (Spy2016, gil3623025), GAS146 (Spy0763; gil3621942), GAS195 (Spy2043; gil3623043), GAS561 (Spyll34; gil3622269), GAS179 (Spyl718, gil3622773) eGAS681 (spyll52; gil362228).

Moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas de SLO mutantes

A invenção inclui moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas de SLO mutantes. A invenção também inclui moléculas de ácido nucléico que compreendem seqüências de nucleotídeos que possuem pelo menos 50% de identidade de seqüência para essas moléculas. Dependendo da seqüência em particular, o grau de identidade de seqüência é preferivelmente maior do que 50% (por exemplo, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais). A identidade entre seqüências de nucleotídeos é determinada preferivelmente pelo algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman, como implementado no programa MPSRCH (Oxford Molecular), usando uma pesquisa de lacunas afins com os parâmetros: penalidade de lacuna (gap) aberta = 12 e penalidade de extensão de lacuna = 1.

A invenção também fornece moléculas de ácido nucléico que podem hibridizar para essas moléculas. As reações de hibridização podem ser realizadas sob condições de diferentes "rigores". Condições que aumentam o rigor de uma reação de hibridização são amplamente conhecidas e publicadas na técnica. Veja, por exemplo, página 7.52 de Sambrook e cols., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989. Exemplos de condições relevantes incluem (em ordem de rigor crescente): temperaturas de incubação de 25°C, 37°C, 50°C, 55°C e 68°C; concentrações de tampão de 10X SSC, 6X SSC, IX SSC e O,1X SSC (em que SSC é 0,15 M de NaCI e 15 mM de tampão citrato) e seus equivalentes usando outros sistemas de tampão; concentrações de formamida de 0%, 25%, 50% e 75%; tempos de incubação de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 ou mais etapas de lavagem; tempos de incubação de lavagem de 1, 2 ou 15 minutos; e soluções de lavagem de 6X SSC, IX SSC, 0,lX SSC ou água deionizada. Técnicas de hibridização e sua otimização são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook, 1989; Ausubel e cols.,eds., "Short Protocols in Molecular Biology", 4a Edição, 1999; Patente U.S. 5.707.829; Ausubel e cols.,eds., "Current Protocols in Molecular Biology", Suplemento 30, 1987.

Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucléico da invenção hibridizam para um alvo sob condições de baixo rigor; em outras modalidades, as moléculas de ácido nucléico da invenção hibridizam sob condições de rigor intermediário; em modalidades preferidas, as moléculas de ácido nucléico da invenção hibridizam sob condições de rigor elevado. Um exemplo de uma condição de hibridização de baixo rigor é 50°C e 10X SSC. Um exemplo de uma condição de hibridização de rigor intermediário é 55°C e IX SSC. Um exemplo de uma condição de hibridização de rigor elevado é 68°C e 0,lX SSC.

Produção de proteínas de SLO mutantes Produção recombinante

A redundância do código genético é bem conhecida. Dessa forma, qualquer molécula de ácido nucléico (polinucleotídeo) que codifica a proteína de SLO do tipo selvagem ou um mutante de SLO proteína da invenção pode ser usada para produzir aquela proteína recombinantemente. Exemplos de seqüências de nucleotídeos que codificam SLO do tipo selvagem, mutante de SLO P427L, W535F, C530G, AA248, W535F + D482N, P427L + W535F, P427L + C530G, e P427L + C530G + W535F são fornecidos na listagem de seqüências (veja também IDS. DE SEQ. Nos: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 e 36, respectivamente). Moléculas de ácido nucléico que codificam SLO do tipo selvagem também podem ser isoladas da bactéria S. pyogenesapropriada usando técnicas padronizadas de purificação de ácido nucléico, ou podem ser sintetizadas usando uma técnica de amplificação como, por exemplo, a reação em cadeia de polimerase (PCR) ou pela utilização de um sintetizador automático. Veja Caruthers e cols., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, 1980; Horn e cols. Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980; Hunkapiller e cols., Nature 310, 105-11, 1984; Grantham e cols., Nucleic Acids Res. 9, r43-r74, 1981.

As moléculas de cDNA podem ser feitas com técnicas padronizadas de biologia molecular, usando mRNA como modelo. As moléculas de cDNA podem posteriormente ser replicadas com o uso de metodologias de biologia molecular bem conhecidas na técnica. Uma técnica de amplificação como, por exemplo, PCR, pode ser usada para se obter cópias adicionais de polinucleotídeos da invenção, usando DNA genômico ou cDNA como modelo.

Se desejado, os polinucleotídeos podem ser criados geneticamente com o uso de métodos geralmente conhecidos na técnica para alterar as seqüências codificadoras de antígeno por diversas razões, incluindo, sem limitação, alterações que modificam a clonagem, processamento e/ou expressão do polipeptídeo ou produto de mRNA. 0 embaralhamento de DNA (shuffling)por fragmentação aleatória e remontagem por PCR de fragmentos gênicos e oligonucleotídeos sintéticos pode ser usado para criar geneticamente as seqüências de nucleotídeos. Por exemplo, mutagênese sítio-dirigida pode ser usada para inserir novos sítios de restrição, alterar padrões de glicosilação, alterar a preferência de códon, produzir variantes por splice,introduzir mutações, e assim por diante.

Modificações de seqüências, por exemplo, a adição de uma seqüência de purificação de tagou otimização de códon, podem ser usadas para facilitar a expressão. Por exemplo, a seqüência-líder do terminal N pode ser substituída com uma seqüência que codifica uma proteína tagcomo, por exemplo, polihistidina ("HIS") ou glutationa S-transferase ("GST"). Essas proteínas tag podem ser usadas para facilitar a purificação, detecção e estabilidade da proteína expressa. Os códons preferidos por um hospedeiro procariótico ou eucariótico em particular podem ser selecionados para aumentar a taxa de expressão de proteína ou para produzir um transcrito de RNA que possui propriedades desejáveis, por exemplo, uma meia-vida que seja mais longa do que aquela de um transcrito gerado pela seqüência de ocorrência natural. Esses métodos são bem conhecidos na técnica e são ainda descritos em WO 05/032582.

Vetores de expressão

Uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína de SLO mutante pode ser inserida em um vetor de expressão que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da seqüência codificadora inserida. Métodos que são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica podem ser usados para a construção de vetores de expressão que contêm seqüências codificadoras e elementos apropriados de controle da transcrição e tradução. Esses métodos incluem técnicas in vitrode DNA recombinante, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo.

Células hospedeiras

As células hospedeiras para a produção de proteínas de SLO mutantes podem ser procarióticas ou eucarióticas. E. coli é uma célula hospedeira preferida, mas outros hospedeiros adequados incluem Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria(por exemplo, M. tuberculosis), leveduras, baculovírus, células mamíferas etc.

Uma cepa da célula hospedeira pode ser escolhida por sua habilidade para modular a expressão das seqüências inseridas ou para processar o polipeptídeo expresso da forma desejada. Essas modificações do polipeptídeo incluem, sem limitação, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. 0 processamento pós- tradução que cliva uma forma "pré-pró" do polipeptídeo também pode ser usado para facilitar a inserção, dobragem e/ou função corretas. Diferentes células hospedeiras que possuem maquinário celular e mecanismos característicos específicos para atividades pós-tradução estão disponíveis pela "American Type Culture Collection"(ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) e podem ser escolhidas para assegurar a modificação e o processamento corretos de uma proteína estranha. Veja WO 01/98340.

Construções de expressão podem ser introduzidas em células hospedeiras usando técnicas bem estabelecidas que incluem, sem limitação, transferência de DNA mediada por transferrina-policãtion, transfecção com ácidos nucléicos desnudos ou encapsulados, fusão celular mediada por lipossomo, transporte intracelular de glóbulos de látex revestidos com DNA, fusão de protoplasto, infecção viral, eletroporação, métodos "arma gênica" e transfecção mediada por DEAE ou fosfato de cálcio.

Células hospedeiras transformadas com vetores de expressão podem ser cultivadas sob condições adequadas à expressão e recuperação da proteína da cultura de células. A proteína produzida por uma célula transformada pode ser secretada ou contida intracelularmente, dependendo da seqüência de nucleotídeos e/ou do vetor de expressão usado. Aqueles habilitados na técnica compreenderão que vetores de expressão podem ser projetados para conter seqüências sinalizadoras que dirigem a secreção de antígenos solúveis através da membrana de uma célula procariótica ou eucariótica.

Purificação

Seqüências exportadoras de sinal podem ser incluídas em uma proteína de SLO mutante produzida recombinantemente de forma que o antígeno possa ser purificado do meio da cultura de células usando métodos conhecidos. Alternativamente, proteínas de SLO mutantes produzidas recombinantemente da invenção podem ser isoladas de células hospedeiras criadas geneticamente e separadas de outros componentes na célula, por exemplo, proteínas, carboidratos ou lipídeos, com o uso de métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, sem limitação, cromatografia por exclusão de tamanho, fracionamento com sulfato de amónio, cromatografia por troca iônica, cromatografia por afinidade e eletroforese preparativa em gel. Uma preparação de proteínas de SLO mutantes purificadas é pelo menos 80% pura; preferivelmente, as preparações são 90%, 95% ou 99% puras. A pureza das preparações pode ser avaliada por qualquer meio conhecido na técnica, por exemplo, eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Quando adequado, as proteínas de SLO mutantes podem ser solubilizadas, por exemplo, com uréia.

Síntese química

As proteínas de SLO mutantes podem ser sintetizadas, por exemplo, com o uso de técnicas de fase sólida. Veja, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2.149 54, 1963; Roberge e cols., Science 269, 202-04, 1995. A síntese de proteína pode ser realizada com o uso de técnicas manuais ou por automação. A síntese automatizada pode ser obtida, por exemplo, com o uso do Sintetizador de Peptídeos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Opcionalmente, fragmentos de uma proteína de SLO mutante podem ser sintetizados separadamente e combinados com a utilização de métodos químicos para produzir uma molécula de comprimento total.

Anticorpos

A invenção fornece anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína de SLO mutante da invenção, mas que não se ligam à proteína de SLO do tipo selvagem. O termo "anticorpo" inclui moléculas intactas de imunoglobulina, bem como fragmentos destas que são capazes de ligação a um antígeno. Esses incluem moléculas híbridas de anticorpo (quiméricas) (por exemplo, Winter e cols., Nature349, 293-99, 1991; Patente U.S. 4.816.567); fragmentos F(ab')2 e F(ab) e moléculas Fv; heterodímeros não covalentes (por exemplo, Inbar e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.69, 2.659-62, 1972; Ehrlich e cols.,

Biochem. 19, 4,091-96, 1980); moléculas Fv de cadeia única (sFv) (por exemplo, Huston e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.85, 5.897-83, 1988); construções diméricas e triméricas de fragmento de anticorpo; minibodies(por exemplo, Pack e cols., Biochem. 31, 1.579-84, 1992; Cumber e cols., J. Immunology149B, 120-26, 1992); moléculas de anticorpo humanizadas (por exemplo, Riechmann e cols., Nature332, 323-27, 1988; Verhoeyan e cols., Science 239, 1.534-36, 1988; e Publicação de Patente U.K. N° GB 2.276.169, publicada em 21 de setembro de 1994); e quaisquer fragmentos funcionais obtidos dessas moléculas, bem como anticorpos obtidos por meio de processos não convencionais como, por exemplo, apresentação em fago. De preferência, os anticorpos são anticorpos monoclonais. Métodos para a obtenção de anticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica.

Tipicamente, são necessários pelo menos 6, 7, 8, 10 ou 12 aminoácidos contíguos para formar um epitopo. No entanto, epitopos que envolvem aminoácidos não contíguos podem necessitar mais, por exemplo, pelo menos 15, 25 ou 50 aminoácidos. Vários imunoensaios (por exemplo, Western blots,ELISAs, radioimunoensaios, ensaios imunoistoquímicos, imunoprecipitações ou outros ensaios imunoquímicos conhecidos na técnica) podem ser usados para identificar anticorpos que possuem a especificidade desejada. Vários protocolos para ligação competitiva ou ensaios imunorradiométricos são bem conhecidos na técnica. Esses imunoensaios tipicamente envolvem a medida de formação de complexo entre um imunógeno e um anticorpo que se liga especificamente ao imunógeno. Uma preparação de anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína de SLO mutante tipicamente fornece um sinal de detecção pelo menos 5, 10 ou 2 0 vezes maior do que um sinal de detecção fornecido com outras proteínas quando usado em um ensaio imunoquímico e não fornece um sinal detectável se colocado em contato com a proteína de SLO do tipo selvagem. De preferência, os anticorpos não detectam outras proteínas em ensaios imunoquímicos e podem imunoprecipitar o antígeno em particular da solução.

Geração de anticorpos

Proteínas de SLO mutantes ou antígenos de polipeptídeo não SLO (descritos abaixo) podem ser usados para imunizar um mamífero, por exemplo, um camundongo, um rato, um coelho, um porquinho-da-índia, um macaco ou um ser humano, para produzir anticorpos policlonais. Se desejado, um antígeno pode ser conjugado a uma proteína transportadora, por exemplo, albumina sérica bovina, tireoglobulina e hemocianina keyhole limpet.Dependendo da espécie hospedeira, vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica. Esses adjuvantes incluem, sem limitação, adjuvante de Freund, géis minerais (por exemplo, hidróxido de alumínio), e substâncias tensoativas (por exemplo, lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianina keyhole limpete dinitrofenol). Entre os adjuvantes usados em seres humanos, BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum são especialmente úteis.

Anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a um antígeno podem ser preparados com o uso de qualquer técnica que permita a produção de moléculas de anticorpo por linhagens de células contínuas em cultura. Essas técnicas incluem, sem limitação, a técnica do hibridoma, a técnica do hibridoma de célula B humana, e a técnica do hibridoma de EBV (Kohler e cols., Nature256, 495-497, 1985; Kozbor e cols., J. Immunol. Methods81, 31-42, 1985; Cote e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2.026-2.030, 1983; Cole e cols., Mol. Cell Biol.62, 109-120, 1984).

Além disso, técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos", a junção de genes de anticorpo de camundongo a genes de anticorpo humano para se obter uma molécula com especificidade de antígeno e atividade biológica apropriadas podem ser usadas (Morrison e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6.851-6.855, 1984; Neuberger e cols., Nature312, 604-608, 1984; Takeda e cols., Nature 314, 452-454, 1985). Anticorpos monoclonais e outros também podem ser "humanizados" para evitar que um paciente monte uma resposta imune contra o anticorpo quando ele é usado terapeuticamente. Esses anticorpos podem ser suficientemente similares em termos de seqüência aos anticorpos humanos para serem usados diretamente em terapia, ou podem necessitar de alteração de uns poucos resíduos cruciais. As diferenças de seqüência entre anticorpos de roedores e seqüências humanas podem ser minimizadas por substituição de resíduos que diferem daqueles nas seqüências humanas por mutagênese sítio- dirigida de resíduos individuais ou por substituição de regiões determinantes de complementaridade inteiras.

Alternativamente, anticorpos humanizados podem ser produzidos com o uso de métodos recombinantes, como descrito abaixo. Anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno em particular podem conter sítios de ligação de antígeno que são parcial ou totalmente humanizados, como revelado em U.S. 5.565.332.

Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única podem ser adaptadas com o uso de métodos conhecidos na técnica para produzir anticorpos de cadeia única que se ligam especificamente a um antígeno em particular. Anticorpos com especificidade relacionada, mas de composição idiotípica distinta, podem ser gerados por embaralhamento de cadeia a partir de bibliotecas combinatórias aleatórias de imunoglobulina (Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11.120-23, 1991).

Anticorpos de cadeia única também podem ser construídos usando um método de amplificação de DNA, por exemplo, PCR, usando cDNA de hibridoma como modelo (Thirion e cols., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11). Anticorpos de cadeia única podem ser mono- ou biespecíficos, e podem ser bivalentes ou tetravalentes. A construção de anticorpos de cadeia única tetravalentes, biespecíficos, é ensinada, por exemplo, em Coloma &Morrison, Nat. Biotechnol.15, 159-63, 1997. A construção de anticorpos de cadeia única bivalentes, biespecíficos, é ensinada em Mallender & Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206, 1994.

