ES2310684T3 - Epitopes de celulas t en eritropoyetina. - Google Patents
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Abstract
Una molécula modificada que tiene la actividad biológica de la eritropoyetina (EPO) humana y que es sustancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que cualquier molécula sin modificar con la misma actividad biológica en un individuo cuando se usa in vivo, en la que dicha pérdida de inmunogenicidad se consigue eliminando uno o más epítopes de células T procedentes de la molécula originalmente sin modificar, siendo dichos epítopes de células T ligandos del MHC clase II o secuencias peptídicas que muestras la capacidad de estimular o unirse a células T por medio de su presentación en clase II; dicha molécula modificada tiene la secuencia de aminoácidos: APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENX 1 TTGCAEHCSX 2 NENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEV WQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPX 3 EPX 4 QX 5 HX 6 DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAAS AAPLRTITADTFRKX 7 X 8 RX 9 X 10 SNX 11 X 12 RGKX 13 KLYTGEACRTGDR donde X 1 = A, G, P; X 2 = A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y T; X 3 = T, A y G; X 4 = A, P, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y T; X 5 = A, P, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y T; X 6 = A, P, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y T; X 7 = T; X 8 = A, P y G; X 9 = T; X 10 = P, A y G; X 11 = A, P y G; X 12 = S, A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R y T; X 13 = A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y T; y cuando se analiza como una proteína completa en un ensayo biológico de proliferación de células T, muestra un índice de estimulación (IE) menor de 2,0 y menor que el de la molécula parental sin modificar.
Description
Epítopes de células T en eritropoyetina.
La presente invención se refiere al campo de la
inmunología. La invención identifica determinantes en la
eritropoyetina (EPO) humana capaces de inducir una respuesta
inmune. En particular, la invención está relacionada con la
identificación de epítopes de células T en EPO humana. La invención
se refiere, además, a péptidos de epítopes de células T derivados
de la EPO por medio de los cuales es posible crear variantes
modificadas de EPO con inmunogenicidad reducida.
Existen muchos casos por los que la eficacia de
una proteína terapéutica está limitada por una reacción inmune no
deseada a dicha proteína. Varios anticuerpos monoclonales de ratón
han mostrado ser prometedores como tratamientos en varios contextos
patológicos humanos, pero en ciertos casos han fracasado debido a la
inducción de grados significativos de respuesta de anticuerpos
humanos anti-ratón (HAMA, por sus siglas en inglés)
[Schroff, R. W. y col. (1985) Cancer Res. 45:
879-885; Shawler, D.L. y col. (1985) J.
Immunol. 135: 1530-1535]. Se han
desarrollado varias técnicas para anticuerpos monoclonales en un
intento por reducir la respuesta HAMA [documentos WO 89/09622; EP
0239400; EP 0438310 y WO 91/06667]. Estas estrategias de ADN
recombinante generalmente han reducido la información genética de
ratón en la construcción final del anticuerpo, a la vez que
incrementa la información genética humana en la construcción final.
No obstante, los anticuerpos "humanizados" resultantes han
desarrollado, en varios casos, aún una respuesta inmune en pacientes
[Issacs J.D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456;
Rebello, P.R. y col. (1999) Transplantation 68:
1417-1420].
Los anticuerpos no son la única clase de
moléculas polipeptídicas administradas como agente terapéutico
contra las cuales puede desarrollarse una respuesta inmune. Incluso
proteínas de origen humano y con las mismas secuencias de
aminoácidos que las que existen en humanos pueden inducir una
respuesta inmune en seres humanos. Entre otros, son ejemplos
destacables el uso terapéutico del factor estimulador de colonias de
granulocitos-macrófagos [Wadhwa, M. Y. col. (1999)
Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361]
e interferón alfa 2 [Russo, D. y col. (1996) Bri. J. Haem.
94: 300-305; Stein, R. y col. (1988) New
Engl. J. Med. 318: 1409-1413]. En tales
situaciones en las que estas proteínas humanas son inmunogénicas,
existe una supuesta rotura de la tolerancia inmunológica a estas
proteínas que de otra manera hubiera estado funcionando en estos
sujetos.
Un reciente ejemplo destacado de este problema
se observa en el uso terapéutico de eritropoyetina (EPO) humana
recombinante. Se trata de una glucoproteína que es un factor de
crecimiento crítico, puesto que estimula la formación de
eritrocitos in vivo. La proteína se usa terapéuticamente en
el tratamiento de pacientes anémicos en diálisis y en otros
pacientes para los que la anemia es un problema. La proteína ha
demostrado ser segura y eficaz en el tratamiento de la anemia para
la gran mayoría de los pacientes. Sin embargo, en 1997, Prabhakar y
Muhlfelder [Prabhakar, S. y Muhlfelder, T. Clin. Nephrol.
47: 331-335] describieron un sólo caso de
aplasia pura de serie roja por altas concentraciones de anticuerpos
anti-EPO. Posteriormente, se han descrito muchos
otros casos de aplasia pura de serie roja relacionados con el
desarrollo de anticuerpos frente a la EPO recombinante. Se ha
concluido que los anticuerpos inducidos tienen una reacción cruzada
con la proteína endógena que lleva a un bloqueo completo de la
diferenciación de eritrocitos (para una revisión, véase Indiveri F.
y Murdaca, G; Rev. Clin. Exp. Hematol. (2002) Supl. 1:
7-11). Los pacientes sobreviven sólo por medio de
transfusiones sanguíneas frecuentes y aunque los niveles de
anticuerpo disminuyen cuando se interrumpe el tratamiento,
aproximadamente la mitad de los pacientes afectados siguen
dependiendo de transfusiones.
Una respuesta de anticuerpos mantenida frente a
una proteína terapéutica como la EPO requiere la estimulación de la
proliferación y la activación de células T cooperadoras. La
estimulación de células T requiere del establecimiento de una
sinapsis de células T entre una célula T y una célula presentadora
de antígeno (APC, por sus siglas en inglés). En el núcleo de la
sinapsis está el receptor de células T (TCR) sobre la célula T
acoplada con un complejo péptido-MHC clase II sobre
la superficie de la APC. El péptido procede del procesamiento
intracelular de la proteína antigénica. Las secuencias peptídicas
de los antígenos proteicos que pueden estimular la actividad de
células T por medio de su presentación sobre las moléculas de MHC
clase II son los denominados "epítopes de células T". Estos
epítopes de células T se definen normalmente como cualquier
secuencia de restos de aminoácidos con capacidad para unirse a
moléculas de MHC clase II. De forma implícita, un "epítope de
células T" significa un epítope que cuando se une a moléculas de
MHC puede ser reconocido por un TCR y el cual puede, al menos en
principio, causar la activación de estas células T al acoplarse a un
TCR para inducir una respuesta de células T. Se entiende que para
muchas proteínas un pequeño número de epítopes de células T
cooperadoras puede dirigir la señalización de células T cooperadoras
para dar lugar a respuestas mantenidas de alta afinidad y con
cambio de clase para las que podría existir un repertorio muy grande
de determinantes de superficie expuestos sobre la proteína
terapéutica.
