ES2248992T3 - Tratamiento y diagnostico de las infecciones por estafilococos. - Google Patents
Tratamiento y diagnostico de las infecciones por estafilococos.Info
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Abstract
Proteína transportadora ABC estafilocócica que tiene la secuencia de SEC ID nº 2, o una forma modificada parcialmente de la misma, que posee, por lo menos, una homología del 70 % con la misma sobre su longitud completa, o un fragmento inmunogénico de la misma, para su utilización en un procedimiento de tratamiento o diagnóstico del organismo humano o animal.
Description
Tratamiento y diagnóstico de las infecciones por
estafilococos.
La presente invención se refiere al tratamiento y
diagnóstico de las infecciones estafilocócicas, particularmente las
de Staphylococcus aureus, y proporciona una proteína,
epítopos de la misma, y anticuerpos y otros agentes de unión y
neutralización específicos contra la misma.
La resistencia múltiple a los medicamentos (MDR)
constituye un problema creciente entre las bacterias Gram positivas
(Banergee, S.N. et al. 1991, Am. J. Med. 91:
865-895; Shaberg, D.R. et al. 1991, Am. J.
Med. suppl., 88: 72-75; Gaynes, R.P. et
al, 1994, Infect. Dis. Clin. Pract.,
6:452-455), particularmente en los
hospitales. En particular, se demostraron problemáticos el
Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) y los
estafilococos coagulasa-negativos (CNS),
particularmente los CNS resistentes a la meticilina, siendo
resistentes a todas las penicilinas y céfalosporinas. La resistencia
a otros agentes tales como las quinolonas está ampliamente extendida
(Malabarta, A. et al., 1997, Eur. J. Med. Chem., 32:
459-478; Lewis, K., 1994, TIBS, 19:
119-123; Traub, W.H. et al., 1996,
Chemotherapy, 42,118-132). El tratamiento se
lleva a cabo típicamente utilizando vancomicina o teicoplanina. Sin
embargo, la resistencia a estos agentes se está extendiendo y, por
lo tanto, son necesarias nuevas
terapias.
terapias.
La patente WO 98/01154 da a conocer la
utilización de proteínas transportadoras ABC fúngicas y bacterianas
y de agentes neutralizantes específicos contra las mismas, en
procedimientos de tratamiento y diagnóstico del organismo animal o
humano. Las proteínas enterocócicas transportadoras ABC con pesos
moleculares de 97 y 54 kDa se han identificado como terapéuticamente
útiles, así como también varios epítopos. Los homólogos
estafilocócicos de las proteínas IstA e IstB de Bacillus
thuringiensis (Menou et al., 1990, J. of Bacteriology, 1
173:6689-6696) también se han identificado,
presentando pesos moleculares de 69 y 37 KDA y siendo antígenos
inmunodominantes conservados. También se han identificado epítopos
de las mismas.
En la presente invención y a partir de una cepa
epidémica MRSA, se ha aislado ahora con éxito una proteína
estafilocócica transportadora ABC, con un peso molecular de 67 KDA,
que tiene la secuencia aminoácida de SEC ID nº2 y la secuencia
codificante de SEC ID nº1. Estas secuencias se identifican
parcialmente mediante el proyecto de secuenciación del genoma de
S. aureus NCTC 8325 como contig 1184, contig 1177 y contig
1158, que contienen datos de secuencias
amino-terminales. No se sugirió previamente que esta
proteína fuera una proteína transportadora ABC, ni que pudiera
presentar usos diagnósticos o terapéuticos. La proteína tiene un
peso molecular verdadero calculado de 60,1 kDa, aunque las
modificaciones posttraduccionales dan lugar a que se identifique en
experimentos con un peso molecular de 67 kDa.
La función de la proteína ni se sugiere ni se da
a conocer por los homólogos IstA e IstB de la patente WO 98/01154,
ya que tienen secuencias distintas y distintos pesos moleculares.
Además, las muestras a partir de las cuales se aislaron los
homólogos IstA e IstB eran más bien dializados peritoneales que
cultivos sanguíneos y de heridas, utilizados para la presente
invención (véase más adelante), no pudiendo dicho procedimiento de
purificación haber conducido a la presente invención, ya que la
etapa de diálisis previamente utilizada provocó un cambio en las
proporciones relativas del anticuerpo en el dializado, cuando se
comparó con el suero. De modo similar, otras técnicas conocidas
anteriores no sugieren la función de la proteína, ni sugieren que
tenga una utilidad diagnóstica o terapéutica. Otras técnicas
anteriores importantes incluyen la patente EP 0786519 y Allignet J y
El Solh (Gene. 1997 Nov 20; 202 (1-2):
133-8; PMID: 9427556), que da a conocer una
secuencia de 552 aminoácidos con una homología del 28% (nº de
registro AAB95639).
Por tanto, según la presente invención, se
proporciona una proteína estafilocócica transportadora ABC que tiene
la secuencia de SEC ID nº:2, o una forma modificada parcialmente de
la misma, con una homología del 70% respecto a su longitud completa,
o un fragmento inmunogénico de la misma, para ser utilizada en un
procedimiento de tratamiento o diagnóstico del organismo animal o
humano.
Los fragmentos inmunogénicos de la proteína
incluyen cualquier fragmento de la misma que provoque una respuesta
inmune, e incluyen epítopos (es decir, péptidos que transportan
epítopos). De modo semejante, pueden crearse fácilmente análogos (de
epítopos (mimotopos), que tienen secuencias diferentes, pero que
exhiben el mismo epítopo, y, de este modo, el término "fragmentos
inmunogénicos" abarca asimismo análogos inmunogénicos de los
fragmentos, por ejemplo, mimotopos. Los epítopos pueden determinarse
fácilmente, y los mimotopos, diseñarse también fácilmente. (Geysen,
H.M. et al., 1987, Journal of Immunological Methods,
102: 259-274; Geysen, H.M. et
al.,1988, J.Mol. Recognit.,1 (1):32-41;
Jung, G y Beck-Sickinger, A. G., 1992, Angew. Chem.
Int. Ed. Eng,.
31:367-486).
31:367-486).
El alcance de la presente invención no incluye
otras proteínas estafilocócicas transportadoras ABC, tales como las
de la patente WO 98/01154. Sin embargo, la invención no incluye
comprender formas proteicas que se hayan modificado
insustancialmente (es decir, que se hayan modificado parcialmente),
en particular, formas de la proteína que exhiben las mismas
propiedades inmunogénicas que la proteína misma.
Por "modificación parcial" y "parcialmente
modificado" quiere significarse, respecto a las secuencias
aminoácidas, una forma modificada parcialmente de la molécula, que
conserva sustancialmente las propiedades de la molécula de la que se
deriva, aunque, por supuesto, puede mostrar una funcionalidad
adicional. La modificación parcial, puede, por ejemplo, consistir en
una adición, deleción o sustitución de residuos aminoácidos. las
sustituciones pueden ser sustituciones conservadas. Por tanto, la
molécula parcialmente modificada, puede ser homóloga de las
moléculas de las cuales se derivó. Puede, por ejemplo tener el 70%
de homología de la molécula de la que se ha derivado. Puede, por
ejemplo tener el 80, 90 o 95% de homología de la molécula de la que
se ha derivado. Un ejemplo de homólogo es un mutante alélico. De
modo similar, secuencias nucleótidas que codifican la molécula o
secuencias aminoácidas, pueden ser parcialmente modificadas para
codificar cualquiera de dichas modificaciones para una molécula o
secuencia aminoácida. Las secuencias nucleótidas pueden asimismo ser
modificadas, por supuesto, de modo que codifiquen todavía los mismos
residuos aminoácidos, pero teniendo una secuencia nucleótida
distinta.
distinta.
El estafilococo puede ser S.aureus o puede
ser, por ejemplo, un Estafilococo coagulasa negativo, S.
epidermidis, S. haemolyticus, S. hyicus o S.
saprophyticus.