Uma seqüência de nucleotídeos que codifica um anticorpo de cadeia única pode ser construída usando síntese manual ou automatizada de nucleotídeos, clonada em uma construção de expressão usando métodos padronizados de DNA recombinante, e introduzida em uma célula para expressar a seqüência codificadora, como descrito abaixo. Alternativamente, anticorpos de cadeia única podem ser produzidos diretamente, usando, por exemplo, tecnologia de fago filamentoso (Verhaar e cols., Int. J. Cancer61, 497- 501, 1995; Nicholls e cols., J. Immunol. Meth. 165, 81-91, 1993) .

Anticorpos que se ligam especificamente a um antígeno em particular também podem ser produzidos por indução da produção in vivo na população de linfócitos ou por seleção de bibliotecas de imunoglobulinas ou painéis de reagentes de ligação altamente específicos, como revelado na literatura (Orlandi e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. 86, 3.833-3.837, 1989; Winter e cols., Nature349, 293-299, 1991) .

Anticorpos quiméricos podem ser construídos como revelado em WO 93/03151. Proteínas de ligação que são derivadas de imunoglobulinas e que são multivalentes e multiespecíficas, por exemplo, os "diabodies" descritos em WO 94/13804, também podem ser preparados.

Anticorpos podem ser purificados por métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos podem ser purificados por afinidade por passagem sobre uma coluna à qual o antígeno relevante está ligado. Os anticorpos ligados podem então ser eluídos da coluna usando um tampão com uma concentração salina elevada.

Composições farmacêuticas

A invenção também fornece composições para uso como medicamentos (por exemplo, como composições imunogênicas ou vacinas). As composições da invenção são úteis para prevenção e/ou tratamento de doença causada como resultado de infecção por S. pyogenese compreendem pelo menos um agente ativo, que pode ser um polipeptídeo, uma molécula de ácido nucléico ou um anticorpo. A referida doença pode ser, por exemplo, bacteremia, meningite, febre puerperal, escarlatina, erisipelas, faringite, impetigo, fascite necrotizante, miosite ou síndrome de choque tóxico.

Composições que contêm proteínas de SLO mutantes são preferivelmente composições imunogênicas, e são mais preferivelmente composições de vacina. O pH dessas composições preferivelmente está entre 6 e 8, preferivelmente em torno de 7. 0 pH pode ser mantido pelo uso de um tampão. A composição pode ser estéril e/ou livre de pirogênio. A composição pode ser isotônica com relação aos seres humanos.

Vacinas de acordo com a invenção podem ser usadas profilática ou terapeuticamente, mas tipicamente serão profiláticas. Conseqüentemente, a invenção inclui um método para o tratamento terapêutico ou profilático de uma infecção por Streptococcus pyogenes. preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente ainda um ser humano. Os métodos envolvem a administração ao animal de uma quantidade terapêutica ou profilática das composições imunogênicas da invenção.

Algumas composições da invenção compreendem uma proteína de polipeptídeo de SLO mutante, como aqui descrito. Outras composições da invenção compreendem uma molécula de ácido nucléico que codifica a(s) proteína(s) de SLO mutante(s) e, opcionalmente, outros antígenos que podem ser incluídos na composição (veja abaixo). Veja, por exemplo, Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology9: 271-283; Donnelly e cols. (1997) Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648; Scott-Taylor & Dalgleish (2000) Expert Opin. Investig. Drugs 9: 471-480; Apostolopoulos & Piebanski (2000) Curr. Opin. Mol. Ther. 2: 441-447; Ilan (1999) Curr. Opin. Mol. Ther. 1: 116-120; Dubensky e cols. (2000) Mol. Med. 6: 723-732; Robinson & Pertmer (2000) Adv. Virus Res. 55: 1-74; Donnelly e cols. (2000) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162(4 Pt 2): S190-193; Davis (1999) Mt. Sinai J. Med. 66: 84-90. Tipicamente, a molécula de ácido nucléico é uma molécula de DNA, por exemplo, na forma de um plasmídeo.

Em algumas modalidades, as composições da invenção podem incluir um ou mais agentes ativos adicionais. Esses agentes incluem, sem limitação, (a) outra proteína de SLO mutante da invenção, (b) um antígeno polipeptídico que é útil em uma vacina pediátrica, (c) um antígeno polipeptídico que é útil em uma vacina para idosos ou indivíduos imunocomprometidos, (d) uma molécula de ácido nucléico que codifica (a)- (c), e um anticorpo que se liga especificamente a (a)-(c).

Antígenos adicionais

As composições da invenção podem ser administradas em conjunto com um ou mais antígenos adicionais para uso em métodos terapêuticos ou profiláticos da presente invenção. Antígenos adequados incluem aqueles listados abaixo. Adicionalmente, as composições da presente invenção podem ser usadas para tratar ou evitar infecções causadas por qualquer um dos patógenos listados abaixo. Além da combinação com os antígenos descritos abaixo, as composições da invenção também podem ser combinadas com um adjuvante, como aqui descrito.

Antígenos para uso com a invenção incluem, sem limitação, um ou mais dos seguintes antígenos apresentados abaixo ou antígenos derivados de um ou mais dos patógenos apresentados abaixo:

A. Antígenos bacterianos

Antígenos bacterianos adequados para uso na invenção incluem proteínas, polissacarídeos, lipopolissacarídeos e vesículas da membrana externa que podem ser isolados, purificados ou derivados de uma bactéria. Além disso, antígenos bacterianos podem incluir lisados bacterianos e formulações de bactérias inativadas. Antígenos bacterianos podem ser produzidos por expressão recombinante. Antígenos bacterianos preferivelmente incluem epítopos que estão expostos na superfície das bactérias durante pelo menos um estágio de seu ciclo de vida. Antígenos bacterianos são preferivelmente conservados através de múltiplos sorotipos. Antígenos bacterianos incluem antígenos derivados de uma ou mais das bactérias apresentadas abaixo, bem como os exemplos de antígenos específicos identificados abaixo.

Neisseria meningitidis:Antígenos de Neisseria meningitidispodem incluir proteínas (por exemplo, aquelas identificadas nas Referências 1 - 7), sacarídeos (incluindo um polissacarídeo, oligossacarídeo ou lipopolissacarídeo) ou vesículas da membrana externa (Referências 8, 9, 10, 11) purificadas ou derivadas do sorogrupo de N. meningitidis como, por exemplo, A, C, W135, Y e/ou B. antígenos proteicos de N. meningitidispodem ser selecionados de adesões, autotransportadores, toxinas, proteínas de aquisição de Fe, e proteínas associadas à membrana (preferivelmente proteína integral da membrana externa).

Streptococcus pneumoniae:Antígenos de Streptococcus pneumoniaepodem incluir um sacarídeo (incluindo um polissacarídeo ou um oligossacarídeo) e/ou proteína de Streptococcus pneumoniae.Antígenos sacarídicos podem ser selecionados dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F. Antígenos protéicos podem ser selecionados de uma proteína identificada em WO 98/18931, WO 98/18930, Patente U.S. N° 6.699.703, Patente U.S. N° 6.800.744, WO 97/43303 e WO 97/37026. Proteínas de Streptococcus pneumoniaepodem ser selecionadas da família da Tríade de PoliHistidina (PhtX), da família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX), CbpX truncadas, da família LytX, LytX truncadas, proteínas quiméricas CbpX truncada-LytX truncada, pneumolisina (Ply), PspA, PsaA, Spl28, SplOl, Spl30, Spl25 ou Spl33.

Streptococcus pyogenes {Streptococcusdo Grupo A) : Antígenos de Streptococcus do Grupo A podem incluir uma proteína identificada em WO 02/34771 ou WO 2005/032582 (incluindo, sem limitação, GAS39 (spy0266; gi-15674446), GAS40 (spy0269; gi-15674449), GAS42 (spy0287; gi-15674461), GAS45 (M5005_spy0249; gi-71910063), GAS57 (spy0416; gi- 15674549), GAS58 (spy0430; gi-15674556), GAS84 (spyl274; gi-15675229), GAS95 (sptl733; gi-15675582), GAS117 (spy0448; gi-15674571), GAS130 (spy0591; gi-15674677), GAS137 (spy0652; gi-15674720) , GAS159 (spyllOS; gi- 15675088), GAS193 (spy2025; gi-15675802), GAS202 (spyl309; gi-15675258), GAS217 (spy0925; gi-15674945), GAS236 (spyll26; gi-15675106), GAS253 (spyl524; gi-15675423), GAS277 (spyl939; gi-15675742), GAS294 (spyll73; gi- 15675145), GAS309 (spy0124; gi-15674341), GAS366 (spyl525; gi-15675424), GAS372 (spyl625; gi-15675501), GAS384 (spyl874; gi-15675693), GAS389 (spyl981; gi-15675772), GAS504 (spyl751; gi-15675600), GAS509 (spyl618; gi- 15675496), GAS290 (spyl959; gi-15675757), GAS511 (spyl743; gi-15675592), GAS527 (spyl204; gi-15675169), GAS529 (spyl280; gi-15675233) e GAS533 (spyl877; gi-15675696)), fusões de fragmentos de proteínas GAS M (incluindo aquelas descritas em WO 02/094851, e Dale, Vaccine(1999) 17: 193- 200, e Dale, Vaccine14(10): 944-948), proteína de ligação de fibronectina (Sfbl), proteínas estreptocócicas associadas ao heme (Shp), e Estreptolisina S (SagA). Antígenos de GAS adicionais incluem GAS68 (Spy0163; gil3621456), GAS84 (Spyl274; gil3622398), GAS88 (Spyl361; gil3622470), GAS89 (Spyl390; gil3622493), GAS98 (Spyl882; gil3622916), GAS99 (Spyl979; gil3622993), GAS102 (Spy2016, gil3623025), GAS146 (Spy0763; gil3621942), GAS195 (Spy2043; gil3623043), GAS561 (Spyll34; gil3622269), GAS179 (Spyl718, gil3622773) eGAS681 (spyll52; gil362228).

Moraxella catarrhalis:Antígenos de Moraxellaincluem antígenos identificados em WO 02/18595 e WO 99/58562, antígenos proteicos da membrana externa (HMW-OMP), C- antigeno e/ou LPS.

Bordetella pertussis:Antígenos de Pertussisincluem holotoxina de pertussis (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis,opcionalmente também em combinação com pertactina e/ou antígeno de aglutinógenos 2 e 3.

Staphylococcus aureus:Antígenos de Staphylococcus aureusincluem polissacarídeos capsulares de S. aureus do tipo 5 e 8, opcionalmente conjugados à exotoxina A recombinante atóxica de Pseudomonas aeruginosa, por exemplo, StaphVAX™, ou antígenos derivados de proteínas da superfície, invasinas (leucocidina, quinases, hialuronidase), fatores de superfície que inibem o envolvimento fagocítico (cápsula, Proteína A) , carotenóides, produção de catalase, Proteína A, coagulase, fator de coagulação e/ou toxinas que danificam a membrana (opcionalmente detoxificadas) que lisam membranas de células eucarióticas (hemolisinas, leucotoxina, leucocidina).

Staphylococcus epidermidis:Antígenos de S. epidermidisincluem antígeno slime-associado (SAA).

Clostridium tetani (tétano): Antígenos tetânicos incluem toxóide tetânico (TT), usado preferivelmente como uma proteína transportadora em conjunto/conjugada às composições da presente invenção.

Corynebacterium diphtheriae (difteria): Antígenos diftéricos incluem toxina diftérica, preferivelmente detoxifiçada, por exemplo, CRM197. Adicionalmente, antígenos capazes de modular, inibir ou associados à ribosilação de ADP são contemplados para combinação/coadministração/conjugação com as composições da presente invenção. Os toxóides diftéricos podem ser usados como proteínas transportadoras.

Haemophilus influenzaeB (Hib): Antígenos de Hib incluem um antígeno sacarídico de Hib.

Pseudomonas aeruginosa-.Antígenos de Pseudomonas incluem endotoxina A, proteína Wzz, LPS de P. aeruginosa, mais particularmente LPS isolado de PAO1 (sorotipo 05) e/ou Proteínas da Membrana Externa, incluindo Proteínas da Membrana Externa F (OprF) (Infect. Immun.Maio de 2001; 69(5): 3.510-3.515).

Legionella pneumophila.Antígenos bacterianos podem ser derivados de Legionella pneumophila.

Streptococcus agalactiae (Streptococcusdo Grupo B) : Antígenos de Streptococcus do Grupo B incluem um antígeno proteico ou sacarídico identificado em WO 02/34771, WO 03/093306, WO 04/041157 ou WO 2005/002619 (incluindo proteínas GBS 80, GBS 104, GBS 276 e GBS 322, e incluindo antígenos sacarídicos derivados dos sorotipos Ia, Ib, la/c, II, III, IV, V, VI, VII e VIII).

Neisseria gonorrhoeae-. antígenos de N. gonorrhoeae incluem proteína Por (ou porina) , por exemplo, PorB (veja Zhu e cols., Vaccine(2004) 22: 660-669), uma proteína de ligação de transferrina, por exemplo, TbpA e TbpB (Veja Price e cols., Infection and Immunity(2004) 71(1): 277- 283), uma proteína de opacidade (por exemplo, Opa), uma proteína modificável da redução (Rmp) e preparações de vesícula da membrana externa (OMV) (veja Plante e cols., J.

Infectious Disease (2000) 182: 848-855); veja também, por exemplo, WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280, WO 02/079243) .

Chlamydia trachomatis:Antígenos de Chlamydia trachomatisincluem antígenos derivados dos sorotipos A, B, Ba e C (agentes do tracoma, uma causa de cegueira), sorotipos LI, L2 e L3 (associados ao 1infogranuloma venéreo), e sorotipos D-K. Antígenos de Chlamydia trachomatistambém podem incluir um antígeno identificado em WO 00/37494, WO 03/049762, WO 03/068811 ou WO 05/002619, incluindo PepA (CT045), LcrE (CT089), ArtJ (CT381), DnaK (CT396), CT398, OmpH-líke (CT242), L7/L12 (CT316), OmcA (CT444), AtosS (CT467) , CT547, Eno (CT587) , HrtA (CT823) e MurG (CT761).

Treponema pallidum(sífilis): Antígenos da sífilis incluem o antígeno TmpA.

Haemophilus ducreyi(que causa cancróide): Antígenos de Ducreyiincluem proteína da membrana externa (DsrA).

Enterococcus faecalis ou Enterococcus faecium: Antígenos incluem uma repetição de trissacarídeo ou outros antígenos derivados de Enterococcusfornecidos na Patente U.S. N° 6.756.361.

Helicobacter pylori:Antígenos de H. pyloriincluem os antígenos Cag, Vac, Nap, HopX, HopY e/ou urease.

Staphylococcus saprophyticus: Antígenos incluem a hemaglutinina de 160 kDa do antígeno de S. saprophyticus.

Antígenos de Yersinia enterocolitica incluem LPS (Infect. Immun. Agosto de 2002; 70(8): 4.414).

E. coli: Antígenos de E. coli podem ser derivados de E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAggEC), E. colidifusamente aderente (DAEC), E. coli enteropatogênica (EPEC) e/ou E. colienteremorrágica (EHEC).

Bacillus anthracis(antraz): Antígenos de B. anthracis são opcionalmente detoxifiçados e podem ser selecionados de componentes A (fator letal (LF) e fator de edema (EF)), ambos podendo compartilhar um componente B comum conhecido como antígeno protetor (PA).

Yersinia pestis (praga): Os antígenos da praga incluem antígeno capsular Fl {Infect. Immun.Janeiro de 2003; 71(1)): 374-383, LPS {Infect. Immun.Outubro de 1999; 67(10): 5.395), antígeno V de Yersinia pestis {Infect. Immun.Novembro de 1997; 65(11): 4.476-4.482).

