DE69534252T2

DE69534252T2 - Enzyme zur spaltung der verankerungsregion von oberflächenproteinen aus gram-positiven bakterien

Info

Publication number: DE69534252T2
Application number: DE69534252T
Authority: DE
Inventors: A. Vincent FISCHETTI; Vijaykumar Pancholi
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-10-06
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2015-10-07
Also published as: AU697227B2; DE69534252D1; ES2240979T3; EP0804559A4; PT804559E; EP0804559B1; EP0804559A1; ATE296877T1; AU3824095A; JPH10506795A; CA2201616A1; US5968763A; WO1996011263A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Enzym zum Spalten eines Oberflächen-Proteins eines gram-positiven Bakteriums innerhalb der Wandverankerungs-Region, ein Verfahren zum Nachweis dieses Enzyms und ein Verfahren zur Reinigung dieses Enzyms. Insbesondere wird das Enzym aus einem Streptococcus der Gruppe A isoliert und spaltet die Ankerregion des Streptococcus-M-Proteins.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Bakterien können auf der Grundlage der Färbung ihrer Zellwände mit Gram-Farbe als gram-positiv und als gram-negativ bezeichnet werden. Innerhalb der breiten Abteilung der gram-positiven Bakterien befinden sich gram-positive Kokken, welche die Gattungen Aerococcus, Corprococcus, Deinobacter, Deinococcus, Enterococcus, Gemella, Lactococcus, Leuconostoc, Marinococcus, Melissococcus, Micrococcus, Pediococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Planococcus, Ruminococcus, Saccharococcus, Salinicoccus, Carcina, Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Trichococcus, Vagococcus, Listeria und Actinomyces einschließen.
In gram-positiven Bakterien werden Proteine in das umgebende Medium sekretiert, wohingegen in gram-negativen Bakterien die Sekretion in den periplasmatischen Raum zwischen der zytoplasmatischen und äußeren Membran stattfindet (Model und Russel (1990) Cell 61: 739–741; Schatz und Beckwith (1990) Annu. Rev. Genet. 24: 215–248). Prokaryotische Sortierungssignale sind für die lokale Anordnung von supramolekularen Strukturen wie Pili (Strom und Lory, (1987) J. Bacteriol. 169: 3181–3188), Flagella (Loewy et al. (1987) Genes Dev. 1: 626–635) und Bakteriophagen (Brissette und Russel (1990) J. Mol. Biol. 211: 565–580) oder für die Anordnung von Proteinen in definierten bakteriellen Kompartimenten denkbar. Derartige Kompartimente schließen die äußere Membran von gram-negativen Bakterien (Model und Russel (1990) Cell 61: 739–741), die Zellwand (Braun et al. (1970) Eur. J. Biochem. 13: 336–346; Eur. J. Biochem. 14: 387–391; Biochemistry 9: 5041–5049; Shockman und Barrett (1983) Annu. Rev. Microbiol. 37: 501–527) und den periseptalen Annulus (MacAlister et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 1372–1376) ein.
Man kann sich demgemäß vorstellen, dass die Zellwand von gram-positiven Bakterien ein einziges Zellkompartiment darstellt, das verankerte Oberflächen-Proteine enthält, die spezifische Sortierungssignale erfordern. Einige biologisch wichtige Produkte sind auf diese Weise verankert, einschließlich Protein A und Fibronektin-bindender Proteine von Staphylococcus aureus und M-Protein von Streptococcus pyogenes. Untersuchungen von Staphylococcus-Protein A und E. coli-alkalischer Phosphatase zeigen, dass das Signal, das für die Zellwandverankerung sowohl erforderlich als auch hinreichend ist, aus einem LPXTGX-Motiv (SEQ ID NO: 1), einer C-terminalen hydrophoben Domäne und einem geladenen Schwanz besteht. Diese Sequenzelemente sind in vielen Oberflächen-Proteinen aus verschiedenen gram-positiven Bakterien konserviert.
M-Protein von Streptokokken der Gruppe A, ein α-helikales superspiralisiertes fibrilläres Molekül, das auf der Oberfläche des Organismus gefunden wird (Fischetti et al. (1988) Proteins Struct. Func. Genet. 3: 60), ist für die antiphagozytische Eigenschaft dieser Bakterien verantwortlich (Lancefield et al. (1962) J. Immunol. 89: 307). Die antigene Variation (Jones et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 45: 8271) und Typen-spezifische Immunität sind von Epitopen abhängig, die innerhalb der NH₂-terminalen Hälfte des M-Moleküls angeordnet sind (distal zur Zellwand) (Jones et al. (1988) J. Exp. Med. 167: 1114). Aminosäuresequenzen, die unter verschiedenen M-Proteinen konserviert sind, sind in der COOH-terminalen Hälfte angeordnet (Jones et al. (1985) J. Exp. Med. 161: 623; Hollingshead et al. (1987) Infect. Immun. 55: 3237) und enthalten Epitope, von denen kürzlich gezeigt wurde, dass sie für eine nicht-Typen-spezifische Immunität gegen eine Streptokokken-Besiedelung verantwortlich sind (Bessen et al. (1988) Infect. Immun. 56: 2666; Fischetti et al. (1989) Science (Wash. DC) 244: 1487).
Die Anbringungsregion des Moleküls, die aus der DNA-Sequenz vorhergesagt wurde, ist am COOH-terminalen Ende angeordnet, das aus geladenen Aminosäuren am COOH-Terminus zusammengesetzt ist, gefolgt von 19 hydrophoben Aminosäuren, von denen vermutet wird, dass sie ein Membrananker sind, gefolgt von einem Hexapeptid-Motiv, LPXTGX. Diese Region grenzt an eine Prolin- und Glycin-reiche Region an, die innerhalb der Peptidoglycan-Schicht der Zellwand angeordnet ist (Fischetti (1988) Proteins Struct. Func. Genet. 3: 60; Pancholi et al. (1988) J. Bacteriol. 170: 2618; Hollingshead et al. (1986), J. Biol. Chem. 161: 1677).
Die Assoziation des M-Proteins von gram-positiven Bakterien mit der zytoplasmatischen Membran kann nach Entfernen der Zellwand mit dem muralytischen Enzym Lysin überprüft werden (Fischetti et al. (1974) Streptococcal Disease and the Community M. J. Haverkorn, Herausgeber. Excerpta Medica, Amsterdam. 26.), welches über einen breiten pH-Bereich gegen Zellwände der Streptokokken der Gruppe A wirksam ist. M-Protein wird während der Entfernung der Zellwand freigesetzt, was anzeigt, dass ein endogener Faktor diese Freisetzung vermittelt (Pancholi et al. (1989) J. Exp. Med. 170: 2119–2133).
Die Analyse der freigesetzten Form des M-Proteins demonstriert, dass die COOH-terminalen 19 hydrophoben Aminosäuren und der geladene Schwanz des M-Moleküls nicht vorliegen (Pancholi et al. (1989) J. Exp. Med. 170: 2119–2133). Dies legt nahe, dass die Freisetzung von M-Proteinen aus der Membran und ihre Anbringung an der Zellwand auf irgendeine Weise mit der Abspaltung der COOH-terminalen hydrophoben Region verbunden ist.
Es wurde gezeigt, dass die Spaltung der Oberflächen-Proteine von gram-positiven Bakterien in der LPXTGX-Region, die an die hydrophobe Domäne angrenzt, beim Verankerungsprozess dieser Proteine stattfindet (Schneewind et al. (1992) Cell 70: 267–281). Da eine Störung dieser Spaltung die korrekte Platzierung der Oberflächen-Proteine auf der Bakterienzelle verhindert, wäre die Charakterisierung des Enzyms, das für diese Spaltung verantwortlich ist, ein kritischer Schritt bei einer Antibiotikum-Entwicklung.
Pancholi et al. (J. Exp. Med. 170(6): 2119–2133 (1989)) beschreiben eine endogene Membrananker-spaltende Enzymaktivität mit der Fähigkeit, M-Protein aus isolierten Streptococcus-Protoplasten freizusetzen. Die Freisetzung von M-Protein-Molekülen findet statt, wenn die mit M-Protein beladenen Protoplasten in Raffinose-Puffer bei pH 7,4 gegeben werden. Tests bestätigen, dass die Anker-spaltende Enzymaktivität membrangebunden ist, wahrscheinlich ein unversehrtes Membran-Molekül. Es werden auch Belege präsentiert, die eine Sequenzähnlichkeit zwischen dem M-Protein und gewissen GPI-verankerten Proteinen in der Region anzeigen, die für die Proteinverankerung verantwortlich ist.