Un fragmento inmunogénico puede comprender un
sitio de unión a ATP o una parte de la misma. Se han identificado
asimismo (a continuación) los péptidos que transportan (es decir,
muestran) diversos epítopos de la proteína transportadora ABC y así,
un fragmento inmunogénico de la proteína, puede comprender la
secuencia de SEC ID nº: 3, 4, 5, 9, 10, 11 ó 12. Los epítopos de SEC
ID nºs 3, 4 y 5 se muestran mediante péptidos que tienen las
secuencias de SEC ID nºs 6, 7 y 8 respectivamente, y así, un
fragmento inmunogénico puede comprender la secuencia de SEC ID nºs
6,7, u 8. En particular, los experimentos mostraron que los péptidos
que tienen SEC ID nºs 6 y 7, que exhiben epítopos que tienen SEC ID
nºs 3 y 4, son de utilización terapéutica particular. Se ha
encontrado que los péptidos que tienen las secuencias de SEC ID nºs
13 y 14, llevan asimismo epítopos, siendo terapéuticos en un modelo
animal (véanse experimentos a continuación), los anticuerpos contra
los mismos, y por tanto, un fragmento inmunogénico puede tener la
fórmula de SEC ID nº 13 o 14. También se ha encontrado un epítopo
adicional que tiene la secuencia de SEC ID nº 17, y un péptido que
tiene la secuencia de SEC ID nº 18 que transporta el mismo, provoca
la generación de antisuero policlonal específico contra el antígeno
de 67 kDa. Así, un fragmento inmunogénico puede tener la secuencia
de cualquiera de las SEC ID nºs 17 o 18.
La proteína transportadora ABC estafilocócica,
que expone los epítopos que incluyen los anteriormente descritos,
proporciona por tanto una oportunidad diagnóstica y terapéutica,
pudiéndose utilizar en la terapia, así como fragmentos inmunogénicos
de la misma, tanto profilácticamente (por ejemplo, como
inmunoestimulantes tales como vacunas), como para el tratamiento de
una infección estafilocócica.
Los agentes de unión y los neutralizantes (tales
como anticuerpos) específicos contra la proteína transportadora ABC,
fragmentos inmunogénicos de la misma o formas modificadas
parcialmente de la misma, pueden asimismo utilizarse tanto
diagnóstica como terapéuticamente. Los agentes de unión tienen una
diana para la cual son específicos, y en el caso de un agente de
unión que sea un anticuerpo, la diana es un antígeno. Un ejemplo de
medicamento terapéutico es un anticuerpo específico contra la
proteína transportadora ABC, pudiéndose utilizar esto en
inmunoterapia, por ejemplo, en la inmunoterapia pasiva. Los
anticuerpos, su preparación y utilización son bien conocidos
(Harlow, E. y Lane, D., "Antibodies - A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York,
1988; Harlow, E. y Lane, D., "Using Antibodies: A Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1998), y
por tanto, los anticuerpos y sus fragmentos de unión antigénica
serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia.
La secuencia nucleótida de la proteína o el
fragmento inmunogénico pueden proporcionar asimismo la base para las
aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, una secuencia nucleótida que
codifica la proteína o su fragmento inmunogénico, pueden utilizarse
en la preparación de una vacuna de ADN. (Montgomery, D.L. et
al., 1997, Pharmacol. Ther., 74(2):
195-205; Donnelly, J.J. et al., 1997, Annu.
Rev. Immunol., 15: 617-648; Manickan, E et
al., 1997, Crit. Rev. Immunol.,
17(2):139-154). Otros agentes neutralizantes
tales como ribozimas y oligonucleótidos antisentido serán fácilmente
evidentes para el experto en la materia.
Así, la presente invención proporciona asimismo
la utilización de la proteína transportadora ABC estafilocócica, del
fragmento inmunogénico de la misma, y de los agentes de unión y
neutralizantes específicos contra las mismas, en un procedimiento de
preparación de un medicamento para tratar las infecciones
estafilocócicas. Asimismo, se proporciona un procedimiento de
preparación de un medicamento para tratar las infecciones
estafilocócicas, caracterizado por la utilización del mismo.
Asimismo, se proporciona un procedimiento de tratamiento del
organismo animal o humano, que comprende la utilización del mismo.
La dosificación de un medicamento puede determinarse fácilmente
mediante experimentos estándar de dosis-respuesta.
Los medicamentos pueden comprender además un transportador,
diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable (Remington's
Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopeia, 1984, Mack Publishing
Company, Easton, PA; USA).
Tal como se ha considerado anteriormente, la
proteína transportadora ABC, sus fragmentos inmunogénicos, y los
agentes de unión y neutralizantes específicos contra la misma,
pueden utilizarse asimismo diagnósticamente y por tanto, la presente
invención proporciona su utilización en la preparación de un kit de
ensayo diagnóstico para estafilococos, particularmente para
infecciones estafilocócicas. Asimismo, se proporciona su utilización
en un procedimiento de ensayo diagnóstico para estafilococos.
\newpage
Asimismo, según la presente invención, se
proporciona un procedimiento de ensayo diagnóstico para la infección
estafilocócica que comprende las etapas de:
I) hacer reaccionar una proteína transportadora
ABC o un fragmento inmunogénico de la misma, según la presente
invención, con una muestra;
- (ii)
- detectar una reacción de unión antígeno-anticuerpo; y
- (iii)
- correlacionar la detección de la reacción de unión antígeno-anticuerpo con la presencia de estafilococos.
Asimismo, se proporciona según la presente
invención, un procedimiento de ensayo diagnóstico para la infección
estafilocócica, que comprende las etapas de:
I) hacer reaccionar un anticuerpo u otro agente
específico de unión contra una proteína transportadora ABC, según la
presente invención, con una muestra;
- ii)
- detectar una reacción de unión diana-agente de unión; y
- iii)
- correlacionar la detección de la reacción de unión diana-agente de unión, con la presencia de Estafilococos.
Las muestras pueden ser del plasma del paciente o
de una fracción del mismo, por ejemplo, suero o antisuero. El
procedimiento de ensayo diagnóstico puede ser para la infección
estafilocócica de un paciente, siendo la muestra una muestra del
paciente y la correlación que determina la infección estafilocócica
del paciente.
Asimismo, según la presente invención, se
proporciona un kit de ensayo diagnóstico, para llevar a cabo un
procedimiento de ensayo diagnóstico según la presente invención. El
kit de ensayo diagnóstico puede incluir instrucciones para llevar a
cabo un ensayo/diagnóstico utilizando el equipo.
Asimismo, según la presente invención, se
proporciona un procedimiento in vitro de diagnóstico de la
infección estafilocócica, que comprende la utilización de una
proteína transportadora ABC estafilocócica, de un fragmento
inmunogénico de la misma, y de un agente de unión o neutralizante,
según la presente invención.
La invención será además evidente a partir de la
descripción que sigue a continuación, que muestra, sólo como
ejemplo, el diagnóstico y el tratamiento de las infecciones
estafilocócicas.
Se llevaron a cabo experimentos utilizando sueros
MRSA procedentes de cultivos sanguíneos y de heridas de varios
grupos de pacientes. Se prepararon extractos antigénicos a partir de
cada grupo y se rastrearon respecto a antisueros de los pacientes.
Esto identificó un antígeno de 67 kDa, rastreándose entonces una
biblioteca de expresión creada a partir de una cepa MRSA epidémica,
que permitió la identificación de la proteína. La obtención de mapas
epitópicos identificó entonces regiones antigénicas de la proteína,
y experimentos ulteriores identificaron epítopos y péptidos, algunos
de los cuales con potencial terapéutico.
A partir del Clinical Microbiology Laboratory at
the Manchester Royal Infirmary (MRI), se obtuvo una cepa epidémica
MRSA (EMRSA). La cepa a la que se ha aludido como EMRSA (VSRS), era
sensible a vancomicina y rifampicina. Un aislamiento separado del
mismo clon se obtuvo a partir de un paciente en el que se había
inducido resistencia a la rifampicina in vivo mediante la
administración de ésta (VSRR).
- Grupo 1
- Pacientes infectados en esputos o heridas, que requieren tratamiento con vancomicina y rifampicina sistémica (n= 3). Aislamientos totalmente sensibles a la rifampicina.
- Grupo 2
- Cultivo sanguíneo positivo, que requiere tratamiento con vancomicina y rifampicina sistémica (n= 3). Aislamientos totalmente sensibles a la rifampicina.
- Grupo 3
- Úlcera colonizada de la pierna en paciente diabético con clon resistente a la rifampicina (n= 3) Sin terapia sistémica.
- Grupo 4
- Septicemia, cultivo sanguíneo positivo, tratado con vancomicina y rifampicina (n=3), La cepa se volvió resistente a la rifampicina durante el tratamiento.