Mycobacterium tuberculosis:Antígenos de M. tuberculosisincluem lipoproteínas, LPS, antígenos de BCG, uma proteína de fusão de antígeno 85B (Ag85B) e/ou ESAT-6, opcionalmente formulada em vesículas lipídicas catiônicas {Infect. Immun.Outubro de 2004; 72(10): 6.148), antígenos associados à isocitrato desidrogenase de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) {Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Agosto de 2004 24; 101(34): 12.652) e/ou antígenos MPT51 {Infect. Immun.Julho de 2004; 72(7): 3.829).

Rickettsia:Antígenos incluem proteínas da membrana externa, incluindo a proteína da membrana externa A e/ou B (OmpB) {Biochim. Biophys. Acta.Novembro de 2004 1; 1.702 (2) : 145) , LPS, e antígeno de proteína da superficie (SPA) (J. Autoimmun.Junho 1989; 2 Supl:81).

Listeria monocytogenes.Antígenos bacterianos podem ser derivados de Listeria monocytogenes.

Chlamydia pneumoniae:Antígenos incluem aqueles identificados em WO 02/02606.

Vibrio cholerae: Antígenos incluem antígenos de proteinase, LPS, particularmente lipopolissacarídeos de Vibrio cholerae II, 01 Inaba polissacarídeos O-específicos, V. cholera0139, antígenos da vacina IEM108 (Infect. Immun. Outubro de 2003; 71(10): 5.498-504) e/ou toxina da Zonula occludens(Zot).

Salmonella typhi (febre tifóide): Antígenos incluem polissacarídeos capsulares preferivelmente conjugados (Vi, ou seja, vax-TyVi).

Borrelia burgdorferi(doença de Lyme): Antígenos incluem lipoproteínas (por exemplo, OspA, OspB, OspC e OspD), outras proteínas da superfície como, por exemplo, proteínas relacionadas a OspE (Erps), proteínas de ligação de decorina (por exemplo, DbpA), e proteínas antigenicamente variáveis VI, por exemplo, antígenos associados a P39 e P13 (uma proteína integral da membrana, Infect. Immun. Maio de 2001; 69(5): 3.323-3.334), "Antigenic Variation Protein VlsE"(J. Clin. Microbiol. Dezembro de 1999; 37(12): 3.997).

Porphyromonas gingivalis:Antígenos incluem proteína da membrana externa (OMP) de P. gingivalis.

Klebsiella:Antígenos incluem uma OMP, incluindo OMP A, ou um polissacarídeo opcionalmente conjugado ao toxóide tetânico.

Antígenos bacterianos da invenção adicionais podem ser antígenos capsulares, antígenos polissacarídicos ou antígenos proteicos de qualquer um dos acima. Antígenos bacterianos adicionais também podem incluir uma preparação de vesícula da membrana externa (OMV). Adicionalmente, antígenos incluem versões vivas, atenuadas e/ou purificadas de qualquer uma das bactérias mencionadas anteriormente. Os antígenos da presente invenção podem ser derivados de bactérias gram-negativas ou gram-positivas. Os antígenos da presente invenção podem ser derivados de bactérias aeróbicas ou anaeróbicas.

Adicionalmente, qualquer um dos sacarídeos derivados de bactérias acima (polissacarídeos, LPS, LOS ou oligossacarídeos) pode ser conjugado a outro agente ou antígeno, por exemplo, uma proteína transportadora (por exemplo, CRM197). Essa conjugação pode ser uma conjugação direta efetuada por aminação redutiva de porções carbonil no sacarídeo em grupos amino na proteína, como fornecido na Patente U.S. N° 5.360.897 e Can. J. Biochem. Cell. Biol. Maio de 1984; 62(5): 270-5. Alternativamente, os sacarídeos podem ser conjugados por meio de um vinculador, por exemplo, com succinamida ou outras ligações fornecidas em Bioconjugate Techniques,1996 e CRC, "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking", 1993.

B. Antígenos virais

Antígenos virais adequados para uso na invenção incluem vírus inativado (ou morto), vírus atenuado, formulações de vírus dividido, formulações de subunidade purificada, proteínas virais que podem ser isoladas, purificadas ou derivadas de um vírus, e Partículas Vírus- Like(VLPs). Antígenos virais podem ser derivados de vírus propagados em cultura de células ou outro substrato. Alternativamente, antígenos virais podem ser expressos recombinantemente. Antígenos virais preferivelmente incluem epítopos que estão expostos na superfície do vírus durante pelo menos um estágio de seu ciclo de vida. Antígenos virais são preferivelmente conservados através de múltiplos sorotipos ou isolados. Antígenos virais incluem antígenos derivados de um ou mais dos vírus apresentados abaixo, bem como dos exemplos de antígenos específicos identificados abaixo.

Ortomixovírus: Antígenos virais podem ser derivados de um Ortomixovírus, por exemplo, Influenza A, B e C. Antígenos de Ortomixovírus podem ser selecionados de uma ou mais das proteínas virais, incluindo hemaglutinina (HA) , neuraminidase (NA), nucleoproteína (NP), proteína da matriz (Ml), proteína da membrana (M2), um ou mais dos componentes de transcriptase (PB1, PB2 e PA) . Antígenos preferidos incluem HA e NA.

Antígenos de Influenza podem ser derivados de cepas de gripe interpandêmicas (anuais). Alternativamente, antígenos de influenza podem ser derivados de cepas com o potencial para causar um surto pandémico (ou seja, cepas de influenza com nova hemaglutinina comparada com a hemaglutinina em cepas atualmente circulantes ou cepas de influenza que são patogênicas em aves e possuem o potencial para serem transmitidas horizontalmente na população humana ou cepas de influenza que são patogênicas para os seres humanos).

Vírus Paramyxoviridae: Antígenos virais podem ser derivados de vírus Paramyxoviridae, por exemplo, Pneumovírus (RSV), Paramixovírus (PIV) e Morbillivírus (sarampo).

Pneumovírus: Antígenos virais podem ser derivados de um Pneumovírus, por exemplo, o vírus sincicial respiratório (RSV), vírus sincicial respiratório bovino, vírus da pneumonia de camundongo e virus da rinotraqueite em perus. De preferência, o Pneumovirus é RSV. Antígenos de Pneumovirus podem ser selecionados de uma ou mais das seguintes proteínas, incluindo fusão de proteínas da superfície (F) , glicoproteína (G) e pequena proteína hidrofóbica (SH), proteínas da matriz M e M2, proteínas do nucleocapsídeo N, P e L e proteínas não estruturais NS1 e NS2. Antígenos de Pneumovírus preferidos incluem F, G e M. Veja, por exemplo, J. Gen. Virol.Novembro de 2004; 85 (Pt 11): 3.229). Antígenos de Pneumovírus também podem ser formulados ou derivados de vírus quiméricos. Por exemplo, vírus RSV/PIV quiméricos podem compreender componentes tanto de RSV quanto de PIV.

Paramixovírus: Antígenos virais podem ser derivados de um Paramixovírus como, por exemplo, vírus Parainfluenza tipos 1-4 (Ply), da caxumba, vírus Sendai, vírus Símio 5, vírus da parainfluenza bovina e vírus da doença de Newcastle. De preferência, o Paramixovírus é PIV ou da caxumba. Antígenos de Paramixovírus podem ser selecionados de uma ou mais das seguintes proteínas: hemaglutinina - neuraminidase (HN), proteínas de fusão Fl e F2, nucleoproteína (NP), fosfoproteína (P), proteína grande (L) e proteína da matriz (M). Proteínas de Paramixovírus preferidas incluem HN, Fl e F2. Os antígenos de Paramixovírus também podem ser formulados ou derivados de vírus quiméricos. Por exemplo, vírus RSV/PIV quiméricos podem compreender componentes tanto de RSV quanto de PIV. Vacinas para caxumba comercialmente disponíveis incluem vírus da caxumba vivo atenuado, em uma forma monovalente ou em combinação com vacinas para sarampo e rubéola (MMR).

Morbillivírus: Antígenos virais podem ser derivados de um Morbillivírus, por exemplo, o vírus do sarampo. Antígenos de Morbillivírus podem ser selecionados de uma ou mais das seguintes proteínas: hemaglutinina (H) , glicoproteína (G), fator de fusão (F), proteína grande (L), nucleoproteína (NP), fosfoproteína de polimerase (P) e da matriz (M). Vacinas para sarampo disponíveis comercialmente incluem vírus do sarampo vivo atenuado, tipicamente em combinação com vírus da caxumba e da rubéola (MMR).

Picornavírus: Antígenos virais podem ser derivados de Picornavírus, por exemplo, Enterovirus, Rinovírus, Heparnavírus, Cardiovírus e Aftovírus. Antígenos derivados de Enterovirus, por exemplo, Poliovirus, são preferidos.

Enterovirus: Antígenos virais podem ser derivados de um Enterovirus, por exemplo, Poliovirus dos tipos 1, 2 ou 3, vírus Coxsackie A dos tipos 1 a 22 e 24, vírus Coxsackie B dos tipos 1 a 6, vírus Ecovírus (ECHO) dos tipos 1 a 9, 11 a 27 e 29 a 34 e Enterovirus 68 a 71. De preferência, o Enterovirus é poliovirus. Antígenos de Enterovirus são selecionados preferivelmente de uma ou mais das seguintes proteínas do capsídeo: VP1, VP2, VP3 e VP4. Vacinas para pólio disponíveis comercialmente incluem Vacina para Pólio Inativada (IPV) e vacina oral para poliovirus (OPV).

Heparnavírus: Antígenos virais podem ser derivados de um Heparnavírus, por exemplo, o vírus da Hepatite A (HAV). Vacinas para HAV disponíveis comercialmente incluem a vacina de HAV inativado.

Togavírus: Antígenos virais podem ser derivados de um Togavírus, por exemplo, um Rubivírus, um Alfavírus ou um Arterivírus. Antígenos derivados de Rubivírus, por exemplo, vírus da rubéola, são preferidos. Antígenos de Togavírus podem ser selecionados de El, E2, E3, C, NSP-1, NSPO-2, NSP-3 ou NSP-4. Antígenos de Togavírus são selecionados preferivelmente de El, E2 ou E3. Vacinas para rubéola disponíveis comercialmente incluem um vírus vivo adaptado ao frio, tipicamente em combinação com vacinas para caxumba e sarampo (MMR).

Flavivírus: Antígenos virais podem ser derivados de um Flavivírus, por exemplo, encefalite transmitida por carrapatos (TBE) , Dengue (tipos 1, 2, 3 ou 4), febre amarela, encefalite japonesa, encefalite do Oeste do Nilo, encefalite de St. Louis, encefalite russa da primavera- verão, encefalite de Powassan. Antígenos de Flavivírus podem ser selecionados de PrM, M, C, E, NS-1, NS-2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5. Antígenos de Flavivírus são selecionados preferivelmente de PrM, M e E. Uma vacina de TBE disponível comercialmente inclui vacinas de vírus inativado.

Pestivírus: Antígenos virais podem ser derivados de um Pestivírus, por exemplo, o vírus da diarréia viral bovina (BVDV), vírus da febre suína clássica (CSFV) ou doença da fronteira (BDV).

Hepadnavírus: Antígenos virais podem ser derivados de um Hepadnavírus, por exemplo, o vírus da Hepatite B. Antígenos de Hepadnavírus podem ser selecionados de antígenos de superfície (L, M e S) , antígenos centrais (HBc, HBe) . Vacinas para HBV disponíveis comercialmente incluem vacinas de subunidade que compreendem a proteína do antígeno de superfície S.

Vírus da Hepatite C: Antígenos virais podem ser derivados de um vírus da Hepatite C (HCV). Antígenos de HCV podem ser selecionados de um ou mais de El, E2, E1/E2, poliproteína NS345, poliproteína NS 345-central, central, e/ou peptídeos das regiões não estruturais (Houghton e cols., Hepatology(1991) 14: 381).

Rabdovírus: Antígenos virais podem ser derivados de um Rabdovírus, por exemplo, um Lissavírus (vírus da raiva) e Vesiculovirus (VSV). Antígenos de Rabdovírus podem ser selecionados de glicoproteína (G), nucleoproteína (N), proteína grande (L) , proteínas não estruturais (NS) . Vacinas do vírus da raiva disponíveis comercialmente compreendem vírus morto desenvolvido em células diplóides humanas ou células pulmonares fetais de rhesus.

Calciviridae: Antígenos virais podem ser derivados de Calciviridae, por exemplo, vírus de Norwalk, e vírus Norwalk-like,por exemplo, vírus do Hawaii e vírus da Montanha Nevada.

Coronavirus: Antígenos virais podem ser derivados de um Coronavirus, SARS, Coronavirus respiratório humano, vírus da bronquite infecciosa aviária (IBV), vírus da hepatite do camundongo (MHV), e vírus da gastrenterite transmissível suína (TGEV). Antígenos de Coronavirus podem ser selecionados de spike(S) , envelope (E) , matriz (M) , nucleocapsídeo (N) e glicoproteína de hemaglutinina- esterase (HE) . De preferência, o antígeno de Coronavirus é derivado de um vírus da SARS. Antígenos virais da SARS são descritos em WO 04/92360;

Retrovirus: Antígenos virais podem ser derivados de um Retrovirus, por exemplo, um Oncovirus, um Lentivirus ou um Espumavírus. Antígenos de Oncovirus podem ser derivados de

HTLV-1, HTLV-2 ou HTLV-5. Antígenos de Lentivírus podem ser derivados de HIV-1 ou HIV-2. Antígenos de Retrovirus podem ser selecionados de gag, pol, env, tax, tat, rex, rev, nef, vif, vpu e vpr. Antígenos de HIV podem ser selecionados de gag (p24gag e p55gag) , env (gpl60 e gp41) , pol, tat, nef, rev vpu, miniproteinas, (preferivelmente p55 gag e gpl40v deletada) . Antígenos de HIV podem ser derivados de uma ou mais das seguintes cepas: HIVIIIb, HIVSF2, HIVLAV, HIVLAI, HIVMN, HIV-1CM235, HIV-1US4.

Reovírus: Antígenos virais podem ser derivados de um Reovírus, por exemplo, um Ortoreovírus, um Rotavirus, um Orbivírus ou um Coltivírus. Antígenos de Reovírus podem ser selecionados de proteínas estruturais Xl, À.2, A,3, pl, p2, σl, σ2 ou σ3 ou proteínas não estruturais σNS, pNS ou σls. Antígenos de Reovírus preferidos podem ser derivados de um Rotavirus. Antígenos de Rotavirus podem ser selecionados de VP1, VP2, VP3, VP4 (ou o produto clivado VP5 e VP8), NSP 1, VP6, NSP3, NSP2, VP7, NSP4 ou NSP5. Antígenos de Rotavirus preferidos incluem VP4 (ou o produto clivado VP5 e VP8), e VP7.

Parvovirus: Antígenos virais podem ser derivados de um Parvovirus, por exemplo, Parvovirus B19. Antígenos de Parvovirus podem ser selecionados de VP-1, VP-2, VP-3, NS-1 e NS-2. De preferência, o antígeno de Parvovirus é a proteína do capsídeo VP-2.

Vírus da hepatite Delta (HDV): Antígenos virais podem ser derivados do HDV, particularmente antígeno δ de HDV (veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.378.814).

Vírus da Hepatite E (HEV): Antígenos virais podem ser derivados de HEV.

Vírus da Hepatite G (HGV): Antígenos virais podem ser derivados de HGV.

