DE69738525T2

DE69738525T2 - Pilz-antigene und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69738525T2
Application number: DE69738525T
Authority: DE
Inventors: Kazutoh Otsu-shi TAKESAKO; Shigetoshi Gamo-gun MIZUTANI; Masahiro Kusatsu-shi ENDO; Ikunoshin Uji-shi KATO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1996-09-04
Filing date: 1997-08-29
Publication date: 2009-02-19
Anticipated expiration: 2017-08-30
Also published as: DE69738525D1; WO1998009990A8; CA2264496C; AU4032797A; US6333164B1; TWI232222B; CA2639051A1; US7491511B2; WO1998009990A1; JP4118340B2; CA2264496A1; KR100524245B1; US20060068448A1; US20020058293A1; EP0970966A4; EP0970966A1; EP0970966B1; KR20000068430A; JP2005323598A; AU725733B2

Description

Technischer Hintergrund
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Pilzantigen, wie durch die beigefügten Patentansprüche gekennzeichnet, welches bei Infektionskrankheiten, die durch Pilze hervorgerufen werden, welche pathogene Mikroorganismen mit einer Zellwand sind, bei der Verhinderung oder Behandlung von Allergosen und bei der Diagnose von Krankheiten, die durch Pilze hervorgerufen werden, wirksam ist, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Hintergrund des Fachgebiets
Es ist bekannt, dass Pilze Wirbeltiere wie Menschen und Tiere infizieren und alle Sorten von Krankheiten hervorrufen, wie zum Beispiel eine Dermatomykose in der menschlichen Haut, im Mund oder dergleichen, eine Systemmykose der inneren Organe, des Gehirns oder dergleichen und ähnliche infektiöse Erkrankungen bei Tieren wie Haustieren und Nutztieren. Diese Pilze schließen zum Beispiel Candida wie Candida albicans, Cryptococcus wie Cryptococcus neoformans, Aspergillus wie Aspergillus fumigatus, Pneumocystis carinii oder dergleichen ein, welche als die wichtigsten auslösenden Pilze einer systemischen Mykose-Infektion beim Menschen bekannt sind. Candida-Pilze, welche die Haut, den Mund, die Vagina oder dergleichen infizieren, und Dermatophyten wie Trichophyton mentagrophytes und Trichophyton rubrum, welche die Haut der Hände, Füße oder dergleichen infizieren, werden als die als wichtigsten auslösenden Pilze einer Dermatomykose angesehen.
Viele Dermatophyten sind Pilze, welche Infektionskrankheiten bei Haustieren und dergleichen hervorrufen und welche bekanntermaßen neben Trichophyton wie Trichophyton verrucosum, wie oben erwähnt, auch andere Pilze wie Microsporum, zum Beispiel Microsporum canis und Microsporum gypseum, einschließen. Neben diesen Pilzen gibt es eine große Vielzahl von Pilzen, welche in der lebenden Umgebung vorkommen, von denen angenommen wird, dass sie Menschen und Tiere infizieren. Darüber hinaus ist in letzter Zeit beobachtet worden, dass infolge der häufigen Verwendung einer Vielzahl von Antibiotika, Immunsuppressiva, immunsuppressiven Antikebsmitteln etc. die Patienten, welche diese Arzneistoffe erhalten, sich zu Wirten mit einer geschwächten Immunabwehr entwickelt haben, wobei eine Zunahme von opportunistischen Infektionen durch Pilze mit einer geringen Pathogenität bei normalen Individuen, an welche dieser Arzneistoffe verabreicht werden, zu beobachten ist. Auch leiden AIDS-Patienten häufig an einer Candidose der Mundschleimhaut und Komplikationen infolge verschiedener Mykosen. Patienten mit einem intravaskulären Dauerkatheder zur Behandlung, insbesondere zur intravenösen Hyperalimentation (IVH), entwickeln sehr wahrscheinlich Infektionskrankheiten, die durch Pilze, insbesondere durch Candida, aufgrund des Katheders, hervorgerufen werden.
Daneben ist eine drastische Zunahme von Allergosen, typischerweise einschließlich Asthma, atopischer Dermatitis und allergischer Rhinitis, beobachtet worden, wobei eine sehr große Zahl von Allergosen durch Pilze ausgelöst wird.
Bei einer Vielzahl von Allergosen wird aufgrund einer Sensibilisierung mit einem auslösenden Antigen der Krankheit ein IgE-Antikörper (Reagin-Antikörper), welcher für das Antigen als ein Allergen spezifisch ist, im Serum und in dem Gewebe produziert, so dass der IgE-Antikörper an Mastzellen und an basophile Rezeptoren gebunden wird. Eine erneute Exposition gegen dasselbe Antigen hat eine Vernetzung des an die Zellen gebundenen IgE mit dem Antigen auf der Zelloberfläche zur Folge, woraus physiologische Effekte der IgE-Antigen-Wechselwirkung resultieren. Diese physiologischen Effekte zeigen sich in der Freisetzung von chemischen Mediatoren wie Histamin, Serotonin, Heparin, dem eosinophilen chemotaktischen Faktor und verschiedenen Leukotrienen. Diese Effekte können systemisch oder topisch sein, abhängig von dem Weg, auf dem ein Antigen in den Körper eintritt, und dem IgE-Ablagerungsmuster auf den Mastzellen oder den basophilen Zellen.
Die systemischen Symptome schließen einen anaphylaktischen Schock ein, der eine intravaskuläre IgE-Basophilen-Antwort auf das Antigen hervorruft. Die wichtigsten daraus resultierenden Veränderungen schließen eine Kontraktion der glatten Muskulatur und eine Erweiterung der Kapillaren ein, wodurch Symptome wie Hautausschläge, Erbrechen, Durchfall und Atemnot hervorgerufen werden. In schwereren Fällen kann dies zum Tode führen. Die topischen Symptome, welche sich im Allgemeinen an der Epitheloberfläche an der Stelle entwickeln, an welcher das Antigen in den Körper eintritt, schließen Hautrötungen und Knötchen ein. Wenn die topischen Symptome sich als eine Kontraktion der glatten Muskulatur der Bronchien entwickeln, manifestiert sich dies als Bronchialasthma.
Als kausative Stämme für das Auslösen von Allergosen sind Penicillium, Candida, Aspergillus, Alternaria, Cladosporium, Malassezia, Botrytis, Mucor, Rhizopus, Aureobasidium, Fusarium, Trichoderma, Helminthosporium, Neurospora, Wallemia, Rhodotorula und Trichophyton bekannt.
Die Therapie für Pilzinfektionen umfasst im Allgemeinen eine Behandlung mit einem Antimykotikum. Eine große Zahl von Arzneistoffen gegen Dermatomykosen ist entwickelt worden, wobei einige ausgezeichnete Arzneistoffe für systemische Infektionen zur Verfügung stehen. Jedoch sind deren Wirkungen im Hinblick auf Wirksamkeit, Toxizität, Nebenwirkungen etc. nicht zufriedenstellend. Zum Beispiel werden durch Amphotericin B, das lange Zeit verwendet worden ist, verschiedene Nebenwirkungen einschließlich einer schweren Nierenfunktionsstörung hervorgerufen. Obwohl verschiedene Azol-Antimykotika, einschließlich typischerweise Fluconazol, entwickelt worden sind, ist es sehr wahrscheinlich, dass die Infektionen aufgrund ihrer statischen Wirkung rezidivieren. Auch hat eine häufige Verwendung die Entstehung von resistenten Stämmen zur Folge. Wenn resistente Stämme entstehen, finden Kreuzresistenzen statt, da viele der gegenwärtig in der Praxis verwendeten Antimykotika ähnliche Wirkungsmechanismen haben, woraus sich schwerwiegende Probleme ergeben können. Im Falle von Dermatomykosen sind verschiedene therapeutische Arzneistoffe entwickelt worden, wobei aber keines zufriedenstellend ist, da ein langer Behandlungszeitraum erforderlich ist und wiederholt Rückfälle auftreten. Daher ist die Entwicklung eines weiter verbesserten Arzneistoffes wünschenswert. Ferner, da eine ausschließliche Behandlung mit topischen Präparaten bei einigen Dermatomykosen, z. B. Nagelpilz, unbefriedigend wäre, wäre bei diesen Dermatomykosen eine systemische Medikation, zum Beispiel mit Griseofulvin, notwendig. In diesem Fall wäre eine Langzeitverabreichung erforderlich, welche verschiedene Nebenwirkungen infolge der Arzneistoffe hervorrufen kann. Ein wesentliches Problem in Bezug auf Dermatomykosen und Candidosen der Mundschleimhaut in Verbindung mit AIDS aufgrund der repetitiven Natur der Infektion sind die Kosten, selbst wenn ein wirksames Antimykotikum entwickelt wird.
Wie vorstehend beschrieben, ist eine Behandlung mit einem Antimykotikum mit verschiedenen Probleme verbunden.
Der lebenden Körper besitzt von Natur aus die Fähigkeit, sich gegen eine Infektion zu schützen, indem er solche fremden eindringenden Mikroorganismen bekämpft. Impfstoffe machen sich diese Fähigkeit zunutze. Mit Hilfe von Impfstoffen ist ein Schutz gegen eine Infektion mit pathogenen Bakterien erreicht worden, wobei diese Impfstoffen seit langer Zeit mit hinreichender Wirksamkeit verwendet werden. Für solche Impfstoffe gegen bakterielle Infektionskrankheiten sind attenuierte Bakterien (Mycobacterium tuberculosis), abgetötete Bakterien (Vibrio cholerae), Toxoide (Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani) oder gereinigte Antigene der Kapselpolysaccharide auf der Zelloberfläche (Bordetella Pertussis, Streptococcus pneumoniae, Influenzavirus, Neisseria meningitidis) als Antigene verwendet worden. Die Impfstoffe sehen die Möglichkeit vor, den Wirt durch Antikörper gegen antigene Moleküle des Pathogens und durch eine zelluläre Immunität gegen eine Infektion zu schützen. Es wird angenommen, dass die Antikörper dadurch wirksam sind, dass sie die toxischen Substanzen neutralisieren, welche durch die Pathogene sezerniert werden, und die Pathogene am Eindringen in die Wirtszellen durch die Bindung an die Zelloberflächenmoleküle des Pathogens hindern. Bei der zellulären Immunität spielen CD4⁺-Zellen und CD8⁺-T-Zellen eine wichtige Rolle bei der Erkennung der antigenen Moleküle des Pathogens und bei der Aktivierung einer für das Pathogen spezifischen Schutzreaktion. Immunogene Substanzen, die antigene Moleküle sind, welche bei den Pathogenen vorliegen, sind isoliert und identifiziert worden, wobei einige Studien unter Verwendung dieser Immunogene als sensibilisierende Antigene (Impfstoffe) durchgeführt worden sind. In solchen Fällen werden im Allgemeinen Kapselpolysaccharide, welche Zelloberflächenmoleküle sind, wie vorstehend beschrieben, als Immunogene verwendet.
Eine außerordentlich große Zahl von verschiedenen Pilzarten ist in der Umgebung zu finden, wobei praktisch alle Wirbeltiere gegen diese Pilze sensibilisiert sind. Im Allgemeinen kommt auch eine große Zahl von Pilzen im lebenden Körper vor. Daher sind die Wirbeltiere im Allgemeinen mit verschiedenen Immunreaktionen zum Schutz des Körpers gegen diese Pilze ausgestattet. Immunreaktionen, welche eine wichtige Funktion bei Pilzinfektionen haben, beinhalten eine Phagocytose und fungizide Wirkungen von aktivierten Makrophagen und polymorphkernigen Leuko cyten (PMN), welche ein wichtige Rolle spielen, wobei auch bekannt ist, dass sie Antikörper induzieren und zu einer zellulären Immunität beitragen. Pilze besitzen an ihrer Zelloberfläche eine Zellwand, die als eine Hauptkomponente Polysaccharide wie Mannan, Glucan und Chitin umfasst, wobei deren Anteil bei einigen Pilzzellen nahezu 30% der gesamten Zelle ausmacht [Klis R. U. et al., Yeast, Bd. 10 (1994), 851–869]. Von diesen Zellwandkomponenten hat Mannan die stärkste antigene Wirkung. Mannan ist ein Polysaccharid der Zelloberflächenschicht, wobei große Mengen eines Antikörpers gegen die Polysaccharid-Einheit produziert werden. Die Zellwand-Glucane von Pilzen, typischerweise einschließlich Zymosan, haben verschiedene biologische Aktivitäten, wobei bekannt ist, dass sie unspezifische immunsteigernde Wirkungen besitzen. Es wird angenommen, dass die Zellwandkomponenten einschließlich Mannan auf der Zelloberfläche von Pilzen eine wichtige Rolle bei der Verursachung einer Infektion als ein Adhäsionsmolekül für die Bindung an Zellen des lebenden Körpers spielen.
Es ist auch berichtet worden, dass Galactoxylomannan von Ciyptococcus [Devi S. J. N. et al., Infect. Immun., Bd. 59 (1991), 3700–3707] und der Phosphomannoprotein-Adhäsionsfaktor von Candida albicans ( WO 95/31998 ) als Impfstoff wirksam sind, wobei berichtet worden ist, dass Antikörper gegen diese antigenen Moleküle eine Schutzwirkung gegen eine Infektion besitzen. Im Hinblick auf die Induktion eines immunologischen Schutzes vor einer Infektion durch lebende oder abgetötete Candida-Zellen ist eine Vielzahl von Berichten veröffentlicht worden [Segal E. et al., Critical Reviews in Microbiology, Bd. 14 (1987), 229–271). Auch in diesem Fall wird davon ausgegangen, dass hauptsächlich eine Immunreaktion gegen die Zellwandkomponenten, die Zelloberflächenmoleküle sind, für den Schutz des Körpers verantwortlich ist.
Andere Impfstoffe gegen Pilze einschließlich Ribosomen-Impfstoffe [Segal E., Handbook of Applied Mycology, Band 2: Immunization Against Fungal Diseases in Man and Animals, Humans, Animals and Insects) sind hinsichtlich Infektionskrankheiten, die durch Pilze, typischerweise einschließlich Candida albicans und Trichophyton, hervorgerufen werden, untersucht und an Labortieren und teilweise an Menschen und Haustieren getestet worden. Vor kurzem ist berichtet worden, dass Enolase und das Stressprotein HSP90 (ungeprüfte Japanische Patentveröffent lichung Nr. Hei 4-502257 ) eine Schutzwirkung gegen eine Infektion hervorrufen können.
Jedoch kann nicht für alle der vorstehend angeführten antigenen Moleküle bestätigt werden, dass sie eine ausreichende Wirksamkeit besitzen. Auch ist es fraglich, ob durch eine Behandlung mit einem einzigen antigenen Molekül eine ausreichende Wirksamkeit in hochentwickelten Säugern erreicht werden kann oder nicht.
Dahingegen schließen Therapien für Allergosen die Verwendung von Antihistamin-Arzneistoffen, steroidalen entzündungshemmenden Arzneimistoffen, Suppressoren der Freisetzung chemischer Mediatoren und dergleichen ein. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass die Antihistamine ein Risiko für die Entwicklung von verschiedenen Nebenwirkungen wie Unwohlsein, Müdigkeit und Schwindel beinhalten; dass die Steroide ein Risiko für die Entwicklung von verschiedenen Nebenwirkungen wie eine Atrophie und Fehlfunktion der Nebenniere sowie Magenschwüre beinhalten; und dass die Suppressoren der Freisetzung chemischer Mediatoren auch das Risiko einer Hemmung der Wirkung von chemischen Mediatoren, welche an anderen Zuständen von Interesse als der Allergose beteiligt sind, beinhalten. Unter diesem Gesichtspunkt wird ein Präventionsverfahren zur Verringerung der Möglichkeit einer Exposition gegen Allergene, welche durch eine Diagnose der Antigene spezifiziert werden, und/oder eine Desensibilisierungstherapie unter Verwendung von solchen auslösenden Allergenen als eine hervorragende Therapie in Erwägung gezogen.
Daher ist es bei Allergosen erforderlich, zunächst eine Diagnose durchzuführen, um das auslösende Antigen zu identifizieren, wobei zu diesem Zweck mehr als 100 Arten von kommerziell erhältlichen Allergenextrakten, zuweilen auch solche, welche im Labor hergestellt werden, einem intradermalen Test auf in Verdacht stehende Antigenextrakte unterzogen werden. Nach der Identifizierung eines sehr wahrscheinlichen Antigens kann das Antigen durch die Bestimmung des IgE-Antikörpertiters im Serum, einen Expositionstest oder einen Histamin-Freisetzungstests unter Verwendung von Gesamtblut oder Lymphocyten spezifiziert werden.
Als Allergene, durch welche allergische Symptome in Menschen hervorgerufen werden, sind eine große Zahl von natürlich vorkommenden Allergenen bekannt. Im Handel erhältliche Nahrungsmittel und andere Allergenextrakte werden als Rohextrakte für natürliche Allergene bereitgestellt. Daher sind sie natürliche Agglo merate, welche aus vielen Stoffen bestehen, und enthalten eine Vielzahl von Antigenen. Vor kurzem sind als Ergebnis von Fortschritten auf dem Gebiet der Trenn- und Reinigungstechniken sowie der Beurteilungsverfahren für eine Allergenaktivität antigene Proteine, welche den Hauptkörper der Allergene umfassen, aus einer Vielzahl von Nahrungsmittelallergenen isoliert und identifiziert worden.
Auch sind von allen in der Umwelt vorkommenden Allergenen wie von Milben, Cryptomeria japonica-Pollen und Katzenhaaren, antigene Proteine, bezeichnet als Der-pl [Smith W. A. et al., Clin. Exp. Allergy, Bd. 24 (1994), 220–228], Cry-jl [Sone T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 199 (1994), 619–625] bzw. Fel-dl [Morgenstern J. P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 88 (1991), 9690–9694], als Hauptallergene isoliert worden. Ferner sind die Gene, die diese Allergen-Proteine codieren, isoliert worden, so dass reine Allergen-Proteine mittels gentechnischer Verfahren in großen Mengen hergestellt werden können.
Mittlerweile sind Versuche unternommen worden, um die Allergene von Pilzen zu isolieren, wobei antigene Proteine aus den in Pilzzellen vorkommenden Proteinen isoliert und identifiziert worden sind. Zum Beispiel sind eine Alkohol-Dehydrogenase (Can-al) [Shen H. D. et al., Clin. Exp. Allergy, Bd. 21 (1991), 675–681] und eine Enolase [Ishiguro A. et al., Infect. Immun., Bd. 60 (1992), 1550–1557] aus Candida albicans isoliert und identifiziert worden; und ein Ribotoxin (Asp-f-la) [Mosor M. et al., J. Immunol., Bd. 149 (1992), 454–460] ist aus Aspergillus fumigatus isoliert und identifiziert worden, wobei bekannt ist, dass einige der antigenen Proteine als Allergene wirksam sind.
Allgemein gesagt, im Falle von Allergenen aus Pilzen, einschließlich Candida und Aspergillus, sind jedoch nur wenige Fälle bekannt, in denen ein einziges Hauptallergen als ein antigenes Protein wirksam ist, aber es existiert eine Vielzahl von antigenen Proteinen [Stewart G. A. et al., Clin. Exp. Allergy, Bd. 26 (1996), 1020–1044], wobei verschiedene Antigene, abhängig von dem Individuum, oder eine Vielzahl von Antigenen für jedes Individuum als Allergene, auf welche das Individuum reagiert, erkannt werden. Mit anderen Worten, selbst wenn das Individuum zum Beispiel gegen Candida allergisch ist, ist es bekannt, dass die Antigene, auf welche jedes Individuum reagiert, in vielen Fällen unterschiedliche Antigene sind und dass jedes Individuum auf eine Vielzahl von Antigenen, die von Candida stammen, reagiert.
Die gegenwärtig im Handel erhältlichen diagnostischen oder therapeutischen Allergenextrakte sind zum großen Teil einfache Extrakte oder kaum gereinigte Rohextrakte, so dass die darin enthaltenen Bestandteile im Wesentlichen unkontrolliert sind. Die Allergenextrakte von Pilzen schließen solche von Candida, Aspergillus, Alternaria, Cladosporium, Malassezia, Penicillium und dergleichen ein. Jedoch unterscheiden sich die Verfahren zu deren Herstellung von den vorstehend beschriebenen Verfahren für die Allergenextrakte von natürlich vorkommenden Allergenen in Nahrungsmitteln oder in der Umgebung. Mit anderen Worten werden diese Extrakte nicht in Form von gezüchteten Zellen des auslösenden Pilzes per se bereitgestellt, sondern aus einem extrazellulären Produkt, das in die Kulturbrühe sezerniert wird, als einem Ausgangsmaterial hergestellt, welches als ein Nebenprodukt angesehen werden kann, das dadurch erhalten wird, dass ein repräsentativer Stamm der jeweiligen Gattung einer Langzeitkultivierung in einem chemisch definierten Medium, enthaltend eine begrenzte Nährstoffquelle, unterzogen wird. Daher ist das Antigen, welches durch ein solches Herstellungsverfahren erhältlich ist, ein Autolysat von Zellen oder ein extrazelluläres Sekretionsprodukt, welches wahrscheinlich als eine Hauptkomponente Zellwandpolysaccharide, typischerweise einschließlich Mannan und Glucan, umfasst. Jedoch sind bislang weder die Bestandteile dieser Antigene noch die anderen Arten von antigenen Proteinen ermittelt worden. Zusätzlich müssen ausreichende Vorsichtsmaßnahmen im Hinblick auf die Verwendung davon getroffen werden, da ihre Qualität zwischen den Herstellern sehr variiert.
Zellwandpolysaccharide, welche in den im Handel erhältlichen Allergenextrakten von Pilzen in großen Mengen enthalten sind, insbesondere Mannan, sind einerseits als Hauptallergene bei einigen Patienten mit einer Allergie wirksam, wobei selbst normale Individuen große Mengen an IgG und IgM gegen diese Zellwandpolysaccharide aufweisen. Ferner ist bekannt, dass Mannan per se, insbesondere neutrales Mannan, eine Toxizität, einschließlich einer letalen Wirkung bei der Maus, besitzt [Japanese Journal of Medical Mycology, Bd. 36 (1995), 203–208]. Es ist auch bekannt, dass Zellwand-Glucan pathologische Wirkungen, einschließlich der Induktion einer Entzündung, besitzt [Kogan G. et al., Biomedical and Biotechnological Advances in Industrial Polysaccharides (1989), 251–258].
US-A-5,275,814 offenbart ein Verfahren zur Gewinnung einer Pilzzellenfraktion, welches die Entfernung der Zellwand einschließt. Für die erhaltenen Fraktio nen wird gezeigt, dass die Ribosomen, die Zellwand, die Zellmembran und die Polysaccharide einen immunverstärkenden Effekt haben, während der cytoplasmatische Zellextrakt einen immunsuppressiven Effekt hat. Es wird darin nicht vorgeschlagen, dass eine Pilzzellenfraktion, aus der die Zellwandkomponenten entfernt wurden, eine antigene Aktivität haben könnte.
Browning et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 1831–1834, offenbaren eine Hefe-Dihydrolipoamid-Dehydrogenase mit 68,5% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 5 in der vorliegenden Beschreibung und die codierende Nucleinsäure hiervon. Gegen dieses Protein werden Antikörper hervorgerufen. Dieses Dokument offenbart nicht die vorteilhafte antigene Aktivität des Pilzantigens, das SEQ ID NO: 5 entspricht, bzw. liegt diese nicht nahe.
Marres et al., Eur. J. Biochem. 147 (1985), 153–161, offenbaren eine Hefe-Mangan-Superoxid-Dismutase mit 63% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 6 in der vorliegenden Beschreibung und die codierende Nucleinsäure hiervon. Es wird keine antigene Aktivität des Proteins offenbart.
Suissa et al., EMBO J. 3 (1984), 1773–1781, offenbaren eine Hefe-Citrat-Synthase mit 68% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 3 und die codierende Nucleinsäure hiervon. Es wird keine antigene Aktivität des Proteins offenbart.
Cueva et al., FEBS Lett. 259 (1989), 125–129, offenbaren eine Hefe-Vakuolen-Aminopeptidase mit 62,5% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 4 und die codierende Nucleinsäure hiervon. Es wird keine antigene Aktivität des Proteins offenbart.
Hay et al., Infect. Immun. 22 (1978), 72–79, beschreiben die Herstellung von verschiedenen Antigenfraktionen aus Cryptococcus neoformans. Eine "Mitochondrienmembran"-Fraktion wird dadurch erhalten, dass die Zellen aufgebrochen und bei 5500 × g zentrifugiert werden, um die intakten Zellen und die Zellwände zu entfernen, wodurch eine Fraktion erhalten wird, aus der die Zellwände entfernt worden sind. Diese Fraktion wird dann bei 20.000 × g zentrifugiert, wobei ein unlösliches Pellet von Mitochondrien und Membranen erhalten wird, welches anschließend in 0,85% NaCl resuspendiert wird. Diese "Mitochondrienmembran"-Fraktion wird verwendet, um Mäuse zu immunisieren. Dieses Dokument liefert keine Hinweise auf die Verwendung des Pilzantigens, das eine solubilisierte Fraktion ist, welche ein lösliches Protein, wie in der vorliegenden Erfindung beansprucht, enthält.
Die Verwendung von Mannan und anderen Zellwandkomponenten, welche Antigene sind, oder Pilzzellen per se als Impfstoffe beinhaltet daher Risiken wie zum Beispiel das Hervorrufen einer Hypersensitivität. Auch sind die Zellwandkomponenten bei einer Desensibilisierungstherapie etc. von Allergosen nicht immer als Hauptallergene wirksam; daher ist, falls eine Allergenzusammensetzung verwendet wird, die eine Zellwandkomponente enthält, ihre Antigenität sehr wichtig, wobei Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden müssen, wenn die Zusammensetzung an Menschen verabreicht wird. In dieser Hinsicht sind die gegenwärtig erhältlichen Allergenextrakte von Pilzen vollkommen unzureichend. Außerdem sind keine diagnostischen und/oder therapeutischen Arzneimittel bekannt, welche eine ausreichende Menge eines wirksamen Antigens enthalten.
Wie vorstehend beschrieben, ist es unter den Gesichtspunkten der zunehmenden Häufigkeit von Mykosen und von anderen Problemen in Verbindung mit Nebenreaktionen, der Entwicklung von resistenten Stämmen, der medizinischen Kosten etc. im Hinblick auf die gegenwärtig verwendeten Antimykotika besonders wünschenswert, neue therapeutische Arzneistoffe mit einer hohen Wirksamkeit und einer hohen Sicherheit für Mykosen zu entwickeln. Impfstoffe sind gegenüber Antimykotika in vielerlei Hinsicht vorteilhaft, und falls Impfstoffe für solche Infektionskrankheiten, die durch Pilze hervorgerufen werden, gefunden werden könnten, wäre es nicht nur möglich, Schmerzen und eine Schwächung in Verbindung mit diesen Infektionskrankheiten zu verhindern, sondern auch die Dosis der zur Behandlung dieser Infektionskrankheiten verwendeten Arzneistoffe deutlich zu verringern. Ferner wird der Selektionsdruck auf die pathogenen Mikroorganismen infolge von Überdosen der antifungalen Mittel durch das Vermeiden einer Verwendung dieser Arzneistoffe auf eine solche Weise verringert, so dass die Verbreitung der resistenten Stämme vermindert werden kann. Bis jetzt sind jedoch keine solche hochwirksamen Impfstoffe gefunden worden. Es wird auch erwartet, dass eine Sensibilisierung mit einer Vielzahl von Antigenen besser eine Vorbeugung gegen eine Infektion als die Sensibilisierung mit einem einzigen Antigen im Hinblick auf eine Resistenz und die Wirksamkeit bewirkt.
Darüber hinaus sind mit der Zunahme der Häufigkeit von Allergosen zahlreiche therapeutische oder diagnostische Allergenextrakte kommerziell zugänglich geworden, wobei jedoch viele davon wirksame Bestandteile enthalten, die bislang noch nicht ermittelt worden sind. Obwohl im Hinblick auf Pilze weiterhin unbekannt ist, von welchen Teilen der Pilzzellen die Komponenten abhängig von dem Verfahren zu deren Herstellung stammen, wird davon ausgegangen, dass die Hauptkomponente davon aus Polysacchariden besteht, welche von der Zellwand stammen, wobei die Komponente offensichtlich einen geringen Anteil an antigenen Bestandteilen enthält, welche von intrazellulären Komponenten abgeleitet sind, woraus eine sehr ungleichmäßige Verteilung der antigenen Komponenten resultiert. Aus diesem Grund wird davon ausgegangen, dass keine zufriedenstellende Behandlung oder Diagnose unter Verwendung der kommerziell erhältlichen Allergenextrakte von Pilzen und Antigenextrakten, welche durch ähnliche Verfahren erhalten werden, möglich ist. Daher wird erwartet, dass Allergenextrakte, enthaltend Bestandteile, welche sich von den Bestandteilen unterscheiden, die in herkömmlichen Antigenextrakten enthalten sind, wobei sich die Menge der Bestandteile in solchen Allergenextrakten von der Menge der herkömmlichen Allergene unterscheidet, eine hohe Wirksamkeit zeigen. Bei der vorliegenden Desensibilisierungstherapie, von der angenommen wird, dass sie bei Allergosen wirksam ist, ist es auch notwendig, dass eine antigene Flüssigkeit in kleinen Dosen zu einem Zeitpunkt einmal oder zweimal pro Woche intradermal verabreicht wird, wobei die Dosis auf einen Wert erhöht wird, welcher über einen Zeitraum von 3 bis 4 Monaten beibehalten wird, und wobei die Verabreichung davon für weitere 1 bis 3 Jahre fortgesetzt wird. Es wird daher erwartet, dass mittels der Verwendung einer Antigenzusammensetzung, deren Volumen und/oder Dosis leicht erhöht werden kann, ein außerordentlich guter therapeutischer Effekt in einer einfacheren Weise erreicht werden kann. Auch sind Säuger, typischerweise einschließlich Menschen, im Allgemeinen verschieden, und es ist sehr wahrscheinlich, dass sich die Komponenten, welche als Antigene erkannt werden, unterscheiden, selbst wenn ein Säuger mit einer Pilzart infiziert wird oder dagegen allergisch wird. Daher sind Antigene wünschenswert, die eine ausreichende Menge an unterschiedlichen antigenen Komponenten enthalten.
Ferner ist es diagnostisch wichtig, das auslösende Antigen zu spezifizieren, wenn eine wirksame Therapie gewählt wird, wodurch eine hochwirksame und eine sicherere Behandlung wie eine Desensibilisierungstherapie unter Verwendung des Antigens durchgeführt werden können. Unter diesem Gesichtspunkt wird daher bevorzugt, dass unbekannte Antigene spezifiziert werden.
Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Pilzantigens, welches für wirksame, sicherere, biologische Produkte gegen Krankheiten, welche durch Pilze hervorgerufen werden, einschließlich zum Beispiel Impfstoffzusammensetzungen, Zusammensetzungen für eine Desensibilisierungstherapie und diagnostische Zusammensetzungen, wie durch die beigefügten Patentansprüche gekennzeichnet, verwendet werden kann. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung des Pilzantigens und einer Nucleinsäure, die das Pilzantigen codiert.
Offenbarung der Erfindung
Da einige der Zellwandkomponenten von Pilzen, die herkömmlicherweise hauptsächlich als antigene Moleküle untersucht worden sind, Immunreaktionen hervorrufen, die für den lebenden Körper nachteilig sind, haben die hierin genannten Erfinder Substanzen, die eine Antigenität und eine Aktivität als Impfstoffe und/oder Allergene besitzen, auf Komponenten untersucht, welche keine Zellwandkomponenten sind, wobei sie Protoplasten als Ausgangsmaterialien verwendeten, welche dadurch erhalten wurden, dass die Zellwand der Pilzzellen entfernt wurde. Als Ergebnis haben die Erfinder entdeckt, dass unlösliche Fraktionen, enthaltend cytoplasmatische Membranproteine und Membranproteine einer Zellorganelle, die aus Protoplasten gewonnen wurden, welche von Pilzen stammen, die Infektionskrankheiten hervorrufen, unerwarteterweise eine wirksame Antigenität besitzen. Sie entdeckten weiterhin, dass, obwohl die unlöslichen Fraktionen im Wesentlichen keine Zellwandkomponenten enthalten, die Aktivität davon als Impfstoffe dem Aktivitätsgrad von lebenden Zellen entspricht oder sogar stärker ist. Die Erfinder haben auch entdeckt, dass eine solubilisierte Fraktion, welche aus der unlöslichen Fraktion unter Verwendung eines Lösungsvermittlers wie eines oberflächenaktiven Stoffes erhältlich ist, ebenfalls eine starke Antigenität und eine wirksame Aktivität als ein Impfstoff besitzt.
Ferner haben die Erfinder festgestellt, dass davon auszugehen ist, dass das Produkt der vorliegenden Erfindung einen größeren Bereich von Immunantworten als im Falle der Verabreichung einer bestimmten einzelnen antigenen Komponente vorsehen kann, da das Produkt in Form eines Gemisches von mehreren Arten von Antigenen erhältlich ist, und dass das Produkt tatsächlich eine wirksamere Impfstoffaktivität als irgendeine der antigenen Komponenten besitzt, welche herkömmli cherweise untersucht worden sind. Die Erfinder haben weiterhin festgestellt, dass das Antigen dadurch wirksam ist, dass es Immunocyten, typischerweise einschließlich Lymphocyten, stimuliert, so dass es eine Aktivität besitzt, Cytokine wie IFN-γ aus Zellen freizusetzen. Die Cytokin-freisetzenden Zellen schließen zum Beispiel T-Lymphocyten, natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und dergleichen ein. Darüber hinaus haben die Erfinder festgestellt, dass die unlösliche Fraktion, welche aus Protoplasten erhältlich ist, die von Pilzen stammen, welche Allergosen auslösen, eine wirksame Antigenität und eine ausreichende Aktivität als ein Allergen besitzen. Die Erfinder haben auch entdeckt, dass die solubilisierte Fraktion, welche aus den unlöslichen Fraktionen unter Verwendung eines Lösungsvermittlers wie eines oberflächenaktiven Stoffes erhältlich ist, ebenfalls eine wirksame Antigenität und eine ausreichende Aktivität als ein Allergen aufweist. Zusätzlich haben die Erfinder festgestellt, dass die unlösliche Fraktion, welche aus Protoplasten erhältlich ist, die von Pilzen stammen, welche Krankheiten hervorrufen, und/oder die solubilisierte Fraktion, welche aus der unlöslichen Fraktion erhältlich ist, eine ausreichende Aktivität als ein diagnostisches Antigen besitzen. Ferner ist es den Erfindern gelungen, ein Protein mit einer Antigenität, welches herkömmlicherweise nicht in diesen Fraktionen nachgewiesen werden konnte, zu isolieren. Auf diese Weise ist die vorliegende Erfindung vollendet worden.
Insbesondere ist die vorliegende Erfindung wie folgt gekennzeichnet:

[1] Pilzantigen, das eine solubilisierte Fraktion ist, welche ein lösliches Protein enthält, wobei die solubilisierte Fraktion aus der unlöslichen Fraktion mit einem Puffer, der einen oberflächenaktiven Stoff enthält, extrahiert und davon abgetrennt wurde, wobei die unlösliche Fraktion aus Pilzzellen erhältlich ist durch (a) Aufbrechen von Protoplasten oder Sphäroplasten der Pilzzellen und (b) Ausfällen der in Schritt (a) erhaltenen Komponenten durch eine Behandlung mittels Zentrifugation, und wobei die unlösliche Fraktion eine Zellorganelle, ein Membranprotein der Zellorganelle und/oder ein cytoplasmatisches Membranprotein enthält.

Das Pilzantigen gemäß Punkt [1] kann dadurch gekennzeichnet werden, dass die unlösliche Fraktion eine Fraktion ist, welche dadurch erhältlich ist, dass die Komponenten, welche in Form eines Präzipitats mittels Aufbrechen von Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist, erhalten wurden, einer Behandlung mittels Zentrifugation unter Bedingungen von etwa 100.000 × g unterworfen werden.
Das Pilzantigen im Einklang mit einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Pilzantigen, wobei die unlösliche Fraktion eine Zellorganelle enthält, welche aus der Gruppe, bestehend aus Mitochondrien, Kernen, Lysosomen und Vakuolen ausgewählt ist.
Im Hinblick auf das Pilzantigen im Einklang mit der Erfindung kann die unlösliche Fraktion ein cytoplasmatisches Membranprotein und/oder ein Membranprotein einer Zellorganelle enthalten.
Wie hierin vorstehend angegeben, ist das Pilzantigen eine solubilisierte Fraktion, welche aus der vorstehenden unlöslichen Fraktion extrahiert und davon abgetrennt wurde, wobei die solubilisierte Fraktion ein lösliches Protein ist und mit einem Puffer, der einen oberflächenaktiven Stoff enthält, daraus extrahiert und davon abgetrennt wird.
Das Pilzantigen im Einklang mit der Erfindung besitzt vorzugsweise die Fähigkeit, an ein Zuckergruppen-spezifisches Affinitätsmedium zu binden. Besonders bevorzugt ist das Zuckergruppen-spezifische Affinitätsmedium ein immobilisiertes Concanavalin A-Medium.
Das Pilzantigen im Einklang mit der Erfindung gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform besitzt nicht die Fähigkeit, an ein Zuckergruppen-spezifisches Affinitätsmedium zu binden, wobei das Zuckergruppen-spezifische Affinitätsmedium am meisten bevorzugt ein immobilisiertes Concanavalin A-Medium ist.
Das Pilzantigen im Einklang mit der Erfindung gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eines, wobei die Pilzzellen aus einem oder mehreren Pilzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pilzen von Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Mucor, Rhizopus, Absidia, Nocardia, Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides, Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, Sporothrix, Dematiaceous fungi, Malassezia, Pneumocystis, Penicillium, Alternaria, Cladosporium, Botrytis, Aureobasidium, Fusarium, Trichoderma, Helminthosporium, Neurospora, Wallemia und Rhodotorula, gewonnen werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Pilzantigens im Einklang mit der Erfindung stammen die Pilzzellen von mindestens einem Stamm von Candida albicans, mindestens einem Stamm von Aspergillus fumigatus, mindestens einem Stamm von Cryptococcus neoformans oder mindestens einem Stamm von Dermatophyten, die zu Trichophyton, Microsporum oder Epidermophyton gehören.

[2] Pilzantigen, umfassend ein antigenes Protein mit einer Impfstoffaktivität oder einer Allergenaktivität, welches von Candida albicans stammt, wobei das antigene Protein die partielle Aminosäuresequenz, welche in SEQ ID NO: 1 in dem Sequenzprotokoll dargestellt ist, umfasst und ein Molekulargewicht von etwa 65.000, bestimmt mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, aufweist.
[3] Pilzantigen, umfassend ein Peptid, welches die gesamte Sequenz der in SEQ ID NO: 5 in dem Sequenzprotokoll gezeigten Aminosäuresequenz umfasst, wobei das Peptid eine Impfstoffaktivität oder eine Allergenaktivität hat.
[4] Nucleinsäure, die das Pilzantigen gemäß Punkt [2] oder [3], vorstehend, codiert. [5] Nucleinsäure, wobei die Nucleinsäure die gesamte Sequenz der in SEQ ID NO: 7 in dem Sequenzprotokoll gezeigten Nucleotidsequenz umfasst.
[6] Nucleinsäure, die ein Peptid codiert, das eine Impfstoffaktivität oder eine Allergenaktivität hat, wobei die Nucleinsäure in der Lage ist, mit der Nucleinsäure gemäß Punkt [4] oder [5], vorstehend, zu hybridisieren.
[7] Pilzantigen, umfassend ein antigenes Protein mit einer Impfstoffaktivität oder einer Allergenaktivität, welches von Candida albicans stammt, wobei das antigene Protein die partielle Aminosäuresequenz, welche in SEQ ID NO: 2 in dem Sequenzprotokoll dargestellt ist, umfasst und ein Molekulargewicht von etwa 25.000, bestimmt mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, aufweist.
[8] Pilzantigen, umfassend ein Peptid, welches die gesamte Sequenz der in SEQ ID NO: 6 in dem Sequenzprotokoll gezeigten Aminosäuresequenz umfasst, wobei das Peptid eine Impfstoffaktivität oder eine Allergenaktivität hat.
[9] Nucleinsäure, die das Pilzantigen gemäß Punkt [7] bis [8], vorstehend, codiert.
[10] Nucleinsäure, wobei die Nucleinsäure die gesamte Sequenz der in SEQ ID NO: 8 in dem Sequenzprotokoll gezeigten Nucleotidsequenz umfasst.
[11] Nucleinsäure, die ein Peptid codiert, das eine Impfstoffaktivität oder eine Allergenaktivität hat, wobei die Nucleinsäure in der Lage ist, mit der Nucleinsäure gemäß Punkt [9] oder [10], vorstehend, zu hybridisieren.
[12] Pilzantigen, umfassend ein antigenes Protein mit einer Impfstoffaktivität oder einer Allergenaktivität, welches von Candida albicans stammt, wobei das antigene Protein die partielle Aminosäuresequenz, welche in SEQ ID NO: 3 in dem Sequenzprotokoll dargestellt ist, umfasst und ein Molekulargewicht von etwa 30.000, bestimmt mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, aufweist.
[13] Pilzantigen, umfassend ein antigenes Protein mit einer Impfstoffaktivität oder einer Allergenaktivität, welches von Candida albicans stammt, wobei das antigene Protein die partielle Aminosäuresequenz, welche in SEQ ID NO: 4 in dem Sequenzprotokoll dargestellt ist, umfasst und ein Molekulargewicht von etwa 62.000, bestimmt mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, aufweist.
[14] Verfahren zum Herstellen eines Pilzantigens, das eine solubilisierte Fraktion ist, welche aus einer unlöslichen Fraktion extrahiert und davon abgetrennt wurde, wobei die unlösliche Fraktion aus Pilzzellen erhältlich ist, deren Zellwand entfernt worden ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (1) Gewinnen von lebenden Pilzzellen; (2) Gewinnen von Pilzzellen, deren Zellwand entfernt worden ist; (3) Aufbrechen der Pilzzellen, deren Zellwand entfernt worden ist; (4) Gewinnen einer unlöslichen Fraktion; und (5) Extrahieren und Abtrennen einer solubilisierten Fraktion von der unlöslichen Fraktion.

Vorzugsweise umfasst das Verfahren gemäß Punkt [14], vorstehend, weiterhin den Schritt des Reinigens der erhaltenen solubilisierten Fraktion unter Verwendung eines Zuckergruppen-spezifischen Affinitätsmediums.
Ferner wird ein Verfahren im Einklang mit der Erfindung bevorzugt, wobei die solubilisierte Fraktion ein lösliches Protein enthält.
Des weiteren wird ein Verfahren im Einklang mit der Erfindung bevorzugt, wobei der Schritt des Extrahierens und Abtrennens einer solubilisierten Fraktion von der unlöslichen Fraktion einen Schritt des Solubilisierens der unlöslichen Fraktion mit einem Puffer, der einen oberflächenaktiven Stoff enthält, einschließt.
Weiterhin wird ein Verfahren im Einklang mit der Erfindung bevorzugt, wobei das Zuckergruppen-spezifische Affinitätsmedium ein immobilisiertes Concanavalin A-Medium ist.
Ebenfalls bevorzugt wird ein Verfahren im Einklang mit der Erfindung, wobei die Pilzzellen, deren Zellwand entfernt worden ist, durch eine enzymatische Lyse behandlung der Zellwand und/oder eine physikalische Behandlung der Zellwand gewonnen werden.
Des weiteren wird ein Verfahren im Einklang mit der Erfindung bevorzugt, wobei die Pilzzellen, deren Zellwand entfernt worden ist, Protoplasten oder Sphäroplasten der Pilzzellen sind.
Ferner bevorzugt wird ein Verfahren, wobei die unlösliche Fraktion dadurch gewonnen wird, dass die Komponenten, welche durch das Aufbrechen der Pilzzellen, deren Zellwand entfernt worden ist, erhalten wurden, einer Behandlung mittels Zentrifugation unter Bedingungen von etwa 100.000 × g unterworfen werden.

[15] Biologisches Produkt, enthaltend das Pilzantigen der Erfindung oder ein Pilzantigen, das durch das Verfahren der Erfindung hergestellt wird, wobei das biologische Produkt eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Herbeiführen einer protektiven Immunität gegen Pilze oder zum Vorsehen von therapeutischen Wirkungen hierfür durch die Verabreichung davon an ein Individuum; eine Impfstoffzusammensetzung zum Herbeiführen einer protektiven Immunität gegen Pilze oder zum Vorsehen von therapeutischen Wirkungen hierfür durch die Verabreichung davon an ein Individuum; ein Cytokin-freisetzendes Agens; eine Allergenzusammensetzung zur Vorbeugung vor Allergosen durch Pilze oder zum Vorsehen von therapeutischen Wirkungen hierfür durch die Verabreichung davon an ein Individuum; oder eine diagnostische Zusammensetzung für eine Erkrankung, welche durch Pilze hervorgerufen wird, ist.

Die Erfindung betrifft weiterhin:

[16] Verwendung des Pilzantigens, wie oben definiert, für die Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zum Schutz vor einer Pilzinfektion.
[17] Allergenzusammensetzung, wie oben definiert, zur Vorbeugung von Allergosen durch Pilze oder für die Desensibilisierungstherapie von Allergosen.
[18] Verwendung des Pilzantigens, wie oben definiert, für die Herstellung einer Allergenzusammensetzung für die Desensibilisierungstherapie von Allergosen.
[19] Verwendung des Pilzantigens, wie oben definiert, für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für eine Erkrankung, welche durch eine Pilzinfektion verursacht wird, oder von Allergosen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Anwendung der Erfindung betrifft die Erkrankung ein Wirbeltier.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Fotografien, welche die Morphologie von Candida albicans TIMM 1768-Zellen (Hefetyp) vor und nach der Entfernung der Zellwand veranschaulichen, wobei die Fotografien bei einer 1000fachen Vergrößerung unter Verwendung eines Differentialinterferenzmikroskops (hergestellt durch Nikon Corporation) aufgenommen wurden und wobei A die Zellen vor der Entfernung der Zellwand zeigt und B die Zellen nach der Entfernung der Zellwand zeigt.
2 zeigt Fotografien, welche die Morphologie von Aspergillus fumigatus-Zellen vor und nach der Entfernung der Zellwand veranschaulichen, wobei die Fotografien bei einer 400fachen Vergrößerung unter Verwendung eines Differentialinterferenzmikroskops (hergestellt durch Nikon Corporation) aufgenommen wurden und wobei A die Zellen vor der Entfernung der Zellwand zeigt und B die Zellen nach der Entfernung der Zellwand zeigt.
3 ist ein Diagramm, das die Anwesenheit von Antikörpern gegen Proteine, welche aus der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans stammen, die in einem Maus-anti-Candida-Serum (Bahn 1), Kaninchen-anti-Candida-Serum (Bahn 2) und einem normalem Serum eines Individuums (Bahn 3) enthalten war, veranschaulicht.
4 ist ein Diagramm, das die Anwesenheit von Antikörpern gegen ein Protein, welches aus der unlöslichen Fraktion Af-LSP von Aspergillus fumigatus stammt (Bahn 1), und ein Protein, welches aus der unlöslichen Fraktion Crn-LSP von Cryptococcus neoformans stammt (Bahn 2), welche jeweils in einem Maus-anti-Aspergillus-Serum enthalten waren, veranschaulicht.
5 ist ein Diagramm, das die Anwesenheit von Antikörpern gegen ein Protein, welches aus der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans stammt (Bahn 1), ein Protein, welches aus der unlöslichen Fraktion Crn-LSP von Cryptococcus neoformans stammt (Bahn 2), und ein Protein, welches aus der unlöslichen Fraktion Af-LSP von Aspergillus fumigatus stammt (Bahn 3), welche jeweils in einem Maus-anti-Candida-Serum enthalten waren, veranschaulicht.
6 ist ein Diagramm, das die Anwesenheit von Antikörpern gegen ein Protein, welches aus der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans vom Hefetyp stammt (Bahn 1), und ein Protein, welches aus der unlöslichen Fraktion Ca-LSP-M des Myzels von Candida albicans stammt (Bahn 2), welche jeweils in einem Maus-anti-Candida-Serum enthalten waren, veranschaulicht.
7 zeigt Fotografien, welche die Morphologie der Myzelzellen von Candida albicans vor und nach der Entfernung der Zellwand veranschaulichen, wobei die Fotografien bei einer 400fachen Vergrößerung unter Verwendung eines Differentialinterferenzmikroskops (hergestellt durch Nikon Corporation) aufgenommen wurden und wobei A die Zellen vor der Entfernung der Zellwand zeigt und B die Zellen nach der Entfernung der Zellwand zeigt.
8 ist ein Diagramm, das die Menge an menschlichem IFN-γ zeigt, welche innerhalb von 7 Tagen nach Beginn der Kultivierung in einem RPMI-1640-Medium, enthaltend menschliche periphere einkernige Blutzellen (PBMCs), supplementiert mit der Ca-LSP-Antigenflüssigkeit, gebildet wurde.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlich beschrieben.
Das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung ist durch die beigefügten Patentansprüche gekennzeichnet. Derartige Pilzantigene können zum Beispiel in Form von biologischen Produkten verwendet werden. Das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung wird aus einem eine Infektionskrankheit hervorrufenden Pilz oder einem eine Allergose auslösenden Pilz gewonnen. Das Pilzantigen, welches von einem Pilz stammt, der eine Infektionskrankheit hervorruft, ist in der Lage, eine Immunität gegen eine Infektion in Wirbeltieren herbeizuführen, so dass das Pilzantigen geeigneterweise insbesondere in einer Impfstoffzusammensetzung verwendet werden kann. Dagegen kann das Pilzantigen, welches von einem Pilz stammt, der eine Allergose hervorruft, dazu verwendet werden, Wirbeltiere zu desensibilisieren, so dass das Pilzantigen geeigneterweise zur Vorbeugung und Behandlung von Allergosen verwendet werden kann. Ferner können derartige Pilzantigene geeigneterweise dazu verwendet werden, Krankheiten zu diagnostizieren, die durch Pilze hervorgerufen werden.
1. Pilzzellen
Die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Pilze sind nicht besonders begrenzt und schließen nicht nur Pilze ein, die eine Pathogenität in Wirbeltieren wie Menschen und Tieren zeigen, sondern auch andere Pilze, welche nahe damit verwandt sind. Beispiele hierfür schließen einen oder mehrere Pilze, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pilzen von Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Mucor, Rhizopus, Absidia, Nocardia, Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides, Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, Sporothrix, (Dematiaceous fungi) Malassezia, Pneumocystis, Penicillium, Alternaria, Cladosporium, Botrytis, Aureobasidium, Fusarium, Trichoderma, Helminthosporium, Neurospora, Wallemia und Rhodotorula ein.
In der vorliegenden Erfindung umfassen fungale Infektionskrankheiten in Wirbeltieren eine Candidose, Aspergillose, Cryptococcose, Mucormykose, Actinomykose, Histoplasmose, Blastomykose, verschiedene Hautmykosen, Tinea versicolor und eine Pneumocystis carinii-Pneumonie bei Menschen. Daher wird unter dem Gesichtspunkt der Nützlichkeit bevorzugt, dass der Pilz, welcher in einer Impfstoffzusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, ein Pilz ist, der eine solche fungale Infektionskrankheit hervorruft.
Konkrete Beispiele hierfür schließen eine Candidose auslösende Pilze wie Candida albicans, C. tropicalis und Candida glabrata; eine Aspergillose auslösende Pilze wie Aspergillus fumigatus und Aspergillus flavus; eine Cryptococcose auslösende Pilze wie Cryptococcus neoformans; eine Mucormykose auslösende Pilze wie Mucor sp., Absidia sp. und Rhizopus sp.; eine Actinomykose auslösende Pilze wie Nocardia asteroides; andere fungale Infektionskrankheiten der inneren Organe hervorrufende Pilze wie Trichosporon cutaneum, Rhodotorula glutinis, Geotrichum candidum, Pneumocystis carinii, Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum und Blastomyces dermatitidis; Trichophyton, der ein Dermatophyt ist, zum Beispiel Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum und Trichophyton verrucosum; Microsporum wie Microsporum canis und Microsporum gypseum, sowie Epidermophyton sp.; Phialophora sp. und Cladosporium sp., welche Dematiaceous fungi sind; Malassezia furfur, welcher Tinea versicolor auslöst; andere Hautmykosen auslösende Pilze wie Sporothrix schenckii und Fonsecaea pedrosoi; und dergleichen ein.
Der verwendbare Pilzstamm ist nicht besonders begrenzt, solange wie er mit Pilz, der die Mykose hervorruft, welche behandelt oder verhindert werden soll, nahe verwandt ist, wobei ein Stamm bevorzugt wird, der eine Pathogenität (z. B. eine letale Toxizität gegenüber Mäusen) besitzt. Typische Beispiele der nützlichen Stämme schließen Candida albicans ATCC 10231, TIMM 1768 und TIMM 0239 für eine Candidose; Aspergillus fumigatus ATCC 28212, ATCC 42202 und TIMM 1776 für eine Aspergillose; und Cryptococcus neoformans ATCC 24067, TIMM 0354 sowie den Kapsel-defizienten Stamm Ciyptococcus neoformans TIMM 0357 für eine Cryptococcose ein.
Falls das Pilzantigen verwendet wird, um ein Cytokin aus Zellen freizusetzen, stammt es vorzugsweise von einem normal besiedelnden Pilz, gegen den selbst normale Individuen immunologisch sensibilisiert sind, wobei ein Antigen bevorzugt wird, welches von Candida albicans stammt.
Wenn hingegen das Pilzantigen dazu verwendet wird, eine allergische Reaktion zu unterdrücken, ist der Pilz, welcher für die Herstellung des Pilzantigens, das in der Allergenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthalten ist, geeignet ist, unter dem Gesichtspunkt der Nützlichkeit vorzugsweise ein auslösender Pilz, der allergische Symptome bei Menschen hervorruft.
Konkrete Beispiele hierfür schließen Candida wie Candida albicans, Candida tropicalis, Candida glabrata und Candida boidinii; Aspergillus wie Aspergillus fumigatus, Aspergillus restrictus und Aspergillus versicolor, Trichophyton wie Trichophyton mentagrophytes; Malassezia wie Malassezia furfur, Mucor wie Mucor racemosus; Rhizopus wie Rhizopus oryzae: Penicillium wie Penicillium notatum; Alternaria wie Alternaria alternata und Alternaria kikuchiana; Cladosporium wie Cladosporium cladosporioides und Cladosporium carionii; Botrytis wie Botrytis cinerea; Aureobasidium wie Aureobasidium pullulans; Fusarium wie Fusarium oxysporum; Trichoderma wie Trichoderma viridae; Helminthosporium wie Helminthosporium maydis; Neurospora wie Neurospora crassa; Wallemia wie Wallemia sebi; Rhodotorula wie Rhodotorula glutinis; und dergleichen ein.
Der verwendbare Pilzstamm ist nicht besonders begrenzt, solange wie er mit dem Pilz, der die Allergose auslöst, welche behandelt oder verhindert werden soll, nahe verwandt ist. Typische Beispiele hierfür schließen Candida wie Candida albicans ATCC 10231 und TIMM 1768 sowie Candida boidinii ATCC 18810 für die Herstellung von Candida-Antigenen; Aspergillus wie Aspergillus fumigatus ATCC 28212 und TIMM 1776 sowie Aspergillus restrictus ATCC 16912 für die Herstellung von Aspergillus-Antigenen; Alternaria wie Alternaria alternata IFO 31188 für die Herstellung von Alternaria-Antigenen; Malassezia wie Malassezia furfur ATCC 14521 und TIMM 2782 für die Herstellung von Malassezia-Antigenen; und dergleichen ein.
Falls in der vorliegenden Erfindung ein Pilzantigen dazu verwendet wird, eine Krankheit zu diagnostizieren, die durch einen Pilz verursacht wird, ist der Pilz, welcher verwendet werden kann, vorzugsweise der vorstehend beschriebene Pilz, welcher die Krankheit hervorruft.
2. Pilzantigene
"Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt worden ist" in dem Ausdruck "Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist", wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, verweisen auf die Protoplasten oder Protoplasten-ähnliche Zellen der Pilzzellen. "Pilzzellen, deren Zellwand zumindest teilweise entfernt worden ist", verweisen auf die Sphäroplasten oder Sphäroplasten-ähnliche Zellen der Pilzzellen. Insbesondere sind typische Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt worden ist, die Protoplasten der Pilzzellen, und sind typische Pilzzellen, deren Zellwand zumindest teilweise entfernt worden ist, die Sphäroplasten der Pilzzellen. Demgemäß bedeutet der Ausdruck "unlösliche Fraktion, erhältlich aus Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist", dass die unlösliche Fraktion aus den Protoplasten, Sphäroplasten oder dergleichen der Pilzzellen erhältlich ist.
Der Ausdruck "die Zellwand ist zumindest teilweise entfernt worden" bedeutet, dass die Zellwandbestandteile, zum Beispiel Mannan oder Glucan, in einem Ausmaß entfernt werden, dass die Funktion der Zellwand wie die Beibehaltung der Morphologie oder die Beständigkeit gegenüber dem osmotischen Druck von hypotonischen Lösungen, verloren geht und dass gleichzeitig die Zellwand in einem Ausmaß entfernt wird, dass wenigstens keine Nebenwirkungen durch die Zellwandkomponente hervorgerufen werden. In der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von Pilzzellen bevorzugt, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt worden ist. Jedoch können die verwendeten Pilzzellen noch darin verbleibende Zellwand komponenten aufweisen, solange wie die Komponenten, welche von der Zellwand stammen, bei der Verabreichung an den lebenden Körper keine Nebenwirkungen wie eine Hypersensibilität oder Letalität in dem lebenden Körper hervorrufen. Insbesondere enthält die unlösliche Fraktion relativ große intrazelluläre Strukturen wie Zellmembranen, Zellorganellen (Mitochondrien, Kerne, Lysosomen, Vakuolen etc.) und Zellorganellmembranen, ein an die Zellmembran gebundenes Protein sowie ein an die Zellorganellmembran gebundenes Protein. Es ist nicht erforderlich, dass die unlösliche Fraktion der vorliegenden Erfindung alle der vorstehend erwähnten Komponenten enthält, solange wie sie mindestens eine der Komponenten enthält.
Die unlösliche Fraktion kann ferner Phospholipide, Glycolipide und andere Lipide, Zucker, Nucleinsäuren etc. enthalten. In dem Fall jedoch, dass Pilzzellen verwendet werden, deren Zellwand zum Teil noch daran verbleibt, kann das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung, wenn es an einen lebenden Körper verabreicht wird, Komponenten enthalten, welche von der Zellwand stammen, solange wie die Komponenten quantitativ oder qualitativ keine Nebenwirkungen wie eine Hypersensibilität oder Letalität in dem lebenden Körper hervorrufen. Das Ausmaß der Verunreinigung mit diesen antigenen Komponenten, welche von der Zellwand stammen, kann zum Beispiel quantitativ dadurch bestimmt werden, dass die Hemmaktivität in einer Agglutinationsreaktion unter Verwendung eines Antiserums gegen die Zellwandkomponente, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, bestimmt wird.
Die unlösliche Fraktion der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel dadurch erhalten werden, dass die Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist, aufgebrochen werden. Außerdem kann eine ausgefällte Fraktion, welche dadurch erhältlich ist, dass die durch das Aufbrechen erhaltenen Komponenten bei etwa 100.000 × g zentrifugiert werden, auch als unlösliche Fraktion verwendet werden.
Wie erwähnt, ist das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung eine solubilisierte Fraktion, welche aus der unlöslichen Fraktion der vorliegenden Erfindung extrahiert und davon abgetrennt wurde. Die solubilisierte Fraktion enthält vorwiegend antigene lösliche Proteine. Zusätzlich können auch Zucker und Lipide darin enthalten sein. Die solubilisierte Fraktion kann zum Beispiel mittels Filtration in dem Reinigungsschritt sterilisiert werden, wodurch die Zubereitung von antigenen Komponenten ermöglicht wird, welche gegenüber Sterilisierungsverfahren durch Erhitzen oder mittels organischer Lösungsmittel empfindlich sind, wobei die Aktivität in dem Solubilisierungsschritt aufrechterhalten wird. Eine solche solubilisierte Fraktion kann mittels Extraktion und Abtrennung davon mit einem Puffer, der einen Lösungsvermittler enthält, zum Beispiel einem Puffer, enthaltend einen oberflächenaktiven Stoff, erhalten werden.
Ferner kann das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung eine Fraktion sein, welche dadurch erhalten wird, dass die solubilisierte Fraktion mittels eines Trenn- und Reinigungsverfahrens, welches für diesen Zweck geeignet ist, weiter gereinigt wird. Zum Beispiel wird eine Fraktion, die ein Molekül enthält, welches die Fähigkeit hat, an ein Zuckergruppen-spezifisches Affinitätsmedium zu binden, dadurch erhalten, dass eine solubilisierte Fraktion von Candida albicans TIMM 1768 als ein Ausgangsmaterial mit einem Adsorptionsmittel behandelt wird, wobei diese Fraktion ebenfalls als das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Das Zuckergruppen-spezifische Affinitätsmedium schließt zum Beispiel immobilisiertes Concanavalin A (ConA)-Medium ein. Da ConA an Moleküle bindet, die α-D-Mannopyranose, α-D-Glucopyranose oder einen sterisch ähnlichen Zuckerrest davon enthalten, können die Komponenten, welche in der solubilisierten Fraktion enthalten sind, basierend auf den Unterschieden in Bezug auf den Zuckerrest, der in jeder Komponente enthalten ist, mit Hilfe von Con A, immobilisiert an ein Harz, weiter in verschiedene Fraktionen aufgetrennt werden. Zum Beispiel hat eine Fraktion, die an ConA bindet und aus einer solubilisierten Fraktion von Candida albicans TIMM 1768 (einer Fraktion mit einem hohen Gehalt an Proteinen, die Zuckerreste enthalten, welche an ConA binden) abgetrennt werden kann, bei der Verabreichung an eine Maus eine ausreichende Schutzwirkung gegen eine Infektion.
Andererseits sind verschiedene Pilzantigene der vorliegenden Erfindung in Fraktionen vorhanden, die Moleküle umfassen, welche nicht die Fähigkeit besitzen, an ein Zuckergruppen-spezifisches Affinitätsmedium zu binden. Mit anderen Worten schließt das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung auch eine Fraktion ein, welche erhalten wird, wie vorstehend beschrieben, und Moleküle umfasst, welche nicht die Fähigkeit besitzen, an ein Zuckergruppen-spezifisches Affinitätsmedium zu binden, wobei es eine Fraktion einschließen kann, welche dadurch erhalten wird, dass eine solche Fraktion weiter gereinigt wird. Zum Beispiel können gereinigte Fragmente erhalten werden, wenn eine Fraktion, die nicht an ConA bindet und von Candida albicans TIMM 1768 stammt, einer Ionenaustauschchromatographie etc. unterzogen wird, wobei die Fragmente umfassen: ein antigenes Protein mit der partiellen Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 1 in dem Sequenzprotokoll dargestellt, und mit einem Molekulargewicht von etwa 65.000 (SOS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen); ein antigenes Protein mit der partiellen Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 in dem Sequenzprotokoll dargestellt, und mit einem Molekulargewicht von etwa 25.000 (SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen); ein antigenes Protein mit der partiellen Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 3 in dem Sequenzprotokoll dargestellt, und mit einem Molekulargewicht von etwa 30.000 (SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen); und ein antigenes Protein mit der partiellen Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 4 in dem Sequenzprotokoll dargestellt, und mit einem Molekulargewicht von etwa 62.000 (SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen). Die gereinigte Fraktion oder irgendein isoliertes antigenes Protein, welche/s als das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind bei der Therapie und Diagnose von Krankheiten, die durch Pilze hervorgerufen wird, nützlich. Insbesondere sind die isolierten antigenen Proteine bei der Identifizierung der auslösenden Antigene etc. während einer Diagnose nützlich.
Die antigenen Proteine stammen von Candida albicans und besitzen eine Impfstoffaktivität gegen Infektionskrankheiten, welche durch Candida albicans hervorgerufen werden, oder besitzen eine Allergenaktivität, welche bei der Vorbeugung und der Therapie von allergischen Symptomen, welche durch Candida albicans hervorgerufen werden, nützlich ist. Der Begriff "Impfstoffaktivität", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, bedeutet, dass der Impfstoff, welcher durch ein herkömmliches Verfahren unter Verwendung des Pilzantigens der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, eine pharmakologische Wirkung zeigt, welche in einem Impfstoff wirksam ist. Der Begriff "Allergenaktivität" bedeutet, dass in einem Test zur Messung des IgE-Antikörpertiters gegen das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung mittels RAST etc. unter Verwendung eines Serums von einem Patienten mit einer Allergose ein ungewöhnlich hoher Wert erhalten wird oder in einem Hauttest unter Verwendung des Pilzantigens der vorliegenden Erfindung eine positive Reaktion beobachtet wird.
Zum Zwecke der Erhöhung der Stabilität des Pilzantigens und/oder der Erhöhung der gewünschten Reaktionsfähigkeit, d. h. zur Verstärkung der Induktion einer individuellen protektiven Immunität, zur Abschwächung von allergischen Reak tionen oder zur Inaktivierung von Enzymen für therapeutische Zwecke sowie zur Verstärkung der spezifischen Antigen-Antikörper-Bindung für diagnostische Zwecke, ist es übrigens möglich, ein antigenes Protein oder ein antigenes Fragment zu einem Derivat hiervon zu modifizieren oder es mittels der PEG-Methode [Wie et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., Bd. 64 (1981), 84–99] an Polyethylenglykol (PEG) zu binden. Proteinmodifikationen schließen eine Pyridylethylierung, Reduktion, Alkylierung, Acylierung, eine chemische Kopplung an geeignete Träger, eine milde Formalinbehandlung und eine Guanidinhydrochlorid-Behandlung ein.
Alternativ können basierend auf der Information für eine partielle Aminosäuresequenz des vorstehend isolierten antigenen Proteins mittels PCR oder einer ähnlichen Methode Nucleinsäuren isoliert werden, die das Antigen codieren. Ein Beispiel hierfür wird nachstehend beschrieben:
Zunächst wird eine cDNA-Bank aus Zellen, exprimierend ein gewünschtes antigenes Protein, hergestellt. Anschließend wird mit der genomischen DNA der Zelle, exprimierend das antigene Protein, als eine Matrize eine PCR unter Verwendung eines als Amplifikationsprimer verwendbaren Oligonucleotids, welches basierend auf der Nucleotidsequenz der Nucleinsäure entworfen wurde, von der angenommen wird, dass sie eine partielle Aminosäuresequenz eines antigenen Proteins codiert, und eines geeigneten Oligonucleotids, welches in der Lage ist, mit dem vorstehenden Oligonucleotid für die obige Nucleinsäure ein Amplifikationsprimerpaar zu bilden, durchgeführt. Durch eine Hybridisierung unter Verwendung eines DNA-Fragments, welches durch die vorstehende PCR erhalten wurde, kann aus der cDNA-Bank eine DNA ausgewählt werden, die das gewünschte antigene Protein codiert. Zum Beispiel kann mittels des vorstehenden Verfahrens aus einer cDNA-Bank von Candida albicans TIMM 1768 unter Verwendung der Aminosäuresequenzinformation, die in SEQ ID NO: 1 in dem Sequenzprotokoll beschrieben ist, und der genomischen DNA von Candida albicans TIMM 1768 eine DNA isoliert werden, welche die in SEQ ID NO: 7 in dem Sequenzprotokoll dargestellte Nucleotidsequenz aufweist, die ein Protein codiert, das die in SEQ ID NO: 5 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst.
Ferner können mittels einer RT-PCR unter Verwendung der RNA von Zellen, welche das gewünschte antigene Protein exprimieren, und von Amplifikationsprimern, welche basierend auf der Nucleotidsequenz einer Nucleinsäure entworfen wurden, aus deren Sequenz abgeleitet wurde, dass sie eine partielle Aminosäuresequenz codiert, und einer ähnlichen Methode Nucleinsäuren isoliert werden, welche das antigene Protein codieren. Zum Beispiel kann mittels des vorstehenden Verfahrens unter Verwendung der in SEQ ID NO: 2 in dem Sequenzprotokoll beschriebenen Aminosäuresequenzinformation und der RNA von Candida albicans TIMM 1768 eine DNA, umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 8 in dem Sequenzprotokoll, welche ein Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 6 in dem Sequenzprotokoll codiert, isoliert werden. Im Übrigen sind in der vorliegenden Erfindung die Nucleinsäuren, die ein Pilzantigen codieren, das ein Protein mit der in SEQ ID NO: 5 in dem Sequenzprotokoll beschriebenen Aminosäuresequenz umfasst, nicht besonders auf Nucleinsäuren begrenzt, welche die in SEQ ID NO: 7 dargestellte Nucleotidsequenz aufweisen. In gleicher Weise sind die Nucleinsäuren, die ein Pilzantigen codieren, das ein Protein mit der in SEQ ID NO: 6 in dem Sequenzprotokoll beschriebenen Aminosäuresequenz umfasst, nicht besonders auf Nucleinsäuren begrenzt, welche die in SEQ ID NO: 8 in dem Sequenzprotokoll dargestellte Nucleotidsequenz aufweisen. Insbesondere ist im Hinblick auf das Codon, das eine Aminosäure in einem Gen festlegt (Triplett-Basenkombination), bekannt, dass es für jede Art von Aminosäure 1 bis 6 verschiedene Codons gibt. Daher kann es abhängig von der Aminosäuresequenz eine Vielzahl von Nucleinsäuren geben, welche die Aminosäuresequenz codieren. In der Natur ist die Nucleinsäure nicht stabil, wobei es nicht ungewöhnlich ist, dass Variationen der Nucleinsäure auftreten. In einigen Fällen wird durch eine Mutation in der Nucleinsäure keine Veränderung der codierten Aminosäuresequenz hervorgerufen (stumme Mutation). in diesem Fall kann davon ausgegangen werden, dass unterschiedliche Nucleinsäuren, welche dieselbe Aminosäuresequenz codieren, hergestellt wurden. Daher kann die Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden, dass, selbst wenn eine Nucleinsäure isoliert wird, die eine bestimmte Aminosäuresequenz codiert, bei der Passage der Generationen der Organismen, welche die Nucleinsäuren enthalten, eine Vielzahl von Nucleinsäuren, welche dieselbe Aminosäuresequenz codieren, hergestellt wird. Außerdem ist es mit Hilfe von verschiedenen gentechnischen Verfahren ohne weiteres möglich, eine Vielzahl von Nucleinsäuren herzustellen, welche dieselbe Aminosäuresequenz codieren.
Bei der Herstellung eines Proteins mittels gentechnischer Verfahren ist die Menge des exprimierten Proteins zum Beispiel zuweilen gering, falls ein Codon, das in dem natürlichen Gen, welches das gewünschte Protein codiert, verwendet wird, in dem verwendeten Wirt nur wenig Verwendung findet. In einem solchen Fall kann eine hohe Expressionsrate des gewünschten Proteins dadurch erreicht werden, dass das Codon zu einem anderen Codon, das in dem Wirt häufig gebraucht wird, künstlich verändert wird, ohne die dadurch codierte Aminosäuresequenz zu verändern (vgl. zum Beispiel die geprüfte Japanische Patentveröffentlichung Nr. Hei 7-102146 ). Es ist natürlich auch möglich, eine Vielzahl von Genen künstlich herzustellen, die eine bestimmte Aminosäuresequenz codieren.
Darüber hinaus umfassen die Nucleinsäuren, welche das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung codieren, auch Nucleinsäuren, welche in der Lage sind, mit einer Nucleinsäure, umfassend die gesamte Sequenz der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 5 oder 6 in dem Sequenzprotokoll oder eine partielle Sequenz davon, zu hybridisieren, wobei das Peptid, welches durch die vorstehende Nucleinsäure codiert wird, eine Impfstoffaktivität oder eine Allergenaktivität hat, welche zu dem Pilzantigen der vorliegenden Erfindung äquivalent ist. Der Begriff "befähigt zur Hybridisierung" kann durch die folgenden Bedingungen beispielhaft veranschaulicht werden: Genauer wird eine Membran, auf der eine DNA immobilisiert wurde, mit einer Sonde bei 50°C für 12 bis 20 Stunden in 6× SSC (1× SSC entspricht 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0), enthaltend 0,5% SDS, 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Ficoll 400 und 0,01% denaturierte Lachssperma-DNA, inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wird die Membran zunächst bei 37°C in 2× SSC, enthaltend 0,5% SDS, gewaschen. Anschließend wird die SSC-Konzentration auf 0,1× SSC und wird die SSC-Temperatur auf 50°C erhöht, bis ein Signal durch die immobilisierte DNA von dem Hintergrund unterschieden werden kann.
Wenn die vorstehende Nucleinsäure verwendet wird, kann ein antigenes Protein mittels eines gentechnischen Verfahrens als ein rekombinantes Protein in Escherichia coli, Hefen, Pilzen, Säugerzellen oder dergleichen hergestellt werden. Zusätzlich kann ein antigenes Fragment des vorstehenden antigenen Proteins mit Hilfe eines gentechnischen Verfahrens unter Verwendung eines partiellen Teils der vorstehenden Nucleinsäure hergestellt werden.
Die Toxizität des Pilzantigens der vorliegenden Erfindung (Ca-LSP in Beispiel 1) ist gering, so dass keine Anomalien beobachtet werden, selbst wenn es in einer Menge von 20 mg/kg intravenös an eine Maus verabreicht wird.
3. Verfahren zur Herstellung eines Pilzantigens
Das Verfahren zur Herstellung eines Pilzantigens, das eine unlösliche Fraktion ist, die aus Pilzzellen erhältlich ist, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist, schließt zum Beispiel ein Verfahren ein, welches die folgenden Schritte umfasst:

(1) Gewinnen von lebenden Pilzzellen;
(2) Gewinnen von Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist;
(3) Aufbrechen der Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist; und
(4) Gewinnen einer unlöslichen Fraktion. Dieses Verfahren wird hierin lediglich durch Bezugnahme angeführt.