Lee et al. (Infect. & Immun. 60(10): 4032–4039 (1992)) beschreiben, wie ganze Zellen und Protoplasten von Spreptococcus mutans in der Lage sind, ihre Oberflächen-Proteine auf pH-abhängige Weise mit einer optimalen Freisetzung bei pH 5 bis 6 freizusetzen. Eine Analyse zeigte auf, dass die freigesetzten Proteine sehr komplex waren und dass die Freisetzung von Adhäsin P1 wahrscheinlich nicht auf einer proteolytischen Aktivität beruhte.
Die US-A-4598044 beschreibt ein chromogenes Peptid, um die Proteaseaktivität zu testen.
Die US-A-5235039 beschreibt verschiedene allgemeine Enzymassays für zahlreiche Proben.
Es ist deshalb offensichtlich, dass auf diesem Gebiet ein Verfahren zum Nachweis und zur Isolierung dieses Oberflächen-Protein-Spaltungsenyzms von gram-positiven Bakterien benötigt wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß ist ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung, ein isoliertes und gereinigtes Enzym bereitzustellen, das Oberflächenproteine von gram-positiven Bakterien innerhalb des LPXTGX-Motivs spaltet.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Antikörper bereitzustellen, der gegen das Spaltungsenzym von gram-positiven Bakterien gerichtet ist.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit des innerhalb des LPXTGX-Motivs spaltenden Enzyms von gram-positiven Bakterien bereitzustellen.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Isolierung eines Enzyms bereitzustellen, das Oberflächen-Proteine auf gram-positiven Bakterien spaltet.
Kurz gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Enzym, das ein Oberflächen-Protein auf gram-positiven Bakterien spaltet, und ein Verfahren zu dessen Nachweis, welches die Schritte einschließt: (a) Synthetisieren eines Peptids, das eine Aminosäuresequenz LPXTGX umfasst; (b) Markieren des Peptids von Schritt (a) mit einer nachweisbaren Markierung; (c) kovalentes Verknüpfen des markierten Peptids mit einer Chromatographieperle; (d) Mischen der verknüpften Perlen mit einem Membran-Extrakt von gram-positiven Bakterien; (e) Nachweisen einer Freisetzung von Markierung aus den Perlen; und (f) Korrelieren der Freisetzung von Markierung mit der Anwesenheit des Enzyms.
Die Erfindung betrifft auch Antikörper, die auf das Spaltungsenzym gerichtet sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Isolierung des Spaltungsenzyms, welches die Schritte einschließt: (a) Herstellen eines Membran-Extrakts der gram-positiven Bakterien, der membrangebundene Proteine enthält; (b) Fraktionieren der membrangebundenen Proteine durch Chromatographie unter Verwendung eines Salzgradienten; und (c) Identifizieren der Anwesenheit des Enzyms in mindestens einer Fraktion.
Mit den vorangehenden und weiteren Zielen, Vorteilen und Merkmalen der Erfindung, die nachstehend offensichtlich werden, kann die Natur der Erfindung mit Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und auf die beigefügten Ansprüche klarer verstanden werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Dosis-Antwort-Kurve mit dem dialysierten Carbonat-Extrakt von D471-Membranen.
2 ist eine Zeit-Antwort-Kurve unter Verwendung eines Carbonat-Extrakts von D471-Membranen.
3 zeigt die Spaltungsaktivität des Enzyms in Anwesenheit von Enzyminhibitoren und -aktivatoren.
CPM = Zählrate pro Minute
DTT = Dithiothreit
ZnCl₂ = Zinkchlorid
CdOAc = Cadmiumacetat
CaCl₂ = Calciumchlorid
pHMB = Parahydroxyquecksilber(II)-benzoesäure
pHMPS = Parahydroxyquecksilber(II)-phenylsulfonsäure
4 ist ein Schema, das die Anordnung des Oberflächen-Proteins in der Bakterienmembran und den Spaltungsschritt veranschaulicht, der zu infektiösen Bakterien führt. Ein Antibiotikum, das gegen den Spaltungsschritt gerichtet ist, hat nicht-infektiöse Bakterien zum Ergebnis.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis und zur Reinigung eines Spaltungsenzyms, das Oberflächen-Proteine von gram-positiven Bakterien bei einem bekannten Motiv, vorzugsweise einem LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Motiv spaltet, und betrifft auch das gereinigte Spaltungsenzym selbst.
Das Spaltungsenzym kann aus irgendeinem gram-positiven Bakterium isoliert werden. Derartige gram-positive Bakterien umfassen die Gattungen Aerococcus, Corprococcus, Deinobacter, Deinococcus, Enterococcus, Gemella, Lactococcus, Leuconostoc, Marinococcus, Melissococcus, Micrococcus, Pediococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Planococcus, Ruminococcus, Saccharococcus, Salinicoccus, Carcina, Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Trichococcus, Vagococcus, Listeria und Actinomyces. Gram-positive Bakterien, von denen bekannt ist, dass sie Oberflächen-Proteine aufweisen, die ein LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Motiv enthalten, sind die folgenden:
Eine bevorzugtere Art für die vorliegende Erfindung ist Streptococcus pyogenes und am bevorzugtesten M Typ 6.
Protoplasten können durch irgendein in der Technik bekanntes Mittel aus den Bakterien präpariert werden. Die Kultur wird in irgendeinem Medium gezüchtet, von dem bekannt ist, dass es das Wachstum der speziellen Art aufrechterhält, bevorzugt Todd-Hewitt-Nährbrühe. Die Zellen werden dann abzentrifugiert und gewaschen. Die Zellen werden dann in einem Phosphat-Puffer resuspendiert, der bevorzugt 20–100 mM, am bevorzugtesten etwa 50 mM und bevorzugt Raffinose zu etwa 10–50%, bevorzugt etwa 30%, oder Saccharose zu etwa 10–30%, bevorzugt etwa 20%, und EDTA enthält. Dann wird ein Enzym, das für den Abbau der Zellwand spezifisch ist, vorzugsweise ein Phagen-assoziiertes Streptococcus-Gruppe C-Lysin, dazugegeben und mindestens 30 Minuten lang bei etwa 37°C inkubiert.
Membranen können aus den Protoplasten unter Verwendung jedes in der Technik bekannten Verfahrens präpariert werden, aber bevorzugt durch wiederholte Frost-Tau-Behandlungen in Anwesenheit von Protease-Inhibitoren. Die Membranen werden dann durch Zentrifugation bei etwa 100.000 × g gesammelt, gewaschen und dann in Anwesenheit von Protease-Inhibitoren erneut sedimentiert.
Als Verfahren zur Analyse der Spaltungsaktivität des Enzyms und insbesondere zur Analyse der Aktivität von Spaltungsenzym-Mutanten können Ziel-Oberflächen-Moleküle hergestellt werden, indem man die Oberflächen-Moleküle unter Verwendung irgendeines in der Technik bekannten Verfahrens aus der Membran freisetzt. Vorzugsweise kann das Oberflächen-Molekül durch Behandlung der Membranen mit Natriumcarbonat bei einem pH > 9, bevorzugt > 11, am bevorzugtesten etwa 11,5, freigesetzt werden.
Die Anwesenheit von Oberflächen-Protein, besonders M-Protein, im Überstand kann unter Verwendung jedes in der Technik bekannten Verfahrens identifiziert werden, einschließlich einer Auftrennung auf SDS-PAGE-Gel, Western-Blot, Enzyme-linked-immunosorbent-Assay (ELISA), Einfang-ELISA, RIA und dergleichen. Antikörper zum Nachweis von M-Protein sind in der Technik verfügbar und umfassen polyklonale Seren, wie dasjenige gegen ColiM6.1-Protein (Fischetti et al. (1984) J. Exp. Med. 159: 108); polyklonale Seren gegen ein synthetisches Peptid, das Resten des M-Proteins entspricht, wie den Resten 1–21 (Jones et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8271), oder Anti-SM6 (308–327) gegen die Reste 308–327, Anti-SM6 (339–352) gegen die Reste 339–352 oder Anti-SM6 (381–398) gegen die Reste 381–398; oder den monoklonalen Antikörper 10B6 gegen ein Epitop in der konservierten Region des M-Moleküls zwischen den Resten 275 und 289.
Im Allgemeinen werden die monoklonalen Antikörper bei einer Verdünnung von 1 : 100–1 : 10.000, bevorzugt etwa 1 : 1000 verwendet, und polyklonale Seren werden bei einer Verdünnung von etwa 1 : 50–1 : 5000, bevorzugt etwa 1 : 500 verwendet.