Se inocularon colonias únicas de las mencionadas
anteriormente (VRRS y VSRR) en 10 ml de un caldo de cultivo
nutritivo nº 2, (Oxoid, UK) con vancomicina a 1 \mug/ml,
incubándose a 33ºC con agitación. Cuando el líquido de cultivo se
volvió turbio, se utilizaron cuatro gotas (120 \mul) para inocular
otros 10 ml de líquido con 2 \mug/ml de vancomicina. Cuando este
cultivo se volvió turbio, se utilizaron 120 \mul del cultivo para
inocular otro cultivo con 3 \mug/ml de vancomicina. Esto se
repitió con una concentración gradualmente creciente de 4, 5, 6, 7 y
8 \mug/ml, y así hasta que se alcanzaron 22 \mug/ml para EMRSA,
y 15 hasta 16 \mug/ml para EMRSA resistente a la rifampicina. Los
nuevos clones se denominaron VSRR y VRRR, respectivamente.
Se utilizó un cultivo con una alta resistencia a
la vancomicina, para inocular cuatro matraces de 1 litro,
conteniendo cada uno 500 ml del caldo nutritivo nº 2. Éste fue de 30
\mug/ml para la cepa resistente a la rifampicina y de 20 \mug/ml
para el aislamiento resistente a la rifampicina.
Después de añadir vancomicina al caldo de cultivo
utilizando una pipeta estéril de 5 ml, el matraz se agitó
suavemente. Antes de proceder a la inoculación del matriz con la
bacteria que iba a ensayarse, se tomó una muestra del caldo de
cultivo (1 ml) utilizando una pipeta estéril (nueva). La muestra se
envió al Clinical Microbiology Laboratory para el ensayo de la
vancomicina.
Los matraces se inocularon a 37ºC con agitación
(200 rpm), hasta que el caldo de cultivo se enturbió. Antes de
recuperar las células, se obtuvo una muestra (2 ml) del caldo,
utilizando una pipeta estéril en la campana de seguridad. La muestra
se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 minutos. El sedimento se
desechó en Hibitane, y el sobrenadante se filtró utilizando un
filtro Millipore de 0,22 \mum, enviándose después a realizar el
ensayo para la vancomicina. El valor para la cepa sensible a la
rifampicina al inicio de la inoculación fue de 27,1 \mug/ml, y al
final, de 8,1 \mug/ml. Los valores correspondientes para el clon
resistente a la rifampicina fueron de 20,7 \mug/ml y 7
\mug/ml.
En la campana de seguridad se llevaron a cabo los
pasos siguientes: Para asegurarse de que los cultivos no se habían
contaminado, a partir de cada cultivo, al recuperar las células, se
obtuvo una placa de agar sangre con un alto grado de pureza. Las
células se recuperaron después de la incubación, mediante
centrifugación a 3500 rpm, durante 15 minutos. Los sobrenadantes se
desecharon en Hibitane. Los depósitos se lavaron dos veces en
solución salina estéril, con centrifugación a 3500 rpm durante 25
minutos después de cada lavado.
Las células recuperadas se pipetearon en el
cilindro limpio del desintegrador Bio X-press (LKB
Instruments, Bromma, Suecia) montado, utilizando una pipeta
disponible de plástico, situando el segundo émbolo en el cilindro
con el lado plano mirando hacia abajo. El émbolo se empujó a su
lugar hasta que se notó una ligera resistencia, cubriéndose entonces
el conjunto con una cubierta de plástico y volteándolo a
continuación lateralmente, situando el cilindro que contenía las
células a un nivel elevado, y dejándolo reposar durante la noche a
-20^{0}C. La bomba hidráulica manual se unió a la prensa
hidráulica con la manecilla ajustada al collar roscado. La cubierta
de plástico se quitó del desintegrador congelado, que se situó
entonces verticalmente respecto a la prensa, con el émbolo del
desintegrador contra la parte superior de la prensa. El soporte
plástico se situó en la parte superior del émbolo del desintegrador,
localizando el soporte centralmente sobre el émbolo, bombeando
lentamente a mano, hasta que el soporte de plástico se elevara hasta
la parte superior de la prensa, continuando el bombeo hasta que se
oyeran varios "resquebrajamientos", sin que la aguja penetrara
en el área roja del calibrador de presión, liberando la presión
girando la palanca sobre la bomba, una vez que el émbolo hubiera
recorrido la distancia completa.
El desintegrador se desmontó y utilizando una
espátula, las células aplastadas se depositaron mediante una cuchara
en un contenedor estéril. Las células se sometieron a una rotación a
3.500 rpm durante 10 minutos, quitando el sobrenadante y desechando
el sedimento. El sobrenadante se utilizó más tarde a una
concentración apropiada en una electroforesis en gel de
poliacrilamida - sulfato dodecil sódico
(SDS-PAGE).
Para utilizar esta técnica, se utilizaron los
equipos siguientes para elaborar dos geles: 4 abrazaderas laterales,
2 placas cortas de vidrio, 2 placas largas de vidrio, 4 separadores
de placas, 2 bases de goma y una abrazadera de base.
Para preparar cada gel, un par de placas de
vidrio (larga y corta) se juntaron por sus lados mediante la
abrazadera. Los separadores de placas crearon un espacio entre las 2
placas. las placas se situaron sobre una base de goma precintada y
que estaba asegurada en una abrazadera de base. Entre las placas, se
vertió agua destilada, hasta un nivel justamente por encima de las
flechas sobre las abrazaderas laterales. El nivel del agua se marcó
con una plumilla de fieltro en los extremos, dejándola reposar
algunos minutos para asegurarse de que no había fugas. El agua se
vertió entonces hacia afuera.
Se hizo una marca 4 cm por debajo de la parte
superior de la placa de vidrio más corta y se marcó. La mezcla de
gel resolutivo se vertió en el equipo hasta esa altura. Utilizando
una pipeta de plástico, se añadió una capa de agua destilada a la
parte superior de la mezcla del gel, que se dejó reposar durante 60
minutos aproximadamente a temperatura ambiente. Cuando estaba
fijada, la capa de agua destilada se vertió a partir de la parte
superior del gel resolutivo, y entre las dos placas de vidrio, con
un ángulo de 45ºC, se insertó una banda con 10 pocillos. Se
añadieron aproximadamente 5 ml de una mezcla de gel amontonada se
añadieron utilizando una pipeta, evitando cuidadosamente la creación
de burbujas, insertando y centrando la banda con los pocillos y
añadiendo posteriormente otra vez la mezcla de gel, sobrepasándose
la parte superior de la placa, y dejándola reposar 30 minutos. Los
geles pueden utilizarse en el mismo día o almacenarse en la nevera
por la noche, después de envolver las partes superiores del gel
resolutivo y el conjunto de pocillos con un trozo de envoltura de
plástico.
Para utilizar el gel, la banda con pocillos se
extrajo suavemente, y los pocillos se lavaron 3 veces con tampón de
electroforesis. Cualquier tampón de electroforesis abandonado en el
fondo del pocillo, se extrajo con una jeringuilla y una aguja. Las
placas de vidrio que contenían el gel, se quitaron de la abrazadera
de base y se inclinaron al contenedor del tanque que se sumergió en
el tanque para electroforesis.
Las muestras se prepararon en tubos Eppendorf de
1,5 ml. Un total de 25 \mul de cada muestra que iba a ser
procesada en el gel (diluida en agua destilada según los resultados
de la titulación antigénica) se mezclaron con 25 \mul de tampón de
desintegración. Un total de 20 \mul del tampón de desintegración
se añadieron asimismo a 20 \mul del marcador de peso molecular
Rainbow de proteína coloreada (RTM) (Amersham Internation plc,
Buckinghamshire).
Las muestras y el marcador en el tampón de
desintegración se hirvieron entre 2 y 3 minutos en un contenedor
apropiado. Utilizando una pipeta Gilson, se cargaron entonces
cuidadosamente 25 \mul del marcador en el pocillo uno y 50 \mul
de cada muestra en el pocillo apropiado.
El tampón de electroforesis se aplicó
cuidadosamente sobre las muestras con una pipeta de plástico, no
dejando que una muestra se amontonara sobre la próxima. El espacio
que quedaba entre las placas de vidrio se rellenó con el tampón de
electroforesis, y el depósito del centro se rellenó hasta que el
tampón se encontraba aproximadamente 2 mm por debajo de su parte
superior, dejando que el agua de refrigeración circulara. La tapa
del depósito se reemplazó y el aparato se enchufó a una corriente
constante de entre 40 y 50 mA por gel, chequeándose las burbujas que
se elevaban en el depósito central.