La identificación de epítopes de células T se
considera la primera etapa para la eliminación de epítopes y es muy
deseable para identificar epítopes de células T en proteínas
terapéuticas como la EPO. Las solicitudes de patente WO 98/52976 y
WO 00/34317 muestran técnicas de reconocimiento de plegamiento por
ordenador para identificar secuencias de polipéptidos con el
potencial de unirse a un subgrupo de alotipos DR del MHC clase II
humano, en las que se eliminan epítopes de células T predichos
mediante el uso de una sustitución de aminoácidos razonable en la
proteína de interés. Sin embargo, con este esquema y otros
procedimientos por ordenador para la identificación de epítopes
[Godkin, A.J. y col. (1998) J. Immunol. 161:
850-858; Sturniolo, T. y col. (1999) Nat.
Biotechnol. 17: 555-561], los péptidos
predichos como capaces de unirse a moléculas de MHC clase II pueden
no funcionar como epítopes de células T en todas las situaciones,
especialmente in vivo, debido a las vías de procesamiento y
a otros fenómenos. Además, las técnicas por ordenador para la
predicción de epítopes de células T, en general no han sido capaces
de producir epítopes con restricción DP o DQ.
Igualmente, los métodos in vitro para
medir la capacidad de péptidos sintéticos para unirse a moléculas
de MHC clase II, por ejemplo, usando líneas de células B con un
alotipo de MHC definido como fuente de superficie de unión de MHC
clase II [Marshall K.W. y col. (1994) J. Immunol.
152:4946-4956; O'Sullivan y col. (1990)
J. Immunol. 145: 1799-1808; Robadey C.
y col. (1997) J. Immunol 159:
3238-3246], se pueden aplicar a la identificación
de ligandos de MHC clase II. Sin embargo, estas técnicas no están
adaptadas para la selección de múltiples epítopes posibles en una
amplia variedad de alotipos de MHC, ni pueden confirmar que un
péptido de unión pueda funcionar como epítope de células T.
Recientemente se han empleado técnicas que
utilizan complejos solubles de moléculas de MHC recombinantes en
combinación con péptidos sintéticos [Kern, F. y col. (1998)
Nature Medicine 4:975-978; Kwok, W.W.
y col. (2001) TRENDS in Immunol.
22:583-588]. Estos reactivos y procedimientos
se usan para identificar la presencia de clones de células T a
partir de muestras de sangre periférica de seres humanos o animales
experimentales que son capaces de unirse a complejos
MHC-péptido en particular, pero no están adaptados
para la selección de múltiples epítopes potenciales en una amplia
diversidad de alotipos de MHC.
Los ensayos biológicos de activación de células
T siguen siendo la mejor opción práctica para proporcionar una
lectura de la capacidad de una secuencia peptídica/proteica de
prueba para inducir una respuesta inmune. Ejemplos de este tipo de
técnica son el trabajo de Petra y col., que utilizan ensayos de
proliferación de células T para la proteína bacteriana
estafilocinasa, seguido por el mapeo de epítopes usando péptidos
sintéticos para estimular líneas de células T [Petra, A.M. y col.
(2002) J Immunol. 168: 155-161]. De
forma similar, los ensayos de proliferación de células T usando
péptidos sintéticos de la proteína toxina tetánica han dado como
resultado la definición de regiones de epítopes inmunodominantes de
la toxina [Reece J.C. y col. (1993) J. Immunol. 151:
6175-6184]. En el documento WO 99/53038 se describe
una estrategia en la que pueden determinarse los epítopes de
células T en una proteína problema usando subgrupos aislados de
células inmunes humanas, estimulando su diferenciación in
vitro, y el cultivo de las células en presencia de péptidos
sintéticos de interés, así como la cuantificación de cualquier
proliferación inducida en las células T cultivadas. La misma técnica
la describe también Stickler y col. [Stickler, M.M. y col. (2000)
J. Immunotherapy 23:654-660],
aplicándose el método, en ambos casos, a la detección de epítopes
de células T en subtilisina bacteriana. Esta técnica requiere la
aplicación cuidadosa de técnicas de aislamiento de células y el
cultivo celular con múltiples suplementos de citocinas para obtener
el subgrupo deseado de células inmunes (células dendríticas, células
T CD4+ y/o CD8+).
En una variación de estas estrategias, Hiemstra
y col. [Hiemstra, H.S. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci USA
94:10313-10318] han descrito un procedimiento
para identificar un epítope de péptido capaz de estimular una
célula T conocida, siendo valioso este procedimiento para la
detección de clones de células T autorreactivas de los cuales se
desconozca el auto(antígeno).
Abundan los ejemplos anteriores y otros ensayos
biológicos que incluyen variaciones técnicas en la cuantificación
de un evento de activación de células T in vitro, normalmente
mediante la cuantificación de una respuesta de proliferación
inducida. Sin embargo, ninguno de los procedimientos proporciona un
esquema unificado para la detección de epítopes biológicamente
relevantes en proteínas de origen humano ni son fácilmente
aplicables a la detección de epítopes significativos para la amplia
población de alotipos de MHC. La presente invención proporciona un
esquema para la identificación de epítopes de células T en EPO
humana y análogos de la EPO en el que los epítopes de células T
tienen alterada su capacidad para interaccionar con moléculas de MHC
clase II.
Los presentes inventores han descrito
anteriormente los posibles ligandos de MHC clase II en la secuencia
de EPO humana en el documento WO 02/062843. A diferencia de la
presente invención, el conjunto de datos de posibles ligandos de
MHC clase II descritos en el documento WO 02/062843 se obtiene
únicamente usando medios informáticos, es muy grande y representa
el universo de posibles ligandos del MHC. Por razones tales como el
requisito de un procesamiento proteolítico de la proteína EPO
completa y otras etapas fisiológicas que lleven a presentación de
péptidos EPO in vivo, está claro que sólo un subgrupo menor
del repertorio completo de péptidos tendrá una relevancia biológica
final y la presente invención, en forma de mapa de epítopes de
células T de EPO, se concibe para solucionar la deficiencia en la
técnica.
Como se indicó anteriormente, la EPO
recombinante se usa como tratamiento eficaz para la anemia causada
por insuficiencia renal crónica. La EPO es una hormona
glucoproteica implicada en la maduración de células progenitoras
eritroides en eritrocitos. La EPO natural se produce en el hígado
durante la vida fetal y en el riñón en adultos. La hormona circula
en sangre para estimular la producción de eritrocitos en la médula
ósea. La anemia es casi invariablemente una consecuencia de la
insuficiencia renal debido a una reducción de la producción de EPO
en el riñón. Previamente se ha descrito la producción de EPO usando
técnicas de ADN recombinante [Jacobs y col. Nature,
313: 806-810; Lin, F.-K y col. (1985)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
82:7580-7585] y pueden producirse cantidades
terapéuticas, por ejemplo, según los procedimientos descritos en la
publicación PCT WO 85/02610 de Kirin-Amgen y otros
ejemplos.
