DE69928384T2 - Behandlung und nachweis von staphylokokkeninfektionen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung und Diagnose von Staphylokokken-Infektionen, insbesondere solche von Staphylococcus aureus, und stellt ein Protein, Epitope hiervon und Antikörper sowie andere Bindungs- und Neutralisierungsmittel bereit, die gegen diese spezifisch sind.
  • Eine multiple Arzneimittelresistenz (engl. multiple drug resistance, MDR) ist ein wachsendes Problem unter grampositiven Bakterien (Banergee, S. N. et al. 1991, Am. J. Med. 91: 856–895; Shaberg, D. R. et al., 1991, Am. J. Med. suppl., 88: 72–75; Gaynes, R. P. et al., 1994, Infect. Dis. Clin. Pract., 6: 452–455), insbesondere in Krankenhäusern. Insbesondere das gegen Methicillin resistente Staphylococcus aureus (MRSA) und Coagulase-negative Staphylokokken (CNS), insbesondere gegen Methicillin resistente CNS, erwei sen sich als problematisch, da sie resistent gegenüber allen Penicillinen und Cephalosporinen sind. Resistenz gegenüber anderen Mitteln, wie Chinolonen, ist weit verbreitet (Malabarta, A. et al., 1997, Eur. J. Med. Chem., 32: 459–478; Lewis, K., 1994, TIBS, 19: 119–123; Traub, W. H. et al., 1996, Chemotherapy, 42: 118–132). Die Behandlung wird üblicherweise unter Verwendung von Vancomycin oder Teicoplanin bewirkt. Dennoch verbreitet sich die Resistenz gegenüber diesen Mitteln, so dass neue Therapien benötigt werden.
  • Die WO 98/01154 offenbart die Verwendung von bakteriellen und fungalen ABC-Transporterproteinen und Neutralisierungsmitteln, die gegen diese spezifisch sind, in Verfahren zur Behandlung und Diagnose des menschlichen oder tierischen Körpers. Enterokokken-ABC-Transporterproteine mit scheinbaren Molekulargewichten von 97 und 54 kDa sind als therapeutisch wirksam identifiziert worden und es wurden verschiedene Epitope ebenso identifiziert. Staphylococcen-Homologe der IstA- und IstB-Proteine von Bacillus thuringiensis wurden ebenso identifiziert (Menou et al., 1990, J. of Bacteriology, 173: 6689–6696), wobei die Homologen scheinbare Molekulargewichte von 69 und 37 kDa aufweisen und immunodominant bewahrende Antigene sind. Ebenso werden Epitope derselben identifiziert.
  • Ein Staphylokokken-ABC-Transporterprotein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 67 kDa wurde nun von dem vorliegenden Erfinder aus einem epidemischen MRSA-Stamm erfolgreich isoliert und aufgereinigt und besitzt die Kodierungssequenz SEQ ID NO: 1 und die Aminosäurensequenz SEQ ID NO: 2. Diese Sequenzen sind teilweise durch das Sequenzierungsprojekt des S. aureus NCTC 8325-Genoms als contig 1184, contig 1177 und contig 1158 enthaltend Amino-terminale Sequenzda ten identifiziert. Dieses Protein wurde bisher nicht als ABC-Transporterprotein vorgeschlagen und es wurden bislang für dieses keine diagnostischen oder therapeutischen Verwendungen vorgeschlagen. Das Protein hat ein berechnetes wahres Molekulargewicht von 60,1 kDa, obwohl Modifizierungen nach der Umsetzung dazu führten, dass in Versuchen dieses mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 67 kDa identifiziert wurde.
  • Die Bedeutung des Proteins ist weder vorgeschlagen noch offenbart durch die IstA- und IstB-Homologe von WO 98/01154, weil diese unterschiedliche Sequenzen und unterschiedliche Molekulargewichte besitzen. Zusätzlich waren die Proben, von denen die IstA- und IstB-Homologen isoliert wurden, peritoneale Dialysate im Gegensatz zu dem Blut und den Wundkulturen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurden (siehe unten), so dass solch ein Reinigungsverfahren nicht zu der vorliegenden Erfindung geführt hätte, weil der zuvor verwendete Dialyse-Schritt zu einem Wechsel der relativen Proportionen des Antikörpers in dem Dialysat im Vergleich zum Serum führt. In ähnlicher Weise wird durch weiteren Stand der Technik die Bedeutung des Proteins nicht vorgeschlagen. Ebenso wenig wird vorgeschlagen, dass es eine diagnostische oder therapeutische Verwendung besitzt. Weiterer relevanter Stand der Technik schließt die EP 0 786 519 und Allignet J. und El Solh N. (Gene. 1997 Nov 20; 202 (1–2): 133–8; PMID: 9427556), wo eine 552-Aminosäurensequenz mit 28% Homologie offenbart ist (Zugangsnummer AAB95639).
  • Somit wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Staphylokokken-ABC-Transporterprotein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder einer teilweise modifizierten Form hiervon, die mindestens 70% Homologie mit dieser über die gesamte Länge aufweist, oder ein immunogenes Fragment hiervon für die Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Diagnose des menschlichen oder tierischen Körpers bereitgestellt.
  • Immunogene Fragmente des Proteins schließen sämtliche Fragmente des Proteins, die eine Immunantwort hervorrufen, und Epitope (d.h. Epitope tragende Peptide) ein. In gleicher Weise können Analoga (Mimotope) der Epitope leicht hergestellt werden, wobei die Mimotope andere Sequenzen besitzen, aber das gleiche Epitop entwickeln und somit der Begriff „immunogene Fragmente" auch immunogene Analoga der Fragmente, z.B. Mimotope, umfasst. Epitope können leicht bestimmt und Mimotope leicht hergestellt werden (Geysen, H. M. et al., 1987, Journal of Immunological Methods, 102: 259–274; Geysen, H. M. et al., 1988, J. Mol. Recognit., 1 (1): 32–41; Jung, G. und Beck-Sickinger, A. G., 1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 31: 367–486).
  • Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung umfasst nicht andere Staphylokokken-ABC-Transporterproteine, wie die aus WO 98/01154. Dennoch umfasst die Erfindung auch Proteinformen, die unwesentlich modifiziert wurden (d.h. die teilweise modifiziert wurden), insbesondere Proteinformen, die die gleichen immunogenen Eigenschaften wie das Protein selbst entwickeln.
  • Mit Bezug auf die Aminosäuren bedeuten die Begriffe „teilweise Modifikation" und „teilweise modifiziert" eine teilweise modifizierte Form des Moleküls, die die Eigenschaften des Moleküls, von dem es abstammt, im wesentlichen beibehält, obwohl sie natürlich eine zusätzliche Funktionalität aufweisen kann. Eine teilweise Modifikation kann z.B. durch eine Addition, Beseitigung oder Substitution von Aminosäureresten er folgen. Substitutionen können bewahrende Substitutionen sein. Deshalb kann das teilweise modifizierte Molekül ein homologes der Moleküle, von denen es abstammt, sein. Es kann z.B. mindestens 70% Homologie mit dem Molekül, von dem es stammt, aufweisen. Es kann z.B. mindestens 80, 90 oder 95% Homologie mit dem Molekül, von dem es abstammt, aufweisen. Ein Beispiel eines Homologen ist eine allele Mutation. In gleicher Weise können Nukleotidsequenzen, die das Molekül kodieren, oder Aminosäuresequenzen teilweise modifiziert sein, um sämtliche solche Modifikationen an einer Aminosäurensequenz oder einem Molekül zu kodieren. Nukleotidsequenzen können natürlich auch modifiziert sein, so dass sie noch die gleichen Aminosäurereste kodieren, aber eine unterschiedliche Nukleotidsequenz aufweisen.
  • Das Staphylococcus kann S. aureus oder z.B. ein Coagulase-negatives Staphilococcus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hyicus oder S. saprophyticus sein.