Schritt (1)
Schritt (1) umfasst die Gewinnung von lebenden Pilzzellen. Insbesondere umfasst Schritt (1) das Züchten eines Pilzes in einem Kulturmedium, das für dessen Vermehrung geeignet ist, und das Gewinnen von frischen lebenden Pilzzellen.
Die Züchtung des Pilzes kann bei einer Temperatur und unter Bedingungen, bei denen der Pilz in einem Nährmedium, enthaltend Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und andere Nährstoffquellen, welche für jeden Pilz geeignet sind, wachsen kann, durchgeführt werden. Als Nährmedium, das üblicherweise für die Züchtung von Pilzen geeignet ist, kann im Allgemeinen Sabouraud-Medium, Kartoffel-Dextrose-Medium, Czapek-Dox-Medium, Malzmedium, ein chemisch definiertes Hefe-Stickstoff-Base-Medium und dergleichen breit verwendet werden, wobei gegebenenfalls Serum und/oder Serumalbumin zugesetzt werden kann. Es gibt auch einige Pilze, deren Wachstum in einem mit Olivenöl oder dergleichen supplementiertem Medium begünstigt wird, wie zum Beispiel Malassezia furfur. Obwohl die Züchtungstemperatur üblicherweise zwischen etwa 15°C und etwa 45°C liegt, werden bei einigen Pilzen morphologische Veränderungen in Abhängigkeit von der Züchtungstemperatur beobachtet (wobei viele davon als dimorphe Pilze bekannt sind), so dass die Züchtungstemperatur geeignet gewählt werden muss. Zum Beispiel wird im Falle von Candida albicans, wofür vorzugsweise eine Züchtungstemperatur im Bereich von 25°C bis 37°C verwendet wird, bei der Züchtung in einem herkömmlichen Medium bei etwa 30°C ein Hefephasen-Wachstum beobachtet, während bei etwa 37°C ein Myzelphasen-Wachstum wahrscheinlich ist. Für dimorphe Pilze können die Züchtungsbedingungen entsprechend dem Zweck angepasst werden, da sich dadurch auch die Zellwandkomponenten und Proteinkomponenten, wie die intrazellulären Proteine, einschließlich der Membranproteine, verändern. Viele Pilze bilden Aggregate oder Klumpen von Zellen, so dass unter üblichen Züchtungsbedingungen eine uneinheitliche Zellsuspension erhalten wird, wobei in diesem Fall die Zellwand-lytischen Enzyme etc. in dem nachfolgenden Schritt nicht hinreichend auf den Pilz einwirken können. Um eine Zellsuspension zu erhalten, welche so einheitlich wie möglich ist, kann das Züchtungsverfahren daher modifiziert werden. Im Falle von Aspergillus fumigatus kann dieses Problem zum Beispiel durch die Erhöhung der Salzkonzentration durch Zugabe von 0,5 M bis 1 M NaCl oder dergleichen zu dem Medium gelöst werden. Der Pilz kann durch die vorstehend beschriebenen Pilze beispielhaft veranschaulicht werden.
Schritt (2)
Schritt (2) umfasst die Gewinnung von Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist. Obwohl die Zellwand in einem Ausmaß entfernt werden kann, dass die Pilzzellen zumindest eine Empfindlichkeit gegenüber dem osmotischen Druck zeigen, wird bevorzugt, dass die Zellwand in dem Umfang weiter entfernt wird, dass Protoplasten gebildet werden. Daher sind die Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist, vorzugsweise die Protoplasten oder Sphäroplasten der Pilzzellen.
Die Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist, können zum Beispiel dadurch erhalten werden, dass man ein Zellwand-lytisches Enzym auf die Pilzzellen einwirken lässt, oder dass die Pilzzellen physikalisch behandelt werden. Die Behandlung mit dem Zellwand-lyti schen Enzym und die physikalische Behandlung können in Kombination miteinander angewendet werden.
Gegenwärtig sind verschiedene Zellwand-lytische Enzyme bekannt, wobei kommerzielle Produkte Zymolase (hergestellt durch Seikagaku Corporation), Lyticase (hergestellt durch Sigma), Yatalase (hergestellt durch Ozeki Corporation-Takara Shuzo Co., Ltd.), Chitinase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.), lytisches Enzym von Trichoderma (hergestellt durch Novo-Sigma), β-Glucuronidase-Enzym aus dem intestinalen Verdauungssaft der Schnecke (hergestellt durch Sigma) und Laminariase (hergestellt durch Sigma) einschließen. Diese Enzyme umfassen lytische Enzyme für verschiedene Zellwandpolysaccharide (Chitin, β-1,3-Glucan, Mannan, Galactomannan, Xyloglucan etc.), wobei viele davon auch eine Proteaseaktivität haben.
Um die Zellwand von Pilzzellen zu lysieren und um nackte Zellen herzustellen, welche gegenüber dem osmotischen Druck empfindlich sind, z. B. Protoplasten, werden die durch die Züchtung erhaltenen frischen Zellen zunächst gewaschen und dann in einem hypertonischen Puffer, enthaltend 0,8 M bis 1,5 M Sorbit, Mannit oder NaCl, suspendiert. Die erforderliche Menge des Zellwand-lytischen Enzyms wird bei einer Temperatur, in einem Puffer und bei pH-Bedingungen, welche für das Enzym geeignet sind, für einen Zeitraum von 10 Minuten bis mehrere Stunden auf die Suspension einwirken gelassen, um die Zellwand zu entfernen. Bei diesem Prozess kann eine vollständigere Entfernung der Zellwand dadurch erreicht werden, dass in einigen Fällen eine Protease darauf einwirken gelassen wird. Bei einigen Pilzen ist keine Einwirkung einer Protease erforderlich, wobei in diesem Fall ein Proteaseinhibitor wie PMSF oder Pepstatin zugegeben werden kann.
Die physikalische Behandlung kann zum Beispiel darin bestehen, dass die fraglichen Zellen in einem hypertonischen Puffer wie einer 2,5 M Sucrose-Lösung suspendiert werden, um eine Plasmolyse zu bewirken, oder die Zellwand mit Hilfe eines Messers entfernt wird.
Schritt (3)
Schritt (3) umfasst das Aufbrechen der Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist und welche in Schritt (2) erhältlich sind. Die Verfahren zum Aufbrechen von Zellen schließen zum Beispiel eine Ultraschallbehandlung, eine Behandlung in einer French-Presse sowie eine Behandlung in einer hypotonischen Lösung bei unterschiedlichen osmotischen Drücken ein. Das Aufbrechen durch eine Behandlung in einer hypotonischen Lösung kann dadurch erfolgen, dass die Zellen mit einer hypotonischen Lösung hinreichend gewaschen werden und die Zellen anschließend in einer hypotonischen Lösung, d. h. einer physiologischen Kochsalzlösung oder in einem Puffer mit einer geringen Ionenstärke (z. B. einer physiologischen Kochsalzlösung im Falle von Candida albicans TIMM 1768), suspendiert werden. Die Puffer, welche verwendet werden können, schließen zum Beispiel Phosphatpuffer und Citratpuffer, jeweils mit einem pH von 5 bis 8, ein. Um die Zellorganellen so intakt wie möglich zu gewinnen, kann die Ionenstärke ausgewählt werden. Um zum Beispiel die Mitochondrien in einem Zustand zu präparieren, welcher eine ähnliche Funktion wie in den Zellen sicherstellt, werden die Zellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist, dadurch aufgebrochen, dass die Zellen mit Hilfe von Ultraschall, einem Waring-Mischer, einer French-Presse oder dergleichen in einem Puffer, enthaltend 0,5 M bis 0,6 M Sorbit oder 0,25 M Sucrose, behandelt werden, wobei die Mitochondrien in einem Zustand gewonnen werden, welcher ähnliche Funktionen wie in den Zellen aufweist.
Schritt (4)
Schritt (4) umfasst die Gewinnung einer unlöslichen Fraktion.
Die Komponenten, die in Schritt (3) durch das Aufbrechen erhalten werden, werden zentrifugiert oder filtriert, um ein Präzipitat oder einen Rückstand zu erhalten, das bzw. der als die unlösliche Fraktion verwendet wird. Die Komponenten, die durch das Aufbrechen erhalten werden, können mit Hilfe von Ultraschall oder Glaskügelchen, falls erforderlich, weiter fein zerkleinert werden.
Obwohl die Zentrifugationsbedingungen für die Gewinnung der unlöslichen Fraktion nicht besonders begrenzt sind, wird bevorzugt, dass die Zentrifugation bei etwa 100.000 × g oder weniger, mehr bevorzugt 10.000 × g oder weniger, durchgeführt wird, und dass die Zentrifugationszeit zwischen 10 Minuten und 3 Stunden beträgt.
Die Komponenten, welche durch eine Zentrifugation bei 100.000 × g oder weniger in Form eines Präzipitats gewonnen werden können, sind cytoplasmatische Membranen und Zellorganellen wie Mitochondrien, Kerne, Lysosomen und Vakuolen. Die cytoplasmatischen Membranproteine und die Membranproteine der Zellorganellen können in Form von Präzipitaten, worin das Protein an die Membran gebunden ist, erhalten werden.
Bei einer Zentrifugation bei 100.000 × g für etwa eine Stunde werden die Ribosomen ebenfalls in Form eines Präzipitats gewonnen, das in der unlöslichen Fraktion enthalten sein kann. Die Zentrifugationsbedingungen können verändert werden, um einzelne Zellorganellen zu einem gewissen Teil abzutrennen. Zum Beispiel ermöglicht eine Zentrifugation bei etwa 1000 × g eine Abtrennung der Kerne. Die oben erwähnten Zellorganellen können auch durch eine Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Sucrose etc. abgetrennt und gereinigt werden. Es ist auch möglich, die unlösliche Fraktion durch Filtration zu gewinnen, wobei sie bis zu einem gewissen Grad der Partikelgröße nach klassifiziert werden kann.
Da die so erhaltene unlösliche Fraktion aus Pilzzellen gewonnen wird, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist, wie aus den Protoplasten oder Sphäroplasten der Pilzzellen, ist der Anteil der Zellwandkomponenten, welche in der unlöslichen Fraktion enthalten sein können, gering. Zum Beispiel kann der Anteil der Zellwandkomponente, welche in der unlöslichen Fraktion der vorliegenden Erfindung enthalten ist, mittels einer Antigen-Antikörper-Reaktion, wobei die Zellwandkomponente als Antigen verwendet wird, quantitativ bestimmt werden. Insbesondere kann zum Beispiel, falls die verwendeten Pilzzellen von Candida albicans TIMM 1768 stammen, der Anteil des Serotyp A-Mannans in der unlöslichen Fraktion unter Verwendung des Serumfaktors Nr. 1 (hergestellt durch latron Laborstories, Inc.), der aus einem anti-Candida-Serum besteht, quantitativ bestimmt werden, wie nachstehend in den Beispielen ausführlich beschrieben wird. Der auf diese Weise bestimmte Anteil an Serotyp A-Mannan ist vorzugsweise nicht höher als der Wert für die Nachweisgrenze (0,5 mg/ml).
Die unlösliche Fraktion, welche erhältlich ist, wie vorstehend beschrieben, kann auch gewaschen und mit einem organischen Lösungsmittel wie Ethanol, Isopropanol, Phenol oder Acetonitril sterilisiert oder mittels einer Hitzebehandlung sterilisiert werden.
Die unlösliche Fraktion der vorliegenden Erfindung kann, wie vorstehend beschrieben, erhalten werden. In der vorliegenden Erfindung ist eine solubilisierte Fraktion, welche durch das Extrahieren und Abtrennen von der unlöslichen Fraktion erhältlich ist, ebenfalls als ein Pilzantigen wirksam. Die solubilisierte Fraktion kann zum Beispiel durch ein Verfahren erhalten werden, welches die folgenden Schritte umfasst:

(1) Gewinnen von lebenden Pilzzellen;
(2) Gewinnen von Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist;
(3) Aufbrechen der Pilzzellen, deren Zellwand im Wesentlichen entfernt oder zumindest teilweise entfernt worden ist;
(4) Gewinnen einer unlöslichen Fraktion; und
(5) Extrahieren und Abtrennen einer solubilisierten Fraktion von der unlöslichen Fraktion.