Das Spaltungsenzym wird bevorzugt durch Herstellen eines nachweisbar markierten synthetischen Substrats nachgewiesen. Das markierte synthetische Substrat enthält bevorzugt eine LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Sequenz und enthält bevorzugter eine LPSTGE-(SEQ ID NO: 14)Sequenz. Verfahren zur Herstellung und Analyse eines derartigen synthetischen Peptids sind in der Technik wohlbekannt.
Das synthetische Peptid kann mit irgendeiner in der Technik bekannten Markierung markiert werden. Vorzugsweise ist diese Markierung ein Isotop, am bevorzugtesten ¹²⁵I. Das markierte synthetische Peptid wird dann bevorzugt an ein Substrat geknüpft, am bevorzugtesten eine kommerziell verfügbare Perle. Der Bakterienstamm, der das Spaltungsenzym enthält, wird behandelt, um die Bakterienmembran zu extrahieren. Vorzugsweise werden die Bakterienmembranen mit einem alkalischen Puffer, bevorzugt Carbonat-Puffer, bei einem pH von etwa 9–13, bevorzugt etwa 11,5, behandelt. Die Extraktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur unterhalb von Raumtemperatur, bevorzugt bei etwa 0°C durchgeführt. Der Membran-Extrakt wird dann in einem geeigneten Puffer mit den markierten Perlen gemischt, und die Freisetzung von Radiomarkierung aus dem gespalteten synthetischen Peptid wird analysiert.
Das Enzym wird unter Verwendung von in der Technik wohlbekannten Protein-Reinigungsverfahren aus dem Extrakt isoliert. Insbesondere wird der Membran-Extrakt, der die nachgewiesene Spaltungsaktivität enthält, chromatographischen Techniken unterzogen, welche die Proteine, die in dem Extrakt vorliegen, gemäß Größe, Affinität und Ladung auftrennen. Fraktionen, die aus jedem chromatographischen Schritt erhalten werden, werden bezüglich Spaltungsaktivität analysiert, wie oben beschrieben, und weiteren Reinigungsschritten unterzogen. Ein besonders vorzuziehendes Verfahren zum Erhalt von gereinigtem Spaltungsenzym ist Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC).
Nachdem das Enzym gereinigt worden ist, kann seine Aminosäuresequenz unter Verwendung von in der Technik wohlbekannten Aminosäure-Sequenzierungs verfahren bestimmt werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist der Edman-Abbau. Nachdem man die Sequenzinformation über das Spaltungsenzym erhalten hat, kann man Oligonukleotid-Sonden für die Isolierung der DNA, welche das Spaltungsenzym codiert, unter Verwendung herkömmlicher Durchmusterungsverfahren oder Amplifikationsverfahren, wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), konstruieren. Es ist besonders vorzuziehen, solche Oligonukleotide in einer vollständig degenerierten Weise zu konstruieren, so dass Oligonukleotide, die jedes Codon enthalten, das eine spezielle Aminosäure codiert, in der Oligonukleotid-Mischung vorliegen. Alternativ kann Inosin an Positionen in dem Codon verwendet werden, bei denen bekanntermaßen Degenerationen vorliegen.
Im Allgemeinen sind die Verfahren zur Isolierung der DNA, die das Spaltungsenzym codiert, zur Durchführung eines partiellen Verdaus, zur Isolierung von DNA-Fragmenten, zum Ligieren der Fragmente in einen Klonierungsvektor und zum Transformieren eines Wirts in der rekombinanten DNA-Technologie wohlbekannt. Demgemäß kann ein gewöhnlicher Fachmann die detaillierten Protokolle für solche Verfahren verwenden oder anpassen, wie sie in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 3 Bände, oder in jedem anderen Handbuch über rekombinante DNA-Technologie gefunden werden.
Wenn das Gen, welches das LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym codiert, aus einer Art erhalten worden ist, kann es als Hybridisierungssonde dienen, um entsprechende Gene durch Kreuzhybridisierung unter niedrigen bis mäßigen Stringenzbedingungen aus den anderen Arten zu isolieren. Derartige Bedingungen werden gewöhnlich empirisch durch Bestimmung der Bedingungen gefunden, bei denen die Sonde spezifisch mit ihrem Gegenstück-Gen mit einem Minimum an Hintergrund-Hybridisierung kreuzhybridisiert. Die Nukleinsäure-Hybridisierung ist eine wohlbekannte Technik und gründlich in Sambrook et al. in Einzelheiten angegeben.
Wie oben erwähnt, kann die DNA, die das Spaltungsenzym codiert, ursprünglich unter Verwendung von PCR isoliert werden. Entsprechende DNAs aus anderen Arten können ebenfalls unter Verwendung von PCR isoliert werden, und Oligonukleotide zur Durchführung dieser anschließenden PCR-Reaktionen können unter Verwendung der Sequenzinformation optimiert werden, die aus der aus der ersten Art klonierten DNA erhalten wurde.
Die Nukleinsäuren, welche die vorliegenden Gene in replizierbaren Expressionsvektoren codieren, und transformierte Wirte, welche diese Vektoren enthalten, können ebenfalls erzeugt werden. Die replizierbaren Expressionsvektoren können auch verwendet werden, um die Polypeptide der vorliegenden Erfindung durch in der rekombinanten DNA-Technologie wohlbekannte Verfahren zu erhalten.
Replizierbare Expressionsvektoren können Nukleinsäure umfassen, die das vorliegende Gen codiert, d. h. die codierende Sequenz ist operabel in einem geeigneten Leseraster mit einem Nukleotidsequenz-Element verknüpft, welches die Expression des Spaltungsenzyms lenkt. Insbesondere können die Nukleotidsequenz-Elemente einen Promotor, ein Transkriptions-Enhancerelement, ein Terminationssignal, ein Translationssignal oder eine Kombination von zwei oder mehr dieser Elemente enthalten, die im Allgemeinen mindestens ein Promotor-Element einschließt.
Replizierbare Expressionsvektoren sind allgemein DNA-Moleküle, die für eine gesteuerte Expression eines gewünschten Gens konstruiert werden, insbesondere wenn es wünschenswert ist, große Mengen eines speziellen Genprodukts oder Polypeptids zu erzeugen. Die Vektoren umfassen ein oder mehrere Nukleotidsequenzen, die operabel mit einem Gen zur Steuerung der Expression dieses Gens, wodurch das Gen exprimiert wird, und einem Replikationsstartpunkt verknüpft sind, der in dem betreffenden Wirt operabel ist. Bevorzugt codiert der Vektor einen selektierbaren Marker, z. B. eine Antibiotikum-Resistenz. Bei replizierbaren Expressionsvektoren kann es sich um Plasmide, Bakteriophagen, Cosmide und Viren handeln. Jeder Expressionsvektor, der RNA umfasst, wird ebenfalls in Betracht gezogen. Die replizierbaren Expressionsvektoren können das Spaltungsenzym in hohen Mengen exprimieren. Viele dieser Vektoren basieren auf pBR322, M13 und Lambda und sind in der Technik wohlbekannt und verwenden solche Promotoren wie trp, lac, P_L, T7-Polymerase und dergleichen. Deshalb steht dem Fachmann eine große Auswahl von replizierbaren Expressionsvektoren, kompatiblen Wirten und wohlbekannten Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Vektoren zur Verfügung.
Darüber hinaus werden auch Peptide und Fragmente sowie chemisch modifizierte Derivate des LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzyms in Betracht gezogen. Kurz gesagt, wird jedes Peptid-Fragment, -Derivat oder -Analogon, das im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität des LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzyms beibehält, in Betracht gezogen. Ein Analogon kann hierin als ein Peptid oder Fragment definiert werden, das eine LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsaktivität zeigt, aber im Vergleich zum Wildtyp-Spaltungsenzym eine Aminosäure-Substitution, -Insertion oder -Deletion aufweist. Ein derartiges Analogon kann durch die "konservative" Substitution einer Aminosäure mit ähnlichen chemischen Eigenschaften hergestellt werden.