La secuencia de aminoácidos madura de la EPO
humana contiene 166 restos de aminoácidos e, ilustrada con el
código de una sola letra, comprende la siguiente secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
- APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQ GLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLR TITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR
\vskip1.000000\baselineskip
La EPO humana recombinante (expresada en células
de mamífero) contiene tres cadenas de oligosacáridos unidas en N y
en O que contienen cada una restos de ácido siálico terminales.
Estos últimos son importantes para hacer posible que la EPO evite
un rápido aclaramiento en circulación por la proteína de unión a
asialoglucoproteínas hepáticas. Se han llevado a cabo varios
estudios en los que se ha aplicado una modificación por mutación de
la proteína para entender mejor la estructura y función de la
molécula. Por ejemplo, estudios realizados por Yamaguchi
[Yamaguchi, K. y col. (1991) J. Biol. Chem. 266:
20434-20439], Delorme [Delonne, E. y col. (1992)
Biochemistry 31: 9871-9876] y por Bill
[Bill, R. y col. (1995) Biochim. Biophys. Acta. 1261:
35-43] se han centrado en los sitios de N y O
glucosilación dentro de la proteína, haciendo sustituciones en N24,
N38, N83 y S126. Este trabajo ha indicado que se requiere cierta
glucosilación en N para la actividad de la EPO; en especial, los
azúcares unidos en N aumentan el peso molecular aparente de la EPO y
prolongan su semivida en circulación. En el caso de Bill y col., la
sustitución fue N24, N38 y N83 por cisteína, dando lugar a una
actividad funcional muy reducida.
La sustitución con cisteína también se describe
en el documento WO 99/03887, en donde el propósito es el de
proporcionar variantes de la EPO con cisteína agregada y su uso para
preparar conjugados usando PEG que reaccionan con cisteínas y otros
restos que también reaccionan con cisteína. La solicitud muestra que
ciertos aminoácidos de la EPO no son esenciales para la actividad
biológica y pueden mutarse a restos de cisteína sin alterar el
patrón normal de puentes disulfuro ni la conformación global de la
molécula. Ejemplos de sustituciones contempladas en el documento WO
99/03887 incluyen
\vskip1.000000\baselineskip
S126C, N24C, I25C, T26C, N38C, I39C, T40C, N83C,
S84C, A1C, P2C, P3C, R4C, D8C, S9C, T27C, G28C, A30C, E31C, H32C,
S34C, N36C, D43C, T44C, K45C, N47C, A50C, K52C, E55C, G57C, Q58C,
G77C, Q78C, A79C, Q86C, W88C, E89C, T107C, R110C, A111C, G113C,
A114C, Q115C, K116C, E117C, A118C, S120C, P121C, P122C, D123C,
Al24C, Al25C, Al27C, Al28C, T132C, K154C, T157C, G158C, E159C,
A160C, T163C, G164C, D165C, R166C y S85C.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención describe análogos de la
EPO que incorporan sustituciones en una o más de las posiciones
anteriores identificadas por la incorporación de cisteína libre. Sin
embargo, la presente invención se aleja específicamente de
cualquiera de las sustituciones contempladas presentadas
anteriormente y no se centra en absoluto en la incorporación de
restos de cisteína libre adecuados para la derivación con restos de
PEG.
La patente de EE.UU. 4.703.008 proporciona
variantes de EPO naturales, así como sustituciones de aminoácidos
que están presentes en proteínas EPO de mamíferos.
El documento EP0357804 proporciona composiciones
de EPO que comprenden sustituciones de M54. La sustitución
preferida es M54L y otra realización preferida especifica la
sustitución en N38. La sustitución M54L se considera que hace la
composición de EPO menos susceptible a la oxidación y reduce al
mínimo la incorporación errónea de norleucina durante la
biosíntesis.
En otros documentos también se han proporcionado
moléculas de EPO modificadas, como los documentos US 5.856.298 y US
5.955.422, pero se entiende que estas estrategias y otros ejemplos
tienen como objetivo mejorar la producción comercial de EPO y
estrategias para afectar al estado de glucosilación de la proteína
como molécula recombinante.
En ninguna de estas estrategias se reconoce la
importancia de los epítopes de células T para las propiedades
inmunogénicas de la proteína ni se han concebido para afectar
directamente a dichas propiedades de forma específica y controlada
de acuerdo con el esquema de la presente invención.
La procedencia o localización de epítopes de
células T dentro de una secuencia de proteína lineal se denomina en
este documento "mapa de epítopes". Un objetivo de la presente
invención es proporcionar un mapa de epítopes para la EPO
humana.
Un objetivo adicional de la presente invención
es proporcionar análogos de la EPO en los cuales los epítopes de
células T mapeados previamente tengan alterada su capacidad para
funcionar como ligandos del MHC clase II y/o para activar células T
en combinación con moléculas MHC clase II. Es muy deseable
proporcionar EPO con potencial reducido o ausente para reducir una
respuesta inmune en el ser humano y es, por tanto, un objetivo
particular de la presente invención proporcionar proteínas EPO
modificadas en las cuales la característica inmune se modifique por
medio de un número reducido de posibles epítopes de células T, como
se reivindica en la reivindicación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En resumen, la invención se refiere a los
siguientes aspectos:
- \bullet
- una molécula EPO que contiene una secuencia peptídica modificada que cuando se prueba individualmente induce un índice de estimulación inferior a 2,0 en un ensayo de células T;
- \bullet
- una molécula EPO que contiene modificaciones de tal manera que cuando se prueba en un ensayo de células T induce un índice de estimulación reducido en comparación con una molécula de proteína sin modificar;
- \bullet
- una molécula EPO en la cual se han mapeado las regiones inmunogénicas usando un ensayo de células T y posteriormente modificada de tal manera que tras una prueba adicional en un ensayo de células T, la proteína modificada induce un índice de estimulación menor que el de la molécula parental (sin modificar) y más preferiblemente, inferior a 2,0 o incluso inferior a 1,8;
- \bullet
- una molécula modificada que tiene la actividad biológica de la EPO y que es sustancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que cualquier otra molécula sin modificar que tenga la misma actividad biológica cuando se usa in vivo;
- \bullet
- una molécula especificada en consecuencia en la que la alteración se lleva a cabo en uno o más restos de la cadena de restos contiguos definida en este documento como regiones de epítopes y que comprenda una de las secuencias
- (a) RVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVP,
- (b) RGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTL o
- (c) RTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRT
- \bullet
- una molécula especificada en consecuencia en la que la alteración se lleva a cabo en uno o más restos de la cadena de restos contiguos definida en este documento como región de epítopes R1 y que comprende la secuencia AKEAENITTGCAEHCSLNENI;
- \bullet
- una molécula especificada en consecuencia en la que la alteración se lleva a cabo en uno o más restos de la cadena de restos contiguos definida en este documento como región de epítopes R2 y que comprende la secuencia RGQALLVNSSQPWEPLQLHVD;
- \bullet
- una molécula especificada en consecuencia en la que la alteración se lleva a cabo en uno o más restos de la cadena de restos contiguos definida en este documento como región de epítopes R3 y que comprende una de la secuencia TFRKLFRVYSNFLRGKLKLYT;
- \bullet
- una secuencia o molécula de ADN que codifica cualquiera de las moléculas modificadas especificadas como se define anteriormente y más adelante;
- \bullet
- una composición farmacéutica que comprende una molécula modificada que tiene la actividad biológica de la EPO.