  • Ein immunogenes Fragment kann eine ATP-Bindungsstelle oder einen Teil davon enthalten. Peptide, die eine Anzahl von Epitopen des ABC-Transporterproteins tragen (d.h. entwickeln) sind ebenso identifiziert worden (siehe unten), so dass ein immunogenes Fragment des Proteins auch die Sequenz SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9, 10, 11 oder 12 enthalten kann. Die Epitope der SEQ ID NOs: 3, 4 und 5 werden von Peptiden mit den Sequenzen SEQ ID NOs: 6, 7 bzw. 8 entwickelt, so dass ein immunogenes Fragment die Sequenz von SEQ ID NO: 6, 7 oder 8 enthalten kann. Insbesondere haben Versuche gezeigt, dass Peptide mit SEQ ID NOs: 6 und 7 die Epitope mit SEQ ID NOs: 3 und 4 entwickeln, von besonderem therapeutischen Nutzen sind. Es wurde herausgefunden, dass Peptide mit den Sequenzen SEQ ID NOs: 13 und 14 Epitope tragen, ein Antikörper dagegen, der im Tierversuch therapeutisch ist (siehe folgende Versuche), so dass ein immunogenes Fragment die Formel SEQ ID NO: 13 oder 14 haben kann. Ein zusätzliches Epitop mit der Sequenz SEQ ID NO: 17 wurde ebenso gefunden, und ein Peptid mit der Sequenz von SEQ ID NO: 18, das dieses trägt, löst die Bildung polyklonaler Antiseren, die gegen die 67 kDa Antigen spezifisch sind, aus. Somit kann ein immunogenes Fragment auch die Sequenz SEQ ID NOs: 17 oder 18 haben.
  • Das Staphylokokken-ABC-Transporterprotein, das Epitope einschließlich der oben beschriebenen entwickelt, stellt daher eine therapeutische und diagnostische Möglichkeit dar – das Protein und immunogene Fragmente hiervon können in der Therapie verwendet werden, beide prophylaktisch (z.B. als Immunostimulantien, wie Impfstoffe) und für die Behandlung einer Staphylokokken-Infektion.
  • Ebenso können Bindungsmittel und Neutralisierungsmittel (wie z.B. Antikörper), die gegen das ABC-Transporterprotein, immunogene Fragmente hiervon oder teilweise modifizierte Formen hiervon spezifisch sind, sowohl diagnostisch als auch therapeutisch verwendet werden. Bindungsmittel haben ein Target, gegenüber dem sie spezifisch sind, und in dem Fall, das ein Bindungsmittel ein Antikörper ist, ist das Target ein Antigen. Ein Beispiel für ein therapeutisches Element ist ein Antikörper, der gegen das ABC-Transporterprotein spezifisch ist, was in der Immunotherapie, z.B. der passiven Immunotherapie, angewendet werden kann. Antikörper, deren Herstellung und Verwendung sind bekannt (Harlow, E. und Lane, D., „Antibodies – A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor La boratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 1988; Harlow, E. und Lane, D., „Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998), so dass Antikörper und Antigen-bindende Fragmente hiervon dem Fachmann leicht zugänglich sind.
  • Die Nukleotidsequenz des Proteins oder des immunogenen Fragmentes kann ebenso die Basis für therapeutische Anwendungen bilden. So kann z.B. eine Nukleotidsequenz, die das Protein oder das immunogene Fragment hiervon kodiert, für die Herstellung eines DNA-Impfstoffes verwendet werden (Montgomery, D. L. et al., 1997, Pharmacol. Ther., 74 (2): 195–205; Donnelly, J. J. et al., 1997, Annu. Rev. Immunol., 15: 617–648; Manickan, E. et al., 1997, Crit. Rev. Immunol., 17 (2): 138–154). Andere Neutralisierungsmittel, wie z.B. Ribozyme und Antisens-Oligonukleotide, sind dem Fachmann leicht zugänglich.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung ebenso die Verwendung eines Staphylokokken-ABC-Transporterproteins, eines immunogenen Fragmentes hiervon, von Bindungsmittel und Neutralisierungsmittel, die gegen diese spezifisch sind, in einem Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Staphylokokken-Infektionen bereit.
  • Ebenso wird ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Staphylokokken-Infektionen bereitgestellt, das durch deren Verwendung charakterisiert ist. Es wird auch ein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers bereitgestellt, das deren Verwendung umfasst. Die Dosierung des Arzneimittels kann leicht durch standardisierte Dosierungs-Reaktions-Versuche bestimmt werden. Die Arzneimittel können zusätzlich einen pharma zeutisch verträglichen Träger, ein Verdünnungsmittel oder einen Hilfsstoff enthalten (Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA).
  • Wie zuvor erörtert, können das ABC-Transporterprotein, immunogene Fragmente hiervon, Bindungsmittel und Neutralisierungsmittel, die gegen diese spezifisch sind, auch diagnostisch verwendet werden, so dass die vorliegende Erfindung deren Verwendung in der Herstellung eines diagnostischen Test-Kits für Staphylokokken, insbesondere für Staphylokokken-Infektionen, bereitstellt. Ebenso wird die Verwendung in einem diagnostischen Testverfahren für Staphylokokken bereitgestellt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch ein diagnostisches Testverfahren für Staphylokokken-Infektionen bereitgestellt, das folgende Schritte enthält:
    • i) Reaktion eines ABC-Transporterproteins oder eines immunogenen Fragmentes hiervon gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer Probe,
    • ii) Detektion einer Bindungsreaktion zwischen Antikörper und Antigen und
    • iii) Korrelation der Detektion der Bindungsreaktion zwischen Antikörper und Antigen mit der Anwesenheit von Staphylokokken.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch ein diagnostisches Testverfahren für Staphylokokken-Infektionen bereitgestellt, das folgende Schritte enthält:
    • i) Reaktion eines Antikörpers oder anderen Bindungsmittels, das gegen ein ABC-Transporterprotein gemäß der vorliegenden Erfindung spe zifisch ist, mit einer Probe,
    • ii) Detektion einer Bindungsreaktion zwischen Bindungsmittel und Zielmolekül (Target) und
    • iii) Korrelation der Detektion der Bindungsreaktion des Bindungsmittels mit dem Zielmolekül mit der Anwesenheit von Staphylokokken.
  • Die Proben können vom Plasma eines Patienten oder einer Fraktion hiervon, z.B. Seren oder Antiseren, stammen. Das diagnostische Testverfahren kann für eine Staphylokokken-Infektion eines Patienten dienen, wobei die Probe eine Probe des Patienten ist und die Korrelation die Staphylokokken-Infektion des Patienten bestimmt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ebenso ein diagnostisches Test-Kit für die Durchführung eines diagnostischen Testverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Das diagnostische Test-Kit kann Anweisungen für die Durchführung eines diagnostischen Tests unter Verwendung des Kits enthalten.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro-Verfahren zur Diagnose von Staphylokokken-Infektion bereitgestellt, das die Verwendung eines Staphylokokken-ABC-Transporterproteins, eines immunogenen Fragmentes hiervon, eines Bindungsmittels oder eines Neutralisierungsmittels gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Die Erfindung wird durch die folgende Beschreibung verdeutlicht, die lediglich anhand von Beispielen die Diagnose und die Behandlung von Staphylokokken-Infektionen zeigt.
  • Experimentelles
  • Die Versuche wurden unter Verwendung von MRSA-Seren aus Blut und Wundkulturen von verschiedenen Patientengruppen durchgeführt. Antigen-Extrakte wurden von jeder Gruppe hergestellt und ein Screening gegen Antiseren von Patienten durchgeführt. Dies identifizierte ein 67 kDa-Antigen, wonach eine Expressions-Bibliothek, die von einem epidemischen MRSA-Stamm erzeugt wurde, überprüft wurde, wodurch die Identifikation des Proteins ermöglicht wurde.
  • Durch Epitop-Mapping wurden Antigen-Bereiche des Proteins identifiziert und weitere Versuche identifizierten Epitope und diese tragende Peptide mit therapeutischem Potential.
  • Immunoblotting
  • Bakterienstämme
  • Ein epidemischer MRSA (EMRSA)-Stamm wurde von dem klinischen mikrobiologischen Labor der Manchester Royal Infirmary (MRI) erhalten. Der als EMRSA (VSRS) bezeichnete Stamm war sensitiv gegenüber Vancomycin und Rifampicin. Ein separates Isolat des gleichen Klons wurde von einem Patienten erhalten, bei dem eine Resistenz gegen Rifampicin in vivo durch Rifampicin-Verarbreichung (VSRR) hervorgerufen wurde. Gruppen von Seren
    Gruppe 1 Infizierte Patienten, entweder Sputum oder Wunde, die einer Behandlung mit systemischen Vancomycin oder Rifampicin (n = 3) bedürfen. Die Isolate waren durchweg sensitiv gegenüber Rifampicin.
    Gruppe 2 Blutkultur-positive Patienten, die einer Behandlung mit systemischen Vancomycin und Rifampicin (n = 3) bedürfen. Die Isolate waren durchweg sensitiv gegenüber Rifampicin.