So sollte auch anerkannt werden, dass nicht nur DNA-Sequenzen hergestellt werden können, die ein LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym mit der gleichen Aminosäuresequenz wie das Wildtyp-Enzym codieren, sondern es können auch diejenigen DNA-Sequenzen erzeugt werden, die zur Wildtyp-Sequenz degeneriert sind. Mit "degeneriert zu" ist gemeint, dass ein verschiedenes Dreibuchstaben-Codon verwendet wird, um eine spezielle Aminosäure festzulegen. Es ist in der Technik wohlbekannt, dass die folgenden Codons austauschbar verwendet werden können, um jede spezielle Aminosäure zu codieren:

Phenylalanin (Phe oder F)	UUU oder UUC
Leucin (Leu oder L)	UUA oder UUG oder CUU oder CUC oder CUA oder CUG
Isoleucin (Ile oder I)	AUU oder AUC oder AUA
Methionin (Met oder M)	AUG
Valin (Val oder V)	GUU oder GUC oder GUA oder GUG

Serin (Ser oder S)	UCU oder UCC oder UCA oder UCG oder AGU oder AGC
Prolin (Pro oder P)	CCU oder CCC oder CCA oder CCG
Threonin (Thr oder T)	ACU oder ACC oder ACA oder ACG
Alanin (Ala oder A)	GCU oder GCG oder GCA oder GCG
Tyrosin (Tyr oder Y)	UAU oder UAC
Histidin (His oder H)	CAU oder CAC
Glutamin (Gln oder Q)	CAA oder CAG
Asparagin (Asn oder N)	AAU oder AAC
Lysin (Lys oder K)	AAA oder AAG
Asparaginsäure (Asp oder D)	GAU oder GAC
Glutaminsäure (Glu oder E)	GAA oder GAG
Cystein (Cys oder C)	UGU oder UGC
Arginin (Arg oder R)	CGU oder CGC oder CGA oder CGG oder AGA oder AGG
Glycin (Gly oder G)	GGU oder GGC oder GGA oder GGG
Terminationscodon	UUA (Ochre) oder UAG (Amber) oder UGA (Opal)

Es sollte verstanden werden, dass die oben angegebenen Codons für RNA-Sequenzen gelten. Die entsprechenden Codons für DNA weisen T anstelle von U auf.
Mutationen können in der Wildtyp-Sequenz so vorgenommen werden, dass ein spezielles Codon zu einem Codon abgeändert wird, das eine verschiedene Aminosäure codiert. Eine derartige Mutation wird im Allgemeinen vorgenommen, indem so wenig wie möglich Nukleotidänderungen vorgenommen werden. Eine Substitutionsmutation dieser Art kann vorgenommen werden, um eine Aminosäure in dem resultierenden Protein auf nicht-konservative Weise (d. h. durch Änderung des Codons von einer Aminosäure, die zu einer Gruppierung von Aminosäuren mit einer speziellen Größe oder einem speziellen Merkmal gehört, zu einer Aminosäure, die zu einer anderen Gruppierung gehört) oder auf konservative Weise abzuändern (d. h. durch Änderung des Codons von einer Aminosäure, die zu einer Gruppierung von Aminosäuren mit einer speziellen Größe oder einem speziellen Merkmal gehört, zu einer Aminosäure, die zu derselben Gruppierung gehört). Ein derartiger konservativer Austausch führt im Allgemeinen zu weniger Änderung in der Struktur und Funktion des resultierenden Proteins. Eine nicht-konservative Änderung ändert mit mehr Wahrscheinlichkeit die Struktur, Aktivität oder Funktion des resultierenden Proteins.
Das Folgende ist ein Beispiel von verschiedenen Gruppierungen von Aminosäuren:
Aminosäuren mit unpolaren Gruppen R