Herpesvirus humano: Antígenos virais podem ser derivados de um Herpesvirus humano, por exemplo, vírus do Herpes Simples (HSV), vírus da varicela-zoster (VZV), vírus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovírus (CMV), herpesvirus humano 6 (HHV6), herpesvirus humano 7 (HHV7) e herpesvirus humano 8 (HHV8). Antígenos do herpesvirus humano podem ser selecionados de proteínas precoces imediatas (a), proteínas precoces (£) e proteínas tardias (y) . Antígenos de HSV podem ser derivados de cepas de HSV-1 ou HSV-2. Antígenos de HSV podem ser selecionados de glicoproteínas gB, gC, gD e gH, proteína de fusão (gB) ou proteínas de escape imune (gC, gE ou gi). Antígenos de VZV podem ser selecionados de proteínas centrais, do nucleocapsídeo, do tegumento ou do envelope. Uma vacina de VZV vivo atenuado está disponível comercialmente. Antígenos de EBV podem ser selecionados de proteínas antigênicas precoces (EA), antígeno do capsídeo viral (VCA) e glicoproteínas do antígeno da membrana (MA). Antígenos de CMV podem ser selecionados de proteínas do capsídeo, glicoproteínas do envelope (por exemplo, gB e gH) e proteínas do tegumento.

Papovavírus: Antígenos podem ser derivados de Papovavírus, por exemplo, Papilomavírus e Poliomavírus. Poliomavírus incluem sorotipos do HPV 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 e 65. De preferência, antígenos de HPV são derivados dos sorotipos 6, 11, 16 ou 18. Antígenos do HPV podem ser selecionados de proteínas do capsídeo (Ll) e (L2) ou El - E7 ou fusões destas. Antígenos de HPV são preferivelmente formulados em partículas vírus-like(VLPs). Vírus de Poliomavírus incluem vírus BK e vírus JK. Antígenos de Poliomavírus podem ser selecionados de VP1, VP2 ou VP3.

São ainda fornecidos antígenos, composições, métodos, e micróbios incluídos em Vaccines, 4a Edição (Plotkin e Orenstein ed. 2004); "Medical Microbiology"4a Edição (Murray e cols. ed. 2002); Virology,3a Edição (W.K. Joklik ed. 1988); "Fundamental Virology", 2a Edição (B.N. Fields e D.M. Knipe, eds. 1991), que são contemplados em conjunto com as composições da presente invenção.

C. Antígenos fúngicos

Antígenos fúngicos para uso na invenção podem ser derivados de um ou mais dos fungos apresentados abaixo.

Antígenos fúngicos podem ser derivados de Dermatófitos, incluindo: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum e/ou Trichophyton faviforme.

Patógenos fúngicos podem ser derivados de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternariaspp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp e Cladosporium spp.

Processos para a produção de antígenos fúngicos são bem conhecidos na técnica (veja Patente U.S. N° 6.333.164). Em um método preferido, uma fração solubilizada extraída e separada de uma fração insolúvel que pode ser obtida de células fúngicas das quais a parede celular foi substancialmente removida ou pelo menos parcialmente removida, caracterizado pelo fato de que o processo compreende as etapas de: obtenção de células fúngicas vivas; obtenção de células fúngicas das quais a parede celular foi substancialmente removida ou pelo menos parcialmente removida; ruptura das células fúngicas das quais a parede celular foi substancialmente removida ou pelo menos parcialmente removida; obtenção de uma fração insolúvel; e extração e separação de uma fração solubilizada da fração insolúvel.

D. Antígenos de DST

As composições da invenção podem incluir um ou mais antígenos derivados de uma doença sexualmente transmitida (DST). Esses antígenos podem fornecer uma profilaxia ou terapia para DSTs como, por exemplo, clamídia, herpes genital, hepatites (por exemplo, HCV), condilomas genitais, gonorréia, sífilis e/ou cancróide (veja, WO 00/15255). Antígenos podem ser derivados de uma ou mais DSTs virais ou bacterianas. Antígenos de DST virais para uso na invenção podem ser derivados de, por exemplo, HIV, vírus do herpes simples (HSV-1 e HSV-2), papilomavírus humano (HPV) e hepatite (HCV). Antígenos de DSTs bacterianas para uso na invenção podem ser derivados de, por exemplo, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Haemophilus ducreyi, E. coli, e Streptococcus agalactiae. Exemplos de antígenos específicos derivados desses patógenos são descritos acima.

E. Antígenos respiratórios

As composições da invenção podem incluir um ou mais antígenos derivados de um patógeno que causa doença respiratória. Por exemplo, antígenos respiratórios podem ser derivados de um vírus respiratório como, por exemplo, Ortomixovírus (influenza), Pneumovírus (RSV), Paramixovírus (PIV), Morbillivírus (sarampo), Togavírus (rubéola), VZV e Coronavirus (SARS). Antígenos respiratórios podem ser derivados de bactérias que causam doenças respiratórias, por exemplo, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Bacillus anthracis e Moraxella catarrhalis. Exemplos de antígenos específicos derivados desses patógenos estão descritos acima.

F. Antígenos de vacina pediátrica

As composições da invenção podem incluir um ou mais antígenos adequados para uso em indivíduos pediátricos. Os indivíduos pediátricos têm tipicamente menos de 3 anos de idade ou menos do que aproximadamente 2 anos de idade ou menos do que cerca de 1 ano de idade. Antígenos pediátricos podem ser administrados várias vezes ao longo de 6 meses, 1, 2 ou 3 anos. Os antígenos pediátricos podem ser derivados de um vírus que pode ter como alvo populações pediátricas e/ou um vírus ao qual as populações pediátricas são suscetíveis à infecção. Antígenos pediátricos virais incluem antígenos derivados de um ou mais de Ortomixovírus (influenza), Pneumovírus (RSV), Paramixovírus (PIV e caxumba), Morbillivírus (sarampo), Togavirus (rubéola), Enterovirus (pólio), HBV, Coronavirus (SARS) e vírus da varicela-zoster (VZV), vírus de Epstein-Barr (EBV). Antígenos pediátricos bacterianos incluem antígenos derivados de um ou mais de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pyogenes {Streptococcus do Grupo A) , Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani(tétano), Corynebacterium diphtheriae(difteria), Haemophilus influenzae B (Hib), Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae {Streptococcus do Grupo B) , e E. coli.Exemplos de antígenos específicos derivados desses patógenos estão descritos acima.

G. Antígenos adequados ao uso em idosos ou indivíduos imunocomprometidos

As composições da invenção podem incluir um ou mais antígenos adequados para uso em idosos ou indivíduos imunocomprometidos. Esses indivíduos podem precisar ser vacinados mais freqüentemente, com doses maiores ou com formulações com adjuvante para aumentar sua resposta imune aos antígenos visados. Antígenos que podem ser visados para uso em idosos ou indivíduos imunocomprometidos incluem antígenos derivados de um ou mais dos seguintes patógenos: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae,

Streptococcus pyogenes {StreptococcusGrupo do A) , Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Clostridium tetani (tétano), Corynebacterium diphtherias(difteria), Haemophilus influenzae B (Hib), Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Streptococcus agalactiae (Streptococcus do Grupo B) , Enterococcus faecalis, Helicobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Ortomixovirus (influenza), Pneumovirus (RSV), Paramixovirus (PIV e caxumba), Morbillivírus (sarampo), Togavírus (rubeola), Enterovirus (pólio), HBV, Coronavirus (SARS), virus da varicela-zoster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), Citomegalovírus (CMV). Exemplos de antígenos específicos derivados desses patógenos estão descritos acima.

H. Antígenos adequados ao uso em vacinas para adolescentes

As composições da invenção podem incluir um ou mais antígenos adequados para uso em indivíduos adolescentes. Adolescentes podem necessitar de um reforço de um antígeno pediátrico administrado previamente. Antígenos pediátricos que podem ser adequados ao uso em adolescentes estão descritos acima. Além disso, adolescentes podem ser visados para receber antígenos derivados de um patógeno de DST a fim de assegurar imunidade protetora ou terapêutica antes do início da atividade sexual. Antígenos de DST que podem ser adequados ao uso em adolescentes estão descritos acima.

I. Formulações de antígenos

Em outros aspectos da invenção, são fornecidos métodos de produção de micropartículas que possuem antígenos adsorvidos. Os métodos compreendem: (a) fornecimento de uma emulsão por dispersão de uma mistura compreendendo (i) água, (ii) um detergente, (iii) um solvente orgânico, e (iv) um polímero biodegradável selecionado do grupo que consiste em um poli(ácido a-hidróxi), um ácido polihidroxi butírico, uma policaprolactona, um poliortoéster, um polianidrido e um policianoacrilato. 0 polímero está tipicamente presente na mistura em uma concentração de cerca de 1% até cerca de 3 0% em relação ao solvente orgânico, enquanto o detergente está tipicamente presente na mistura em uma proporção peso/peso de detergente/polímero de cerca de 0,00001:1 até cerca de 0,1:1 (mais tipicamente cerca de 0,0001:1 até cerca de 0,1:1, cerca de 0,001:1 até cerca de 0,1:1 ou cerca de 0,005:1 até cerca de 0,1:1); (b) remoção do solvente orgânico da emulsão; e (c) adsorção de um antígeno na superfície das micropartículas. Em certas modalidades, o polímero biodegradável está presente em uma concentração de cerca de 3% até cerca de 10% em relação ao solvente orgânico.

Micropartículas para uso neste pedido serão formadas por materiais que são esterilizáveis, atóxicos e biodegradáveis. Esses materiais incluem, sem limitação, poli(ácido a-hidróxi) , ácido polihidroxibutírico, policaprolactona, poliortoéster, polianidrido, PACA e policianoacrilato. De preferência, as micropartículas para uso com a presente invenção são derivadas de um poli(ácido a-hidróxi), em particular, de uma poli(lactida) ("PLA") ou um copolímero de D,L-lactida e glicolida ou ácido glicólico, por exemplo, uma poli(D,L-lactida-co-glicolida) ("PLG" ou "PLGA") ou um copolímero de D,L-lactida e caprolactona. As micropartículas podem ser derivadas de qualquer um dos vários materiais poliméricos de partida que possuem diversos pesos moleculares e, no caso dos copolímeros como, por exemplo, PLG, diversas proporções de lactida:glicolida, cuja seleção será em grande parte uma questão de escolha, dependo, em parte, da macromolécula coadministrada. Esses parâmetros são discutidos mais plenamente abaixo.

Antígenos adicionais também podem incluir uma preparação de vesícula da membrana externa (OMV).

Métodos de formulação e antígenos adicionais (especialmente antígenos tumorais) são fornecidos na Patente U.S. N° de Série 09/581.772.

J. Referências de antígenos

As referências seguintes incluem antígenos úteis em conjunto com as composições da presente invenção: 1. Pedido de Patente International WO 99/24578. 2. Pedido de Patente International WO 99/36544. 3. Pedido de Patente International WO 99/57280. 4. Pedido de Patente International WO 00/22430. 5. Tettelin e cols. (2000) Science 287: 1.809-1.815. 6. Pedido de Patente International WO 96/29412. 7. Pizza e cols. (2000) Science 287: 1.816-1.820. 8. PCT WO 01/52885. 9. Bjune e cols. (1991) Lancet338 (8.775). 10. Fuskasawa e cols. (1999) Vaccine17: 2.951-2.958. 11. Rosenqist e cols. (1998) Dev. Biol. Strand92: 323-333. 12. Constantino e cols. (1992) Vaccine10: 691-698. 13. Constantino e cols. (1999) Vaccine17: 1.251- 1.263. 14. Watson (2000) Pediatr. Infect. Dis. J. 19: 331- 332 . 15. Rubin (20000) Pediatr. Clin. North Am. 47: 269- 285,v. 16. Jedrzejas (2001) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 187-207. 17. Pedido de Patente International depositadoem 3 de julho de 2001 que reivindica prioridade de GB 0016363.4; WO 02/02606; PCT IB/01/00166. 18. Kalman e cols. (1999) Nature Genetics 21: 385-389. 19. Read e cols. (2000) Nucleic Acids Res 28: 1.397- 406. 20. Shirai e cols. (2000) J. Infect. Dis. 181 (Supl. 3): S524-S527. 21. Pedido de Patente International WO 99/27105. 22. Pedido de Patente International WO 00/27994. 23. Pedido de Patente International WO 00/37494. 24. Pedido de Patente International WO 99/28475. 25. Bell (2000) Pediatr. Infect. Dis. J.19: 1.187- 1.188. 26. Iwarson (1995) APMIS103: 321-326. 27. Gerlich e cols. (1990) Vaccine 8 Supl.: S63-68 e 79-80. 28. Hsu e cols. (1999) Clin. Liver Dis. 3: 901-915. 29. Gastofsson e cols. (1996) N. Engl. J. Med. 334- :349-355. 30. Rappuoli e cols. (1991) TIBTECH 9: 232-238. 31. "Vaccines" (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0- 7216-1946-0. 32. Del Guidice e cols. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19: 1-70. 33. Pedido de Patente International WO 93/018150. 34. Pedido de Patente International WO 99/53310. 35. Pedido de Patente International WO 98/04702. 36. Ross e cols. (2001) Vaccine 19: 135-142. 37. Sutter e cols. (2000) Pediatr. Clin. North Am. 47: 287-308. 38. Zimmerman & Spann (1999) Am. Fan. Physician 59: 113-118, 125-126. 39. Dreensen (1997) Vaccine 15 Supl. S2-6. 40. "MMWR Morb Mortal Wkly Rep" 1998 Jan 16:47(1) : 12, 9. 41. McMichael (2000) Vaccine 19 Supl. 1: S101-107. 42. Schuchat (1999) Lancer 353(9146): 51-6. 43. Pedidos de Patente GB 0026333.5, 0028727.6 e 0105640.7. 44. Dale (1999) Infect. Disclin. North Am. 13: 227-43, viii. 45. Ferretti e cols. (2001) PNAS USA 98: 4.658-4.663. 46. Kuroda e cols. (2001) Lancet 357(9264): 1.225- 1.240; veja também as páginas 1.218-1.219. 47. Ramsay e cols. (2001) Lancet 357 (9251): 195-196. 48. Lindberg (1999) Vaccine 17 Supl. 2: S28-36. 49. Buttery & Moxon (2000) J. R. Coil Physicians Long 34: 163-168. 50. Ahmad & Chapnick (1999) Infect. Dis. Clin. North Am. 13: 113-133, vii. 51. Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47: 663-567. 52. Patente Européia 0 477 508. 53. Patente U.S. N° 5.306.492. 54. Pedido de Patente International WO 98/42721. 55. "Conjugate Vaccines" (eds. Cruse e cols.) ISBN 3805549326, particularmente vol. 10: 48-114. 56. Hermanson (1996) "Bioconjugate Techniques" ISBN: 012323368 e 012342335X. 57. Pedido de Patente Européia 0372501. 58. Pedido de Patente Européia 0378881. 59. Pedido de Patente Européia 0427347. 60. Pedido de Patente International WO 93/17712. 61. Pedido de Patente International WO 98/58668. 62. Pedido de Patente Européia 0471177. 63. Pedido de Patente International WO 00/56360. 64. Pedido de Patente International WO 00/67161.

Cujos teores das patentes, pedidos de patente e artigos de revistas científicas citados acima são incorporados por referência como se aqui totalmente citados.

Quando um antígeno de sacarídeo ou carboidrato é usado, ele é preferivelmente conjugado a uma proteína transportadora a fim de aumentar a imunogenicidade. Veja Ramsay e cols. (2001) Lancet357 (9.251): 195-196; Lindberg (1999) Vaccine17 Supl. 2: S28-36; Buttery &Moxon (2000) J. R. Coll. Physicians Lond. 34: 163-168; Ahmad & Chapnick (1999) Infect. Dis. Clin. North Am. 13: 113-133, vii; Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47: 563-567; Patente Européia 0 477 508; Patente U.S. N° 5.306.492; WO 98/42721; "Conjugate Vaccines" (eds. Cruse e cols.) ISBN 3805549326, particularmente vol. 10: 48-114; Hermanson (1996) "Bioconjugate Techniques" ISBN: 0123423368 ou 012342335X. Proteínas transportadoras preferidas são toxinas ou toxóides bacterianos, por exemplo, toxóides diftérico tetânico. O toxóide diftérico CRM197 é particularmente preferido.