La presente invención proporciona ejemplos de
sustituciones idóneas dentro de las regiones más inmunogénicas de
la molécula parental, considerándose estas sustituciones
realizaciones de la invención.
Los péptidos sintéticos se prueban para
verificar su capacidad para inducir una respuesta proliferativa en
células T humanas cultivadas in vitro. Las células T están
presentes en la capa de célula mononucleares de sangre periférica
(PBMC), fácilmente obtenible por medios bien conocidos a partir de
muestras de sangre completa. Además, la preparación de PBMC
contiene relaciones fisiológicas de células T y células
presentadoras de antígeno y es, por tanto, una fuente adecuada de
material con el que llevar a cabo una reacción inmune in
vitro subrogada. Los inventores han establecido que, en el
desarrollo de este ensayo, un índice de estimulación muy próximo o
que exceda de 2,0 es un valor útil de proliferación inducida. El
índice de estimulación (IE) se obtiene convencionalmente mediante
la división de la puntuación de proliferación (p. ej., cuentas por
minuto de radioactividad, si se usa por ejemplo incorporación de
^{3}H-timidina) medida para el péptido de prueba
entre la puntuación medida en células que no se han puesto en
contacto con un péptido de prueba. Los péptidos que no inducen
ninguna respuesta dan un IE = 1,0 aunque en la práctica, los valores
del IE en el intervalo de 0,8-1,2 son
insignificantes. Pueden incorporarse varios procedimientos técnicos
en el desarrollo de estos ensayos para garantizar la credibilidad
en las puntuaciones registradas. Normalmente, todas las
determinaciones se hacen al menos por triplicado y se puede
calcular la puntuación media. Cuando el IE calculado es \geq 2,0,
pueden analizarse las puntuaciones individuales del triplicado para
comprobar los datos extremos. Los péptidos de prueba se ponen en
contacto con células a al menos dos concentraciones diferentes y las
concentraciones normalmente abarcarían una diferencia de un mínimo
de dos veces la diferencia de la concentración. Este intervalo de
concentraciones proporciona un desequilibrio de la dimensión
cinética del ensayo y es especialmente importante cuando se está
llevando a cabo la determinación de un único punto temporal, por
ejemplo en más día 7. En algunos ensayos pueden realizarse varias
determinaciones del curso temporal, pero en cualquier caso éstas
también podrían hacerse usando un inmunógeno peptídico
proporcionado a un mínimo de dos concentraciones diferentes.
De forma similar, pueden incluirse en la placa
de ensayo péptidos control a los que se espera sean sensibles la
mayoría de las muestras de PBMC de donantes. El péptido
307-309 de la hemaglutinina del virus de la gripe,
la secuencia PKYVKQNTLKLA y la secuencia peptídica de HSP60 de
Chlamydia KVVDQIKKISKPVQH son péptidos control especialmente
adecuados, aunque puede sacarse provecho de muchos otros ejemplos.
Preferiblemente, los ensayos deben usar también un potente antígeno
de proteína completa, como hemocianina de lapa bocallave, con el
que se esperaría que todas las muestras de PBMC mostraran un IE
significativamente mayor de 2,0.
Se desea especialmente proporcionar un mapa de
epítopes de la EPO humana que tenga relevancia para un amplio
espectro de posibles alotipos de MHC. Se desea que el mapa sea lo
suficientemente representativo como para permitir el diseño o
selección de la proteína modificada para la que se elimine, o al
menos se reduzca, la capacidad para inducir una respuesta inmune
dependiente de células T en la mayoría de los pacientes a quienes
probablemente se vaya a administrar la proteína. En consecuencia, en
la práctica de los procesos de selección, se obtienen células T
procedentes de PBMC de donantes vírgenes a partir de un grupo de
donantes con suficiente diversidad inmunológica para proporcionar
una muestra de al menos más del 90% del repertorio de MHC clase II
(HLA-DR) existente en la población humana. Cuando se
va a detectar una respuesta de células T vírgenes frente a un
péptido sintético determinado, el péptido en práctica se pone en
contacto por separado con preparaciones de PBMC procedentes de
varios donantes; el número de donantes (o el tamaño del "grupo de
donantes") probablemente no es, a los fines prácticos, inferior
a 20 individuos no emparentados, y todas las muestras del grupo de
donantes pueden preseleccionarse de acuerdo con su haplotipo de MHC
clase II.
La expresión "donante virgen" en el
contexto de la presente invención significa que las células T se
han obtenido de un individuo que no ha recibido ninguna fuente
terapéutica o exógena de EPO.
La presente invención describe en este documento
un método para el mapeo de epítopes de células T explotando células
T inmunológicamente vírgenes. Las células T se obtienen de una
muestra de sangre periférica de una multiplicidad de donantes sanos
para quienes la proteína de interés puede ser una molécula endógena,
pero quienes no hayan recibido la proteína de interés de ninguna
fuente exógena, por ejemplo, administrada terapéuticamente. El
ensayo se lleva a cabo usando PBMC cultivadas in vitro
utilizando procedimientos comunes en la técnica e implica poner en
contacto las PBMC con especies de péptidos sintéticos
representativos de la proteína de interés y, después de un periodo
de incubación adecuado, la cuantificación de la activación de
células T inducida por el péptido, como la proliferación celular.
La cuantificación se realiza mediante cualquier medio adecuado y
puede, por ejemplo, llevarse a cabo usando la incorporación de
^{3}H-timidina mediante la cual se mide
fácilmente la acumulación de ^{3}H en el material celular usando
instrumentos de laboratorio. Se analiza el grado de proliferación
celular para cada combinación de muestra de PBMC y péptido sintético
en relación con el grado observado en una muestra de PBMC no
tratada con péptido. También se puede hacer referencia a la
respuesta proliferativa observada después del tratamiento con un
péptido o péptidos para los cuales exista un efecto proliferativo
esperado. A este respecto, se considera particularmente ventajoso
usar péptidos con una amplia restricción de MHC conocida y
especialmente epítopes de péptidos con restricción de MHC para los
isotipos DP o DQ.
Para facilitar el ensamblaje de un mapa de
epítopes para la EPO humana, se produjo un conjunto de péptidos
sintéticos. Cada uno de los péptidos tenía una longitud de 15 restos
de aminoácidos y cada uno solapaba con el siguiente péptido de la
serie en 12 restos de aminoácidos; es decir, cada péptido sucesivo
de la serie añadía progresivamente 3 aminoácidos más al análisis.
De esta forma, cualquier par adyacente de péptidos dado mapeaba 18
aminoácidos de secuencia contigua. En el caso de la EPO fue
necesario un total de 51 péptidos para hacer posible una
exploración de la proteína madura completa. En el Ejemplo 1 se
proporciona un método particularmente eficaz para definir un mapa
de células T para la EPO usando ensayos con células T vírgenes.