    Gruppe 3 Kolonisiertes Beingeschwür eines diabetischen Patienten mit einem gegen Rifampicin resistenten Klon (n = 3). Keine systemische Therapie.
    Gruppe 4 Septicaemia, Blutkultur-positiv, behandelt durch Vacomycin und Rifampicin (n = 3). Der Stamm wurde während der Behandlung resistent gegenüber Rifampicin.
  • Herstellung von gegenüber Vancomycin resistenten EMRSA
  • Einzelne Kolonien von VRRS und VSRR (s. oben) wurden in einer 10 ml Nährstoffbrühe Nr. 2 (Oxoid, UK) mit Vancomycin bei 1 μg/ml geimpft und bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Als die Brühe trüb wurde, wurden vier Tropfen (120 μl) für die Impfung weiterer 10 ml der Brühe mit 2 μg/ml Vancomycin verwendet. Als diese Brühe trüb wurde, wurden 120 μl der Kultur verwendet, um eine andere Brühe mit 3 μg/ml Vancomycin zu impfen. Dies wurde mit stufenweise steigenden Konzentrationen von Vancomycin (4, 5, 6, 7, 8 μg/ml usw.) wiederholt, bis für EMRSA 15 22 μg/ml und für das gegen Rifampicin resistente EMRSA 16 μg/ml erreicht wurde. Die neuen Klone wurden VSRR bzw. VRRR genannt.
  • Eine Kultur mit hoher Resistenz gegenüber Vancomycin wurde für die Impfung von vier 1-Liter-Kolben, jeweils enthaltend 500 ml der Nährstoffbrühe Nr. 2 verwendet. Dies waren 30 μg/ml für den gegenüber Rifampicin resistenten Stamm und 20 μg/ml für das gegen Rifampicin resistente Isolat.
  • Sammeln der Proben der Brühe für das Vancomycin-Assay
  • Nach Zusatz von Vancomycin zu der Brühe unter Verwendung einer sterilen 5 ml-Pipette wurde der Kolben leicht geschüttelt. Vor der Impfung des Kolbens mit den Test-Bakterien wurde unter Verwendung einer frischen sterilen Pipette eine Probe der Brühe (1 ml) genommen. Die Probe wurde in das klinische mikrobiologische Labor für ein Vancomycin-Assay gesandt.
  • Die Kolben wurden bei 37°C unter Schütteln (200 rpm) inkubiert, bis die Brühe trüb wurde. Vor der Ernte der Zellen wurde eine Probe (2 ml) der Brühe unter Verwendung einer sterilen Pipette in dem Sicherheitsgehäuse erhalten. Die Probe wurde bei 13000 rpm 10 min. lang zentrifugiert. Das Fällungsmittel wurde in Hibitane verworfen und der Überstand wurde unter Verwendung eines 0,22 μm Filters von Millipore gefiltert und für das Vancomycin-Assay versandt. Der Wert des gegenüber dem Rifampicin sensitiven Stamm bei Beginn der Impfung betrug 27,1 μg/ml und am Ende 8,1 μg/ml. Die korrespondierenden Werte für das gegenüber Rifampicin resistente Klon waren 20,7 μg/ml und 7 μg/ml.
  • Ernten der Zellen
  • Die folgenden Schritte wurden in einem Sicherheitsgehäuse durchgeführt. Zum Zeitpunkt der Ernte wurde von jeder Kultur eine Agar-Reinheitsplatte mit Blut hergestellt, um sicherzustellen, dass die Kulturen nicht kontaminiert wurden. Nach 15-minütiger Inkubation durch Zentrifugation bei 3500 rpm wurden die Zellen geerntet. Die überstehenden Lösungen wurden in Hibitane verworfen. Die Rückstände wurden zweimal in steriler Kochsalzlösung mit Zentrifugation bei 3500 rpm 15 min. lang nach jedem Waschgang gewaschen.
  • Lyse der Zellen unter Verwendung des Bio X-Press Zellen-Desintegrators
  • Die geernteten Zellen wurden in einen leeren Zylinder des montierten Bio X-Press Desintegrators (LKB Instruments, Bromma, Schweden) unter Verwendung einer Einweg-Plastikpipette pipettiert und der zweite Kolben wurde in den Zylinder mit der flachen Seite nach unten platziert. Der Kolben wurde an seine Stelle gedrückt bis ein leichter Widerstand festgestellt wurde. Die Anordnung wurde dann mit einer Plastikhülle abgedeckt und mit dem die Zellen in einem erhöhten Niveau enthaltenen Zylinder auf ihre Seite gedreht und über Nacht bei –20°C belassen. Die manuell betriebene hydraulische Pumpe wurde mit dem eingezogenen Stellring fingerfest befestigt. Die Plastik-Abdeckung wurde von dem gefrorenen Desintegrator entfernt, der dann in eine aufrechte Position auf der Presse mit dem Kolben des Desintegrators gegenüber der Spitze der Presse gebracht wurde. Die Plastik-Unterstützung wurde auf dem Oberteil des Kolbens des Desintegrators platziert, wobei die Unterstützung zentral auf dem Kolben positioniert wurde, der Griff pumpte langsam bis die Plastik-Unterstützung bis zur Spitze der Presse stieg und das Pumpen wurde fortgesetzt bis eine Anzahl von „Sprüngen" während des Pumpens gehört wurde, wobei die Nadel der Druckanzeige nicht den roten Bereich erreichte. Der Druck wurde durch Drehen des Hebels an der Pumpe gesenkt, sobald der Kolben über die volle Distanz ausgelenkt wurde.
  • Der Desintegrator wurde demontiert und die gemeinen Zellen wurden unter Verwendung eines Spatels in einen sterilen Container geschöpft. Die Zellen wurden bei 3500 rpm 10 min. lang geschleudert, die überstehende Lösung wurde entfernt und der Niederschlag verworfen. Die überstehende Lösung wurde später bei einer geeigneten Konzentration in der Gel-Elektrophorese mit Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid (SDS-PAGE) verwendet.
  • Gel-Elektrophorese mit Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid (SDS-PAGE)
  • Vorbereitung der Ausrüstung und des Gels für die SDS-PAGE
  • Für die Verwendung dieser Technik wurde die folgende Ausstattung verwendet, um zwei Gele herzustellen: vier Seitenklammern, zwei kurze Glasplatten, zwei lange Glasplatten, vier Plattenseparatoren, zwei Gummiunterlagen und eine Basisklammer.
  • Zur Herstellung jedes Gels wurden ein Paar Glasplatten (kurz und lang) an deren Seiten zusammengeklammert. Zwischen beiden Platten wurde durch Plattenseparatoren ein Raum erzeugt. Die Platten wurden auf einer Gummiunterlagendichtung platziert und in einer Basisklammer gesichert. Destilliertes Wasser wurde zwischen die Platten bis auf ein Niveau knapp über den Pfeilen auf den Seitenklammern gegossen. Das Wasserniveau wurde mit einem Filzstift markiert und wenige Minuten so belassen, um sicherzustellen, dass keine Lecks existieren. Das Wasser wurde dann ausgekippt.
  • Eine Markierung wurde 4 cm unterhalb der Spitze der kürzeren Glasplatte erzeugt und markiert. Die aufgelöste Gelmischung wurde in die Vorrichtung bis zu dieser Höhe gegossen. Unter Verwendung einer Plastik-Pipette wurde eine Schicht von destilliertem Wasser oben auf der Gelmischung zugesetzt, die man 60 min. bei Raumtemperatur sich setzen ließ. Nachdem sie sich gesetzt hatte, wurde die Schicht des destillierten Wassers auf dem aufgelösten Gel abgegossen und ein Kamm mit 10 Wells wurde zwischen die beiden Glasplatten mit einem Winkel von 45° eingesetzt. Unter Verwendung einer Pipette wurden 5 ml einer Sammelgelmischung zugesetzt, wobei sorgfältig die Bildung von Blasen vermieden wurde. Anschließend wurde der Kamm eingesetzt und zentriert, weitere Gelmischungen unter Überfüllung der Plattenoberfläche zugesetzt, die man 30 min. sich setzen ließ. Die Gele können am selben Tag verwendet werden oder im Kühlraum über Nacht nach Einhüllen der Oberfläche des Trenngels und des Kamms mit einem Stück einer Plastikhülle aufbewahrt werden.