Se dejó que los geles se procesaran durante 3
horas, o hasta que la línea azul se encontrara 1 cm por encima
aproximadamente del fondo de la placa.
Después de desconectar la corriente eléctrica y
el agua de la electroforesis, el contenedor que contiene las placas
de vidrio se extrajo del depósito y el tampón de electroforesis en
exceso se inclinó. El conjunto de placas de vidrio no se inclinó, y
éstas se separaron suavemente haciendo palanca con una pieza lateral
de plástico (separador de placa). Después de quitar el gel sobrante,
el gel de separación se extrajo para tinción argéntica o
transferencia.
Las proteínas separadas en los geles
(resolutivos) de poliacrilamida se tiñeron con el equipo Daiichi
Silver Stain II (Integrated Separation Systems, Japón). Los geles
que se utilizaron en la titulación de las preparaciones antigénicas,
y aquellos que se utilizaron para comparar la expresión proteica en
los organismos que se habían desarrollado bajo distintas condiciones
de incubación, se tiñeron mediante este procedimiento utilizando las
instrucciones de los fabricantes.
Para estudiar la respuesta de los anticuerpos, el
suero se transfirió contra las proteínas separadas de los
organismos, las cuales proteínas se habían transferido a una
membrana de nitro-celulosa después de
SDS-PAGE. La adición del conjugado
anti-IgG humana o del anti-IgM
humana, seguido por el sustrato apropiado, hizo posible visualizar
aquéllas bandas proteicas a las cuales se unieron los anticuerpos
IgG ó IgM que se encontraban en el suero.
Los materiales que se necesitaron para cada gel
fueron un contenedor plástico de gel (formado por dos mitades), dos
trozos de material "scotchbrite", 4 trozos de papel para
transferencia y un trozo de membrana de nitroce-
lulosa.
lulosa.
Un depósito de transferencia se rellenó
parcialmente con el tampón de transferencia y el lado que
correspondía al mango del contenedor de plástico, se situó en el
depósito. Dos trozos del material "scotchbrite" se hicieron
descender sobre el contenedor, utilizando un movimiento ondulado
para evitar el atrapamiento de burbujas de aire. Dos trozos de papel
de filtro se situaron por encima del material "scotchbrite" de
la misma forma. Un trozo de membrana de nitrocelulosa (BioRad
Laboratories, Hercules, California, USA), que se había cortado hasta
alcanzar un tamaño de 15 x 16,5 cm, se dispuso en la parte superior
y se dejó que se remojara durante 20 minutos. Después de que la
corriente de electroforesis y de agua (de SDS-PAGE)
se desconectaran, el contenedor que contenía las placas de vidrio se
extrajo del tanque de electroforesis. Un conjunto de placas no
estaba inclinado y las placas de vidrio se separaron haciendo
palanca con una pieza lateral de plástico. Después de quitar el gel
sobrante, el gel de resolución se deslizó de la placa de vidrio, de
forma que eliminara el resto del gel sobrante. El gel de resolución
se situó en la parte superior de la membrana de nitrocelulosa
empapada, y otros dos trozos del papel para transferencia se
situaron sobre el gel. La otra mitad del contenedor de plástico se
inclinó en el lugar y el contenedor con su contenido descendió al
depósito de transferencia. (Transphor Power Lid, Hoefer Scientific
Instruments, San Francisco, USA.). La tapa del depósito se reemplazó
y el agua de refrigeración se puso en marcha. El aparato funcionó
con la potencia máxima durante 45 minutos.
Cuando la transferencia se hubo completado, la
corriente se cortó y el agua de refrigeración se detuvo. El
contenedor se extrajo y no se inclinó, y el gel y la membrana de
nitrocelulosa se eliminaron. La membrana se cortó con un escalpelo
afilado hasta conseguir el tamaño del gel, y se dejó en 100 ml de
BSA al 3% (Sigma Chemical Co, St. Louis, USA) a 4ºC durante la
noche.
Tanto la parte superior como el fondo de la
membrana de nitrocelulosa se marcaron utilizando como guía una banda
de 10 pocillos. La membrana se cortó en tiras utilizando un
escalpelo y una regla. Las tiras se situaron en un recipiente para
tiras, y cada una de éstas se cubrió con 3,8 ml de BSA al 3% (BSA al
3% en el que la nitrocelulosa que se había conservado durante la
noche, se utilizó). Un volumen total de 200 \mul de suero que iba
a ser sometido a inmunotransferencia se añadió a cada tira, dando
lugar a una dilución sérica de 1:20. Las tiras se incubaron en un
agitador rotatorio durante 2 horas a temperatura ambiente.
Utilizando la solución de lavado, las tiras se
lavaron 5 veces durante 6 minutos cada vez. Con una dilución de
1:1000 (diluido en BSA al 3%), se añadió un conjugado de fosfatasa
alcalina anti-IgG humana o anti-IgM
humana a las tiras apropiadas y se agitó a temperatura ambiente
durante 1 hora. Las tiras se lavaron otra vez 5 veces como antes.
Mientras, se prepararon NBT (nitro-azul tetrazolio)
y BCIP (5 bromo-4-cloro
3-indolil fosfato) añadiendo 1 ml de DMF (n,
n-dimetil formamida) a 0,05 de cada uno de estas
sustancias pulverulentas. Justo antes del uso, se añadió un volumen
de 660 \mul de NBT y de 330 \mul de BCIP a 100 ml de tampón
sustrato de fosfatasa alcalina. Cinco mililitros de esta solución se
añadieron a cada tira, hasta que éstas se tiñeron satisfactoriamente
(aproximadamente, entre 5 y 15 minutos). La reacción se detuvo
entonces lavando las tiras con agua destilada, y dejando éstas
entonces a secar sobre papel de transferencia.
Se construyó una biblioteca genómica en el vector
de expresión/clonación lambda ZAP express, esencialmente tal como se
describe por Young y Davies (1983, PNAS USA, 80:
1194-1198). El ADN cromosómico procedente de un
aislamiento clínico se digirió parcialmente mediante Sau3, y
fragmentos de un tamaño del orden de 2 a 9 kpb, se insertaron en el
vector, dando lugar a la producción de proteínas de fusión
\beta-galactosidasa. Cada biblioteca se rastreó
con el anticuerpo IgG positivo para la banda de 67 kDa de EMRSA
(dilución 1 en 100) a partir de un paciente que se había recuperado
de una septicemia positiva en un cultivo sanguíneo. Los clones
positivos se detectaron utilizando la fosfatasa alcalina conjugada
con la antiinmunoglobulina humana (IgG) de cabra (1 en 5000) (Sigma,
Poole, UK). Se prepararon lisógenos a partir de los clones positivos
en Escherichia coli Y1089 según Huynh, Young y Davies (1985,
DNA cloning, vol. 1, a practical approach, IRL Press Oxford, p
49-78, Ed. D.M. Glover). El epítopo expresado por
cada uno de los clones positivos se identificó mediante selección
antigénica, tal como se describe por Lyon et al. (1986, PNAS
USA, 83:2989-2993). Por esto, el suero se
purificó por afinidad mediante hibridización con las calvas
recombinantes positivas lambda. El anticuerpo unido se eluyó
entonces con tampón de glicina pH 2,8 y se utilizó para
inmunotransferencia de lisados de las bacterias pertinentes.
Se utilizó la PCR con los iniciadores T3 y T7
"hacia adelante" e inverso, para amplificar el ADN insertado
procedente de clones séricos positivos. Este se subclonó en el TA
Cloning System (versión 1.3, Invitrogen Corporation, Oxon, UK) antes
de secuenciar el ADN, utilizando el procedimiento de finalización
didesoxi (equipo de la versión secuencial 2.0; United States
Biochemical, Cambridge, UK). Las reacciones de secuenciación
iniciales se realizaron utilizando iniciadores universales de
secuenciación, determinándose las secuencias restantes utilizando
una estrategia de desplazamiento de los iniciadores mediante la
síntesis progresiva de iniciadores de secuencias para generar nuevos
datos secuenciales.
La tinción argéntica de los extractos antigénicos
(VSRS, VRRS, VSRR Y VRRR) produjo el mismo patrón para los cuatro.