In der vorliegenden Erfindung kann die solubilisierte Fraktion gegebenenfalls entsprechend dem Verwendungszweck in einem Schritt (6) durch herkömmliche Trenn- und Reinigungsverfahren weiter aufgetrennt und gereinigt werden.
Von den vorstehenden Schritten entsprechen die Schritte (1) bis (4) den Schritten für das Verfahren zur Herstellung einer unlöslichen Fraktion. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass, obwohl die Zellwandkomponente in der unlöslichen Fraktion, die in diesen Schritten verwendet werden kann, vorzugsweise in einem Ausmaß entfernt wird, dass die unlösliche Fraktion klinisch verwendet werden kann, dieses Ausmaß nicht immer dem Grad des Ausmaßes entsprechen muss, bei dem die unlösliche Fraktion per se als das Pilzantigen verwendet wird. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Zellwand von Pilzzellen reich an Glucan, Chitin etc. ist, wobei einige Komponenten davon zum Beispiel durch oberflächenaktive Stoffe nicht löslich sind und in dem nachfolgenden Schritt, umfassend das Gewinnen einer solubilisierten Fraktion, abgetrennt werden können. Die Schritte (5) und (6) werden nachstehend beschrieben.
Schritt (5)
Schritt (5) umfasst das Extrahieren und Abtrennen einer solubilisierten Fraktion von der unlöslichen Fraktion, wobei die Extraktion und die Abtrennung mittels Verfahren erfolgen kann, welche im Allgemeinen bei einer Solubilisierung angewendet werden. Die Lösungsvermittler hierfür schließen zum Beispiel Salze wie NaCl und KCl; Chelatbildner wie EDTA; organische Lösungsmittel wie Butanol; und Puffer, worin ein Proteindenaturierungsmittel wie Harnstoff gelöst ist, ein, wobei unter dem Gesichtspunkt der Stabilität der solubilisierten Komponenten und der Extraktionseffizienz die Verwendung eines Puffers, der einen oberflächenaktiven Stoff enthält, bevorzugt wird. Falls keine ausreichende Extraktionswirkung erreicht werden kann, können die oben angeführten organischen Lösungsmittel und Proteindenaturierungsmittel in Kombination miteinander verwendet werden. Im Allgemeinen kann eine solubilisierte Fraktion dadurch erhalten werden, dass die in Schritt (4) erhältliche unlösliche Fraktion in einem Puffer, enthaltend einen geeigneten Lösungsvermittler wie einen oberflächenaktiven Stoff für einen bestimmten Zeitraum suspendiert wird und dann die unlöslichen Komponenten mittels Zentrifugation und/oder Filtration entfernt werden. Der Begriff "solubilisierte Fraktion", wie hierin verwendet, soll wasserlösliche Komponenten, welche die unlösliche Fraktion begleiten, wie zum Beispiel intraorganellare wasserlösliche Komponenten und/oder durch eine Solubilisierungsbehandlung solubilisierte Komponenten, einschließlich zum Beispiel cytoplasmatischer Membranproteine und Lipide, einschließen. Falls ein klinisch verwendbarer oberflächenaktiver Stoff verwendet wird, kann die solubilisierte Fraktion per se ohne Entfernung des oberflächenaktiven Stoffes als ein Pilzantigen verwendet werden.
Der oberflächenaktive Stoff, welcher bei der Solubilisierung der Membranproteine etc., die in der erfindungsgemäß verwendbaren unlöslichen Fraktion enthalten sind, verwendet werden kann, ist vorzugsweise Octylthioglucosid, Lubrol PX, Triton X-100, Nonidet P-40 und dergleichen. Die klinisch verwendbaren oberflächenaktiven Stoffe schließen ionische (anionische, kationische, amphotere) oberflächenaktive Stoffe (z. B. Alkylsulfonate, Benzalkoniumchloride und dergleichen) und nichtionische oberflächenaktive Stoffe (z. B. Polyoxyethylen-hydrierte Castoröle, Polyoxyethylen-Sorbitolfettsäureester, Polyoxyethylen-Sorbitanfettsäureester, Polyoxyethylen-Glycerinfettsäureester, Polyethylenglykol-Fettsäureester, Polyoxyethylen-Alkylphenylester und dergleichen) ein. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete oberflächenaktive Stoff ist vorzugsweise ein nichtionischer oberflächenaktiver Stoff. Die Polyoxyethylen-hydrierten Castoröle schließen zum Beispiel NIKKOL HCO-40, HCO-50 und HCO-60 (hergestellt durch Nikko Chemicals) und Uniox HC-40, HC-50 und HC-60 (hergestellt durch NOF Corporation) ein.
Die Polyoxyethylen-Sorbitolfettsäureester schließen zum Beispiel NIKKOL GO-430, GO-440, GO-460, GL-1, Atlox 1045A, 1196, G-1045 und G-1441 (hergestellt durch Kao Atlas) ein. Die Polyoxyethylen-Sorbitanfettsäureester schließen Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Emasol 1130, Emasol 3130, NIKKOL TL-1010, TP-10, TS-10 und dergleichen ein. Die Polyoxyethylen-Glycerinfettsäureester schließen zum Beispiel NIKKOL TMGS-15, TMGS-5 und dergleichen ein. Die Polyethylenglykol-Fettsäureester schließen zum Beispiel NIKKOL MYL-110, MYS-10 und dergleichen ein. Die Polyoxyethylen-Alkylphenylesther schließen NIKKOL NP-10, Emulgen 810 und dergleichen ein.
Unter dem Gesichtspunkt der Beibehaltung der Antigenität etc. ist es selbstverständlich, dass ein besonders geeigneter Typ eines oberflächenaktiven Stoffes sowie eine optimale Konzentration davon für die löslichen Komponenten gewählt wird. Im Allgemeinen ist der oberflächenaktive Stoff wirksam, solange wie die Konzentration des oberflächenaktiven Stoffes einem Wert entspricht, der gleich oder höher als die Konzentration ist, bei welcher der oberflächenaktive Stoff eine Mizelle bildet, wenn er in einem wässrigen Lösungsmittel gelöst wird, d. h. einem Wert, der gleich oder höher als die kritische Mizellenkonzentration (nachstehend bezeichnet als "CMC") ist. Der oberflächenaktive Stoff wird vorzugsweise in Konzentrationen im Bereich der CMC oder höher und bis zu dem 10fachen der CMC verwendet, wobei eine besonders gute Wirkung erreicht wird, wenn die Solubilisierung bei Konzentrationen im Bereich der CMC bis zu dem 5fachen der CMC durchgeführt wird. Die Puffer schließen Phosphatpuffer und Tris-HCl-Puffer ein.
Die Solubilisierung wird üblicherweise dadurch bewirkt, dass die unlösliche Fraktion stehen gelassen wird oder dass die unlösliche Fraktion bei einer niedrigen Temperatur von etwa 4°C für eine Stunde bis über Nacht gerührt wird. Bei diesem Prozess kann ein Proteaseinhibitor zugegeben werden. Die solubilisierte Fraktion kann zum Beispiel als ein Überstand der bei etwa 100.000 × g für etwa eine Stunde zentrifugierten Flüssigkeit der Solubilisierungsbehandlung oder als ein Filtrat der filtrierten Flüssigkeit der Solubilisierungsbehandlung erhalten werden. Es ist auch möglich, den Lösungsvermittler, der für die Solubilisierung verwendet wurde, mittels einer Dialyse des Überstands oder des Filtrats gegen einen Puffer, der frei von einem Lösungsvermittler ist, oder einen Puffer, der einen klinisch verwendbaren oberflächenaktiven Stoff enthält, zu entfernen. Die solubilisierte Fraktion kann auch gewaschen und mit einem organischen Lösungsmittel wie Ethanol, Isopropanol, Phenol oder Acetonitril sterilisiert oder mittels einer Hitzebehandlung sterilisiert werden.
Außerdem, falls die solubilisierte Fraktion gegen einen Puffer dialysiert wird, der frei von einem Lösungsvermittler ist, wird ein Teil der hydrophoben Komponenten einschließlich der Lipide in Form von Präzipitaten gewonnen. Diese ausgefällten Komponenten sowie die Komponenten in Lösung sind alle im Schutzumfang für die solubilisierte Fraktion in der vorliegenden Beschreibung eingeschlossen.
In der vorliegenden Erfindung kann als Schritt (6) die solubilisierte Fraktion entsprechend dem Verwendungszweck durch herkömmliche Trenn- und Reinigungsverfahren, einschließlich zum Beispiel mittels einer Trennung und Reinigung basierend auf Unterschieden im Hinblick auf die Affinität der Komponente, den Ladungszustand, das Molekulargewicht, die Hydrophobie und dergleichen, wie gewünscht, weiter gereinigt werden. Zum Beispiel kann die solubilisierte Fraktion mittels Fraktionierung basierend auf Unterschieden im Hinblick auf die Zuckerreste, welche in dem Glycoprotein enthalten sind, mit einem Zuckergruppen-spezifischen Affinitätsmedium gereinigt werden. Das Zuckergruppen-spezifische Affinitätsmedium schließt zum Beispiel ein immobilisiertes ConA-Medium ein. Insbesondere wird ConA gebunden an ein Harz bevorzugt, um eine Komponente abzutrennen, die einen Zuckerrest enthält, der an ConA bindet (einen α-D-Glucoserest oder α-D-Mannoserest, worin die C3-, C4- und C6-Hydroxylgruppen unsubstituiert sind), z. B. ein Glycoprotein, das in vielen Pilzen vorkommt, welches reich an Mannoseresten ist, die an ConA binden. Für die Reinigung wird die Verwendung eines Puffers entsprechend dem Verwendungszweck davon bevorzugt, wobei auch ein oberflächenaktiver Stoff, ein organisches Lösungsmittel und dergleichen zugegeben werden kann. Der Reinigungsgrad kann durch die Verwendung eines Ionenaustauschharzes oder eines Gelfiltrationsträgers erhöht werden.
In der vorliegenden Erfindung kann das erfindungsgemäße Pilzantigen auch in einfacher Weise durch herkömmliche gentechnische Verfahren unter Verwendung einer Nucleinsäure, die das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung codiert, wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden.
4. Biologische Produkte
Das biologische Produkt der vorliegenden Erfindung enthält ein Pilzantigen, wie vorstehend beschrieben, als einen aktiven Bestandteil. Ein biologisches Produkt ist ein Impfstoff oder eine ähnliche Zubereitung, welche von einem pathogenen Mikroorganismus einer Infektionskrankheit abgeleitet ist und zur Diagnose, Vorbeugung oder Behandlung einer Krankheit oder Störung verwendet wird. In der vorliegenden Erfindung wird daher ein Pilz als Ausgangsmaterial verwendet. Daneben ist auch ein biologische Produkt eingeschlossen, das ein therapeutisches Serum oder dergleichen enthält, welches unter Verwendung des Antigens der vorliegenden Erfindung erhältlich ist. Unter anderem ist das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung, das eine große Zahl von verschiedenen Pilzproteinen enthält, in der Lage, eine erworbene Immunität in Wirbeltieren hervorzurufen, so dass es insbesondere vorzugsweise in einer Impfstoffzusammensetzung verwendet werden kann. Mit anderen Worten enthält die Impfstoffzubereitung der vorliegenden Erfindung, welche eine protektive Immunität gegen eine Infektion hervorruft oder einen therapeutische Effekt gegen eine mykotische Infektionskrankheit in Wirbeltieren vorsieht, das vorstehend beschriebene Pilzantigen als einen Wirkstoffbestandteil. Das Pilzantigen, welches in dem biologischen Produkt oder der Impfstoffzusammensetzung der vorliegenden Erfindung als ein Wirkstoffbestandteil enthalten ist, kann zum Beispiel durch das vorstehend beschriebene Herstellungsverfahren erhalten werden. Im Übrigen wird in der vorliegenden Beschreibung eine Impfstoffzusammensetzung in einigen Fällen einfach als ein Impfstoff bezeichnet.
Wenn das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung als eine Impfstoffzusammensetzung verwendet wird, wird bevorzugt, dass das Pilzantigen in Form einer Zubereitung als eine Suspension oder eine Lösung, enthaltend ein Adjuvans, wie nachstehend beschrieben, verabreicht wird, um eine wirksamere humorale und/oder zelluläre Immunität zu erreichen. Obwohl das Adjuvans üblicherweise zusammen mit dem Antigen verabreicht wird, kann das Adjuvans vor oder nach der Verabreichung des Antigens verabreicht werden. Die Adjuvanzien, welche für die Impfung von Säugern geeignet sind, schließen komplettes oder inkomplettes Freundsches Adjuvans; Gele aus anorganischen Substanzen wie Aluminiumhydroxid und Alaun; oberflächenaktive Stoffe wie Lysolecithin, Dimethyloctadecylammoniumbromid und Lysolecithin; Polyanionen wie Dextransulfat und Poly-IC; Peptide wie Muramyl dipeptid und Tuftsin; Monophosphoryllipid A (MPL), hergestellt durch Ribi; TiterMax, hergestellt durch CytRx; und die Choleratoxin B-Untereinheit, ohne darauf begrenzt zu sein, ein. Das Antigen kann auch dadurch verabreicht werden, dass es in ein Liposom oder einen anderen Mikroträger eingebracht wird. Selbstverständlich können auch Antigene von verschiedenen Pilzen in Vermischung miteinander verwendet werden, wodurch eine protektive Immunität gegen eine Vielzahl von mykotischen Infektionskrankheiten hervorgerufen wird. Die Impfstoffzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in Kombination mit antifungalen Mitteln wie Fluconazol und Amphotericin B sowie β-Lactam-Antibiotika und verschiedenen anderen antibakteriellen/antimikrobiellen Mitteln verwendet werden. Die Impfstoffzusammensetzung der vorliegenden Erfindung zeigt eine additive oder geometrisch erhöhte Wirksamkeit, wenn sie in Kombination mit einem antifungalen Mittel verwendet wird.
Wirbeltiere schließen Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel, Menschen und Säugetiere mit Ausnahme von Menschen ein, welche Antikörper als Reaktion auf Antigene produzieren, so dass alle Wirbeltiere in der Lage sind, mit Impfstoffen zu reagieren. Obwohl Impfstoffe im Allgemeinen an Säuger wie Menschen oder Haustiere verabreicht werden, sind Wirbeltiere, z. B. Fische, welche zu kommerziellen Zwecken gezüchtet werden, im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, solange wie sie die vorstehend beschriebenen Eigenschaften besitzen.
Im Hinblick auf den Verabreichungsweg kann das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung oral, transmukosal (z. B. nasal, intravaginal), perkutan (subkutan oder intrakutan) oder intravenös verabreicht werden. Typische Anfangsdosen sind Proteinmengen von 0,001 bis 5 mg/kg Körpergewicht, wobei die Dosis abhängig von dem erforderlichen Schutzgrad oder der Therapie erhöht werden kann oder die Anzahl der Verabreichungen erhöht werden kann.
Bei der Verabreichung einer solubilisierten Fraktion, die ein Pilzantigen der vorliegenden Erfindung ist, kann eine wirksame zelluläre Immunität und/oder humorale Immunität induziert werden, wodurch eine Pilzinfektion verhindert oder behandelt werden kann. Die protektiven Effekte und die therapeutischen Effekte können nicht nur gegen den Pilz von Interesse zum Schutz oder zur Therapie induziert werden, sondern auch gegen andere Pilze, wenngleich mit einer geringeren Wirksamkeit. Dies ist vermutlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Antigen-Gemeinsamkeiten zwischen Pilzen und/oder die Aktivierung des Immunsystems die Freisetzung von Superoxidanionen, Stickstoffoxid und verschiedenen Cytokinen, die ein breites antimikrobielles Wirkungsspektrum haben, induzieren.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung bereit: 1) eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Induktion einer protektiven Immunität gegen Pilze oder zum Vorsehen von therapeutischen Effekten durch die Verabreichung davon an Individuen, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung das oben beschriebene Pilzantigen oder ein Pilzantigen, das durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt wurde, enthält; und 2) eine Impfstoffzusammensetzung für die Induktion einer protektiven Immunität gegen Pilze oder zum Vorsehen von therapeutischen Effekten durch die Verabreichung davon an Individuen, dadurch gekennzeichnet, dass die Impfstoffzusammensetzung das oben beschriebene Pilzantigen oder ein Pilzantigen, das durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt wurde, enthält.
Das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung kann in Form eines biologischen Produkts wie eines Cytokin-freisetzenden Mittels, einer Allergenzusammensetzung, die für eine Desensibilisierungstherapie von Allergosen und andere Zwecke verwendet werden kann, und der oben beschriebenen Impfstoffzusammensetzung verwendet werden. Ferner kann das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung auch für eine in-vivo-Diagnose und/oder Labordiagnose zur Ermittlung der Vorgeschichte einer Infektion durch eine Hautreaktion, für eine Allergosediagnose durch einen Kratztest und für andere Zwecke verwendet werden. Die für eine Labordiagnose verwendeten Zubereitungen schließen zum Beispiel immunologische diagnostische Mittel wie Mikrotiter-Reagenzien, Latex-Agglutinationsreagenzien, immunnephelometrische Reagenzien und Reagenzien für einem Enzymimmuntest ein.
Bei der Verabreichung an ein Individuum kann das Cytokin-freisetzende Mittel der vorliegenden Erfindung in Form eines gefriergetrockneten Pulvers oder einer geeigneten Salzlösung oder Suspension oder einer Suspension oder Lösung, enthaltend das vorstehend beschriebene Adjuvans, verwendet werden. Das Cytokinfreisetzende Mittel kann auch als ein therapeutisches Mittel für eine Krankheit, gegen welche das Cytokin-freisetzende Mittel wirksam ist, verwendet werden. Falls zum Beispiel das freigesetzte Cytokin IFN-γ ist, kann das Cytokin-freisetzende Mittel als ein therapeutisches Mittel gegen Krebserkrankungen, bakterielle Infektionskrankheiten und Allergosen verwendet werden.
Im Hinblick auf den Verabreichungsweg kann das Mittel perkutan (subkutan oder intrakutan), mittels Zerstäubung intrapulmonal, transmukosal (z. B. in die Nase, das Auge, die Vagina oder dergleichen), oral, sublingual oder intravenös verabreicht werden. Zum Beispiel ist eine typische Dosis für die Behandlung einer Krebserkrankung 0,02 μg bis 1 mg/kg pro Verabreichung im Falle eines Menschen, wobei die Dosis abhängig von der zu behandelnden Krankheit und dem erforderlichen Zweck erhöht werden kann oder die Anzahl der Verabreichungen erhöht werden kann.
Falls die Allergenzusammensetzung der vorliegenden Erfindung an einen Patienten zu dem Zweck verabreicht wird, eine Allergose zu verhindern oder zu behandeln, kann die Allergenzusammensetzung in Form einer geeigneten Salzlösung oder Suspension verwendet werden und kann mit Polyethylenglykol oder Phenol supplementiert werden. Die Allergenzusammensetzung kann ferner auch als eine Suspension oder Lösung, enthaltend ein Adjuvans, das für die Herstellung von Impfstoffzubereitungen für Säuger geeignet ist, wie oben beschrieben, verabreicht werden. Das Adjuvans kann üblicherweise zusammen mit einem Antigen verabreicht werden, oder es kann vor oder nach der Verabreichung des Antigens verabreicht werden. Das Antigen kann auch dadurch verabreicht werden, dass es in ein Liposom oder einen anderen Mikroträger eingebracht wird. Selbstverständlich kann die solubilisierte Fraktion mit ähnlichen Fraktionen oder unlöslichen Fraktionen von einigen anderen Pilzen vermischt werden, oder kann mit kommerziell erhältlichen Allergenextrakten von Pilzen, verschiedenen Allergenextrakten wie von Hausstaub und Cryptomeria japonica und/oder mit gereinigten Allergenen gemischt werden. Durch die Verwendung dieses Gemisches kann eine Immunität mittels Desensibilisierung gegen eine Vielzahl von Allergenen in Patienten mit Allergosen, welche gegen eine Vielzahl von Allergenen empfindlich sind, induziert werden.
Im Hinblick auf den Verabreichungsweg kann die Allergenzusammensetzung perkutan (subkutan oder intrakutan), mittels Zerstäubung intrapulmonal, transmukosal (z. B. in die Nase, das Auge, die Vagina oder dergleichen), oral, sublingual oder intravenös verabreicht werden. Eine typische Anfangsdosis für eine Behandlung hängt von dem Verabreichungsweg ab und beträgt zum Beispiel 0,2 ng bis 0,1 mg/kg pro Verabreichung, wobei die Dosis abhängig von dem Schutzgrad und der Thera pie, welche erforderlich sind, erhöht werden kann oder die Anzahl der Verabreichungen erhöht werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Allergenzusammensetzung zur Vorbeugung von Allergosen gegen Pilze oder zum Vorsehen von therapeutischen Effekten durch die Verabreichung davon an Individuen bereit, dadurch gekennzeichnet, dass die Allergenzusammensetzung das oben beschriebene Pilzantigen oder ein Pilzantigen, das durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt wurde, enthält.
Falls das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung in einem Individuum zum Zwecke einer in-vivo-Diagnose, z. B. in einem inhalativen Expositionstest, einem Hauttest oder einem Nasen- oder Augen-Schleimhauttest, verwendet wird, kann es in Form eines gefriergetrockneten Pulvers oder einer geeigneten Salzlösung oder Suspension verwendet werden, wobei Polyethylenglykol und/oder Phenol dazu zugegeben werden kann. Bei Pflastertests ist es möglich, eine Lösung der oben erwähnten antigenen Komponente in Vermischung mit weißem Petrolatum als ein Ausgangsmaterial, supplementiert mit einem oberflächenaktiven Stoff wie Natriumlaurylsulfat, zu verwenden.
Das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung kann auch für Labordiagnosen, z. B. Diagnoseverfahren, die auf Antigen-Antikörper-Reaktionen basieren, wie eine Agglutinationsreaktion, Fällungsreaktion und Neutralisationsreaktion; oder Diagnoseverfahren unter Verwendung eines markierten Antikörpers; oder in einem Histamin-Freisetzungstest, einem Lymphocyten-Transformationstest und einem Leukocytenmigration-Hemmtest verwendet werden. Falls die oben beschriebene antigene Komponente zum Beispiel als ein Antigen für die Bestimmung des IgE-Antikörpertiters verwendet wird, kann die antigene Komponente an einer festen Phase wie einer Papierscheibe, einem Celluloseschwamm oder einer Mikrotiterplatte immobilisiert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine diagnostische Zusammensetzung für eine durch Pilze verursachte Krankheit bereit, dadurch gekennzeichnet, dass die diagnostische Zusammensetzung das oben beschriebene Pilzantigen oder ein Pilzantigen, das durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt wurde, enthält.
Die Wirbeltiere in der vorliegenden Erfindung schließen Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel, Menschen und Säugetiere mit Ausnahme von Menschen, welche Antikörper als Reaktion auf Antigene produzieren, ein, so dass alle Wirbeltiere in der Lage sind, mit Antigenen zu reagieren. Obwohl die Pilzantigene der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen an Säuger wie Menschen oder Haustiere verabreicht werden, sind Wirbeltiere, z. B. Fische, welche zu kommerziellen Zwecken gezüchtet werden, im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, solange wie sie die vorstehend beschriebenen Eigenschaften besitzen.
Die vorliegende Erfindung wird durch Ausführungsbeispiele genauer beschrieben, wobei der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung durch diese Beispiele nicht begrenzt werden soll.
Beispiel 1 (Herstellung einer Zellfraktion und einer unlöslichen Fraktion aus Candida albicans-Zellen)
1) Präparation von Protoplastenzellen:
Eine Platinösenfüllung von Candida albicans TIMM 1768 in einer Sabouraud-Agar-Schrägkultur wurde auf ein YPD-Medium (1 Gew.-% Hefeextrakt, 2 Gew.-% Polypepton, 2 Gew.-% Glucose) in einem Teströhrchen überimpft. Nach dem Schütteln der Kultur bei 30°C für 24 Stunden wurde ein Teil der Kultur in ein YPD-Medium in einem Erlenmeyerkolben übertragen und einer Schüttelkultur über Nacht bei 35°C unterzogen. Die erhaltene Kultur wurde bei 2000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. Die erhaltenen Zellen befanden sich in der Hefephase. Die Zellen wurden einmal mit sterilem Wasser und dann einmal mit einer SSB-Lösung (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,8 M Sorbit) gewaschen. Nach dem erneuten Suspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen der SSB-Lösung wurde eine SSB-Lösung, enthaltend 100 mM EDTA, in einem Volumenanteil von einem Achtel des Volumens der oben erwähnten SSB-Lösung zugegeben, gefolgt von der Zugabe eines geeigneten Volumens an 2-Mercaptoethanol, und anschließend wurde das Gemisch vorsichtig geschüttelt. Zu dieser Suspension wurde anschließend Zymolase 20T (hergestellt durch Seikagaku Corporation) in einer Endkonzentration von 0,3 mg/ml zugegeben, gefolgt durch vorsichtiges Schütteln bei 35°C für eine Stunde. Zusätzlich wurde das Trichoderma-Lyse-Enzym (hergestellt durch Sigma) in einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben, gefolgt durch vorsichtiges Schütteln bei 35°C für eine Stunde. Die erhaltene Suspension wurde bei 2000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um die Protoplastenzellen zu gewinnen. Die Zellen wurden mit der SSB-Lösung hinreichend gewaschen und einer Zellfraktionierung unterzogen.
2) Subzelluläre Fraktionierung von Protoplastenzellen und Herstellung von Antigenlösungen:
Zu den Protoplastenzellen, welche erhalten wurden, wie oben beschrieben, wurde sterile physiologische Kochsalzlösung in einer Zelldichte von etwa 4 × 10⁹ Zellen/ml zugegeben, gefolgt durch ausreichendes Rühren, anschließend wurde das Gemisch für 10 Minuten auf Eis stehen gelassen. Nachdem bestätigt wurde, dass die Protoplastenzellen aufgebrochen worden waren, wurde das Gemisch bei 10.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert, und das erhaltene Präzipitat wurde als eine unlösliche Fraktion (nachstehend bezeichnet als "Ca-LSP") verwendet. Der Zentrifugationsüberstand wurde noch einmal bei 100.000 × g für 60 Minuten zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wurde als eine Ribosomenfraktion (nachstehend bezeichnet als "HSP") verwendet, und der Zentrifugationsüberstand wurde als eine lösliche Fraktion (nachstehend bezeichnet als "HSS", wobei in dieser Fraktion HSP90 und Enolase enthalten waren) verwendet. Nach dem erneuten Suspendieren der Ca-LSP-Fraktion in physiologischer Kochsalzlösung wurde die Ca-LSP-Fraktion einer Ultraschallbehandlung unterzogen und dann in einem Bad mit kochendem Wasser für 5 Minuten sterilisiert, um eine LSP-Antigenlösung, enthaltend Membranproteine und dergleichen, zu erhalten. Die HSP-Fraktion wurde auch in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, um eine geeignete Proteinkonzentration zu erreichen, und diese Suspension wurde als eine Antigenlösung verwendet. Die HSS-Fraktion wurde auch auf die Proteinkonzentration untersucht, und ein geeignetes Volumen davon wurde als ein Antigen verwendet. Die Ca-LSP-Antigenlösung, welche durch die Behandlung der aus einer 2 l-Kultur gewonnenen Zellen erhalten wurde, wie vorstehend beschrieben, wies eine Proteinkonzentration von 2,3 mg/ml auf, wobei die Proteinmenge unter Verwendung des Reagens Bicinchoninsäure (BCA) mit BSA als Standard quantitativ bestimmt wurde.
3) Bestätigung des Ausmaßes der Entfernung der Zellwand der Pilzzellen:
Das Ausmaß der Entfernung der Zellwand wurde mittels einer mikroskopischen Untersuchung der Zellmorphologie, einer Zählung der Anzahl der lebenden Zellen nach dem Aufbrechen in physiologischer Kochsalzlösung und einer relativen Quantifizierung basierend auf der Hemmung der Agglutination mit einem Serumfaktor bestätigt. Zum Beispiel wurden im Falle von Candida albicans- oder Aspergillus fumigatus-Zellen deutliche morphologische Veränderungen beobachtet, wenn die Zellwand durch das vorstehend beschriebene Verfahren entfernt wurde (1 und 2). Die Protoplastenzellen, welche durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt wurden, wurden auch in physiologischer Kochsalzlösung aufgebrochen, wobei die darin enthaltenen lebenden Zellen weniger als 1% ausmachten. Im Anschluss an das Ausstreichen von 100 μl der vorstehend hergestellten Ca-LSP-Antigenlösung auf YPD-Agarmedium und das Züchten bei 30°C für vier Tage wurden keine Kolonien von Candida albicans-Zellen beobachtet, was zeigt, dass keine lebenden Zellen in der Ca-LSP-Antigenlösung vorhanden waren. Für die HSP-Antigenlösung und die HSS-Antigenlösung wurden ebenfalls keine Kolonien beobachtet.
Dagegen wurde durch den Serumfaktor Nr. 1 (hergestellt durch latron Laborstories, Inc.), einem anti-Candida-Serum, eine Agglutination der Zellen von Candida albicans TIMM 1768 (Serotyp A) hervorgerufen. Anhand der Hemmwirkung gegen diese Agglutination wurde die verbleibende Menge der Zellwandkomponenten, welche in der unlöslichen Fraktion enthalten waren, als die Menge an Zellwand-Mannan, einer Bestandteilskomponente, quantitativ bestimmt. Die verwendete Vergleichskontrolle für das Zellwand-Mannan umfasste den Allergen Scratch Extract "Torii" Candida (hergestellt durch Torii Pharmaceutical Co., Ltd.), einen im Handel erhältlichen Candida-Allergenextrakt.
Als positive Kontrolle wurde ein Serotyp A-Mannan, aufgereinigt nach der Methode von Kobayashi et al. [Kobayashi H. et al., Arch. Biochem. Biophys., Bd. 272 (1989), 364–375] des Candida albicans-Stamms J-1012 (Serotyp A), in Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen verwendet. Obwohl der im Handel erhältliche Candida-Allergenextrakt (Proteinkonzentration: etwa 0,4 mg/ml) 4,5 mg/ml Serotyp A-Mannan von Candida albicans-Zellwand (nachstehend bezeichnet als "Serotyp A-Mannan") enthielt, bewirkte Ca-LSP (Proteinkonzentration: etwa 2,3 mg/ml) keine Hemmung der Agglutination davon, wodurch bestätigt wurde, dass der Gehalt an Serotyp A-Mannan in der antigenen Komponente der vorliegenden Erfindung nicht oberhalb der Nachweisgrenze der Methode von 0,5 mg/ml lag. Mit anderen Worten wurde gezeigt, dass das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung einen hohen Proteingehalt hat, sowie einen Gehalt an Zellwand-Mannan aufweist, welcher nicht oberhalb der Nachweisgrenze der vorstehend beschriebenen Methode liegt. Auf diese Weise wurde gezeigt, dass sich dieser Allergenextrakt von dem herkömmlichen Allergenextrakt deutlich unterscheidet.
Die erhaltene Ca-LSP-Antigenlösung wurde auf den Gehalt an neutralen Zuckern, Lipiden und Nucleinsäuren untersucht, wobei ein Teil davon entnommen und gefriergetrocknet und dann gewogen wurde. Als Ergebnis waren etwa 130 mg des gefriergetrockneten Rückstandes (23 mg Protein, 2 mg neutrale Zucker, 8 mg Lipide und 90 mg NaCl, wie berechnet, sowie geringe Mengen an Nucleinsäuren und Wasser als andere Komponenten) in 10 ml der Ca-LSP-Antigenlösung enthalten.
Beispiel 2 (Herstellung einer unlöslichen Fraktion von Aspergillus fumigatus)
1) Herstellung einer unlöslichen Fraktion von Aspergillus fumigatus (Af-LSP) (1):
Zu einer Sabouraud-Dextrose-Agar-Schrägkultur von Aspergillus fumigatus TIMM 1776 wurde eine physiologische Kochsalzlösung, enthaltend 0,1 Gew.-% Tween 80, zugegeben, um eine Sporensuspension herzustellen. Ein Teil der Suspension wurde in ein Kartoffel-Dextrose-Medium (hergestellt durch Difco) in einem Erlenmeyerkolben übertragen und einer Schüttelkultur über Nacht bei 30°C unterzogen. Die erhaltene Kultur wurde mit einem Glasfilter gefiltert, um das Myzel zu gewinnen. Das Myzel wurde in 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,0, enthaltend 0,8 M NaCl, suspendiert, und anschließend wurde Yatalase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) in einer Endkonzentration von 10 mg/ml zugegeben, gefolgt durch vorsichtiges Schütteln bei 30°C für 4 Stunden. Die erhaltene Suspension wurde mit einem Glasfilter gefiltert, um die Protoplastenzellen zu gewinnen.
Die Zellen wurden zweimal mit 0,8 M NaCl gewaschen. Anschließend wurde zu den erhaltenen Protoplastenzellen eine sterile physiologische Kochsalzlösung zugegeben, um eine Zelldichte von 1 × 10⁸ Zellen/ml zu erreichen, und die Zellen wurden aufgebrochen. Die Lösung wurde bei 10.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert, wodurch eine unlösliche Fraktion gewonnen wurde. Nach dem erneuten Suspendieren der unlöslichen Fraktion in physiologischer Kochsalzlösung wurde die unlösliche Fraktion einer Ultraschallbehandlung unterzogen und dann in einem Bad mit kochendem Wasser für 5 Minuten sterilisiert, um eine unlösliche Fraktion von Aspergillus fumigatus (Af-LSP), die Antigenlösung Nr. 1 (Proteinkonzentration: etwa 0,9 mg/ml), zu gewinnen.
2) Herstellung einer unlöslichen Fraktion von Aspergillus fumigatus (Af-LSP) (2):
Ein Teil einer Sporensuspension, welche in der gleichen Weise wie vorstehend unter Punkt 1) hergestellt wurde, wurde in ein Kartoffel-Dextrose-Medium (hergestellt durch Difco), enthaltend 0,8 M NaCl, in einem Erlenmeyerkolben übertragen und einer Schüttelkultur über Nacht bei 30°C unterzogen. Die Trübung der Kultur entsprach dem Trübungswert von Punkt 1). Die erhaltene Kultur wurde mit einem Glasfilter gefiltert, um das Myzel zu gewinnen. Das Myzel wurde in 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,0, enthaltend 0,8 M NaCl, suspendiert. Zu der Suspension wurden Yatalase (Endkonzentration: 10 mg/ml), Trichoderma-Lyse-Enzym (Endkonzentration: 3 mg/ml) und Zymolyase 20T (Endkonzentration: 1 mg/ml) zugegeben, gefolgt durch vorsichtiges Schütteln bei 30°C für 2 Stunden. Die erhaltene Zellsuspension wurde mit einem Glasfilter gefiltert, und die Protoplastenzellen wurden aus dem Filtrat gewonnen. Die Anzahl der Protoplastenzellen wurde ermittelt, und als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Anzahl der Protoplastenzellen ungefähr doppelt so hoch war wie die unter Punkt 1) erhaltene Zellzahl für das gleiche Kulturvolumen. Demgemäß wurde bestätigt, dass die Ausbeute an Protoplastenzellen mittels dieser Kulturmethode verbessert wurde. Die Zellen wurden zweimal mit 0,8 M NaCl gewaschen, und die erhaltenen Protoplastenzellen wurden in der gleichen Weise wie vorstehend unter Punkt 1) behandelt, um eine unlösliche Fraktion von Aspergillus fumigatus (Af-LSP), die Antigenlösung Nr. 2, zu gewinnen.
Beispiel 3 (Herstellung einer unlöslichen Fraktion von Cryptococcus neoformans (Crn-LSP))
Eine Platinösenfüllung von Cryptococcus neoformans TIMM 0354 in einer Sabouraud-Dextrose-Agar-Schrägkultur wurde in ein YPD-Medium in einem Erlenmeyerkolben überimpft, gefolgt durch eine Schüttelkultur bei 30°C über Nacht. Die erhaltene Kultur wurde bei zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. Die Zellen wurden einmal mit sterilem Wasser gewaschen und dann in 100 mM Citratpuffer, pH 5,8, enthaltend 1 M Sorbit und 100 mM EDTA, suspendiert. Anschließend wurde das Trichoderma-Lyse-Enzym wurde in einer Endkonzentration von 5 mg/ml dazu zugegeben, gefolgt durch vorsichtiges Schütteln bei 37°C für 1 Stunde. Die erhaltene Suspension wurde bei 2000 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um die Protoplastenzellen zu gewinnen. Nach dem Waschen der Zellen mit dem vorstehen den hypertonischen Puffer wurde eine sterile physiologische Kochsalzlösung zugegeben, um die Protoplastenzellen in einer Konzentration von 1 × 10⁸ Zellen/ml zu suspendieren, und die Zellen wurden anschließend aufgebrochen. Die Suspension wurde bei 10.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert, um eine unlösliche Fraktion zu gewinnen. Nach dem erneuten Suspendieren der unlöslichen Fraktion in physiologischer Kochsalzlösung wurde die unlösliche Fraktion einer Ultraschallbehandlung unterzogen, in einem Bad mit kochendem Wasser für 5 Minuten sterilisiert und dann bei 10.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert, um eine unlösliche Fraktion zu gewinnen. Die unlösliche Fraktion wurde als eine unlösliche Fraktion von Cryptococcus neoformans, Crn-LSP-Antigenlösung (Proteinkonzentration: etwa 2,9 mg/ml), verwendet.
Beispiel 4 (Herstellung einer solubilisierten Fraktion aus der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans)
Zu 100 ml der Ca-LSP-Antigenlösung (Proteinkonzentration: 2,3 mg/ml), die in Beispiel 1 erhalten wurde, wurden 100 ml einer 40 mM Bis-Tris-Pufferlösung (pH 6,5), enthaltend 100 mM Octylthioglucosid, zugegeben. Nach dem Rühren des Gemisches über Nacht bei 4°C wurde das Gemisch bei 100.000 × g für 1 Stunde zentrifugiert, wobei 200 ml einer Lösung einer solubilisierten Fraktion, enthaltend 50 mM Octylthioglucosid (Ca-LSP-S), als Überstand (Proteinkonzentration: 0,4 mg/ml) erhalten wurden. Ein 100 ml-Teil dieser Lösung wurde mittels Ultrafiltration (Molekulargewicht-Abtrennungsgrenze: 10.000) konzentriert, und das Konzentrat wurde dann gegen eine phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung dialysiert, um das Octylthioglucosid zu entfernen. Dieses Dialysat wurde unter Verwendung eines Membranfilters mit einer Porengröße von 0,22 μm noch einmal gefiltert, wobei 20 ml einer Lösung einer solubilisierten Fraktion, aus welcher der oberflächenaktive Stoff entfernt worden war, erhalten wurden (Ca-LSP-SD) (Proteinkonzentration: 1,3 mg/ml).
Beispiel 5 (Fraktionierung der solubilisierten Fraktion von Candida albicans (Ca-LSP-S) unter Verwendung einer ConA-Säule)
Die restlichen 100 ml der Ca-LSP-S-Fraktion, welche in Beispiel 4 erhalten wurde, wurden mittels Ultrafiltration konzentriert (Proteinkonzentration: 3 mg/ml). Anschließend wurden 1,5 Volumenteile einer 20 mM Bis-Tris-Pufferlösung (pH 6,5) zugegeben, um eine Endkonzentration von 20 mM Octylthioglucosid zu erhalten. Zu der erhaltenen Lösung wurde NaCl bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,25 M zugegeben, gefolgt von der Zugabe von CaCl₂ und MnCl₂ in einer Endkonzentration von 1 mM. Im Anschluss daran wurde dieses Gemisch auf eine ConA-Sepharose 4B-Säule (Pharmacia-LKB) aufgegeben, welche zuvor mit Puffer A (20 mM Bis-Tris, 20 mM Octylthioglucosid, 0,25 M NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂ (pH 6,5)) äquilibriert worden war. Die nicht-adsorbierten Komponenten wurden mit Puffer A ausgewaschen. Die ausströmende Fraktion und die gewonnene gewaschene Fraktion wurden vereinigt und als die nicht an eine ConA-Säule adsorbierende Fraktion verwendet. Anschließend wurden die an die ConA-Säule adsorbierten Komponenten mit Puffer A, enthaltend 0,25 M Methyl-D-glucose, eluiert, und das Eluat wurde als die aus der ConA-Säule eluierte Fraktion verwendet. Die erhaltene nicht an eine ConA-Säule adsorbierte Fraktion und die aus der ConA-Säule eluierte Fraktion wurden mittels Ultrafiltration (Molekulargewicht-Abtrennungsgrenze: 10.000) konzentriert, und die erhaltenen Konzentrate wurden als "Ca-ConA-Durchlauf" bzw. "Ca-ConA-Eluat" bezeichnet.
Beispiel 6 (Herstellung von Impfstoffzubereitungen)
1) Herstellung einer Wasser-in-Öl-Zubereitung (inkomplettes Freundsches Adjuvans):
Ein erforderliches Volumen der vorstehend beschriebenen Antigenlösungen, welche von verschiedenen LSPs (Ca-LSP etc.) abgeleitet wurden, die unlösliche Fraktionen sind, sowie der solubilisierten Fraktionen (Ca-LSP-SD etc.), welche von der LPS-Fraktion abgeleitet wurden und aus denen der oberflächenaktive Stoff entfernt worden war, und der aus der ConA-Säule eluierten Fraktion (Ca-ConA-Eluat) wurde jeweils entnommen und mit einem gleichen Volumen eines inkompletten Freundschen Adjuvans (nachstehend bezeichnet als "IFA") (hergestellt durch Difco) hinreichend vermischt, um eine Wasser-in-Öl-Impfstoffzubereitung zu erhalten.
2) Herstellung einer Alaun-Zubereitung:
Ein erforderliches Volumen der vorstehend beschriebenen Antigenlösungen, welche von verschiedenen LSPs abgeleitet wurden, die unlösliche Fraktionen sind, und der vorstehend beschriebenen solubilisierten Fraktionen (Ca-LSP-SD etc.), welche von der LPS-Fraktion abgeleitet wurden, aus denen der oberflächenaktive Stoff entfernt worden war, wurde jeweils entnommen, und ein gleiches Volumen an Alaun (hergestellt durch Pierce) wurde unter Rühren zugetropft. Nach Zugabe des gesamten Volumenteils wurde das Gemisch weitere 30 Minuten gerührt, um eine Impfstoffzubereitung zu erhalten.
Beispiel 7 (Vergleich der Impfstoffaktivität der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans mit HSP- und HSS-Antigenlösungen und Vergleich mit einem Lebendzellen-Impfstoff)
1) Vergleich der Impfstoffaktivität von Ca-LSP-, HSP- und HSS-Antigenlösungen:
Die in Beispiel 1 erhaltenen Ca-LSP-, HSP- und HSS-Antigenlösungen wurden jeweils mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Proteinkonzentration von 400 μg/ml verdünnt. In Übereinstimmung mit Beispiel 6 wurde zu jeder Verdünnung ein gleiches Volumen an IFA zugegeben, um eine Impfstoffzubereitung zu erhalten, welche dann subkutan in C57BL/6-Mäuse (6 Wochen alt, Weibchen, fünf Tiere pro Gruppe) zu 0,1 ml pro Tier injiziert wurde, um die Mäuse zu immunisieren. Als Kontrolle wurde an eine Gruppe physiologische Kochsalzlösung anstelle der Antigenlösung verabreicht. Eine Woche später wurde das gleiches Volumen noch einmal subkutan injiziert. Genau gesagt betrug die Dosis pro Tier 20 μg Protein/Verabreichung für alle Antigene. Eine Woche nach der zweiten Immunisierung wurden alle immunisierten Mäuse intravenös mit 2,5 × 10⁵ Zellen von Candida albicans TIMM 1768, gezüchtet in einem Sabouraud-Dextrose-Flüssigmedium, infiziert. Nach der Infektion wurden die Mäuse während 30 Tagen auf ein Überleben untersucht.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Die unlösliche Fraktion Ca-LSP zeigte eine wirksamere Impfstoffaktivität als die Ribosomenfraktion (HSP) und die lösliche Fraktion (HSS). Tabelle 1