  • Für die Verwendung des Gels wurde der Kamm vorsichtig entfernt und die Wells wurden dreimal mit Elektrophorese-Puffer gewaschen. Jeder Elektrophorese-Puffer am Boden des Wells wurde mit einer Spritze und Nadel entfernt. Die das Gel enthaltenden Glasplatten wurden von der Basisklammer entfernt und an der Halterung des Behälters, der in den Elektrophorese-Behälter abgesenkt wurde, geklammert.
  • Herstellung und Laden der Proben
  • Die Proben wurden in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen hergestellt. Insgesamt 25 μl von jeder Probe, die auf dem Gel laufen sollte (verdünnt mit destilliertem Wasser gemäß den Ergebnissen der Antigen-Titration), wurden mit 25 μl Spaltungs-Puffer gemischt. Ebenso wurden insgesamt 20 μl Spaltungs-Puffer zu 20 μl eines Regenbogen (RTM)-gefärbten Proteinmolekulargewichts-Marker (Amersham International plc, Buckinghamshire) zugesetzt.
  • Die Proben und der Marker in dem Spaltungs-Puffer wurden 2 bis 3 min. lang in einem geeigneten Behälter gekocht. Unter Verwendung einer Gilson-Pipette wurden 25 μl des Markers anschließend in den Well 1 und 50 μl jeder Probe in den passenden Well gegeben.
  • Mit einer Plastik-Pipette wurden die Proben mit dem Elektrophorese-Puffer überschichtet, wobei sorgfältig vermieden wurde, dass eine Probe in die nächste hinüberläuft. Der verbleibende Raum zwischen den Glasplatten wurden mit Elektrophorese-Puffer gefüllt, der zentrale Behälter wurde gefüllt bis der Puffer ungefähr 2 mm unterhalb der Oberfläche des Behälters stand und das Kühlwasser wurde angestellt. Der Deckel des Behälters wurde entfernt und die Vorrichtung wurde bei einem konstanten Strom von 40 bis 50 mA für jedes Gel angeschaltet, wobei die in dem zentralen Behälter aufsteigenden Blasen kontrolliert wurden.
  • Man ließ die Gele 3 h lang laufen oder bis die blaue Linie etwa 1 cm oberhalb des Bodens der Platte lag.
  • Nach Abschalten des Eletrophorese-Stroms und des Wassers wurde die die Glasplatten enthaltende Halterung aus dem Behälter genommen und überschüssiger Elektrophorese-Puffer abgegossen. Der Glasplatten-Set wurde entklammert und die Glasplatten wurden durch vorsichtiges Bewegen mit einem Seitenstück aus Plastik (Plattenseparator) getrennt. Nach Entfernen des Sammelgels wurde das Trenngel für die Silber-Färbung oder das Transblotting entfernt.
  • Silber-Färben von SDS-PAGE-Gelen
  • Separierte Proteine in Polyacrylamid (Trenn)-Gelen wurden mit dem Daiichi-Silber-Färbe-II-Kit (Integrated Separations Systems, Japan) gefärbt. Gele, die in der Titration der Antigen-Herstellung verwendet wurden und Gele, die für den Vergleich der Protein-Expression unter verschiedenen Inkubationsbedingungen gewachsenen Organismen verwendet wurden, wurden unter Verwendung der Herstellerangaben durch dieses Verfahren gefärbt.
  • Immunoblotting
  • Die Seren wurden gegen die separierten Organismenproteine, die auf eine Nitrocellulose-Membran nach der SDS-PAGE übertragen wurden, geblottet. Der Zusatz von anti-humanem IgG- oder anti-humanem IgM-Konjugat gefolgt von dem passenden Substrat, machte die Visualisierung solcher Proteinbanden möglich, an die IgG- oder IgM-Antikörper, die in den Seren anwesend waren, gebunden wurden.
  • Transblotting
  • Für jedes Gel waren als Materialien ein Plastik-Gelhalter (besteht aus zwei Hälften), zwei Stücke Scotchbrite, vier Stücke des Blotting-Papiers und ein Stück einer Nitrocellulose-Membran erforderlich.
  • Ein Transferbehälter wurde teilweise mit dem Transblotting-Puffer gefüllt und eine Griffseite des Plastikhalters im Behälter platziert. Zwei Stücke Scotchbrite wurden durch eine rollende Bewegung auf den Halter abgesenkt, um zu vermeiden, dass Luftblasen eingefangen werden. Zwei Stücke Filterpapier wurden auf gleichem Wege über dem Scotchbrite platziert. Ein Stück Nitrocellulose-Membran (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA), das auf eine Größe von 15 × 16,5 cm zugeschnitten wurde, wurde auf die Oberfläche gelegt und man ließ es 20 min. aufsaugen.
  • Nachdem der Elektrophorese-Strom und Wasser (von SDS-PAGE) abgeschaltet wurde, wurde die die Glasplatten enthaltende Halterung aus dem Elektrophorese-Behälter herausgenommen. Ein Satz von Platten wurde entklammert und die Glasplatten wurden durch Hebeln mit einem Plastik-Seitenstück getrennt. Nach Entfernung des Sammelgels (Stacking-Gel) wurde das Trenngel von der Glasplatte geschoben, um Rückstände des Sammelgels zu entfernen. Das Trenngel wurde auf die Oberfläche der vollgesogenen Nitrocellulose-Membran gegeben und weitere zwei Stücke Blotting-Papier wurden auf dem Gel platziert. Die andere Hälfte der Plastik-Halterung wurde festgeklammert und die Halterung mit ihrem Inhalt in den Transblotting-Behälter (Transphor Power Lid, Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, USA) abgesenkt. Der Deckel des Behälters wurde entfernt und das Kühlwasser eingeschaltet. Die Vorrichtung lief bei maximaler Leistung 45 min. lang.
  • Als das Transblotting abgeschlossen war, wurde der Strom abgeschaltet und das Kühlwasser abgestellt. Die Halterung wurde entfernt und entklammert und das Gel und die Nitrocellulose-Membran entfernt. Die Membran wurde mit einem scharfen Skalpell auf die Größe des Gels zugeschnitten und man beließ sie in 100 ml 3% BSA (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) bei 4°C über Nacht.
  • Antikörperuntersuchung, Konjugations- und Färbetechniken
  • Sowohl die Ober- als auch die Unterseite der Nitrocellulose-Membran wurde unter Verwendung eines 10-Well-Kamms als Führung markiert. Die Membran wurde unter Verwendung eines Skalpells und eines Lineals in Streifen geschnitten. Die Streifen wurden in einer Streifenbox platziert und jeder Streifen wurde mit 3,8 ml 3% BSA bedeckt (es wurde 3% BSA verwendet, in der die Nitrocellulose über Nacht gelagert wurde). Ein Gesamtvolumen von 200 μl des Serums, das dem Immunoblot unterzogen werden sollte, wurde jedem Streifen zugesetzt, was zu einer Verdünnung des Serums von 1:20 führte. Die Streifen wurden auf einem Rotationsschüttler 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Unter Verwendung der Waschlösung wurden die Streifen jeweils fünfmal 6 min. lang gewaschen. Den passenden Streifen wurde anti-humanes IgG- oder anti-humanes IgM-Alkaliphosphatase-Konjugat in einer Verdünnung von 1:1000 (verdünnt in 3% BSA) zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang gerührt. Die Streifen wurden wiederum wie zuvor fünfmal gewaschen. In der Zwischenzeit wurden NBT (Nitro-Blau-Tetrazolium) und BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat) durch Zusatz von 1 ml DMF (n,n-Dimethylformamid) zu 0,05 g jeder dieser Pulver hergestellt. Kurz vor der Verwendung wurde ein Volumen von 660 μl von NBT und 330 μl von BCIP zu 100 ml des Alkalyphosphatase-Substrats zugesetzt. Jedem Streifen wurden 5 ml dieser Lösung zugesetzt, bis sie gut eingefärbt waren (ungefähr 5 bis 15 min.). Die Reaktion wurde dann durch Waschen der Streifen mit destilliertem Wasser gestoppt und sie wurden zum Trocknen auf Blotting-Papier plat ziert.