Los presentes estudios han revelado 16
secuencias peptídicas capaces de inducir una respuesta proliferativa
significativa. Estos péptidos se enumeran en la Tabla 1 y
constituyen una realización de la invención. Dentro de este grupo
de péptidos, se identificó un subgrupo adicional de péptidos, en el
que cada uno de los péptidos inducía una respuesta proliferativa
significativa en 2 ó más muestras de donantes individuales. Estos
péptidos se enumeran en la Tabla 2 y constituyen una realización de
la invención.
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Se sugiere que cada uno de los péptidos
identificados en la Tabla 1 es capaz de unirse al MHC clase II y de
acoplar al menos un TCR relacionado con suficiente afinidad como
para inducir un estallido proliferativo detectable en el sistema de
ensayo. En el caso de los péptidos de la Tabla 2 se han conseguido
estos exigentes criterios usando PBMC procedentes de dos o tres
muestras de PBMC de donantes no emparentados. Se considera que estos
péptidos abarcan las regiones de epítopes principales de la
molécula y se agrupan en tres zonas de la secuencia de la EPO
denominadas en este documento regiones de epítopes R1, R2 y R3.
Los péptidos P7, P8, y P9, que comprenden la
secuencia AKEAENITTGCAEHCSLNENI, abarcan la región R1. El péptido
P26, que comprende la secuencia RGQALLVNSSQPWEP, abarca la región de
epítopes R2. Obsérvese que en el caso del epítope R2 los péptidos
consecutivos P27 y P28 también reaccionan cada uno con una muestra
de PBMC de donante. En el caso del péptido P27, el donante también
reacciona con el péptido P26 y es probable que una única secuencia
central común dentro de R2 sea responsable de esta estimulación.
Debido al escalonamiento de cada péptido consecutivo en la
secuencia, es posible que la misma secuencia nonámero central sea
compartida (es decir, sea común) entre 2 ó 3 péptidos adyacentes.
El escalonamiento exacto depende de la proximidad al extremo
N-terminal y está relacionado con la longitud de los
péptidos y el número de restos "nuevos" explorados en cada
incremento sucesivo de la secuencia. En el caso del epítope R2, se
ha establecido el límite del extremo C-terminal de
la región de epítopes para incluir una secuencia cubierta no menos
por los péptidos P27 y P28 ya que se ha demostrado que esta región
contiene ligandos significativos del MHC clase II en su región
C-terminal (véase más adelante y la Figura 2). La
región de epítopes R2 se define, en consecuencia, por la secuencia
RGQALLVNSSQPWEPLQLHVD.
Los péptidos P46 y P47 abarcan la región de
epítopes R3 y se extiende hacia el extremo
C-terminal de la secuencia de la EPO. El límite
C-terminal del epítope R3 está limitado por el
extremo natural de la proteína EPO; en particular, el péptido P50
también es reactivo en dos muestras de donantes que son los mismos
que reaccionan con los péptidos P46 y P47. Se considera que el
centro del epítope R3 comprende la secuencia TFRKLFRVYSNFLRGKLK,
pero un ligando adicional del MHC clase II y un péptido reactivo
conocido comprende la secuencia peptídica P50 solapante
LRGKLKLYTGEACRT para dar una secuencia R3 total que comprende
TFRKLFRVYSNFLRGKLKLYT.
Las secuencias peptídicas descritas en este
documento representan la información crítica requerida para la
construcción de moléculas EPO modificadas en las cuales uno o más de
estos epítopes están alterados. Bajo el esquema de la presente
invención, los epítopes están alterados por mutación para dar como
resultado secuencias que ya no son capaces de funcionar como
epítopes de células T. Es posible usar métodos de ADN recombinante
para lograr la muta-
génesis dirigida de las secuencias objetivo; se dispone de muchas de estas técnicas y se conocen bien en la técnica.
génesis dirigida de las secuencias objetivo; se dispone de muchas de estas técnicas y se conocen bien en la técnica.
Aunque el objetivo de esta invención es
modificar las secuencias de aminoácidos de al menos uno o más de los
péptidos enumerados anteriormente en la Tabla 1, se prefiere más
modificar la secuencia de uno o más de los péptidos identificados
en la Tabla 2. En este documento se describen modificaciones
adecuadas que logran el objetivo de reducir o eliminar las
capacidades de la secuencia peptídica en cuestión para funcionar
como epítope de células T, al nivel de ser un ligando de uno o más
alotipos de MHC clase II. En la Figura 4 se proporciona uno de
estos grupos de modificaciones adecuados.
De acuerdo con esta segunda realización, las
modificaciones adecuadas de la proteína pueden incluir sustituciones
de aminoácidos de restos o combinaciones en particular. Para la
eliminación de epítopes de células T, las sustituciones de
aminoácidos se hacen preferiblemente en puntos adecuados dentro de
la secuencia peptídica predicha para conseguir una reducción o
eliminación sustancial de la actividad del epítope de células T. En
la práctica, un punto adecuado equivaldrá preferiblemente a un resto
de aminoácido que se una dentro de uno o más de los bolsillos del
interior del surco de unión del MHC clase II. Se prefiere más
alterar la unión dentro del primer bolsillo de la hendidura en la
llamada posición "P1" o "ancla P1" del péptido. Se acepta
que la calidad de la interacción de unión entre el resto del ancla
P1 del péptido y el primer bolsillo del surco de unión del MHC
clase II es un determinante importante de la afinidad total de
unión para el péptido completo. Una sustitución adecuada es esta
posición del péptido será, para un resto menos fácilmente alojado
dentro de bolsillo, por ejemplo, la sustitución por un resto más
hidrófilo. También se considera, y está dentro del alcance de la
presente invención, los restos de aminoácidos del péptido en las
posiciones que equivalen a la unión en otras regiones del bolsillo
en la hendidura de unión del MHC.
Se entiende que sustituciones de aminoácidos
individuales dentro de un posible epítope de células T determinado
son el medio más preferido para eliminar el epítope. Pueden
contemplarse combinaciones de sustituciones dentro de un único
epítope y, por ejemplo, pueden ser particularmente adecuados cuando
se solapen entre sí epítopes definidos individualmente. Además,
pueden hacerse sustituciones de aminoácidos, ya sea individualmente
dentro de un epítope determinado o en combinaciones con un único
epítope en posiciones que no equivalgan a los "restos del
bolsillo" con respecto al surco de unión del MHC clase II, sino
en cualquier punto dentro de la secuencia peptídica. Pueden hacerse
sustituciones con respecto a una estructura homóloga o método
estructural producido usando técnicas in silico conocidas en
la técnica y pueden basarse en características estructurales
conocidas de la molécula. El modelo de estructura cristalina de la
EPO del Banco de Datos de Proteínas es particularmente útil a este
respecto [PDI ID: 1CN4; Syed, R. y col. (1998) Nature
395: 511-516]. Se puede contemplar un cambio
para restablecer la estructura o actividad biológica de la molécula
variante. Tales cambios compensatorios y cambios también pueden
incluir la detección o adición de restos de aminoácidos particulares
del polipéptido.
Un medio particularmente eficaz para eliminar
epítopes de moléculas de proteína es el uso coordinado del esquema
del ensayo de activación de células T vírgenes como el descrito en
este documento junto con una herramienta in silico
desarrollada de acuerdo con el esquema descrito en la solicitud de
propiedad compartida WO 02/069232 que se incorpora en su totalidad
a este documento como referencia.
