DE69735715T2

DE69735715T2 - Cholin-bindendes Protein, welches als gegen Pneumokokken gerichtetes Vakzin verwendet wird

Info

Publication number: DE69735715T2
Application number: DE69735715T
Authority: DE
Inventors: H.Robert New York MASURE; Carsten I. New York ROSENOW; Elaine New York TUOMANEN; Theresa M. New York WIZEMAN
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2017-05-02
Also published as: WO1997041151A2; ES2262177T3; AU732520B2; CA2253252A1; AU2818297A; DE69735715D1; EP0912608B1; ATE323721T1; EP0912608A2; JP2000511411A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Cholin-bindende Proteine, Verfahren zur Isolierung von Cholin-bindenden Proteinen sowie die Gene, die für solche Proteine kodieren. Die Erfindung betrifft ferner azelluläre Impfstoffe für die Bereitstellung eines Schutzes gegen bakterielle Infektionen unter Verwendung solcher Proteine, ferner betrifft die Erfindung Antikörper gegen solche Proteine zur Verwendung bei der Diagnose und der passiven Immuntherapie. Die Cholin-bindenden Proteine der Erfindung sind insbesondere als Impfstoffe gegen Pneumococcus nützlich. Wenn ein Cholin-bindendes Protein eine Aktivität als Adhäsionsprotein aufweist, kann es auch als kompetitiver Inhibitor einer bakteriellen Adhäsion eingesetzt werden, oder aber um Adhäsionsantagonisten in Form kleiner Moleküle zu entdecken.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Antibakterielle Impfstoff-Strategien
Exportierte Proteine sind in Bakterien bei vielen unterschiedlichen und essenziellen Zellfunktionen beteiligt, wie bspw. bei der Beweglichkeit, der Signaltransduktion, dem Transport und dem Zusammenbau von Makromolekülen, sowie bei der Aneignung essenzieller Nährstoffe. Bei pathogenen Bakterien stellen viele exportierte Proteine Virulenz-Determinanten dar, die als Adhäsions-Elemente dienen, um den Wirt zu besiedeln und daher zu infizieren, oder die als Toxine wirken, um die Bakterien gegenüber dem Immunsystem des Wirts zu schützen [internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 95/06732, veröffentlicht am 9. März 1995 von Masure et al., für einen Übersichtsartikel, siehe Hoepelman und Tuomanen, Infect. Immun., 60: 1729–33 (1992)]. Jedoch können andere exportierte Proteine eine Adhäsion nicht direkt vermitteln.
Seit der Entwicklung des Pocken-Impfstoffes durch Jenner im 18. Jahrhundert ist die Impfung ein wichtiges Werkzeug bei der Bekämpfung von infektiösen Mikroorganismen geworden. Vor der Einführung von Antibiotika war die Impfung der Haupthoffnungsträger, um Bevölkerungen gegen virale oder bakterielle Infektionen zu schützen. Mit der Einführung von Antibiotika im frühen 20. Jahrhundert wurde die Impfung gegen bakterielle Infektionen weniger wichtig. Nichtsdestotrotz führte das neuere Auftreten von Antibiotika-resistenten Stämmen von infektiösen Bakterien zu der Wiedererkennung der Wichtigkeit antibakterieller Impfstoffe.
Eine Möglichkeit für antibakterielle Impfstoffe ist die Verwendung von abgetöteten oder abgeschwächten Bakterien. Impfstoffe mit ganzen Bakterien weisen jedoch einige Nachteile auf, einschließlich der Möglichkeit, dass die getöteten oder abgeschwächten Bakterien wieder virulent werden, insbesondere auf Grund eines unvollständigen Abtötens oder Abschwächens, sowie der Einschluss von toxischen Komponenten, wie bspw. verunreinigenden Stoffen.
Eine andere Impfstoff-Alternative ist es, mit. der bakteriellen Kohlenwasserstoff-Kapsel zu immunisieren. Gegenwärtig werden bei Impfungen gegen Streptococcus pneumoniae Konjugate eingesetzt, die aus den Kapseln der 23 üblichsten. Serotypen dieses Bakteriums zusammengesetzt sind. Diese Impfstoffe sind bei Individuen, die gegenüber pathologischen Infektionen äußerst sensibel sind – also bei jungen, älteren sowie bei Individuen, die in ihrem Immunsystem beeinträchtigt sind – unwirksam, auf Grund deren Unfähigkeit, eine T-Zell-Immunantwort auszulösen. Eine neuere Studie hat gezeigt, dass dieser Impfstoff lediglich zu 50 % für diese Individuen zu einem Schutz führt [Shapiro et al., N. Engl. J. Med. 325: 1453–60 (1991)].
Eine Alternative für die Impfstoffe mit ganzen Bakterien sind azelluläre Impfstoffe oder Impfstoffe mit Untereinheiten, bei welchen das Antigen ein bakterielles Oberflächenprotein mit einschließt. Diese Impfstoffe könnten die Mängel von Impfstoffen mit ganzen Bakterien oder Kapsel-basierten Impfstoffen deutlich überwinden. Darüber hinaus, in Anbetracht der Wichtigkeit exportierter Proteine für eine bakterielle Virulenz, stellen diese Proteine ein wichtiges Ziel für einen therapeutischen Eingriff dar. Von besonderer Wichtigkeit sind Proteine, welche ein gemeinsames Antigen auf allen Stämmen einer bestimmten Bakterienspezies darstellen, und zwar zur Verwendung in einem Impfstoff, der gegenüber allen Stämmen der Bakterien wirksam wäre. Nichtsdestotrotz sind bis heute lediglich eine kleine Anzahl von exportierten Proteinen grampositiver Bakterien identifiziert worden, und keines dieser Proteine stellt ein gemeinsames Antigen für eine bestimmte Bakterienspezies dar.
Kürzlich wurden offensichtliche Fusionsproteine, die PhoA enthielten, in Spezies grampositiver und gramnegativer Bakterien exportiert (Pearce und Masure, 1992, Abstr. Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol. 92: 127, Abstract D-188). In diesem Abstract wird die Insertion von Pneumococcen-DNA stromaufwärts des E. coli phoA-Gens offenbart, dem die Signalsequenz und der Promotor fehlen, wobei die Insertion in einen Shuttle-Vektor erfolgte, der sowohl in E. coli als auch in S. pneumoniae exprimiert wird; in dem Abstract wird ferner angedeutet, dass für die Translokation exportierter Proteine über die Plasmamembranen hinweg ähnliche Wege gefunden werden sollten, und zwar für beide Bakterienspezies.
In älteren Studien konnte durch den Einsatz von zufälligen Genfusionen auf der Translationsebene (PhoA-Mutagenese) zur Identifizierung und Änderung exportierter Proteine in Streptococcus pneumoniae ein Einblick in vermutlich exportierte Proteine gewonnen werden (Pearce et al., Mol. Microbiol., 9: 1037 (1993); internationale Patentanmeldung Nr. WO 95/006732, veröffentlicht am 9. März, 1995; US-Patentanmeldung Nr. 08/116,541, angemeldet am 1. September 1993; US-Patentanmeldung Nr. 08/245,511, angemeldet am 18. Mai 1994]. Indem diese Genfusionstechnologie mit Bioaktivitäts-Assays hinsichtlich der Pneumococcen-Adhärenz gekoppelt wurde, war das Hauptziel, immunogene Adhäsions-Virulenzdeterminanten an eukaryotische Zellen, die das Verhältnis zwischen Bakterium und Wirt definieren und daher als mögliche Impfstoff-Kandidaten dienen, genetisch zu identifizieren und zu charakterisieren. Über 25 Loci, die die Adhärenz bewirken, sind als Virulenzdeterminanten identifiziert worden.
Darüber hinaus werden allmählich die molekularen Mechanismen der Pathogenese, die von Pneumococcen verursacht werden, definiert [Cundell et al., Infect. Immun. 63: 2493–2498 (1995); Wizemann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996); Cundell et al., J. Cell Biol. S18A: 45 (1994); Spellerberg et al., Mol. Microb. (1996)]. Die Ergebnisse dieser Bemühungen zeigen, dass viele bakterielle Komponenten bei einem komplexkoordinierten Prozess, eine Krankheit zu verursachen, beteiligt sind. Es ist jedoch offensichtlich, dass mit dieser Strategie nur wenige mögliche Impfstoff-Kandidaten erzeugt werden konnten.
Bei der Suche nach exportierten Pneumococcen-Proteinen, die attraktive Ziele für einen Impfstoff sein könnten, ist das Pneumococcen-Oberflächenprotein A(PspA) von Bedeutung [siehe Yother et al., J. Bacteriol., 174: 610 (1992)]. von PspA konnte gezeigt werden, dass es für einen S. pneumoniae-Impfstoff in Frage kommt, da es bisher in allen Pneumococcen gefunden werden konnte; das gereinigte Protein kann dazu eingesetzt werden, eine schützende Immunität in Mäusen hervorzurufen; auch verleihen Antikörper gegen das Protein eine passive Immunität in Mäusen [Talkington et al., Microb. Pathog. 13: 343–355 (1992)]. Nichtsdestotrotz zeigte PspA eine antigene Variabilität in dem N-terminalen Abschnitt des Proteins zwischen den Stämmen, wel cher die immunogenen und einen Schutz hervorrufenden Epitope enthält (Yother et al., siehe oben). Dieses Protein stellt kein Antigen dar, das allen S. pneumoniae-Stämmen. gemein ist, und ist daher kein geeigneter Impfstoff-Kandidat.
Pneumococcen-Cholin-bindende Proteine
Ältere Studien haben gezeigt, dass PspA, genauso wie ein anderes Oberflächen-exponiertes Protein, LytA, die autolytische Amidase, in einer Cholin-abhängigen Weise an Teichonsäuren (TA) bindet, die einen integralen Teil der Zellwand von Streptococcus pneumoniae darstellen. TA enthalten einen einzigartigen terminalen Phosphorylcholin-Anteil. PspA, ein Protein mit einem Molekulargewicht von 84 kDa, welches hochvariabel ist, wird von der Zelloberfläche mit einer hohen Cholinkonzentration freigesetzt. Lyt, oder Autolysin, ist ein 36 kDa-Protein, welches die Pneumococcen-Zellwände lysiert (Selbst-Lyse), es wird jedoch von der Zelle weder durch Wachstum in hohen Cholinkonzentrationen freigesetzt, noch durch Waschen in 10%igem Cholin, oder durch Wachstum in Ethanolamin. Veröffentlichungen über Cholinbindende Proteine schließen diejenigen von Sanchez-Puelles et al., Gene 89: 69–75 (1990) mit ein, ferner Briese und Hakenback, Eur. J. Biochem. 146: 417–427; Yother und White, J. of Bacteriol. 176: 2976–2985; Sanchez-Beato et al., J. of Bacteriol. 177: 1098–1193; und Wren, Micro. Review Mol. Microbiol. 5: 797–803 (1991).
Für Proteine, die die Oberfläche von grampositiven Bakterien ausmachen, ist eine Vielzahl von kovalenten und nicht-kovalenten Anhaftungs-Mechanismen beschrieben worden. Einige Streptococcen und Clostridium sp. besitzen Phosphorylcholin als ein zigartige Zellwandkomponente. Dieses Molekül ist der terminale Bestandteil der Teichonsäure (C Polysaccharid) und Lipoteichonsäure (LTA), welche in der Zellwand und der Plasmamembran dieser Bakterien vorliegen. Ferner ist eine Familie von Cholin-bindenden Proteinen (CPBs) beschrieben worden, die einer Vielzahl zellulärer Funktionen dienen. Diese Proteine bestehen aus einer N-terminalen Aktivitätsdomäne und einer wiederholten C-terminalen kennzeichnenden Cholin-bindendenden Domäne, welche diese Moleküle an die Oberfläche der Bakterien anhaftet. Dieses Motiv wurde in den C-terminalen Regionen eines sekretierten Glycoproteins aus Clostridium acetobutylicum NCIB 88052 identifiziert [Sanchez-Beato et al., J. Bacteriol. 177: 1098–1103 (1995)], in den Toxinen A und B aus Clostridium difficile [Von Eichel-Streiber und Sauerborn, Gene 96: 107–13 (1990); Von Eichel-Streiber et al., J. Bacteriol. 174: 6707–6710 (1992)], in einem Glucan-bindenden Protein aus Streptococcus mutans, in mehreren Glycosyltransferasen aus Streptococcus downei und S. mutans, in der Mureinhydrolase (LytA) aus Pneumococcus und Pneumococcen-lytischen Phagen [Ronda et al., Eur. J. Biochem. 164: 621–4 (1987); Diaz et al., J. Bacteriol. 174: 5516–25 (1992); Romero et al., Microb. Lett. 108: 87–92 (1993); Yother und White, J. Bacteriol. 176: 2976–85 (1994)], sowie in einem Oberflächenantigen (PspA) ebenfalls von Pneumococcus.
Pathologie der Pneumococcen-Adhärenz
S. pneumoniae ist ein grampositives Bakterium, das die Hauptursache invasiver Infektionen wie der Sepsis und der Meningitis ist (Tuomanen et al., N. Engl. J. Med. 322: 1280–1284 (1995)]. Die Pneumococcen besiedeln das Epithel des Nasopharynx und durchdringen anschließend das Epithel der Lunge oder der Luft röhre, um Gefäßkompartimente zu erreichen. Eine solche Translokation würde notwendigerweise die Passage von einer Epithelstelle durch die darunter liegende Basalmembran/extrazelluläre Matrix sowie über das Endothel hinweg involvieren. Von den Pneumococcen konnte gezeigt werden, dass sie an Epithelien, Endothelien und Basalmembranen in vitro und in vitro anhaften (Plotkowski et al., Am. Rev. Respir. Dis., 134 (1986); Cundell und Tuomanen, Microb. Path., 17: 361–374 (1994); Cundel et al., Nature, 377: 435–438 (1995); van der Flier et al., Infect. Immun., 63: 4317–4322 (1995)].
Fibronectin ist ein Säugetier-Glycoprotein, das als lösliches Dimer (Molekulargewicht von 550 kDa) in Körperflüssigkeiten wie dem Plasma vorliegt (200–700 mg/ml), der Cerebrospinal-Flüssigkeit und Amnion-Flüssigkeit, und als weniger lösliches Multimer in der extrazellulären Matrix und Basalmembran [Ruoslati, Ann. Rev. Biochem., 57: 375–413 (1988)]. Fibronectin hat spezifische Bindungsstellen für eine Anzahl von Proteinen einschließlich Collagen, Integrine, sowie zwei Bindestellen für Heparin. Viele Mikroorganismen binden Fibronectin, einschließlich orale Streptococcen und einige gramnegative Bakterien [Westerlund und Korhonen, Mol. Microbiol., 9: 687–694 (1993)]. Diese unterschiedlichen Pathogene zielen alle auf die Typ-1-Repeats der N-terminalen Heparin-bindenden Domäne von Fibronectin ab. Die bekannten Fibronectin-bindenden Proteine zeigen ein ähnliches Aminosäurensequenzmotiv, welches mit der Bindung an das gleiche Ziel innerhalb Fibronectin übereinstimmt [Westerlund und Korhonen, 1993, siehe oben]. Im Gegensatz zu diesem Muster wurde von Streptococcus pneumoniae gezeigt, dass es schnell an immobilisiertes Fibronectin an der Carboxyterminalen Heparin-bindenden Domäne adhäriert [van der Flier et al., Infect. Immun., 63: 4317–4322, (1995)] Diese Fibronectin-Domäne weist eine Anzahl an biologischen Aktivitäten auf. Es enthält die Haupt-Proteoglycan-bindende Domäne (Hep II) und unterstützt ferner die Bindung des Leukocytenintegrins VLA-4 an zwei Regionen im Typ-III-verbindenden Segment (IIICS) [Wayner et al., Cell. Biol., 109: 1321–1330 (1989); Guan und Hynes, Cell, 60: 53–61 (1990); Mould et al., J. Bio. Chem., 266: 3579–3585 (1991)]. Die VLA-4-bindende Domäne unterscheidet sich von derjenigen, die das RGD-Motiv zur Bindung des Fibronectins durch VLA-5 enthält [Pierschbacher et al., Cell, 26: 259–267 (1981)]. Das IIICS-Segment wird einem alternativen Splicing unterzogen und fehlt bei einigen löslichen Formen von Fibronectin [Guan und Hynes, 1990, siehe oben].
VLA-4, α4β (CD49d/CD29), ist ein Integrin, das auf Lymphocyten, Monocyten, Muskelzellen und Melanomzellen vorliegt, welches die Bindung an VCAM-1 auf Endothelzellen und Myoblasten und an die IIICS-Domäne von Fibronectin in der subendothelialen Matrix vermittelt [Osborn et al., Cell, 59: 1203–1211 (1989); Mould et al., J. Biol. Chem., 254: 4020–2024 (1990); Shimizu et al., Immunological Reviews, 114: 109–143 (1990); Rosen et al., Cell, 69: 1107–1119 (1992)]. Diese Wechselwirkungen sind während der Infiltration mononucleärer Zellen an Entzündungsherden wichtig, ferner während der Metastasenbildung von Melanomzellen und in der Myogenese [McCarthy et al., J. Cell. Biol., 102: 179–188 (1986); Osborn et al., 1898 siehe oben; Shimuzu et al., 1990, siehe oben; Rosen et al., 1992, siehe oben]. VLA-4 zielt auf eine 25-Aminosäurenregion (CS1) mit der IIICS-Fibronectindomäne ab, wobei diese Interaktion durch das Tripeptid Leu-Asp-Val blockiert werden kann [Guan und Hynes, 1990, siehe oben; Komoriya et al., J. Biol. Chem., 266: 15075–15079 (1991); Mould et al., 1991, siehe oben]. Ein homologes IDSP-Motiv liegt an den VLA-4-bindenden Stellen in den VCAM-1-Domänen I und IV vor [Clemens et al., J. Cell. Sci., 107: 2127–2135 (1994)]. Von den Bindestellen auf VLA-4 für VCAM-1 und Fibronectin wurde angenommen, dass sie sich unterscheiden, jedoch überlappen[Elices et al., Cell, 50: 577–584 (1990); Pulido et al., J. Biol. Chem., 266: 10241–10245 (1991); Vonderheide und Springer, J. Exp. Med., 175: 1433–1442 (1992); Makarem, J. Biol. Chem., 269: 4005–4011 (1994)]. Die Fähigkeit der Pneumococcen, auf die HepII-Region von Fibronectin abzuzielen, brachte die Möglichkeit ins Spiel, dass diese Bakterien die Region erkennen, die HepII und VCAM-1 gemein ist, so dass die Bindung durch eine bakterielle Version von VLA-4 vermittelt wurde. Solche Wechselwirkungen konnten die Passage der Pneumococcen über die Basalmembran fördern. Die Wichtigkeit der VLA-4-VCAM-1-Wechselwirkungen für das Befördern von Leukocyten ins Gehirn legte außerdem nahe, dass die Pneumococcentransmigration in das zentrale Nervensystem bei der Meningitis eine Rolle spielte.
In Anbetracht der zuvor erwähnten Nachteile bei den im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Impfung gegen bakterielle Pathogene sollte es daher offensichtlich sein, dass im Stand der Technik immer noch das Bedürfnis besteht, Proteinantigene zu identifizieren, die zur Verwendung als Untereinheit-Impfstoffe geeignet sind, und zur Verwendung für die Generierung von Antikörpern, die für einen Einsatz bei der passiven Immunisierung geeignet sind.
Die Zitierung der hierin aufgeführten Referenzen soll nicht als Zugeständnis ausgelegt werden, dass diese Referenzen als Stand der Technik zu der Erfindung verfügbar sind.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden bakterielle Oberflächenantigene bereitgestellt, die zur Verwendung bei der Immunisierung von Tieren gegen bakterielle Infektionen geeignet sind. Insbesondere werden neue Cholin-bindende Proteine bereitgestellt, die aus Streptococcus pneumoniae erhallten werden können.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Isolierung und Identifizierung solcher Cholin-bindenden Proteine bereitgestellt, sowie die Gene, die für diese kodieren.
Die vorliegende Erfindung erstreckt in ihrem breitesten Aspekt auf Streptococcen-Oberflächenantigene, welche hierin im Allgemeinen als Cholin-bindende Proteine bezeichnet werden, mit einer oder mehrerer Eigenschaften, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:

a) Adhäsions-Inhibierung von Streptococcus an Wirtszellen;
b) Reaktivität mit Seren von Patienten, die mit Infektionen des Bakteriums infiziert sind, oder sich von einer solchen Infektion erholen;
c) Reaktivität mit Kaninchen-Antiseren, die gegen das Cholin-bindende Protein generiert wurden; und
d) Markiert sein mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) ohne die Notwendigkeit einer bakteriellen Lyse (also in intakten Bakterien), wobei das Cholin-bindende Protein aus Streptococcus pneumoniae gewonnen werden kann, es ferner in der 10 % SDS-PAGE ein offensichtliches Molekulargewicht von 112 kDa oder 50 kDa besitzt und es die Aminosäuresequenz irgendeiner der SEQ ID Nrn. 1, 8 bis 10, 19, 21 und 25 aufweist.