Outros polipeptídeos transportadores incluem a proteína da membrana externa de N. meningitidis(EP-A- 0372501), peptídeos sintéticos (EP-A-0378881 e EP-A 0427347), proteínas de choque térmico (WO 93/17712 e WO 94/03208), proteínas de pertussis (WO 98/58668 e EP A 0471177), proteína D de H. influenzae(WO 00/56360), citocinas (WO 91/01146), linfocinas, hormônios, fatores do crescimento, toxina A ou B de C. difficile(WO 00/61761), proteínas de captação de ferro (WO 01/72337) etc. Quando uma mistura compreende sacarídeo capsular de ambas as serigrafias A e C, pode ser preferido que a proporção (p/p) de Sacarídeo de MenA: sacarídeo de MenC seja maior do que 1 (por exemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 ou maior).

Sacarídeos diferentes podem ser conjugados ao mesmo tipo ou a um tipo diferente de proteína transportadora. Qualquer reação de conjugação adequada pode ser usada, com qualquer vinculador adequado, quando necessário.

Antígenos proteicos tóxicos podem ser detoxifiçados quando necessário, por exemplo, detoxificação de toxina de pertussis por meios químicos e/ou genéticos.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis

As composições da invenção compreenderão tipicamente, além dos componentes mencionados acima, um ou mais "veículos farmaceuticamente aceitáveis". Estes incluem qualquer veículo que não induza, por si mesmo, a produção de anticorpos danosos ao indivíduo que recebe a composição. Veículos adequados tipicamente são macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas como, por exemplo, proteínas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e agregados lipídicos (por exemplo, gotículas de óleo ou lipossomos). Esses veículos são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Uma composição também pode conter um diluente, por exemplo, água, solução salina, glicerol etc. Adicionalmente, uma substância auxiliar, por exemplo, um agente umidificante ou emulsificante, uma substância de tamponamento de pH, e semelhantes, pode estar presente. Uma discussão detalhada de componentes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy". 20a Edição, ISBN: 0683306472.

Agentes imunorreguladores Adjuvantes

As vacinas da invenção podem ser administradas em conjunto com outros agentes imunorreguladores. Em particular, as composições incluirão normalmente um adjuvante. Adjuvantes para uso com a invenção incluem, sem limitação, um ou mais dos seguintes apresentados abaixo:

A. Composições que contêm minerais

Composições que contêm minerais adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem sais minerais, tais como sais de alumínio e sais de cálcio. A invenção inclui sais minerais como, por exemplo, hidróxidos (por exemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por exemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos etc. (por exemplo, veja os capítulos 8 e 9 de "Vaccine Design" (1995) eds. Powell &Newman. ISBN: 030644867X. Plenum), ou misturas de diferentes compostos minerais (por exemplo, uma mistura de um adjuvante de fosfato e um adjuvante de hidróxido, opcionalmente com um excesso do fosfato), com os compostos assumindo qualquer forma (por exemplo, gel, cristalina, amorfa etc.), e com adsorção aos sais sendo preferida. As composições que contêm minerais também podem ser formuladas como uma partícula de sal metálico (WO 00/23105).

Sais de alumínio podem ser incluídos nas vacinas da invenção de tal forma que a dose de Al3+ esteja entre 0,2 e 1,0 mg por dose.

Em uma modalidade, o adjuvante à base de alumínio para uso na presente invenção é alume (sulfato potássico de alumínio (A1K(SO4)2)) ou um derivado de alume, por exemplo, aquele formado in situpor mistura de um antígeno em tampão fosfato com alume, seguido por titulação e precipitação com uma base como, por exemplo, hidróxido de amónio ou hidróxido de sódio.

Outro adjuvante à base de alumínio para uso em formulações de vacina da presente invenção é o adjuvante de hidróxido de alumínio (A1(OH)3) ou oxihidróxido de alumínio cristalino (A1OOH), que é um excelente adsorvente, que possui uma área de superfície de aproximadamente 500 m2/g. Alternativamente, é fornecido o adjuvante de fosfato de alumínio (A1PO4) ou hidroxifosfato de alumínio, que contém grupos fosfato no lugar de alguns ou todos os grupos hidroxil do adjuvante de hidróxido de alumínio. Adjuvantes de fosfato de alumínio preferidos aqui fornecidos são amorfos e solúveis em meios acídicos, básicos e neutros.

Em outra modalidade, o adjuvante da invenção compreende tanto fosfato de alumínio quanto hidróxido de alumínio. Em uma modalidade mais particular desta, o adjuvante possui uma quantidade maior de fosfato de alumínio do que de hidróxido de alumínio, por exemplo, uma proporção de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 ou maior do que 9:1, por peso de fosfato de alumínio para hidróxido de alumínio. Mais particular ainda, os sais de alumínio na vacina estão presentes a 0,4 a 1,0 mg por dose de vacina ou 0,4 a 0,8 mg por dose de vacina ou 0,5 a 0,7 mg por dose de vacina ou cerca de 0,6 mg por dose de vacina.

Geralmente, os adjuvantes à base de alumínio preferidos ou a proporção de múltiplos adjuvantes à base de alumínio, por exemplo, de fosfato de alumínio para hidróxido de alumínio, são selecionados por otimização da atração eletrostática entre moléculas de tal modo que o antígeno carregue uma carga oposta à do adjuvante no pH desejado. Por exemplo, o adjuvante de fosfato de alumínio (ponto isoelétrico = 4) adsorve lisozima, mas não albumina em pH 7,4. Caso albumina seja o alvo, seria selecionado o adjuvante de hidróxido de alumínio (ponto isoelétrico 11,4). Alternativamente, o pré-tratamento de hidróxido de alumínio com fosfato reduz seu ponto isoelétrico, tornando-o um adjuvante preferido para antígenos mais básicos.

B. Emulsões de óleo

Composições de emulsão de óleo adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem emulsões esqualeno- água, tais como MF59 (Esqualeno 5%, TWEEN 8 0™ 0,5% e Span™ 85 0,5%, formulados em partículas submícron com o uso de um microfluidificador) . Veja WO 90/14837. Veja também Podda, Vaccine(2001) 19: 2.673-2.680; Frey e cols., Vaccine(2003) 21: 4.234-4.237. MF59 é usado como o adjuvante na vacina de subunidade trivalente do vírus influenza FLUAD™.

Adjuvantes particularmente preferidos para uso nas composições são emulsões óleo-em-água submícron. Emulsões óleo-em-água submícron preferidas para uso neste pedido são emulsões esqualeno/água contendo opcionalmente quantidades variáveis de MTP-PE, por exemplo, uma emulsão óleo-em-água submícron contendo 4-5% p/v de esqualeno, 0,25-1,0% p/v de TWEEN 80™ (monooleato de polioxietilenossorbitano) e/ou SPAN 85™ 0,25-1,0% (trioleato de sorbitano) e, opcionalmente, N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'- dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosfoforiloxi)-etilamina (MTP-PE), por exemplo, a emulsão óleo-em-água submicron conhecida como "MF59"(Publicação Internacional N° WO 90/14837; Patente U.S. N° 6.299.884 e 6.451.325, e Ott e cols., em "Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach" (Powell, M.F. e Newman, M.J. eds.) Plenum Press, Nova York, 1995, pp. 277-296) . MF59 contém 4-5% p/v de esqualeno (por exemplo, 4,3%), 0,25-0,5% p/v de TWEEN 80™ e 0,5% p/v de SPAN 85™ e, opcionalmente, contém quantidades variáveis de MTP-PE, formulada em particulas submícron usando um microfluidificador como, por exemplo, o microfluidificador Modelo HOY (Microfluidics, Newton, MA) . Por exemplo, MTP-PE pode estar presente em uma quantidade de cerca de 0-500 pg/dose, mais preferivelmente 0-250 pg/dose e, principalmente, 0-100 pg/dose. Como aqui usado, o termo "MF59-0" refere-se à emulsão óleo-em-água submícron acima desprovida de MTP-PE, enquanto o termo MF59-MTP representa uma formulação que contém MTP-PE. Por exemplo, "MF59-100" contém 100 pg de MTP-PE por dose, e assim por diante. MF69, outra emulsão óleo-em-água submícron para uso neste pedido, contém 4,3% p/v de esqualeno, 0,25% p/v de TWEEN 8 0™, e 0,75% p/v de SPAN 85™ e, opcionalmente, MTP-PE. Ainda outra emulsão óleo- em-água submícron é MF75, também conhecida como SAF, que contém 10% de esqualeno, 0,4% de TWEEN 80™, 5% de polímero plurônico em bloco L121, e thr-MDP, também microfluidifiçada em uma emulsão submícron. MF75-MTP representa uma formulação de MF75 que inclui MTP, por exemplo, de 100-400 pg de MTP-PE por dose.

Emulsões óleo-em-água submícron, métodos de sua produção e agentes imunoestimulantes, por exemplo, muramil peptídeos, para uso nas composições, estão descritos em detalhes em WO 90/14837 e nas Patentes U.S. 6.299.884 e 6.451.325.

O adjuvante completo de Freund (CFA) e o adjuvante incompleto de Freund (IFA) também podem ser usados como adjuvantes na invenção.

C. Formulações de saponina

Formulações de saponina também podem ser usadas como adjuvantes na invenção. Saponinas são um grupo heterólogo de glicosídeos de esterol e glicosídeos de triterpenóide que são encontrados na casca, folhas, caules, raízes e até mesmo nas flores de uma ampla gama de espécies de plantas. Saponinas isoladas da casca da árvore Molina Quillaia saponaria foram amplamente estudadas como adjuvante. A saponina também pode ser obtida comercialmente de Smilax ornata (sarsaprilla) , Gypsophilla paniculata (mosquitinho - brides veil)e Saponaria officianalis (saponaria - soap root) . Formulações adjuvantes de saponina incluem formulações purificadas, por exemplo, QS21, além de formulações lipídicas, por exemplo, ISCOMs.

Composições de saponina foram purificadas com o uso de cromatografia em camada delgada de alto rendimento (HP- TLC) e cromatografia líquida de alto rendimento de fase reversa (RP-HPLC). Foram identificadas frações purificadas específicas com o uso dessas técnicas, incluindo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B e QH-C. De preferência, a saponina é QS21. Um método de produção de QS21 é revelado na Patente U.S. N° 5.057.540. As formulações de saponina também podem compreender um esterol, por exemplo, colesterol (veja WO 96/33739).

Combinações de saponinas e colesteróis podem ser usadas para formar partículas únicas denominadas complexos imunoestimulantes (ISCOMs). ISCOMs tipicamente também incluem um fosfolipídeo, por exemplo, fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina. Qualquer saponina conhecida pode ser usada em ISCOMs. De preferência, o ISCOM inclui um ou mais de Quil A, QHA e QHC. ISCOMs são ainda descritos em EP0109942, WO 96/11711 e WO 96/33739. Opcionalmente, os ISCOMs podem ser desprovidos de detergente (ou detergentes) adicional. Veja WO 00/07621.

Uma revisão do desenvolvimento de adjuvantes baseados em saponina pode ser encontrada em Barr, e cols., Advanced Drug Delivery Reviews(1998) 32: 247-271. Veja também Sjolander, e cols., Advanced Drug Delivery Reviews(1998) 32: 321-338.

D. Virossomas e partículas vírus-like (VLPs)

Virossomas e partículas vírus-like(VLPs) também podem ser usadas como adjuvantes na invenção. Essas estruturas geralmente contêm uma ou mais proteínas de um vírus, opcionalmente combinadas ou formuladas com um fosfolipídeo. Elas são geralmente não patogênicas, não replicantes e, geralmente, não contêm nada do genoma virai nativo. As proteínas virais podem ser produzidas de forma recombinante ou isoladas de vírus inteiros. Essas proteínas virais adequadas para uso em virossomas ou VLPs incluem proteínas derivadas do vírus influenza (por exemplo, HA ou NA) , do vírus da hepatite B (por exemplo, proteínas centrais ou do capsídeo), do vírus da hepatite E, do virus do sarampo, do virus Sindbis, de rotavirus, do virus da febre aftosa, de retrovirus, do virus de Norwalk, do virus do papiloma humano, do HIV, RNA-fagos, Qβ-fago (por exemplo, proteínas de revestimento), GA-fago, fr- fago, fago AP205 e Ty (por exemplo, proteína do retrotransposon Ty pl) . VLPs são discutidos ainda em WO 03/024480, WO 03/024481 e Niikura e cols., Virology (2002) 293: 273-280; Lenz e cols., Journal of Immunology (2001) 5.246-5.355; Pinto, e cols., Journal of Infectious Diseases (2003) 188: 327-338; e Gerber e cols., Journal of Virology (2001) 75(10): 4.752-4.760. Virossomas são discutidos ainda, por exemplo, em Gluck e cols., Vaccine (2002) 20: B10-B16. Virossomas de influenza imunopotencializadores reconstituídos (IRIV) são usadas como o sistema de liberação de antígeno de subunidade no produto intranasal trivalente INFLEXAL™ (Mischler &Metcalfe (2002) Vaccine20 Supl. 5: B17-23) e no produto INFLUVAC PLUS™.

E. Derivados bacterianos ou microbianos

Adjuvantes adequados para uso na invenção incluem derivados bacterianos ou microbianos como, por exemplo:

(1) Derivados atôxicos de lipopolissacarídeo enterobacteriano (LPS)

Esses derivados incluem monofosforil lipídeo A (MPL) e MPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL é uma mistura de monofosforil lipídeo A 3 des-O-acilado com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Um exemplo não limitante de uma "pequena partícula" de monofosforil lipídeo A 3 des-O-acilado é revelado em EP 0 689 454. Essas "pequenas partículas" de 3dMPL são suficientemente pequenas para serem esterilizadas por filtração através de uma membrana de 0,22 micron (veja EP 0 689 454). Outros derivados atóxicos de LPS incluem miméticos de monofosforil lipídeo A, por exemplo, derivados de fosfato de aminoalquil glicosaminida, por exemplo, RC-529. Veja Johnson e cols. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett.9: 2.273-2.278.

(2) Derivados de lipídeo A

Derivados delipídeo A incluem derivados de lipídeo A de Escherichia coli, por exemplo, OM-174. OM-174 é descrito, por exemplo, em Meraldi e cols., Vaccine(2003) 21: 2.485-2.491; e Pajak, e cols., Vaccine(2003) 21: 836- 842 .

(3) Oligonucleotídeos imunoestimulantes

Oligonucleotídeos imunoestimulantes adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem seqüências de nucleotídeos que contêm um motivo CpG (uma seqüência que contém uma citosina não metilada, seguida por guanosina, e ligada por uma ligação fosfato). RNA bacteriano de fita dupla ou oligonucleotídeos que contêm seqüências palindrômicas ou poli(dG) também demonstraram ser imunoestimulantes.

Os CpGs podem incluir modificações/análogos de nucleotídeos como, por exemplo, modificações fosf orotioato, e podem ser de fita dupla ou de fita simples. Opcionalmente, a guanosina pode ser substituída com um análogo como, por exemplo, 2'-desoxi-7- deazaguanosina. Veja Kandimalla, e cols., Nucleic Acids Research (2003) 31(9): 2.393-2.400; WO 02/26757 e WO 99/62923 para exemplos de possíveis substituições análogas. O efeito adjuvante de oligonucleotídeos CpG é ainda discutido em Krieg, Nature Medicine (2003) 9(7): 831-835; McCluskie, e cols., FEMS Immunology and Medical Microbiology (2002) 32: 179-185; WO 98/40100; Patente U.S. N° 6.207.646; Patente U.S. N° 6.239.116 e Patente U.S. N° 6.429.199.