Alananin
Valin
Leucin
Isoleucin
Prolin
Phenylalanin
Tryptophan
Methionin

Aminosäuren mit ungeladenen polaren Gruppen R

Glycin
Serin
Threonin
Cystein
Tyrosin
Asparagin
Glutamin

Aminosäuren mit geladenen polaren Gruppen R (negativ geladen bei pH 6,0)

Asparaginsäure
Glutaminsäure

Basische Aminosäuren (positiv geladen bei pH 6,0)

Lysin
Arginin
Histidin (bei pH 6,0)

Bei einer weiteren Gruppierung kann es sich um die Aminosäuren mit Phenylgruppen handeln:
Phenylalanin
Tryptophan
Tyrosin
Eine weitere Gruppierung kann gemäß dem Molekulargewicht vorgenommen werden (d. h. Größe der Gruppen R):

Glycin 75

Alanin 89

Serin 105

Prolin 115

Valin 117

Threonin 119

Cystein 121

Leucin 131

Isoleucin 131

Asparagin 132

Asparaginsäure 133

Glutamin 146

Lysin 146

Glutaminsäure 147

Methionin 149

Histidin (bei pH 6,0) 155

Phenylalanin 165

Arginin 174

Tyrosin 181

Tryptophan 204
Besonders bevorzugte Substitutionen sind:

– Lys für Arg und umgekehrt, so dass eine positive Ladung aufrechterhalten werden kann;
– Glu für Asp und umgekehrt, so dass eine negative Ladung aufrechterhalten werden kann;
– Ser für Thr, so dass ein freies -OH aufrechterhalten werden kann; und
– Gln für Asn, so dass ein freies -NH₂ aufrechterhalten werden kann.