  • Herstellung und Screening einer Genom-Expressions-Bibliothek von gegen Methicillin resistentem Staphylococcus aureus
  • In dem Expressions/Klonierungs-Vektor-Lambda-ZAP-Express wurde eine Genom-Bibliothek erstellt, wie es im Wesentlichen von Young & Davis (1983, PNAS USA, 80: 1194–1198) beschrieben ist. Chromosomen-DNA eines klinischen Isolats wurde durch Sau3a teilweise verdaut, Fragmente im Größenbereich von 2 bis 9 kbp wurden in den Vektor eingesetzt, was zur Herstellung von β-Galactosidase-Fusionsproteinen führte. Jede Bibliothek wurde mit IgG-Antikörper, positiv für die 67 kDa-Bande von EMRSA (Verdünnung 1:100) eines Patienten, der sich von einer Blutkultur positiven Septicaemia erholt hatte, gescreent. Positive Klone wurden unter Verwendung von mit Alkalyphosphatase konjugiertem anti-humanen Immunoglobulin (IgG) von der Ziege (1 in 5000) (Sigma, Poole, UK) detektiert. Lysogene wurden aus positiven Klonen in Escherichia coli Y1089 gemäß Huynh, Young und Davis (1985, DNA cloning vol. 1, a practical approach, IRL Press Oxford, S. 49–78, Ed. D. M. Glover) hergestellt. Das durch jede der positiven Klone exprimierte Epitop wurde durch Antigen-Auswahl, wie bei Lyon et al. (1986, PNAS USA, 83: 2989–2993) beschrieben, identifiziert. Hierfür wurde das Serum durch Hybridisierung mit positiven, rekombinanten Lambda-Plaques affinitätsgereinigt. Der gebundene Antikörper wurde dann mit Glycin-Puffer pH 2,8 eluiert und für Immunoblots der Lysate der relevanten Bakterien verwendet.
  • DNA-Sequenzierung
  • Eine PCR mit T3 und T7 Forward- und Reverse-Primern wurde für die Verstärkung der Einführung von DNA aus Seren-positiven Klonen verwendet. Dies wurde in einem TA-Klonierungssystem (Version 1.3, Invitrogen Corporation, Oxon, UK) vor der DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Dideoxy-Terminierungsverfahren (Sequenzversion 2.0 Kit; United States Biochemical, Cambridge, UK) subkloniert. Die ersten Sequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung einer Sequenzierung von Universalprimern durchgeführt, wobei die verbleibende Sequenz unter Verwendung einer Primer-Wander-Strategie durch progressive Synthese von Sequenzierungs-Primern zur Herstellung neuer Sequenzdaten bestimmt wurde.
  • Schlussfolgerung
  • Immunoblotting
  • Das Silber-Färben der Antigen-Extrakte (VSRS, VRRS, VSRR und VRRR) erzeugte das gleiche Muster für alle vier Extrakte. Das Immunoblotting identifizierte Antigen-Banden, die im scheinbaren Molekulargewicht von 27 bis 140 kDa variieren (Tabellen 1 und 2).
  • Patienten erzeugten einen Antikörper gegen das 67 kDa-Antigen in allen vier Gruppen. Dies traf insbesondere zu, wenn sie eine Blutkultur-positive Infektion gehabt hatten, die eine Behandlung mit Vancomycin erfordert. In Gruppe 4 waren ebenso sequentielle Seren von zwei Patienten verfügbar, wobei beide einen erhöhten Anteil von Antikörpern gegenüber diesem Antigen zeigten, als sich der Patient erholte. Dieses Antigen war in allen vier Antigen-Extrakten anwesend.
  • IgG war in den Seren der Patienten, die eine Septicaemia aufgrund des gegenüber Rifampicin resistenten Stammes überlebt hatten, anwesend, aber nicht in den Seren der Patienten, die sich von einer gegenüber Rifampicin sensitiven Septicaemia erholt haben.
  • Ein 67 kDa Antigen-positives Serum wurde anschließend für ein Screening der durch das EMRSA gebildeten Expressions-Bibliothek verwendet. Zwei positive Klone wurden erhalten. Die Antigen-Auswahl zeigte ein Epitop, das durch beide Klone, die mit dem konservierten 67 kDa-Antigen eines epidemischen EMRSA-Stammes reagiert hatten, exprimiert wurde. Die Sequenzierung zeigte eine Teilsequenz im Rahmen mit dem β-Galactosidase-Gen. Die gesamte eingesetzte Größe betrug 4,5 Kb. Die erhaltene Aminosäurensequenz erzeugte ein Protein mit 3 ATP-Bindungsdomänen und ein Sequenz-Homolog zu der Proteingruppe, zu der ABC-Transporter gehören (Fath und Kilter 1993, Microbiological Reviews 37, 995–1017). Dies war das C-Ende des Proteins, beginnend bei Aminosäure 133 der SEQ ID NO: 2. Die Sequenz wurde in der Genomsequenz-Projektdatenbank von S. aureus NCTC 8325 gesucht, wodurch Treffer für Contigs 1184, 1177 und 1158 erhalten wurden, die Sequenzen aufwiesen, die teilweise mit den identifizierten Sequenzen überlappen. Dies wiederum erlaubte die Synthese von PCR-Primern für die Klonierung des kompletten Gens, das das Protein kodiert.
  • Das vollständige ABC-Transporterprotein wurde aus gereinigtem EMRSA-DNA unter Verwendung der PCR-Primer mit SEQ ID NOs: 15 und 16 (Vorwärts- bzw. Rückwärts-Primer) erhalten.
  • Das vollständige Gen wurde in den pBAD-Vektor über das pBAD-TA-TOPO-Klonierungs-Kit (Invitrogen) klo niert und in E. coli exprimiert. Nach der Expression wurde das Protein affinitätschromatographisch gereinigt, wodurch das Protein in dessen ursprünglicher Konformation bereitgestellt wurde. Es wurde eine Säule mit der Ni-NTA-Aufschlämmung von Qiagen hergestellt, die das His-Tag am N-Ende des Proteins bindet. Das Protein wurde mit 250 mM Imidazol mit einer Endkonzentration von 1 mg/ml von der Säule gewaschen.
  • Durch Injektion des ABC-Transporters bei Kaninchen wurde polyclonales Antiserum hergestellt (0,5 mg/Injektion bei vollständigem Freund's chem. Adjuvans wiederholt nach 14 Tagen und 14-tägig in unvollständigen Freund's chem. Adjuvans). Die Seren vor und nach der Blutung (erhalten nach 28 Tagen) wurden hingegen das vom epidemischen EMRSA-Stamm erhaltene Pressat bei einer Verdünnung von 1:100 mit einem Immunoblot geblottet. Dies zeigte eine Serenkonversion zu Antigenen mit scheinbaren Molekulargewichten von 67 und 33 kDa.
  • Dies bestätigte weiter die Identität des 67 kDa Staphylokokken-Antigens.
  • Epitop-Mapping
  • Eine Serien von überlappenden Nonapeptiden, die die Reste 135 bis 533 der erhaltenen Aminosäuresequenz abdecken, wurden auf Polyethylen-Pins mit Reagenzien aus einem Epitop-Scanning-Kit (Cambridge Research Biochemicals, Cambridge, United Kingdom), wie durch Geysen, H. M. et al. (Journal of Immunological Methods, 102: 259–274) beschrieben, hergestellt. Peptid 1 bestand aus den Resten 1 bis 9, Peptid 2 bestand aus den Resten 2 bis 10 etc. Die Reaktivität von jedem Peptid mit Seren von Patienten (1:200) wurde für IgG durch ELISA bestimmt. Die Daten wurden als A405 nach 30 min. Inkubation exprimiert. Patientenseren mit EMRSA-Kolonisierung einer signifikanten klinischen Stelle (chronisch ambulante Dialysate nach Infektion (n = 2), infizierter Amputationsstumpf nach Infektion (n = 3) mit negativen Blutkulturen, aber weiterhin eine systemische Vancomycin-Therapie erfordernd, Septicaemia aufgrund von EMRSA erfolgreich behandelt durch Vancomycin und Rifampicin (Nachinfektion, n = 4), fatale Septicaemia aufgrund von EMRSA (n = 4)) und Kontrollseren von Krankenhauspatienten (n = 2) wurden untersucht.
  • Indirekte ELISA
  • Drei nach dem zuvor beschriebenen Verfahren erhaltene Epitope wurden nacheinander ausgewählt (SEQ ID NOs: 3 bis 5) und Peptide 1 bis 3 (SEQ ID NOs: 6 bis 8), die diese repräsentieren, wurden durch ein BT7400 Multiple Peptide Synthesizer (Biotech Instruments, Luton, UK) hergestellt. Diese wurden beim indirekten ELISA verwendet. Seren
    Gruppe A Kein Nachweis von EMRSA, Kolonisation oder Infektion (n = 12).