In einem spezifischen Beispiel wird das bakterielle Oberflächenantigen aus Pneumococcus isoliert. In einem weiteren Aspekt erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf Impfstoffe, die auf Cholin-bindenden Proteinen basieren, wobei das Cholinbindende Protein in der 10 % SDS-PAGE ein offensichtliches Molekulargewicht von 112 kDa hat, und es die Aminosäuresequenz irgendeiner der SEQ ID Nrn. 1, 9–10, 21 und 25 aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Cholin-bindendes Protein mit einem hohen Grad an Sequenzähnlichkeit mit Enolase bereit, insbesondere mit der B. subtilis-Enolase.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nucleinsäuren, wie bspw. rekombinante DNA-Moleküle oder klonierte Gene, oder eine degenerierte Variante davon, welche für ein bakterielles Cholin-bindendes Protein (CBP) der Erfindung codiert. Insbesondere codiert das Nucleinsäuremolekül, insbesondere ein rekombinantes DNA-Molekül oder kloniertes Gen, für ein Cholinbindendes Protein, das eine der folgenden Aminosäuresequenzen aufweist:
CBP50 mit der nahezu vollständigen Länge (SEQ ID Nr. 19) oder SEQ ID Nr. 25.
In einer spezifischen Ausführungsform besitzt eine Nucleinsäure gemäß der Erfindung eine Nucleotidsequenz, wie sie mit der SEQ ID Nr. 18 gezeigt ist, und zwar von Nucleotid 1 bis zum Stopp- Codon TAA, oder die Nucleotidsequenz, wie sie in der codierenden Sequenz der SEQ ID Nr. 24 dargestellt ist.
Die DNA-Sequenzen, die für CBPs der vorliegenden Erfindung codieren, können als Sonden hergestellt werden, damit nach komplementären Sequenzen und genomischen Klonen in den gleichen oder anderen Spezies gescreent werden kann,. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf Sonden, die derart vorbereitet sind, dass sie für ein Screening bereitgestellt werden können. So können die Sonden bspw. mit einer Vielzahl von bekannten Vektoren; wie bspw. dem λ-Phagen-Vektor, bereitgestellt werden. Derartige Sonden sind für die Diagnose nützlich, das heißt bspw. um eine Spezies oder einen Stamm einer Infektion mit einem grampositiven Bakterium zu bestätigen, jedoch ebenso für die Klonierung von cDNA oder von Genen, die für CBPs codieren.
Die vorliegende Erfindung schließt ferner CBPS mit den hierin aufgeführten Aktivitäten mit ein, und diejenigen, die die hierin beschriebenen Aminosäuresequenzen aufweisen, und ausgewählt sind aus den SEQ ID Nrn. 1, 8, 9, 10, 19 und 21.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die vollständige DNA-Sequenz des rekombinanten DNA-Moleküls oder des derart bestimmten klonierten Gens operativ mit einer Expressions-Kontrollsequenz verbunden werden, welche in einen geeigneten Wirt eingeführt werden kann. Die Erfindung erstreckt sich dementsprechend auf einzellige Wirte, die mit dem klonierten Gen oder dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind, welche eine DNA-Sequenz, die für die vorliegenden CBP(s) codiert, aufweisen, und insbesondere die DNA-Sequenzen, die oben angegeben wurden und die SEQ ID Nr. 18 von Nucleotid 1 bis zum Stoppcodon TAA oder die codierenden Region der SEQ ID Nr. 24 gezeigt sind.
Gemäß anderen bevorzugten Merkmalen bestimmter bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes Expressionssystem bereitgestellt, um biologisch aktive CBPs oder immunologisch reaktive Abschnitte davon herzustellen.
Bei dem Konzept der bakteriellen Oberflächenantigene wird in Betracht gezogen, dass für entsprechend specifische bindende Proteine, wie CBPs und ähnliche, wie weiter oben beschrieben, spezifische Faktoren existieren. Dementsprechend wird die exakte Struktur jedes CBP logischerweise derart variieren, dass die Cholin-Bindung und Aktivitäts-Spezifität erreicht wird. Mit dieser Spezifität und der direkten Beteiligung des CBP bei der Adhärenz der Bakterien wird die Aussicht eines breiten Spektrums an diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten bereitgestellt.
Bei der vorliegenden Erfindung werden selbstverständlich mehrere Mittel für die Herstellung der CBPs in Erwägung gezogen, einschließlich – wie hierin dargestellt – bekannte Rekombinationstechniken, wobei die Erfindung dementsprechend auch synthetische Präparationen innerhalb ihres Rahmens abdecken soll. Die Isolierung der DNA und der Aminosäurensequenzen, die hierin offenbart sind, erleichtert die Reproduktion der CBPs durch solche rekombinanten Verfahren, so dass sich die Erfindung entsprechend auch auf Expressionsvektoren erstreckt, die, ausgehend von den offenbarten DNA-Sequenzen für die Expression in Wirtssystemen durch rekombinanten DNA-Techniken hergestellt wurden, sowie auf die hieraus resultierenden transformierten Wirte.
Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass mit ihr für die Kommerzialisierung von Anti-CBP-Impfstoffen hinreichende Mengen an CBPs durch die Herstellung bereitgestellt werden. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass die Erfindung für eine Bereitstellung von Multi-Komponentenimpfstoffen mit zwei oder mehreren CBPs sorgt, wodurch die potenzielle Effektivität des Impfstoffes verbreitert und erhöht wird. In ihrem Hauptaspekt bezieht sich die Erfindung auch auf die Verwendung der CBPs der Erfindung, entweder getrennt oder in Kombination von zwei oder mehreren, bei Impfstoffen zum Schutz gegen Pneumococcen-Infektionen. Vorzugsweise weist ein Impfstoff, der zwei oder mehrere CBPs aufweist, ferner PspA, LytA oder beide auf. Gemäß der Erfindung können die CBPs rekombinant hergestellt werden. Alternativ können die CBPs aus bakteriellen Kulturen gewonnen werden, bspw. unter Verwendung von hierin beschriebenen und beispielhaft aufgeführten Reinigungsverfahren. In einer spezifischen Ausführungsform wird eine Mischung von CBPs aus Pneumococcus bspw. durch eine Cholin-Affinitäts-Chromatographie gewonnen und wird direkt – ohne eine weitere Reinigung – für die Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines Tieres eingesetzt und zur Generierung von schützenden Antikörpern. Eine solche Mischung von Cholinaffinitätsgereinigten Proteinen kann aus Bakterien gewonnen werden, die PspA exprimieren oder denen die PspA-Expression fehlt (das heißt, PspA^--Bakterien, wie hierin beispielhaft dargestellt).
In einem weiteren Aspekt werden die Gene (wie bspw. die cDNA), die für einen oder mehrere CBPs der Erfindung codieren, in einen transgenen Vektor für die Expression in einem Säugetierwirt in vitro eingebaut, wie bspw. ein Impfstoff, der auf einer Nucleinsäure basiert.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel werden die CBPs der Erfindung dazu eingesetzt, Antikörper für die passive Immunisierung, für Diagnostika oder für ein Screening zu generieren. In einem spezifischen Beispiel, siehe unten, verhindert die passive Immunisierung im Mausmodell die Todesfolge einer Pneumococcen-Infektion.
Die diagnostische Brauchbarkeit der vorliegenden Erfindung erstreckt sich auf die Verwendung von Bindepartnern, insbesondere Antikörpern, bis hin auf die vorliegenden CBPs in Assays, um nach einer bakteriellen Infektion zu screenen.
Antikörper gegen die CBPs schließen natürlich generierte und rekombinant hergestellte Antikörper mit ein. Solche Antikörper könnten für das Screening von Expressions-Bibliotheken eingesetzt werden, um das Gen oder die Gene zu erhalten, die für die CBPs codieren. Diese können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper mit einschließen, die durch bekannte genetische Verfahren hergestellt werden, ebenso wie spezifische (chimäre) Antikörper und Antikörper, welche andere Funktionalitäten mit einschließen, welche für eine weitere diagnostische Verwendung geeignet sind, welche mit deren Fähigkeit, die bakterielle Adhärenz zu modulieren, verbunden ist.
Daher können die CBPs, deren Analoga und/oder Analoga, sowie Antikörper, die gegen diese gerichtet hergestellt werden können, in Verbindung mit verschiedenen diagnostischen Verfahren eingesetzt werden, einschließlich Immunoassays, wie bspw. ein Radioimmunoassay, unter Verwendung von bspw. einem gegen CBP gerichteten Antikörper, der entweder durch eine radioaktive Addition oder durch Radioiodination markiert wurde.
Bei einem Immunoassay kann eine Kontrollmenge der Antagonisten oder der dagegen gerichteten Antikörper oder ähnliche, hergestellt werden, und mit einem Enzym, einem spezifischen Bindungspartner und/oder einem radioaktiven Element markiert werden, und anschließend in eine zelluläre Probe eingeführt werden. Nachdem das markierte Material oder deren Bindepartner mit Stellen innerhalb der Probe reagieren konnte, kann die resultierende Masse durch bekannte Verfahren untersucht werden, die in Abhängigkeit der Charakteristika der angehefteten Markierung variieren können.
In dem Fall, wenn eine radioaktive Markierung gewählt wird, wie bspw. die Isotope ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I und ¹⁸⁶Re, können gegenwärtig bekannte, verfügbare Auszählverfahren verwendet werden. Wenn die Markierung ein Enzym ist, kann die Detektion durch eine der gegenwärtig eingesetzten colorimetrischen, spektrofotometrischen, fluorospektrofotometrischen, amperometrischen oder gasometrischen Verfahren bewerkstelligt werden, die im Stand der Technik: bekannt sind.
Die vorliegende Erfindung schließt ein Assaysystem mit ein, welches in Form eines Testkits zur quantitativen Analyse des Ausmaßes des Vorliegens der bakteriellen Infektion, oder zur Identifizierung von Arzneimitteln oder anderen Stoffen hergestellt werden kann, die eine solche Infektion nachahmen oder blockieren können. Das System oder das Testkit kann eine markierte Komponente aufweisen, die nach den hierin beschriebenen radioaktiven und/oder enzymatischen Verfahren hergestellt wurden, ferner durch das Binden einer Markierung an die CBPs, deren Agonisten und/oder Antagonisten, und eine oder mehrere zusätzlichen immunochemischen Reagenzien, von denen zumindest einer ein freier oder immobilisierter Ligand ist, welcher entweder mit der markierten Komponente, deren Bindepartner, einer der zu bestimmenden Komponenten oder deren Bindepartner(n) binden kann.
Insbesondere könnten die Proteine der CBPs, deren Sequenzen in den SEQ ID Nrn. 1, 8 bis 10, 19, 21 und 25 hierin dargestellt sind, deren Antikörper, Agonisten, Antagonisten oder aktive Fragmente davon, in pharmazeutische Formulierungen zur Verabreichung in den Fällen bereitgestellt werden, in denen eine Antibiotika-Therapie geeignet ist, wie bspw. zur Behandlung und/oder Prävention von bakteriellen Infektionen. Solche freien Proteine könnten mit der bakteriellen CBP-Funktion konkurrieren, wodurch die bakterielle pathologische Aktivität, wie bspw. die Adhäsion, behindert wird.
Dementsprechend ist eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein CBP und dessen Untereinheiten in gereinigter Form bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Antikörper gegen CBP und dessen Untereinheiten bereitzustellen, sowie Verfahren zu deren Herstellung, einschließlich rekombinante Verfahren.
Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Detektion des Vorliegens von CBP und dessen Untereinheiten in Säugetieren bereitzustellen, in welchen invasive, spontane oder idiopathische pathologische Zustände vermutet werden.
Es ist ferner eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Arzneimittel zur Behandlung von Säugetieren bereitzustellen, um die Menge oder die Aktivität von Bakterien, das CBP oder Untereinheiten davon zu kontrollieren, um nachteilige Konsequenzen eines solchen Vorliegens oder der Aktivität abzuändern, oder aber – wenn dies günstig sein sollte – eine solche Aktivität zu verstärken.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Arzneimittel zur Behandlung von Säugetieren bereitzustellen, um die Menge der Aktivität der Bakterien oder deren Untereinheiten zu kontrollieren, um die nachteiligen Konsequenzen von invasiven, spontanen, oder idiopathischen pathologischen Zuständen verhindern oder behandeln zu können.
Es ist ferner eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei therapeutischen Verfahren bereitzustellen, welche das CBP, dessen Untereinheiten oder deren Bindepartner aufweisen, oder auf diesen basieren.
Andere Aufgaben und Vorteile werden den Fachleuten, ausgehend von der nachfolgenden Beschreibung, klar werden, welche zu nächst auf die folgenden beispielhaften Zeichnungen Bezug nimmt, und anschließend auf eine detaillierte Beschreibung der Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 Western Blot einer 6 % SDS-PAGE, auf welcher bakterielle Oberflächenproteine aufgetrennt wurden. Spur A stellt FITC-markierte Oberflächenproteine aus LM91 (PsPA^-) dar. Spur B stellt FITC-markierte Oberflächenproteine aus LM91 nach einer Cholin-Affinitäts-Chromatographie dar. Spur C stellt LM91-Proteine nach einer Cholin-Affinitäts-Chromatographie (CBRO) dar. „FITC" bedeutet, dass Anti-FITC-Antikörper (Maus) verwendet wurden. „Convalesc." zeigt die Verwendung eines Antikörpers eines genesenden Menschen (post-Pneumococcen-Infektion) an. „CBP" bedeutet, dass ein Anti-CBP-Antikörper (Kaninchen) verwendet wurde.
2. Western Blot einer 10 % SDS-PAGE, wie in 1 beschrieben.
3. Adhäsionsassay von PN R6 an die Lungenzelle A549.
4. Adhäsionsassay von PN R6 an HUVEC-(Endothel-)Zellen.
5. Stand der Technik. Schematische Darstellung von Fibronectin und dessen Fragmenten.
6. Direkte Adhärenz von Pneumococcen an rekombinante Fragmente der 33-kDa-Heparin-11-bindenden Domäne.
7. Direkte Adhärenz von Pneumococcus an synthetische Peptide, die auf den Heparin-11-Typ III#14- und IIICS-Regionen basieren.
8. Inhibierung der S. pneumiae-Adhärenz durch Choline. Die Bakterien wurden mit Cholin vorinkubiert, eluierte Proteine und Cholin wurden abgewaschen, und die bakterielle Adhäsion an Fibronectin untersucht.
9. Inhibierung der Pneumococcen-Adhärenz an Fibronectin durch einen Anti-Cholin-Antikörper, TEPC15.
10. Vergleich der Amino-terminalen Sequenz des 50-kDa-Proteins mit der B. subtilis Enolase.
11. Inhibierung der Pneumococcen-Adhärenz an Fibronectin durch Hefe-Enolase (Sigma).
12. Inhibierung der Pneumococcen-Adhärenz an Fibronectin durch L-Lysin.
13. SDS-PAGE des Eluats aus einer Fibronectin-gekoppelten CnBr-aktivierten SEPHAROSE 4B-Säule (Spur A), und Hefe-Enolase (Sigma) (Spur B). Das S. pneumoniae-Lysat aus der „French Press" wurde auf die Fibronectin-SEPHAROSE-Säule aufgetragen. Die Säule wurde gewaschen und adsorbierte Proteine, mit 0,01, 0,1 und 0,5 M L-Lysin eluiert. Das 0,5-M-Lysin-Eluat wurde mittels SDS-PAGE mit nachfolgender Silberfärbung analysiert. Das eluierte Protein hatte ein mit der Hefe-Enolase vergleichbares offensichtliches Molekulargewicht.
14. DNA-Sequenz-Vergleich der DNA für das 50-kDa-Protein (SEQ ID Nr. 14) und der B. subtilis-Enolase (SEQ ID Nr. 15). Die Sequenzen waren zu 74 % identisch.
15. Abgeleiteter Aminosäurensequenzvergleich für das 50-kDa-Protein (SEQ ID Nr. 16) und der B. subtilis-Enolase (SEQ ID Nr. 17). Diese Sequenzen waren zu 72 % identisch, mit 85 % Positiven.
16. Passiver Schutz der Mäuse gegen Sepsis mit einem Anti-CBP-Antiserum. (A) CF1-Mäuse, interperitoneal mit D39 (Typ 2)-Pneumococcen mit einer Dosis von entweder 4,5 × 10⁴ (n = 10 pro Gruppe; ⦁) oder 8,4 × 10⁴ (n = 5 pro Gruppe;
) in 0,5 ml PBS getriggert. Die Versuchsgruppen (–) wurden mit 0,5 ml einer 1:10 verdünnten Kaninchen-Anti-CBP-Serum eine Stunde nach der Impfung mit den Bakterien behandelt. Die Kontrollmäuse (--) erhielten ein Prä-Immunserum. Der Prozentsatz der überlebenden wurde täglich über einen Sechstageszeitraum evaluiert. (B) Passiver Schutz gegen eine Triggerung mit dem heterologen Serotyp SIII (Typ 3; n = 5 pro Gruppe; ☐) wurde wie in A mit einer Dosis von 200 cfu durchgeführt. Die Bakterien wurden mit Antiserum (⦁) 30 min vor der intraperitonealen Beimpfung vorinkubiert. Das Blut wurde nach 24 Stunden für die cfu abgenommen, und die Überlebensrate wurde alle 12 Stunden über einen Zeitraum von 72 Stunden hinweg aufgezeichnet.
17. Kompetitive Inhibierung der Pneumococcen-Adhärenz an menschliche Zellen durch exogenes gereinigtes CBPs. (A) Typ II Lungenzellen (LC) oder (B) Endothelzellen (EC) wurden 15 Minuten lang mit einer CBP-Präparation (1 mg/ml) vorinkubiert, gewaschen und anschließend mit FITC-markiertem R6-Pneumococcus inkubiert. Als Kontrolle wurde E. coli DH5a verwendet. Die Adhärenz wurde durch die Fluoreszenzintensität quantifiziert. (C) Die Dosisabhängigkeit der Fähigkeit der CBPs, die Adhärenz an FITC-markierte Pneumococcen zu inhibieren.
18. Die Adhärenz von CbpA^--Mutanten an menschliche Zellen und Glycokonjugate. (A) Monolayer der Typ II-Lungenzelllinie A549 (LC) oder (B) Nabelschnurvenen-Endothelzellen (EC) wurden durch Behandlung mit TNFa (10 ng/ml über 2 h) oder IL-1 (5 ng/ml über 4 h) aktiviert, oder wurden unbehandelt eingesetzt (ruhend). R6 und die CbpA^--Mutante wurden Fluorescein-markiert und 30 min lang auf die Monolayers geschichtet. Die nicht adhärierenden Bakterien wurden abgewaschen und die Adhärenz wurde visuell quantifiziert und sind als Prozent der Kontrolle ausgedrückt, das heißt, 100 % = 498 ± 81 oder 174 ± 81 R6-Bakterien pro jeweils 100 ruhenden LC und EC. Der Versuch wurde 5 Mal mit 6–8 Wells pro Zustand durchgeführt. (C) Terasaki-Platten wurden mit 6'-Sialyllactose (6'SL), Lacto-N-neotetraose (LnNT), N-Acetylgalactosamin-β1,4-galactose HSA, (GlcNAc-β1,4-Gal), N-Acetylgalactosamin-β1,3-galactose HSA, (GlcNAc-β1,3-Gal), oder HSA mit 100 μM beschichtet. R6 (gefüllte Säulen) oder CbpA (gestreifte Säulen) wurden bis zu einer OD₆₂₀ von 0,4 wachsen gelassen, und zwar bei allen Versuchen mit Ausnahme derjenigen mit 6'SL (OD₆₂₀ von 0,6). Die Fluorescein-markierten Bakterien wurden 30 min lang in den Wells inkubiert, diese wurden anschließend gewaschen und die adhärierenden Bakterien wurden visuell durch eine 40fache Vergrößerung ausgezählt. Die Werte sind als % der Kontrolle angegeben, das heißt, 100 % = 133 pm 24 R6 pro 40 × Feld der 6' SL Well, 32 ± 8, 20 ± und 15 ± 4 für jeweils 6'SL, LnNT, GlcNAc-β1,4-Gal und GlcNAc-β1,3-Gal. Der Versuch wurde 3 Mal mit 6 bis 12 Wells pro Zustand durchgeführt.
19. Der Beitrag des CbpA zu der Pneumococcen-Übertragung in jungen Ratten. Die Fähigkeit, den Nasopharynx von 5 Tage alten Ratten zu besiedeln, wurde zwischen den Kontrollstämmen D39 (schraffiert), D39 (iga^-) (getüpfelt) und einem isogenen cbpA-fehlerhaften Stamm (gefüllt) verglichen. Die Ordinate zeigt die Zeit an, die auf die Beimpfung folgte, die Abszisse die Anzahl der Kolonien in den Nasenabstrichten (Mittelwert ± SD, n = 20 pro Gruppe).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Wie oben beschrieben, betrifft die vorliegende Erfindung bakterielle Oberflächenantigene, die zur Immunisierung von Tieren gegen bakterielle Infektionen geeignet sind. Insbesondere werden neue Cholin-bindende Proteine aus Pneumococcen bereitgestellt. Diese Proteine, die auf der Oberfläche der Pneumococcen gefunden werden, werden – wenn sie zusammen mit einem geeigneten Adjuvans formuliert werden – in Impfstoffen zum Schutz gegen Pneumococcen verwendet, sowie gegen andere Bakterien mit kreuzreagierenden Cholin-bindenden Proteinen.
Wie bereits zuvor berichtet wurde, adhäriert S. pneumoniae an Fibronectin an einer Stelle innerhalb der Carboxy-terminalen Heparin II-bindenden Domäne [Flier et al., Infect. Immun., 63: 4317 (1995)]. Ein Acht-Aminosäureabschnitt innerhalb des Typ II#14-Repeats unterstützt die Adhärenz. Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung, dass das Pneumococcen-Adhäsin für Fibronectin ein Cholin-bindendes Protein mit einer ungefähren Größe von 50 kDa zu sein scheint. Dieses Protein besitzt eine bedeutende Hämologie zu dem glycolytischen Enzym Enolase. So wird bspw. durch die Vorinkubation von S. pneumoniae mit rsVCAM die Adhärenz an gesamtes Fibronectin durch 96 % inhibiert, und S. pneumoniae adhärieren direkt an rsVCAM mit 6 % der Adhärenz an gesamtes Fibronectin. Darüber hinaus binden die Pneumococcen direkt an ein synthetisches Peptid, Fn5, basierend auf dem Heparin II Typ III#14-Abschnitt, mit der Sequenz WQPPRARI (SEQ ID Nr. 11). Antikörper gegen Fn5 inhibieren die Adhärenz von S. pneumoniae an gesamtes Fibronectin um mehr als 70 % (1:100). Die hierin dargestellten Daten zeigen, dass das Wachstum von S. pneumoniae in Ethanolamin gegenüber Cholin um eine mehr als 90%ige Abnahme in der Adhärenz resultiert. CBP-Präparationen inhibieren die Adhärenz von S. pneumoniae an Fibronectin kompetitiv mit 75 bis 90 %. Ein Anti-Cholin-Antikörper inhibiert die Adhärenz von S. pneumoniae an Fibronectin um mehr als 95 % bei einer Verdünnung von 1:10 bis 1:5000. Die Vorbehandlung von S. pneumoniae in 10 % Cholin resultiert in eine mehr als 50%ige Abnahme der der Adhärenz an Fibronectin.
In einer spezifischen Ausführungsform ist ein CBP der Erfindung ein Homolog der Enolase.
Sowohl die diagnostischen als auch die therapeutischen Möglichkeiten, die durch die Existenz der CBP geboten werden, sind von der Tatsache abgeleitet, dass das CBP an einer direkten und ursächlichen Protein-Protein-Interaktion zwischen den Bakterien und deren Wirtszelle beteiligt zu sein scheint. Wie bereits früher vorgeschlagen und hierin weiter untersucht, betrifft die vorliegende Erfindung ein pharmazeutisches Eingreifen in die Bindereaktion, bei welcher das CBP beteiligt ist, um die Aktivität zu modulieren, die durch das Binden des CBP initiiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von Cholin-bindenden Proteinen bereitgestellt, sowie der für sie kodierenden Gene. Insbesondere ermöglicht es die Isolierung der Gene, die für Cholinbindenden Proteine der Erfindung kodieren, die Proteine rekombinant herzustellen, was die Möglichkeit stark erhöht, kosteneffektive Impfstoffe herzustellen.
Die Cholin-bindenden Protein-Streptococcen-Oberflächenantigene der Erfindung besitzen eine oder mehrere der Eigenschaften, die aus der Gruppe, bestehend aus den Folgenden ausgewählt sind:

a) Inhibieren der Adhärenz von Streptococcus an Wirtszellen;
b) Reagieren mit Seren von Patienten, die infiziert sind, oder sich von einer bakteriellen Infektion erholen;
c) Reagieren mit Kaninchen-Antiseren, die gegen das Cholin-bindende Protein generiert wurden; und
c) Markiert sein durch Fluoresceinisothiocyanat (FITC) ohne die Notwendigkeit einer bakteriellen Lyse (das heißt, in intakten Bakterien),