Aminosäure-Substitutionen können auch eingeführt werden, um eine Aminosäure mit einer besonders vorzuziehenden Eigenschaft zu substituieren. Zum Beispiel kann ein Cys an einer potentiellen Stelle für eine Disulfid-Verbrückung mit einem weiteren Cys eingeführt werden. Ein His kann als eine besonders "katalytische" Stelle eingeführt werden (d. h. His kann als Säure oder Base wirken und ist die häufigste Aminosäure in der biochemischen Katalyse). Pro kann wegen seiner speziellen ebenen Struktur eingeführt werden, welche β-Windungen in der Struktur des Proteins induziert.
Die Reinigung des vorliegenden LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzyms aus natürlichen oder rekombinanten Quellen kann durch herkömmliche Reinigungsmaßnahmen, wie Ammoniumsulfat-Fällung, Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Adsorptionschromatographie, Affinitätschromatographie, Chromatofokussierung, HPLC, FPLC und dergleichen, vorgenommen werden, wobei geeignete Reinigungsschritte chargenweise oder in Säulen vorgenommen werden können.
Peptid-Fragmente des LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzyms können durch Proteolyse oder durch chemischen Abbau hergestellt werden. Typische proteolytische Enzyme sind Trypsin, Chymotrypsin, V8-Protease, Subtilisin und dergleichen; die Enzyme sind im Handel erhältlich, und Protokolle zur Durchführung eines proteolytischen Verdaus sind wohlbekannt. Peptid-Fragmente werden durch herkömmliche Mittel gereinigt, wie oben beschrieben. Peptid-Fragmente können häufig durch die Aminosäure-Zusammensetzung oder -Sequenz identifiziert werden. Peptid-Fragmente sind als Immunogene nützlich, um Antikörper gegen das vorliegenden LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper gegen das LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym. Derartige Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein und werden bei der Entwicklung von Nachweisassays (Immunoassays) für Spaltungsenzym-Proteine, der Überwachung der Spaltungsenzym-Mengen und bei der Reinigung von Spaltungsenzym als nützlich angesehen. Demgemäß umfasst gemäß dieser Erfindung ein Antikörper gegen ein LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen das LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym oder gegen antigene Teile desselben.
Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper gegen das LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym werden durch Immunisieren eines Tiers mit gereinigtem LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym, gereinigtem rekombinantem LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym, Fragmenten dieser Proteine oder gereinigten Fusionsproteinen des LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzyms mit einem weiteren Protein erhalten. Im Fall von monoklonalen Antikörpern können partiell gereinigte Proteine oder Fragmente als Immunogene dienen. Die Verfahren zum Erhalt beider Arten von Antikörpern sind in der Technik wohlbekannt, wobei ausgezeichnete Protokolle zur Antikörper-Produktion in Harlow et al. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 726 S., gefunden werden.
Polyklonale Seren werden relativ leicht durch Injektion einer wirksamen Menge des gereinigten LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzyms oder von Teilen desselben in ein geeignetes Labortier, Sammeln von Serum aus dem Tier und Isolieren von spezifischen Seren durch irgendeine der bekannten Immunoadsorbens-Techniken hergestellt. Antikörper, die durch dieses Verfahren erzeugt werden, sind praktisch in jeder Art von Immunoassay nützlich.
Monoklonale Antikörper sind besonders nützlich, da sie in großen Mengen und mit einem hohen Grad an Homogenität erzeugt werden können. Hybridom-Zelllinien, die monoklonale Antikörper erzeugen, werden durch Fusion einer unsterblichen Zelllinie mit Lymphozyten hergestellt, die gegen das immunogene Präparat sensibilisiert sind, und dies wird durch Techniken vorgenommen, die dem Fachmann wohlbekannt sind. (Siehe zum Beispiel Douillard, I. Y. und Hoffman, T., "Basic Facts About Hybridomas", in Compendium of Immunology, Band II, L. Schwanz (Hsg.) (1981); Köhler, G. und Milstein, C., Nature 256: 495–497 (1975) und European Journal of Immunology 6: 511–519 (1976); Harlow et al.; Koprowski et al., U.S. Patent 4,172,124; Koprowski et al., U.S. Patent 4,196,265 und Wands, U.S. Patent 4,271,145).
Die Anwesenheit des LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzyms in einer Probe, wie einem Kulturüberstand und dergleichen, in einem Mikroorganismus oder in irgendeiner anderen Quelle, von der vermutet wird, dass sie das LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym enthält, kann unter Verwendung von wie oben hergestellten Antikörpern, entweder monoklonalen oder polyklonalen, in praktisch jeder Art von Immunoassay nachgewiesen werden. Gleichermaßen können die vorliegenden Antikörper verwendet werden, um Mikroorganismen zu identifizieren, die das LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym aufweisen oder produzieren. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzyms durch die Schritte: In-Kontakt-Bringen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie das LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym enthält, mit einem Antikörper der Erfindung über eine Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um einen Enzym-Antikörper-Komplex zu bilden, und Einwirkenlassen eines Nachweismittels auf diesen Komplex. Wie es dem Fachmann wohlbekannt ist, sind die Zeit und die Bedingungen für Immunonachweis-Assays variabel und hängen von dem speziellen Assay ab.
Ein großer Bereich von Nachweistechniken und -bedingungen ist für den Fachmann erhältlich, wie mit Bezug auf die U.S. Patente Nr. 4,016,034; 4,424,279 und 4,018,653 an Harlow et al. gesehen werden kann, welche umfangreiche Protokolle für einen Immunonachweis von Molekülen bereitstellen. Diese Techniken umfassen natürlich sowohl Einzelstellen- als auch Zweistellen- oder "Sandwich"-Assays, Assays der nicht-kompetitiven Arten sowie kompetitive Bindungsassays, ELISA, Radioimmunassays, Immunfällung und Immunoblotting (Western-Blotting). Üblicherweise werden Sandwich-Assays verwendet, es gibt eine Anzahl von Abwandlungen der Technik, und alle sollen durch die vorliegende Erfindung eingeschlossen werden.
Direkte und indirekte Immunoassays, d. h. ELISA, Immunoblotting und dergleichen, können Reporter-Moleküle verwenden, die entweder an einen primären Antikörper (direkter Assay) oder an einen zweiten Antikörper oder ein Antikörper-spezifisches Protein, wie Protein A oder Protein G (indirekter Assay) geknüpft sind. Der primäre Antikörper kann ein Antikörper der vorliegenden Erfindung sein, der mit dem gewünschten Reporter-Molekül markiert ist.
Mit "Reporter-Molekül", wie hierin verwendet, ist ein Molekül gemeint, das durch seine chemische Natur ein identifizierbares Signal liefert, um Antigen-Antikörper-Komplexe nachzuweisen. Der Nachweis kann entweder qualitativ oder quantitativ sein. Die am häufigsten verwendeten Reporter-Moleküle sind entweder Enzyme, Fluorophore oder ein Radionukleid enthaltende Moleküle (d. h. Radioisotope). Im Fall eines Enzym-Immunoassays wird ein Enzym an den Antikörper konjugiert, im Allgemeinen mittels Glutaraldehyd oder Periodat. Wie man leicht erkennt, gibt es jedoch eine große Vielfalt von verschiedenen Konjugationstechniken, die für den Fachmann leicht verfügbar sind. Häufig verwendete Enzyme umfassen unter anderem Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase und alkalische Phosphatase. Das mit einem speziellen Enzym zu verwendende Substrat wird im Allgemeinen für die Erzeugung einer nachweisbaren Farbänderung bei der Reaktion gewählt. Beispielsweise ist p-Nitrophenylphosphat zur Verwendung mit alkalische Phosphatase-Konjugaten geeignet; für Peroxidase-Konjugate werden üblicherweise 1,2-Phenylendiamin, 5-Aminosalicylsäure oder Toluidin verwendet. Es ist auch möglich, anstelle der oben erwähnten chromogenen Substrate fluorogene Substrate zu verwenden, die ein fluoreszierendes Produkt liefern. Nach Binden eines Enzym-markierten Antikörpers an ein Antigen oder einen Antigen-Antikörper-Komplex, wie zutreffend, wird der überschüssige markierte Antikörper abgewaschen, und eine Lösung, die das geeignete Substrat enthält, wird dazugegeben. Das Substrat reagiert mit dem Enzym, d. h. dem Reporter-Molekül, um ein qualitatives visuelles Signal oder ein quantitatives Signal zu ergeben, das bewertet werden kann, um die in der Probe vorhandene Menge an Antigen anzuzeigen.
Alternativ können fluoreszierendes Verbindungen, wie Fluorescein und Rhodamin, chemisch an Antikörper ohne Änderung von deren Bindungsfähigkeit gekuppelt werden. Wie in der Immunofluoreszenz verwendet, absorbiert ein mit einem Fluorophor markierter Antikörper, wenn er durch Beleuchten mit Licht einer spezifischen Wellenlänge aktiviert wird, die Lichtenergie, was einen angeregten Zustand des Fluorophors induziert, dem eine Lichtemission mit einer charakteristischen Wellenlänge folgt. Im Allgemeinen ist das emittierte Licht eine charakteristische Farbe im sichtbaren Bereich und ist mit einem Lichtmikroskop nachweisbar, das für Immunofluoreszenz ausgestattet ist. Fluoreszierende Antikörper werden in Sandwich-Assays, direkten und indirekten Immunoassays verwendet, wie oben beschrieben, außer dass der Immunkomplex nach dem Waschen Licht der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird und die Fluoreszenz beobachtet wird. Immunofluoreszenz und Immunoassay-Techniken auf Enzym-Basis sind beide in der Technik gut etabliert und werden besonders bevorzugt. Jedoch können auch andere Reporter-Moleküle, wie Radioisotope, chemilumineszierende oder biolumineszierende Moleküle, verwendet werden. Es ist für den Fachmann leicht ersichtlich, wie das Verfahren zu variieren ist, um für den erforderlichen Zweck geeignet zu sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Mittel zur Reinigung eines LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzyms durch Affinitätsselektion bereit. Dieses Verfahren beinhaltet das In-Kontakt-Bringen einer Probe, die das LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym enthält, mit einem Antikörper der Erfindung und das Abtrennen des Antigen-Antikörper-Komplexes, zum Beispiel des Enzym-Antikörper-Komplexes, von dem Rest der Probe und die Gewinnung des Enzyms in freier Form aus dem Antikörper. Typisch wird die Komplex-haltige Probe fraktioniert, und die Fraktion(en), die das Enzym enthält bzw. enthalten, werden durch ein zweckmäßiges biochemisches, enzymatisches, immunologisches oder anderes Nachweismittel identifiziert. Um die Fraktionierung zu erleichtern, können die vorliegenden Antikörper vor oder nach dem Binden an das Spaltungsenzym an ein Chromatographieharz gebunden werden. Dieses Verfahren kann gereinigtes Spaltungsenzym in großen Mengen und in reiner Form liefern.