El software simula el proceso de presentación de
antígenos a nivel de interacción de unión MHC clase
II-péptido para proporcionar una puntuación de
unión para cualquier secuencia peptídica dada. Esta puntuación se
determina para muchos de los alotipos del MHC clase II
predominantes que existen en la población. Puesto que este esquema
es capaz de analizar cualquier secuencia peptídica, pueden
predecirse las consecuencias de las sustituciones, adiciones o
deleciones de aminoácidos con respecto a la capacidad de un péptido
para interaccionar con un surco de unión del MHC clase II. En
consecuencia, se pueden diseñar nuevas composiciones de secuencia
que contengan un número reducido de péptidos capaces de
interaccionar con el MHC clase II y, de esta manera, funcionar como
epítopes inmunogénicos de células T. Aunque el ensayo biológico
usando cualquier muestra de donante determinada puede evaluar la
unión a un máximo de 4 alotipos DR, el proceso in silico
puede analizar la misma secuencia peptídica usando > 40 alotipos
simultáneamente. En la práctica, esta estrategia es capaz de dirigir
el diseño de nuevas variantes de secuencia que tengan su capacidad
alterada para interaccionar con múltiples alotipos MHC.
El ensayo de células T era capaz de definir tres
regiones inmunogénicas R1-R3 dentro de la molécula y
el sistema de software, de acuerdo con el esquema del documento WO
02/069232, era capaz de identificar ligandos predichos del MHC
clase II dentro de cada uno de los epítopes. Por otra parte, el
sistema era capaz además de identificar sustituciones de
aminoácidos dentro de los epítopes que daban lugar a una pérdida
significativa de afinidad de unión entre la secuencia peptídica y
esencialmente todos los alotipos de MHC clase II representados en
el sistema.
La rotura de la región de epítopes R1 constituye
un ejemplo de este grupo de modificaciones. El grupo de
sustituciones I25A y L35A da lugar a una alteración de los
principales ligandos del MHC clase II dentro del epítope R1.
De forma similar, en el caso de ligandos del MHC
clase II identificados dentro de la región de epítopes R2, las
sustituciones V82A, Q88W, L91G, L93P y V95A son ejemplos de cambios
posibles.
En el caso de la región de epítopes R3 se
identifica una serie solapante de ligandos de MHC. Una serie de
sustituciones adecuada comprende uno o más de los cambios L141T,
F142A, V144T, Y145P, F148A, L149S y/o L153A. En todos los casos
anteriores pueden distinguirse grupos alternativos de mutaciones en
función de la capacidad de un péptido determinado para unirse
dentro del surco de unión del MHC clase II y consideraciones
estructurales en función del análisis del modelo de estructura
cristalina de la EPO [PDB ID: 1CN4; Syed, R. y col. (1998)
Nature 395: 511-516].
Cada una de las sustituciones anteriores son
ejemplos del procedimiento y son composiciones peptídicas bajo el
esquema de la presente invención. Como le resultará claro a un
experto en la materia, pueden obtenerse varios grupos alternativos
de sustituciones con los que se logre el objetivo de eliminar
epítopes no deseados. Las secuencias resultantes serían, sin
embargo, reconocidas como altamente homólogas a las composiciones
específicas descritas en este documento y, por tanto, estarían
dentro del alcance de la presente invención. La forma madura de la
proteína EPO puede contener 165 ó 166 aminoácidos debido a la
eliminación postraduccional de la arginina
C-terminal. D165 es el extremo
C-terminal de la forma de 165 aminoácidos y R166 es
el aminoácido C-terminal de la forma de 166
aminoácidos. Los análogos de la EPO descritos en este documento
pueden comprender las formas de 165 ó 166 aminoácidos de la
EPO.
La estrategia combinada de usar una herramienta
in silico para la identificación de ligandos del MHC clase
II y el diseño de análogos de secuencias que carezcan de ligandos
del MHC clase II, junto con el mapeo de epítopes y las pruebas
adicionales usando opcionalmente ensayos de activación de células T
con base biológica es un método particularmente eficaz y la
realización más preferida de la invención. El método general según
esta realización comprende las siguientes etapas:
- i)
- uso de ensayos de activación de células T vírgenes y péptidos sintéticos que abarcan en conjunto la secuencia de proteínas de interés para identificar regiones del epítope capaces de activar células T;
- ii)
- uso de un esquema informático que simule la unión del ligando peptídico con uno o más alotipos de MHC para analizar las regiones de epítopes identificadas en la etapa (i) y, de esta manera, identificar ligandos del MHC clase II dentro de la región de epítopes;
- iii)
- uso de un esquema por ordenador que simule la unión del ligando peptídico a uno o más alotipos de MHC para identificar análogos de las secuencias de los ligandos del MHC que abarcan las regiones de epítopes que ya no se unen al MHC clase II o que se unen con afinidad reducida a un número menor de alotipos de MHC y, opcionalmente
- iv)
- uso de ensayos de activación de células T vírgenes y péptidos sintéticos que abarcan completamente o en conjunto las regiones de epítopes identificadas dentro de la proteína de interés, y análisis de los análogos de secuencias en un ensayo de activación de células T vírgenes en paralelo con las secuencias de tipo salvaje (parentales).
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La expresión "epítope de células T"
significa, según lo que se entiende en esta invención, una
secuencia de aminoácidos que es capaz de unirse al MHC clase II,
capaz de estimular células T y/o también de unirse (sin necesidad
de una activación cuantificable) a células T en complejo con MHC
clase II.
El término "péptido" según se usa en este
documento y en las reivindicaciones adjuntas, es un compuesto que
incluye dos o más aminoácidos. Los aminoácidos están unidos entre sí
por un enlace peptídico (definido más adelante en este documento).
Existen 20 aminoácidos naturales diferentes implicados en la
producción biológica de péptidos y se puede unir un número
cualquiera de ellos en un orden cualquiera para formar una cadena o
anillo peptídico. Los aminoácidos naturales empleados en la
producción biológica de péptidos tienen todos la configuración L.
Pueden prepararse péptidos sintéticos empleando métodos de síntesis
convencionales, utilizando L-aminoácidos o
D-aminoácidos o diversas combinaciones de
aminoácidos de las dos configuraciones diferentes. Algunos péptidos
contienen sólo pocas unidades de aminoácidos. Los péptidos cortos,
por ejemplo, que tienen menos de diez unidades de aminoácidos, a
veces se denominan "oligopéptidos". Otros péptidos contienen
un gran número de restos de aminoácidos, por ejemplo hasta 100 ó
más, y se denominan "polipéptidos". Por convención, un
"polipéptido" se puede considerar como cualquier cadena
peptídica que contenga tres o más aminoácidos, mientras que un
"oligopéptido" se considera normalmente como un tipo particular
de polipéptido "corto". De este modo, según se usa en este
documento, se entiende que cualquier referencia a un
"polipéptido" también incluye un oligopéptido. Además,
cualquier referencia a un "péptido" incluye polipéptidos,
oligopéptidos y proteínas. Cada disposición diferente de aminoácidos
forma un polipéptido o proteína diferente. El número de
polipéptidos, y por consiguiente el número de proteínas, que pueden
formarse es prácticamente limitado.