La inmunotransferencia identificó bandas antigénicas que variaban en
el peso molecular entre 27 y 140 KDa (Tablas 1 y 2).
Los pacientes produjeron un anticuerpo contra el
antígeno de 67 KDa en los cuatro grupos. Esto fue especialmente
cierto si habían tenido una infección de cultivo sanguíneo positivo
que necesitaba tratamiento con vancomicina. En el Grupo 4, estaban
asimismo disponibles sueros secuenciales de dos pacientes y ambos
demostraron el aumento de nivel del anticuerpo para este antígeno
cuando el paciente se recuperó. Este antígeno estaba presente en los
cuatro extractos antigénicos. IgG se encontraba presente en el suero
de los pacientes que sobrevivieron a una septicemia, debido a la
cepa resistente a la rifampicina, pero no en el suero de los
pacientes que se recuperaron de una septicemia sensible a la
rifampicina.
El suero positivo al antígeno de 67 KDa se
utilizó entonces para rastrear la biblioteca de expresión producida
a partir de la EMRSA. Se obtuvieron dos clones positivos. La
selección antigénica demostró un epítopo que se expresó por ambos
clones, que reaccionó con el antígeno conservado de KDa 67 de una
cepa epidémica EMRSA. La secuenciación demostró una secuencia
parcial formando un marco de lectura con el gen de la
\beta-galactosidasa. El tamaño total del inserto
fue de 4,5 Kb. La secuencia aminoácida derivada produjo una proteína
con tres dominios de unión a ATP y una secuencia homóloga al grupo
de proteínas que son transportadores ABC (Fath y Kilter 1993,
Microbiological Reviews 37, 995-1017). Este
fue el extremo C de la proteína, que se inicia en el aminoácido 133
de SEC ID nº:2. La secuencia se buscó en la base de datos del
proyecto de secuencia genómica de S. aureus NCTC 8325, y esto
dio lugar a emparejamientos con los contigs 1184, 1177 y 1158 que
tenían secuencias que se solapaban parcialmente con la secuencia
identificada. Esto, a su vez, permitió la síntesis de iniciadores
PCR para la clonación del gen completo que codifica la proteína.
La proteína transportadora ABC completa se obtuvo
a partir de ADN EMRSA purificado utilizando los iniciadores PCR que
tenían SEC ID nºs: 15 y 16 (iniciadores "hacia adelante" e
inversos respectivamente).
El gen completo se clonó en el vector pBAD
mediante el equipo de clonación
pBAD-TA-TOPO (Invitrogen), y se
expresó en E.coli. Después de la expresión, la proteína se
purificó utilizando cromatografía de afinidad, suministrando la
proteína en su conformación original. Se preparó una columna con la
lechada Ni-NTA de Qiagen, que une la marca His al
extremo N-terminal de la proteína. La proteína se
eluyó de la columna con 250 mM de imidazol con una concentración
proteica final de 1 mg/ml.
Se preparó un antisuero policlonal inyectando a
conejos con el transportador ABC (0,5 mg/inyección en adyuvante
completo de Freund), que se repitió después de 14 días, y
quincenalmente en adyuvante incompleto de Freund). Los sueros
obtenidos a los 28 días antes y después de llevar a cabo una
sangría, se inmunotransfirieron contra los extractos derivados de la
cepa epidémica EMRSA a una dilución de 1 en 100. Esto demostró la
seroconversión a antígenos de pesos moleculares entre 67 y 33
kDa.
Esto confirmó además la identidad del antígeno
Estafilocócico de 67 kDa.
Sobre agujas de politileno, con reactivos
procedentes de un equipo de rastreo epitópico (Cambridge Research
Biochemicals, Cambridge, U.K), tal como se describe por Geysen, H.M.
et al. (Journal of Immunological Methods,
102:259-274), se sintetizó una serie de
nonapéptidos que se solapaban y que cubrían los residuos 135 a 533
de la secuencia aminoácida derivada. El péptido 1 estaba formado por
los residuos 1 a 9, el Péptido 2 estaba formado por los residuos 2 a
10, etc. La reactividad de cada péptido con los sueros de los
pacientes (1:200) se determinó para IgG mediante ELISA. Los datos se
expresaron como A405 después de 30 minutos de incubación. Se
examinaron los sueros de los pacientes con colonización EMRSA de un
sitio clínico significativo (dializado ambulatorio crónico
postinfección (n=2), muñón infectado procedente de amputación
postinfección (n=3) con cultivos sanguíneos negativos pero que
necesitaban todavía terapia sistémica con vancomicina, septicemia
debida a EMRSA tratada con éxito mediante vancomicina y rifampicina
(postinfección, n=4), septicemia fatal debida a EMRSA (n=4)) y suero
control de pacientes hospitalarios.
Tres epítopos derivados de los anteriormente
mencionados se escogieron a continuación (SEC ID nºs:
3-5) y los péptidos 1-3 (SEC ID
nºs:6-8) que los representan se sintetizaron
mediante un sintetizador múltiple de péptidos BT7400 (Biotech
Instruments, Luton, UK). Estos se utilizaron en el ELISA
indirecto.
- Grupo A:
- No hay evidencia de colonización o infección por EMRSA (n=12).
- Grupo B:
- Pacientes colonizados por EMRSA en un sitio clínicamente importante, dializado ambulatorio crónico (n=2), o sitio de amputación (n=2) y que necesitan todavía terapia sistémica con vancomicina para conseguir la curación.
- Grupo C:
- Pacientes que sobrevivieron a una septicemia debida a EMRSA tratada con vancomicina (n= 3).
- Grupo D:
- Pacientes que murieron de una septicemia debida a EMRSA (n= 3).
Mediante una simple adsorción de péptidos a una
placa de microtitulación, se llevó a cabo el procedimiento siguiente
para cada péptido. El péptido se disolvió en 2 ml de solución salina
tamponada 0,01 M (PBS), de pH 7,2, y se diluyó hasta alcanzar una
concentración de 10 \mug/ml (1/100) en el mismo tampón.
El ELISA indirecto se llevó asimismo a cabo con
los péptidos 4 y 5 que tenían las secuencias SEC ID nºs 13 y 14. Se
utilizaron un total de 39 sueros con distintas historias
clínicas.
- Grupo E:
- 12 sueros de 12 pacientes sin evidencia de infección o colonización estafilocócica.
- Grupo F:
- 3 sueros de 3 pacientes con diabetes y una úlcera colonizada en los pies con el clon resistente a la rifampicina.
- Grupo G:
- 14 sueros de 14 pacientes con cultivos positivos procedentes de una línea intravenosa, de los esputos o de gasas de heridas que requerían terapia sistémica con vancomicina y rifampicina.
- Grupo H:
- 7 sueros de pacientes que se habían recuperado de una septicemia de cultivo sanguíneo positivo.
- Grupo I:
- 3 sueros de pacientes que habían muerto de infección MRSA, tal como se probó mediante cultivos sanguíneos positivos persistentes, a pesar de la terapia antibiótica.
- (1)
- alícuotas de 150 \mul de péptidos (10 \mug/ml en 0,01 M PBS) se pipetearon en los pocillos de una placa Falcon 3912 de microensayo y se incubaron durante la noche a 4ºC.
- (2)
- El péptido no unido se eliminó lavando 4 veces (4 x 10 minutos) con Tween 20 al 0,05% en 0,01 M PBS (pH de 7,2).
- (3)
- Las placas se bloquearon con leche desnatada al 2% - FCS al 10% en 0,01M PBS durante 1 hora a 37ºC.
- (4)
- Las placas se lavaron cuatro veces (4 x 10 minutos) con Tween 20 al 0,05% en 0,01 M PBS y se añadió el suero que se investigaba (dilución de 1/100 en solución de bloqueo) en los pocillos de la placa de micro ensayo (tres pocillos utilizados para cada suero) y se incubaron durante 2 horas a 37ºC.
- (5)
- Las placas se lavaron cuatro veces (4 x 10 minutos) con Tween 20 al 0,05% en 0,01 M PBS y el anticuerpo secundario, el conjugado peroxidasa anti-IgM (o IgG) humana (dilución de 1/1000 en solución bloqueante) se añadió y tuvo lugar la incubación durante 1 hora a 37ºC.