    Gruppe B Durch EMRSA kolonisierte Patienten an einer klinisch wichtigen Stelle, chronisch ambulante Dialysate (n = 2) oder Amputationsstellen (n = 2), die eine systemische Vancomycin-Therapie zur Heilung erfordern.
    Gruppe C Patienten, die eine Septicaemia aufgrund von EMRSA überlebten, behandelt durch Vancomycin (n = 3).
    Gruppe D Patienten, die an Septicaemia aufgrund von EMRSA (n = 3) überlebten.
  • Durch einfache Adsorption von Peptiden auf einer Mikrotiterplatte wurde das folgende Verfahren für jedes Peptid durchgeführt. Das Peptid wurde in 2 ml 0,01 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,2 und auf eine Konzentration von 10 μg/ml (1/100) im gleichen Puffer verdünnt.
  • Das indirekte ELISA wurde ebenso mit den Peptiden 4 und 5 mit den Sequenzen SEQ ID NOs: 13 und 14 durchgeführt. Insgesamt 39 Seren mit unterschiedlichem klinischen Hintergrund wurden verwendet. Seren
    Gruppe E 12 Seren von 12 Patienten ohne Hinweis auf Staphylokokken-Infektion oder -Kolonisation.
    Gruppe F 3 Seren von 3 Patienten mit Diabetes und einem Fußgeschwür, kolonisiert mit dem gegenüber Rifampicin resistenten Klon.
    Gruppe G 14 Seren von 14 Patienten mit positiven Kulturen aus einer intravenösen Linie, Sputum oder Wundabstrich, die eine systemische Vancomycin- und Rifampicin-Therapie erforderten.
    Gruppe H 7 Seren von Patienten, die sich von einer Blutkultur-positiven Septicaemia erholt hatten.
    Gruppe I 3 Seren von Patienten, die an einer MRSA-Infektion gestorben waren, wie erwiesen durch anhaltende positive Blutkulturen trotz antibiotischer Therapie.
    • (1) 150 μl-Aliquots des Peptids (10 μg/ml in 0,01 M PBS) wurden in die Wells einer Falcon 3912 Mikroassay-Platte pipettiert und über Nacht bei 4°C inkubiert.
    • (2) Das ungebundene Peptid wurde durch viermaliges Waschen (4 × 10 min.) mit 0,05% Tween 20 in 0,01 M PBS (pH 7,2) entfernt.
    • (3) Die Platten wurden mit 2% Magermilch-10% FCS in 0,01 M PBS 1 h lang bei 37°C blockiert.
    • (4) Die Platten wurden viermal (4 × 10 min.) mit 0,05% Tween 20 in 0,01 M PBS gewaschen und das zu untersuchende Serum wurde den Wells der Mikroassayplatte (3 Wells wurden für jedes Serum verwendet) zugesetzt (1/100 Verdünnung in der Blockierungslösung) und 2 h lang bei 37°C inkubiert.
    • (5) Die Platten wurden viermal (4 × 10 min.) mit 0,05% Tween 20 in 0,01 M PBS gewaschen, Sekundärantikörper, anti-humanes IgM (oder IgG) Peroxidase-Konjugat (Verdünnung von 1/1000 in der Blockierungslösung) wurde zugesetzt und die Inkubation 1 h lang bei 37°C fort.
    • (6) Die Platten wurden viermal (4 × 10 min.) mit 0,05% Tween 20 in 0,01 M PBS gewaschen, gefolgt von einem weiteren Waschschritt mit 0,01 M PBS. Die Platte wurde dann 45 min. lang bei Raumtemperatur unter Rühren in 0,5 mg/ml frisch hergestellter 2,2 Azino-bis[3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure]diammonium (ABTS-Tabletten) in einem Citratpuffer (pH 4,0) mit 0,01% (w/v) Wasserstoffperoxid inkubiert.
    • (7) Kontrollwells wurden in jeder Platte verwendet. Drei Wells mit ABTS-Lösung alleine und drei Wells mit ABTS-Lösung plus antihumanes IgG- oder IgM-Meerrettichperoxidase-Konjugat wurden verwendet.
    • (8) Messungen der optischen Dichte (O. D.) wurden mit einem ELISA-Plattenleser (Titertek Multiscan) bei einer Wellenlänge von 405 nm durchgeführt.
    • (9) Die mittleren Ablesungen für jeden der drei Wells pro Patientenserum wurden bestimmt.
  • Die Immunogenizität des Peptids 6 (SEQ ID NO: 18), das das Epitop mit der Sequenz SEQ ID NO: 17 trägt, wurde durch Herstellung polyclonaler Kaninchen-Antiseren gegen Peptid 6 unter Verwendung des zuvor beschriebenen Protokolls getestet. Seren von vor und nach der Blutung wurden gegen das klonierte und exprimierte ABC-Transporterprotein per Immunoblot geblottet und zeigten eine Serenkonversion zum 67 kDa-Antigen.
  • Herstellung einer Phagen-Antikörper-Entwicklungsbibliothek und ScFv
  • Die Phagen-Antikörper-Entwicklungsbibliothek und ScFv wurden im Wesentlichen hergestellt wie zuvor beschrieben durch Matthews, R. C. et al. (1995, J. Infect. Dis., 171: 1668–1671). In kürze beschrieben wurden periphere Blut-Lymphozyten durch Trennung von 20 ml von heparinisiertem Blut über Ficoll von einem Patienten, der sich von einer EMRSA-Infektion erholt hatte, erhalten. MRNA wurde durch Guanidinium-Thiocyanat extrahiert und anschließend erfolgte eine Reinigung auf einer Oligo(dT)-Cellulose-Säule (Quick Prep mRNA; Pharmacia, St. Albans, UK). Eine Synthese von erststrängiger cDNA wurde mit einem Primer mit konstantem Bereich für alle vier Unterklassen der schweren Ketten von humanem IgG (HulgG1–4) durchgeführt (Matthews, R. C. et al., 1994, Serodiagn. Immunother. Infect. Dis., 6: 213–217), wobei Avian-Myeloblastosis-Virus-Reverse-Transkriptase (HT Biotechnology, Cambridge, UK) verwendet wurde. Die schwerkettigen Gene mit variablen Domänen wurden durch primäre PCRs mit auf der Familie basierenden Vorwärts-(HuJH1–6) und Rückwärts-(HuVH1a bis -6a)-Primer verstärkt. Eine Sfi1-Restriktionsstelle wurde stromaufwärts zu dem VH3a rück-erzeugten Produkt vor der Anordnung mit einem verschiedenartigen Pool von leichtkettigen Genen mit variablen Domänen eingeführt. Letzteres führte ebenso ein Linker-Fragment (Gly4 Ser3) und eine Not1-Stelle stromabwärts ein. Durch Verwendung der Sfi1- und NoI1-Restriktionsenzymstellen wurde das Produkt ohne Richtungsvorgabe in einem Phagemid-Vektor kloniert. Der gebundene Vektor wurde in E. coli TG1 durch Elektroporation eingeführt und die Phagen wurden mit der Helfer-Phage M13K07 (Pharmacia) gesichert. Um Antigen-spezifische scFv anzureichern, wurde die Phagen-Bibliothek gegen Peptide, die zwei der durch Epitop-Mapping entworfenen Epitope repräsentieren, nämlich Peptid 1 (SEQ ID NO: 6) und Peptid 2 (SEQ ID NO: 7), geschwenkt (durch Panning). Das Schwenken (Panning) wurde in Immunoröhrchen durchgeführt, die mit dem korrespondierenden Peptid beschichtet waren. Gebundene Phagen wurden mit Log-Phase E. coli TG1 eluiert. Nach Sicherung mit M13K07 wurden die Phagen weitere dreimal gegen das Peptid erneut geschwenkt. BstN1 (New England Biolabs, Hiychen, UK)-DNA-Fingerprint wurde zur Bestätigung der Anreicherung von spezifischem scFv nach aufeinanderfolgenden Runden des Pannings verwendet.
  • Tierversuche
  • Versuch 1
  • 30 weiblichen CD1-Mäusen wurde ein Bolus von 2 × 106 Kolonie-bildenden Einheiten (cfu) von EMRSA in Form einer IV-Injektion verabreicht. Zwei Stunden später wurde ihnen entweder M13K07 (108 Phage, 200 μl Bolus, n = 10), Phage 12 (2 × 108 Phage, 200 μl Bolus, n = 10) oder Phage 16 (3,16 × 108 Phage, 200 μl Bolus, n = 10) verabreicht. Koloniezählungen der Niere, Leber und der Milz wurden an den Tagen 3 und 7 nach der Injektion durchgeführt, wobei der Tag der Injektion als Tag 1 betrachtet wird.