In einem spezifischen Beispiel, siehe unten, kann das Streptococcen-Oberflächenantigen durch Affinitäts-Chromatographie auf einer Cholin-Agarose-Säule durch Elution mit 10 % Cholin aus Pneumococcus gewonnen werden.
In einer weiteren Ausführungsform, hierin beschrieben, bindet ein Peptid, das auf dem Heparin II Typ III#14-Abschnitt von Fibronectin basiert, das Streptococcen-Enolase-Homolog der Erfindung. In einer spezifischen Ausführungsform ist das Peptid Fn5 mit einer Aminosäuresequenz WQPPRARI (SEQ ID Nr. 11). Ganze Pneumococcen adhärieren an dieses synthetisch hergestellte Peptid. Daher wird von dem freien Peptid angenommen, dass es die Enolase-vermittelte Adhärenz an Fibronectin in vivo inhibiert. Darüber hinaus inhibiert ein für dieses Peptid spezifischer Antikörper die Pneumococcen-Adhärenz an Fibronectin. In einer spezifischen Ausführungsform inhibiert ein Anti-Fn5-Antikörper die Adhärenz von S. pneumoniae an ganzes Fibronectin um mehr als 70 %.
Der Ausdruck „bakteriell", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf grampositive Bakterien mit Cholin-bindenden Proteinen, die zu den hierin beschriebenen Proteinen homolog sind. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere auf Streptococcen-CBPs gerichtet, und insbesondere auf Pneumococcen-CBPs.
Die Ausdrücke „bakterielle (oder Streptococcen- oder Pneumococcen-)Oberflächenantigene", „Cholin-bindendes Protein (CBP)" und jede nicht spezifisch aufgeführte Variante, kann hierin untereinander austauschbar verwendet werden, und sie – wie sie durch die vorliegende Anmeldung und die Ansprüche hindurch verwendet werden – beziehen sich auf proteinloses Material mit einfachen oder multiplen Proteinen, und erstrecken sich auf diejenigen Proteine, die die Aminosäurensequenzdaten, wie hierin beschrieben und identifiziert durch die SEQ ID Nrn. 1–10, 19 und 20, besitzen sowie die Aktivitätsprofile, die hierin und in den Ansprüchen beschrieben sind. Dementsprechend werden Proteine, die im Wesentlichen eine äquivalente oder geänderte Aktivität zeigen, auf ähnliche Weise mit eingeschlossen. Diese Modifizierungen können bewusst sein, wie bspw. Modifizierungen, die durch ortsspezifische Mutagenese erhalten wurden, oder können zufällig sein, wie bspw. diejenigen, die durch Mutationen in Wirten gewonnen werden, welche Produzenten des Komplexes oder dessen benannten Untereinheiten sind. Ferner sollen die Ausdrücke „bakterielles (oder Streptococcen- oder Pneumococcen-)Oberflächenantigen" und „Cholin-bindendes Protein (CBP)" innerhalb deren Schutzbereich Proteine mit einschließen, die hierin spezifisch aufgeführt sind, ebenso wie alle im Wesentlichen homologen Analoga und allelische Variationen.
Der Ausdruck „Enolase" bezieht sich auf das Enzym 2-Phospho-D-Glycerat-Hydrolase.
Die Aminosäurenreste, die hierin beschrieben werden, sind vorzugsweise in der „L"-isomeren Form. Reste in der „D"-isomeren Form können jedoch auch für irgendeinen L-Aminosäurenrest substituiert sein, so lange, wie die gewünschte Funktionelle Eigenschaft des Immunglobulin-Bindens durch das Polypeptid beibehalten wird. NH₂ bezieht sich auf die freie Aminogruppe, die am Amino-Terminus eines Polypeptids vorliegt. COOH bezieht sich auf die freie Carboxy-Gruppe, die am Carboxy-Terminus eines Polypeptids vorliegt. Die hierin verwendeten Abkürzungen sind in Übereinstimmung mit der standardisierten Polypeptidnomenklatur, J. Biol. Chem., 243: 3552–29 (1969).
Es sollte bemerkt werden, dass alle Aminosäuren-Restsequenzen hierin durch Formeln dargestellt werden, deren linke und rechte Orientierung in der üblichen Richtung Amino-Terminus zu Carboxy-Terminus liegt. Darüber hinaus sollte bemerkt werden, dass der Strich zu Beginn oder Ende einer Aminosäurenrestsequenz eine Peptidbindung an eine weitere Sequenz einer oder mehrerer Aminosäurereste bedeutet.
Reinigung der CBPs
Teichonsäure (TA), die einen integralen Teil der Zellwand von Streptococcus pneumoniae darstellt, enthält einen einzigartigen terminalen Phosphorylcholin-Anteil. Die Cholin-Affinitäts-Chromatographie oder Mono-Q-Sepharose, ein naher Verwandter des Cholins, wurden zur Reinigung der CBPs eingesetzt. Es ist wichtig zu bemerken, dass diese Proteine anfangs aus einem verkapselten Pneumococcen-Stamm gereinigt wurden, der genetisch dahingehend geändert war, PspA, ein Haupt-CBP, nicht zu produzieren. Die Reinigungsschemata lauten wie folgt:
Die ganzen Bakterien werden entweder mit Cholin-Agarose oder Mono-Q-Sepharose inkubiert.
Die Bakterien werden mit einem Detergens lysiert und ungebundenes Material mit 0,5 M NaCl gewaschen.
Die CBPs werden mit entweder 0,5 M Cholinchlorid oder mit einem linearen Cholinchlorid-Gradienten eluiert. Die mole kularen Massen der Proteine, die durch diese beiden Verfahren gereinigt wurden, sind in der Tabelle 1 zusammengefasst (siehe 1).
Die Reinigung der CBPs über die Cholin-Agarose-Affinitäts-Chromatographie ist bevorzugt, wobei zumindest 9 Proteine mit einem Molekulargewicht im Bereich von 200 bis 40 kDa auf diese Weise identifiziert werden konnten. Ferner konnte auch eine Bande mit 37 kDa detektiert werden, von der gezeigt wurde, dass sie LytA ist, und zwar mit Antiseren, die für dieses Protein spezifisch sind. Dieses stellt ein sehr gut charakterisiertes CBP dar, und diente daher als Positivkontrolle.
Kriterien für die Impfstoff-Kandidaten
Die CBPs können einer Vielzahl von Tests unterzogen werden, um zu bestimmen, ob sie gute Impfstoff-Kandidaten sind. Die Kriterien für die Impfstoffentwicklung und die Charakteristika der isolierten CBPs sind nachstehend zusammengefaßst.
Die CBPs müssen auf der Oberfläche exponiert sein. Ganze Bakterien können mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) chemisch markiert werden, und die markierten Proteine können mit Antiseren, die spezifisch für FITC sind, detektiert werden. (Tabelle 1 und 1). Die CBPs 112, 75 und 80, ebenso wie LytA, wurden mit FITC effektiv markiert, was darauf hindeutete, dass diese Proteine auf der Oberfläche exponiert waren.
Die Impfstoff-Kandidaten müssen immunogen sein, weshalb Kandidaten-CBPs mit Seren von genesenden Menschen reagieren sollten. Die CBPs 112, 75 und 80 ergaben ein starkes Signal mit gepoolten humanen Antiseren, die aus Individuen gewonnen wurden, die sich von einer Pneumococcen-Krankheit erholten (1).
Die Impfstoff-Kandidaten müssen antigen sein. Die CBPs aus der Cholin-Agarose-Chromatographie wurden in Kaninchen injiziert und die Seren anschließend hinsichtlich Kreuzreaktivität getestet. Mehrere Proteine produzierten ein starkes Signal. Starke Signale hatten CBPs 112, 90, 84, 70 und 50 (1 und 2).
Ein guter Impfstoff-Kandidat kann die Adhärenz an Target-Zellrezeptoren blockieren, die im Wirt an den kritischen Infektionsorten vorliegen. Im Vergleich zu den Kontrollen blockierten die CBP-Fraktionen die Pneumococcen-Adhärenz um 45 % bei LC und 89 % bei EC in einer dosisabhängigen Weise (3). Basierend auf diesen Ergebnissen ist es sehr wahrscheinlich, dass die Fraktion an CBPs Adhäsine enthält, die bei der Bindung der Bakterien an eukaryotische Targetzellen beteiligt sind. Der Beitrag jeder dieser CBPs, die adhäsiven Eigenschaften der Elternbakterien zu blockieren, kann bestimmt werden, wie bspw. die Blockierung der Bindung von Pneumococcus an Epithel (Typ II Lungenzellen), Endothelzellen (menschliche Nabelschnur-Endothelzellen) und immobilisierte Glycokonjugate, die GlcNacβ1-4Gal, GlcNacβ1-3Gal, GlcNAc oder andere Zucker enthalten, von denen gezeigt werden konnte, dass sie Analoga für eukaryotische Rezeptoren sind.
Es sollte bemerkt werden, dass nicht jedes CBP als ein Adhäsin wirkt, und auf ähnliche Weise kann die Adhäsionsaktivität eine kolaterale Eigenschaft der CBPs sein.
Ein bevorzugter Impfstoff-Kandidat wird eine schützende Immunantwort hervorrufen, und zwar ohne antigene Variabilität unter klinischen Serotypen. Antiseren (entweder monoklonal oder polyklonal) gegen jedes CBP werden generiert, um zu bestimmen, ob die nativen und die rekombinanten CBPs immunogen sind. CBP-spezifische Antikörper werden verwendet, um relevante Pneumococcen-Serotypen hinsichtlich ihrer Antigenvariabilität zu screenen.
In einem bevorzugteren Aspekt werden die Antikörper gegen die CBPs getestet, um zu bestätigen, dass sie gegen eine Pneumococcen-Infektion schützen, vorzugsweise verschiedener Stämme oder Serotypen. Dafür werden bspw. passiv oder aktiv immunisierte Tiere mit Pneumococcen in Modellen hinsichtlich der Bacteriämie oder Besiedelung getriggert, oder vorzugsweise hinsichtlich beidem.
Andere Kriterien, die bei der Auswahl eines bevorzugten CBPs als Impfstoff-Kandidat in Erwägung gezogen werden, schließen das Testen von CBP-defektiven Mutanten mit ein, und zwar hinsichtlich der Virulenzverzögerung im Tiermodell bezüglich der Bacteriämie oder Besiedelungseffizienz alleine oder in Kombination oder gekoppelt an ein kapsuläres Polysaccharid. So zeigen bspw. erste Daten, dass CBP 112 in virulenten transparenten Bakterien exprimiert wird, dass jedoch die Expression in einem avirulenten, lichtundurchlässigem Bakterium vermindert ist.
Für CBPs codierende Gene
Wie oben bemerkt, betrifft die vorliegende Erfindung auch ein rekombinantes DNA-Molekül oder ein kloniertes Gen, oder eine degenerierte Variante davon, die für ein CBP codiert, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die in den SEQ ID Nrn. 19 und 25 wiedergegeben ist. In einem spezifischen Aspekt besitzt ein Nucleinsäuremolekül, insbesondere ein rekombinantes DNA-Molekül oder ein kloniertes Gen, das für die 50 bis 112 kDa-CBPs codiert, eine Nucleotidsequenz, die in den SEQ ID Nr. 18 von Nucleotid 1 bis zum Stoppcodon TAA, oder der codierenden Region von SEQ ID Nr. 24 gezeigt ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können herkömmliche molekularbiologische, mikrobiologische und rekombinante DNA-Techniken eingesetzt werden, die im Fachkönnen innerhalb des Standes der Technik liegen. Solche Techniken sind in der Literatur vollständig beschrieben (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III [Ausubel, R. M., Hrsg. (1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III [J. E. Celis, Hrsg. (1994))]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., Hrsg. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, Hrsg. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins, Hrsg. (1985)]; "Transcription And Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins, Hrsg. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, Hrsg. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Aus diesen Gründen sollen – wenn sie hierin auftreten – die folgenden Ausdrücke die nachstehend aufgeführten Definitionen haben.
Ein „Replikon" ist ein genetisches Element (wie bspw. ein Plasmid, Chromosom, Virus), das als eine autonome Einheit einer DNA-Replikation in vivo fungiert; das heißt, dass es unter seiner eigenen Kontrolle fähig zur Replikation ist.
Ein „Vektor" ist ein Replikon, wie bspw. ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an welches ein anderes DNA-Segment angefügt werden kann, um die Replikation des angefügten Segments zu fördern.
Ein „DNA-Molekül" bezieht sich auf die polymere Form von Desoxyribonucleotiden (Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin) entweder in dessen einzelsträngigen Form oder einer doppelsträngigen Helix. Dieser Ausdruck bezieht sich nur auf die Primär- und Sekundärstruktur des Moleküls und beschränkt sich jedoch nicht auf irgendeine besondere Tertiärform. Daher schließt dieser Ausdruck doppelsträngige DNA mit ein, die u.a. bei linearen DNA-Molekülen (bspw. Restriktionsfragmenten), Viren, Plasmiden und Chromosomen gefunden wird. Bei der Diskussion der Struktur von besonderen doppelsträngigen DNA-Molekülen können hierin beschriebene Sequenzen gemäß der normalen Konvention beschrieben werden, bei welcher lediglich die Sequenz in der 5'- bis 3'-Richtung entlang dem nicht transkribierten DNA-Strang wiedergegeben wird (das heißt, der DNA-Strang, dessen Sequenz homolog zur mRNA ist).
Ein „Replikationsursprung" bezieht sich auf diejenigen DNA-Sequenzen, die bei der DNA-Synthese teilnehmen.
Eine DNA-„kodierende Sequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, die in ein Polypeptid in vivo transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5'-(Amino-)Terminus und durch ein Translations-Stoppcodon am 3'-(Carboxy-)Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA von eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryotischer (bspw. Säugetier-)DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen enthalten, ist jedoch hierauf nicht beschränkt. Gewöhnlich wird ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz 3' zu der codierenden Sequenz vorliegen.
Transkriptionelle und translationale Kontrollsequenzen sind DNA-regulatorische Sequenzen, wie bspw. Promotor, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Terminationssequenzen und Ähnliches, die für die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle sorgen.
Eine „Promotorsequenz" ist ein regulatorischer DNA-Abschnitt, der die RNA-Polymerase in einer Zelle binden und die Transkription einer downstream codierenden Sequenz (3'-Richtung) initiieren kann. Zu Zwecken der Definition der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus von der Transkriptionsinitiationsstelle gebunden und erstreckt sich upstream (in die 5'-Richtung), um die minimale Anzahl der Basen oder Elemente mit einzuschließen, die für den Start der Transkription auf Level, die über dem Hintergrund detektierbar sind, notwendig sind. Innerhalb der Promotorsequenz wird eine Transkriptionsinitiationsstelle zu finden sein (die üblicherweise durch eine Kartierung mit der Nuclease S1 definiert wird), ebenso wie Protein-bindende Domänen (Consensus-Sequenzen), die für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren werden oftmals – jedoch nicht immer – „TATA"-Boxen und „CAT"-Boxen enthalten. Prokaryotische Promotoren enthalten Shine-Dalgarno-Sequenzen zuzüglich zu den -10- und -35-Konsensus-Sequenzen.
Eine „Expressionskontrollsequenz" ist eine DNA-Sequenz, die die Transkription und Translation einer anderen DNA-Sequenz kontrolliert und reguliert. Eine codierende Sequenz ist „unter der Kontrolle" einer transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenz in einer Zelle, wenn die RNR-Polymerase die codierende Sequenz in mRNA transkribiert, welche anschließend in das Protein translatiert wird, für welches die codierende Sequenz codiert.
Eine „Signalsequenz" kann vor der codierenden Sequenz mit eingeschlossen sein. Diese Sequenz codiert für ein Signalpeptid, welches N-terminal zu dem Polypeptid liegt, und das mit der Wirtszelle kommuniziert, um das Polypeptid an die Zelloberfläche zu dirigieren, oder um das Polypeptid in das Medium zu sekretieren, wobei das Signalpeptid von der Wirtszelle abgespalten wird, bevor das Protein die Zelle verlässt. Signalsequenzen können mit einer Vielzahl von Proteinen verbunden sein, die in Prokaryoten und Eukaryoten nativ vorliegen.
Der Ausdruck „Oligonucleotid", wie er hierin für die Sonde der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird als ein Molekül definiert, das aus zwei oder mehreren Ribonucleotiden besteht, vorzugsweise aus mehr als drei. Seine exakte Größe wird von vielen Faktoren abhängen, die wiederum von der letztendlichen Funktion und der Verwendung des Oligonucleotids abhängt.
Der Ausdruck „Primer", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das – sei es natürlich auftretend in einem gereinigten Restriktionsverdau, oder sei es synthetisch produziert – dazu in der Lage ist, als Startpunkt der Synthese zu fungieren, wenn es in Bedingungen gebracht wird, in welchen die Synthese eines Primerextensionsproduktes, das komplementär zu einem Nucleinsäurestrang ist, induziert wird, das heißt, in Gegenwart von Nucleotiden und einem induzierenden Agens, wie bspw. einer DNA-Polymerase, und bei einer geeigneten Temperatur und bei einem geeigneten pH-Wert. Der Primer kann entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein, und muss hinreichend lang genug sein, um die Synthese des gewünschten Extensionsproduktes in Gegenwart des induzierenden Agens zu „primen". Die genaue Länge des Primers wird von vielen Faktoren abhängen, einschließlich der Temperatur, der Quelle des Primers und Verwendung des Verfahrens. So enthält bspw. bei diagnostischen Anwendungen – in Abhängigkeit von der Komplexität der Zielsequenz – der Oligonucleotidprimer typischerweise 15 bis 25 oder mehr Nucleotide, obwohl er auch weniger Nucleotide enthalten kann.
Eine DNA-Sequenz ist „operativ verbunden" mit einer Expressionskontrollsequenz, wenn die Expressionskontrollsequenz die Transkription und Translation dieser DNA-Seguenz kontrolliert und reguliert. Der Ausdruck „operativ verbunden" schließt somit ein, dass ein geeignetes Startsignal (bspw. ATG) vor der DNA-Sequenz, die exprimiert werden soll, vorliegt, und dass der korrekte Leserahmen beibehalten wird, um die DNA-Sequenz unter Kontrolle der Expressionskontrollsequenz zu exprimieren und das von der DNA-Sequenz codierte gewünschte Produkt zu produzieren. Wenn ein Gen, das in ein rekombinantes DNA-Molekül eingebaut werden soll, kein geeignetes Startsignal enthält, kann ein solches Startsignal vor das Gen eingefügt werden.
Der Ausdruck „standardisierte Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf Salz- und Temperaturbedingungen, die im Wesent lichen äquivalent sind zu 5 × SSC und 65°C, und zwar sowohl für die Hybridisierung als auch das Waschen. Nichtsdestotrotz wird der Fachmann erkennen, dass solche „standardisierten Hybridisierungsbedingungen" von den besonderen Bedingungen abhängen, einschließlich der Konzentration an Natrium und Magnesium im Puffer, der Länge und Konzentration der Nucleotidsequenz, dem Prozentsatz der Fehlanpassung, dem Prozentsatz Formamid und Ähnlichen. Bei der Bestimmung von „standardisierten Hybridisierungsbedingungen" ist ferner wichtig, ob die zwei hybridisierenden Sequenzen RNA-RNA, DNA-DNA oder RNA-DNA sind. Solche standardisierten Hybridisierungsbedingungen werden durch den Fachmann gemäß hinreichend bekannten Formeln einfach bestimmt, wobei die Hybridisierung typischerweise 10 bis 20°C unterhalb der vorhergesagten oder bestimmten Schmelztemperatur T_m liegt, wobei die Waschschritte mit höherer Stringenz durchgeführt werden, falls erwünscht.
Die hierin beschriebenen Primer werden dahingehend ausgewählt, dass sie „im Wesentlichen" komplementär zu unterschiedlichen Strängen einer bestimmten Ziel-DNA-Sequenz sind. Dies bedeutet, dass die Primer hinreichend komplementär sein müssen, um mit deren jeweiligen Strängen zu hybridisieren. Aus diesen Gründen müssen die Primersequenzen nicht die genaue Sequenz des Templates wiedergeben. So kann bspw. ein nicht-komplementäres Nucleotidfragment an das 5'-Ende des Primers angebracht werden, wobei die übrig bleibende Primersequenz zu dem Strang komplementär ist. Alternativ können nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen in den Primer eingebaut werden, vorausgesetzt, dass die Primersequenz mit der Sequenz des Stranges hinreichend komplementär ist, um mit dieser zu hybridisieren, und um da durch das Template für die Synthese des Extensionsproduktes zu bilden.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Ausdrücke „Restriktionsendonucleasen" und „Restriktionsenzyme" auf bakterielle Enzyme, von denen jedes doppelsträngige DNA an oder in der Nähe einer spezifischen Nucleotidsequenz schneidet.
Eine Zelle ist dann mit exogener oder heterologer DNA „transformiert" worden, wenn eine solche DNA in die Zelle eingeführt wurde. Die transformierende DNA kann – muss aber nicht (kovalent verbunden) – in chromosomale DNA, die das Genom der Zelle ausmacht, eingebaut werden. In Prokaryoten, Hefe und Säugetierzellen kann die transformierende DNA bspw. auf einem episomalen Element, wie bspw. einem Plasmid, beibehalten werden. Bezüglich eukaryotischen Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine solche, in welcher die transformierende DNA in ein Chromosom derart integriert wurde, dass es von den Tochterzellen durch Chromosomenreplikation ererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryotischen Zelle demonstriert, Zelllinien oder Klone zu etablieren, die aus einer Population an Tochterzellen besteht, die die transformierende DNA enthalten. Ein „Klon" ist eine Population an Zellen, die von einer einzelnen Zelle oder einer gewöhnlichen Nachkommenschaft durch Mitose entstehen. Eine „Zelllinie" ist ein Klon einer Primärzelle, die dazu in der Lage ist, viele Generationen lang in vitro stabil zu wachsen.
Zwei DNA-Sequenzen werden als „im Wesentlichen homolog" bezeichnet, wenn mindestens 75 % (vorzugsweise mindestens ungefähr 80 %, und am bevorzugtesten mindestens ungefähr 90 oder 95 %) der Nucleotide über die definierte Länge der DNA-Sequenzen passen. Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können durch einen Sequenzvergleich unter Verwendung von Standardsoftware identifiziert werden, die in Sequenzdatenbanken verfügbar sind, oder aber bei Southern-Hybridisierungsversuchen unter bspw. stringenten Bedingungen, wie für dieses besondere System definiert. Die Definition von geeigneten Hybridisierungsbedingungen liegt im Fachbereich des Standes der Technik. Siehe bspw. Maniatis et al., siehe oben; DNA Cloning, Vols. I & II, siehe oben; Nucleic Acid Hybridization, siehe oben.

Ferner sollte erkannt werden, dass innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung DNA-Sequenzen liegen, die für CBPs codieren, die für ein CBP der Erfindung codieren, die jedoch bezüglich einem Oligonucleotid degeneriert sind, das durch das gereinigte natürliche (also native) Gen dargestellt wird, bspw. durch die SEQ ID Nr. 11. Mit „degeneriert" ist gemeint, dass ein unterschiedliches 3-Buchstaben-Codon verwendet wird, um eine bestimmte Aminosäure zu spezifizieren. Es ist im Stand der Technik hinreichend bekannt, dass die folgenden Codons untereinander austauschbar verwendet werden können, um für jede spezifische Aminosäure zu codieren:

Phenylalanin (Phe oder F)	UUU oder UUC
Leucin (Leu oder L)	UUA oder UUG oder CUU oder CUC oder CUA oder CUG
Isoleucin (Ile oder I)	AUU oder AUC oder AUA
Methionin (Met oder M)	AUG
Valin (Val oder V)	GUU oder GUC oder GUA oder GUG
Serin (Ser oder S)	UCU oder UCC oder UCA oder UCG oder AGU oder AGC
Prolin (Pro oder P)	CCU oder CCC oder CCA oder CCG
Threonin (Thr oder T)	ACU oder ACC oder ACA oder ACG
Alanin (Ala oder A)	GCU oder GCG oder GCA oder GCC
Tyrosin (Tyr oder Y)	UAU oder UAC
Histidin (His oder H)	CAU oder CAC
Glutamin (Gln oder Q)	CAA oder CAG
Asparagin (Asn oder N)	AAU oder AAC
Lysine (Lys oder K)	AAA oder AAG
Asparaginsäure (Asp oder D)	GAU oder GAC
Glutaminsäure (Glu oder E)	GAA oder GAG
Cystein (Cys oder C)	UGU oder UGC
Arginin (Arg oder R)	CGU oder CGC oder CGA oder CGG oder AGA oder AGG
Glycin (Gly oder G)	GGU oder GGC oder GGA oder GGG
Stoppcodon	UAA (ocker) oder UAG (bernsteinfarben) oder UGA (opal)

Es sollte klar sein, dass die oben angegebenen Codons für RNA-Sequenzen sind. Die korrespondierenden Codons für die DNA besitzen ein T anstelle des U.
Vollständig degenerierte Oligonucleotide können basierend auf der Aminosäurensequenz gebildet werden, die für das CBP codiert, unter Berücksichtigung der oben genannten Degenerate. Auf ähnliche Weise kann – wenn ein Codon, das für eine Aminosäure codiert, nicht mit Sicherheit bekannt ist, bspw. auf Grund der Degeneration des genetischen Codes – Inosin an der unbekannten Position eingebaut werden.
Mutationen können in einer Nucleinsäure, die für ein CBP codiert, derart vorgenommen werden, dass ein bestimmtes Codon in ein Codon abgeändert wird, welches für eine unterschiedliche Aminosäure codiert. Eine solche Mutation wird im Allgemeinen durch die Durchführung von so wenig Nucleotidaustauschen wie möglich vorgenommen. Eine Substitutionsmutation dieser Art kann durch den Austausch einer Aminosäure in dem resultierenden Protein auf eine nicht-konservative Art und Weise durchgeführt werden (d.h., durch Austauschen des Codons von einer Aminosäure, die zu einer Aminosäurengruppe mit einer bestimmten Größe oder mit einer bestimmten Eigenschaft gehört, in eine Aminosäure, die zu einer anderen Gruppe gehört) oder auf eine konservative Art und weise (das heißt, durch Austausch des Codons von einer Aminosäure, die zu einer Aminosäurengruppe mit einer bestimmten Größe oder Eigenschaft gehört, in eine Aminosäure, die zu der gleichen Gruppe gehört). Derartige konservative Austausche führen im Allgemeinen zu einer geringeren Änderung in der Struktur und Funktion des resultierenden Proteins. Ein nicht-konservativer Austausch ändert mit höherer Wahrscheinlichkeit die Struktur, die Aktivität oder die Funktion des resultierenden Proteins. Bei der vorliegenden Erfindung sollte bedacht werden, dass auch Sequenzen mit eingeschlossen sind, die konservative Änderungen beinhalten, die die Aktivität oder die Bindungscharakteristika des resultierenden Proteins nicht bedeutend ändern. Aminosäureaustausche innerhalb der Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse ausgeswählt werden, zu welcher die Aminosäure gehört. So schließen bspw. die nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin mit ein. Aminosäuren, die aromatische Ringstrukturen enthalten, sind Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin mit ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin mit ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Aspartamsäure und Glutaminsäure mit ein. Solche Änderungen werden voraussichtlich das offensichtliche Molekulargewicht nicht beeinflussen, wie es durch die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese oder durch den isoelektrischen Punkt bestimmt wurde.
Besonders bevorzugte Substitutionen sind:

– Lys für Arg und umgekehrt, derart, dass eine positive Ladung beibehalten wird;
– Glu für Asp und umgekehrt, derart, dass eine negative Ladung beibehalten wird;
– Ser für Thr, derart, dass eine freie -OH-Gruppe beibehalten wird; und
– Gln für Asn, derart, dass eine freie -NH₂-Gruppe beibehalten wird.