- (6)
- Las placas se lavaron cuatro veces (4 x 10 minutos) con Tween 20 al 0,05% en 0,01 M PBS, seguido por otro lavado con 0,01 M PBS. La placa se incubó entonces durante 45 minutos a temperatura ambiente con agitación en 0,5 mg/ml de 2,2, Azino-bis [ácido 3-etilbenz-tiazolina-6-sulfónico] diamonio recién preparado (comprimidos ABTS) en un tampón de citrato de pH 4,0 con peróxido de hidrógeno al 0,01% (peso/volumen).
- (7)
- Los pocillos de control se utilizaron en cada placa. Sólo se utilizaron los tres pocillos con solución ABTS y los tres pocillos que tenían solución ABTS más el conjugado de peroxidasa de rábano-anti-IgM o IgG humana.
- (8)
- Las mediciones de la densidad óptica (O.D.) se realizaron con un lector de placa ELISA (Titertek Multiscan) a una longitud de onda de 405 nm.
- (9)
- Se determinaron las lecturas promedio para cada uno de los tres pocillos por suero de paciente.
La inmunogenicidad del Péptido 6 (SEC ID nº:18)
que transporta el epítopo que tiene la secuencia de SEC ID nº: 17 se
ensayó generando antisueros policlonales de conejo contra el péptido
6, utilizando el protocolo anteriormente descrito. Los sueros
obtenidos antes y después de llevar a cabo una sangría, se
inmunotransfirieron contra la proteína transportadora ABC expresada
y clonada, y mostraron una seroconversión al antígeno de 67 kDa.
La biblioteca de exhibición de los anticuerpos
fágicos y ScFv se produjeron esencialmente tal como se ha descrito
previamente por Matthews, R.C. et al. (1995, J. Infect. Dis.,
171:1668-1671). Brevemente, se obtuvieron
linfocitos sanguíneos periféricos de un paciente que se había
recuperado de una infección EMRSA, separando 20 ml de sangre
heparinizada sobre Ficoll. Se extrajo ARNm mediante tiocianato de
guanidio; esto fue seguido por la purificación en una columna de
oligo(dT)-celulosa (Quick Prep ARNm;
Pharmacia, St. Albans, UK). La síntesis del cADN monocatenario se
llevó a cabo con un iniciador regional constante para la totalidad
de los cuatro tipos de las cadenas pesadas de la IgG humana
(HulgG1-4) (Matthews, R.C. et al. 1994,
Serodiagn. Immunother. Infect. Dis,. 6:
213-217) utilizando la transcriptasa inversa del
virus de la mieloblastosis aviaria (HT Biotechnology, Cambridge,
UK). Los genes de dominio variable de la cadena pesada se
amplificaron mediante PCRs primarias con iniciadores hacia adelante
(HuJH1-6) y hacia detrás (Hu VH1a
to-6a) basados en la familia. Se introdujo un sitio
de restricción Sfi1 corriente arriba del producto VH3a
generado hacia atrás, antes del montaje con un conjunto diverso de
genes de dominio variable de cadena ligera. Los últimos introdujeron
asimismo un fragmento de enlace (Gly_{4} SER_{3}) y un sitio
Not1 corriente abajo. Utilizando los sitios enzimáticos de
restricción Sfi1 y Nol1 el producto se clonó de forma
no dirigida en un vector fagémido. El vector unido se introdujo en
E.coli TG1 mediante electroporación y los fagos se rescataron
con el fago auxiliador M13K07 (Pharmacia). Para enriquecer scFv
específico antigénico, la biblioteca fágica se cribó respecto a
péptidos que representaban dos de los epítopos delineados por la
elaboración del mapa de epítopos, los péptidos 1 (SEC ID nº:6) y el
péptido 2 (SEC ID nº: 7). El cribado se llevó a cabo en inmunotubos
revestidos con el péptido correspondiente. Los fagos unidos se
eluyeron con TG1 de E.coli en fase logarítmica. Después del
rescate con M13K07, los fagos se volvieron a cribar respecto al
péptido otras tres veces. La huella BstN1 del ADN (New
England Biolabs, Hiychen, UK), se utilizó para confirmar el
enriquecimiento del scFv específico, después de sucesivas tandas
de
cribado.
cribado.
Experimento
1
A 30 ratones hembras CD1 se les administró un
bolo de 2 x 10^{6} unidades formadoras de colonias (cfu) de EMRSA
en forma de una inyección intravenosa (rápida). Dos horas después,
se les administró M13K07 (10^{8} fagos, bolo de 200 \mul,n= 10),
12,2 x 10^{8} fagos, bolo de 200 \mul, n= 10) o el fago 16 (3,16
x 10^{8} fagos, bolo de 200 \mul, n= 10). Los contajes de las
colonias del riñón, hígado y bazo se llevaron a cabo en los días 3 y
7 después de la inyección, considerándose día 1 el de la
inyección.
Experimento
2
A cada uno de 30 ratones hembras CD1 se
administró un bolo de 100 \mul de EMRSA que contenía 3 x 10^{7}
cfu. Dos horas después, se les administró una súper biblioteca de
fagos negativos (7 x 10^{10} fagos, bolo de 200 \mul, n= 10), el
fago 12 (9 x 10^{7} fagos, bolo de 200 \mul, n= 10), o el fago
16 (5 x 10^{8} fagos, bolo de 200 \mul, n= 10). Los contajes de
las colonias del riñón, hígado y bazo se llevaron a cabo en los días
1 y 2.
Experimento
3
A cada uno de 48 ratones hembras CD1 se le
administró un bolo de 100 \mul de EMRSA que contenía 2 x 10^{7}
cfu. Dos horas después, se les administró un fago negativo (10^{8}
fagos, bolo de 200 \mul, n= 12), el fago 12 (10^{8} fagos, bolo
de 200 \mul, n= 12, fago x (10^{7} fagos, bolo de 200 \mul, n=
12) o el fago 4 (10^{6} fagos, bolo de 200 \mul, n= 12). La
mitad de los animales se sacrificó de forma selectiva y se
administró una segunda dosis de fagos. Los animales restantes se
mataron de forma selectiva en el día 2.
Experimento
4
A cada uno de 45 ratones hembras CD1 se
administró un bolo de 100 \mul de EMRSA que contenía 2 x 10^{7}
cfu. Dos horas después, se les administró un fago negativo (2,5 x
10^{7} fagos, bolo de 200 \mul, n= 15), fago X (3,3 x 10^{6}
fagos, bolo de 200 \mul, n= 15, o el fago Y (1,3 X 10^{6} fagos,
bolo de 200 \mul, n= 15). Cinco animales de cada grupo se
sacrificaron de forma selectiva para los contajes el día 2 y los 10
restantes en cada grupo el día 3).
La elaboración de mapas epitópicos definió siete
áreas en los residuos 135 a 533 de la proteína transportadora ABC en
las que los pacientes fueron tratados con éxito de una septicemia
EMRSA. Un área se denominó como portadora de un epítopo si producía
tres o más pocillos consecutivos con una densidad óptima media (OD)
de por lo menos 2 desviaciones estándar por encima de la de los
controles de los pacientes hospitalizados y de la de los pacientes
septicémicos que murieron (Tabla 3). Las secuencias aminoácidas que
se solapaban, se derivaron comparando las primeras y las últimas
secuencias peptídicas. Los sueros de los pacientes colonizados
fueron asimismo positivos con algunos de los epítopos.
Los resultados para los péptidos 1 a 3 se dan en
la Tabla 4. Los resultados para los péptidos 4 y 5 se dan en
la
Tabla 10.
Tabla 10.
Los pacientes colonizados (Grupo B) reconocían
los péptidos 1 y 3 más que el péptido 2. El péptido 3 fue el menos
inmunogénico. IgG contra el péptido 2 (Grupo C) se encontró en los
pacientes que sobrevivieron a la septicemia y no en los pacientes
colonizados (grupo B) y en aquellos que murieron (Grupo D). Los
resultados obtenidos para los péptidos 4 y 5 muestran una
correlación positiva entre el anticuerpo contra ambos péptidos 4 y
5, y la supervivencia de la infección sistémica.
Estos péptidos se utilizaron para cribar la
biblioteca de exhibición de los anticuerpos fágicos (véase
anteriormente). La amplificación primaria PCR de las familias de los
genes de dominio variable de cadena pesada mostró amplificación de
sólo VH3a, produciendo un producto de 330 pares de bases que se
ensambló con la biblioteca génica de dominio variable de cadena
ligera. Las huellas BstNI de los insertos de scFv
amplificados mediante PCR antes del cribado, mostraron una
biblioteca muy heterogénea. Después del cribado contra el Péptido 1,
dos huellas BstN1 predominaron (X e Y) y después del cribado
con el Péptido 2, otras dos huellas BstN1 (12 y 16). Estas se
seleccionaron para los experimentos con animales.