  • Versuch 2
  • 30 weiblichen CD1-Mäusen wurde jeweils ein 100 μl Bolus von EMRSA enthaltend 3 × 107 cfu verabreicht. Zwei Stunden später wurde ihnen eine Negativphagen-Super-Bibliothek (7 × 1010 Phage, 200 μl Bolus, n = 10), Phage 12 (9 × 107 Phage, 200 μl Bolus, n = 10) oder Phage 16 (5 × 108 Phage, 200 μl Bolus, n = 10) verabreicht. Koloniezählungen der Niere, Leber und Milz wurden an den Tagen 1 und 2 durchgeführt.
  • Versuch 3
  • 48 weiblichen CD1-Mäusen wurde jeweils ein 100 μl Bolus von EMRSA enthaltend 2 × 107 cfu verabreicht. Zwei Stunden später wurde ihnen entweder eine negative Phage (108 Phage, 200 μl Bolus, n = 12), Phage 12 (108 Phage, 200 μl Bolus, n = 12), Phage X (107 Phage, 200 μl Bolus, n = 12) oder Phage 4 (106 Phage, 200 μl Bolus, n = 12) verabreicht. Die Hälfte der Tiere wurden ausgewählt und eine zweite Dosis der Phage verabreicht. Die verbleibenden Tiere wurden am Tag 2 ausgemerzt.
  • Versuch 4
  • 45 weiblichen CD1-Mäusen wurde jeweils ein 100 μl Bolus von EMRSA enthaltend 2 × 107 cfu verabreicht. Zwei Stunden später wurde ihnen entweder eine negative Phage (2,5 × 107 Phage, 200 μl Bolus, n = 15), Phage X (3,3 × 106 Phage, 200 μl Bolus, n = 15) oder Phage Y (1,3 × 106 Phage, 200 μl Bolus, n = 15) verabreicht. Fünf Tiere von jeder Gruppe wurden für das Koloniezählen am Tag 2 ausgemerzt und die verbleibenden 10 in jeder Gruppe am Tag 3.
  • Ergebnisse
  • Epitopmapping
  • Das Epitopmapping definierte sieben Bereiche in den Resten 135 bis 533 des ABC-Transporterproteins, wo Patienten erfolgreich gegen EMRSA-Septicaemia behan delt wurden. Ein Bereich wurde als Epitop-tragend festgelegt, wenn drei oder mehr aufeinanderfolgende Wells mit einer mittleren optischen Dichte (OD) mindestens zwei Standardabweichungen oberhalb von der von Patienten-Kontrollproben und von Patienten mit Septicaemia, die starben, zeigten (Tabelle 3). Die überlappenden Aminosäuresequenzen wurden durch einen Vergleich der ersten und letzten Peptidsequenzen erhalten. Die Seren von kolonisierten Patienten waren ebenso positiv mit einigen der Epitope.
  • Indirekte ELISA
  • Die Ergebnisse für die Peptide 1 bis 3 sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Ergebnisse für die Peptide 4 und 5 sind in Tabelle 10 dargestellt.
  • Schlussfolgerung
  • Kolonisierte Patienten (Gruppe B) erkannten Peptide 1 und 3 mehr als Peptid 2. Peptid 3 war am wenigsten immunogen. IgG gegen Peptid 2 (Gruppe C) wurde in den Patienten gefunden, die eine Septicaemia überlebten, während es nicht in kolonisierten Patienten (Gruppe B) und bei verstorbenen Patienten (Gruppe D) gefunden wurde. Die Ergebnisse, die für die Peptide 4 und 5 erhalten wurden, zeigen eine positive Korrelation zwischen Antikörper gegen sowohl Peptid 4 als auch 5 und das Überleben von einer systemischen Infektion.
  • Menschliche rekombinante Antikörper
  • Diese Peptide wurden für das Panning der Phagen-Antikörper-Entwicklungsbibliothek (siehe oben) verwendet. Die primäre PCT-Verstärkung der Familien der schwerkettigen Gene mit variablen Domänen zeigte eine Ver stärkung von VH3a alleine, wobei ein 330-bp-Produkt erstellt wurde, das in die Bibliothek der leichtkettigen Gene mit variabler Domäne eingebaut wurde. Die BstN1-Fingerprints der PCR-amplifizierten scFv-Einsätze vor dem Panning zeigte eine sehr heterogene Bibliothek. Nach dem Panning gegen Peptid 1 herrschten zwei BstNI-Fingerprints (X und Y) vor und nach dem Panning mit Peptid 2 herrschten zwei weitere BstN1-Fingerprints (12 und 16) vor. Diese wurden für die Tierversuche ausgewählt.
  • Tierversuche
  • Versuch 1
  • Die Koloniezählungen sind in Tabelle 5 zusammengefasst. In der Gruppe der Mäuse, denen Klon 12 verabreicht wurde, starben zwei Mäuse spontan, während in der Gruppe von Mäusen, denen Klon 16 am Tag 1 gegeben wurde, eine Maus starb.
  • Schlussfolgerung
  • M13K07 (negative Kontrolle) am Tag 3 ergab ähnliche Ergebnisse für die Niere, während Leber und Milz eine gewisse Aktivität mit den Klonen 12 und 16 zeigte. Am Tag 7 zeigten M13K07 und Klon 16 gleiche Ergebnisse, während Klon 12 geringere Zahlen als M13K07 in Niere, Leber und Milz zeigte.
  • Versuch 2
  • Die Koloniezählungen sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
  • Schlussfolgerung
  • Die Superbibliothek (negative Kontrolle) gab gleiche Ergebnisse für Klon 16. Klon 12 hatte geringere Zahlen für Niere und Milz (Tag 1) und Milz und Leber (Tag 2).
  • Versuch 3
  • Die Koloniezahlen sind in den Tabellen 7 und 8 zusammengefasst.
  • Schlussfolgerung
  • Die negative Phage produzierte gleiche Zahlen für Phage 12 (Niere, Leber), Phage X (Leber, Milz) am Tag 1 und Page X (Leber, Milz) am Tag 2. Phage Y war durchweg positiv und positiver als Phage 12 mit der Ausnahme der Zahlen für die Niere am Tag 2.
  • Versuch 4
  • Die Koloniezahlen sind in Tabelle 9 zusammengefasst.
  • Schlussfolgerung
  • Die negative Phage produzierte gleiche Zahlen für Phage X (Niere, Milz) am Tag 3 und Phage Y (Niere) am Tag 2. Die anderen Parameter zeigten eine therapeutische Antwort für die Phagen X und Y, wobei Y aktiver an den Tagen 2 und 3 mit Ausnahme der Zahlen für die Niere am Tag 2 war.
  • Gesamtschlussfolgerung
  • Die Phagen 12 X und Y zeigten alle therapeutische Aktivität, wodurch die durch die Peptide 1 bis 5 repräsentierten Epitope als Targets für die Antikörper-Therapie bestätigt wurden.
  • Tabelle 1
    Figure 00350001
  • Tabelle 2
    Figure 00360001
  • Tabelle 3
    Figure 00370001
  • Tabelle 4
    Figure 00380001
  • Tabelle 5
    Figure 00380002
  • Tabelle 6
    Figure 00390001
  • Tabelle 7
    Figure 00390002
  • Tabelle 8
    Figure 00390003
  • Tabelle 9
    Figure 00400001
  • Tabelle 10
    Figure 00400002
  • Sequenz-Protokoll
    Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001

Claims (21)

  1. Staphylokokken-ABC-Transporterprotein mit der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder einer teilweise modifizierten Form hiervon, die mindestens 70% Homologie mit dieser über die gesamte Länge aufweist, oder ein immunogenes Fragment hiervon für die Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Diagnose des menschlichen oder tierischen Körpers.
  2. Staphylokokken-ABC-Transporterprotein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es durch eine teilweise modifizierte Form von SEQ ID NO: 1 kodiert ist, die mindestens 70% Homologie mit dieser über die gesamte Länge aufweist und eine allele Mutation des Staphylokokken-ABC-Transporterproteins nach Anspruch 1 enthält.
  3. Staphylokokken-ABC-Transporterprotein nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens 80, 90 oder 95% Homologie mit der Sequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
  4. Eine Nukleotidsequenz, die ein Staphylokokken-ABC-Transporterprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert, für die Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Diagnose des menschlichen oder tierischen Körpers.