Zwei Aminosäuresequenzen sind „im Wesentlichen homolog", wenn mindestens 70 % der Aminosäurereste (vorzugsweise mindestens 80 %, und am bevorzugtesten mindestens 90 bis 95 %) identisch sind, oder konservative Substitutionen darstellen.
Ein „heterologer" Abschnitt des DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares Segment der DNA innerhalb eines größeren DNA-Moleküls, welches in der Natur nicht in Verbindung mit dem größeren Molekül gefunden wird. Daher wird – wenn der heterologe Abschnitt für ein Säugetiergen codiert – das Gen gewöhnlich von einer DNA flankiert sein, die die genomische Säugetier-DNA in dem Genom des Quellorganismus nicht flankiert. Ein anderes Beispiel einer heterologen codierenden Sequenz ist ein Konstrukt, bei welchem die codierende Sequenz selber nicht in der Natur gefunden wird (bspw. eine cDNA, bei der die genomische codierende Sequenz Introns enthält, oder synthetische Sequenzen mit Codons, die zu denen des nativen Gens unterschiedlich sind). Allelische Variationen oder natürlich auftretende Mutationsereignisse führen nicht zu einem heterologen DNA-Abschnitt, wie er hierin beschrieben ist.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf die Herstellung von Oligonucleotiden, die zur Hybridisierung mit Nucleinsäuren, die für CBPs codieren, verwendet werden können.
Wie oben erwähnt, kann eine DNA-Sequenz, die für ein CBP codiert, eher durch Synthese als durch Klonierung hergestellt werden. Die DNA-Sequenz kann mit den geeigneten Codons für die CBP-Aminosäuresequenz gebildet werden. Im Allgemeinen werden bevorzugte Codons für den Wirt von Interesse ausgewählt werden, wenn die Sequenz zur Expression verwendet wird. Die vollständige Sequenz wird aus überlappenden Oligonucleotiden zusammengebaut, die durch Standardverfahren hergestellt und in eine vollständige Codierungssequenz zusammengebaut wurden. Siehe bspw. Edge, Nature, 292: 756 (1981); Nambair et al., Science, 223: 1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984).
Mit synthetischen DNA-Sequenzen können einfach Gene konstruiert werden, die CBP-Analoga oder „Muteine" exprimieren werden. Alternativ kann die DNA, die für Muteine codiert, durch eine ortsspezifische Mutagenese nativer CBP-Gene oder cDNAs hergestellt werden, und die Muteine können direkt durch Einsatz einer konventionellen Polypeptidsynthese hergestellt werden.
Ein allgemeines Verfahren zum ortsspezifischen. Einbau von nicht natürlich vorkommenden Aminosäuren in Proteine ist in Christopher J. Noren, Spencer J. Anthony-Cahill, Michael C. Griffith, Peter G. Schultz, Science, 244: 182–188 (April 1989) beschrieben. Dieses Verfahren kann dazu eingesetzt werden, Analoga mit nicht natürlich vorkommenden Aminosäuren zu schaffen.
Rekombinante Herstellung von CBPs
Ein anderer Aspekt dieser Erfindung ist die Expression von DNA-Sequenzen, die hierin offenbart sind. Wie im Stand der Technik hinreichend bekannt ist, können DNA-Sequenzen dadurch exprimiert werden, dass man sie operativ an eine Expressions-Kontrollsequenz in einem geeigneten Expressionsvektor verbindet, und dass dieser Expressionsvektor dazu verwendet wird, einen geeigneten einzelligen Wirt zu transformieren.
Eine derartige operative Verbindung einer DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung an eine Expressions-Kontrollsequenz schließt selbstverständlich – wenn es nicht bereits Teil der DNA-Sequenz ist – die Bereitstellung eines Startcodons, ATG, mit ein, und zwar im korrekten Leserahmen stromaufwärts der DNA-Sequenz.
Eine breite Vielfalt an Wirt-/Expressionsvektor-Kombinationen können bei der Expression der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Geeignete Expressionsvektoren können bspw. aus Segmenten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen bestehen. Geeignete Vektoren schließen Derivate von SV40 und bekannten bakteriellen Plasmiden mit ein, wie bspw. die E. coli-Plasmide col E1, pCR1, pBR322, pMB9 und deren Derivate, Plasmide, wie bspw. RP4: Phagen-DNAs, wie bspw. die vielfältigen Derivate des Phagen λ, wie bspw. NM989, sowie andere Phagen-DNA, bspw. M13 und filamentöse einzelsträngige Phagen-DNA; Hefeplasmide, wie bspw. das 2 μ-Plasmid oder Derivate davon; Vektoren, die in eukaryotischen Zellen geeignet sind, wie bspw. Vektoren, die in Insekten- oder Säugetierzellen geeignet sind; Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs abgeleitet sind, wie bspw. Plasmide, die dahingehend modifiziert wurden, Phagen-DNA oder andere Expressions-Kontrollsequenzen aufzunehmen; und Ähnliches.
Irgendeine aus einer großen Vielzahl von Expressions-Kontrollsequenzen – also Sequenzen, die die Expression einer DNA-Sequenz kontrollieren, die operativ mit dieser verbunden ist – können in diesen Vektoren eingesetzt werden, um die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Solche geeigneten Expressions-Kontrollsequenzen schließen bspw. die frühen oder späten Promotoren von SV40, CMV, Vaccinia, Polyoma oder Adenovirus mit ein, das lac-System, das trp-System, das TAC-System, das TRC-System, das LTR-System, die großen Operator- und Promotor-Regionen des Phagen λ, die Kontrollregionen des fd-Hüllenproteins, der Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase oder für andere glycolytische Enzyme, die Promotoren der Säure-Phosphatase (bspw. Pho5), die Promotoren der Hefe-α-Paarungsfaktoren, und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen eukaryotischer und prokaryotischer Zellen oder deren Viren kontrollieren, sowie verschiedene Kombinationen davon.
Eine große Vielzahl von einzelligen Wirtszellen sind ferner bei der Expression von DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung geeignet. Diese Wirte können alle bekannten eukaryotischen und prokaryotischen Wirte mit einschließen, wie bspw. Stämme von E. Coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Pilze, wie bspw. Hefen, und Tierzellen, wie bspw. CHO-, R1.1-, B-W- und L-M-Zellen, African Green Monkey Kidney-Zellen (bspw. COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 und BMT10), Insektenzellen (bspw. Sf9), sowie menschliche Zellen und Pflanzenzellen in Gewebekultur.
Es wird klar sein, dass nicht alle Vektoren, Expressions-Kontrollsequenzen und Wirte gleich gut funktionieren werden, um die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Genau so wenig werden alle Wirte gleich gut mit dem gleichen Expressionssystem funktionieren. Jedoch wird der Fachmann in der Lage sein, geeignete Vektoren, Expressions-Kontrollsequenzen und Wirte auszuwählen, und zwar ohne einen unzumutbaren Aufwand, um die erwünschte Expression zu bewerkstelligen, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Z.B. muss für die Auswahl des Vektors der Wirt berücksichtigt werden, da der Vektor in dem Wirt funktionieren muss. Ferner muss die Kopienzahl des Vektors, die Fähigkeit zur Kontrolle dieser Kopienzahl sowie die Expression jeglicher anderer Proteine, die von dem Vektor codiert werden, wie bspw. Antibiotikamarker, berücksichtigt werden.
Bei der Auswahl einer Expressionskontrollsequenz wird normalerweise eine Vielzahl von Faktoren berücksichtigt werden. Diese schließen bspw. die relative Stärke des Systems mit ein, dessen Kontrollierbarkeit und Kompatibilität mit insbesondere den zu exprimierenden DNA-Sequenzen oder Genen, insbesondere im Hin blick auf mögliche Sekundärstrukturen. Geeignete einzellige Wirte werden durch Berücksichtigung von bspw. deren Kompatibilität mit dem ausgewählten Vektor, deren Sekretionscharakteristika, deren Fähigkeit, Proteine korrekt zu falten, sowie deren Fermentationsbedürfnisse ausgewählt werden, ebenso wie die Toxizität des Produktes, das von den zu exprimierenden DNA-Sequenzen codiert wird, gegenüber dem Wirt, sowie der Einfachheit der Reinigung der Expressionsprodukte.
Unter Berücksichtigung dieser und anderer Faktoren wird ein Fachmann dazu in der Lage sein, eine Vielzahl. von Vektor-/Expressions-Kontrollsequenz-/Wirts-Kombinationen herzustellen, mit welchen die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung mittels einer Fermentation oder einer Tierkultur im großen Maßstab exprimiert werden können.
Es ist ferner beabsichtigt, dass CBP-Analoga aus Nucleotidsequenzen des Proteinkomplexes/Untereinheit hergestellt werden können, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind. Analoga, wie bspw. Fragmente, können bspw. durch einen Pepsin-Verdau von CBP oder bakteriellem Material hergestellt werden. Andere Analoga, wie bspw. Muteine, können durch standardisierte ortsspezifische Mutagenese von CBP-codierenden Sequenzen hergestellt werden. Analoga, die die „Cholin-bindende Aktivität" aufweisen, wie bspw. kleine Moleküle, können – sei es in der Funktion als Promotor oder Inhibitor – durch bekannte in vivo- oder in vitro-Assays identifiziert werden.
Antikörper gegen CBPs
Wie oben bemerkt, können die CBPs der vorliegenden Erfindung – seien sie durch eine Reinigung aus bakteriellen Quellen oder rekombinant gewonnen – dazu eingesetzt werden, Antikörper für die Diagnose oder Therapie herzustellen, wie nachstehend detailliert beschrieben ist. Daher sind bevorzugte CBPs der vorliegenden Erfindung antigen, und bevorzugter immununogen.
Ein Molekül ist „antigen", wenn es dazu in der Lage ist, mit einem Antigen-erkennenden Molekül des Immunsystems spezifisch wechselzuwirken, wie bspw. einem Immunglobulin (Antikörper) oder einem T-Zell-Antigenrezeptor. Ein antigenes Polypeptid enthält mindestens 5, und vorzugsweise mindestens 10 Aminosäuren. Ein antigener Anteil eines Moleküls kann derjenige Anteil sein, der für den Antikörper oder die T-Zell-Rezeptorerkennung immundominant ist, oder kann ein Anteil sein, der dazu verwendet wird, einen Antikörper gegen das Molekül. zu bilden, und zwar durch Konjugation des antigenen Anteils an ein Trägermolekül für eine Immunisierung. Ein Molekül, das antigen ist, muss selber nicht immunogen sein, das heißt, in der Lage, eine humorale Immunantwort ohne einen Träger auslösen zu können.
Ein „Antikörper" für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann jedes Immunglobulin sein, einschließlich Antikörper und Fragmente davon, die spezifisch an ein Epitop auf einem CBP binden. Der Ausdruck umfasst polyklonale, monoklonale und chimäre Antikörper, wobei letztere detailliert in den US-Patenten mit den Nrn. 4,816,397 und 4,816, 567 beschrieben sind.
Eine „Antikörper-Kombinationsstelle" ist derjenige strukturelle Abschnitt eines Antikörpermoleküls, der aus variablen und hypervariablen Regionen der schweren und leichten Kette besteht, welcher das Antigen spezifisch bindet.
Der Ausdruck „Antikörpermolekül" bedeutet mit seinen hierin verwendeten, verschiedenen grammatikalischen Formen sowohl ein intaktes Immunglobulinmolekül als auch einen immunologisch aktiven Abschnitt eines Immunglobulinmoleküls.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die CBP(s), die entweder rekombinant, oder durch chemische Synthese hergestellt wurden, oder aus der natürlichen Bakterienquelle gereinigt wurden, sowie Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon, einschließlich Fusionsproteine, als ein Immunogen verwendet werden, um Anti-CBP-Antikörper herzustellen. Solche Antikörper schließen polyklonale, monoklonale, chimäre, einzelkettige, Fab-Fragmente und eine Fab-Expressionsbibliothek mit ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Verschiedene, im Stand der Technik bekannte Verfahren können zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern eingesetzt werden, die gegen CBPs oder Derivate oder Analoga davon gerichtet sind (siehe bspw. Antibodies – A Laboratory Manual, Harlow und Lane, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, 1988). Zur Herstellung eines Antikörpers können verschiedene Wirtstiere durch Injizieren von CBP: oder Derivaten (bspw. Fragmente oder Fusionsproteine) davon immunisiert werden, einschließlich – jedoch nicht hierauf beschränkt – Kaninchen, Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen, etc. In einem Ausführungsbeispiel kann das CBP oder das Fragment davon an einen immuno genen Träger konjugiert sein, wie bspw. Rinderserumalbumin (BSA) oder das „Keyhole"-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH). Verschiedene Adjuvantien können zur Verstärkung der immunologischen Antwort eingesetzt werden, in Abhängigkeit von der Wirtsspezies.
Zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die gegen das CBP oder ein Fragment davon, ein Analog oder ein Derivat davon, gerichtet sind, kann jedes Verfahren eingesetzt werden, mit welchem Antikörpermoleküle durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur hergestellt werden können (siehe bspw. Antibodies – A Laboratory Manual, Harlow und Lane, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, 1988). Diese schließen die Hybridom-Verfahren mit ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt, die ursprünglich von Kohler und Milstein entwickelt wurden (1975, Nature 256: 495–497), ebenso wie die Trioma-Technik, die menschliche B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72), und die EBV-Hybridomtechnik, mit welcher humane monoklonale Antikörper hergestellt werden können (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77–96). In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können monoklonale Antikörper in keimfreien Tieren unter Verwendung neuerer Technologien hergestellt werden (PCT/US90/02545). Gemäß der vorliegenden Erfindung können menschliche Antikörper verwendet werden, welche unter Verwendung von menschlichen Hybridomen gewonnen werden können (Cote et al., 1583, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2026–2030), oder durch die Transformation von humanen B-Zellen mit einem EBV-Virus in vitro (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Seiten 77–96). Tatsächlich können gemäß der vorliegenden Erfindung auch Verfahren eingesetzt werden, die für die Herstellung von „chimären Antikörpern" (Morrison et al., 1984, J. Bacteriol., 159–870; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604–608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452–454) entwickelt wurden, und zwar durch Splicing der Gene aus einem Maus-Antikörpermolekül, welches für ein CBP spezifisch ist, zusammen mit Genen aus einem menschlichen Antikörpermolekül einer geeigneten biologischen Aktivität; solche Antikörper liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Solche humanen oder humanisierten chimären Antikörper sind für den Einsatz in einer Therapie von menschlichen Krankheiten (wie oben beschrieben) bevorzugt, da die humanen oder humanisierten Antikörper mit niedrigerer Wahrscheinlichkeit eine Immunantwort, insbesondere eine allergene Antwort, auslösen als xenogene Antikörper.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Verfahren, die für die Herstellung von einzelkettigen Antikörpern beschrieben sind (US-Patent Nr. 4,946,778) dazu angepasst: werden, CBP-spezifische einzelkettige Antikörper zu produzieren. Bei einer zusätzlichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Techniken eingesetzt, die für die Konstruktion von Fab-Expressionsbibliotheken beschrieben sind (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275–1281), um eine schnelle und einfache Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der erwünschten Spezifität für CBP, dessen Derivate oder Analoge zu ermöglichen.
Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Antikörpermoleküls enthalten, können durch bekannte Techniken hergestellt werden. Solche Fragmente schließen bspw. Folgendes mit ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt: das F(ab')₂-Fragment, das durch einen Pepsinverdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann; die Fab'-Fragmente, die durch eine Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')₂-Fragments hergestellt werden können, und die Fab-Fragmente, die durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem reduzierenden Agens hergestellt werden können.
Bei der Produktion der Antikörper kann das Screenen nach dem erwünschten Antikörper durch im Stand der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden, wie bspw. durch Radioimmunoassays, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), „Sandwich"-Immunoassays, immunoradiometrische Assays, Geldiffusions-Präzipitationsreaktionen, Immunodiffusionsassays, in situ-Immunoassays (unter Verwendung von bspw. colloidalem Gold, Enzym- oder Radioisotop-Markierungen), Western Blots, Fällungsreaktionen, Agglutinierungsassays (wie bspw. Gelagglutinierungsassays, Hämagglutinierungsassays), Komplementfixierungsassays, Immunfluoreszenzassays, Protein-A-Assays, und immunelektrophoretische Assays, etc. In einer Ausführungsform wird die Bindung des Antikörpers durch die Detektion einer Markierung auf dem Primärantikörper detektiert. In einer anderen Ausführungsform wird der primäre Antikörper durch die Detektion der Bindung eines sekundären Antikörpers oder Reagens an den primären Antikörper detektiert. In einer weiteren Ausführungsform ist der sekundäre Antikörper markiert. Viele verschiedene Mittel sind im Stand der Technik bekannt, die Bindung in einem Immunoassay zu detektieren, und liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung. So können bspw. zur Auswahl von Antikörpern, die ein spezifisches Epitop auf einem CBP erkennen, Hybridome hinsichtlich einem Produkt untersucht werden, welches an ein CBP-Fragment, das ein solches Epitop enthält, bindet. Zur Auswahl eines Antikörpers, der gegen ein CBP eines besstimmten Stammes vom grampositiven Bakterien spezifisch ist, insbesondere Pneumococcus, kann auf der Basis der positiven Bindung mit CBP selektiert werden, welches exprimiert wird von oder isoliert wird aus Zellen des Bakterienstamms.
Die oben genannten Antikörper können in Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, eingesetzt werden, welche sich auf die Lokalisierung und die Aktivität des CBPs beziehen, wie bspw. Western Blots, Darstellung des CBP-Polypeptids in situ, dessen Messung in geeigneten physiologischen Proben, etc.
In einer spezifischen Ausführungsform können Antikörper, die die gleiche Wirkung haben oder die der Aktivität der CBPs entgegenwirken, hergestellt werden. Solche Antikörper können unter Einsatz der weiter oben beschriebenen Assays zur Charakterisierung der CBPs getestet werden.
Der Ausdruck „Adjuvans" bezieht sich auf eine Verbindung oder eine Mischung, die die Immunantwort auf ein Antigen verstärkt. Ein Adjuvans kann als Gewebedepot dienen, das das Antigen langsam freisetzt, und ferner auch als ein Aktivator des lymphoiden Systems, welches die Immunantwort unspezifisch verstärkt (Hood et al., Immunology, Zweite Ausgabe, 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, Seite 384). Oftmals wird mit einem ersten Reiz mit einem Antigen alleine, das heißt, in Abwesenheit eines Adjuvans, keine humorale oder zelluläre Immunantwort ausgelöst werden. Die Adjuvantien schließen – sind jedoch nicht hierauf beschränkt – Folgendes mit ein: vollständiges Freund'sches Adjuvans, unvollständiges Freund'sches Adjuvans, Saponin, Mineralgele, wie bspw. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie bspw. Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Öl- oder Kohlenwasserstoffemulsionen, „keyhole"-Napfschnecken-Hämocyanine, Dinitrophenol und möglicherweise geeignete humane Adjuvantien, wie bspw. BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum. Das Adjuvans ist vorzugsweise pharmazeutisch akzeptierbar.
Impfung und passive Immuntherapie
Eine aktive Immunität gegenüber grampositiven Bakterien, insbesondere Pneumococcus, kann durch eine Immunisierung (Impfung) mit einer immunogenen Menge an CBP oder einem antigenen Derivat oder Fragment davon, und einem Adjuvans induziert werden, wobei das CBP oder das antigene Derivat oder Fragment davon die antigene Komponente des Impfstoffs ist.
Das CPB – entweder alleine, oder mit einer Kapsel oder Kapseln konjugiert – kann keine bakterielle Infektion auslösen, und die aktive Immunität, die durch Impfung mit dem Protein gemäß der vorliegenden Erfindung hervorgerufen wird, kann sowohl in eine sofortige Immunantwort als auch in ein immunologisches Gedächtnis resultieren, und bietet daher einen Langzeitschutz gegen die Infektion durch das Bakterium. Die CBPs der vorliegenden Erfindung, oder antigene Fragmente davon, können in einer Beimischung mit einem Adjuvans hergestellt werden, um einen Impfstoff herzustellen. Das CBP, oder ein Derivat oder Fragment davon, welches an die antigene Komponente des Impfstoffes eingesetzt wird, ist vorzugsweise ein Adhäsin. Dabei ist noch bevorzugter, wenn das CBP, oder das Derivat oder Fragment davon, welches als die antigene Komponente des Impfstoffes verwendet wird, ein Antigen ist, das allen oder vielen Stämmen einer Spezies von grampositiven Bakterien gemein ist, oder zumindest nahe verwandten Spezies von Bakterien gemein ist. Dabei ist am meisten bevorzugt, wenn die antigene Komponente des Impfstoffes ein Adhäsin ist, das ein gemeinsames Antigen ist.
Die Auswahl eines Adjuvans hängt von dem zu impfenden Subjekt ab. Vorzugsweise wird ein pharmazeutisch akzeptierbares Adjuvans verwendet. So sollte bspw. ein Impfstoff für einen Menschen kein Öl und keine Kohlenwasserstoff-Emulsions-Adjuvantien enthalten, einschließlich des vollständigen und unvollständigen Freud'schen Adjuvans. Ein Beispiel für ein Adjuvans, das zur Verwendung in Menschen geeignet ist, ist Alaun (Aluminiumgel). Jedoch kann ein Impfstoff für ein Tier Adjuvantien enthalten, die zur Verwendung beim Menschen nicht geeignet sind.
Eine Alternative für traditionelle Impfstoffe, die ein Antigen und ein Adjuvans aufweisen, beinhaltet die direkte in vivo-Einführung von DNA, die für das Antigen codiert, in Gewebe eines Subjekts, um das Antigen durch die Zellen des Gewebes des Subjekts exprimieren zu lassen. Solche Impfstoffe werden hierin als „Nucleinsäure-basierte Impfstoffe" bezeichnet. Da das CBP-Gen definitionsgemäß eine Signalsequenz enthält, resultiert die Expression des Gens in Gewebezellen in die Sekretion von Membranassoziierungen des exprimierten Proteins. Alternativ kann der Expressionsvektor dahingehend gebildet werden, dass er anstelle der CBP-Signalsequenz eine autologe Signalsequenz enthält. So kann bspw. ein nackter DNA-Vektor (siehe bspw. Ulmer et al., 1993, Science 259: 1745–1149), ein DNA-Vektortransporter (bspw. Wu et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 963–967; Wu und Wu, 1988, J. Biol. Chem., 263: 14621–14624; Hartmut et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311, ange meldet am 15. März 1990) oder ein viraler Vektor, der das gewünschte CBP-Gen enthält, in das Gewebe injiziert werden. Geeignete virale Vektoren schließen Retroviren mit ein, die in Zellen mit einem amphotropen Wirtsbereich gepackt sind (siehe Miller, 1990, Human Gene Ther., 1: 5–14; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 49), sowie verzögerte oder defekte DNA-Viren, wie bspw. das Herpes Simplex-Virus (HSV) (siehe bspw. Kapplitt et al., 1991, Molec. Cell. Neurosci., 2: 320–330), Papillomavirus, Epstein Barr-Virus (EBV), Adenovirus (siehe bspw. Stratford-Perricaudet et al., 1992, J. Clin. Invest., 90: 626–630), Adeno-assoziierte Virus (AAV) (siehe bspw. Samulski et al., 1987, J. Virol., 61: 3096–3101; Samulski et al., 1989, J. Virol., 63: 3822–3828) und ähnliche, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Defekte Viren, denen entweder vollständig oder beinahe vollständig virale Gene fehlen, sind dabei bevorzugt. Ein defekter Virus ist nach Einführung in eine Zelle nicht infektiv.
Vektoren, die den Nucleinsäure-basierten Impfstoff gemäß der Erfindung enthalten, können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren in den erwünschten Wirt eingeführt werden, wie bspw. durch eine Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphatfällung, Lipofektion (Lysosomenfusion), Verwendung einer Genpistole oder einem DNR-Vektortransporter (siehe bspw. Wu et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 963–967; Wu und Wu, 1988, J. Biol. Chem., 263: 14621–14624; Hartmut et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311, angemeldet am 15. März 1990).
Entweder ein Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung, das heißt, ein Impfstoff, der das CBP-Antigen oder ein antigenes Derivat oder Fragment davon aufweist, oder ein CBP-Nucleinsäurenimpfstoff können über jeden parenteralen Weg verabreicht werden, einschließlich intramuskulär, intraperitoneal, intravenös und Ähnliches, ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Da es das erwünschte Ergebnis der Impfung ist, eine Immunantwort gegen das Antigen hervorzurufen, und dadurch gegen den pathogenen Organismus, erfolgt die Verabreichung direkt oder aber indirekt, durch Auswahl oder Abzielen eines viralen Vektors bspw. auf lymphoide Gewebe, wie bspw. Lymphknoten oder die Milz. Da die Immunzellen sich kontinuierlich replizieren, sind sie ideale Ziele für retrovirale Vektor-basierte Nucleinsäurenimpfstoffe, da die Retroviren replizierende Zellen benötigen.
Eine passive Immunität kann einem Tiersubjekt verliehen werden, von welchem angenommen wird, dass es an einer Infektion mit einem grampositiven Bakterium, vorzugsweise Streptococcen, und noch bevorzugter Pneumococcen, leidet, indem ein Antiserum, polyklonale Antikörper oder ein neutralisierender monoklonaler Antikörper gegen ein Cholin-bindendes Protein gemäß der Erfindung verabreicht wird. Obwohl die passive Immunität keinen Langzeitschutz verleiht, kann sie ein wertvolles Werkzeug für die Behandlung einer bakteriellen Infektion eines Subjekts sein, das zuvor nicht geimpft worden ist. Die passive Immunität ist insbesondere für die Behandlung von Antibiotika-resistenten Stämmen von grampositiven Bakterien wichtig, da keine andere Therapie zur Verfügung stehen kann. Die zur passiven Immuntherapie verabreichten Antikörper sind vorzugsweise autologe Antikörper. Wenn das Subjekt bspw. ein Mensch ist, sind die Antikörper vorzugsweise von humanem Ursprung, oder aber sind humanisiert worden, um die Möglichkeit einer Immunantwort gegen die Antikörper zu minimieren. In einem spezifischen Beispiel, siehe unten, schützt die passive Immunität vollständig gegen tödliche bakterielle Infektionen.
Eine Therapie, die zu der passiven Immunisierung analog ist, ist die Verabreichung einer Menge eines CBP-Adhäsionsproteins, welches die Adhäsion, des Bakteriums an dessen Zielzelle inhibieren kann. Die hierfür benötigte Menge kann durch den Fachmann unter Einsatz von Standardverfahren bestimmt werden.
Die aktiven oder passiven Impfstoffe gemäß der Erfindung, oder die Verabreichung eines Adhäsins, können dazu eingesetzt werden, ein Tiersubjekt vor einer Infektion eines grampositiven Bakteriums, vorzugsweise Streptococcen, und noch bevorzugter Pneumococcus, zu schützen. Daher kann ein Impfstoff gemäß der Erfindung in Vögeln, wie bspw. Hühnern, Truthähnen, und Haustieren eingesetzt werden; ferner in Säugetieren, vorzugsweise dem Menschen, obwohl die Impfstoffe gemäß der Erfindung zum Einsatz in anderen Säugetierspezies berücksichtigt werden, und zwar einschließlich – jedoch nicht hierauf beschränkt – domestizierte Tiere (Hunde und Katzen); Bauernhoftiere (Rinder, Schafe, Pferde, Ziegen, Schweine und ähnliche); Nagetiere; und nicht domestizierte Tiere.
Diagnose einer grampositiven bakteriellen Infektion
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung, die gegen CBPs aus grampositiven Bakterien hergestellt werden können, sind wertvolle Reagenzien für die Diagnose einer Infektion mit einem grampositiven Mikroorganismus, insbesondere einem Pneumococcus. Gegenwärtig ist die Diagnose einer Infektion mit einem grampositiven Bakterium schwierig. Gemäß der Erfindung kann das Vor liegen eines grampositiven Bakteriums in einer Probe von einem Subjekt, von dem angenommen wird, dass es eine Infektion mit einem grampositiven Bakterium hat, durch die Detektion der Bindung eines Antikörpers an das CBP des Bakteriums in oder aus der Probe detektiert werden. In einem Aspekt der Erfindung kann der Antikörper für einen einzigen Stamm oder eine limitierte Anzahl von Stämmen des Bakteriums spezifisch sein, wodurch die Diagnose der Infektion mit diesem bestimmten Stamm (oder Stämmen) ermöglicht wird. Alternativ kann der Antikörper für viele oder alle Stämme des Bakteriums spezifisch sein, wodurch die Diagnose der Infektion mit diesen Spezies ermöglicht wird.
Bei der Diagnose einer Infektion mit einem grampositiven Bakterium kann irgendein im Stand der Technik bekanntes Immunoassayformat wie benötigt eingesetzt werden. Im Abschnitt mit der Überschrift „Antikörper gegen CBPs" sind viele mögliche Immunoassayformate beschrieben. Die Antikörper können für die Detektion in vitro markiert sein, bspw. mit Markern, wie Enzyme, Fluorophore, Chromophore, Radioisotope, Farbstoffe, colloidales Gold, Latexpartikel und chemolumineszierende Agenzien. Alternativ können die Antikörper für die Detektion in vivo markiert werden, bspw. mit Radioisotopen (vorzugsweise Technetium oder Iod); Magnetresonanz-Shift-Reagenzien (wie bspw. Gadolinium und Mangan); oder röntgenfähige Reagenzien.
In spezifischen Ausführungsformen kann das Vorliegen von CBP in oder auf den Zellen durch herkömmliche immunologische Verfahren bestätigt werden, die für solche Bestimmungen anwendbar sind. Eine Vielzahl von geeigneten Verfahren ist im Stand der Technik bekannt. Die Verfahren und deren Anwendungen sind den Fachleuten bekannt und können entsprechend im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. So ist bspw. ein „kompetitives" Verfahren in den US-Patenten mit den Nummern 3,654,090 und 3,850,752 beschrieben. Ein „Sandwich"-Verfahren ist in den US-Patenten mit den Nummern RE 31,006 und 4,016,043 beschrieben. Weitere andere Verfahren sind bekannt, wie bspw. der „doppelte Antikörper" oder das „DASP"-Verfahren.
In jedem Fall bildet das CBP mit einem oder mehreren Antikörpern oder Bindungspartnern Komplexe, und ein Mitglied des Komplexes ist mit einem detektierbaren Marker markiert. Die Tatsache, dass sich ein Komplex gebildet hat, und, wenn gewünscht, die Menge davon, kann durch bekannte Verfahren bestimmt werden, die für die Detektion von Markern anwendbar sind.
Die am häufigsten eingesetzten Marker für diese Untersuchungen sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien mit Fluoreszenz, wenn sie Ultraviolettlicht ausgesetzt werden, und andere.
Eine Anzahl von fluoreszierenden Materialien sind bekannt und können als Marker eingesetzt werden. Diese schließen bspw. Fluorescein, Rhodamin, Auramin, Texas-Rot, AMCA-Blau und Lucifer-Gelb mit ein. Ein besonderes Detektionsmaterial ist ein Anti-Kaninchen-Antikörper, der in Ziegen generiert wird, und der durch ein Isothiocyanat mit Fluorescein konjugiert ist.
Das CBP oder dessen Bindepartner kann auch mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert sein. Der radioaktive Marker kann durch eine der gegenwärtig verfügbaren Zählverfahren detektiert werden. Die bevorzugten Isotope können ausgewählt sein aus ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I und ¹⁸⁶Re.
Ebenso sind Enzymmarker ähnlich nützlich, und können durch irgendeines der gegenwärtig eingesetzten colorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorspektrophotometrischen, amperometrischen und gasometrischen Verfahren detektiert werden. Das Enzym wird durch eine Reaktion mit brückenbildenden Molekülen, wie bspw. Carbodiimide, Diisocyanate, Glutaraldehyd und ähnlichen mit dem ausgewählten Partikel konjugiert. Viele Enzyme, die bei diesen Verfahren eingesetzt werden können, sind im Stand der Technik bekannt und brauchbar. Die bevorzugten Enzyme sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphatase. Beispielhaft wird auf die US-Patente mit den Nummern 3,654,090; 3,850,752 und 4,016,043 hinsichtlich deren Offenbarung für alternative Markierungsmaterialien und -verfahren Bezug genommen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können kommerzielle Testkits, die für den Einsatz durch einen medizinischen Spezialisten geeignet sind, hergestellt werden, um das Vorliegen oder die Abwesenheit einer vorbestimmten Bindungsaktivität oder einer vorbestimmten Bindungsaktivität-Fähigkeit an vermutete Zielzellen zu bestimmen. Gemäß den oben diskutierten Testverfahren wird eine Klasse solcher Kits, zumindest das markierte CBP oder dessen Bindungspartner, bspw. ein dagegen spezifischer Antikörper, sowie Anweisungen enthalten, selbstverständlich in Abhängigkeit von dem ausgewählten Verfahren, wie bspw. einem „kompetitiven", „Sandwich"-, DASP"-Verfahren und Ähnlichem. Die Kits können ferner auch periphere Reagenzien, wie bspw. Puffer, Stabilisatoren, etc. enthalten.
Dementsprechend kann ein Testkit zum Nachweis des Vorliegens oder der Fähigkeit von Zellen für eine vorbestimmte bakterielle Bindungsaktivität hergestellt werden, welches Folgendes aufweist:

(a) eine vorbestimmte Menge von zumindest einem markierten, immunochemisch reaktiven Komponente, welche durch das direkte oder indirekte Anhaften des vorliegenden CBP-Faktors oder eines spezifischen Bindungspartners daran, an einen detektierbaren Marker gewonnen wird;
(b) andere Reagenzien; und
(c) Anleitungen zur Verwendung des Kits.

Genauer kann das Diagnosetestkit Folgendes aufweisen:

(a) eine bekannte Menge des oben beschriebenen CBPs (oder eines Bindungspartners), welches im Allgemeinen an eine feste Phase gebunden ist, um ein Immunoabsorbens zu bilden, oder das alternativ an einen geeigneten Tag oder mehrerer solcher Endprodukte gebunden ist, etc. (oder deren Bindungspartner) eines davon;
(b) falls notwendig weitere Reagenzien; und
(c) Anleitungen zur Verwendung des Testkits.

In einer weiteren Variation kann das Testkit hergestellt und für Zwecke eingesetzt werden, die oben beschrieben wurden, und wobei das Testkit gemäß einem vorbestimmten Protokoll funktioniert (bspw. „kompetitiv", „Sandwich", „doppelte Antikörper", etc.), und wobei es Folgendes aufweist:

(a) eine markierte Komponente, welche durch Bindung des CBPs an einen detektierbaren Marker gewonnen wurde;
(b) eine oder mehrere zusätzliche immunochemische Reagenzien, von denen zumindest eine ein Ligand oder ein immobili sierter Ligand ist, wobei der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (i) ein Ligand, der mit der markierten Komponente (a) binden kann; (ii) ein Ligand, der mit einem Bindungspartner der markierten Komponente (a) binden kann; (iii) ein Ligand, der mit zumindest einem der zu bestimmenden Komponenten binden kann; und (iv) ein Ligand, der mit zumindest einem der Bindepartner der zumindest einen zu bestimmenden Komponenten binden kann; und
(c) Anleitungen zur Durchführung eines Protokolls zur Detektion und/oder Bestimmung von einem oder mehrerer Komponenten einer immunochemischen Reaktion zwischen dem CBP und einem spezifischen Bindungspartner dazu.