Experimento
1
Los contajes coloniales se sumarizan en la Tabla
5. Dos ratones murieron espontáneamente en el grupo al que se había
administrado el clon 12 y 1 ratón del grupo al que se había
administrado el clon 16 en el día 1.
El (control negativo) M13K07 en el día 3 dio
lugar a resultados similares para el riñón, mientras que el hígado y
el bazo mostraron alguna actividad con los clones 12 y 16. En el día
7 M13K07 y el clon 16 dieron resultados similares, mientras que el
clon 12 mostraba contajes más bajos que M13K07 en el riñón, hígado y
bazo.
Experimento
2
Los contajes coloniales se sumarizan en la Tabla
6.
La súper biblioteca (control negativo) dio
resultados similares al clon 16. El clon 12 presentaba contajes
menores para el riñón y el bazo (día 1) y el bazo y el hígado (día
2).
Experimento
3
Los contajes coloniales se sumarizan en las
tablas 7 y 8.
El fago negativo produjo contajes similares al
fago 12 (riñón, hígado), fago X (hígado, bazo) en el día 1 y el fago
X (hígado, bazo) en el día 2. El fago Y fue consistentemente
positivo y más positivo que el fago 12, con la excepción de los
contajes renales en el día 2.
Experimento
4
Los contajes coloniales se sumarizan en la Tabla
9.
El fago negativo produjo contajes similares al
fago X (riñón, bazo) en el día 3 y al fago Y (riñón en el día 2).
Los otros parámetros mostraron una respuesta terapéutica para los
fagos X e Y, siendo Y más activo en ambos días 2 y 3, con la
excepción del contaje renal en el día 2.
\newpage
Los fagos 12, X y Y mostraron todos actividad
terepéutica, confirmando a los epítopos representados por los
péptidos 1-5 como diana para la terapia.
\vskip1.000000\baselineskip
| Grupos | ||||
| A | B | C | D | |
| Péptido 1 | n=12 | n=6 | n=3 | n=3 |
| IgM>0,4 | 0 | 5 | 1 | 1 |
| IgG>0,3 | 2 | 5 | 3 | 3 |
| Péptido 2 | ||||
| IgM>0,4 | 2 | 2 | 1 | 1 |
| IgM>0,3 | 0 | 1 | 3 | 0 |
| Péptido 3 | ||||
| IgM>0,3 | 0 | 2 | 0 | 0 |
| IgM>0,2 | 0 | 3 | 0 | 1 |
| M13K07 | Clon 12 | Clon 16 | |
| Riñón Hígado Bazo | Riñón Hígado Bazo | Riñón Hígado Bazo | |
| Día 3 | (n=5) | (n=5) | (n=5) |
| 3,7x10^{7} \hskip0.2cm 8,9x10^{4} \hskip0.2cm 8,7x10^{4} | 1,5x10^{9} \hskip0.2cm 5,3x10^{3} \hskip0.2cm 6,8x10^{3} | 1,7x10^{17} \hskip0.2cm 5x10^{3} \hskip0.2cm 3x10^{3} | |
| Día 7 | (n=5) | (n=3) | (n=4) |
| 1,7x10^{7} \hskip0.2cm 1,1x10^{6} \hskip0.2cm 3,1x10^{3} | 5,1x10^{6} \hskip0.2cm 2,9x10^{4} \hskip0.2cm 2x10^{3} | 5,4x10^{7} \hskip0.2cm 5,5x10^{3} \hskip0.2cm 4x10^{3} |
| Superbibioteca | Clon 12 | Clon 16 | |
| Riñón Hígado Bazo | Riñón Hígado Bazo | Riñón Hígado Bazo | |
| Día 3 | (n=5) | (n=5) | (n=5) |
| 7,2x10^{5} \hskip0.2cm 1,7x10^{4} \hskip0.2cm 6,1x10^{5} | 5,8x10^{5} \hskip0.2cm 1,6x10^{4} \hskip0.2cm 5,4x10^{4} | 1,0x10^{8} \hskip0.2cm 1x10^{4} \hskip0.2cm 1,6x10^{4} | |
| Día 2 | (n=5) | (n=5) | (n=5) |
| 2,6x10^{7} \hskip0.2cm 8,3x10^{3} \hskip0.2cm 6,6x10^{4} | 3,2x10^{7} \hskip0.2cm 4x10^{3} \hskip0.2cm 2,6x10^{4} | 1,4x10^{7} \hskip0.2cm 1,1x10^{4} \hskip0.2cm 2,8x10^{4} |
| Fagos negativos | Fago 12 | |
| Riñón Hígado Bazo | Riñón Hígado Bazo | |
| (n=6) | (n=6) | |
| Día 1 | 8,1x10^{6} \hskip0.2cm 1,5x10^{4} \hskip0.2cm 1,2x10^{5} | 6,5x10^{6} \hskip0.2cm 5x10^{4} \hskip0.2cm 9x10^{4} |
| Día 2 | 3x10^{8} \hskip0.2cm 8,4x10^{4} \hskip0.2cm 2,9x10^{5} | 3x10^{8} \hskip0.2cm 1,5x10^{5} \hskip0.2cm 3x10^{4} |
| Fago X | Fago Y | |
| Riñón Hígado Bazo | Riñón Hígado Bazo | |
| (n=6) | (n=6) | |
| Día 1 | 4,7x10^{5} \hskip0.2cm 9,8x10^{4} \hskip0.2cm 1,5x10^{5} | 9,1x10^{5} \hskip0.2cm 8,3x10^{3} \hskip0.2cm 8x10^{4} |
| Día 2 | 1,5x10^{7} \hskip0.2cm 5x10^{4} \hskip0.2cm 1x10^{5} | 1x10^{7} \hskip0.2cm 1,7x10^{4} \hskip0.2cm 2x10^{4} |
| Fago negativo | Clon X | Clon Y | |
| Riñón Hígado Bazo | Riñón Hígado Bazo | Riñón Hígado Bazo | |
| Día 2 | (n=5) | (n=5) | (n=5) |
| 1,7x10^{7} \hskip0.2cm 3,2x10^{4} \hskip0.2cm 4,5x10^{4} | 4x10^{6} \hskip0.2cm 4,8x10^{3} \hskip0.2cm 2,7x10^{4} | 1,3x10^{7} \hskip0.2cm 1,6x10^{4} \hskip0.2cm 1,4x10^{4} | |
| Día 3 | (n=10) | (n=10) | (n=10) |
| 6,7x10^{7} \hskip0.2cm 1,7x10^{5} \hskip0.2cm 1,6x10^{5} | 9,4x10^{7} \hskip0.2cm 5,4x10^{4} \hskip0.2cm 1,2x10^{5} | 4,7x10^{7} \hskip0.2cm 3,2x10^{4} \hskip0.2cm 5x10^{4} |
\vskip1.000000\baselineskip
| Péptido 4 | Péptido 5 | |||
| IgM | IgG | IgM | IgG | |
| Suero de control | 4 | 1 | 2 | 0 |
| n=12 (Grupo E) | ||||
| Úlcera colonizada | 1 | 0 | 1 | 0 |
| del pie n=3 | ||||
| (Grupo F) | ||||
| Línea IV, esputos, | 6 | 9 | 7 | 8 |
| gasas en heridas | ||||
| ^{a}n=14 | ||||
| (Grupo G) | ||||
| Supervivientes | 3 | 6 | 3 | 5 |
| sistémicos n=7 | ||||
| (Grupo H) | ||||
| Muertos sistémicos | 0 | 0 | 0 | 0 |
| n=3 | ||||
| (Grupo I) |
<110> NeuTec Pharma plc
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<120> Tratamiento y diagnóstico de las
infecciones por estafilococos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> M98/0156/PCT
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\vskip0.400000\baselineskip
<140>
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<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
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<170> PatentIn Ver. 2.1.