A seqüência CpG pode ser dirigida a TLR9, por exemplo, o motivo GTCGTT ou TTCGTT. Veja Kandimalla, e cols., Biochemical Society Transactions (2003) 31 (parte 3): 654-658. A seqüência CpG pode ser específica para a indução de uma resposta imunológica Thl, por exemplo, um ODN CpG-A, ou ela pode ser mais específica para a indução de uma resposta de célula B, por exemplo, um ODN CpG-B. ODNs CpG-A e CpG-B são discutidos em Blackwell, e cols., J. Immunol. (2003) 170(8): 4.061-4.068; Krieg, TRENDS in Immunology (2002) 23(2): 64-65 e WO 01/95935. De preferência, o CpG é um ODN CpG-A.

De preferência, o oligonucleotídeo CpG é construído de forma que a extremidade 5'seja acessível para reconhecimento de receptor. Opcionalmente, duas seqüências de oligonucleotídeos CpG podem ser anexadas em suas extremidades 31 para formar "imunômeros". Veja, por exemplo, Kandimalla, e cols., BBRC (2003) 306: 948-953; Kandimalla, e cols., Biochemical Society Transactions (2003) 31 (parte 3): 664-658; Bhagat e cols., BBRC (2003) 300: 853-861 e WO 03/035836.

(4) Toxinas de ribosilação de ADP e derivados detoxificados destas

Toxinas bacterianas de ribosilação de ADP e derivados detoxificados destas podem ser usadas como adjuvantes na invenção. De preferência, a proteína é derivada de E. coli (ou seja, enterotoxina termolábil de E. coli"LT"), cólera ("CT") ou pertussis ("PT"). O uso de toxinas de ribosilação de ADP detoxifiçadas como adjuvantes mucosos ê descrito em WO 95/17211, e como adjuvantes parenterais em WO 98/42375. De preferência, o adjuvante é um mutante detoxifiçado de LT como, por exemplo, LT-K63, LT-R72 e LTR192G. O uso de toxinas de ribosilação de ADP e derivados detoxifiçados destas, particularmente LT-63 e LT-R72, como adjuvantes pode ser encontrado nas seguintes referências: Beignon, e cols., Infection and Immunity (2002) 70(6): 3.012-3.019; Pizza, e cols., Vaccine(2001) 19: 2.534-2.541; Pizza, e cols. , Int. J. Med. Microbiol. (2000) 290(4-5): 455-461; SchartonKersten e cols., Infection and Immunity(2000) 68(9): 5.306-5.313; Ryan e cols., Infection and Immunity(1999) 67(12): 6.270-6.280; Partidos e cols., Immunol. Lett.(1999) 67(3): 209-216; Peppoloni e cols., Vaccines(2003) 2(2): 285-293; e Pine e cols., (2002) J. Control Release(2002) 85 (1-3): 263-270. As referências numéricas para substituições de aminoácidos são baseadas preferivelmente nos alinhamentos das subunidades A e B de toxinas de ribosilação de ADP apresentados em Domenighini e cols., Mol. Microbiol. (1995) 15(6): 1.165-1.167.

F. Bioadesivos e mucoadesivos

Bioadesivos e mucoadesivos também podem ser usados como adjuvantes na invenção. Bioadesivos adequados incluem microesferas de ácido hialurônico esterificado (Singh e cols. (2001) J. Cont. Rele. 70: 267-276) ou mucoadesivos como, por exemplo, derivados entrecruzados de ácido poliacrílico, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, polissacarídeos e carboximetilcelulose. Quitosana e derivados desta também podem ser usados como adjuvantes na invenção. Veja WO 99/27960.

G. Micropartícuias

Micropartículas também podem ser usadas como adjuvantes na invenção. Micropartículas (ou seja, partículas de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 150 pm de diâmetro, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 30 pm de diâmetro, e de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 10 pm de diâmetro) , formadas por materiais que são biodegradáveis e atóxicos (por exemplo, um poli(ácido a-hidróxi) , um ácido polihidróxi butírico, um poliortoéster, um polianidrido, uma policaprolactona etc.), com poli(lactida-co-glicolida), são preferidas, opcionalmente tratadas para ter uma superfície carregada negativamente (por exemplo, com SDS) ou uma superfície carregada positivamente (por exemplo, com um detergente catiônico, por exemplo, CTAB).

H. Lipossomos

Exemplos de formulações de lipossomo adequadas para uso como adjuvantes são descritas na Patente U.S. N° 6.090.406, Patente U.S. N° 5.916.588 e EP 0 626 169.

I. Formulações de éter de polioxietileno e éster de polioxietileno

Adjuvantes adequados para uso na invenção incluem éteres de polioxietileno e ésteres de polioxietileno. WO 99/52549. Essas formulações ainda incluem tensoativos de éster de polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol (WO 01/21207) , além de tensoativos de éteres ou éster de polioxietileno alquil em combinação com pelo menos um tensoativo não iônico adicional como, por exemplo, um octoxinol (WO 01/21152).

Éteres de polioxietileno preferidos são selecionados do seguinte grupo: polioxietileno-9-lauril éter {laureth 9) , polioxietileno-9-esteoril éter, polioxietileno-8- esteoril éter, polioxietileno-4-lauril éter, polioxietileno-35-lauril éter e polioxietileno-23-lauril éter.

J. Polifosfazeno (PCPP)

Formulações de PCPP são descritas, por exemplo, em Andrianov e cols., "Preparation of hydrogel microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions", Biomaterials (1998) 19(1-3): 109-115 e Payne e cols., "Protein Release from Polyphophazene Matrices", Adv. Drug. Delivery Review (1998) 31(3): 185-196.

K. Mur ami 1 peptídeos

Exemplos de muramil peptídeos adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem N-acetil-muramil-L-treonil- D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-l-alanil-d- isoglutamina (nor-MDP) e N-acetilmuramil-l-alanil-d- isoglutaminil-l-alanina-2-(11-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3- hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE).

L. Compostos de imidazoquinolona

Exemplos de compostos de imidazoquinolona adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem, sem limitação, Imiquamod e seus homólogos, descritos com mais detalhe em Stanley, Clin. Exp. Dermatol.(2002) 27(7): 571-577 e Jones, Curr. Opin. Investig. Drugs(2003) 4(2): 214-218; e Patentes U.S. 4.689.338, 5.389.640, 5.268.376, 4.929.624, 5.266.575, 5.352.784, 5.494.916, 5.482.936, 5.346.905, 5.395.937, 5.238.944, e 5.525.612.

M. Compostos de tiossemicarbazona.

Exemplos de compostos de tiossemicarbazona, bem como métodos de formulação, fabricação e seleção de compostos adequados para uso como adjuvantes na invenção, incluem aqueles descritos em WO 04/60308. As tiossemicarbazonas são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano para a produção de citocinas, por exemplo, TNF-a.

N. Compostos de triptantrina.

Exemplos de compostos de triptantrina, bem como métodos de formulação, fabricação e seleção de compostos adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem aqueles descritos em WO 04/64759. Os compostos de triptantrina são particularmente eficazes na estimulação de células mononucleares do sangue periférico humano para a produção de citocinas, por exemplo, TNF-a.

A invenção também pode compreender combinações dos adjuvantes identificados acima. Por exemplo, as seguintes composições de adjuvantes podem ser usadas na invenção: (1) uma saponina e uma emulsão óleo-em-água (WO 99/11241); (2) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado atóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) (veja WO 94/00153); (3) uma saponina (por exemplo, QS21) + um derivado atóxico de LPS (por exemplo, 3dMPL) + um colesterol; (4) uma saponina (por exemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + um esterol) (WO 98/57659); (5) combinações de 3dMPL com, por exemplo, QS21 e/ou emulsões óleo-em-água (veja os Pedidos de patente européia 0835318, 0735898 e 0761231); (6) SAF, que contém Esqualano 10%, Tween 80 0,4%, polímero em bloco-plurônico 5% L121 e thr-MDP, microfluidizado em uma emulsão submicron ou turbilhonado para gerar uma emulsão com tamanho de partícula maior. (7) Sistema adjuvante RIBI™ (RAS), (Ribi Immunochem), que contém esqualeno 2%, Tween 8 0 0,2%, e um ou mais componentes da parede celular bacteriana do grupo que consiste em monofosforilipídeo A (MPL), dimicolato de trehalose (TDM), e esqueleto da parede celular (CWS), preferivelmente MPL + CWS (DETOX™) ; e (8) um ou mais sais minerais (por exemplo, um sal de alumínio) + um derivado atóxico de LPS (por exemplo, 3dPML). (9) um ou mais sais minerais (por exemplo, um sal de alumínio) + um oligonucleotídeo imunoestimulante (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos que inclui um motivo CpG).

O. Imunomoduladores humanos

Imunomoduladores humanos adequados para uso como adjuvantes na invenção incluem citocinas, por exemplo, interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 etc.), interferons (por exemplo, interferon- y), fator de estimulação de colônias de macrófagos e fator de necrose tumoral.

Sais de alumínio e MF59 são adjuvantes preferidos para uso com vacinas injetáveis de influenza. Toxinas bacterianas e bioadesivos são adjuvantes preferidos para uso com vacinas de liberação mucosa, por exemplo, vacinas nasais.

O conteúdo de todas as patentes, pedidos de patente e artigos de revistas científicas citados acima é incorporado por referência como se aqui totalmente citado.

Métodos terapêuticos

A invenção fornece as composições descritas acima para uso em terapia. A invenção fornece as composições descritas acima para indução ou aumento de uma resposta imune ao S. pyogenes.A invenção fornece métodos para indução ou aumento de uma resposta imune ao S. pyogenes com o uso das composições descritas acima. A resposta imune é preferivelmente protetora e pode incluir anticorpos e/ou imunidade mediada por células (incluindo imunidade sistêmica e mucosa). Respostas imunes incluem respostas de reforço.

Adolescentes e crianças, incluindo bebês e nenéns, podem receber uma vacina para uso profilático; vacinas terapêuticas tipicamente são administradas aos adolescentes ou adultos. Uma vacina destinada às crianças também pode ser administrada aos adultos, por exemplo, para avaliar a segurança, dosagem, imunogenicidade etc.

Doenças causadas por Streptococcus pyogenesque podem ser evitadas ou tratadas de acordo com a invenção incluem, sem limitação, faringite (por exemplo, inflamação na garganta estreptocócica), escarlatina, impetigo, erisipelas, celulite, septicemia, síndrome de choque tóxico, fascite necrotizante, e seqüelas como, por exemplo, febre reumática e glomerulonefrite aguda. As composições também podem ser eficazes contra outras bactérias estreptocócicas, por exemplo, GBS.

Testes para determinar a eficácia da resposta imune

Uma forma de avaliar a eficácia do tratamento terapêutico envolve o monitoramento da infecção por GAS após administração da composição da invenção. Uma forma de avaliar a eficácia do tratamento profilático envolve o monitoramento das respostas imunes contra as proteínas de SLO mutantes nas composições da invenção após administração da composição.

Outra forma de avaliar a imunogenicidade das proteínas componentes das composições imunogênicas da presente invenção é a expressão de proteínas de SLO mutantes recombinantemente e para avaliar o soro ou secreções mucosas do paciente por imunoblot. Uma reação positiva entre a proteína e o soro do paciente indica que o paciente desenvolveu previamente uma resposta imune à proteína em questão; ou seja, a proteína é um imunógeno. Esse método também pode ser usado para identificar proteínas e/ou epítopos imunodominantes.

Outra forma de verificar a eficácia do tratamento terapêutico envolve o monitoramento da infecção por GAS após administração das composições da invenção. Uma forma de verificar a eficácia do tratamento profilático envolve o monitoramento de respostas imunes tanto sistemicamente (por exemplo, monitoramento do nível de produção de IgGl e IgG2a) e nas mucosas (por exemplo, monitoramento do nível de produção de IgA) contra SLO após administração da composição. Tipicamente, respostas de anticorpo soro- específica são determinadas pós-imunização, mas pré- ataque, enquanto respostas corporais específicas para mucosas são determinadas pós-imunização e pós-ataque.

As composições de vacina da presente invenção podem ser avaliadas em modelos animais in vitro e in vivo antes da administração ao hospedeiro, por exemplo, um ser humano. Modelos em camundongo particularmente úteis incluem aqueles nos quais a imunização intraperitoneal é seguida por ataque intraperitoneal ou ataque intranasal.

A eficácia das composições imunogênicas da invenção também pode ser determinada por modelos animais de imunização in vivo (por exemplo, porquinhos-da-índia ou camundongo) com as composições imunogênicas e verificando- se o nível de proteção obtido após ataque com GAS.

Modelos de eficácia in vivo incluem, sem limitação: (i) um modelo de infecção murídeo usando sorotipos de GAS humano; (ii) um modelo de doença murídeo que é um modelo murídeo que utiliza uma cepa de GAS adaptada ao camundongo, por exemplo, a cepa M23, que é particularmente virulenta em camundongos, e (iii) um modelo em primata que usa isolados de GAS humano.

A resposta imune pode ser uma ou ambas de uma resposta imune TH1 e uma resposta imune TH2. A resposta imune pode ser uma resposta imune aprimorada ou aumentada ou alterada. A resposta imune pode ser uma ou ambas de uma resposta imune sistêmica e uma resposta imune mucosa. De preferência, a resposta imune é ima resposta sistêmica e/ou mucosa aumentada.

Uma imunidade sistêmica e/ou mucosa aumentada é refletida em uma resposta imune TH1 e/ou TH2 aumentada. De preferência, a resposta imune aumentada inclui um aumento na produção de IgGl e/ou IgG2a e/ou IgA.

De preferência, a resposta imune mucosa é uma resposta imune TH2. De preferência, a resposta imune mucosa inclui um aumento na produção de IgA.

Células TH2 ativadas aumentam a produção de anticorpo e são, portanto, de valor na resposta às infecções extracelulares. Células TH2 ativadas podem secretar um ou mais de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Uma resposta imune TH2 pode resultar na produção de IgGl, IgE, IgA e células B de memória para proteção futura.

Uma resposta imune TH2 pode incluir (um ou mais de) um aumento em uma ou mais das citocinas associadas a uma resposta imune TH2 (por exemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) ou um aumento na produção de IgGl, IgE, IgA e células B de memória. De preferência, a resposta imune TH2 aumentada incluirás um aumento na produção de IgGl.

Uma resposta imune TH1 pode incluir um ou mais de um aumento em CTLs, um aumento em uma ou mais das citocinas associadas a uma resposta imune TH1 (por exemplo, IL-2, IFNy, e TNFβ, um aumento em macrófagos ativados, um aumento na atividade de NK ou um aumento na produção de IgG2a. De preferência, a resposta imune TH1 aumentada incluirá um aumento na produção de IgG2a.

As composições imunogênicas da invenção, em particular, a composição imunogênica que compreende uma ou mais proteínas de SLO mutantes da presente invenção, podem ser usadas tanto isoladamente quanto em combinação com outros antígenos de GAS opcionalmente com um agente imunorregulador capaz de despertar uma resposta Thl e/ou Th2.

A invenção também compreende uma composição imunogênica que compreende um ou mais agentes imunorreguladores, por exemplo, um sal mineral, por exemplo, um sal de alumínio e um oligonucleotídeo contendo um motivo CpG. Principalmente, a composição imunogênica inclui tanto um sal de alumínio quanto um oligonucleotídeo contendo um motivo CpG. Alternativamente, a composição imunogênica inclui uma toxina de ribosilação de ADP, por exemplo, uma toxina de ribosilação de ADP detoxificada e um oligonucleotídeo contendo um motivo CpG. De preferência, um ou mais dos agentes imunorreguladores incluem um adjuvante. 0 adjuvante pode ser selecionado de um ou mais do grupo que consiste em um adjuvante de TH1 e um adjuvante de TH2.

As composições da invenção preferivelmente despertarão tanto uma resposta imune mediada por células quanto uma resposta imune humoral a fim de tratar eficazmente uma infecção por GAS. Essa resposta imune preferivelmente induzirá uma imunidade de anticorpos de longo prazo (por exemplo, neutralizantes) e uma imunidade mediada por células que podem responder rapidamente mediante exposição a um ou mais antígenos de GAS.