Alternativ können die Nucleinsäuren der Erfindung und Sequenzen davon in der Diagnose einer Infektion mit einem grampositiven Bakterium eingesetzt werden. So können bspw. die CBP-Gene oder hybridisierbare Fragmente davon für in vitro-Hybridisierungen mit einer Probe aus einem Subjekt eingesetzt werden, von dem angenommen wird, dass es eine Infektion mit einem grampositiven Bakterium trägt. In einer anderen Ausführungsform können spezifische Gensegmente eines grampositiven Bakteriums unter Verwendung der PCR-Amplifizierung mit Sonden identifiziert werden, die auf den CBP-Genen gemäß der Erfindung basieren. In einem Aspekt der Erfindung kann die Hybridisierung mit einer Sonde oder mit den PCR-Primern unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden, oder aber mit einer Sequenz, die für einen einzigen Stamm oder eine begrenzte Anzahl von Stämmen des Bakteri ums, oder beide, spezifisch ist, wodurch die Diagnose der Infektion mit dem bestimmten Stamm (oder den Stämmen) ermöglicht wird. Alternativ kann die Hybridisierung unter weniger stringenten Bedingungen durchgeführt werden, oder aber die Sequenz kann in irgendeinem oder allen Stämmen eines Bakteriums homolog sein, wodurch die Diagnose der Infektion mit diesen Spezies ermöglicht wird.
Therapeutische Zusammensetzungen und Impfstoffe, die CBPs aufweisen
Wie oben bemerkt, werden mit der vorliegenden Erfindung therapeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die Antikörper gegen CBPs aufweisen (das heißt, eine passive Immuntherapie), Anti-CBP-Impfstoffe (entweder aufweisend CBPs in einem Adjuvans oder ein Nucleinsäurenimpfstoff), CBPs, welche mit den bakteriellen CBPs hinsichtlich der pathogenen Aktivitäten in Konkurrenz stehen, wie bspw. die Adhärenz an Wirtszellen, Peptide, wie bspw. Fn5, oder Antikörper gegen Fn5. Eine solche Zusammensetzung ist vorzugsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die aktive Komponente (den Antikörper, den Impfstoff oder CBP) in einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger aufweist.
Die Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen, die eine aktive Komponente enthalten, ist in dem vorliegenden Gebiet gut bekannt. Typischerweise werden solche Zusammenensetzungen als Injektionen zubereitet, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, jedoch können auch feste Formen hergestellt werden, die zur Auflösung oder zur Suspension in flüssiger Form vor der Injektion geeignet sind. Ferner kann die Zubereitung auch emulgiert werden. Der therapeutische Wirkstoff wird oft mals mit Arzneimittelträgern vermengt, die pharmazeutisch akzeptierbar und mit dem Wirkstoff kompatibel sind. Geeignete Arzneimittelträger sind bspw. Wasser, Saline, Dextrose, Glycerol, Ethanol oder Ähnliches, sowie Kombinationen daraus. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung – falls notwendig – kleinere Mengen an Hilfsstoffen enthalten, wie bspw. Benetzungsmittel oder Emulgatoren, den pH-Wert puffernde Stoffe, die die Effektivität des Wirkstoffes verstärken.
Eine aktive Komponente kann in der therapeutischen Zusammensetzung in Form von neutralisierten, pharmazeutisch akzeptierbaren Salzformen formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptierbare Salze schließen die Säureadditionssalze mit ein (gebildet mit den freien Aminogruppen des Polypeptids oder des Antikörpermoleküls), und werden mit anorganischen Säuren gebildet, wie bspw. Salzsäure oder Phosphorsäure, oder organischen Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Tartarsäure, Mandelsäure, und Ähnliches. Salze, die auf den freien Carboxylgruppen gebildet sind, können auch aus anorganischen Basen abgeleitet werden, wie bspw. Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium oder Eisenhydroxide, sowie aus organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und Ähnlichem.
Eine Zusammensetzung, die „A" aufweist (wobei „A" ein einzelnes Protein, DNA-Molekül, Vektor etc. ist), ist im Wesentlichen frei von „B" (wobei „B" ein oder mehrere verunreinigende Proteine, DNA-Moleküle, Vektoren, etc. aufweist), wenn zumindest ungefähr 75 Gew.-% der Proteine, DNA, Vektoren (in Abhängigkeit von der Spezies-Kategorie, zu welcher A und B gehören) in der Zusammensetzung „A" ist. Vorzugsweise weist „A" mindestens ungefähr 90 Gew.-% der A+B-Spezies in der Zusammensetzung auf, am bevorzugtesten mindestens ungefähr 99 Gew.-%.
Der Ausdruck „pharmazeutisch akzeptierbar" bezieht sich auf Molekülanteile und Zusammensetzungen, die physiologisch verträglich sind, und typischerweise keine allergischen oder ähnlich ungünstige Reaktionen hervorrufen, wie bspw. Magenverstimmung, Schwindelanfälle und Ähnliches, wenn sie einem Menschen verabreicht werden. Der Ausdruck „pharmazeutisch akzeptierbar", wie er hierin verwendet wird, bedeutet vorzugsweise genehmigt durch eine Kontrollbehörde der Bundes- oder Staatsregierung oder aufgeführt im US-Arzneibuch oder anderen, allgemein anerkannten Arzneibüchern zur Verwendung bei Tieren, und insbesondere bei Menschen. Der Ausdruck „Träger" bezieht sich auf ein Verdünnungsmittel, Adjuvans, Arzneimittelträger oder Vehikel, mit welchem die Verbindung verabreicht wird. Solche pharmazeutischen Träger können sterile Flüssigkeiten, wie bspw. Wasser und Öle sein, einschließlich Petroleumöl, Öl von tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, wie bspw. Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und Ähnlichem. Wasser oder wässrige Lösungen, Salinelösungen und wässrige Dextrose und Glycerollösungen werden vorzugsweise als Träger eingesetzt, insbesondere für injizierbare Lösungen. Geeignete pharmazeutische Träger sind in „Remington's Pharmaceutical Sciences" von E. W. Martin beschrieben.
Der Ausdruck „therapeutisch effektive Menge" wird hierin verwendet, um eine Menge zu bezeichnen, die hinreichend ist, ein klinisch signifikantes Defizit in der Aktivität, Funktion oder Antwort des Wirtes um mindestens ungefähr 15 %, vorzugsweise um mindestens 50 %, noch bevorzugter um mindestens 90 % und am bevorzugtesten vollkommen verhindern kann. Alternativ ist eine therapeutisch effektive Menge hinreichend, um eine Verbesserung eines klinisch signifikanten Zustands im Wirt zu erreichen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird ein Defizit in der Antwort des Wirtes durch eine Fortführung oder Ausbreitung der bakteriellen Infektion aufgezeigt. Eine Verbesserung eines klinisch signifikanten Zustandes im Wirt schließt ein Absenken in der bakteriellen Belastung, das Beseitigen der Bakterien aus besiedelten Wirtszellen, die Reduktion eines Fiebers oder einer Entzündung, die mit der Infektion verbunden ist, oder eine Reduktion jeglichen Symptoms, das mit der bakteriellen Infektion verbunden ist, mit ein.
Gemäß der Erfindung kann die Komponente oder die Komponenten der therapeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung bspw. parenteral, transmuskulär, oral, nasal, pulmonär, rektal oder transdermal verabreicht werden. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung parenteral, bspw. über eine intravenöse Injektion, und schließt auch intraarterielle, intramuskuläre, intradermale, subkutane, intraperitoneale, intraventrikuläre und intracraniale Verabreichungen mit ein, ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Eine orale oder pulmonäre Abgabe kann bevorzugt sein, um die Mucosa-Immunität zu aktivieren; da die Pneumococcen im Allgemeinen die nasopharyngeale und pulmonäre Mucosa besiedeln, kann die Mucosa-Immunität eine besonders effective Präventionsbehandlung sein. Der Ausdruck „Einheitsdosis", wenn er hierin in Bezug auf eine therapeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die für Menschen als einheitliche Dosierungen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge eines aktiven Materials enthält, welches den gewünschten therapeutischen Effekt in Zusammenhang mit dem benötigten Verdünnungsmittel, das heißt, einem Träger oder einem Vehikel, hervorrufen soll.
In anderen Ausführungsformen kann die aktive Verbindung im einem Vesikel geliefert werden, insbesondere in einem Liposom (siehe Langer, Science, 249: 1527–1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein und Fidler (Hrsg.), Liss, New York, Seiten 353–365 (1989); Lopez-Berestein, ebenfalls dort, Seiten 317–327; im Allgemeinen siehe dort).
In noch einer weiteren Ausführungsform kann die therapeutische Verbindung in einem System mit kontrollierter Freisetzung abgegeben werden. So kann bspw. das Polypeptid mit einer intravenösen Infusion, einer implantierbaren osmotischen Pumpe, einem transdermalen Pflaster, Liposomen, oder anderen Verabreichungsarten verabreicht werden. In einer Ausführungsform kann eine Pumpe verwendet werden (Langer, wie oben; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery, 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321: 574 (1989)). In einer anderen Ausführungsform können polymere Materialien verwendet werden (siehe Medical Applications of Controlled Release, Langer und Wise (Hrsg.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen und Ball (Hrsg.), Wiley, New York (1984); Ranger und Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23: 61 (1983); siehe ebenso Levy et al., Science, 228: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol., 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg., 71: 105 (1989)). In noch einer weiteren Ausführungsform kann ein System mit kontrollier ter Freisetzung in unmittelbarer Nähe zum therapeutischen Ziel platziert werden, wie bspw. dem Gehirn, wodurch lediglich eine Fraktion der systemischen Dosis benötigt wird (siehe bspw. Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, wie oben, Vol. 2, Seiten 115–138 (1984)). Die Vorrichtung zur kontrollierten Freisetzung wird vorzugsweise in ein Subjekt eingeführt, und zwar in unmittelbarer Nähe der Stelle einer ungeeigneten Immunaktivierung oder einem Tumor.
Andere Systeme mit kontrollierter Freisetzung werden in dem Übersichtsartikel von Langer diskutiert (Science, 249: 1527–1533 (1990)).
Ein Subjekt, in welchem die Verabreichung einer aktiven Komponente, wie oben dargelegt, ein effektives therapeutisches Mittel für eine bakterielle Infektion ist, ist vorzugsweise ein Mensch, kann jedoch auch irgendein Tier sein. Daher werden – wie durch einen Durchschnittsfachmann leicht bestimmt werden kann – die Arzneimittel und pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung insbesondere für die Verabreichung an irgendein Tier geeignet sein, insbesondere an ein Säugetier, und einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf – Haustiere, wie bspw. Katzen oder Hunde, Hoftiere, wie bspw. – jedoch nicht hierauf beschränkt – Tiere, die zu den Rindern, Pferden, Ziegen, Schafen und Schweinen gezählt werden, Wildtiere (seien es Wildtiere in der Wildnis oder in einem zoologischen Garten), Forschungstiere, wie Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schafe, Schweine, Hunde, Katzen, etc., das heißt, zur Verwendung in der Veterinärmedizin.
In den therapeutischen Arzneimitteln und Zusammensetzungen gemäß der Erfindung wird eine therapeutisch effektive Dosis der aktiven Komponente bereitgestellt. Eine therapeutisch effektive Dosierung kann durch den durchschnittlichen Mediziner ermittelt werden, basierend auf den Patienteneigenschaften (Alter, Gewicht, Geschlecht, Zustand, Komplikationen, andere Krankheiten, etc.), wie im Stand der Technik gut bekannt ist. Da weitere Routineuntersuchungen durchgeführt werden, werden darüber hinaus spezifischere Informationen bezüglich geeigneten Dosierungsmengen hinsichtlich der Behandlung verschiedener Zustände in verschiedenen Patienten offenbar werden, und der durchschnittliche Mediziner wird – unter Heranziehung des therapeutischen Kontexts, des Alters und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Empfängers – dazu in der Lage sein, die geeignete Dosierung herzustellen. Im Allgemeinen kann die Dosierung für eine intravenöse Injektion oder Infusion niedriger sein als für eine intraperitoneale, intramuskuläre oder eine andere Verabreichungsart. Das Dosierungsschema kann variieren, in Abhängigkeit der Zirkulations-Halbwertszeit sowie der verwendeten Formulierung. Die Zusammensetzungen werden auf eine Art und Weise verabreicht, die mit der Dosierungsformulierung in der therapeutisch effektiven Menge kompatibel ist. Die genauen Mengen des Wirkstoffes, der verabreicht werden muss, hängen von der Einschätzung des Mediziners ab und sind für jedes Individuum spezifisch. Jedoch können geeignete Dosierungen im Bereich von ungefähr 0,1 bis 20, vorzugsweise von 0,5 bis 10, und noch bevorzugter von 1 bis mehrere Milligramm des Wirkstoffes pro Kilogramm Körpergewicht eines Individuums pro Tag betragen und hängen vom Verabreichungsweg ab. Geeignete Pläne zur anfänglichen Verabreichung und „booster shots" können ebenfalls variiert werden, werden jedoch durch eine anfängliche Verabrei chung, gefolgt von wiederholten Dosen mit Intervallen von nach einer bis mehrere Stunden, durch eine nachfolgende Injektion oder weiteren Verabreichungen spezifiziert. Alternativ können kontinuierliche intravenöse Infusionen in Betracht gezogen werden, die ausreichend sind, Konzentrationen von zehn Nanomolar bis zehn Mikromolar im Blut aufrechtzuerhalten.
Verabreichung mit anderen Verbindungen. Zur Behandlung einer bakteriellen Infektion kann die vorliegende aktive Komponente in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, die für die Behandlung bakterieller Infektionen verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht hierauf beschränkt, (1) Antibiotika; (2) lösliche kohlenwasserstoffbasierte Inhibitoren bakterieller Adhäsion; (3) andere Inhibitoren der bakteriellen Adhäsion in Form kleiner Moleküle; (4) Inhibitoren des bakteriellen Stoffwechsels, Transports oder der Transformation; (5) Stimulatoren der bakteriellen Lyse oder (6) antibakterielle Antikörper oder Impfstoffe, die gegen andere bakterielle Antigene gerichtet sind. Andere wirksame aktive Komponenten schließen entzündungshemmende Stoffe mit ein, wie bspw. Steroide und nicht-steroidische antiinflammatorische Arzneimittel. Die Verabreichung kann simultan erfolgen (bspw. eine Verabreichung einer Mischung der vorliegenden aktiven Komponente mit einem Antibiotikum) oder kann aufeinander folgend verabreicht werden.
Dementsprechend können die therapeutischen Zusammensetzungen in spezifischen Ausführungsformen eine effektive Menge der aktiven Komponente mit einschließen und einen oder mehrere der folgenden aktiven Inhaltsstoffe: ein Antibiotikum, ein Steroid, etc. Beispielhafte Formulierungen sind nachstehend wiedergegeben: Intravenöse Formulierung I Formulierungen