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<210> 1
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<211> 1602
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<212> ADN
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<213> Staphylococcus aureus
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1) .. (1602)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 534
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus aureus
\newpage
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 3
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\sa{Gly Asn Thyr Asp}
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<210> 4
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 4
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\sa{Arg Arg Tyr Pro Phe}
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<210> 5
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 5
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\sa{Arg Gly Phe Leu}
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<210> 6
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 6
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\sa{Lys Ile Lys Val Tyr Val Gly Asn Tyr Asp Phe
Trp Tyr Gln Ser}
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<210> 7
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 7
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\sa{Asp Ile Gln Pro Ser Ser Arg Arg Tyr Pro Phe
Val Lys Phe Thr}
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<210> 8
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 8
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\sa{Thr Glu Thr Pre Leu Arg Gly Phe Leu Gly Arg
Met Leu Phe Ser}
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<210> 9
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 9
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\sa{Asp Arg His Phe Leu Asn}
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<210> 10
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<211> 6
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<213> Staphylococcus aureus
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<400>10
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\sa{Lys Thr Thr Leu Leu Lys}
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<210> 11
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<211> 7
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 11
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\sa{Gly Val Thr Thr Ser Leu Ser}
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<210> 12
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 12
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\sa{Val Asp Trp Leu Arg}
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<210> 13
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<211> 15
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<213> Staphylococcus aureus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 13
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\sa{Glu Pro Asp Val Leu Leu Leu Asp Glu Pro Thr
Asn Gly Leu Asp}
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<210> 14
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<211> 15
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<400> 14
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\sa{Leu Ile Gly Asp Ser Glu Ile Ala Lys Thr Thr
Leu Lys Ile}
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<210> 15
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Staphylococcus aureus
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskipttttaaaacg ccgatttctt g
\hfill21
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\sa{Gly Ala Asn Gly Ala Gly Lys Ser Thr}
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ala Asn Gly Ala Gly Lys Ser Thr Phe Leu
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Proteína transportadora ABC estafilocócica que
tiene la secuencia de SEC ID nº 2, o una forma modificada
parcialmente de la misma, que posee, por lo menos, una homología del
70% con la misma sobre su longitud completa, o un fragmento
inmunogénico de la misma, para su utilización en un procedimiento de
tratamiento o diagnóstico del organismo humano o animal.
2. Proteína transportadora ABC estafilocócica
según la reivindicación 1, codificada por la forma modificada
parcialmente de SEC ID nº:1, que posee, por lo menos, una homología
del 70% con la misma sobre su longitud completa, y que comprende un
mutante alélico de la proteína transportadora ABC estafilocócica de
la reivindicación 1.
3. Proteína transportadora ABC estafilocócica
según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que posee una
homología de por lo menos el 80, 90 o 95%, con la secuencia de SEC
ID nº:2.
4. Secuencia nucleótida que codifica una proteína
transportadora ABC estafilocócica según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, para su utilización en un procedimiento de
tratamiento o diagnóstico del organismo humano o animal.
5. Secuencia nucleótida según la reivindicación
4, que tiene la secuencia de SEC ID nº:1.
6. Proteína transportadora ABC estafilocócica o
secuencia nucleótida que codifica la misma, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, siendo el estafilococo el S.
aureus, un Staphylococcus coagulasa negativo, S.
epidermidis, S haemolyticus, S. hyicus o S.
saprophyticus.
7. Fragmento inmunogénico de una proteína
transportadora ABC estafilocócica según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, presentando el fragmento la secuencia
de cualquiera de las SEC nºs 3 a 14, 17 ó 18.
8. Utilización de una proteína transportadora ABC
estafilocócica o de un fragmento inmunogénico de la misma, según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la preparación
de un medicamento para el tratamiento de la infección
estafilocócica.
9. Utilización de un agente específico
neutralizante o de unión contra una proteína transportadora ABC
estafilocócica o un fragmento inmunogénico de la misma, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de la infección estafilocócica,
seleccionándose dicho agente neutralizante o de unión de entre el
grupo constituido por un anticuerpo, un fragmento de unión
antigénica del mismo, una vacuna de ADN, un ribozima y un
oligonucleótido antisentido.
10. Procedimiento para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de la infección estafilocócica,
caracterizado por la utilización de una proteína
transportadora ABC estafilocócica o de un fragmento inmunogénico de
la misma, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
11. Procedimiento para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de la infección estafilocócica,
caracterizado por la utilización de un agente específico
neutralizante o de unión contra una proteína transportadora ABC
estafilocócica o un fragmento inmunogénico de la misma, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, seleccionándose dicho
agente neutralizante o de unión de entre el grupo constituido por un
anticuerpo, un fragmento de unión antigénica del mismo, una vacuna
de ADN, un ribozima y un oligonucleótido antisentido.
12. Utilización de una proteína transportadora
ABC estafilocócica, de un fragmento inmunogénico de la misma, o de
un agente específico neutralizante o de unión contra dicha proteína
transportadora ABC estafilocócica,
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de un kit de ensayo diagnóstico para estafiloco-
cos, seleccionándose dicho agente neutralizante o de unión de entre el grupo constituido por un anticuerpo, un
fragmento de unión antigénica del mismo, una vacuna de ADN, un ribozima y un oligonucleótido antisen-
tido.
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la preparación de un kit de ensayo diagnóstico para estafiloco-
cos, seleccionándose dicho agente neutralizante o de unión de entre el grupo constituido por un anticuerpo, un
fragmento de unión antigénica del mismo, una vacuna de ADN, un ribozima y un oligonucleótido antisen-
tido.
13. Utilización de una proteína transportadora
ABC estafilocócica, de un fragmento inmunogénico de la misma, o de
un agente específico neutralizante o de unión contra dicha proteína
transportadora ABC estafilocócica, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en un ensayo diagnóstico, seleccionándose
dicho agente neutralizante o de unión de entre el grupo constituido
por un anticuerpo, un fragmento de unión antigénica del mismo, una
vacuna de ADN, un ribozima y un oligonucleótido antisentido.
14. Utilización de una proteína transportadora
ABC estafilocócica, de un fragmento inmunogénico de la misma, o de
un agente específico neutralizante o de unión contra dicha proteína
transportadora ABC estafilocócica, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en un procedimiento para la preparación de
un kit de ensayo diagnóstico o en un procedimiento de ensayo
diagnóstico in vitro, siendo el equipo o el procedimiento
para el diagnóstico de estafilococos.
\newpage
15. Procedimiento de ensayo diagnóstico in
vitro para Estafilococos, que comprende las etapas
siguientes:
- (i)
- hacer reaccionar una proteína transportadora ABC estafilocócica, o un fragmento inmunogénico de la misma, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, con una muestra;
- (ii)
- detectar una reacción de unión anticuerpo-antígeno; y
- (iii)
- correlacionar la detección de la reacción de unión antígeno-anticuerpo con la presencia de estafilococos.
16. Procedimiento de ensayo diagnóstico in
vitro para estafilococos, que comprende las etapas
siguientes:
- (i)
- hacer reaccionar un agente específico neutralizante o de unión contra una proteína transportadora ABC estafilocócica o un fragmento inmunogénico de la misma, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, con una muestra, seleccionándose dicho agente neutralizante o de unión de entre el grupo constituido por un anticuerpo, un fragmento de unión antigénica del mismo, una vacuna de ADN, un ribozima y un oligonucleótido antisentido;
- (ii)
- detectar una reacción de unión diana-agente neutralizante o de unión; y
- (iii)
- correlacionar la detección de la reacción de unión agente neutralizante o de unión-diana con la presencia de estafilococos.
17. Procedimiento de ensayo diagnóstico según
cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16, en el que el agente de
unión es un anticuerpo y la diana es un antígeno.
18. Procedimiento de ensayo diagnóstico según
cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, apropiado para el
diagnóstico de la infección estafilocócica en un paciente, en el que
la muestra es una muestra del paciente y la correlación determina la
infección Estafilocócica del paciente.
19. Procedimiento de ensayo diagnóstico según
cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que la muestra es
el plasma, suero o antisuero del paciente.
20. Kit de ensayo diagnóstico para llevar a cabo
un procedimiento de ensayo diagnóstico, según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 19, que comprende una proteína transportadora
ABC estafilocócica o un fragmento inmunogénico de la misma según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un agente específico
neutralizante o de unión contra dicha proteína transportadora ABC
estafilocócica, o un fragmento inmunogénico de la misma, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
21. Kit de ensayo diagnóstico según la
reivindicación 20, que incluye las instrucciones para llevar a cabo
un ensayo diagnóstico utilizando el equipo.
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2000
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