Em uma modalidade particularmente preferida, a composição imunogênica compreende uma ou mais proteínas de SLO mutantes que despertam uma resposta de anticorpos neutralizantes e uma ou mais proteínas de SLO mutantes que despertam uma resposta imune mediada por células. Dessa forma, a resposta de anticorpos neutralizantes evita ou inibe uma infecção inicial por GAS, enquanto a resposta imune mediada por células capaz de despertar uma resposta celular Thl aumentada evita a disseminação posterior da infecção por GAS.

As composições da invenção geralmente serão administradas diretamente a um paciente. As composições da presente invenção podem ser administradas, isoladamente ou como parte de uma composição, por maio de diversas vias diferentes. Certas vias podem ser favoráveis a certas composições, resultando na geração de uma resposta imune mais eficaz, preferivelmente uma resposta de CMI, ou tendo uma menor probabilidade de induzir efeitos colaterais ou ter administração mais fácil.

Os métodos de liberação incluem a injeção parenteral (por exemplo, uma injeção subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular ou intersticial) e administração retal, oral (por exemplo, comprimido, spray), vaginal, tópica, transdérmica (por exemplo, veja WO 99/27961), transcutânea (por exemplo, veja WO 02/074244 e WO 02/064162), intranasal (por exemplo, veja WO 03/028760), ocular, aural e pulmonar ou outra administração mucosa.

Apenas como exemplo, as composições da presente invenção podem ser administradas por meio de uma via sistêmica ou por uma via mucosa ou uma via transdérmica, ou podem ser administradas diretamente em um tecido específico. Como aqui usado, o termo "administração sistêmica"inclui, sem limitação, quaisquer vias parenterais de administração. Em particular, a administração parenteral inclui, sem limitação, injeção subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, intramuscular ou intra-esternal, técnicas de infusão intravenosa, intra-arterial ou por diálise renal. De preferência, a administração parenteral, sistêmica, é por injeção intramuscular. Como aqui usado, o termo "administração mucosa"inclui, sem limitação, a administração oral, intranasal, intravaginal, intra-retal, intratraqueal, intestinal e oftálmica.

A dosagem do tratamento pode ser um esquema de dose única ou um esquema de doses múltiplas. Doses múltiplas podem ser usadas em um esquema de imunização primária e/ou em um esquema de imunização de reforço. Em um esquema de doses múltiplas, as várias doses podem ser dadas pela mesma via ou por vias diferentes, por exemplo, uma dose de sensibilização parenteral e um reforço mucoso, uma dose mucosa de sensibilização e uma dose parenteral de reforço etc.

As composições da invenção podem ser preparadas de várias formas. Por exemplo, a composição pode ser preparada como um injetável, como uma solução ou uma suspensão líquida. Formas sólidas adequadas à solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas (por exemplo, uma composição liofilizada) . A composição pode ser preparada para administração oral, por exemplo, um comprimido ou uma cápsula, como um spray ou como um xarope (opcionalmente flavorizado). Uma composição pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, como um inalador, com o uso de um pó fino ou um spray. Uma composição pode ser preparada como um supositório ou pessário. Uma composição pode ser preparada para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como gotas. Uma composição pode ser na forma de kit, projetado de tal forma que uma composição combinada seja reconstituída imediatamente antes da administração a um paciente. Esses kits podem compreender uma ou mais SLO mutantes ou outros antígenos em forma líquida e um ou mais antígenos liofilizados.

Composições imunogênicas usadas como vacinas podem compreender uma quantidade imunologicamente eficaz de uma SLO mutante ou outros antígenos (ou moléculas de ácido nucléico que codifica os antígenos), bem como quaisquer outros componentes, como necessário, por exemplo, antibióticos. Uma "quantidade imunologicamente eficaz" é uma quantidade que, quando administrada a um indivíduo, tanto como uma dose única quando como parte de uma série, aumenta uma resposta imune mensurável ou evita ou reduz um sintoma clínico.

As composições imunogênicas da presente invenção podem ser administradas em combinação com um regime de tratamento antibiótico. Em uma modalidade, o antibiótico é administrado antes da administração do antígeno da invenção ou da composição que compreende uma ou mais proteínas de SLO mutantes da invenção.

Em outra modalidade, o antibiótico é administrado após a administração de uma proteína de SLO mutante da invenção. Exemplos de antibióticos adequados para uso no tratamento de uma infecção por GAS incluem, sem limitação, penicilina, ou um derivado desta, ou clindamicina, cefalosporinas, glicopeptídeos (por exemplo, vancomicina), e cicloserina.

A quantidade de agente ativo em uma composição varia, no entanto, dependendo da saúde e da condição física do indivíduo a ser tratado, da idade, do grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata etc.), da capacidade do sistema imune do indivíduo para sintetizar anticorpos, do grau de proteção desejado, da formulação da vacina, da avaliação do médico responsável pelo tratamento da situação médica, e de outros fatores relevantes. A quantidade cairá em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada por meio de experimentos de rotina.

Kits

A invenção também fornece kits que compreendem um ou mais recipientes de composições da invenção. As composições podem estar em forma líquida ou podem estar liofilizadas, bem como antígenos individuais. Recipientes adequados para as composições incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados por vários materiais, incluindo vidro ou plástico. Um recipiente pode ter uma entrada de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa ou frasco de solução intravenosa que possui uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica).

O kit pode ainda compreender um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer ou solução de dextrose. Ele também pode conter outros materiais úteis ao usuário final, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. O kit também pode compreender um segundo ou terceiro recipiente com outro agente ativo, por exemplo, um antibiótico.

O kit também pode compreender uma bula que contém instruções escritas para os métodos de indução de imunidade contra S. pyogenesou para o tratamento de infecções por S. pyogenes.A bula pode ser um rascunho de bula não aprovado ou pode ser uma bula aprovada pela "Food and Drug Administration" (FDA - agência governamental americana que regula e fiscaliza a fabricação de comestíveis, drogas e cosméticos) ou outra agência reguladora.

Todas as patentes, pedidos de patente e referências citadas nessa revelação são expressamente aqui incorporadas por referência. A revelação acima escreve de forma geral a presente invenção. Uma compreensão mais detalhada pode ser obtida por referência aos exemplos específicos seguintes, que são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não visam limitar o escopo da invenção.

EXEMPLO 1 Clonagem de proteínas de SLO do tipo selvagem e mutantes

Genes que codifica proteínas de SLO do tipo selvagem e mutantes foram amplificados por PCR usando os iniciadores do genoma de SF370 mostrado na Tabela 1.

Os produtos de PCR foram digeridos com NheT-XhoT e ligados com o vetor pet24b+ (Novagen) cortado com as mesmas enzimas. Células eletrocompetentes de E. coli DH5a foram transformadas com as reações de ligação. Foi adicionado meio LBPTK e, após incubação por 1 h a 37°C, com agitação a 250 rpm, as bactérias foram plaqueadas sobre placas de LBPTK contendo 50 pg/ml de canamicina. As colônias positivas foram identificadas por PCR da colônia.

Plasmídeos der colônias positivas foram preparados a partir de uma cultura de um dia para o outro em meio LBPTK contendo 50 pg/ml de canamicina e analisados por seqüenciamento de DNA, que confirmou o gene do inserto esperado sob o promotor de T7 polimerase. As seqüências de DNA e da proteína finais dos genes clonados são mostradas na listagem de seqüências. Veja Tabela 2.

Células competentes de E. coli BL21(DE3) (Novagen) foram transformadas com a construção correta. Foi adicionado meio LBPTK e, após incubação por 1 h a 37°C, com agitação a 250 rpm, as bactérias foram plaqueadas sobre placas de LBPTK contendo 50 pg/ml de canamicina. Células BL21(DE3) pet24b + SLO do tipo selvagem sem tagforam desenvolvidas a 25 °C e induzidas com 1 mM de IPTG. A expressão do clone foi verificada por SDS-PAGE (sem tag, FIGS. 8A e 8B; com tag de His, FIG. 9).

EXEMPLO 2 Purificação de proteínas com tag de His

Os péletes de E. coliforam suspensos em tampão de lise e misturados por 30-40 minutos em temperatura ambiente. Os lisados foram centrifugados a 30-40.000 x g por 20-25 minutos, e os sobrenadantes foram carregados em colunas equilibradas com tampão de lavagem A (Poly-Prep com 1 ml de resina de Fluxo Rápido Quelante de Sefarose Ativada por Ni) . A resina carregada foi lavada três vezes com tampão de lavagem A e três vezes com tampão de lavagem B. As proteínas foram eluídas com tampão de eluição em tubos de Eppendorf contendo 2 mM finais de DTT. As proteínas após eluição total foram quantificadas com reagente de Bradford e depois analisadas por eletroforese em gel de SDS- poliacrilamida (FIGS. 8 e 9).

Tampões

Tampão de quebra (Use) : 10 ml de B-PER™ (Reagente de Extração de Proteína Bacteriana, catálogo Pierce. 78266) Concentração final de MgCl2 de 0,1 mM DNAsi I (catálogo Sigma D-4263): 100 unidades Lisozima (catálogo Sigma L-7651): concentração final de 1 mg/ml Tampão de lavagem A: 50 mM de NaH2PO4, 3 00 mM de NaCI, pH 8,0 Tampão de lavagem B: 20 mM de imidazol, 50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCI, pH 8,0 Tampão de eluição: 250 mM de imidazol, 50 mM de NaH2PO4, 3 00 mM de NaCI, pH 8,0

EXEMPLO 3 Purificação de proteínas sem tag Preparação do lisado

Aproximadamente 80-110 g de pélete de cultura bacteriana foram suspensos em 200-280 ml de reagente B- PER™ (Pierce) suplementado com 6 comprimidos de inibidor de protease COMPLETE®, 10 ml de EDTA 0,2 M pH 7,5 (concentração final de 5 mM) , 10 ml de uma solução de 100 mg/ml de lisozima, 8 ml de uma solução de 10.000 K unidades/ml de DNAse I e 1 ml de uma solução de 50 mM de MgCl2. A lise bacteriana foi obtida por agitação da suspensão bacteriana por 60 minutos, até que fosse obtida uma suspensão homogênea.

Após centrifugação por 60 minutos a 13.000 rpm (25.400 x g) , o sobrenadante foi filtrado usando um filtro de 0,22 pm e é diluído com H20 até que fosse obtida uma condutividade de 1,8-1,9 mS. O pH foi ajustado até 8,0. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford. Cromatografia por troca aniônica O sobrenadante derivado do lisado tratado como descrito acima foi carregado em uma coluna de Sefarose Q HP 50/10 (aproximadamente 200 ml), equilibrada previamente com 30 mM de TRIS, pH 8,0. 0 fluxo foi coletado. As frações contendo proteína GAS25 foram reunidas em pool e dialisadas contra 10 mM de fosfato de Na, pH 6,8. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford. Tampão A: 30 mM de TRIS, pH 8,0 Tampão B: 30 mM TRIS, 1 M de NaCI, pH 8,0 Equilíbrio e carga: 0% de B Gradiente: 0-25% de B em 5 volumes de coluna (VC) - 25% de B 2 VC Lavagem: 100% de B 2 VC + 3 VC Fluxo: 20 ml/min Volume da fração: 14 ml Cromatografia com hidroxilapatita O pool obtido previamente foi carregado em uma coluna CHT20 equilibrada previamente com 10 mM de Na-fosfato, pH 6,8. 0 fluxo foi coletado. Tampão A: 10 mM de Na-fosfato, pH 6,8 Tampão B: 500 mM de Na fosfato, pH 6 8 Lavagem: 8 VC Lavagem: 30% de B 6 VC Gradiente: 30-100% de B (10 VC) Lavagem: 100% de B Fluxo: 5 ml/min. Volume da fração: 5 ml Alíquotas da fração foram carregadas em géis de Critério 12% sob condições redutoras e não redutoras. As frações contendo proteína GAS25 foram reunidas em pool e a concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford. Cromatografia por filtração em gel O pool coletado foi concentrado usando um filtro Amicon a fim de obter um volume < 10 ml. 0 material concentrado foi carregado em uma HiLoad Superdex 200 26/60 equilibrada com pelo menos 3-4 de volumes de coluna de PBS. Tampão: PBS Eluição: Isocrática Fluxo: 2,5 ml/min. Volume da fração: 5 ml As frações contendo proteína GAS25 foram reunidas em pool e a concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford. Uma estimativa adicional da concentração de proteína foi realizada por medida UV considerando Abs 0,1% (=1 g/l) 1,119. A pureza da proteína foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida (FIG. 11).

EXEMPLO 4 Ensaios hemolíticos

Protocolo para ensaio hemolítico quantitativo

Foram preparadas diluições seriais de toxina em placas de 96 poços com fundos em forma de "U" usando PBS + BSA 0,5%. Um ml de sangue de carneiro foi lavado três vezes em PBS (com centrifugação a 3.000 x g) , e as células sangüíneas foram suspensas em 5 ml de PBS. Um volume igual de suspensão foi adicionado a 50 pl de cada diluição da toxina, e incubado a 37°C por 3 0 min. Triton (2%) em água foi usado para gerar 100% de hemólise, e PBS + BSA 0,5% foi usado como controle negativo. As placas foram então centrifugadas por 5 min a 1.000 x g, e o sobrenadante foi transferido cuidadosamente para placas de 96 poços com fundo plano. A absorbância foi lida a 540 nm. Comparação de extratos de E. coli que contêm SLO do tipo selvagem e mutante de SLO P427L

O gene que codifica SLO P427L foi amplificado usando PCR a partir do genoma de SF370 Ml e clonado no vetor pET21b+, o que permitiu a expressão em E. coli BL21DE3 da proteína com tagde His. Os extratos solúveis de E. coli que expressa quantidades similares das proteínas de estreptolisina O do tipo selvagem e mutadas (veja FIG. 5) foram usados para realizar um ensaio hemolítico para comparar as propriedades citolíticas dos dois antígenos. O resultado do ensaio é mostrado na FIG. 2, que demonstra que a proteína mutada é pelo menos 100 vezes menos toxica do que a do tipo selvagem.

Comparação de SLO do tipo selvagem e mutante de SLO P427L purificadas O mutante de SLO P427L foi purificado de acordo com procedimentos de purificação padronizados para proteínas recombinantes com tagde His (FIG. 3). Concentrações diferentes das proteínas do tipo selvagem e mutadas purificadas foram usadas para repetir o ensaio hemolítico, que confirmou a atividade citolítica diminuída (FIG. 4).

Atividade hemolítica de extratos de E. coli que contêm SLO do tipo selvagem e mutante de SLO P427L com tag de His e sem tag

Comparamos a atividade hemolítica de lisados de E. coli transformados com SLO recombinante do tipo selvagem (rSLO) sem um tag de His (BL21 DE3, Novagen N° 71382 - pET24) e rSLO mutante P427L sem um tag de His (BL21 DE3, 5 Novagen N° 71382 - pET24) . E. coli BL21 DE3 (Novagen, N° 71382) transformada com pET24 sem inserto foi usada como controle negativo. 0 controle positivo foi uma solução hipotônica contendo Triton 2% em água. O controle negativo foi o tampão de diluição da proteína (PBS contendo BSA 10 0,5%, pH 7,4).

A hemólise foi determinada por medida da absorbância a 540 nm (A540nm) dos sobrenadantes. A titulação foi calculada como a diluição com 50% da A540nra máxima.

Os resultados são mostrados nas Tabelas 3 e 4 e na

FIG. 6. Esses dados demonstram que, sob as mesmas condições, P427L mutante é 1.000 vezes menos hemolítica do que SLO do tipo selvagem.

Comparação de SLO do tipo selvagem e vários mutantes de SLO

A atividade hemolitica de SLO do tipo selvagem foi comparada com a atividade hemolitica de vários mutantes de 5 SLO diferentes. Os resultados são mostrados na FIG. 13 e na Tabela 5, abaixo. Uma unidade hemolitica (HU) é definida como a quantidade de toxina necessária para obter 50% da lise máxima obtida por tratamento das células sangüíneas com Triton 2%.