Gruppe Verabreichung von	Mittleres Überleben ± SA Tage	Anzahl der über- lebenden Mäuse nach 30 Tagen Anzahl der verwendeten Mäuse
Physiologischer Kochsalzlösung	5.8 ± 1.6	0/5
Ca–LSP	> 28.8 ± 2.7	4/5
HSP	7.6 ± 3.4	0/5
HSS	7.11 ± 0.9	0/5

2) Vergleich der Impfstoffaktivität der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans mit einem Lebendzellen-Impfstoff:
Die Konzentrationen der Ca-LSP-Antigenlösungen wurden eingestellt, so dass eine Dosis von Ca-LSP von 0,2 μg Protein/Verabreichung, 2 μg Protein/Verabreichung oder 20 μg Protein/Verabreichung erhalten wurde. Anschließend wurde in Übereinstimmung mit Beispiel 6 eine Impfstoffzubereitung hergestellt, welche dann in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan in C57BL/6-Mäusen (fünf Tiere pro Gruppe) in der gleichen Weise wie unter Punkt 1) von Beispiel 7 injiziert wurde, um die Mäuse zu immunisieren. Zusätzlich wurde Candida albicans TIMM 1768 einer Schüttelkultur über Nacht in einem Sabouraud-Dextrose-Medium unterzogen, und die Zellen wurden mittels Zentrifugation gewonnen. Die Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die erhaltenen Zellen wurden in physiologischer Kochsalzlösung in einer Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml, 1 × 10 Zellen/ml oder 1 × 10⁸ Zellen/ml suspendiert. Zu jeder Suspension wurde ein gleiches Volumen an IFA zugegeben und damit vermischt. Anschließend wurde die Suspension subkutan in Mäuse zu 0,1 ml pro Maus injiziert, um die Mäuse zu immunisieren. Eine Woche später wurden lebende Candida-Zellen, welche in der gleichen Weise wie vorstehend präpariert wurden, in der gleichen Zellzahl für jede Maus subkutan injiziert. Genau gesagt betrug die Dosis pro Maus 5 × 10⁴ Zellen/Verabreichung, 5 × 10⁵ Zellen/Verabreichung oder 5 × 10⁶ Zellen/Verabreichung. Als Kontrolle wurde ein Gemisch von physiologischer Kochsalzlösung und IFA in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan injiziert. Eine Woche nach der zweiten Immunisierung wurden alle immunisierten Mäuse intravenös mit 2,5 × 10⁵ Zellen von Candida albicans TIMM 1768, gezüchtet in einem Sabouraud-Dextrose-Flüssigmedium, infiziert. Nach der Infektion wurden die Mäuse während 30 Tagen auf ein Überleben untersucht.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben. Ca-LSP zeigte eine wirksamere Schutzaktivität gegen eine Infektion, selbst bei einer Dosis von 2 μg Protein/Verabreichung, und wies eine bessere Schutzaktivität gegen eine Infektion auf als die Immunität, welche durch die lebenden Zellen hervorgerufen wurde. Tabelle 2

Gruppe Verabreichung von	Einmalige Dosis	Mittleres Überleben ± SA Tage	Anzahl der über- lebenden Mäuse nach 30 Tagen Anzahl der verwendeten Mäuse
Physiologischer Kochsalzlösung	-	4.0 ± 1.4	0/5
	0.2*	9.6 ± 2.5	0/5
Ca-LSP	2	> 27.6 ± 4.3	2/5
	20	> 30.0 ± 0.0	5/5
	5 × 10⁴	16.8 ± 6.3	0/5
Lebenden	5 × 10⁵	19.6 ± 9.0	0/5
Zellen	5 × 10⁶	> 20.8 ± 10.1	5/5

*: μg Protein.

Beispiel 8 (Schutzaktivität einer solubilisierten Fraktion, die aus der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans abgeleitet wurde und aus welcher der oberflächenaktive Stoff entfernt worden war, gegen eine Infektion)

Die in Beispiel 4 aus Ca-LSP hergestellte solubilisierte Fraktion (Ca-LSP-SD), aus welcher der oberflächenaktive Stoff entfernt worden war, wurde auf eine Konzentration verdünnt, so dass eine Dosis von 20 μg Protein/Verabreichung erhalten wurde. Anschließend wurde in Übereinstimmung mit Beispiel 6 eine Impfstoff zubereitung davon hergestellt. Die Impfstoffzubereitung wurden dann in der gleichen Weise wie unter Punkt 1 von Beispiel 7 in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan in C57BL/6-Mäuse (fünf Mäuse pro Gruppe) injiziert, um die Mäuse zu immunisieren. Als Kontrolle wurden eine Zubereitung der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans und IFA sowie ein Gemisch von physiologischer Kochsalzlösung und IFA in der gleichen Weise wie für eine Immunisierung verabreicht. Eine Woche nach der Immunisierung wurden die Mäuse intravenös mit 2,5 × 10⁵ Zellen von Candida albicans TIMM 1768 infiziert. Nach der Infektion wurden die Mäuse während 30 Tagen auf ein Überleben untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben. Die solubilisierte Fraktion LSP zeigte eine Schutzaktivität gegen eine Infektion, welche dem Grad der Schutzaktivität der unlöslichen Fraktion LSP entsprach. Tabelle 3

Gruppe Verabreichung von	Mittleres Überleben ± SA Tage	Anzahl der über- lebenden Mäuse nach 30 Tagen Anzahl der verwendeten Mäuse
Physiologischer Kochsalzlösung	6.6 ± 2.9	0/5
Ca-LSP	> 26.8 ± 4.7	2/5
Ca-LSP-SD	> 24.6 ± 5.1	2/5

Beispiel 9 (Schutzaktivität des Ca-ConA-Eluats, welches aus der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans abgeleitet wurde, gegen eine Infektion)
Das in Beispiel 5 erhaltene Ca-ConA-Eluat, d. h. die Fraktion, welche einen hohen Gehalt an einem Glycoprotein aufweist, das einen an ConA bindenden Mannoserest enthält, wurde mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Proteinkonzentration von 4 μg/ml verdünnt. In Übereinstimmung mit Beispiel 6 wurde ein gleiches Volumen an IFA zu der Verdünnung zugegeben, um eine Impfstoffzubereitung herzustellen, welche dann in der gleichen Weise wie unter Punkt 1) von Beispiel 7 an C57BL/6-Mäuse (sechs Wochen alt, Weibchen, fünf Tiere pro Gruppe) ver abreicht wurde, um die Schutzwirkung gegen eine Infektion mit Candida albicans TIMM 1768 zu bestätigen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. Das Ca-ConA-Eluat zeigte eine ausreichende Schutzaktivität gegen eine Infektion, wenn die Dosis 0,2 μg Protein/Verabreichung beträgt. Tabelle 4

Gruppe Verabreichung von	Mittleres Überleben ± SA Tage	Anzahl der über- lebenden Mäuse nach 30 Tagen Anzahl der verwendeten Mäuse
Physiologischer Kochsalzlösung	4.0 ± 1.4	0/5
Ca-ConA-Eluat	> 20.8 ± 12.3	2/5

Beispiel 10 (Impfstoffwirkung der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans in verschiedenen Mausmodellen einer systemischen Candidose-Infektion)
1) Schutz gegen eine Infektion in geimpften Mäusen in einem immunkompetenten Stadium:
Ca-LSP wurde auf eine Konzentration verdünnt, so dass eine Dosis von Ca-LSP, wie in Beispiel 1 hergestellt, von 20 μg Protein/Verabreichung erhalten wurde.
Anschließend wurde in Übereinstimmung mit Beispiel 6 eine Impfstoffzubereitung davon hergestellt. Die Impfstoffzubereitung wurde in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan an C57BL/6-Mäuse (fünf Tiere pro Gruppe) verabreicht, um die Mäuse in der gleichen Weise wie unter Punkt 1) von Beispiel 7 zu immunisieren. Als Kontrolle wurde ein Gemisch von physiologischer Kochsalzlösung und IFA in der gleichen Weise wie vorstehend für eine Immunisierung verabreicht.
Nach der zweiten Immunisierung erhielt jede immunisierte Maus am dritten Tag eine intraperitoneale Verabreichung von 200 mg/kg Cyclophosphamid, um einen immunsupprimierten Zustand zu induzieren. Vier Tage später wurden die Mäuse intravenös mit 5 × 10⁴ Zellen von Candida albicans TIMM 1768 infiziert. Nach der Infektion wurden die Mäuse während 30 Tagen auf ein Überleben untersucht.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Selbst wenn die Immunantwort durch Cyclophosphamid abgeschwächt wurde, zeigte die mit Ca-LSP immunisierte Gruppe eine ausreichende Schutzwirkung gegen eine Infektion. Tabelle 5

Gruppe Verabreichung von	Mittleres Überleben ± SA Tage	Anzahl der über- lebenden Mäuse nach 30 Tagen Anzahl der verwendeten Mäuse
Physiologischer Kochsalzlösung	1.6 ± 1.3	0/5
Ca-LSP	> 27.6 ± 5.4	4/5

2) Schutzdauer nach Impfung mit Ca-LSP:
Ca-LSP wurde auf eine Konzentration verdünnt, so dass eine Dosis von Ca-LSP, wie in Beispiel 1 hergestellt, von 20 μg Protein/Verabreichung erhalten wurde.
Anschließend wurde in Übereinstimmung mit Beispiel 6 eine Impfstoffzubereitung davon hergestellt. Die Impfstoffzubereitung wurde in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan an C57BL/6-Mäuse (fünf Tiere pro Gruppe) verabreicht, um die Mäuse in der gleichen Weise wie unter Punkt 1) von Beispiel 7 zu immunisieren. Nach der zweiten Immunisierung wurde jede Maus am 34. Tag intravenös mit 1 × 10⁵ Zellen von Candida albicans TIMM 1768 infiziert. Nach der Infektion wurden die Mäuse am 12. Tag getötet, und beide Nieren wurden aseptisch entfernt. Zu den Nieren wurden 6 ml physiologische Kochsalzlösung zugegeben, und unter Verwendung eines Homogenisators wurde ein Homogenat hergestellt. Das Homogenat wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt (×1, ×10 und ×100).
Ein 100 μl-Teil jeder Verdünnung wurde auf einem Sabouraud-Dextrose-Agar-Medium ausgestrichen und bei 30°C für einen Tag kultiviert, und die erscheinenden Kolonien wurden gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Anhand der Ergebnisse wird deutlich, dass die Immunisierung mit Ca-LSP eine Verringerung der Zellzahlen in den Nieren zur Folge hatte, wobei die protektive Immunität gegen eine Infektion selbst noch am 34. Tag nach der Immunisierung fortbestand. Tabelle 6

Gruppe Verabreichung von Kolonie-bildende Einheiten (× 10³)*

Physiologischer

Kochsalzlösung 9100, 11100, 2800, 1600, – **

Ca-LSP 130, 26, 0, 0, 0

*: Anzahl der Kolonien bildenden Zellen in den Homogensten (6 ml) der beiden Nieren für alle 5 Mäuse.
**: Die Mäuse starben, bevor sie getötet wurden.

Beispiel 11 (Infektion mit Candida albicans TIMM 0239)
Ca-LSP wurde auf eine Konzentration verdünnt, so dass eine Dosis von Ca-LSP, wie in Beispiel 1 hergestellt, von 20 μg Protein/Verabreichung erhalten wurde. Anschließend wurde in Übereinstimmung mit Beispiel 6 eine Impfstoffzubereitung davon hergestellt. Die Impfstoffzubereitung wurde in der gleichen Weise wie unter Punkt 1) von Beispiel 7 in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan an C57BL/6-Mäuse (fünf Tiere pro Gruppe) verabreicht, um die Mäuse zu immunisieren.

Als Kontrolle wurde einer Gruppe physiologische Kochsalzlösung anstelle von Ca-LSP verabreicht. Eine Woche nach der Immunisierung wurde jede Maus (fünf Tiere pro Gruppe) intravenös mit 5 × 10⁵ Zellen oder 1 × 10⁶ Zellen von Candida albicans TIMM 0239, einem Stamm, welcher sich von dem Stamm Candida albicans TIMM 1768 unterscheidet, der für die Herstellung des immunisierenden Antigens verwendet wurde, infiziert. Nach der Infektion wurden die Mäuse während 30 Tagen auf ein Überleben untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben. Anhand der Ergebnisse wird deutlich, dass durch eine Immunisierung mit der LSP-Fraktion eines Stammes von Candida albicans auch eine protektive Immunität gegen eine Infektion mit anderen Candida albicans-Stämmen induziert wird. Tabelle 7

Anzahl der infizierten Zellen (Zellen)	Gruppe Verabreichung von	Mittleres Überleben ± SA Tage	Anzahl der überlebenden Mäuse nach 30 Tagen Anzahl der verwendeten Mäuse
5 × 10⁵	Physiologischer Kochsalzlösung	8.6 ± 8.7	0/5
5 × 10⁵	Ca-LSP	> 30.0 ± 0.0	5/5
	Physiologischer
1 × 10⁶	Kochsalzlösung	2.0 ± 0.7	0/5
1 × 10⁶	Ca-LSP	> 24.0 ± 9.2	2/5

Beispiel 12 (Spezifische Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (DTH) gegen Ca-LSP in Mäusen, welche mit lebenden Zellen von Candida albicans immunisiert wurden)
C57BL/6-Mäuse (fünf Tiere pro Gruppe) wurden in der gleichen Weise wie unter Punkt 2) von Beispiel 7 in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan mit 5 × 10⁴, 5 × 10⁵ oder 5 × 10⁶ lebenden Zellen immunisiert. Zusätzlich wurde an C57BL/6-Mäuse (fünf Tiere pro Gruppe) auch eine Ca-LSP-Zubereitung mit IFA in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan in einer Dosis von 0,2 μg, 2 μg und 20 μg Protein/Verabreichung verabreicht, um die Mäuse zu immunisieren. Am 6. Tag nach der Immunisierung wurden 50 μl einer Ca-LSP-Antigenlösung in einer Konzentration von 200 μg Protein/ml subkutan in die Fußballen einer jeden Maus verabreicht. 24 Stunden später wurde die Schwellung der Fußballen gemessen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben. Anhand der Ergebnisse wird deutlich, dass einzelne Mäuse, die mit lebenden Zellen sensibilisiert wurden, eine zelluläre Immunität gegen Ca-LSP entwickelten, bei der eine DTH-Reaktion zur Erkennung von Ca-LSP als ein Antigen ausgelöst wird, d. h. bei Mäusen, welche eine protektive Immunität gegen eine Infektion erworben haben. Es wurde auch in den mit Ca-LSP immunisierten Mäusen eine wirksame zelluläre Immunität gegen Ca-LSP induziert. Tabelle 8

Gruppe Verabreichung von	Dosis pro Verabreichung	Fußballenschwellung ± SA (× 10^–2 mm)
Physiologischer Kochsalzlösung	-	14.2 ± 9.5
Lebenden	5 × 10 Zellen	123.0 ± 34.5
Zellen	5 × 10⁵ Zellen	114.8 ± 21.2
	5 × 10⁶ Zellen	144.0 ± 17.1
	0.2 *	85.0 ± 16.6
Ca-LSP	2	109.2 ± 26.5
	20	120.4 ± 18.6

*: μg Protein.

Beispiel 13 (Spezifische Proliferation von Milzlymphocyten in Mäusen, welche mit Candida albicans-Zellen immunisiert wurden, als Antwort auf Ca-LSP von Candida albicans)
BALB/c-Mäusen, welche in der gleichen Weise wie unter Punkt 2) von Beispiel 7 mit 5 × 10⁶ lebenden Zellen immunisiert wurden, wurde am 15. Tag nach der letzten Immunisierung die Milz entnommen und in RPMI-1640-Medium homogenisiert, um eine Zellsuspension zu erhalten. Zu der Suspension wurde RPMI-1640-Medium zugegeben, und die Suspension wurde gewaschen und zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen erneut in RPMI-1640-Medium, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), suspendiert. Diese Zellsuspension wurde auf eine mit Nylonwolle gefüllte Säule aufgegeben und bei 37°C für eine Stunde kultiviert, gefolgt durch eine Elution mit RPMI-1640-Medium, supplementiert mit 10% FCS, um eine mit T-Zellen angereicherte Fraktion zu erhalten. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gewonnen und in RPMI-1640-Medium, supplementiert mit 10% FCS, in einer Zelldichte von 1 × 10⁷ Zellen/ml suspendiert. Es wurde ein 100 μl-Aliquot einer geeignet verdünnten Ca-LSP-Antigenlösung in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen eingebracht, und die Zellsuspension wurde anschließend zu 100 μl pro Vertiefung zugegeben. Nach der Züchtung für 2 Tage bei 37°C in 5% CO₂ wurde ³H-Thymidin (0,5 μCi/Vertiefung) zugegeben. Nach einem Züchtungszeitraum von 18 Stunden wurden die Zellen gewonnen und auf die aufgenommene Menge an ³H-Thymidin untersucht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angegeben. Die aus den immunisierten Mäusen gewonnenen Splenocyten zeigten eine dosisabhängige Proliferation als Antwort auf Ca-LSP. Tabelle 9

Ca-LSP – Konzentration ** ³H-Thymidin-Aufnahme (zpM) ± SA Stimulationsindex (SI)*

0 2477 ± 219 1.0

0.05 2882 ± 334 1.2

0.5 14357 ± 2771 5.8

5 41736 ± 2326 16.9

*: SI = [Aufgenommene Menge an ³H-Thymidin unter Zugabe von Ca-LSP (ZpM)] [Aufgenommene Menge an ³H-Thymidin ohne Zugabe von Ca-LSP (ZpM)]
**: μg Protein.