Inhaltsstoff mg/ml

Cefotaxim 250,0

CBP 10,0

Dextrose USP 45,0

Natriumbisulfit USP 3,2

Edetatdinatrium USP 0,1

Wasser für die Injektion q.s.a.d. 1,0 ml

Intravenöse Formulierung II

Inhaltsstoff mg/ml

Ampicillin 250,0

CBP 10,0

Natriumbisulfit USP 3,2

Dinatriumedetat USP 0,1

Wasser für die Injektion q.s.a.d. 1,0 ml

Intravenöse Formulierung III

Inhaltsstoff mg/ml

Gentamicin (geladen als Sulfat) 40,0

CBP 10.0

Natriumbisulfit USP 3,2

Dinatriumedetat USP 0,1

Wasser für die Injektion q.s.a.d. 1,0 ml

Intravenöse Formulierung IV

Inhaltsstoff ng/ml

CBP 10.0

Dextrose USP 45,0

Natriumbisulfit USP 3,2

Edetatdinatrium USP 0,1

Wasser für die Injektion q.s.a.d. 1,0 ml

Intravenöse Formulierung V

Inhaltsstoff mg/ml

CBP Antagonist 5,0

Natriumbisulfit USP 3,2

Dinatriumedetat USP 0,1

Wasser für die Injektion q.s.a.d. 1,0 ml
Vorliegend bedeutet „pg" Picogramm, „ng" bedeutet Nanogramm, „ug" oder „μg" bedeutet Mikrogramm, „mg" bedeutet Milligramm, „ul" oder „μ1" bedeute Mikroliter, „ml" bedeutet Milliliter, „1" bedeutet Liter.
In einem spezifischen Fall, bei welchem es notwendig ist, die Infektion, die aus einer CBP-vermittelten Bindung der Bakterien an die Wirtszelle herrührt, zu reduzieren oder aber zu inhibieren, könnte daher CBP oder ein dagegen gerichteter Antikörper, oder ein Ligand davon oder ein Antikörper gegen diesen Liganden, wie bspw. Fn5, verabreicht werden, um die Wechselwirkung der auf den Bakterien vorliegenden CBPs mit der Wirtszelle zu blockieren.
Wie weiter oben diskutiert, können die CBPs oder die dagegen gerichteten Antikörper in pharmazeutischen Zusammensetzungen bereitgestellt werden, mit einem geeigneten Träger und mit einer Stärke, die für die Verabreichung durch verschiedene Mittel an einen Patienten effektiv ist, welcher einen nachteiligen medizinischen Zustand erfährt, der mit einer spezifischen bakteriellen Infektion verbunden ist, um diesen zu behandeln. Eine Vielzahl von Verabreichungstechniken können eingesetzt werden, darunter parenterale Techniken, wie eine subkutane, intravenöse und intraperitoneale Injektion, Katheterisierungen und Ähnliches. Durchschnittliche Mengen an CBPs oder deren Untereinheiten können variieren und sollten insbesondere auf den Empfehlungen und der Verschreibung eines qualifizierten Arztes oder Veterinärmediziners basieren.
Pulmonäre Abgabe
Wie hierin in Erwägung gezogen, ist die Pulmonäre Abgabe des vorliegenden Adhäsions-inhibierenden Agens (oder Derivaten davon) gemäß der Erfindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Cholin-bindenden Protein gemäß der Erfindung, einem Antikörper gegen ein Cholin-bindendes Protein gemäß der Erfindung, einem Cholin-bindenden Protein gemäß der Erfindung, welches eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 8 oder SEQ ID Nr. 19 aufweist, einem Peptid mit nicht mehr als 15 Aminosäureresten mit der Aminosäuresequenz WQPPRARI (SEQ ID Nr. 11), sowie einem Antikörper, der für ein Epitop spezifisch ist, das die Aminosäuresequenz WQPPRARI (SEQ ID Nr. 11) aufweisst. Das Adhäsionsinhibierende Agens (oder das Derivat) ist geeignet, in die Lungen eines Säugetieres gegeben zu werden, wo es mit der bakteriellen, das heißt, Streptococcen- und vorzugsweise Pneumococcen-Bindung an Wirtszellen wechselwirken kann. In einer spezifischen Ausführungsform inhibiert ein Adhäsionsinhibitorisches Agens die Bindung der Streptococcenenolase an Fibronectin. Andere Berichte über Bereitstellung von Proteinen zur pulmonären Abgabe können im Stand der Technik aufgefunden werden [Adjei et al., Pharmaceutical Research, 7: 565–569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63: 135–144 (1990) (Neuprolidacetat); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (suppl. 5): 143–146 (1989) (Endothelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, Vol. III, Seiten 206–212 (1989) (α1-Antitrypsin); Smith et al., J. Clin. Invest., 84: 1145–1146 (1989) (α1-Proteinase); Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, (1990) (rekombinante menschliches Wachstumshormon); Debs et al., J. Immunol., 140: 3482–3488 (1988) (Interferon-γ und Tumornecrosefaktor Alpha); Platz et al., U.S. Patent, Nr. 5,284,656 (Granulocytenkolonie-stimulierender Faktor)]. Ein Verfahren und eine Zusammensetzung für die pulmonären Abgabe von Arzneimitteln ist in dem U.S. Patent Nr. 5,451,569, erteilt am 19. September, 1995 von Wong et al., beschrieben.
In der Anwendung der vorliegenden Erfindung werden zur Verwendung ein breiter Bereich von mechanischen Vorrichtungen in Erwägung gezogen, die für die pulmonäre Abgabe therapeutischer Produkte gebildet sind, einschließlich – jedoch nicht begrenzt auf – Zerstäuber, Dosierungs-Inhalationsgeräte, Pulver-Inhalationsgeräte, welche allesamt den Fachleuten bekannt sind. Bezüglich der Konstruktion der Abgabevorrichtung kann jede im Gebiet bekannte Aerolisierungsform in der Anwendung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, einschließlich – jedoch nicht begrenzt auf – Sprühfläschchen, Zerstäuber, Atomisierung oder Pumpen-Aerolisierung einer flüssigen Formulierung, sowie die Aerolisierung einer trockenen Pulverformulierung.
Einige spezifische Beispiele von kommerziell. verfügbaren Vorrichtungen, die für die Anwendung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind der Ultravent-Zerstäuber, der von Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri, hergestellt wird; der Acorn-II-Zerstäuber, hergestellt von Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; das Ventolin-Dosierungs-Inhalationsgerät, hergestellt von Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; sowie das Spinhaler-Pulver-Inhalationsgerät, hergestellt von Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Bei all diesen Vorrichtungen ist der Einsatz von Formulierungen notwendig, die für die Dispergierung des Adhäsions-inhibierenden Agens (oder Derivats davon) geeignet sind. Typischerweise ist jede Formulierung für den jeweils eingesetzten Vorrichtungstyp spezifisch, wobei der Einsatz eines geeigneten Treibmittels notwendig sein kann, zusätzlich zu dem üblichen Verdünnungsmittel, Adjuvantien und/oder Trägern, die bei der Therapie nützlich sind. Auch die Verwendung von Liposomen, Mikrokapseln oder Mikrosphären, Einschluss-Komplexe oder andere Trägerarten wird in Betracht gezogen. Auch können chemisch modifizierte Adhäsions-inhibierende Agenzien in unterschiedlichen Formulierungen hergestellt werden, je nach Abhängigkeit der Art der chemischen Modifizierung oder der eingesetzten. Vorrichtungsart.
Formulierungen, die zur Verwendung mit einem Zerstäuber geeignet sind, entweder Jet- oder Ultraschallzerstäuber, werden typischerweise ein Adhäsions-inhibierendes Agens (oder Derivat davon) aufweisen, welches in Wasser mit einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 25 mg eines biologisch aktiven Adhäsions-inhibierenden Agens pro ml Lösung gelöst ist. Die Formulierung kann ferner einen Puffer und einen einfachen Zucker mit einschließen (bspw. zur Stabilisierung des Adhäsions-inhibierenden Agens und zur Regulation des osmotischen Drucks). Die Zerstäu ber-Formulierung kann ferner einen oberflächenaktiven Stoff enthalten, um eine oberflächeninduzierte Aggregation des Adhäsions-inhibierenden Agens zu reduzieren oder zu verhindern, welche durch die Atomisierung der Lösung bei der Bildung des Aerosols verursacht wird.
Formulierungen, die mit einem Dosierungs-Inhalationsgerät zum Einsatz kommen, werden im Allgemeinen ein feingesiebtes Pulver aufweisen, welches das Adhäsions-inhibitorische Agens (oder ein Derivat davon) enthält, wobei das Pulver in einem Treibmittel mit Hilfe eines oberflächenaktiven Stoffes suspendiert ist. Das Treibmittel kann jedes Material sein, das üblicherweise für diesen Zweck verwendet wird, wie bspw. ein Chlorfluorkohlenstoff, ein Hydrochlorfluorkohlenstoff, ein Hydrofluorkohlenstoff oder ein Kohlenwasserstoff, einschließlich Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlortetrafluorethanol, und 1,1,1,2-Tetrafluorethan, oder Kombinationen daraus. Geeignete oberflächenaktive Stoffe schließen Sorbitantrioleat und Sojalecithin mit ein. Auch Oleinsäure kann als oberflächenaktiver Stoff geeignet sein.
Die flüssigen Aerosol-Formulierungen enthalten das Adhäsionsinhibierende Agens sowie ein dispergierendes Agens in einem physiologisch akzeptierbaren Verdünnungsmittel. Die trockenen Pulver-Aerosol-Formulierungen der vorliegenden Erfindung bestehen aus einer feingesiebten festen Form des Adhäsions-inhibitorischen Agens sowie einem dispergierenden Agens. Sowohl bei der flüssigen als auch bei der trockenen Pulver-Aerosol-Formulierung müssen die Formulierungen aerolisiert werden. Dies bedeutet, dass die Formulierung in flüssige oder feste Partikel aufgebrochen werden muss, um abzusichern, dass die aerolisierte Dosis die Schleimhautmembranen der Nasenwege oder der Lunge auch tatsächlich erreicht. Der Ausdruck „Aerosolpartikel" wird hierin verwendet, um den festen oder flüssigen Partikel zu beschreiben, der für eine nasale oder pulmonäre Verabreichung geeignet ist, das heißt, derjenige, der die Schleimhautmembranen erreicht. Ferner sind andere Überlegungen, wie bspw. die Konstruktion einer Abgabevorrichtung, zusätzliche Komponenten in der Formulierung und Partikel-Eigenschaften, wichtig. Diese Aspekte der pulmonären Verabreichung eines Arzneimittels sind im Stand der Technik hinreichend bekannt, und zur Abänderung der Formulierungen, Aerolisierungsmittel und für die Konstruktion einer Abgabevorrichtung sind höchstens Routineversuche durch den Durchschnittsfachmann notwendig.
In einer besonderen Ausführungsform wird der durchschnittliche massendynamische Durchmesser 5 μm oder weniger sein, um abzusichern, dass die Arzneimittelpartikel die Lungenalveoli erreichen [Wearley, L. L., Crit. Rev. in Ther. Drug Carrier Systems, 8: 333 (1991)].
Systeme zur Aerosolabgabe, bspw. in Form von. druckbetriebenen Dosisinhalatoren und Inhalatoren mit trockenem Pulver sind in Newman, S. P., Aerosols and the Lung, Clarke, S. W. und Davia, D., Herausgeber, Seiten 197–22 beschrieben und können in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform, wie detailliert nachstehend beschrieben, kann eine Aerosol-Formulierung der vorliegenden Erfindung andere therapeutische oder pharmazeutisch aktive Inhaltsstoffe zusätzlich zu dem Adhäsions-inhibierenden Agens aufweisen, wie bspw. ein Antibiotikum, ein Steroid, ein nicht steroides antiinflammatorisches Arzneimittel, etc., sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Flüssige Aerosol-Formulierungen. Die vorliegende Erfindung stellt Aerosol-Formulierungen und Dosierungsformen zur Verwendung in der Behandlung von Subjekten bereit, die an einer bakteriellen, wie bspw. an einer Streptococcen-, insbesondere einer Pneumococcen-, Infektion leiden. Im Allgemeinen enthalten solche Dosierungsformen ein Adhäsions-inhibierendes Agens in einem pharmazeutisch akzeptierbaren Verdünnungsmittel. Pharmazeutisch akzeptierbare Verdünnungsmittel schließen steriles Wasser, Saline, gepufferte Saline, Dextroselösung und Ähnliches mit ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. In einer spezifischen Ausführungsform ist ein Verdünnungsmittel, das in der vorliegenden Erfindung oder der pharmazeutischen Formulierung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, phosphatgepufferte Saline oder eine gepufferte Salinelösunq mit einem pH-Wert von im Allgemeinen 7,0 bis 8,0, oder Wasser.
Die flüssige Aerosol-Formulierung der vorligenden Erfindung kann wahlweise Inhaltsstoffe mit einschließen, wie pharmazeutisch akzeptierbare Träger, Verdünnungsmittel, solubilisierende Stoffe oder Emulgatoren, oberflächenaktive Stoffe und Arzneimittelträger.
Die Formulierung kann ferner einen Träger mit einschließen. Der Träger ist ein Makromolekül, das im Kreislaufsystem löslich ist und das dort physiologisch akzeptierbar ist, wo eine physiologische Akzeptanz bedeutet, dass der Fachmann eine Injektion des besagten Trägers in einen Patienten als Teil eines therapeutischen Plans vornehmen würde. Der Träger ist im Kreislaufsystem vorzugsweise relativ stabil, mit einer akzeptierbaren Plasma-Halbwertzeit. Solche Makromoleküle schließen Sojalecithin, Oleinsäure und Sorbitantrioleat mit ein, sind jedoch nicht hierauf beschränkt, wobei Sorbitantrioleat bevorzugt ist.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können ferner andere Agenzien mit einschließen, die für die Aufrechterhaltung des pH-Wertes, die Stabilisierung der Lösung oder für die Regulation des osmotischen Drucks nützlich sind. Beispiele solcher Agenzien schließen Salze, wie bspw. Natriumchlorid oder Kaliumchlorid, mit ein, sowie Kohlenwasserstoffe, wie bspw. Glucose, Galactose oder Mannose, oder Ähnliches, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Die vorliegende Erfindung zieht ferner flüssige Aerosol-Formulierungen in Betracht, welche ein Adhäsions-inhibierendes Agens sowie ein weiteres, therapeutisch effektives Arzneimittel aufweisen, bspw. ein Antibiotikum, ein Steroid, ein nichtsteroidisches antiinflammatorisches Arzneimittel, etc.
Trockene Aerosol-Pulver-Formulierungen. Ferner wird in Betracht gezogen, dass die vorliegenden Aerosol-Formulierungen als trockene Pulverformulierungen hergestellt werden können, die eine feingesiebte Pulverform des Adhäsions-inhibitorischen Agens und ein Dispergierungsmittel aufweisen.
Formulierungen zur Dispensierung aus einer Pulver-Inhalationsvorrichtung wird ein feingesiebtes trockenes Pulver aufweisen, welches das Adhäsions-inhibierende Agens (oder ein Derivat davon) aufweisen, und kann ferner einen Füllstoff mit einschließen, wie bspw. Lactose, Sorbitol, Sucrose oder Manni tol, und zwar in Mengen, die die Dispersion des Pulvers aus der Vorrichtung erleichtern, wie bspw. 50 bis 90 Gew.-% der Formulierung. Das Adhäsions-inhibierende Agens (oder ein Derivat davon) sollte für eine effektivste Abgabe an die distale Lunge am bevorzugtesten in Partikelform mit einer durchschnittlichen Partikelgröße mit weniger als 10 mm (oder μm) hergestellt werden, am bevorzugtesten von 0,5 bis 5 mm.
In einer anderen Aerosol-Formulierung kann die trockene Pulverformulierung ein feingesiebtes trockenes Pulver aufweisen, welches das Adhäsions-inhibierende Agens enthält, ferner ein Dispersionsmittel und ein Füllmittel. Füllmittel, die in Verbindung mit der vorliegenden Formulierung geeignet sind, schließen Stoffe wie Lactose, Sorbitol, Sucrose oder Mannitol in Mengen mit ein, die die Dispersion des Pulvers aus der Vorrichtung erleichtern.
Die vorliegende Erfindung zieht ferner trockene Pulverformulierungen in Betracht, welche das Adhäsions-inhibierende Agens und ein weiteres therapeutisch effektives Arzneimittel aufweisen, wie bspw. ein Antibiotikum, ein Steroid, ein nichtsteroidisches antiinflammatorisches Arzneimittel, etc.
Identifizierung von Antagonisten von CBPs in Form kleiner Moleküle
Die Identifizierung und Isolierung eines Gens, das für ein Cholin-bindendes Protein gemäß der Erfindung codiert, stellt die Expression des Proteins in Mengen bereit, die größer sind als diejenigen, die aus natürlichen Quellen isoliert werden können, oder in Indikatorzellen, die spezifisch dafür entwi ckelt wurden, die Aktivität eines CBP anzuzeigen, das nach der Transfektion oder Transformation der Zellen exprimiert wird. Zusätzlich zu der rationellen Bildung von Agonisten und Antagonisten, die auf der Struktur des Cholin-bindenden Proteins basiert, zieht die vorliegende Erfindung darüber hinaus ein alternatives Verfahren zur Identifizierung von spezifischen Liganden eines Cholin-bindenden Proteins in Betracht, und zwar unter Verwendung verschiedener Screeningassays, die im Stand der Technik bekannt sind. Beispiele von Antagonisten in Form kleiner Moleküle von CBPs schließen Lysin, Cholin, das Pentapeptid mit der SEQ ID Nr. 11 mit ein; es ist wahrscheinlich, dass die Analoga dieser Typen an Molekülen, wie bspw. Arginin, die bakterielle Adhäsion an das Wirtsgewebe ebenfalls inhibieren werden, insbesondere an Fibronectin.
Jedes im Stand der Technik bekannte Screening-Verfahren kann dazu eingesetzt werden, nach Agonisten oder Antagonisten eines Cholin-bindenden Proteins zu screenen. Bei der vorliegenden Erfindung werden Screens hinsichtlich Liganden oder Liganden-Analoga und diese nachahmende in Form kleiner Moleküle in Betracht gezogen, ebenso wie Screens hinsichtlich natürlicher Liganden, die an ein Cholin-bindendes Protein binden und die Aktivitäten dieses Proteins in vivo fördern oder diesem entgegenwirken, insbesondere die Adhäsion von Bakterien an Wirtszellen oder Geweben, die durch das Cholin-bindende Protein vermittelt wird.
Mit dem Wissen über die Primärsequenz des CBPs und der Ähnlichkeit dieser Sequenz mit Proteinen bekannter Funktion kann ein Ausgangspunkt für Inhibitoren oder Antagonisten des Proteins bereitgestellt werden. Die Identifizierung und das Screenen von Antagonisten wird ferner durch die Bestimmung struktureller Merkmale des Proteins erleichtert, bspw. unter Verwendung von Röntgenstrahlen-Kristallographie, Neutronenbeugung, magnetische Kernresonanz-Spektrometrie sowie andere Techniken zur Strukturbestimmung. Mit diesen Techniken kann das rationelle Design oder die Identifizierung von Agonisten und Antagonisten bereitgestellt werden.
Bei einem anderen Einsatz werden rekombinante Bakteriophagen eingesetzt, um große Bibliotheken herzustellen. Mit dem „Phagen-Verfahren" (Scott und Smith, 1990, Science, 249: 386–390; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 6378–6382; Devlin et al., 1990, Science, 249: 404–406), können sehr große Bibliotheken konstruiert werden (10⁶–10⁸ chemische Einheiten). Bei einem zweiten Ansatz werden hauptsächlich chemische Verfahren eingesetzt, wie bspw. das Geysen-Verfahren (Geysen et al., 1986, Molecular Immunology, 23: 709–715; Geysen et al., 1987, J. Immunologic Method, 102: 259–274) sowie das neuere Verfahren von Fodor et al. (1991, Science, 251: 767–773). Furka et al. (1988, 14. Internationaler Biochemiekongress, Volume 5, Abstract FR:013; Furka 1991, Int. J. Peptide Protein Res., 37: 487–493), Houghton (US-Patent mit der Nummer 4,631,211, erteilt im Dezember 1986) und Rutter et al. (US-Patent Nr. 5,010,175, erteilt am 23. April 1991) beschreiben Verfahren zur Produktion einer Mischung von Peptiden, die als Agonisten oder Antagonisten getestet werden können.
In einem anderen Aspekt können synthetische Bibliotheken (Needles et al., 1993, „Generation and screening of an oligonucleotide encoded synthetic peptide library", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10700–4; Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10922–10926; Lam et al., internationale Patentanmeldung mit der Nummer WO 92/00252; Kocis et al., internationale Patentanmeldung mit der Nummer WO 94/28028) und Ähnliche dazu verwendet werden, nach Liganden für Cholin-bindende Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung zu screenen.
Das Screening kann mit rekombinanten Zellen durchgeführt werden, die das Cholin-bindende Protein exprimieren, oder alternativ mit gereinigtem Protein, das bspw. rekombinant produziert wurde, wie oben beschrieben. So kann bspw. die Fähigkeit eines markierten, löslichen oder gelösten Cholin-bindenden Proteins, welches den Liganden-bindenden Abschnitt des Moleküls mit einschließt, den Ligand zu binden, zum Screenen von Bibliotheken eingesetzt werden, wie in den zuvor genannten Referenzen beschrieben.
Die nachstehenden Beispiele werden aufgeführt, um bevorzugte Ausführungsformen genauer darzustellen. Sie sollen jedoch keineswegs den breiten Rahmen der Erfindung begrenzen.
BEISPIELE: VORÜBERLEGUNGEN
Mit der vorliegenden Erfindung wird eine Familie von CBPs bereitgestellt, die Oberflächenproteine sind, und die als Adhäsine dienen, die für die Bindung von Pneumococcus an eukaryotische Zellen kritisch sind, welcher an den Infektionsstellen gefunden wird. Mit der vorliegenden Erfindung werden ferner ein neues CBP, CbpA, als ein Adhäsin und eine Determinante der Virulenz identifiziert und charakterisiert. Darüber hinaus zeigt die vorliegende Erfindung, dass diese Proteine immunogen sind, und daher als schützende Antigene wirken können.
Unter Verwendung von an Agarose-Kügelchen gebundenem Cholin wurde eine Familie von mindestens 12 bakteriellen Cholinbindenden Proteinen (CBPs), einschließlich LytA, aus einem Serotyp II, PspA^--Pneumococcus-Stamm, gereinigt. Die Markierung der ganzen Bakterien mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) legte nahe, dass vier dieser CBPs oberflächenexprimiert waren, während Seren von genesenden Menschen mit fünf der CBPs kreuzreagierten. Es konnte zuvor gezeigt werden, dass Pneumococcus an Typ II Lungenzellen (LC) und Endothelzellen (EC) des peripheren Gefäßsystems bindet. Im Vergleich zu den Kontrollen blockierte die CBP-Fraktion Pneumococcen-Adhärenz an LC um 45 % und an EC um 89 %, und zwar in einer Dosis-abhängigen Art und Weise. Die CBP-Fraktion wurde dann zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt, und für die Versuche zur passiven Immunisierung wurden polyklonale Antikörper eingesetzt. Die N-terminale und interne Aminosäuresequenz, die aus den drei CBPs gewonnen wurde, zeigte keine Ähnlichkeit mit irgendeiner bekannten Proteinsequenz. Darüber hinaus ist ein überwiegendes Mitglied dieser Proteinfamilie, CbpA, ein 112 kDa Oberflächenprotein, das mit Serum von genesenden Menschen reagiert. Die Sequenzanalyse des korrespondierenden Gens zeigte eine einzigartige N-terminale Sequenz und sechs C-terminale Cholin-bindende Domänen in der C-terminalen Region.
BEISPIEL 1: IDENTIFIZIERUNG VON PNEUMOCOCCEN-CHOLIN-BINDENDEN PROTEINEN
Material und Methoden
Stämme. Die eingesetzten Bakterienstämme schlossen Folgende mit ein: (1) R6, ein unverkapselter Bakterienstamm, abgeleitet von D39 (Typ 2), unverkapselt, (2) AII verkapselt, (3) LM91, abgeleitet von D39 (eingekapselt), der PspA- ist, und (4) Lyt-, abgeleitet von D39, unverkapselt.
Zellkultur und Reinigung der Cholin-bindenden Proteine. 0,1 ml Kulturen von LM91 (–80°C Stammlösung) wurden in 10 ml C + Y halbsynthetischem Medium bei 37°C 5 Stunden lang kultiviert. Diese 10-ml-Kultur wurde anschließend zur Beimpfung von 400 ml C + Y verwendet, und diese Kultur wurde anschließend 5 Stunden lang bei 37°C in 5 % CO₂ bis zu einer OD₆₂₀ von 0,6 inkubiert. Zu dieser Mischung wurden 10 ml Cholin-Agarose-Kügelchen (cholin agarose beads), (CAB), hinzugefügt, und die Mischung anschließend 30 Minuten bei 37°C in 5 % CO₂ unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Die Bakterien und die Kügelchen wurden bei 4°C 15 Minuten lang mit 8000 × g zentrifugiert, und das Pellet in 50 ml Restmedium (C + Y) resuspendiert. Zu diesen 50 ml wurden 20 μg/ml Leupeptin, 100 μg/ml PMSF und 250 μl Triton X100 auf eine Endkonzentration von 0,5 % hinzugefügt. Diese Mischung wurde 20 bis 30 Minuten lang so lange rotiert, bis die Lösung klar wurde, was darauf hindeutete, dass alle Bakterien lysiert waren. Anschließend wurden die CAB auf einem Glasfilter mit DPBS/1 M NaCl gewaschen. Die CAB wurden dann mit 2 Wechseln von 50 ml DPBS/1 M NaCl inkubiert und die Kügelchen wiederum auf einem Glasfilter gewaschen.
Reinigung der Cholin-bindenden Proteine. Die Cholin-bindenden Proteine (CBPs) wurden mit 3 Waschschritten von 5 ml DPBS/10 % Cholin eluiert. Die eluierten CBPs wurden mit einem Ultrafree-20-Konzentrator (Millipore) auf 1,5 ml konzentriert, und anschließend gegen PBS dialysiert.
Herstellung von Kaninchen-Anti-CBP-Antiserum. Die Cholinbindenden Proteine, die wie oben beschrieben von der Cholin-Affinitätssäule isoliert wurden, wurden konzentriert und in einem Impfstoff zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt, um ein Anti-CBP-Antiserum herzustellen. Hierfür wurden New Zealand White-Kaninchen durch eine intradermale Injektion in den Rücken mit 500 μg gereinigten CBPs in 1 ml eines 1:1 Emulsionspuffers und vollständigem Freund'schem Adjuvans immunisiert. Nach der 3., 6., 9., 12. und 15. Woche wurden die Kaninchen mit einer subkutanen Injektion in den Rücken mit 250 μg gereinigten CBPs in 1 ml von Puffer zu unvollständigem Freund'schem Adjuvans 1.1 nochmals immunisiert. Vor den Versuchen wurde den Kaninchen Blut entnommen, sowie Testblut nach ungefähr 10 Tagen vor jeder neuen Immunisierung. Das nach 16 Wochen gewonnene Serum wurde in allen Experimenten verwendet.
Die CBPs wurden mittels SDS-PAGE und Western Blots unter Verwendung der folgenden Antikörper untersucht: (1) polyklonaler Anti-Pneumococcen-Serum-Antikörper (Kaninchen oder „ROB"); (2) anti-PspA-monoklonaler Antikörper; (3) anti-FITC-monoklonaler Antikörper; (4) Anti-Pneumococcen-Seren von genesenden Menschen und (5) polyklonaler Anti-CBP-Antikörper. 9 CBPs wurden auf der SDS-PAGE/dem Western Blot identifiziert. Die Ergebnisse sind den 1 und 2 gezeigt.
BEISPIEL 2: CHARAKTERISIERUNG DER PNEUMOCOCCEN-CHOLIN-BINDENDEN PROTEINE
Die über die SDS-PAGE isolierten CBPs wurden einer N-terminalen Aminosäure-Sequenzanalyse unterzogen. Die aus einer Cholin-Agarosesäule gewonnene Proteinfraktion, die mit 0,5 M Cholinch lorid eluiert wurde, wurde auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und anschließend auf eine PVDF-Membran übertragen und hinsichtlich der Proteine gefärbt. Die einzelnen Banden wurden ausgeschnitten und die N-terminale Aminosäuresequenz durch einen Edman-Abbau erhalten. Die internen Sequenzdaten wurden von Peptidfragmenten gewonnen, die durch einen Proteaseverdau gewonnen wurden. Die Aminosäuren-Sequenzdaten für 8 der 9 CBPs betrugen wie folgt:
CBP112 XENEGSTQAATSSNMAKTEHRKAAKQVVDE (SEQ ID Nr. 1)
CBP90 AREFSLEKTR (SEQ ID Nr. 2)
CBP84 XREFSLEKTRNIGIMAHVDAGKT (SEQ ID Nr. 3)
CBP80 XKXXWQXKQYLKEDGSQAANEXVFDTA (SEQ ID Nr. 4)
CBP78 QKIIGIDLGTTNSAVAVLEGTESKIIANPE (SEQ ID Nr. 5)
CBP70 XXXEVAKXSQDTTTAS (SEQ ID Nr. 6)
CBP60 XNERVKIVATLGPAVEGRG (SEQ ID Nr. 7)
CBP50 XIIXXVYAREVLDSRGNP (SEQ ID Nr. 8)
CBP112-Int1 EDRRNYHPTNTYK (SEQ ID Nr. 9)
CBP112-Int2 XDDQQAEEDYA (SEQ ID Nr. 10)
Keine der Sequenzen ist zuvor identifiziert worden, mit der Ausnahme, dass CBP84 zu 85 % mit dem Elongationsfaktor G (EF-G) identisch war, und DBP50 ähnlich zu Enolase.
BEISPIEL 3: PNEUMOCOCCEN-CHOLIN-BINDENDE PROTEINE BLOCKIEREN DIE ADHÄRENZ
Die in Beispiel 1 isolierte CBP-Fraktion wurde in Adhärenz-Assays eingesetzt, um ihren Effekt auf die Pneumococcen-Adhärenz an Typ II-Lungenzellen (LC) und Endothelzellen des Gefäßsystems (EC) zu bestimmen, wie in der internationalen Patentanmeldung PCT/US95/07209, angemeldet am 6. Juni 1995 von Tuomanen und Cundell, beschrieben. Die CBP-Fraktion blockierte die Pneumococcen-Adhärenz an LC um 45 % und an EC um 89 %, und zwar in einer dosisabhängigen Art und Weise (siehe jeweils 3 und 4).
BEISPIEL 4: DAS 50KD CHOLIN-BINDENDE PROTEIN VERMITTELT DIE PNEUMOCOCCEN-ADHÄSION
Durch die Adhärenz an extrazelluläre Matrixproteine, wie bspw. Fibronectin (siehe 6), ist es Pathogenen möglich, in verletzte Epithelien einzudringen. Von S. pneumoniae ist bekannt, dass es an immobilisiertes Fibronectin an einer Stelle innerhalb der C-terminalen Heparin-bindenden Domäne adhäriert [van der Flier et al., Infect. Immun., 63: 4317–4322 (1995)]. Andere Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass diese Region auch den Leukocyten-Integrin-Adhäsionsrezeptor α4β1 bindet. Ferner konnte gezeigt werden, dass das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAN-1) Sequenzen enthält, die zu IIICS homolog sind, welche die Bindestellen für α4β1 sind. Mit diesem Beispiel sollte unter anderem untersucht werden, ob S. pneumoniae – ähnlich wie α4β1 – Fibronectin und VCAM-1 kreuzerkennt.