Las moléculas EPO de esta invención se pueden
preparar en cualquiera de varias formas, pero se realiza más
preferiblemente explotando métodos habituales de recombinación. Es
un procedimiento relativamente fácil usar las secuencias de
proteínas y la información proporcionada en este documento para
deducir un polinucleótido (ADN) que codifique cualquiera de las
secuencias de proteínas preferidas. Esto puede conseguirse, por
ejemplo, usando herramientas de programas informáticos como el
paquete de software DNSstat [DNAstar Inc, Madison, WI, EE.UU.] o
similar. Cualquiera de estas secuencias de ADN con la capacidad de
codificar los polipéptidos preferidos de la presente invención u
homólogos significativos de los mismos, se deben considerar como
realizaciones de esta invención.
Como esquema general, pueden hacerse genes que
codifiquen cualquiera de las secuencias proteicas de la EPO usando
síntesis génica y clonarse en un vector de expresión adecuado. A su
vez, el vector de expresión se introduce en una célula hospedadora
y se seleccionan y cultivan las células. Las moléculas preferidas se
purifican a partir del medio de cultivo y se formulan en una
preparación para administración terapéutica. Alternativamente,
puede obtenerse una secuencia génica de la EPO de tipo salvaje, por
ejemplo, siguiendo una estrategia de clonación de ADNc usando ARN
preparado a partir de tejido hepático o renal o líneas celulares
humanas adecuadas. El gen de tipo salvaje puede usarse como molde
para la mutagénesis y construcción de las secuencias variantes
preferidas. A este respecto, es especialmente conveniente el uso de
la estrategia de "PCR de extensión por solapamiento" como la
descrita por Higuchi y col. [Higuchi y col. (1988) Nucleic Acids
Res. 16: 7351] aunque pueden aplicarse fácilmente otras
metodologías y sistemas. El ADN codificante alterado se expresa
después por medios convencionales en un sistema de células
hospedadoras seleccionado del cual se recupera y purifica la EPO
deseada. Se conocen bien en la técnica células hospedadoras, métodos
de purificación y esquemas de ensayo adecuados, e incluirían
cualquiera de los esquemas proporcionados en los documentos WO
85/02610, WO 86/03520, WO 99/03887, EP0357804 u otros ejemplos.
Cuando pueda lograrse la formación de la
molécula EPO mediante técnicas de ADN recombinante, pueden incluirse
moléculas EPO fusionadas con otros dominios de proteína, por
ejemplo, un dominio de la región constante de un anticuerpo. Los
métodos para purificar y manipular proteínas recombinantes que
incluyen proteínas de fusión se conocen bien en la técnica. Las
técnicas necesarias se explican íntegramente en la literatura, como
"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición
(Sambrook y col., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J.
Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed.,
1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.);
"Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir y C. C.
Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"
(J. M. Miller y M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in
Molecular Biology" (F. M. Ausubel y col., eds., 1987); "PCR:
The Polymerase Chain Reaction", (Mullis y col., eds., 1994);
"Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan y col., eds.,
1991).
Ya que esta invención se refiere a EPO
modificada, deben considerarse dentro del alcance de la invención
las composiciones que contienen estas proteínas EPO modificadas o
fragmentos de proteínas EPO modificadas y composiciones
relacionadas. Un ejemplo relevante a este respecto podría ser el
desarrollo de estrategias de inducción de tolerancia mediada por
péptido en las que uno o más de los péptidos descritos se administra
a un paciente con intento inmunoterapéutico. En consecuencia, las
moléculas peptídicas sintéticas, por ejemplo, una o más de las
enumeradas en la Tabla 1 o más preferiblemente secuencias que
comprenden toda o parte de cualquiera de las regiones
R1-R3 según lo definido anteriormente y mostradas en
la Tabla 2.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a ácidos nucleicos que codifican entidades de EPO
modificadas. En un aspecto más, la presente invención se refiere a
métodos para el tratamiento terapéutico de humanos usando las
proteínas EPO modificadas. En este aspecto, la EPO modificada puede
producirse como una proteína de fusión recombinante.
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\global\parskip0.900000\baselineskip
La invención se ilustrará ahora por medio de los
siguientes ejemplos experimentales. Los ejemplos hacen referencia a
las siguientes figuras:
La Figura 1 es una representación de los
ligandos del MHC clase II identificados dentro de la región de
epítopes R1. Los ligandos se identifican usando el sistema in
silico del Ejemplo 2. En este caso, el perfil de unión de 18
alotipos DR humanos se muestran en columnas. Los ligandos detectados
son 13mer y el número de resto 1 de cada 13mer se identifica
mediante un bloque coloreado. La intensidad de la interacción de
unión (alta, media o baja) para cada péptido con respecto a cada
uno de los 18 alotipos se indica de acuerdo con la clave
mostrada.
La Figura 2 es una representación de los
ligandos del MHC clase II identificados dentro de la región de
epítopes R2. Los ligandos se identifican usando el sistema in
silico del Ejemplo 2. En este caso, el perfil de unión de 18
alotipos DR humanos se muestran en columnas. Los ligandos detectados
son 13mer y el número de resto 1 de cada 13mer se identifica
mediante un bloque coloreado. La intensidad de la interacción de
unión (alta, media o baja) para cada péptido con respecto a cada
uno de los 18 alotipos se indica de acuerdo con la clave
mostrada.
La Figura 3 es una representación de los
ligandos del MHC clase II identificados dentro de la región de
epítopes R3. Los ligandos se identifican usando el sistema in
silico del Ejemplo 2. En este caso, el perfil de unión de 18
alotipos DR humanos se muestran en columnas. Los ligandos detectados
son 13mer y el número de resto 1 de cada 13mer se identifica
mediante un bloque coloreado. La intensidad de la interacción de
unión (alta, media o baja) para cada péptido con respecto a cada
uno de los 18 alotipos se indica de acuerdo con la clave
mostrada.
La Figura 4 representa una estructura de EPO más
preferida en la cual se eliminan los ligando del MHC clase II
mediante sustituciones dentro de las regiones de epítopes R1, R2 y
R3.
La interacción entre el MHC, péptido y receptor
de células T (TCR) proporciona la base estructural para la
especificidad de antígeno del reconocimiento de células T. Los
ensayos de proliferación de células T analizan la unión de los
péptidos a MHC y el reconocimiento de complejos MHC/péptido por el
TCR. Los ensayos de proliferación de células T in vitro del
presente ejemplo suponen la estimulación de células mononucleares de
sangre periférica (PBMC) que contienen células presentadoras de
antígeno (APC) y células T. La estimulación se realiza in
vitro usando antígenos de péptidos sintéticos y, en algunos
experimentos, antígenos de proteínas completas. La proliferación de
células T estimuladas se mide usando
^{3}H-timidina (^{3}H-T) y la
presencia de ^{3}H-T incorporada se establece
mediante el recuento de centelleo de las células fijadas
lavadas.