Beispiel 14 (Antikörper gegen Proteine, die aus der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans stammen, im Blut von Säugetieren, welche mit lebenden Zellen von Candida albicans immunisiert oder sensibilisiert wurden)
1) Antikörper gegen Proteine von Ca-LSP im Blut von Mäusen, welche mit lebenden Zellen von Candida albicans immunisiert wurden:
Mit Hilfe von BALB/c-Mäusen, welche in der gleichen Weise wie unter Punkt 2) von Beispiel 7 mit 5 × 10⁶ lebenden Zellen immunisiert wurden, wurde ein anti-Candida-Serum hergestellt. Anschließend wurde zu Ca-LSP ein Probenpuffer für eine SDS-Elektrophorese zugegeben, gefolgt durch eine Behandlung in einem Bad mit kochendem Wasser für 3 Minuten und eine anschließende Zentrifugation. Der Überstand wurde einer 12,5%igen SDS-PAGE unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde der Überstand auf eine PVDF-Membran geblottet und einer Blockierung über Nacht mit Block Ace unterzogen. Anschließend wurde die PVDF-Membran mit einer 50fachen Verdünnung des Antiserums und dann mit einem Ratten-anti-Maus-IgG-Antikörper als einen Sekundärantikörper umgesetzt, um Antigenproteine nachzuweisen. Als Ergebnis, wie in 3 (Bahn 1) gezeigt, wurden in dem Serum von immunisierten Mäusen, welche eine protektive Immunität gegen eine Infektion erworben haben, IgG-Antikörper gegen einige der Proteine induziert, die in Ca-LSP enthalten waren. Das Protein, welches ein Molekulargewicht von etwa 65.000 aufweist, entspricht dem in Beispiel 15 beschriebenen Protein.
2) Antikörper gegen Ca-LSP, welche in einem Kaninchen-anti-Candida-Serum enthalten sind:
Ein im Handel erhältliches Kaninchen-anti-Candida-Serum (bezogen von Dainippon Pharmaceutical) wurde als ein Primärantikörper verwendet, und ein Ziegeanti-Kaninchen-IgG-Antikörper wurde als ein Sekundärantikörper verwendet. Die Proteine, welche in Ca-LSP enthalten sind, wurden durch eine SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran geblottet und einem Western-Blot-Verfahren unterzogen, um antigene Proteine in der gleichen Weise wie unter Punkt 1) von Beispiel 14 nachzuweisen. Als Ergebnis, wie in 3 (Bahn 2) gezeigt, enthielt das Kaninchen-anti-Candida-Serum Antikörper gegen einige der Proteine, die in Ca-LSP enthalten waren. Mit anderen Worten wurde gezeigt, dass Komponenten von Ca-LSP auch als Antigene in Kaninchen fungierten. Das Protein, welches bei etwa 65 kD nachgewiesen wurde, entspricht dem in Beispiel 15 beschriebenen Protein.
3) Antikörper gegen Ca-LSP in menschlichem Blut:
Candida albicans ist ein Pilz, welcher normalerweise Menschen besiedelt, und es ist bekannt, dass praktisch alle Menschen gegen Candida albicans-Zellen sensibilisiert sind. Um zu überprüfen, ob Antikörper gegen Proteine von Ca-LSP in dem Blut von normalen Individuen vorhanden sind oder nicht, wurden daher die Proteine von Ca-LSP einem Western-Blot-Verfahren unterzogen, um antigene Proteine in der gleichen Weise wie unter Punkt 1) von Beispiel 14 unter Verwendung von Serum eines normalen Individuums als einen Primärantikörper und eines Ziege-anti-Mensch-IgG-Antikörpers als einen Sekundärantikörper nachzuweisen. Wie in 3 (Bahn 3) gezeigt, wurden in dem Serum eines normalen Individuums IgG-Antikörper gegen einige der Proteine, welche in Ca-LSP enthalten sind, nachgewiesen, wodurch bestätigt wurde, dass Proteine, welche in Ca-LSP enthalten sind, auch in Menschen als Antigene fungieren.
Beispiel 15 (Aufreinigung von antigenen Proteinen aus der solubilisierten Fraktion von Candida albicans (Ca-LSP-S))
1) Isolierung von Proteinen:
Der Ca-ConA-Durchlauf, welcher in Beispiel 5 erhalten wurde, wurde auf eine MonoQ-Säule (hergestellt durch Pharmacia-LKB) aufgegeben, die zuvor mit Puffer B (20 mM Bis-Tris, 20 mM Octylthioglucosid, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂ (pH 6,5)) äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer B wurde eine Elution mit einem linearen Gradienten von 0–0,8 M NaCl in Puffer B durchgeführt. Die erhaltene Fraktion wurde unter denselben Bedingungen wie unter Punkt 1) von Beispiel 14 einem Immunblotverfahren unterzogen. Fraktionen, die Proteine enthielten, welche für ein Maus-anti-Candida-Serum positiv waren, wurden gesammelt und gegen Puffer B dialysiert.
Das erhaltene Dialysat wurde auf Hydroxyapatit (hergestellt durch Mitsui Toastu Chemicals, Inc.), aufgegeben, welches zuvor mit Puffer B äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit Puffer B wurde eine Elution mit einem linearen Gradienten von 0–0,5 M NaCl in Puffer B durchgeführt. Die eluierte Fraktion wurde unter denselben Bedingungen wie unter Punkt 1) von Beispiel 14 noch einmal einem Immunblotverfahren unterzogen. Ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 65.000 (SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen), das eine starke Bindung an das Maus-anti-Candida-Serum zeigte, und ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 25.000 (SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen), das eine schwache Bindung an das Anti-Candida-Serum zeigte, wurden isoliert.
Die N-terminalen Aminosäuresequenzen der zwei erhaltenen Proteine wurden mit Hilfe eines L-500-Fast-Aminosäureanalysegerätes (hergestellt durch Hitachi Ltd.) bestimmt, wobei abgeleitet wurde, dass die Proteine die in SEQ ID NO: 1 in dem Sequenzprotokoll bzw. in SEQ ID NO: 2 in dem Sequenzprotokoll dargestellten Aminosäuresequenzen aufweisen. Basierend auf der erhaltenen Information wurde die Aminosäuresequenz einer Homologiesuche gegen bekannte Proteine unterzogen, wobei festgestellt wurde, dass das Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 65.000 (SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen) eine Homologie zu der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (DLDH) von Saccharomyces cerevisiae in den Mitochondrien aufwies und dass das Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 25.000 (SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen) eine Homologie zu der Superoxid-Dismutase (SOD) von Saccharomyces cerevisiae in den Mitochondrien aufwies woraus gefolgert wurde, dass beide Proteine den Mitochondrien entstammen.
Getrennt wurden die Fraktionen, welche durch die Fraktionierung des Ca-ConA-Durchlaufs mittels einer MonoQ-Säule erhalten wurden, in der gleichen Weise wie in Beispiel 13 auf eine Proliferation-induzierende Aktivität gegenüber Milzlymphocyten aus immunisierten Mäusen untersucht und gleichzeitig einer Proteintrennung mittels SDS-PAGE und einer Analyse mittels Silberfärbung unterzogen. Die Fraktion, welche bei etwa 0,12 M NaCl aus der MonoQ-Chromatographiesäule des Ca-ConA-Durchlaufs eluierte, wurde gesammelt, noch einmal auf die MonoQ-Säule aufgegeben und mit einem linearen Dichtegradienten von 0–0,24 M NaCl in Puffer B eluiert. Aus der erhaltenen eluierten Fraktion konnte ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 30.000 (SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen) isoliert werden.
In gleicher Weise wurde die Fraktion, welche bei etwa 0,64 M NaCl aus der MonoQ-Säule eluierte, abermals auf die MonoQ-Chromatographiesäule des Ca-ConA-Durchlaufs aufgegeben und mit einem linearen Dichtegradienten von 0,24–0,8 M NaCl in Puffer B eluiert. Aus der erhaltenen eluierten Fraktion konnte ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 62.000 (SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen) isoliert werden. Für diese Proteine wurde eindeutig nachgewiesen, dass sie die ³H-Thymidin-Aufnahme in die Milzlymphocyten einer Maus, immunisiert mit lebenden Pilzzellen, die in der gleichen Weise wie in Beispiel 13 präpariert wurden, in einer Proteinendkonzentration von 5 μg/ml begünstigen, wodurch die Proliferation-induzierende Aktivität bestätigt wird, wobei die Proteine allerdings eine sehr geringe Bindung an das unter Punkt 1) von Beispiel 14 beschriebene Maus-anti-Candida-Serum zeigten.
Die N-terminalen Aminosäuresequenzen der zwei erhaltenen Proteine wurden mit Hilfe eines L-500-Fast-Aminosäureanalysegerätes (hergestellt durch Hitachi Ltd.) bestimmt, wobei abgeleitet wurde, dass die Proteine die in SEQ ID NO: 3 in dem Sequenzprotokoll bzw. in SEQ ID NO: 4 in dem Sequenzprotokoll dargestellten Aminosäuresequenzen aufweisen. Basierend auf der erhaltenen Information wurde die Aminosäuresequenz einer Homologiesuche gegen bekannte Proteine unterzogen, wobei festgestellt wurde, dass das Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 30.000 eine Homologie zu der Citrat-Synthase von Saccharomyces cerevisiae aufwies und dass das Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 62.000 eine Homologie zu der Aminopeptidase I in den Vakuolen von Saccharomyces cerevisiae aufwies.
2) Antigenitätstest für die isolierten Proteine:
Die vorstehend isolierten vier Proteine (das Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 65.000; das Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 25.000; das Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 30.000; und das Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 62.000) wurden auf den Umfang der ³H-Thymidin-Aufnahme in Milzlymphocyten von Mäusen, immunisiert mit lebenden Pilzzellen, in der gleichen Weise wie in Beispiel 13, untersucht. Als Ergebnis wiesen alle Proteine eine Proliferation-induzierende Aktivität bei einer Proteinmenge von 5 μg/ml pro Test auf.
Zusätzlich wurden die vorstehend beschriebenen antigenen Proteine in der gleichen Weise wie in Beispiel 12 subkutan in die Fußballen der mit lebenden Pilzzellen immunisierten Mäuse verabreicht, um zu untersuchen, ob eine DTH-Reaktion induziert wird oder nicht. Als Ergebnis des Tests für die vorstehend beschriebenen vier antigenen Proteine wurde gezeigt, das alle Proteine eine signifikante Schwellung der Fußballen hervorriefen, wenn sie in einer Proteinmenge von 5 μg/Verabreichung verabreicht wurden.
Anhand der vorstehenden Ergebnisse wird deutlich, dass die vier isolierten Proteine alle durch Individuen erkannt wurden, die eine protektive Immunität gegen eine Infektion erworben haben.
Beispiel 16 (Erwerb einer protektiven Immunität gegen eine Infektion durch den Transfer von Splenocyten aus Mäusen, welche mit der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans immunisiert wurden)
Eine Zubereitung von Ca-LSP in Vermischung mit IFA wurde in der gleichen Weise wie unter Punkt 1) von Beispiel 7 in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan an BALB/c-Mäuse (fünf Tiere pro Gruppe) in einer Menge von 0,1 ml pro Tier verabreicht, um die Mäuse zu immunisieren. Die Dosis betrug 20 μg Protein/Ver abreichung. Zur Kontrolle wurde ein Gemisch von physiologischer Kochsalzlösung und IFA in der gleichen Weise wie vorstehend für eine Immunisierung verabreicht.
Eine Woche nach der zweiten Immunisierung wurde fünf immunisierten Mäusen die Milz entnommen und in RPMI-1640-Medium homogenisiert, um eine Zellsuspension (etwa 8 × 10⁷ Zellen/0,5 ml) zu erhalten. Ein 0,5 ml-Teil davon wurde in C.B.-17/SCID-Mäuse (fünf Tiere pro Gruppe) übertragen. Einen Tag später wurde jede Maus intravenös mit 5 × 10⁴ Zellen von Candida albicans TIMM 1768 infiziert. Zusätzlich wurden zur Kontrolle normale (ohne eine Übertragung von Splenocyten) C.B.-17/SCID-Mäuse (fünf Tiere pro Gruppe) intravenös mit der gleichen Anzahl an Zellen von Candida albicans TIMM 1768 infiziert. Nach der Infektion wurden die Mäuse am 5. Tag getötet. Anschließend wurden beide Nieren aseptisch entnommen und unter Zugabe von 6 ml physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert, um ein Homogenat zu erhalten. Das erhaltene Homogenat wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt (×1, ×10 und ×100), und anschließend wurde ein 100 μl-Teil einer jeden Verdünnung auf Sabouraud-Dextrose-Agarmedium ausgestrichen und bei 30°C für einen Tag kultiviert. Die Anzahl der gebildeten Kolonien wurde gezählt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 angegeben. Tabelle 10

Transfer von Splenocyten aus Mäusen	Kolonie-bildende Einheiten (× 10²)*	Durch. Kolonie- ± SA bildende Einheiten (× 10^–2 Zellen)
Keine (Normal)	239, 119, 151, 119, 110	148 ± 54
Physiologische Kochsalzlösung	21, 61, 85, 155, 172	99 ± 64
Ca-LSP	9, 17, 2, 49, 182	52 ± 75

*: Anzahl der Kolonien bildenden Zellen in den Homogensten (6 ml) der beiden Nieren für alle 5 Mäuse.

Durch den Transfer der Splenocyten von Mäusen, die mit Ca-LSP immunisiert wurden, verringerten sich die Zellzahlen im Vergleich zu den normalen Mäusen in den Nieren signifikant (p < 0,05). Mit anderen Worten wurde bestätigt, dass ein adoptiver Transfer einer Immunität mittels Splenocyten von Mäusen, die mit Ca-LSP immunisiert wurden, durchgeführt werden konnte.
Beispiel 17 (Impfstoffaktivität der unlöslichen Fraktion Af-LSP von Aspergillus fumigatus)
Eine Impfstoffzubereitung, welche in Übereinstimmung mit Beispiel 6 unter Verwendung der unter Punkt 1) von Beispiel 2 hergestellten Af-LSP-Antigenlösung 1 zubereitet wurde, wurde in einer Menge von 2 μg oder 20 μg Protein/Verabreichung in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan an C57BL/6-Mäuse verabreicht, um die Mäuse zu immunisieren. Zur Kontrolle wurde ein Gemisch von physiologischer Kochsalzlösung und IFA in der gleichen Weise wie vorstehend für eine Immunisierung verabreicht. Nach der Immunisierung wurde jede Maus am 8. Tag intravenös mit 2 × 10⁶ Sporen von Aspergillus fumigatus TIMM 1776 infiziert. Nach der Infektion wurden die Mäuse während 30 Tagen auf ein Überleben beobachtet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 angegeben. Nach zwei Verabreichungen von 20 μg Protein/Verabreichung wurde eine bedeutende schützende Immunität gegen eine Infektion beobachtet, wobei selbst bei 2 μg Protein/Verabreichung eine signifikante Verlängerung der Überlebenstage beobachtet werden konnte. Mit anderen Worten wurde auch gezeigt, dass Af-LSP als ein Impfstoff verwendet werden kann. Tabelle 11

Gruppe Verabreichung von	Dosis pro Verabreichung	Mittleres Überleben ± SA Tage	Anzahl der über- lebenden Mäuse nach 30 Tagen Anzahl der verwendeten Mäuse
Physiologischer Kochsalzlösung	–	5.3 ± 0.5	0/6
Af-LSP	2*	9.6 ± 4.8	0/5
	20	> 11.7 ± 6.5	2/6

*: μg Protein.

Beispiel 18 (Antikörper gegen Proteine, welche der unlöslichen Fraktion Af-LSP von Aspergillus fumigatus entstammen, im Blut von Mäusen, denen lebende Zellen von Aspergillus fumigatus verabreicht wurden)
Eine Sporensuspension von Aspergillus fumigatus TIMM 1776 (1 × 10⁸ Sporen/ml) wurde mit einem gleichen Volumen an komplettem Freundschem Adjuvans gemischt, und 0,1 ml des erhaltenen Gemisches wurde in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan an BALB/c-Mäuse verabreicht, um die Mäuse zu immunisieren. Eine Woche nach der Immunisierung wurde Blut entnommen, um ein anti-Aspergillus-Serum zu gewinnen.
Die Af-LSP-Antigenlösung 1, welche unter Punkt 1) von Beispiel 2 hergestellt wurde, wurde durch eine SDS-PAGE aufgetrennt. Die aufgetrennten Komponenten wurden dann auf eine PVDF-Membran geblottet, um antigene Proteine durch ein Western-Blot-Verfahren in der gleichen Weise wie unter Punkt 1) von Beispiel 14 unter Verwendung des anti-Aspergillus-Serums als einen Primärantikörper und eines Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörpers als einen Sekundärantikörper nachzuweisen. Als Ergebnis, wie in 4 (Bahn 1) gezeigt, waren Antikörper gegen Proteine in Af-LSP enthalten. Mit anderen Worten wurden Proteine, die in Af-LSP enthalten sind, durch einen lebenden Körper, der an einer Aspergillus-Infektion leidet, als Antigene erkannt. Aufgrund dessen scheint es, dass durch die Induktion einer Immunität gegen Af-LSP eine spezifische protektive Immunität, wie in Beispiel 17 beschrieben, induziert werden kann.
Beispiel 19 (Kreuzreaktivität zwischen unlöslichen Fraktionen von Pilzen)
1) Kreuzreaktivität eines anti-Candida-Serums oder eines anti-Aspergillus-Serums mit Proteinen, die von anderen Arten von Pilzen stammen:
Die Af-LSP-Antigenlösung 1 und die Crn-LSP-Fraktion wurden durch eine SDS-PAGE aufgetrennt und jeweils auf eine PVDF-Membran geblottet, um antigene Proteine durch ein Western-Blot-Verfahren in der gleichen Weise wie unter Punkt 1) von Beispiel 14 unter Verwendung eines anti-Candida-Serums [Punkt 1) von Beispiel 14] als einen Primärantikörper und eines Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörpers als einen Sekundärantikörper nachzuweisen. Als Ergebnis, wie in 5 dargestellt, zeigte das anti-Candida-Serum eine Kreuzreaktivität mit Proteinen von Crn-LSP (Bahn 2). Daneben wurde eine schwache Kreuzreaktivität mit Af-LSP von Aspergillus (Bahn 3) beobachtet. Im Übrigen ist Bahn 1 ein Beispiel für die Verwendung einer unlöslichen Fraktion und zwar Ca-LSP.
Die Crn-LSP-Fraktion wurde durch eine SDS-PAGE aufgetrennt. Die aufgetrennten Komponenten wurden dann auf eine PVDF-Membran geblottet, um antigene Proteine durch ein Western-Blot-Verfahren in der gleichen Weise wie unter Punkt 1) von Beispiel 14 unter Verwendung eines anti-Aspergillus-Serums (Beispiel 18) als einen Primärantikörper und eines Kaninchen-anti-Maus-IgG-Antikörpers als einen Sekundärantikörper nachzuweisen. Das anti-Aspergillus-Serum zeigte eine schwache, aber nachweisbare Kreuzreaktivität mit einem Protein, das in Crn-LSP von Cryptococcus enthalten war (4, Bahn 2).
2) Induktion einer spezifischen zellulären Immunität und einer zellulären Immunität gegen Af-LSP in mit Ca-LSP immunisierten Mäusen:

Eine Zubereitung von Ca-LSP in Vermischung mit IFA und eine Zubereitung der Af-LSP-Antigenlösung Nr. 1 in Vermischung mit IFA wurden in einer Menge von 0,2 μg Protein/Verabreichung, 2 μg Protein/Verabreichung oder 20 μg Protein/Verabreichung in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan an C57BL/6-Mäuse verabreicht, um die Mäuse zu immunisieren. Zur Kontrolle wurde eine Immunisierung mit einem Gemisch von physiologischer Kochsalzlösung und IFA in der gleichen Weise wie vorstehend durchgeführt. Nach der Immunisierung wurde Af-LSP am sechsten Tag in einer Menge von 20 μg Protein/50 μl subkutan in die Fußballen einer jeden Maus (fünf Tiere pro Gruppe) verabreicht. 24 Stunden später wurde die Schwellung der Fußballen gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 angegeben. Anhand des Befunds, dass die Schwellung in der mit Af-LSP immunisierten Gruppe stärker war, wird deutlich, dass eine DTH-Reaktion mit einer beträchtlichen Selektivität gegenüber Af-LSP induziert wurde. Daneben wurde eine bedeutende DTH-Reaktion gegenüber Af-LSP in der Gruppe beobachtet, die mit Ca-LSP in einer Menge von 20 μg Protein immunisiert wurde, wodurch bestätigt wurde, dass eine zelluläre Immunität in Verbindung mit einer Kreuzreaktion induziert wurde. Mit anderen Worten wurde das Vorhandensein eines Proteins, das eine Kreuzreaktion mit verschiedenen Pilzen zeigt, nachgewiesen. Aufgrund dessen scheint es, dass durch die Verwendung eines einzigen LSP-Typs ein Schutz vor einer Infektion mit verschiedenen Pilzen vorgesehen werden kann (vgl. Beispiel 20). Tabelle 12

Gruppe Verabreichung von	Dosis pro Verabreichung	Fußballenschwellung ± SA (× 10^–2 mm)
Physiologischer Kochsalzlösung	-	6.8 ± 5.8
	0.2*	21.0 ± 16.1
Af-LSP	2	42.6 ± 18.8
	20	90.0 ± 37.1
	0.2*	7.4 ± 3.4
Ca-LSP	2	52 ± 5.7
	20	28.0 ± 10.9

*: μg Protein.

Beispiel 20 (Impfstoffaktivität der unlöslichen Fraktion Ca-LSP von Candida albicans in einem Mausmodell einer Aspergillose-Infektion)

Eine Zubereitung von Ca-LSP in Vermischung mit IFA wurde in einer Menge von 20 μg Protein/Verabreichung in einem Abstand von einer Woche zweimal subkutan an C57BL/6-Mäuse verabreicht, um die Mäuse zu immunisieren. Zur Kontrolle wurde eine Immunisierung mit einem Gemisch von physiologischer Kochsalzlösung und IFA in der gleichen Weise wie vorstehend durchgeführt. Nach der Immunisierung wurden die Mäuse am achten Tag intravenös mit 2 × 10⁶ Sporen von Aspergillus fumigatus TIMM 1776 infiziert. Nach der Infektion wurden die Mäuse während 30 Tagen auf ein Überleben beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 angegeben. Es wurde gezeigt, dass durch die Immunisierung mit Ca-LSP eine protektive Immunität gegen eine Infektion, die eine Aspergillus-Infektion ist, induziert werden kann. Tabelle 13

Gruppe Verabreichung von	Mittleres Überleben ± SA Tage	Anzahl der über- lebenden Mäuse nach 30 Tagen Anzahl der verwendeten Mäuse
Physiologischer Kochsalzlösung	6.11 ± 0.9	0/6
Ca-LSP	> 22.6 ± 9.0	2/5