Die Adhärenz von S. pneumoniae an immobilisiertes Fibronectin wurde zu 96 % durch die Vorinkubation der Bakterien mit rekombinantem löslichem VCAM-1 inhibiert. S. pneumoniae adhärierte ferner direkt an mit VCAM-1 beschichteten Vertiefungen, und zwar mit einer Dichte von 75 ±18 Bakterien/0,25 mm². Dies stellt 6 % der Adhärenz der Pneumococcen an Gesamtfibronectin dar. Die S. pneumoniae-Adhärenz-Spezifität wurde ferner durch Überprüfung der Adhärenz an Fragmente der 33 kDa Heparin bindenden Domäne von Fibronectin charakterisiert. Verschiedene Fragmente der 33-kDa-Domäne wurden als GST-Fusionsproteine exprimiert. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Die Bakterien adhärierten ungefähr gleich an die rekombinanten Fragmente 33/66, 51 und 15. Durch weitere Versuche unter Verwendung von vier synthetischen Peptiden, die auf der III14-Region basierten, konnte das Peptid FN5 (WQPPRARI (SEQ. ID Nr. 11)) identifiziert werden, das dazu in der Lage war, die Adhärenz von S. pneumoniae zu unterstützen (7). Antikörper gegen FN5 inhibierten die Adhärenz der Pneumococcen an sowohl Gesamtfibronectin als auch an VCAM-1 (jeweils 92 und 69 %). Dieses Beispiel zeigt, dass S. pneumoniae durch ähnliche Mechanismen an VCAM-1 und Fibronectin bindet, wodurch den Pneumococcen Zugang zu Leukocytenwegen ermöglicht wird, wodurch der Fortschritt der Krankheit gefördert wird.
Ein Adhäsin auf der Oberfläche von S. pneumoniae ist das 50 kDa Cholin-bindende Protein. Die Vorinkubation der Bakterien in einer 10 % Cholinlösung, um an Cholin gebundene Oberflächenproteine abzulösen, resultierte in eine mehr als 50%ige Absenkung der Bindung der Pneumococcen an Fibronectin (8). Bakterien, die anstelle von Cholin in Anwesenheit von Ethanolamin kultiviert wurden, so dass sie auf ihren Oberflächen keine Cholin-bindenden Proteine aufweisen, konnten nicht an Fibronectin binden (> 85 % Inhibierung) (Daten nicht gezeigt). Die Pneumococcenbindung wurde um mehr als 95 % von 1:10 bis 1:5000 Verdünnungen des Anti-Cholin-Antikörpers, TEPC15, abgesenkt (9). Präparationen von Cholin-bindenden Proteinen aus S. pneumoniae inhibierten die Adhärenz der Pneumococcen an Fibronectin vollständig (75 bis 90 % Inhibierung) (Daten nicht gezeigt).
Um die Identität des Adhäsinproteins auf der Oberfläche von Pneumococcus zu identifizieren, wurden French-Press-Lysate und Präparationen der Cholin-bindenden Proteine durch die SDS-PAGE getrennt, und auf Immobilon-PVDF-Membranen geblottet. Die Membranen wurden anschließend mit einer Fibronectinlösung über mehrere Stunden hinweg inkubiert. Nach Abwaschen des ungebundenen Proteins wurde das gebundene Fibronectin durch Chemolumineszenz detektiert. Sowohl im Gesamtzelllysat als auch in den Präparationen mit Cholin-bindenden Proteinen wurde eine Bande mit ungefähr 50 kDa beobachtet. Durch die Amino-terminale Proteinsequenzierung dieser Bande konnte dieses Protein als ein Homolog des glycolytischen Enzyms Enolase (2-Phospho-D-Glycerathydrolase) identifiziert werden. In dem 18 Aminosäuren langen Rest, der durch den BLAST-Algorithmus analysiert wurde, wurde eine 16-Reste-Region identifiziert, die mit der Enolase von Bacillus subtilis ein 93%ige Identität (15/16) aufwies (10).
Das Hinzufügen des glycolytischen Enzyms Enolase (Sigma) an mit Fibronectin beschichteten Vertiefungen vor dem Hinzufügen von Bakterien resultierte in die Inhibierung der Pneumococcen-Adhärenz an Fibronectin (11). Die Inhibierung war dosisabhängig. Mit 1000 U/ml Enolase wurde eine maximale Inhibierung (98 %) beobachtet. Es wurde keine Pneumococcen-Adhärenz an Enolase-beschichtete Vertiefungen beobachtet.
Von Enolase wurde gezeigt, dass sie über ihren Carboxyterminalen Lysinrest an Plasminogen adhäriert. Die Adhärenz von S. pneumoniae an gesamtes Fibronectin ist L-Lysin-abhängig. Lysin wurde 15 Minuten vor der Hinzufügung der Bakterien zu Fibronectin-beschichteten Vertiefungen hinzugefügt. Die Pneumo coccen-Adhärenz wurde jeweils um 67 %, 95 % und 99 % jeweils durch 0,1 M, 0,5 M und 1 M L-Lysin inhibiert (12). Das Lysinanalogon, 6-Aminohexansäure, konnte die Adhärenz nicht inhibieren.
S. pneumoniae-French-Press-Lysate wurden auf eine Säule mit Fibronectin-beschichteten Sepharose-Kügelchen gegeben. Die adhärierenden Proteine wurden vollständig mit L-Lysin (0,01 bis 0.5 M) eluiert und mit SDS-PAGE analysiert. In allen Fraktionen wurde eine Bande mit ungefähr 50 kDa beobachtet (13). Diese Bande wanderte auf gleicher Höhe wie die kommerzielle Enolase (Sigma).
Die Teilsequenz für das Enolasegen sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz wurde gewonnen (SEQ ID Nrn. 10 und 20). Ein Vergleich der DNA und der abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Pneumococcus und B. subtilis sind jeweils in den 14 und 15 gezeigt. Auf dem DNA-Level gibt es eine 74%ige Identität, und eine 72%ige, 85%ige Ähnlichkeit auf dem Aminosäurenlevel. Vollständigere Sequenzdaten für die CBP-50-Enolase, der lediglich eine vermeintliche 42-Basen-5'-Abfolge/eine 14-Aminosäuren-N-terminale Abfolge fehlt, ist jeweils in den SEQ ID Nrn. 18 und 19 gezeigt.
Zusätzlich zu der Bindung an Fibronectin und an VCAM besitzt das Enolase-Homolog zwei weitere Eigenschaften, die mit der Virulenz in Zusammenhang stehen. Es bindet an Alpha-1-Säure-Glycoprotein (AGP), das mit Kohlenwasserstoffen ausgestattet ist, die die Schlüsseldeterminanten der Bindung an aktivierte eukaryotische Zellen sind. AGP wurde an eine Säule fixiert und anschließend ein Pneumococcen-Lysat über die Säule gegeben, sowie die an der Säule zurückgehaltenen Proteine eluiert. Ein 50-kDa-Protein wurde spezifisch eluiert, von dem nach einer N-terminalen Aminosäuresequenzierung gezeigt werden konnte, dass es das Enolase-Homolog ist. Eine zweite Eigenschaft des Enolase-Homologs ist es, dass es offenbar nicht in avirulenten Pneumococcen vorliegt, welche Phasenvariationen in Richtung lichtundurchlässiger Koloniemorphologien besitzen. Wenn die Proteine, die aus mit 2 % Cholin behandelten Pneumococcen eluiert wurden, zwischen lichtundurchlässigen und transparenten Stämmen verglichen wurden, fiel auf, dass den lichtundurchlässigen Stämmen ein 112-kDa-Protein und das 50-kDa-Protein fehlte. Dies deutet darauf hin, dass die mangelnde Virulenz mit der fehlenden Expression des Enolase-Homologs verbunden ist, und dass daher das Enolase-Homolog eine echte Virulenzdeterminante ist.
Material und Methoden
Bakterielle Stämme und Wachstumsbedingungen. S. pneumoniae vom Typ 2 (D39) und die isogenen, nicht-verkapselten Derivate R6x und R6 wurden eingesetzt. Der Pneumococcen-Stamm LM34, der hinsichtlich der Produktion des Pneumococcen-Oberflächenproteins A (pspA-) deletiert ist, wurde bereits beschrieben [McDaniel et al., Infect. Immun., 59: 222–9 (1991)]. Die Bakterien wurden auf tryptischem Sojaagar mit 5 % Schafsblut 16–18 Stunden lang bei 37°C mit 5 % CO₂ kultiviert, oder aber in einem Kerzenauslöschbehälter.
Fibronectin und abgeleitete proteolytische Fragmente. Fibronectin aus menschlichem Plasma wurde bei Sigma (St. Louis, MO) und von Gibco BRL (Grand Island, NY) erworben. Die Fragmente sind nach ihrer Molekulargröße benannt und schematisch in 5 wiedergegeben. Die von Gibco BRL erworbenen proteolytischen Fragmente (in 5 in Klammern gezeigt) schlossen ein tryptisches 30kD Collagen-bindendes Fragment, ein α-chymotryptisches 120kD zellbindendes Fragment und ein α-chymotryptisches 40kD Heparin-bindendes Fragment mit ein. Die proteolytischen Fragmente, die nach dem Verfahren von Vercelotti et al. [Vercellotti et al., J. Lab. Clin. Med., 103: 34–43 (1984); McCarthy et al., 1986, siehe oben] (in 5 in den Kästchen gezeigt) hergestellt wurden, schlossen ein 27kD Amino-terminales Fragment, ein 46kD Collagen-bindendes Fragment, ein 75kD zellbindendes Fragment, ein 33kD Heparin-bindendes Fragment, assoziiert mit einem zweiten 66kD Fragment (33/66kD Fragment) und ein 31kD Carboxy-terminales Fragment mit ein. Rekombinante Fragmente aus der 33kD-Domäne (siehe 5) wurden, wie anderswo beschrieben, hergestellt [Huesbsch et al., Cir. Res., 77: 43 (1995); Verfaille et al., Blood, 84: 1802 (1994)].
Bindungsassay an immobilisiertes Fibronectin, VCAM und Fragmente. Fibronectin, dessen rekombinante Fragmente oder rsVCAM wurden durch passive Adsorption an 60-Well-Terasaki-Platten (befeuchtbares Polystyrol [plasmabehandelt] Robbins Scientific, Sunnyvale, CA) nicht-kovalent immobilisiert. Hierzu wurden – kurz beschrieben – Substrate (50 mg/mg) in phosphatgepufferter Saline (DPBS) rekonstituiert und es ihnen ermöglicht, die Teresaki-Platten 90 Minuten lang bei 37°C zu beschichten. Anschließend wurde die Polystyroloberfläche mit 5 % Rinderserumalbumin (Sigma) über einen Zeitraum von mindestens 3 Stunden bei 37°C blockiert. Vor ihrem Einsatz wurden die Platten fünfmal mit DPBS gewaschen und die überschüssige Flüssigkeit aus den Vertiefungen entfernt. Mit diesem Verfahren konnte gezeigt werden, dass es zu der bevorzugten dichten, Multischicht-Packung der adsorbierten Fibronectin-Moleküle führte (2,7 μg/cm²) (van der Flier et al., 1995, siehe oben).
Die Bakterien wurden mit Fluoresceinisothiocyanat, wie zuvor beschrieben, markiert (Geelen et al., Infect. Immun., 61: 1538–1543 (1993)] und wurden in DPBS, ergänzt mit 0,05 % Glucose und Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ resuspendiert. Die bakteriellen Suspensionen wurden auf eine A₆₂₀ von 0,04 eingestellt, was nach vorherigen Berechnungen zu Folge einmal 10⁷ cfu/ml von S. pneumoniae gleichkommt. 10 μl Bakterien wurden in jede Vertiefung gegeben und statisch 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die ungebundenen Bakterien wurden durch fünfmaliges Waschen mit DPBS entfernt. Die gebundenen Bakterien wurden durch Inkubation mit 2,5 % Glutaraldehydlösung für 3 Minuten lang auf der Oberfläche fixiert. Anschließend wurden die Bakterien optisch mit einem Umkehrphasenmikroskop (Nikon) mit Fluoreszenz mit einem IF DM 510-Filter ausgezählt. Die Bindung wurde als Anzahl der angehafteten Bakterien pro 0,25 mm² Oberfläche ausgedrückt. Die Werte wurden hinsichtlich einer unspezifischen Bindung dahingehend korrigiert, dass die Adhärenz an unbeschichtete Vertiefungen abgezogen wurde, und sind als Mittelstandardabweichungen von mindestens 3 Experimenten mit 3 bis 6 Vertiefungen/Platte/Experiment dargestellt. Bei einigen Experimenten wurde die Bindung in Gegenwart eines Kaninchen-polyklonalen Anti-Pneumococcus-R6-Antikörpers oder einer der folgenden monoklonalen Antikörper durchgeführt: Anti-Cholin (TEPC-15), Anti-PspA Xi126 und XiR278 [McDaniel et al., Microb. Pathog., 13: 261–9 (1992)]; Anti-Pneumococcen-Oberflächenadhäsin A PsaA [Sampson et al., Infect. Immun., 62: 319–324 (1994)]; Anti-VLA-4 (R & D Systems); und Anti-VCAM-1 (R & D Systems). Alternativ wurde die mögliche Inhibierung der Pneumococcen-Bindung in Gegenwart von gereinigtem rekombinantem PspA oder PsaA bewertet.
BEISPIEL 5: DAS 112KD CHOLIN-BINDENDE PROTEIN, CBPA VERMITTELT DIE PNEUMOCOCCEN-ADHÄSION AN MENSCHLICHE ZELLEN
In diesem Beispiel wird das neue 112 kDa CBP weiter charakterisiert. Es fungiert als ein Adhäsin und vermittelt die Adhärenz an durch Cytokin aktivierte, menschliche Zellen und nimmt an der Pneumococcen-Besiedelung des Nasopharynx teil, und ist darüber hinaus eine Virulenzdeterminante.
Unter Verwendung von an eine feste Matrix immobilisiertes Cholin wurde eine Familie an CBPs aus einem pspA^--Pneumococcenstamm gereinigt. Polyklonale Antikörper gegen diese CBPs konnten Mäuse, die intraperitoneal mit einer tödlichen Pneumococcendosis infiziert wurden, passiv schützen. Das überwiegende Mitglied dieser Proteinfamilie, CbpA (oder CBP-112), ist ein 112 kDa Oberflächenprotein, das mit Seren von genesenden Menschen reagiert. Die Sequenzanalyse des korrespondierenden Gens zeigt eine einzigartige N-terminale Sequenz und eine C-terminale Domäne, die aus 10 sich wiederholenden Cholinbindenden Domänen besteht, ähnlich wie PspA. Eine cbpA-defektive Mutante zeigte eine mehr als 50%ige Reduktion in der Adhärenz an Cytokin-aktivierte menschliche Zellen und konnte ferner nicht an immobilisierte Sialinsäure oder Lacto-N-Neotetraose binden. Diese Mutante zeigte darüber hinaus in einem Tiermodell für die Besiedelung des Nasopharynx eine 100fache Reduktion in der Virulenz. Zwischen dem Elternstamm und dieser Mutante gibt es keinen Unterschied bezüglich einem intraperitonealen Sepsismodell. Diese Daten für CbpA unterstreichen die wichtigen Funktionen der CBP-Familie für die bakterielle Adhärenz und Virulenz, und stellen einen neuen Pneumococcen-Impfstoffkandidaten dar.
Material und Methoden
Stämme und Medien. Der Serotyp 2 S. pneumoniae-Stamm D39, R6x (nicht-verkapseltes Derivat von D39) Stamm SIII (Kapselserotyp 3) (jeweils erhalten von der Sammlung der Rockefeller Universität). Der Stamm P317 ist ein 6B-Kapselserotyp. Ein lytA-defizienter Stamm ist beschrieben worden [Tomasz, 1988]. LM91 wurde zuvor beschrieben (Larry McDaniel, University of Alabama, Birmingham, AL). Alle Stämme wurden auf tryptischen Sojaagarplatten, ergänzt mit Schafsblut (TSAB) auf eine Endkonzentration von 3 % (v/v) ausplattiert. Die Kulturen wurden ohne Belüftung bei 37°C in 5 % CO₂ in einem flüssigen Medium mit halbsynthetischem Caseinhydrolysat, ergänzt mit Hefeextrakt (C + Y Medium), wie in Beispiel 1 beschrieben, wachsen gelassen. Die Pneumococcen mit integrierten Plasmiden wurden in Gegenwart von 1 mg/ml^-1 Erythromycin wachsen gelassen. Die Koloniemorphologie wurde auf tryptischem Sojaagar beurteilt, auf welchem 5000 U Catalase (Worthington Biochemical Co., Freehold, NJ) hinzugefügt wurden.
Isolierung der CBPs. Zur Herstellung der immobilisierten Cholin-Affinitätsmatrix wurden Vinylsulfon-aktivierte Agarose-Kügelchen (1 g; Sigma, St. Louis, MO) zweimal mit 10 ml destilliertem Wasser gewaschen und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur in 10 mM Cholin in Natriumcarbonatpuffer, pH 11,5, rotiert. Anschließend wurden die Kügelchen wieder mit weiteren 10 ml PBS gewaschen, um ungebundenes Cholin zu entfernen.
Die Cholin-Agarose-Kügelchen wurden zu einer 400 ml Pneumococcenkultur (10⁸ cfu/ml) hinzugefügt und 30 min lang inkubiert. Der Bakterien-Kügelchen-Komplex wurde durch Zentrifugieren bei 8000 × g für 15 min pelletiert und in 50 ml C + Y Medium resuspendiert. Die Bakterien wurden mit Triton X-100 (0,5 %; rotieren für 20 min) in Gegenwart von Leupeptin (20 mg/ml^-1) und Phenylmethylsulfonylfluorid (100 mg/ml^-1) lysiert. Das Lysat wurde bei 1000 × g 5 min lang zentrifugiert, um die Kügelchen zu pelletieren. Anschließend wurden die Kügelchen mit drei Volumen (30 ml) an phosphatgepufferter Saline (PBS), angepasst an 0,5 M NaCl, gewaschen, um unspezifisch gebundenes Material zu entfernen. Das spezifisch gebundene Cholin-Material wurde mit PBS, angepasst auf eine Endkonzentration von 10 % Cholin (w/v), eluiert. Dieses Eluat wurde anschließend gegen PBS dialysiert und durch ein Centricon 10-Ultrafilter (Amicon Inc. Beverly, MA) konzentriert. Das zurückbleibende Material enthielt die CBPs.
Analytische und immunologische Methoden. Die CBPs wurden durch eine 7,5%ige SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gel-Elektrophorese) und durch Western Blot nach einem elektrophoretischen Transfer auf eine Immobilon-P-Transfermembran (Millipore Corporation, Bedford, MA) analysiert. Bei einigen Experimenten wurden die Pneumococcen mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC), wie für das Adhärenz-Assay beschrieben, markiert. Die Western Blot-Analyse wurde mit anti-FITC (Molecular Probes), anti-CBP oder mit Antiseren von Genesenden jeweils mit einer Verdünnung von 1:1000 durchgeführt. Die gebundenen Anti körper wurden mit Peroxidase detektiert, die mit Ziegen-anti-Kaninchenserum konjugiert war, mit dem Chemolumineszenz-Kit von Amersham (Cambridge, MA) detektiert. Die Seren der Genesenden waren eine Mischung aus Seren, die aus fünf Patienten gewonnen wurden und die einen Monat nach Genesung von der bakteriellen Infektion und von einer Lungenentzündung erhalten wurden. Die Kapselserotypen der infizierenden Pneumococcen waren 3, 7, 14, 22 und 23.
Für die Western-Blot-Analyse der CBPs in phänotypischen Varianten wurden lichtundurchlässige und transparente Varianten, abgeleitet vom Stamm R6, zu einer gleichmäßigen Dichte in C + Y Medium (O.D.₆₂₀ von 0,4) wachsen gelassen. Die Zellen wurden in PBS gewaschen und in 1/20 des ursprünglichen Kulturvolumens in PBS mit oder ohne 2 % Cholinchlorid resuspendiert. Die Zellen wurden 15 min lang inkubiert. Bei 4°C wurden die Zellen und die Überstandsfraktionen (Eluat) getrennt. Die Proteine in dem Eluat wurden auf 10 % SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt, auf Immobilon-P transferiert und mit dem Antiserum gegen die CBPs versetzt.
Um eine erste strukturelle Information aus den einzelnen CBPs zu erhalten, wurden konzentrierte Proben von den Cholin-Affinitätssäulen auf SDS-Polyacrylamid-Gele aufgetragen, und die aufgetrennten Proteine durch Elektrophorese auf eine Immobilon-P^SQ-Transfermembran übertragen. Die Proteine wurden nach einer Färbung mit 0, 1 % Amidoschwarz : 10 % Essigsäure : 40 % Methanol identifiziert. Membranen, die individuell gefärbte Proteinbanden enthielten, wurden ausgeschnitten und an das Protein-Sequenzierungszentrum der Rockefeller Universität für eine N-terminale oder interne Sequenzanalyse eingeschickt.
Herstellung eines Kaninchen-Anti-CBP-Antiserums. Das Antiserum wurde durch HRP Ind. (Denver, PA) gemäß den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt.
Klonierung und Sequenzierung von cbpA. Die DNA-Techniken einschließlich der Plasmidpräparationen, Restriktionsendonucleasen-Verdau, Ligationen, Transformationen in E. coli und Gel-Elektrophorese wurden gemäß den im Stand der Technik bekannten Standardverfahren durchgeführt.
Eine anfängliche DNA-Sequenzinformation für cbpA (SEQ ID Nr. 24) wurde ausgehend von DNA-Fragmenten gewonnen, die durch anchored-PCR gewonnen wurden. Diese Fragmente wurden unter Verwendung degenerierter Primer hergestellt, die von der partiellen Primärstruktur interner Fragmente des gereinigten Proteins (SEQ ID Nr. 25) abgeleitet waren, welches durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese gereinigt war. Weitere Sequenzinformationen wurden aus PCR-generierten Fragmenten gewonnen, die mit Templates für die Endregionen der bekannten Fragmente und den anchored-Universalprimer hergestellt wurden. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde unter Verwendung des Gene-Rmp-Kits (Perkin Elmer Cetus) durchgeführt. Die DNA-Sequenzierung wurde auf PCR-Fragmenten mit einem ABI373-DNA-Sequenzierer unter Verwendung der Farbstoff-markierten Didesoxyterminations-Chemie durchgeführt.
Ein degeneriertes Oligonucleotid, das der Amino-terminalen Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 1) von CbpA entsprach, wurde hergestellt (5'GCTCTTNCTCGATGTCTCNGTNGCCAT3'; Sense) (SEQ ID Nr. 22). Das Antisense-Oligonucleotid (AGCATAGTCTTCTTCGACTTGTTGATCATC) (SEQ ID Nr. 23) wurde gemäß der internen Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 10) hergestellt, die mit einer internen Sequenz von PspA ähnlich war. Die gesamtchromosomale DNA von LM91 wurde, wie zuvor beschrieben, hergestellt und einer PCR-Reaktionsmischung mit jeweils 1 mM der oben beschriebenen Sense- und Antisense-Primer hinzugefügt (20 ng), gemäß den mit der AmpliTaq-DNA-Polymerase bereitgestellten Empfehlungen. Dreißig PCR-Zyklen wurden mit einer Oligonucleotid-Hybridisierung bei 55°C durchgeführt. Die DNA-Bande bei ungefähr 600 bp wurde nach einer Agarose-Gel-Elektrophorese mit einer Ultrafree-MC-Filtereinheit (0,45 mm, Millipore Corporation, Bedford, MA) isoliert, mit Sau3A verdaut und in die BamHI-Stelle des Sektors pJDC9 ligiert. Diese Mischung wurde anschließend in E. coli DH5a transformiert, wonach ein einzelner rekombinanter Klon identifiziert wurde, der den Vektor mit dem Insert enthielt.
Weitere Sequenzinformation wurde aus Fragmenten gewonnen, die durch eine anchored-PCR hergestellt wurden, unter Verwendung von Primern, die auf den Enden der bekannten Fragmente und dem Universalprimer basieren, der mit Restriktionsenzymfragmenten chromosomaler DNA verankert ist. Die Nucleotidsequenzierung wurde mit einem ABI 3373-DNA-Sequenzierer unter Verwendung der Farbstoff-markierten Didesoxyterminations-Chemie durchgeführt.
Eine cbpA-defiziente Mutante wurde durch Insertion einer Duplikations-Mutagenese gebildet. Hierfür wurde zunächst ein 643 Basenpaar-DNA-Fragment durch PCR hergestellt, welches den Nucleotiden 554 bis 1196 von cbpA entsprach. Dieses Fragment enthält die codierende Region für die Aminosäuren 155 bis 372. Ein SauIIIA-Verdau dieses Fragments führte zu zwei Fragmenten von 201 und 195 Basenpaaren, die aus einem Agarose-Gel isoliert, in die BamHI-Stelle von pJDC9 ligiert und in E. coli (DH5a) transformiert wurden. Eine einzelne Transformante, die in die D39- oder 6B-Pneumococcenstämme transformiert wurde und zwei mit SPRU625 (D39) und SPRU632 (6B) bezeichnete Transformanten wurden identifiziert, die CbpA nach einer Western-Blot-Analyse nicht exprimierten. Die Southern-Blot-Analyse bestätigte die chromosomale Integration des Vektors, der cbpA in SPRU625 unterbricht (Daten nicht gezeigt). Die entweder mit HindIII oder EcoRV verdaute DNA wurde durch Elektrophorese aufgetrennt und bidirektional auf Hybond-N (Amersham) übertragen. Die Membranen wurden mit einer 643 Basenpaar-PCR-Sonde versehen, das mit Meerrettichperoxidase (Amersham RPN 3000), wie vom Hersteller empfohlen, markiert war.
Die Southern Blot-Analyse wurde mit der elektrophoretisch aufgetrennten chromosomalen DNA durchgeführt, verdaut mit HindIII und EcoRV, bidirektional auf Hybond-N (Amersham) übertragen und mit dem 600 Basenpaar PCR-Sondenfragment versetzt, das mit der Meerrettichperoxidase (Amersham RPM 3000), wie vom Hersteller empfohlen, markiert war.
Bakterielles Adhäsionsassay. Die menschliche Typ II Lungenzelllinie A549 (American Type Culture Collection) wurde in dem Nährstoff-Mischungsmedium F12 Ham (Sigma, St. Louis, MO), ergänzt mit 10%igem fötalem Kälberserum (Sigma), kultiviert. Menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC; Clonetics, San Diego, CA) wurden im M199-Medium (Sigma) kultiviert. Bei Konfluenz wurden die Zellen für eine Subkultur mit Trypsin-0,05 %-EDTA (Sigma) vorbereitet. Für die Adhärenzassays wurden die Zellen auf Terasaki 60-Well-Kulturschalen überführt (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA) und weitere 24 bis 28 Stunden kultiviert, um ein konfluentes Monolayer zu bilden. Um die menschlichen Zellen zu aktivieren, wurden einige Monolayers mit TNFa (10 ng/ml für 2 Stunden; Boehringer-Mannheim) oder IL-1β (5 ng/ml für 4 Stunden; Sigma) inkubiert. Vor dem Adhärenzassay wurde die Kulturflüssigkeit durch zweimaliges Waschen der Monolayer mit Gewebekulturmedium entfernt.
Die Bakterien wurden bei einer OD₆₂₀ von 0,4 oder 0,6 in 1 ml Carbonatpuffer (0,05 M Natriumcarbonat, 0,1 M Natriumchlorid) gewaschen, im gleichen Puffer resuspendiert und mit FITC (Sigma; 1 mg/ml) 20 min lang im Dunkeln bei Raumtemperatur (LO) markiert. Nach 3 Waschschritten mit Carbonatpuffer wurden die Bakterien in M199-Medium ohne Antibiotika resuspendiert und 5 × 10⁷ Pneumococcen pro Well wurden 30 min lang bei 37°C in Gegenwart von 5 % Co₂ inkubiert. Nach Entfernen der ungebundenen Bakterien durch fünfmaliges Waschen der Monolayer mit M199 wurden die Zellen und Bakterien in 2,5 % Glutaraldehyd 3 min lang fixiert und fünfmal mit PBS gewaschen. Die adhärierenden Pneumococcen wurden visuell mit einem umgekehrten Mikroskop (Diaphot-TDM; Nikon Inc. Melville, NY) mit Epifluoreszenz mit einem IF DM-510-Filter ausgezählt und als Anzahl der angehafteten Bakterien pro 100 Lungenzellen ausgedrückt. Die Werte für 6–9 Vertiefungen sind Durchschnittswerte, wobei jedes Experiment 3–6 Mal wiederholt wurde.
Um die Fähigkeit der CBP-Mischung zu testen, die Adhärenz an eukaryotische Zellen zu beeinflussen, wurde das Assay dahingehend modifiziert, dass die Monolayer in 96-Well-Schalen (Falcon), beschichtet mit 0,2 % Gelatine, ausplattiert wurden, und bei Konfluenz mit einem Bereich von Konzentrationen der CBP-Mischung (1 μg bis 1 mg/ml^-1) über 15 min hinweg inkubiert wurden. Nach den Waschschritten wurden die CBP-behandelten Monolayers mit 5 × 10⁶ Pneumococcen 30 min lang behandelt, gewaschen und die Adhärenz wurde als Fluoreszenzintensität, gemessen in einem Cytofluor II (Perseptive) mit einer Erregung bei 485 nm und einer Emission bei 530 nm, quantifiziert.
Die Adhärenz an Glycokonjugate wurde durch die Beschichtung von Terasaki-Platten bestimmt – über Nacht mit 100 M 6'Sialyllactose-HSA, Lacto-N-neotetraose-HSA, N-Acetylglucosamin-β1,4-glucose-HSA oder N-Acetylglucosamin-β1,3-glucose-HSA (Neose Inc., Horsham, PA). Die Vertiefungen wurden gewaschen und 1 × 10⁷ FITC-markierte Pneumococcen wurden 30 min lang bei 37°C hinzugefügt. Die ungebundenen Zellen wurden dreimal mit PBS abgewaschen und die Adhärenz visuell, wie oben beschrieben, bestimmt. Jedes Glycokonjugat wurde in 18 Vertiefungen in drei verschiedenen Experimenten getestet.
Passiver Schutz gegen systemische Reizung. Ausgebrütete CF1-Mäuse wurden unter spezifischen Pathogen-freien Bedingungen gemäß institutseigenen und NHI-Richtlinien gezüchtet. Eingekapselte Pneumococcen wurden 5 Stunden in C + Y Medium wachsen gelassen und in PBS verdünnt. Zwei Gruppen mit jeweils zehn Mäusen empfingen eine Beimpfung mit 4, 5 × 10⁴ cfu an D39, und zwar durch Injektion in den Peritonealraum. Eine Stunde nach der bakteriellen Beimpfung erhielt eine Mäusegruppe intraperitoneal das Kaninchen-Anti-CBP-Serum (0,5 ml in 1:10 in PBS). Die Kontrolltiere erhielten Prä-Immunserum. Ein zweites Experiment wurde mit einer höheren Reizungsdosis durchgeführt, mit zwei Gruppen mit jeweils fünf Mäusen, von denen jede 8,4 × 10⁴ cfu Pneumococcen erhielt. Für die Reizung mit SIII erhielten Gruppen von fünf Mäusen intraperitoneal 200 cfu an unbehandel ten SIII oder an SIII, das 30 min lang mit Anti-CBP-Antiserum vorinkubiert war. SIII ist ein hochvirulenter Stamm mit einer LD₅₀ von weniger als 10 Bakterien.
Reizung des Nasopharynx. Die Besiedelung des Nasopharynx von 1 bis 5 Tage alten Spraque-Dawley-Ratten mit Pneumococcen wurde, wie zuvor beschrieben, unter Verwendung von Isolaten zweier kapsulärer Serotypen 2 (D39) und 6B (P317) durchgeführt. Für jedes Experiment wurden die Würfe willkürlich ausgewählt und in Gruppen von zehn Ratten pro Pneumococcenstamm sortiert. Jede Ratte erhielt die gleiche intranasale Beimpfung von 10⁴ cfu in 10 ml PBS entweder des Elternstammes (D39 oder P317) oder der isogenen Mutante, die eine definierte Mutation in cbpA enthielt. Als eine zusätzliche Kontrolle wurde ein isogener Stamm (P354) eingesetzt, der eine Unterbrechung in dem Oberflächen-IgA1-Protease-Gen, iga, enthielt. Die Besiedelung wurde nach 24 und nach 120 Stunden nach der Beimpfung bestimmt. Um eine genaue Evaluierung der gewonnenen Bakterien abzusichern, wurde die Flüssigkeit aus den Nasenwaschungen in Reihe verdünnt, ausplattiert und die Kolonien ausgezählt. Die Ergebnisse sind als geometrisches Mittel jeder Gruppe ± der Standardabweichung (n = 20) ausgedrückt.
Ergebnisse
Charakterisierung der CBPs. Wie in Beispiel 1 wurde eine CBP-Mischung durch Inkubation einer Cholin-Affinitätsmatrix mit einem pspA-defizienten Bakterienstamm hergestellt, gefolgt von einer Zelllyse, einer Behandlung der Kügelchen mit einer hohen Salzkonzentration, um unspezifisch gebundenes Material zu entfernen und der Elution der CBPs mit einer 10 % Cholinlösung.