Demgemäß kann auch ein Kit für den raschen und bequemen Assay eines LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzyms in einer Probe, von der vermutet wird, dass sie das Enzym enthält, hergestellt werden. Das Kit kann entweder einen Antikörper, der gegen das LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym gerichtet ist, und einen zweiten nachweisbaren Antikörper dagegen enthalten oder kann ein markiertes Substrat für das Enzym enthalten, so dass ein markiertes Spaltungsprodukt in Anwesenheit des Spaltungsenzyms nachgewiesen wird.
Ein weiterer Aspekt ist auf ein Verfahren zum Nachweis der DNA oder RNA, die das vorliegende LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym codiert, durch Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken, wie Southern-Blotting, Northern-Blotting und dergleichen, oder durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gerichtet. Demgemäß wird ein Verfahren zum Nachweis eines Spaltungsenzyms bereitgestellt, welches umfasst, dass man eine Probe, von der vermutet wird, dass sie die das Spaltungsenzym codierende DNA enthält, mit einer ersten Nukleinsäure, die ausreichend komplementär ist, um mit einer zweiten Nukleinsäure zu hybridisieren, welche das Spaltungsenzym in der Probe codiert, über eine Zeit und unter Bedingungen in Kontakt bringt, die ausreichen, um die Hybridisierung zu bewirken und dadurch einen Komplex aus der ersten und der zweiten Nukleinsäure zu bilden, und den Komplex einem Nachweismittel aussetzt. In diesem Verfahren kann an der ersten Nukleinsäure eine Reporter-Gruppe angebracht sein. Reporter-Gruppen können Radioisotope, enzymatisch nachweisbare Gruppen, wie Biotin, oder Fluorophore, wie Rhodamin und Fluorescein, einschließen. Detaillierte Verfahren zur Hybridisierung und zum Blotting werden in Sambrook et al. gefunden.
Bei der PCR umfasst das Verfahren zum Nachweis eines Gens, welches das LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Spaltungsenzym codiert, dass man die Probe, von der vermutet wird, dass sie das Spaltungsenzym enthält, einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von mindestens zwei Oligonukleotid-Primern unterzieht, welche ausreichend komplementär sind, damit sie an eine Nukleinsäure in der Probe hybridisieren, welche das Spaltungsenzym codiert, und dadurch mindestens ein amplifiziertes Nukleinsäure-Segment erzeugt und das Segment identifiziert. Die PCR ist in U.S. Patent Nr. 4,683,195; 4,683,202; und 4,800,159 beschrieben worden, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden, sowie umfangreich in der Literatur beschrieben worden, siehe zum Beispiel Saiki et al. (1988), Science 239: 487–491. Das Segment kann beispielsweise durch Gelelektrophorese oder Blotting nachgewiesen werden.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung vollständiger zu erläutern. Sie sollten jedoch auf keine Weise als Beschränkung des breiten Schutzbereichs der Erfindung angesehen werden.
BEISPIEL 1
Herstellung eines synthetischen Substrats für den Nachweis der Spaltungsaktivität
Es wurde ein synthetisches Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 18) konstruiert:
KRQLPSTGETANPFY
Dieses Peptid wurde durch das Festphasenverfahren von Barany und Merrifield (1979) in Gross und J. Meienhofer, (Hsg.), Academic Press, Inc., New York, S. 1–284, das hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen wird, hergestellt und durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf einer Brownlee C8-Umkehrphase-Säule (Brownlee Laboratories, Santa Clara, CA) mit einem Gradienten von Acetonitril in 0,05% Trifluoressigsäure gereinigt. Die Sequenz wurde durch die Aminosäure-Zusammensetzung und -Sequenzanalyse wie folgt verifiziert:
Für die Aminosäure-Analyse wurden die Peptide 22 Stunden bei 110°C in 6 N HCl hydrolysiert und mit Ethanol-Triethylamin-Wasser-Phenylisothiocyanat (7 : 1 : 1 : 1) in einer Picotag Work Station (Waters Associates, Inc., Milford, MA) derivatisiert und mit einer Novapak C18-Säule (Waters) und einem Waters 840 Datenmodul analysiert.
Die Aminosäuresequenz-Analyse wurde durch automatisierten Edman-Abbau in einem Gasphasen-Sequenzierer Modell 470A (Applied Biosystems, Forster City, CA) durchgeführt. Die Phenylhydantoin-Aminosäuren wurden durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf einer C18-Säule mit entweder einem 1084B-Analysator (Hewlett-Packard Co., Rockville, MD) oder einem Modell 120A PTH-Analysator (Applied Biosystems) identifiziert. Für die Aminozucker-Analyse wurden die Peptide 7 Stunden bei 100°C in 4 N HCl hydrolysiert. Sie wurden dann, wie oben für die Aminosäure-Analyse beschrieben, derivatisiert und mit einer Novapak C18-Säule (Waters) analysiert.
Das gereinigte Peptid enthielt die LPSTGE-(SEQ ID NO: 14)Sequenz, welche auf jeder Seite durch Aminosäuren flankiert war, die in dieser Position in dem Streptokokken-M-Protein-Molekül gefunden werden. Als Marker wurde das Peptid mit einem Tyrosin (Y) am C-terminalen Ende sequenziert, so dass es mit ¹²⁵I markiert werden konnte.
Das Peptid wurde unter Verwendung von Iodperlen mit ¹²⁵I radiomarkiert, und dann wurde das markierte Peptid auf einer Sephadex G10-Säule gereinigt und kovalent durch sein N-terminales Ende mittels EDC (Ethyl-3-(3-diethylaminopropyl)carbodiimid-HCl) an einen verlängerten Arm einer im Handel erhältlichen Perle (3M Emphase Biospheres AB1 von Pierce, Rockford, IL) geknüpft, und die überschüssige Radiomarkierung wurde durch Waschen der Perlen mit 1 M NaCl-Puffer entfernt.
BEISPIEL 2
Nachweis der Spaltungsaktivität in Streptokokken-Membran-Extrakten
Der Streptokokken-Stamm D471 M Typ 6 wurde mit 0,1 M Natriumcarbonat (pH 11,5) behandelt und 30 Minuten bei 0°C inkubiert, um die Streptokokken-Membranen zu extrahieren.
Der resultierende Extrakt wurde mit den markierten Perlen von Beispiel 1 (50 μl-Probe, 50 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit 10 mM DTT) gemischt. Die Radiomarkierung wurde auf Zeit- und Dosis-abhängige Weise freigesetzt, wie in den 1 und 2 zu sehen. Kontrollen unter Verwendung von nichtionischem Detergens und Puffern, die eine hohe Salzkonzentration enthielten, waren nicht in der Lage, die enzymatische Aktivität freizusetzen, was nahelegt, dass die Spaltungsenzym-Aktivität fest mit der Streptokokken-Membran verbunden war. Jedoch zeigten Membranen, die mit 0,1 M Natriumcarbonat, pH 11,5, extrahiert worden waren, eine Spaltungsaktivität.
BEISPIEL 3
Isolierung des Spaltungsenzyms
Der Carbonat-Extrakt wurde auf einer 20 HQ-Perfusionschromatographiesäule unter Verwendung eines Biocad Sprint-Instruments (Perceptive Biosystems) unter Verwendung eines NaCl-Gradienten von 0 mM bis 500 mM (24,9 ml), gefolgt von einem 500 mM bis 1000 mM (33,2 ml) Gradienten, chromatographiert. Um die in den Fraktionen gefundene Enzymaktivität zu messen, wurde eine 50 μl-Probe aus jeder Fraktion in einem Reaktions-Puffer in einem Endvolumen von 100 μl, der 5 mM DTT und 5 μl des Perlen-Substrats, wie in Beispiel 1 beschrieben, enthielt, gemischt. Kontrollproben, die nur Puffer und das Substrat enthielten, wurden ebenfalls gemischt und 4 Stunden unter konstantem langsamem Drehen bei 37°C inkubiert. Die freigesetzte Radioaktivität wurde dann in 25 μl des Überstands gemessen, der nach Zentrifugation erhalten wurde. Die spezifische Aktivität wurde nach Abziehen der Kontrollwerte aus den Testproben gemessen.
Die Enzymaktivität wurde in einem Peak eluiert, der zwischen 0,6 M bis 0,7 M NaCl-Gradient (d. h. 37,5–43,2 mSiemens Leitfähigkeit) in insgesamt 6 Fraktionen von 1 ml erhalten wurde. Man fand, dass die spezifische freigesetzte Radioaktivität in diesen Fraktionen zwischen 6.000 und 11.000 cpm lag, im Vergleich zu anderen Fraktionen, in denen die Werte von 0 bis 1000 cpm variierten.
BEISPIEL 4
Eigenschaften des Spaltungsenzyms
3 veranschaulicht die enzymatische Aktivität des Carbonat-Extraktes der Membranen (als Enzymquelle) in Anwesenheit verschiedener Inhibitoren und Aktivatoren.
Man fand, dass die Aktivität in Anwesenheit von 5 mM DTT und zweiwertigen Kationen, wie Calcium, erhöht wurde.
Jeweils 1 mM Parahydroxyquecksilber(II)-benzoesäure (PHMB) und Parahydroxyquecksilber(II)-phenylsulfonsäure (PHMPS) hemmten die Spaltungsaktivität.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass das Enzym Sulfhydryl-abhängig ist.
BEISPIEL 5
Bestimmung der Spaltungsstelle
Gespaltenes markiertes synthetisches Peptid wird unter Verwendung von C-terminaler Sequenzierung und/oder Aminosäure Analyse analysiert, um die genaue Stelle der Spaltung und die optimalen Flankierungsregionen für die Ziel-LPXTGX-(SEQ ID NO: 1)Stelle zu bestimmen.
Während die Erfindung hierin mit Bezug auf verschiedene spezielle Materialien, Verfahren und Beispiele beschrieben worden ist, versteht es sich, dass die Erfindung nicht auf die speziellen materiellen Kombinationen von Material und Verfahren, die für diesen Zweck gewählt wurden, beschränkt ist. Zahlreiche Abwandlungen derartigen Einzelheiten können eingeschlossen sein, wie es vom Fachmann erkannt wird.