  5. Nukleotidsequenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist.
  6. Staphylokokken-ABC-Transporterprotein oder dieses kodierende Nukleotidsequenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Staphylococcus S. aureus, eine Koagulase-negativer Staphylococcus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hyicus oder S, saprophyticus ist.
  7. Immunogenes Fragment eines Staphylokokken-ABC-Transporterproteins nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Fragment eine der Sequenzen SEQ ID NOs: 3–14, 17 oder 18 aufweist.
  8. Verwendung eines Staphylokokken-ABC-Transporterproteins oder eines immunogenen Fragmentes hiervon nach einem der vorhergehenden Ansprüche für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Staphylokokken-Infektionen.
  9. Verwendung eines Bindungs- oder Neutralisierungsmittels, das gegen ein Staphylokokken-ABC-Transporterprotein oder immunogenes Fragment hiervon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 spezifisch ist, für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Staphylokokken-Infektionen, wobei das Bindungs- oder Neutralisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Antigen-bindenden Fragment hiervon, einem DNA-Impfstoff, Ribozym und einem Antisense-Oligonukleotid.
  10. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Staphylokokken-Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Staphylokokken-ABC-Transporterprotein oder ein immunoge nes Fragment hiervon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 verwendet wird.
  11. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Staphylokokken-Infektionen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Bindungs- oder Neutralisierungsmittel, das gegen ein Staphylokokken-ABC-Transporterprotein oder ein imunogenes Fragment hiervon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 spezifisch ist, verwendet wird, wobei das Bindungs- oder Neutralisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Antigen-bindenden Fragment hiervon, einem DNA-Impfstoff, einem Ribozym und einem Antisense-Oligonukleotid.
  12. Verwendung eines Staphylokokken-ABC-Transporterproteins, einem immunogenen Fragment hiervon oder Bindungs- oder Neutralisierungsmittel, die gegen dieses Staphylokokken-ABC-Transporterprotein spezifisch sind, nach einem der Ansprüche 1 bis 7, für die Herstellung eines diagnostischen Test-Kits für Staphylokokken, wobei das Bindungs- oder Neutralisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Antigen-bindenden Fragment hiervon, einem DNA-Impfstoff, einem Ribozym und einem Antisense-Oligonukleotid.
  13. Verwendung eines Staphylokokken-ABC-Transporterproteins, eines immunogenen Fragmentes hiervon oder eines Bindungs- oder Neutralisierungsmittel, das gegen dieses Staphylokokken-ABC-Transporterprotein spezifisch ist, nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in einem diagnostischen Test, wobei das Bindungs- oder Neutralisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Antigen-bindenden Fragment hiervon, einem DNA-Impfstoff, einem Ribozym und einem Antisense-Olignukleotid.
  14. Verwendung eines Staphylokokken-ABC-Transporterproteins eines immunogenen Fragmentes hiervon oder eines Bindungs- oder Neutralisierungsmittels, das gegen dieses Staphylokokken-ABC-Transporterprotein spezifisch ist, nach einem der Ansprüche 1 bis 7, in einem Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Test-Kits oder in einem diagnostischen in vitro-Testverfahren, wobei der Kit oder das Verfahren für die Diagnose von Staphylokokken dient.
  15. Ein diagnostisches in vitro-Testverfahren für Staphylokokken, das folgende Schritte enthält: (i) Reaktion eines Staphylokokken-ABC-Transporterproteins oder eines immunogenen Fragmentes hiervon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit einer Probe; (ii) Detektion einer Bindungsreaktion zwischen Antikörper und Antigen und (iii) Korrelation der Detektion der Bindungsreaktion zwischen Antikörper und Antigen mit der Anwesenheit von Staphylokokken.
  16. Ein diagnostisches in vitro-Testverfahren für Staphylokokken, das folgende Schritte enthält: (i) Reaktion eines Bindungs- oder Neutralisierungsmittels, das gegen ein Staphylokokken-ABC-Transporterprotein oder ein immunogenes Fragment hiervon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 spezi fisch ist, mit einer Probe, wobei das Bindungs- oder Neutralisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Antigen-bindenden Fragment hiervon, einem DNA-Impfstoff, einem Ribozym und einem Antisense-Oligonukleotid, (ii) Detektion einer Bindungsreaktion zwischen Bindungs- oder Neutralisierungsmittel und Zielmolekül und (iii) Korrelation der Detektion der Bindungsreaktion des Bindungs- oder Neutralisierungsmittels mit dem Zielmolekül mit der Anwesenheit von Staphylokokken.
  17. Diagnostisches Testverfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindungsmittel ein Antikörper und das Zielmolekül ein Antigen ist.
  18. Diagnostisches Testverfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass es für die Diagnose von Staphylokokken-Infektionen in einem Patienten geeignet ist, wobei die Probe eine Patientenprobe ist und die Korrelation Staphylokokken-Infektionen des Patienten bestimmt.
  19. Diagnostisches Testverfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Plasma, Serum oder Antiserum des Patienten ist.
  20. Diagnostisches Test-Kit zur Durchführung eines diagnostischen Testverfahrens nach einem der Ansprüche 15 bis 19 enthaltend ein Staphylokokken- ABC-Transporterprotein oder immunogenes Fragment hiervon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder ein Bindungs- oder Neutralisierungsmittel, das gegen ein Staphylokokken-ABC-Transporterprotein oder ein immunogenes Fragment hiervon nach einem der Ansprüche 1 bis 7 spezifisch ist.
  21. Diagnostisches Test-Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Anleitungen für die Durchführung des diagnostischen Tests unter Verwendung des Kits enthalten sind.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0014907D0 (en) * 2000-06-20 2000-08-09 Univ Sheffield Antigenic polypeptides
US7410647B2 (en) 2001-08-02 2008-08-12 University Of Sheffield Antigenic polypeptides
GB0127983D0 (en) * 2001-11-22 2002-01-16 Neutec Pharma Plc Treatment of micro-organism infection
US20080095777A1 (en) * 2004-09-22 2008-04-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic Composition for Use in Vaccination Against Staphylococcei
GB0515550D0 (en) 2005-07-29 2005-09-07 Univ Strathclyde Inactivation of staphylococcus species
WO2008082903A2 (en) * 2006-12-29 2008-07-10 Dyax Corp. Methods for making passive immunotherapies
BRPI1015218B1 (pt) 2009-05-07 2019-10-08 Biomerieux Inc. Métodos para determinar a resistência antimicrobiana
CN103906535B (zh) 2011-08-15 2017-07-14 芝加哥大学 与葡萄球菌蛋白a的抗体相关的组合物和方法
DE112016003453T5 (de) 2015-07-30 2018-04-12 Vital Vio, Inc. Einzeldiodendesinfektion
US10357582B1 (en) 2015-07-30 2019-07-23 Vital Vio, Inc. Disinfecting lighting device
US10918747B2 (en) 2015-07-30 2021-02-16 Vital Vio, Inc. Disinfecting lighting device
US10835627B2 (en) 2017-12-01 2020-11-17 Vital Vio, Inc. Devices using flexible light emitting layer for creating disinfecting illuminated surface, and related method
US10309614B1 (en) 2017-12-05 2019-06-04 Vital Vivo, Inc. Light directing element
US10413626B1 (en) 2018-03-29 2019-09-17 Vital Vio, Inc. Multiple light emitter for inactivating microorganisms
US11639897B2 (en) 2019-03-29 2023-05-02 Vyv, Inc. Contamination load sensing device
US11541135B2 (en) 2019-06-28 2023-01-03 Vyv, Inc. Multiple band visible light disinfection
WO2021030748A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 Vital Vio, Inc. Devices configured to disinfect interiors
US11878084B2 (en) 2019-09-20 2024-01-23 Vyv, Inc. Disinfecting light emitting subcomponent

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6737248B2 (en) * 1996-01-05 2004-05-18 Human Genome Sciences, Inc. Staphylococcus aureus polynucleotides and sequences
GB9614274D0 (en) * 1996-07-06 1996-09-04 Univ Manchester Treatment and diagnosis of infections of gram positive cocci
WO1998021339A1 (en) * 1996-11-13 1998-05-22 E.I. Du Pont De Nemours And Company Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms
US6380370B1 (en) * 1997-08-14 2002-04-30 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Staphylococcus epidermidis for diagnostics and therapeutics
US6300094B1 (en) * 1997-12-18 2001-10-09 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotides encoding a novel ABC transporter

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EP1068328B1 (de) 2005-11-16

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