Die CBP, LytA (Muramidase), wurde auf deren Vorliegen durch die präparativen und analytischen Verfahren mittels Western-Blot-Analysen verfolgt und diente als Positivkontrolle. Die elektrophoretische Analyse der CBP-Präparation zeigte mindestens acht Proteine, die größer als 45 kDa waren. Ein Protein mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 112 kDa kam am häufigsten vor. Die Muramidase, LytA, war in Präparationen mit einem Molekulargewicht von 36 kDa anwesend, was die Spezifität der Technik bestätigte.
Um zu bestimmen, ob diese CBP-Mischung protektive Antigene enthielt, wurde ein polyklonaler Antikörper gegen die CBP-Mischung generiert, und hinsichtlich seiner Fähigkeit getestet, Mäuse passiv gegenüber einer intraperitonealen Herausforderung mit Bakterien zu schützen, und zwar bei einer Konzentration, die 1000fach größer ist als die LD₅₀ (16a). Neun von zehn Tieren, die ein Prä-Immunserum erhielten, starben innerhalb von 3 Tagen im Gegensatz zu Tieren, die ein Anti-CBP-Antiserum erhielten. In einem zweiten Experiment, unter Verwendung einer zweifach höheren Beimpfung, starben 100 % der mit dem Prä-Immunserum behandelten Tiere innerhalb eines Tages, wohingegen alle Anti-CBP-behandelten Tiere sechs Tage lang überlebten. Das Antiserum wurde anschließend hinsichtlich des Schutzes gegen Sepsis getestet, die durch den heterologen Kapseltyp (Typ 3) induziert wird. Alle Kontrollmäuse, die intraperitoneales SIII alleine oder SIII mit Prä-Immunserum erhielten, waren nach 24 Stunden bakterienhaltig, mit einem breiten Bereich an einer Bakteriendichte von 2 × 10⁴ bis 1 × 10⁷ cfu/ml. Im Gegensatz dazu zeigten Tiere, die SII mit Anti-CBP-Serum oder Anti-Typ-III-Serum erhielten, weniger als 10⁴ Bakterien/ml Blut. Dieser Unterschied reflektierte sich im Überleben nach 36 und 48 Stun den. Die Hälfte der Kontrolltiere starb nach 48 Stunden, wohingegen keine der Anti-CBP- oder Anti-Typ-III-Antikörper-behandelten Tiere nach dem gleichen Zeitintervall starben. Der Schutz wurde schließlich wirkungslos und alle Tiere starben nach 22 Stunden, egal, ob behandelt oder nicht.
Um zu bestimmen, ob die CBP-Mischung Adhäsine enthalten könnte, wurde die CBP-Mischung hinsichtlich deren Fähigkeit getestet, die Adhärenz von Pneumococcus an Endothel- und Epithelzellen zu inhibieren. Die Prä-Inkubation der eukaryotischen Zellen mit den CBPs resultierte in einem Absinken der Adhärenz an Epithelzellen um ungefähr 50 % und an Endothelzellen um mehr als 80 % (17A). Dieses Phänomen war dosisabhängig, wobei die Hälfte der maximalen Aktivität ungefähr 60 μg/ml an CBP benötigte (17B).
Basierend auf den Anzeichen, dass die CBP-Mischung wirksame schützende Antigene und anhaftende Liganden enthielt, wurden einzelne CBPs weiter untersucht. Es wurden Eigenschaften gesucht, die für bioaktive CBPs wichtig sind, insbesondere die Lokalisierung an die Pneumococcen-Oberflächen und die Reaktivität mit Antiseren von genesenden Menschen und dem protektiven Anti-CBP-Serum. Intakte Pneumococcen wurden hierzu mit FITC markiert und anschließend mit den CBP-Fraktionen versetzt. Die SDS-PAGE- und eine Western-Blot-Analyse zur Verwendung von Anti-FITC-Antikörpern zeigte vier Proteine, die sowohl bei den Ganzzellpräparationen als auch den CBP-Präparationen mit FITC markiert waren. Dies ist in Übereinstimmung mit dem Zugang dieser CBP-Gruppe zu dem Pneumococcen-extrazellulären Milieu in den nativen Bakterien. Fünf CBPs reagierten mit Antiseren genesender Menschen, wobei die 112-kDa-Bande in Präparationen aus ganzen Pneumococcen stark markiert war. Das gleiche Muster trat unter Verwendung des Anti-CBP-Antiserums auf, wobei die 112-kDa-Bande in intakten Pneumococcen- und CBP-Präparationen stark markiert war.
Als ein Ergebnis der Lokalisierung der 112-kDa-Bande auf der Pneumococcen-Oberfläche und dessen starker Reaktivität mit den Antiseren der Genesenden und den schützenden Kaninchen-Anti-CBP-Seren, die aus ganzen Bakterien oder aus den verschiedenen CBP-Fraktionierungsverfahren hergestellt wurden, wurde bestimmt, dass das 112-kDa-Protein eine Proteinhauptkomponente der CBP-Mischung ist, und wurde daher als CbpA bezeichnet.
Klonierung und Sequenzanalyse von cbpA. Die direkte N-terminale Aminosäurenanalyse von CbpA ergab eine einzigartige Sequenz (SEQ ID Nr. 1) ohne Ähnlichkeit zu Proteinen in irgendeiner veröffentlichten Datenbank. Im Gegensatz dazu war eine interne Sequenz (SEQ ID Nr. 10) identisch mit einer internen Sequenz des CBP, PspA. Da ein pspA-defizienter Stamm dazu eingesetzt wurde, cbpA zu identifizieren, war dieses Ergebnis kein Artefakt auf Grund einer genetischen Umordnung von pspA, sondern stellte wahrscheinlich ein Gen dar, das aus einer einzigartigen 5'-codierenden Region und einer 3'-codierenden Region zusammengesetzt ist, die ähnlich zu pspA ist. Unter Verwendung einer PCR-basierten Strategie wurde cbpA kloniert und sequenziert. Eine Southern-Blot-Analyse unter Verwendung einer Sonde, die gegen die 5'-Region gerichtet ist (siehe experimenteller Teil dieser Anmeldung), ergab lediglich eine Kopie von cbpA im LM91-Chromosom (Daten nicht gezeigt).
Mit der Analyse der abgeleiteten Proteinsequenz von cbpA wurden mehrere einzigartigen Eigenschaften entdeckt. CpbA ist ein Protein mit 630 Aminosäuren mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 71 kDa. Dies steht im Unterschied zu dem berechneten Molekulargewicht (112 kDa), basierend auf den Wanderungseigenschaften, ermittelt durch SDS-PAGE. Das Vorliegen einer Standard-N-terminalen Signalsequenz legt einen SecA-abhängigen Export nahe. Das Protein besitzt zwei getrennte Domänen. Die N-terminale Region (1–340) hat keine offensichtliche Ähnlichkeiten mit Proteinen, die in öffentlichen Datenbanken zugänglich sind. Mit der Garnier-Robson-Analyse konnten sechs alphahelicale Regionen von den Resten 10 bis 350 vorhergesagt werden. Fünf superspiralisierte Strukturen mit mehr als 50 Aminosäuren Länge in der gleichen Region wurden mittels des Paarbindungsalgorithmus vorhergesagt. Im Gegensatz dazu ist die C-terminale Region (341–360) beinahe identisch (>95 %) mit PspA. Diese Ähnlichkeit erstreckt sich auf die korrespondierende Nucleotidsequenz. Gemeinsame Merkmale sind eine prolinreiche Region (340–370) und zehn sich direkt wiederholende Tandemsequenzen von 20 Aminosäuren (381–584), welche das Cholin-bindende Motiv darstellen, das das Kennzeichen der Cholin-bindenden Proteine ist.
Phänotypische Variation und Expression der Cholin-bindenden Proteine. Da die lichtundurchlässigen und transparenten Varianten der Pneumococcen Unterschiede in der Expression des CBP LytA besitzen, wurde die Expression der CBPs zwischen lichtundurchlässigen und transparenten Varianten eines nichteingekapselten Stammes (R6x) mit Anti-CBP-Serum verglichen. Obgleich in beiden Phänotypen alle Banden vorlagen, unterschieden sich mehrere Banden zwischen den lichtundurchlässigen und den transparenten Zelltypen. Die transparenten Organismen besa ßen deutlich höhere Mengen an LytA, wie bereits zuvor berichtet. Darüber hinaus exprimierte die transparente Variante erhöhte Mengen an CbpA und PspA. Im Gegensatz dazu besaß der lichtundurchlässige Pneumococcenstamm mehr PspA. Bei diesen Daten schienen kleinere Banden zwischen 70 und 90 kDa Abbauprodukte von PspA und CbpA zu sein. Ferner lag in den transparenten Organismen eine Protein mit ungefähr 50 kDa vor, und zwar unabhängig, ob Cholin vorlag oder nicht, was darauf hindeutete, dass dieses kein CBP war. Als zusätzliche Kontrolle wurde die Identität dieser CBPs, also LytA und PspA, durch die Abwesenheit dieser Banden in Material bestätigt, das aus Mutanten mit Defekten in den entsprechenden Genen gewonnen wurde (Daten nicht gezeigt).
Funktionelle Analyse der CbpA^--Mutanten. Um die biologischen Aktivitäten, die durch das CbpA beeinflusst sein könnten, zu untersuchen, wurden genetische Mutanten in einer Vielzahl von Assays konstruiert.
Die Wachstumsrate zweier CbpA^--Mutanten in halbsynthetischem Medium war gleich wie die des Wildtyps und die Rate der phänotypischen Variation von transparenten zu lichtundurchlässigen Kolonie-Varianten war, ausgehend vom Elternstamm, nicht geändert (Daten nicht gezeigt). Andere physiologische Eigenschaften der Pneumococcen waren ebenfalls unverändert, einschließlich der DNA-Transformationseffizienz eines Streptomycin-Resistentmarkers der Lysis in der stationären Phase sowie der Penicillin-induzierten Lysis (Daten nicht gezeigt).
Die verkapselte Serotyp 2-cbpA-defiziente Mutante wurde hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, an menschliche Lungen epithelzellen sowie an Endothelzellen und Glycokonjugate zu adhärieren. Die Mutante adhärierte mit ungefähr 80 % des Levels des Elternstamms (18A, B).
Dies war eine Übereinstimmung mit der äquivalenten Fähigkeit der zwei Stämme, an immobilisiertes GalNAc-β1,4-Gal und GalNAcβ1,3-Gal zu adhärieren, nämlich an Zucker, von denen bekannt ist, dass die Rezeptoren auf diesem eukaryotischen Zellen sind (Cundell) (18C). Ein Unterschied in der Adhärenz zwischen dem Elternstamm und der Mutante wurde zwar beobachtet, jedoch mit Zytokin-aktivierten Zellen. Die Adhärenz des Elternstammes an Zytokin-aktivierte Zellen erhöhte sich auf – 135 % der ruhenden Zellwerte. Im Gegensatz dazu wurde die Adhärenz der cbpA-defizienten Mutante weder für Lungen- noch Epithelzellen erhöht (18A). Dieser Defekt in der Adhärenz an Cytokinaktivierte Zellen war in Übereinstimmung mit der Abwesenheit der Adhärenz der Mutante an gereinigte Glycokonjugate (Sialinsäure und Lacto-N-Neotetraose, LnNT), welches bekannte Rezeptoren für Pneumococcen auf Cytokin-aktivierte Zellen darstellt (18C).
Ein Babyrattenmodell der Pneumococcenübertragung wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die Fähigkeit von CbpA, die Adhärenz an menschliche Epithelzellen zu vermitteln, mit der Fähigkeit von Pneumococcus einherging, den Nasopharynx zu besieden. In diesem Tiermodell überlebt Pneumococcus auf der Schleimhautoberfläche viele Tage lang zu einem hohen Grad, nach einer kleinen intranasalen Beimpfung. Im Gegensatz zu den Kontrollen, die ein verkapselter Serotyp 2-Stamm und eine isogene iga-defiziente Mutante (IgAl-Protease ist ein anderes Oberflächenprotein) waren, war die cbpA-defiziente Mutante in der Besiede lung des Nasopharynx von Babyratten um mehr als hundert Mal weniger effizient (19). Ähnliche Ergebnisse wurden durch den Vergleich eines verkapselten Serotyp 6B-Stammes (P317) und einer isogenen cbpA-defizienten Mutante gewonnen. Der mittlere bakterielle Titer der Nasenspülungen nach 24 Stunden bei Tieren, die mit dem Elternstamm herausgefordert wurden, betrug 3,1 × 10⁴ cfu/ml (n = 9). Im Gegensatz dazu trugen 6 von 10 Babyratten, die mit dem 6b-cbpA^--defizienten Stamm herausgefordert wurden, keine detektierbaren Bakterien (Detektionsgrenzwert 100 cfu/ml), zwei Ratten 100 cfu/ml und 2 Ratten 200 cfu/ml.
Im Gegensatz zu den im Nasopharynx enthaltenen Ergebnissen wurden in einem Modell einer Pneumococcen-induzierten Sepsis mit einer verkapselten Serotyp 2-cbpA-defizienten Mutante keine Unterschiede in der Virulenz beobachtet.
Diskussion
Um die einzigartige Familie der CBP-Oberflächenproteine zu untersuchen, wurde ein umgekehrter genetischer Ansatz entwickelt, wobei eine immobilisierte Cholinmatrix eingesetzt wurde, um CBPs aus intakten Pneumococcen selektiv abzufangen. Die pspA-defiziente Mutante LM91 wurde als CBP-Quelle ausgewählt, um zu vermeiden, dass das Genprodukt gereinigt werden muss. Die Reinigung und elektrophoretische Analyse der auf. der Cholinmatrix zurückgehaltenen Proteine ergab mindestens acht CBPs. Mehrere wichtige Eigenschaften dieser Mischung wurden entdeckt. Ein Antiserum gegen die CBP-Mischung schützte Mäuse gegen eine Reizung mit dem verkapselten Serotyp 2-Stamm, aus welchem die CBP-Mischung abgeleitet war. Darüber hinaus senkte das Antiserum den Bakterienverseuchungsgrad und verlängerte die Überle benschance der Mäuse, die mit einem heterologen und hochvirulenten Serotyp 3-Stamm gereizt wurden. Ein solcher „Über-Kreuz-Schutz" legt nahe, dass zwischen den Serotypen einige CBPs schützende Epitope teilen.
Zusätzlich zu der Erzeugung eines Antiserums mit schützender Aktivität inhibierte die CBP-Mischung die Pneumococcen-Adhärenz, wenn sie direkt auf Lungenepithelzellen und vaskuläre Endothelzellen aufgetragen wurde. Diese Zellen stellen in vitro-Modelle für die Pneumococcen-Adhärenz an Stellen einer Pneumococcen-Infektion dar (NEJM). Dies legte nahe, dass die CBPs an die Rezeptoren der menschlichen Zellen gebunden hatten, und dadurch das CBP-vermittelte bakterielle Anhaften verhinderten. Die Demonstration einer direkten CBP-menschliche-Zellen-Interaktion, welche zu einem Verlust der Adhärenz führte, unterscheidet die CBP von allen anderen Pneumococcen-Proteinen, die in genetischen Versuchen als Beeinflusser der bakteriellen Adhärenz identifiziert wurden. Während der Verlust dieser anderen Elemente die Fähigkeit der Bakterien, anhaften zu können, senkt, gibt es kein Anzeichen dafür, dass sie eine kompetitive Inhibierung der Adhärenz zeigen, ein Schlüsselmerkmal eines strukturellen Adhäsins. Diese Adhärenz- und Virulenzeigenschaften der CBP-Mischung führte zu weiteren Analysen einzelner CBPs.
CbpA wurde für die weiteren Versuche ausgewählt, da es das Haupt-CBP in der Mischung war, es ferner auf der Oberfläche exprimiert war und sowohl mit einem Antikörper eines genesenden Menschen als auch mit dem Maus-schützenden Anti-CBP-Serum stark reagierte, sowohl auf ganzen Bakterien und nach Reinigung in einer CBP-Präparation. Obwohl die Sequenz ein Molekulargewicht von 71 kDa vermuten lässt, wandert das Protein mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 112 kDa auf der SDS-PAGE, eine Diskrepanz, die auch für ein anderes CBP, nämlich PspA, charakteristisch ist. Die Cholin-bindende Domänen von CbpA scheint identisch mit derjenigen von PspA zu sein, beide jeweils auf dem Aminosäuren- als auch dem Nucleotidlevel, was chimäre Genstrukturen für diese Elemente bedeutet. Die N-terminale Domänen der zwei CBPs sind in der Primärsequenz stark unterschiedlich, jedoch teilen sie gemeinsame strukturelle Merkmale, wie bspw. mehrere große alphahelicale Regionen und fünf superspiralisierte Regionen. Dies legt nahe, dass das CbpA ein Faserprotein ist, analog zu PspA, Tropomyosin, Troponin und die M-Proteinfamilie der Streptococcen-Proteine. Es liegt nahe, dass die N-terminale Domäne von CbpA eine oder zwei Lectindomänen enthält, welche dazu in der Lage sind, LnNT und Sialinsäure zu binden. Solche Lectindomänen wären zwischen den Stämmen und den Serotypen konserviert, da sie die Fähigkeit beibehalten müssen, die Zielrezeptoren menschlicher Glycokonjugate zu binden, um die Virulenz beizubehalten. Diese Konservierung kann zu einem Über-Kreuz-Schutz zwischen verschiedenen Serotypen führen, wie bspw. für das Anti-CBP-Antiserum beobachtet wurde.
CbpA scheint in seiner Expression zu variieren, was mit dem Phasenübergang zwischen den lichtundurchlässigen und transparenten Varianten zusammenfällt. Manche CBPs, wie bspw. PspA, werden in den lichtundurchlässigen Varianten in höheren Mengen exprimiert. CbpA variiert auf die gleiche Art und Weise wie LytA, und zwar derart, dass die transparenten Varianten erhöhte Mengen dieses Proteins exprimieren. Die Bedeutung eines erhöhten PspA in lichtundurchlässigen Organismen und die Funktion dieses CBPs ist unbekannt. Im Gegensatz dazu korreliert die erhöhte Expression of LytA und CbpA durch die transparenten Formen mit einer erhöhten Adhärenz und Besiedelung. Eine Rolle für LytA bei der Besiedelung konnte nicht gezeigt werden. Im Gegensatz dazu wurde die Rolle von CbpA bei der Adhärenz und Besiedelung direkt durch die Analyse der cbpA-defizienten Mutante bestätigt.
Ein Zweischrittmodell für die Pneumococcen-Adhärenz ist vorgeschlagen worden. Die Pneumococcen zielen anfänglich auf eine Nische im Wirt ab, indem sie Oberflächenglycokonjugate, wie bspw. GalNAc-β1,4-Gal und GalNAc-β1,3-Gal, auf der Oberfläche von eukaryotischen Zellen binden. Eine cbpA-defiziente Mutante war in ihren Adhärenz-Eigenschaften an diese Zellen oder an korrespondierende Glycokonjugaten nicht beeinflusst. Ein zweiter Schritt in der Anhaftung führt vermutlich zur Invasion und wird nach der Zytokin-Aktivierung der menschlichen Zelle beobachtet. Neue Zuckerspezifitäten scheinen auf den aktivierten Zellen zu einer erhöhten Pneumococcen-Adhärenz zu führen. Dieser zweite Adhärenz-Level wird durch die Fähigkeit unterschieden, dass die sialierten Glycokonjugate (6'SL) und NnNT das bakterielle Anhaften inhibieren. Diese Zucker sind für ruhende Zellen keine Rezeptor-Analoga. Eine cbpA-defiziente Mutante hat die Fähigkeit verloren, an Zytokin-aktivierte Zellen oder an immobilisierte 6'SL und LnNT zu binden. Zusammen mit der Fähigkeit gereinigter CBPs, die Pneumococcen-Anhaftung zu inhibieren, legen diese Ergebnisse nahe, dass das CbpA ein strukturelles Adhäsin mit möglicher Lectinaktivität ist. Zytokin-aktivierte Zellen exprimieren vermutlich den Plättchen-aktivierenden Faktor (PAF-Rezeptor), der das Phosphorylcholin der Pneumococcen-Zellwand binden kann. Das Vorliegen von CBPs, die an Phosphorylcholin anhaften, würde vermutlich die Phosphorylcho linbindung an den PAF-Rezeptor maskieren. Die relative Anzahl von freien gegenüber CBP-gebundenem Phosphorylcholindeterminanten auf der Pneumococcen-Oberfläche ist unbekannt. Es scheint, dass sowohl CbpA und Phosphorylcholin bei der Bindung von Pneumococcen an aktivierte menschliche Zellen teilnehmen.
CbpA scheint das erste Beispiel eines Protein-Adhäsins auf der Pneumococcen-Oberfläche zu sein. Es kann als eine Brücke dem Zellwand-Phosphorylcholin fungieren, gebunden durch die C-terminalen Cholin-bindenden Repeats und menschliches Zellglycokonjugaten, über die N-terminale Domäne. Die Bindungsfähigkeit ist auf aktivierte menschliche Zellen beschränkt und kann deshalb bei dem Fördern des Krankheitsverlaufes von einer gutartigen Besiedelung bis zu einer Invasion wichtig sein. Dies ist ebenfalls in Übereinstimmung mit Ergebnissen, die nahe legen, dass CbpA einer Phasenvariation unterzogen wird, und dass es ein Marker für die transparenten, Besiedelungs-kompetenten, Phasenvarianten der Pneumococcen ist. Entsprechend sind die CBPs, und insbesondere CbpA (CBP-112), attraktive Ziele für die Impfstoffentwicklung und die passive Immuntherapie.
Während die Erfindung hierin mit Bezug auf verschiedene spezifische Materialien, Verfahren und Beispiele beschrieben und dargestellt worden ist, versteht es sich, dass die Erfindung nicht auf die bestimmten Materialkombinationen des Materials sowie die für diesen Zweck ausgewählten Verfahren beschränkt ist. Verschiedene Variationen solcher Details können angewandt werden, und werden den Fachleuten offensichtlich sein.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Cholinbindendes Protein mit einem oder mehreren der folgenden Eigenschaften: a) inhibiert das Anhaften von Streptococcus an Wirtszellen; b) reagiert mit Seren von Patienten, die mit den Bakterien infiziert sind oder sich von einer Infektion mit den Bakterien erholen; c) reagiert mit Kaninchen-Antiseren, die gegen das cholinbindende Protein generiert wurden; und d) markiert mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) ohne Notwendigkeit einer Streptococcen-Lyse (d.h., in intakten Bakterien), wobei das cholinbindende Protein aus Streptococcus pneumoniae gewonnen werden kann, wobei es ferner in der 10 % SDS-PAGE ein offensichtliches Molekulargewicht von 112 kDa oder 50 kDa besitzt, und wobei es die Aminosäurensequenz irgendeiner der SEQ ID Nrn. 1, 8 bis 10, 19, 21 und 25 aufweist.
Cholinbindendes Protein nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 19 oder SEQ ID Nr. 25 aufweist.
Cholinbindendes Protein nach einem der Ansprüche 1 oder 2, markiert mit einem detektierbaren Marker.
Impfstoff, welcher das cholinbindende Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 2 sowie ein pharmazeutisch akzeptierbares Adjuvans aufweist, wobei das cholinbindende Protein in der 10 % SDS-PAGE ein offensichtliches Molekulargewicht von 112 kDa besitzt und die Aminosäuresequenz von irgendeiner der SEQ ID Nrn. 1, 9 bis 10, 21 und 25 aufweist.
Impfstoff nach Anspruch 4, welcher ferner Folgendes aufweist: a) ein weiteres cholinbindendes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 2; b) PspA; c) Autolysin (LytA); oder d) eine Kombination von einem oder mehreren der Vorgenannten.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein cholinbindendes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 2 und einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, welche ferner Folgendes aufweist: a) PspA oder Autolysin (LytA); b) ein Antibioticum; c) einen anti-cholinbindendes-Protein Impfstoff, wobei das cholinbindende Protein ein cholinbindendes Protein nach einem der Ansprüche 1 oder 2 ist; oder e) ein Anti-Streptococcenimpfstoff.
Gereinigter Antikörper gegen das cholinbindende Protein wie in einem der Ansprüche 1 bis 2 definiert.
Monoklonaler Antikörper gegen das cholinbindende Protein wie in einem der Ansprüche 1 bis 2 definiert.
Unsterbliche Zelllinie, die einen monokolnalen Antikörper nach Anspruch 9 produziert.
Antikörper nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, markiert mit einem detektierbaren Marker.
Antikörper nach Anspruch 11, wobei der Marker ein Enzym; ein chemisches fluoreszierendes Reagens; oder ein radioaktives Element ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche den Antikörper nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 sowie einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger aufweist.
Gereinigte Nucleinsäure, die für das cholinbindende Protein nach Anspruch 2 kodiert, oder gereinigte Nucleinsäure, die zu der Nucleinsäure homolog ist und für ein cholinbindendes Protein kodiert.
Gereinigte Nucleinsäure nach Anspruch 14, wobei mindestens 75 % der Nucleotide über die definierte Länge der Nucleotidsequenz der Nucleidsäure, die für das cholinbindende Protein nach Anspruch 2 kodiert, übereinstimmen.
Gereinigte Nucleinsäure nach Anspruch 14, wobei zumindest 80 % der Nucleotide über die definierte Länge der Nucleotidsequenz der Nucleinsäure, die für das cholinbindende Protein nach Anspruch 2 kodiert, übereinstimmen.
Gereinigte Nucleinsäure nach Anspruch 14, wobei zumindest 90 % der Nucleotide über eine definierte Länge der Nucleotidsequenz der Nucleinsäure, die für das cholinbindende Protein nach Anspruch 2 kodiert, übereinstimmen.
Gereinigte Nucleinsäure nach Anspruch 14, wobei zumindest 95 % der Nucleotide über die definierte Länge der Nucleotidse quenz der Nucleinsäure, die für das cholinbindende Protein nach Anspruch 2 kodiert, übereinstimmen.
Nucleinsäure nach Anspruch 14, die ein DNA-Molekül mit einer DNA-Sequenz ist, welche für ein Polypeptid mit irgendeiner der Sequenzen kodiert, wie sie in den SEQ ID Nrn. 19 und 25 dargestellt sind.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 19.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 20, das eine Nucleotidsequenz besitzt wie in der SEQ ID Nr. 18 von Nucleotid 1 bis zum Stopcodon TAA dargestellt, oder das eine Nucleotidsequenz besitzt wie in der kodierenden Region der SEQ ID Nr. 24 dargestellt.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, wobei das DNA-Molekül operativ mit einer Expressions-Kontrollsequenz verbunden ist.
Einzelliger Wirt, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 20 bis 22 transformiert ist.
Nucleinsäureimpfstoff, welcher das rekombinante DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 20 bis 22 aufweist.
Verfahren zur Detektion des Vorliegens eines cholinbindenden Proteins wie in einem der Ansprüche 1 bis 2 definiert, wobei das cholinbindende Protein folgendermaßen gemessen wird: a) In Verbindung bringen einer Probe, in welcher das Vorliegen oder die Aktivität des cholinbindenden Proteins vermu tet wird, mit einem Antikörper gegen das cholinbindende Protein, und zwar unter Bedingungen, die die Bindung des cholinbindenden Proteins an den Bindungspartner ermöglichen; und b) Detektieren, ob zwischen dem cholinbindenden Protein aus der Probe und dem Antikörper eine Bindung stattgefunden hat; wobei die Detektion der Bindung das Vorliegen oder die Aktivität des cholinbindenden Proteins in der Probe anzeigt.
Verfahren zur Detektion des Vorliegens eines Bakteriums mit einem Gen für ein cholinbindendes Protein wie in einem der Ansprüche 1 bis 2 definiert, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) In Verbindung bringen einer Probe, in welcher das Vorliegen oder die Aktivität des Bakteriums vermutet wird, mit einem Oligonucleotid, welches an das Gen für das bindende Protein hybridisiert, und zwar unter Bedingungen, die die spezifische Hybridisierung des Oligonucleotids an das Gen ermöglichen; und b) Detektieren, ob zwischen dem Oligonucleotid in dem Gen eine Hybridisierung stattgefunden hat; wobei die Detektion der Hybridisierung das Vorliegen oder die Aktivität des Bakteriums in der Probe anzeigt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche einen Inhibitoder der Streptococcen-Adhäsion an Fibronectin aufweist, welcher entweder ein Peptid mit nicht mehr als 15 Aminosäureresten mit der Aminosäuresequenz WQPPRARI (SEQ ID Nr. 11) ist; das cholinbindende Protein nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 8 oder SEQ ID Nr. 19 aufweist; oder ein Antikörper, der für die Aminosäuresequenz WQPPRARI spezifisch ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 27, die einer pulmonären Verabreichung angepasst ist.
Cholinbindendes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 2, pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6, 7, 13, 27 und 28, oder der Antikörper nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, zur Verwendung bei der Behandlung einer Infektion durch ein Bakterium, das ein cholinbindendes Protein exprimiert.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 4 bis 5 oder 24, zur Verwendung in der Prävention einer Infektion mit einem Bakterium, das ein cholinbindendes Protein exprimiert.
Verwendung des Impfstoffs nach einem der Ansprüche 4 bis 5 oder 24 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention einer Infektion mit einem Bakterium, das ein cholinbindendes Protein exprimiert.
Nucleinsäure, welche für ein cholinbindendes Protein kodiert, wobei die Nucleinsäure mit der in Anspruch 21 definierten Nucleotidsequenz homolog ist, wobei die Nucleotidsequenz so ist, wie in der kodierenden Region der SEQ ID Nr. 24 dargestellt.
Nucleinsäure nach Anspruch 32, wobei mindestens 80 % der Nucleotide über die definierte Länge der in Anspruch 21 definierten Nucleotidsequenz übereinstimmen, wobei die Nucleotidse quenz so ist, wie in der kodierenden Region der SEQ ID Nr. 24 dargestellt.
Nucleinsäure nach Anspruch 32, wobei mindestens 90 % der Nucleotide über die definierte Länge der in Anspruch 21 definierten Nucleotidsequenz übereinstimmen, wobei die Nucleotidsequenz so ist, wie in der kodierenden Region der SEQ ID Nr. 24 dargestellt.
Nucleinsäure nach Anspruch 32, wobei mindestens 95 % der Nucleotide über die definierte Länge der in Anspruch 21 definierten Nucleotidsequenz übereinstimmen, wobei die Nucleotidsequenz so ist, wie in der kodierenden Region der SEQ ID Nr. 24 dargestellt.