Claims

Isoliertes und gereinigtes Enzym, das die Oberflächenproteine von gram-positiven Bakterien innerhalb des LPXTGX(SEQ ID NO: 1)-Motivs spaltet.
Enzym nach Anspruch 1, bei dem es sich bei den Bakterien um Streptococcus, bevorzugt einen Streptococcus der Gruppe A, handelt.
Enzym nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Enzym-Oberflächenprotein ein M-Protein ist und die Aminosäuresequenz des Motivs bevorzugt LPSTGE (SEQ ID NO: 14) ist.
Enzym nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, das aus gram-positiven Bakterien, bevorzugt aus Streptococcus, bevorzugter einem Streptococcus der Gruppe A, isoliert worden ist.
Enzym nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei dem die Spaltungsaktivität des Enzyms in Anwesenheit eines Reduktionsmittels, bevorzugt Dithiothreit, verstärkt ist.
Enzym nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, bei dem das Enzym durch Parahydroxyquecksilber(II)-benzoesäure oder Parahydroxyquecksilber(II)-phenylsulfonsäure inhibiert wird.
Antikörper, der gegen das Enzym nach irgendeinem vorangehenden Anspruch gerichtet ist.
Antikörper nach Anspruch 7, bei dem der Antikörper polyklonal ist.
Antikörper nach Anspruch 7, bei dem der Antikörper monoklonal ist.
Verfahren zur Analyse des Grades der Enzymaktivität in einer Probe eines Enzyms, das Oberflächenproteine von gram-positiven Bakterien in dem LPXTGX(SEQ ID NO: 1)-Motiv spaltet, umfassend die Schritte: (a) Mischen des Substrats, das kovalent gebundenes markiertes Peptid trägt, welches eine Aminosäuresequenz LPXTGX (SEQ ID NO: 1) umfasst, mit einem Membranextrakt von gram-positiven Bakterien aus der Probe; (b) Nachweisen einer Freisetzung von Markierung aus dem Substrat; und (c) Korrelieren der Freisetzung von Markierung mit der Aktivität des Enzyms.
Verfahren nach Anspruch 10, in dem das Peptid die Sequenz LPSTGE (SEQ ID NO: 14) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, in dem es sich bei den Bakterien um Streptococcus, bevorzugt einen Streptococcus der Gruppe A, handelt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 12, in dem die Markierung radioaktiv ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 13, in dem das Substrat aus Chromatographieperlen besteht, die vorzugsweise einen Durchmesser von 30–100 μm, bevorzugter 50 bis 80 μm, aufweisen.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 14, in dem der Membranextrakt hergestellt wird, indem man die Probe mit einem Carbonat-Puffer, bevorzugt mit einer Natriumcarbonat-Konzentration im Bereich von 0,05–2,0 M, bevorzugter etwa 0,1 M, behandelt.
Verfahren nach Anspruch 15, in dem der Carbonat-Puffer bei einem pH im Bereich von 9–14, bevorzugt bei etwa 11,5 vorliegt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 16, in dem die Aktivität des mutmaßlichen Inhibitors des Enzyms abgeschätzt wird, wobei Schritt a) in Anwesenheit und Abwesenheit des mutmaßlichen Inhibitors durchgeführt wird und die Freisetzung von Markierung in Anwesenheit des Inhibitors mit der Freisetzung von Markierung in Abwesenheit des mutmaßlichen Inhibitors verglichen wird.
Verfahren nach Anspruch 17, in dem der Inhibitor eine Verbindung ist, die Sulfhydrylgruppen der Cystein-Reste in dem Enzym unter Bildung von Cystin oxidiert, und in Schritt a) in einer ausreichenden Menge vorliegt, um die Bindung des Enzyms an sein Substrat zu inaktivieren.
Verfahren nach Anspruch 17, in dem der Inhibitor eine Schwermetall-haltige Verbindung ist, die mit den Sulfhydrylgruppen der Cystein-Reste in dem Enzym unter Bildung von Mercaptiden reagiert, und im Schritt a) vorliegt und vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Parahydroxyquecksilber(II)-benzoesäure und Parahydroxyquecksilber(II)-phenylsulfonsäure in einer ausreichenden Menge, um die Bindung des Enzyms an sein Substrat zu inaktivieren, besteht.
Synthetisches Substrat, umfassend ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz LPSTGE, eine Radiomarkierung und eine Perle umfasst.
Synthetisches Substrat nach Anspruch 20, bei dem es sich bei der Radiomarkierung um ¹²⁵I und bevorzugt Iodperlen handelt.
Synthetisches Substrat nach Anspruch 21, in dem es sich bei dem Peptid um KRQLPSTGETANPFY handelt.
Synthetisches Substrat nach irgendeinem der Ansprüche 20 bis 22, in dem die Perlen Chromatographieperlen sind, die bevorzugt einen Durchmesser von 30–100 μm, bevorzugter 50 bis 80 μm, aufweisen.
Verwendung eines synthetischen Substrats nach irgendeinem der Ansprüche 20 bis 23 in dem Verfahren nach Anspruch 10.
Verfahren zur Isolierung und Identifikation eines Enzyms, das Oberflächenproteine auf gram-positiven Bakterien spaltet, umfassend die Schritte: (a) Herstellen eines Membranextrakts einer Probe, die gram-positive Bakterien enthält, welche Membran-gebundene Proteine enthalten; (b) Fraktionieren der Membran-gebundenen Proteine durch Chromatographie unter Verwendung eines Salzgradienten; und (c) Identifizieren der Anwesenheit des Enzyms in einer Fraktion unter Verwendung des Verfahrens nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 16.
Verfahren nach Anspruch 25, in dem es sich bei den gram-positiven Bakterien in der Probe um Streptococcus, bevorzugt einen Streptococcus der Gruppe A, handelt.
Verfahren nach Anspruch 25 oder Anspruch 26, in dem (in Schritt a) der Membranextrakt unter Verwendung von Carbonat-Puffer bevorzugt mit einer Natriumcarbonat-Konzentration im Bereich von 0,05–0,2 M, bevorzugter etwa 0,1 M, hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 27, in dem der Carbonat-Puffer bei einem pH im Bereich von 9–14, bevorzugt von etwa 11,5, vorliegt.