Beispiel 21 (Präparation von Candida albicans-Myzelzellen und Herstellung einer unlöslichen Fraktion Ca-LSP-M aus den Myzelzellen)
In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurde ein Teil einer Kultur, welche dadurch erhalten wurde, dass Candida albicans TIMM 1768 einer Schüttelkultur in YPD-Medium bei 30°C für 24 Stunden unterzogen wurde, auf ein RPMI-1640-Medium, supplementiert mit 10% FCS, in einem Erlenmeyerkolben überimpft und einer Schüttelkultur bei 37°C für 4 Stunden unterzogen, um Candida albicans-Myzelzellen zu erhalten. Die Kultur wurde mit einem Glasfilter gefiltert. Nach der Gewinnung wurden die Zellen mit einer SSB-Lösung gewaschen und dann in der SSB-Lösung wieder suspendiert. Die Suspension wurde dann in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 mit Zymolase, einem Trichoderma-Lyse-Enzym, behandelt. Um die Myzelzellen von den Protoplastenzellen zu trennen, wurde die Suspension durch einen Glasfilter gefiltert, und das Filtrat wurde gewonnen. Das erhaltene Filtrat wurde bei 1000 × g für 5 Minuten zentrifugiert, um die Protoplastenzellen zu gewinnen. Diese Zellen wurden mit einer SSB-Lösung gewaschen und anschließend wurde eine sterile physiologische Kochsalzlösung zugegeben. Nach hinreichendem Rühren wurde das Gemisch für 10 Minuten auf Eis stehen gelassen. Nachdem bestätigt wurde, dass die Protoplasten-Zellen aufgebrochen wurden, wurde das Gemisch bei 10.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert, und das erhaltene Präzipitat wurde als die unlösliche Fraktion der Myzelzellen (nachstehend bezeichnet als "Ca-LSP-M") verwendet.
Nach der Suspension in einer physiologischen Kochsalzlösung wurde Ca-LSP-M einer Ultraschallbehandlung unterzogen und dann in einem Bad mit kochendem Wasser für 5 Minuten sterilisiert, wobei 2 ml einer Ca-LSP-M-Antigen lösung, enthaltend Membranproteine etc., aus 100 ml der Zellkultur erhalten wurden (Proteinkonzentration: 1,2 mg/ml). Ca-LSP-M und eine Ca-LSP-Kontrolle (beide enthaltend etwa 4 μg Protein) wurden durch eine SDS-PAGE aufgetrennt und dann jeweils auf eine PVDF-Membran geblottet, um antigene Proteine durch ein Western-Blot-Verfahren in der gleichen Weise wie unter Punkt 1) von Beispiel 14 unter Verwendung eines anti-Candida-Serums [Punkt 1) von Beispiel 14] als einen Primärantikörper und eines Ratten-anti-Maus-IgG-Antikörpers als einen Sekundärantikörper nachzuweisen. Als Ergebnis, wie in 6 (Bahn 2) gezeigt, wurden in dem anti-Candida-Serum Antikörper nachgewiesen, welche gegen einige der in Ca-LSP-M enthaltenen Proteine hervorgerufen wurden, wobei die Banden von den Banden einer Ca-LSP-Fraktion von Zellen in der Hefephase in Bahn 1 von 3 unterscheidbar waren (6, Bahn 1). Ferner scheint die Menge der Antikörper größer zu sein. Die morphologischen Veränderungen der in diesem Beispiel verwendeten Candida albicans-Myzelzellen vor und nach der Behandlung zur Entfernung der Zellwand werden in 7 veranschaulicht.
Beispiel 22 (Diagnose durch einen Hauttest am Menschen)
Die in Beispiel 1 erhaltene Ca-LSP-Fraktion in physiologischer Kochsalzlösung (Proteinkonzentration: 2,3 mg/ml) wurde mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Proteinkonzentration von 1,0 mg/ml verdünnt und anschließend weiter auf ×100 und ×1000 verdünnt. Der Hauttest wurde wie folgt durchgeführt. Ein Patch Star-Pflaster (hergestellt durch Torii Pharmaceutical Co., Ltd.), das zuvor mit 20 μl einer jeden Verdünnung imprägniert worden war, wurde für zwei Tage auf die Armhaut von vier Freiwilligen geklebt, und anschließend wurde das Patch Star-Pflaster entfernt. Die Hautreaktion in Form einer Hautrötung oder von Knötchen wurde eine Stunde später untersucht. Die Beurteilung erfolgte gemäß den Kriterien der International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG). Von den vier Freiwilligen zeigten zwei Freiwillige mit einer allergischen Prädisposition eine deutliche Hautrötung, und ein Freiwilliger zeigte eine leichte Hautrötung. Demgemäß wurde gezeigt, dass das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung bei einer Diagnose mit Hilfe von DTH-Reaktionen in Individuen wirksam ist.
Beispiel 23 (Bestimmung des IgE-Antikörpertiters in menschlichem Plasma)
Papierscheiben wurden mit Cyanbromid aktiviert, und das Antigen (eine Lösung, welche dadurch hergestellt wurde, dass die in Beispiel 4 erhaltene Ca-LSP-S-Fraktion auf eine Proteinkonzentration von 100 μg/ml verdünnt wurde) wurde nach der Methode von Miyamoto et al. (Miyamoto et al., Allergy, Bd. 22 (1973), 584–594] an die Papierscheiben gekoppelt. Der IgE-Antikörpertiter in menschlichem Plasma wurde, wie nachstehend beschrieben, bestimmt. Eine Papierscheibe mit dem daran gekoppelten Antigen, hergestellt, wie vorstehend beschrieben, und 50 μl menschliches Serum wurden in ein Polystyrolröhrchen eingebracht und bei Raumtemperatur für drei Stunden stehen gelassen. Anschließend wurde die Papierscheibe dreimal mit einer physiologischen Kochsalzlösung, enthaltend 0,2% Tween 20, gewaschen. Anschließend wurden 50 μl eines ¹²⁵I-markierten anti-Mensch-IgE-Antikörpers, der in dem RAST-RIA-Kit (hergestellt durch Pharmacia) enthalten ist, zugegeben, und die Platte wurde bei Raumtemperatur für 16 Stunden stehen gelassen.
Die Scheibe wurde noch dreimal mit der vorstehenden Waschlösung gewaschen, und anschließend wurde die Radioaktivität unter Verwendung eines Gamma-Zählers gemessen. Gleichzeitig wurde der IgE-Antikörpertiter anhand einer Standardkurve, welche mit Hilfe eines Kontrollreagens aus dem RAST-RIA-Kit aufgestellt wurde, berechnet. Von den Allergie-Patienten wurden 24 positive Patienten für den Hauttest unter Verwendung eines im Handel erhältlichen diagnostischen intrakutanen Allergenextrakts (hergestellt durch Torii Pharmaceutical Co., Ltd.) einer Messung des IgE-Antikörpertiters gegen Ca-LSP-S unterzogen, und als Ergebnis wurde für 15 Patienten eine positive Reaktion (wobei positiv definiert ist als 0,35 PRU/ml oder höher) nachgewiesen. Folglich war die Positiv-Rate gegenüber Ca-LSP-S bei den Allergie-Patienten hoch, wodurch gezeigt wurde, dass das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung, welches aus einer unlöslichen Fraktion besteht, für den Nachweis von IgE-Antikörpern geeignet ist.
Beispiel 24 (Cytokinproduktion von menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen (PBMCs) durch Ca-LSP)
Die PBMCs wurden mittels Leukophorese, gefolgt durch das Sammeln der Leukocytenfraktion und weiteren Trennverfahren, wie nachstehend beschrieben, aus normalen Individuen gewonnen. Genau gesagt wurde die Fraktion mit einem RPMI- 1640-Medium um etwa das 2fache verdünnt, dann auf ein Ficoll-Paque-Zentrifugationstrennmedium (hergestellt durch Pharmacia) überlagert und bei 500 × g und Raumtemperatur für 20 Minuten zentrifugiert. Die PBMCs enthaltende Zwischenschicht wurde mit Hilfe einer Pipette gewonnen, gewaschen und in einer Lösung, bestehend aus 90% fötalem Rinderserum (FCS, hergestellt durch Intergen) und 10% Dimethylsulfoxid (hergestellt durch Sigma), zur Aufbewahrung in Flüssigstickstoff suspendiert. Die Behandlung der PBMCs mit Ca-LSP erfolgte, wie nachstehend beschrieben.
Die vorstehend eingelagerte PBMC-Probe wurde lysiert und dann in RPMI-1640-Medium, supplementiert mit menschlichem AB-Serum (hergestellt durch Irvine Scientific), in einer Endkonzentration von 5% (Vol./Vol.) suspendiert. Diese Suspension wurde auf eine Zelldichte von 1,5 × 10⁶ Zellen/ml verdünnt und in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen zu 1 ml pro Vertiefung verteilt. Anschließend wurde eine Ca-LSP-Antigenlösung, welche dadurch hergestellt wurde, dass die in Beispiel 1 erhaltenen Lösung von Ca-LSP in physiologischer Kochsalzlösung verdünnt wurde (Proteinkonzentration: 2,3 mg/ml), zu 50 μl/Vertiefung, entsprechend 5 μg Protein/Vertiefung, zugegeben, gefolgt durch das Züchten bei 37°C in 5% CO₂. Am siebten Tag nach Beginn der Züchtung wurde der Kulturüberstand gesammelt und unter Verwendung eines ELISA-Kits für menschliches IFN-λ (hergestellt durch Amersham Life Science) auf den Gehalt an IFN-λ untersucht. Diese Messung wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Nachweisgrenze des Kits liegt bei 0,002 ng/ml.
Der Gehalt an IFN-λ am siebten Tag ist in 8 angegeben. Die menschlichen PBMCs produzierten IFN-λ als Antwort auf Ca-LSP. Im Übrigen verteilte sich die Menge an IFN-λ, welche in den 15 Proben produziert wurde, über einen Bereich von 1,435 ± 1,210 (Mittelwert ± SA) ng/ml.
Zur Kontrolle wurde physiologische Kochsalzlösung in einer Menge von 50 μl/Vertiefung anstelle der Ca-LSP-Antigenlösung zugegeben, wobei der Gehalt an IFN-λ in der gleichen Weise wie vorstehend bestimmt wurde. Die Menge an IFN-λ, welche in diesen Vertiefungen nachgewiesen wurde, war nicht höher als die Nachweisgrenze des Kits.
Beispiel 25 (Herstellung eines Reagens für einen intradermalen Test und eines Titrationsreagens für die Diagnose einer Pilzallergie)
Die in Beispiel 1 hergestellte Ca-LSP-Antigenlösung wird getrocknet und in Form eines Pulver gewonnen, das als ein Reagens für einen intradermalen Test auf Pilz-Allergosen und als ein Titrationsreagens für die Diagnose einer Pilzallergie verwendet wird. Das Reagens für einen intradermalen Test wird durch das 1000fache Verdünnen auf eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml unter Verwendung einer 0,9%-igen physiologischen Kochsalzlösung, supplementiert mit 0,5% Phenol, als ein Lösungsmittel hergestellt. Das Titrationsreagens für die Diagnose einer Pilzallergie wird unter Verwendung einer Verdünnung der Stammlösung, welche in Hank-Puffer in einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml gelöst wird, als ein Titrationsreagens für die Freisetzung von Histamin hergestellt.
Beispiel 26 (Herstellung eines antigenen Agens für eine Desensibilisierungstherapie)
Die in Beispiel 1 hergestellte Ca-LSP-Antigenlösung wird getrocknet und in Form eines Pulver gewonnen, welches als ein therapeutisches Agens für eine Desensibilisierung gegen Pilzallergie-Krankheiten verwendet wird. Die als ein Allergen aktive Komponente wird in einer 0,9%igen physiologischen Kochsalzlösung, supplementiert mit 0,5% Phenol, in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst, um eine Stammlösung des Antigens für eine Desensibilisierungstherapie zu erhalten.
Beispiel 27 (Isolierung einer Nucleinsäure, die das antigene Protein von Candida albicans codiert)
1) Isolierung einer DNA, die ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 65.000 codiert:
Um eine Nucleinsäure zu isolieren, die ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 65.000 codiert (nachstehend bezeichnet als 65 k-Protein), welches unter Punkt 1) von Beispiel 15 isoliert wurde, wurde zunächst eine cDNA-Bank für Candida albicans TIMM 1768 hergestellt.
Um die Gesamt-RNA aus den Pilzzellen zu extrahieren und zu reinigen, wurden der vorstehende Pilz zunächst in 200 ml YPD-Medium bei 35°C gezüchtet. Anschließend wurden die erhaltenen Zellen mittels Zentrifugation bei 2000 × g für 5 Minuten gewonnen und dann einmal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die erhal tenen Zellen wurden unmittelbar in Flüssigstickstoff eingefroren. Anschließend wurden die tiefgefrorenen Zellen in einem Mörser aufgebrochen und pulverisiert. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines RNA-Extraktionskits (hergestellt durch Pharmacia) aus den erhaltenen aufgebrochenen Zellen gewonnen und isoliert. Aus der Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Oligotex-dT 30 <Super> (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) eine Poly(A+)-RNA präpariert. Anschließend wurde aus 5 μg der Poly(A+)-RNA unter Verwendung des Takara-cDNA-Synthesekits (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) eine cDNA hergestellt. Nach der Ligierung der synthetisierten cDNA mit dem Lambda-Phagenvektor λSCREEN-1 (hergestellt durch Novagen) wurde durch eine in-vitro-Verpackung unter Verwendung des Phagen-Markersystems Phage Pack Extract (hergestellt durch Novagen) eine cDNA-Bank konstruiert.
Basierend auf der Analyse der Aminosäuresequenz unter Punkt 1) von Beispiel 15 wurde gefolgert, dass das 65 k-Protein ein DLDH-Homolog von Saccharomyces cervisiae ist. Das Oligonucleotid DL2, das eine Nucleotidsequenz aufweist, welche zu der Nucleotidsequenz komplementär ist, für die abgeleitet wurde, dass sie eine Aminosäuresequenz codiert, und zwar eine stark konservierte Aminosäuresequenz in den DLDHs anderer Organismen, und ein Oligonucleotid, das eine Nucleotidsequenz aufweist, für die angenommen wurde, dass sie eine partielle Sequenz der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 in dem Sequenzprotokoll codiert, wurden synthetisiert und gereinigt und als Primer für eine PCR verwendet. Die Nucleotidsequenz für DL1 ist in SEQ ID NO: 9 in dem Sequenzprotokoll dargestellt, und die Nucleotidsequenz für DL2 ist in SEQ ID NO: 10 in dem Sequenzprotokoll dargestellt. Aus Zellen von Candida albicans TIMM 1768 wurde die genomische DNA nach der Methode von Philippsen P. et al. [Methods in Enzymology 194 (1991), 169–175] extrahiert und gereinigt und als eine Matrize für die PCR verwendet. Die PCR wurde unter Verwendung der gereinigten genomischen DNA als eine Matrize sowie DL1 und DL2 als Primer durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen für die PCR umfassten 30 Zyklen eines Temperaturwechsels von 94°C für 1 Minute, 55°C für 1,5 Minuten und 72°C für 2 Minuten. Als Ergebnis wurde eine DNA mit einer Länge von etwa 1 kbp amplifiziert. Die vorstehende DNA wurde in den Vektor pUC118 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) cloniert und anschließend wurde die Nucleotidsequenz davon bestimmt. Die Nucleotidsequenz der amplifizierten DNA entsprach der in SEQ ID NO: 13 in dem Sequenzprotokoll dargestellten Sequenz. Ferner wurde gezeigt, dass die durch die vorstehende Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz ist, welche zu der bestimmten Sequenz des N-Terminus des 65 k-Proteins identisch ist. Dadurch wurde gezeigt, dass das erhaltene, amplifizierte DNA-Fragment ein Teil einer DNA ist, welche das 65 k-Protein codiert.
Um die gesamte cDNA zu erhalten, die das 65 k-Protein codiert, wurde dann die cDNA-Bank unter Verwendung des vorstehend amplifizierten DNA-Fragments als eine Sonde durchmustert. Die cDNA-Bank, welche erhalten wurde, wie vorstehend beschrieben, wurde in den Wirt Escherichia coli ER1647 eingebracht und dann mit Top-Agarose (LB-Medium, enthaltend 0,7% Agarose) vermischt. Das Gemisch wurde auf eine LB-Platte überschichtet und dann bei 37°C über Nacht gezüchtet, um Plaques zu erhalten. Die erhaltenen Plaques wurden auf eine Nylonmembran (Hybond-N, hergestellt durch Amersham) übertragen. Anschließend wurde eine Plaque-Hybridisierung durchgeführt. Das vorstehende PCR-Fragment von 1 kb wurde unter Verwendung eines Zufallprimer-DNA-Markierungskits (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) und von [α-³²P]-dCTP markiert und als Sonde für die Hybridisierung verwendet. Als Ergebnis der Durchmusterung von 1,6 × 10⁵ Plaques hybridisierte eine große Zahl von Phagenclonen mit der Sonde. 28 Clone der hybridisierten Clone, welche starke Signale zeigten, wurden weiter untersucht. Durch eine automatisierte Subclonierung in Escherichia coli wurden Escherichia coli-Zellen erhalten, die Plasmide tragen, welche aus der automatisierten Subclonierung einer Region, enthaltend cDNAs aus diesen Phagen, resultierten. Die Plasmide wurden aus den vorstehenden Escherichia coli-Zellen gereinigt, und anschließend wurde die Länge der cDNAs und das Muster der DNA-Banden als Ergebnis einer Spaltung der CDNAs mit Restriktionsendonucleasen beurteilt. Anschließend wurde eine cDNA ausgewählt, von der angenommen wurde, dass sie das Gen für das 65 k-Protein enthält, und anschließend wurde die Nucleotidsequenz davon bestimmt. Die Nucleotidsequenz der DNA ist in SEQ ID NO: 7 dargestellt. Daraus wurde gefolgert, dass das 65 k-Protein dem Protein entspricht, das die in SEQ ID NO: 5 in dem Sequenzprotokoll dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
2) Isolierung einer DNA, die ein antigenes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 25.000 codiert:
Um eine DNA zu isolieren, die ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 25.000 codiert (nachstehend bezeichnet als 25 k-Protein), das unter Punkt 1) von Beispiel 15 isoliert wurde, wurden zuerst die Oligonucleotide SO1 bzw. SO2, bei denen abgeleitet wurde, dass sie einen Teil der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 in dem Sequenzprotokoll codieren, synthetisiert und gereinigt und als Primer für eine PCR verwendet. Die Nucleotidsequenz von SO1 ist in SEQ ID NO: 11 in dem Sequenzprotokoll dargestellt, und die Nucleotidsequenz von SO2 ist in SEQ ID NO: 12 in dem Sequenzprotokoll dargestellt. Anschließend wurde eine RT-PCR mit Hilfe des Takara-RNA-LA-PCR-Kits (AMV) Ver. 1.1 (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) unter Verwendung von 0,5 μg der isolierten Poly(A+)-RNA durchgeführt. Genau gesagt wurde aus 0,5 μg Poly(A+)-RNA mittels der reversen Transkriptase von AMV (bei 45°C für 30 Minuten) unter Verwendung eines Oligo(dT)20-M4-Adaptor-Primers eine cDNA synthetisiert. Die PCR wurde unter Verwendung der vorstehenden cDNA als eine Matrize sowie des SO1-Primers und des M13M4-Primers (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.) als Primer unter den Bedingungen von 35 Zyklen eines Temperaturwechsels von 94°C für 0,5 Minuten, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 2 Minuten durchgeführt. Zusätzlich wurde unter Verwendung des erhaltenen Reaktionsgemisches als Matrize für eine PCR eine zweite PCR (verschachtelte PCR) durchgeführt. Bei dieser Reaktion wurden der SO2-Primer und der M13M4-Primer als Primer verwendet. Als Ergebnis der PCR wurde eine DNA mit einer Länge von 700 bp amplifiziert. Nach der Clonierung der vorstehend amplifizierten DNA in den Vektor pUC118 wurde die Nucleotidsequenz der DNA bestimmt. Die ermittelte Nucleotidsequenz für die DNA ist in SEQ ID NO: 8 in dem Sequenzprotokoll dargestellt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz, welche durch die vorstehende Nucleotidsequenz codiert wird, ist in SEQ ID NO: 6 in dem Sequenzprotokoll dargestellt. Der N-terminale Teil davon war zu der Aminosäuresequenz identisch, welche für das 25 k-Protein bestimmt wurde. Es war ersichtlich, dass das PCR-Fragment eine DNA ist, welche das 25 k-Protein codiert, das eine Homologie zu SOD aufweist.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung kann in Form von biologischen Produkten wie Impfstoffen, bei der Desensibilisierungstherapie für Allergosen verwendeten Zusammensetzungen, Cytokin-freisetzenden Mitteln und diagnostischen Mittel für Krankheiten verwendet werden, wobei die Produkte bei Infektionskrankheiten, die durch Pilze hervorgerufen werden, besonders wirksam sind. Mit anderen Worten weist das Pilzantigen der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf seine Wirkungen als ein Impfstoff denselben Wirkungsgrad wie eine Immunisierung mit lebenden Zellen auf, wobei die Wirkung davon im Vergleich zu herkömmlichen Pilzantigenen bedeutend besser ist. In dem Pilzantigen der vorliegenden Erfindung ist auch im Hinblick auf die Sicherheit davon der Gehalt an Zellwandkomponenten gering und außerdem sind keine lebenden Zellen darin enthalten und die Toxizität ist gering. Daher, falls das Pilzantigen in Form von Impfstoffen oder Zubereitungen für eine Desensibilisierungstherapie verwendet wird, können Nebenwirkungen, welche durch Zellwandkomponenten wie Mannan und Glucan hervorgerufen werden, supprimiert werden, so dass die Immunreaktionen, welche für die Individuen vorteilhaft sind, verstärkt werden können. Zusätzlich zeigt das Pilzantigen eine hohe Empfindlichkeit bei der Untersuchung von Allergosen. SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Pilzantigen, das eine solubilisierte Fraktion ist, die ein lösliches Protein enthält, wobei die solubilisierte Fraktion aus der unlöslichen Fraktion mit einem Puffer extrahiert und davon getrennt wurde, der einen oberflächenaktiven Stoff enthält, wobei die unlösliche Fraktion aus Pilzzellen erhältlich ist durch (a) Aufbrechen von Protoplasten oder Sphäroplasten der Pilzzellen und (b) Ausfällen der in Schritt (a) erhaltenen Komponenten durch Behandlung mittels Zentrifugation, und wobei die unlösliche Fraktion eine Zellorganelle, ein Membranprotein der Zellorganelle und/oder ein cytoplasmatisches Membranprotein enthält.
Pilzantigen nach Anspruch 1, wobei die Behandlung mittels Zentrifugation unter Bedingungen von etwa 100,000 × g ausgeführt wird.
Pilzantigen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die unlösliche Fraktion eine Zellorganelle enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mitochondrien, Kernen, Lysosomen und Vakuolen.
Pilzantigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Pilzzellen gewonnen werden aus einem oder mehreren Pilzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Mucor, Rhizopus, Absidia, Nocardia, Histoplasma, Blastomyces, Coccidioides, Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, Sporothrix, Dematiaceous fungi, Malassezia, Pneumocystis, Pencillium, Alternaria, Cladosporium, Botrytis, Aureobasidium, Fusarium, Trichoderma, Helminthosporium, Neurospora, Wallemia und Rhodotorula.
Pilzantigen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Pilzzellen von mindestens einem Stamm von Candida albicans, mindestens einem Stamm von Aspergillus fumigatus, mindestens einem Stamm von Cryptococcus neoformans oder von mindestens einem Stamm von Dermatophyten sind, die zu Trichophyton, Microsporum oder Epidermophyton gehören.
Pilzantigen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Pilzantigen eine Fähigkeit, an ein zuckergruppenspezifisches Affinitätsmedium zu binden, hat oder nicht hat.
Pilzantigen nach Anspruch 6, wobei das zuckergruppenspezifische Affinitätsmedium ein immobilisiertes Concanavalin A-Medium ist.
Pilzantigen, umfassend ein als Antigen wirkendes Protein, dass eine Impfstoffaktivität oder eine Allergenaktivität hat, die von Candida albicans stammt, wobei das als Antigen wirkende Protein: (a) die Teilaminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt umfasst und ein Molekulargewicht von etwa 65.000 hat, bestimmt mittels SDS-PAGE unter reduzierten Bedingungen; (b) die Teilaminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt umfasst und ein Molekulargewicht von etwa 25.000 hat, bestimmt mittels SDS-PAGE unter reduzierten Bedingungen; (c) die Teilaminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 3 dargestellt umfasst und ein Molekulargewicht von etwa 30.000 hat, bestimmt mittels SDS-PAGE unter reduzierten Bedingungen; oder (d) die Teilaminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 4 dargestellt umfasst und ein Molekulargewicht von etwa 62.000 hat, bestimmt mittels SDS-PAGE unter reduzierten Bedingungen.
Pilzantigen, umfassend ein Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Peptid umfassend die gesamte Sequenz der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 5 dargestellt; und (b) einem Peptid umfassend die gesamte Sequenz der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 6 dargestellt.
Nucleinsäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nucleinsäure, die das Pilzantigen nach Anspruch 8 oder 9 codiert; (b) einer Gesamtsequenz der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 7 dargestellt; (c) einer Gesamtsequenz der Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 8 dargestellt; und (d) einer Nucleinsäure, die ein Peptid codiert, das eine Impfstoffaktivität oder eine Allergenaktivität hat, wobei die Nucleinsäure in der Lage ist, mit einer der Nucleinsäuren gemäß (a) bis (c) zu hybridisieren.
Vektor, umfassend eine Nucleinsäure nach Anspruch 10.
Zelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 11.
Verfahren zum Herstellen eines als Antigen wirkenden Proteins, umfassend das Exprimieren des Pilzantigens in der transformierten Zelle nach Anspruch 12.
Als Antigen wirkendes Peptid, codiert von einer Nucleinsäure nach Anspruch 10 oder erhältlich mit dem Verfahren nach Anspruch 13.
Verfahren zum Herstellen eines Pilzantigens, das eine solubilisierte Fraktion ist, welche aus der unlöslichen Fraktion extrahiert und davon getrennt wurde, wobei die unlösliche Fraktion aus Pilzzellen erhältlich ist, deren Zellwand entfernt wurde, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Gewinnen lebender Pilzzellen; (b) Gewinnen von Pilzzellen, deren Zellwand entfernt worden ist; (c) Aufbrechen von Pilzzellen, deren Zellwand entfernt worden ist; (d) Gewinnen einer unlöslichen Fraktion; und (e) Extrahieren und Trennen einer solubilisierten Fraktion von der unlöslichen Fraktion.
Verfahren nach Anspruch 15, des weiteren umfassend den Schritt des Reinigens der resultierenden solubilisierten Fraktion unter Verwendung eines zuckergruppenspezifischen Affinitätsmediums.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei die solubilisierte Fraktion ein lösliches Protein enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei der Schritt des Extrahierens und Trennens einer solubilisierten Fraktion von einer unlöslichen Fraktion einen Schritt des Solubilisierens der unlöslichen Fraktion mit einem Puffer einschloss, der einen oberflächenaktiven Stoff enthielt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei das zuckergruppenspezifische Affinitätsmedium ein immobilisiertes Concanavalin A-Medium ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die Pilzzellen, deren Zellwand entfernt worden ist, durch eine enzymatische Lysebehandlung der Zellwand und/oder physikalische Behandlung der Zellwand gewonnen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei die Pilzzellen, deren Zellwand entfernt worden ist, Protoplasten oder Sphäroplasten der Pilzzellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei die unlösliche Fraktion dadurch gewonnen wird, dass die durch Aufbrechen der Plizzellen, deren Zellwand entfernt worden ist, gewonnenen Komponenten einer Behandlung mittels Zentrifugation unterworfen werden, und zwar unter Bedingungen von etwa 100,000 × g.
Biologisches Produkt, enthaltend das Pilzantigen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, ein Pilzantigen, hergestellt mit dem Verfahren nach Anspruch 13 oder einem der Ansprüche 15 bis 22, oder das als Antigen wirkende Peptid nach Anspruch 14, wobei das biologisches Produkt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer pharmazeutischen Zusammensetzung, einer Impfstoffzusammensetzung, einem Cytokin-freisetzenden Agens, einer Allergenzusammensetzung und einer diagnostischen Zusammensetzung.
Pharmazeutische Zusammensetzung oder Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 23 zur Vorbeugung einer Pilzinfektion.
Verwendung des Pilzantigens wie in Anspruch 23 definiert für die Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zur Vorbeugung einer Pilzinfektion.
Allergenzusammensetzung wie in Anspruch 23 definiert zur Vorbeugung von Allergosen gegen Pilze oder für die Desensibilisierungstherapie von Allergosen.
Verwendung des Pilzantigens wie in Anspruch 23 definiert für die Herstellung einer Allergenzusammensetzung für die Desensibilisierungstherapie von Allergosen.
Verwendung des Pilzantigens wie in Anspruch 23 definiert für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für eine Krankheit, die durch eine Pilzinfektion verursacht wird, oder Allergosen.
Verwendung nach Anspruch 28, wobei die Krankheit in einem Wirbeltier ist.