Em função das diferenças na pureza da proteína, as unidades de hemólise/mg de mutantes indicadas em negrito estão superestimadas; no entanto, fica claro que (1) W535F mutante é menos hemolitica do que o mutante C530G; (2) o mutante P427L é cerca de 1.000 vezes menos hemolítico do que a do tipo selvagem e cerca de 6-25 vezes menos hemolítico do que outros dois mutantes W535F e C530G; e (3) o mutante AA248 é certamente menos hemolítico do que a do tipo selvagem).

Efeito do colesterol Duas diluições seriais de cinco vezes em PBS-BSA 0,5% de lisados de E. coli ou em lisado de E. coli com 200 mg/ml de colesterol obtidos após o crescimento da células a 30°C e indução com 1 mM de IPTG a 25°C e OD600nm de cerca de 0,4- 0,6, foram testadas quanto à sua atividade hemolítica. Cinqüenta microlitros de uma solução de eritrócitos de carneiro 2% em PBS foram tratados com um volume igual de preparações de proteína obtidas por lise das bactérias, 3 horas após indução, com tampão de lise (solução B-PER- PIERCE- 1 mM de MgCl2, 100.000 unidades/ml de DNAse (Sigma) e lisozima (Sigma) por 30-40 minutos. A fração insolúvel foi então centrifugada (15 minutos, 21.000 x g, 4°C), e o sobrenadante (lisado de E. coli) foi transferido para um novo tubo de Eppendorf contendo DTT em uma concentração final de 5 mM.

Sob essa condição, colesterol não inibiu SLO do tipo selvagem ou mutante até que fosse usado um fator de diluição de 100 vezes; dessa forma, não houve efeitos sobre a lise induzida pelo mutante. Em contraste, a lise induzida por SLO do tipo selvagem foi acentuadamente reduzida. A lise induzida pelo controle negativo não foi influenciada pelo colesterol, o que sugere que a inibição induzida pelo colesterol é específica. Veja a Tabela 6 e a FIG. 7.

EXEMPLO 5 Inibição de hemólise Protocolo

Diluições seriais de duas vezes de soros de camundongos imunizados com proteínas de SLO do tipo selvagem ou mutantes (sem adjuvantes ou com Alume ou MF59™ como adjuvantes) foram preparadas em placas de 96 poços com fundos em forma de "U" usando PBS + BSA 0,5%. Os soros dos camundongos imunizados com PBS ou com adjuvante isoladamente, como adequado, foram usados como controle negativos. Um volume igual de uma solução de 50-100 ng/ml de toxina (3,5-7 HU) em PBS + BSA 0,5% foi adicionada, e as placas foram incubadas em temperatura ambiente por 20 minutos sob agitação (800 rpm). Após incubação, 50 ml dessa solução foram transferidos para uma nova placa de 96 poços, e um volume igual de uma suspensão de células sangüíneas vermelhas de carneiro (lavada 3 x em PBS) foi adicionada e incubada a 37°C por 30 min. As placas foram então centrifugadas por 1 min a 1.000 x g, o sobrenadante foi cuidadosamente transferido para as placas de 96 poços com fundo plano, e a absorbância foi lida a 54 0 nm. Nos resultados descritos abaixo, a titulação da inibição é expressa como a diluição dos soros que reduziu a hemólise induzida por Triton em 50%.

Inibição de hemólise por SLO por antissoros de SLO do tipo selvagem

A inibição de hemólise por SLO por antissoros anti-SLO do tipo selvagem é mostrada na FIG. 14, FIG. 15, FIG. 16 e Tabelas 7-9. Titulações de soros anti-SLO estão incluídas entre 1/7.000 e 1/14.000 (média aritmética, 1/12.167 + 2.714. As titulações dos soros do controle negativo 5 (adjuvante de Freund) estão incluídas entre 1/375 e 1/4.000 (média aritmética, 1/1.854 + 1.384).

Titulação da atividade hemolítica de SLO do tipo selvagem, SLO do tipo selvagem quimicamente detoxifiçada e mutantes de SLO

A titulação da atividade hemolítica de SLO do tipo selvagem, SLO do tipo selvagem quimicamente detoxificada e mutantes de SLO (P427L; P427L + W535F) é mostrada nas FIGS. 17-19 e na Tabela 10.

Inibição de hemõlise por SLO por antissoro contra proteínas de SLO mutantes

A inibição de hemólise por SLO por antissoros contra proteínas de SLO mutantes é mostrada nas FIGS. 20-22 e nas 5 Tabelas 11-13. Com o uso de 50 ng/ml (3,5 HU) de toxina, a diluição do soro necessária para obter 50% de redução da atividade hemolitica de SLO for mutante de SLO W535-P427L é de 1/17.860 com o uso de adjuvante Alume e de 1/7991 com o uso do adjuvante MF59™. As titulações do controle negativo 10 (somente adjuvante) são de 1/1.000 (Alume) e 1/125 (MF59™)

Uma comparação das diluições dos soros necessárias para obter 50% de redução da atividade hemolítica de SLO para SLO do tipo selvagem e mutante de SLO W535-P427L, ambas usando adjuvante Alume, é mostrada na FIG. 25. Com o uso de 100 ng/ml (7 HU) de toxina, a diluição sérica necessária para obter 50% de redução da atividade hemolítica de SLO para o mutante de SLO W535-P427L é de 1/12000, comparada com uma diluição sérica de 1/8.750 ± 1.500. A diluição controle negativo (somente adjuvante) é de cerca de 1/50.

EXEMPLO 6 Experimentos de proteção in vivo

A proteína de SLO P427L purificada, junto com adjuvante de Freund, foi administrada por via intraperitoneal a 40 camundongos. Os camundongos foram então atacados por via intranasal com a cepa de GAS 3348 Ml. A Tabela 14 registra os dados obtidos em 3 experimentos separados, mostrando que 100% de proteção eram obtidos de forma consistente em todos os experimentos.

Grupos de 10-20 camundongos foram imunizados com 20 pg da proteína recombinante nos dias 0, 21 e 35. Os camundongos de grupos de controle negativo foram imunizados somente com GST ou com contaminantes de E. cole, dependendo 5 da versão da proteína de GAS recombinante usada. Duas semanas após a terceira imunização foram coletadas amostras de sangue. Poucos dias depois, os camundongos imunizados foram atacados por via intranasal com 108 UFC (50 pl) das cepas de GAS Ml 3348. A sobrevida dos camundongos foi 10 monitorada por um período de 10-14 dias. Os soros imunes obtidos dos diferentes grupos foram testados quanto a imunogenicidade em toda a proteína SLO recombinante (análise western blot). Os resultados são mostrados nas Tabelas 15 e 16.

Proteção contra ataque intranasal com a cepa de GAS M.l por mutante de SLO P427L-W535F Trinta camundongos foram imunizados por via intraperitoneal com o mutante de SLO P427L-W535F, com Alume ou MF59 como adjuvantes, e atacados por via intranasal com uma cepa GAS Ml. Os resultados são mostrados na FIG. 26. Setenta e sete por cento dos camundongos imunizados com o mutante de SLO P427L-W535F e Alume estavam protegidos contra ataque intranasal com uma cepa de GAS Ml, quando comparados com 3% dos camundongos do controle negativo (imunizados apenas com adjuvante). Noventa por cento dos camundongos imunizados com o mutante de SLO P427L W535F e MF59 estavam protegidos contra ataque intranasal com uma cepa de GAS Ml, quando comparados com 10% dos camundongos do controle negativo (imunizados apenas com adjuvante). Esses níveis de proteção são comparáveis com aqueles obtidos por imunização dos camundongos com SLO do tipo selvagem.

EXEMPLO 7 Protocolos

Injeção intravenosa de SLO. Uma solução de SLO do tipo selvagem ou mutante em PBS é diluída em uma solução de PBS + 2 mM de DTT, e depois 100 pl são injetados na veia da cauda de um camundongo. Os camundongos são observados por 2-3 dias. A injeção de SLO do tipo selvagem tipicamente resulta em morte em poucos minutos.

Ensaio de inibição da letalidade in vivo. Para a inibição da letalidade mediada por soros imunes, 10 pg/camundongo de SLO do tipo selvagem (uma solução de 100 pg/ml em PBS, 2 mM de DTT) são incubados por 20 minutos com rotação "end over end"em temperatura ambiente com soro anti-SLO ou soro de controle (obtido de camundongos imunizados somente com adjuvante). Após incubação, as amostras são inoculadas nos camundongos por injeção intravenosa na veia da cauda. Os camundongos são observados por 2-3 dias.

Os resultados para SLO do tipo selvagem e SLO mutante P427L-W535F são mostrados na Tabela 17.

Tabela 17.

A toxicidade aguda in vivo foi avaliada usando uma dose de 10 pg/camundongo de SLO do tipo selvagem como controle positivo e injeção somente de adjuvante de Freund como controle negativo. Dez pg/camundongo de SLO do tipo 5 selvagem foram incubados com antissoro para SLO do tipo selvagem ou com soro de controle, e inoculados nos camundongos como descrito acima. Os resultados são mostrados na Tabela 18

Os resultados de outro conjunto de experimentos realizados como descrito acima são mostrados nas Tabelas 19 e 20. A toxicidade aguda in vivo foi avaliada usando 5 ou pg/camundongo de SLO do tipo selvagem. Em particular, 10 pg/camundongo de SLO do tipo selvagem foram pré-incubados com soros de camundongos imunizados com GAS25 P427L-W535F ou apenas PBS (sem soro) . Além disso, 5 pg/camundongo de SLO do tipo selvagem foram pré-incubados com soros de camundongos imunizados com GAS25 P427L-W535F ou soros de camundongos imunizados com PBS mais adjuvante (Alume), as soro de controle negativo.

Os resultados demonstram que doses letais de SLO do tipo selvagem são neutralizadas por soros anti-SLO P427L- W535F, mas não por soros de controle negativo na mesma diluição.

EXEMPLO 8 Imunização com SLO P427L-W535F protege camundongos contra injeção intravenosa de SLO do tipo selvagem

Camundongos com cinco semanas de idade foram imunizados por via intraperitoneal três vezes (dia 0, dia 21 e dia 35) com SLO do tipo selvagem ou com o mutante de SLO P427L-W535F usando alume como um adjuvante (20 pg de proteína em 2 mg/ml de hidróxido de alumínio) . Os 5 camundongos imunizados somente com adjuvante foram usados como controle negativo. No dia 55, os camundongos receberam uma injeção intravenosa com diferentes concentrações de uma solução de SLO do tipo selvagem em PBS, 2 mM de DTT, e foram monitorados por pelo menos 72 horas. Os resultados 10 são mostrados na Tabela 21.

Uma dose de 5 pg/camundongo de SLO do tipo selvagem é letal para camundongos imunizados somente com adjuvante; esses camundongos morreram em poucos minutos após injeção de SLO. No entanto, até mesmo 20 pg/camundongo da mesma preparação de SLO do tipo selvagem não mataram camundongos 5 imunizados com SLO do tipo selvagem ou com o mutante de SLO P427L-W535F.

Claims (16)

1. Proteína de estreptolisina 0 (SLO) mutante purificada, caracterizadapor compreender alterações de aminoácido nas posições de aminoácidos P427 e W535, em que as posições de aminoácidos são numeradas de acordo com o SEQ ID NO: 1 e em que a atividade hemolítica da proteína de SLO mutante está reduzida em pelo menos 50% em relação à SLO do tipo selvagem.

2. Proteína de SLO mutante purificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapor compreender uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 2 7.

3. Proteína de SLO mutante purificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapor estar acoplada a uma proteína transportadora.

4. Proteína de SLO mutante purificada, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadapelo fato de que a proteína transportadora é selecionada do grupo que consiste em uma toxina bacteriana, um toxóide bacteriano, uma proteína da membrana externa de N. meningitidis, uma proteína do choque térmico, uma proteína de pertussis, proteína D de H. influenzae,uma citocina, uma linfocina, um hormônio, um fator de crescimento, toxina A de C. difficile,toxina B de C. difficilee uma proteína de captação de ferro.

5. Molécula de ácido nucléico, caracterizadapor codificar a proteína de SLO mutante como definida na reivindicação 1.

6. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de que a proteína de SLO mutante compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste no SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 27.

7. Molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapor compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo de sequências codificadoras mostradas na SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34.

8. Composição de vacina, caracterizadapor compreender: (a) um agente ativo selecionado de: (i) proteína de estreptolisina 0 (SLO) mutante purificada compreendendo alterações de aminoácido na posição P427 e W535, em que as posições de aminoácidos são numeradas de acordo com o SEQ ID NO: 1 e em que a atividade hemolitica da proteína de SLO mutante está reduzida em pelo menos 50% em relação à SLO do tipo selvagem; e (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica a proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

9. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadaainda por compreender um ou mais agentes ativos selecionados do grupo que consiste em: (iii) um antígeno de GAS; (iv)uma molécula de ácido nucléico que codifica um antígeno de GAS. (v) um agente ativo que é útil em uma vacina pediátrica, como um antígeno polipeptídico de um patógeno selecionado do grupo que consiste em antígenos polipeptídicos de N. meningitidis , S. pneumoniae, Bordetella pertussis, Moraxella catarrhalis, Clostridium tetani, Chorinebacterim diphteriae, vírus sincicial respiratório, vírus da pólio, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus da rubéola e rotavirus; ou uma molécula de ácido nucléico que codifica O antígeno polipeptídico; e (iv) um agente ativo que é útil em uma vacina para idosos ou indivíduos imunocomprometidos, como um antígeno polipeptídico de um patógeno selecionado do grupo que consiste em antígenos polipeptídicos de Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, virus da influenza e virus da parainfluenza; e uma molécula de ácido nucléico que codifica o antigeno polipeptidico.

10. Método de produção de uma vacina para prevenção ou tratamento de infecção por Streptococcus pyogenes, caracterizadopor compreender: (a) um agente ativo selecionado de: (i) uma proteina de estreptolisina O (SLO) mutante purificada que compreende alterações de aminoácido nas posições de aminoácidos P427 e W535, em que as posições de aminoácidos são numeradas de acordo com o SEQ ID NO: 1 e em que a atividade hemolítica da proteina de SLO mutante está reduzida em pelo menos em relação à SLO do tipo selvagem; e (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica a proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada; e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente ativo é a proteína de SLO mutante purificada e a proteína de SLO mutante é feita por um método que compreende: (a) o cultivo de uma célula hospedeira que compreende uma construção de expressão que codifica a proteína de SLO mutante; e (b) a recuperação da proteína de SLO mutante.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado ainda por compreender a combinação com o veículo farmaceuticamente aceitável de um ou mais agentes ativos selecionados do grupo que consiste em: (iii) um antígeno de GAS; e (iv) uma molécula de ácido nucléico que codifica um antígeno de GAS.

13. Uso de um agente ativo caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecção por Streptococcus pyogenes, caracterizado pelo fato de que o agente ativo é selecionado do grupo que consiste em: (i) uma proteína de estreptolisina 0 (SLO) mutante purificada que compreende alterações de aminoácido nas posições de aminoácidos P427 e W535, em que as posições de aminoácidos são numeradas de acordo com a SEQ ID NO: 1 e em que a atividade hemolitica da proteina de SLO mutante está reduzida em pelo menos em relação à SLO do tipo selvagem; e (ii) uma molécula de ácido nucléico que codifica a proteina de estreptolisina 0 (SLO) mutante purificada.

14. Proteina de SLO mutante purificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou uma molécula de ácido nucléico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizada por ser usada como uma vacina.

15. Proteina de SLO mutante purificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, molécula de ácido nucléico, acordo com qualquer uma das reivindicações 5, a 7, ou composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizadas por serem usadas em terapia.

16. Proteina de SLO mutante purificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, molécula de ácido nucléico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, ou composição de vacina, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizadas por serem usadas para o tratamento ou prevenção de infecção por Streptococcus pyogenes.

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