Se obtuvieron las capas leucocíticas de sangre
humana conservada durante menos de 12 horas en el Servicio Nacional
de Sangre (Addenbrooks Hospital, Cambridge, Reino Unido). El
Ficoll-paque se obtuvo de Amersham Pharmacia
Biotech (Amersham, Reino Unido). El medio AIM V sin suero para el
cultivo de linfocitos humanos primarios y que contenía
L-glutamina, 50 \mug/ml de estreptomicina, 10
\mug/ml de gentamicina y 0,1% de albúmina sérica humana era de
Gibco-BRL (Paisley, Reino Unido). Los péptidos
sintéticos se obtuvieron de Pepscan (Países Bajos) y de Babraham
Technix (Cambridge, Reino Unido).
Los eritrocitos y leucocitos se separaron del
plasma y plaquetas mediante la centrifugación suave de las capas
leucocíticas. Se eliminó y descartó la fase superior (que contenía
plasma y plaquetas). Los eritrocitos y leucocitos se diluyeron 1:1
en solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de depositarlos
sobre 15 ml de Ficoll-paque (Amersham Pharmacia,
Amersham, Reino Unido). La centrifugación se hizo de acuerdo con las
condiciones recomendadas por el fabricante y se recogieron las PBMC
de la interfase suero+PBS/Ficoll-paque. Las PBMC se
mezclaron con PBS (1:1) y se recogieron mediante centrifugación. Se
retiró y descartó el sobrenadante y el sedimento de PBMC se
resuspendió en 50 ml de PBS. Las células se sedimentaron de nuevo
mediante centrifugación y se descartó el sobrenadante de PBS. Se
resuspendieron usando 50 ml de medio AIM V y en este punto se hizo
un recuento de células y se evaluó la viabilidad mediante exclusión
con colorante azul tripán. Las células se recogieron de nuevo
mediante centrifugación y se descartó el sobrenadante de PBS. Se
resuspendieron para su conservación criogénica a una densidad de 3
x 10^{7} por ml.
El medio de conservación consistía en el 90%
(v/v) de suero AB humano inactivado por calor (Sigma, Poole, Reino
Unido) y el 10% (v/v) de DMSO (Sigma, Poole, Reino Unidos). Las
células se transfirieron a un recipiente de congelación regulado
(Sigma) y se pusieron a -70ºC durante la noche antes de
transferirlas a N_{2} líquido para su conservación a largo plazo.
Cuando se necesitaron las células se descongelaron rápidamente en un
baño de agua a 37ºC antes de transferirlas a 10 ml de medio AIM V
precalentado.
Las PBMC se estimularon con antígenos proteicos
y peptídicos en una placa de fondo plano de 96 pocillos a una
densidad de 2 x 10^{5} PBMC por pocillo. Las PBMC se incubaron
durante 7 días a 37ºC antes de pulsarlas con
^{3}H-T (Amersham-Pharmacia,
Amersham, Reino Unido). Para el presente estudio, se generaron
péptidos sintéticos (15 mer) que solapaban con cada uno de los
péptidos sucesivos en 12 aminoácidos para abarcar la secuencia
completa de la EPO. Los números de identificación (Nº ID) del
péptido y las secuencias se proporcionan en la Tabla 3.
Cada péptido fue analizado individualmente
frente a PBMC aisladas de 20 donantes vírgenes. En cada ensayo de
donante se usaron dos péptidos control que previamente habían
mostrado ser inmunogénicos y un potente antígeno no de recuerdo
KLH.
Los antígenos control usados en este estudio
fueron el péptido 307-319 de hemaglutinina del virus
de la gripe (secuencia: PKYVKQNTLKLAT), el péptido HSP 60 de
Chlamydia (secuencia: KVVDQIKKISKPVQH) y hemocianina de lapa
bocallave.
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Los péptidos se disolvieron en DMSO a una
concentración final de 10 mM; estas soluciones madre se diluyeron
después 1/500 en medio AIM V (concentración final, 20 \muM). Se
añadieron los péptidos a una placa de 96 pocillos de fondo plano
para dar una concentración final de 2 y 20 \muM en 100 \mul. La
viabilidad de las PBMC descongeladas se determinó mediante
exclusión con colorante azul tripán; a continuación, las células se
resuspendieron a una densidad de 2 x 10^{6} células/ml y se
transfirieron 100 \mul (2 x 10^{5} PBMC/pocillo) a cada pocillo
que contenía péptidos. Se analizaron los cultivos de pocillos por
triplicado a cada concentración de péptido. Las placas se incubaron
durante 7 días en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2} a
37ºC. Se dio un pulso a las células durante 18-21
horas con 1 \muCi de ^{3}H-T/pocillo antes de
recogerlas en filtros. Se determinaron las CPM (cuentas por minuto)
usando un contador beta Wallac de placa superior en placas de
microtitulación (Perkin Elmer). Los resultados se expresaron como
índices de estimulación, donde el índice de estimulación (IE) se
obtiene mediante la división de la puntuación de proliferación (por
ejemplo, cuentas por minuto de radioactividad) medida para el
péptido de prueba entre la puntuación media en células que no han
estado en contacto con un péptido de prueba.
El mapeo de epítopes de células T en la
secuencia de la EPO usando el ensayo de proliferación de células T
dio como resultado la identificación de tres regiones inmunogénicas
R1, R2 y R3. Los péptidos capaces de estimular una respuesta
significativa en al menos una muestra de PBMC de donantes se
enumeran en la Tabla 1. Los péptidos capaces de estimular una
respuesta significativa en dos o más muestras de PBMC de donantes se
enumeran en la Tabla 2. La restricción alotípica de los donantes
sensibles a péptidos de la EPO se proporciona en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se usó el método de la solicitud de patente de
propiedad compartida WO 02/069232 para un análisis de las regiones
de epítopes R1, R2 y R3. El sistema permite la predicción de los
ligandos de MHC particulares contenidos en las regiones de epítopes
detectadas biológicamente y proporciona una "puntuación" con
respecto a la capacidad de un ligando determinado del MHC clase II
para interaccionar con un alotipo MHC en particular.
El patrón de restricción alotípica para los
ligandos del MHC puede ilustrarse usando las representaciones
gráficas de restricción alotípica como las proporcionadas para cada
una de las regiones de epítopes R1-R3 en las
Figuras 1-3 adjuntas.
El análisis se extendió para la consideración de
modificaciones de secuencia dentro de cada uno de los epítopes
R1-R3. Se analizaron la capacidad continua de unirse
al MHC clase II de las variantes de secuencia y sus puntuaciones de
unión cuando esta capacidad se mantenía. Se definieron múltiples
sustituciones de aminoácidos que lograron la eliminación de la
unión del MHC clase II con la mayoría de los alotipos MHC probados.
Se analizó más en profundidad la capacidad de las sustituciones
particulares identificadas para acoplarse en el modelo estructural
de la molécula EPO [PDB ID: 1CN4; Syed, R. y col. (1998)
Nature 395: 511-516]. Se comprobaron
las mutaciones diseñadas en los restos seleccionados de la
secuencia de tipo salvaje para verificar impedimentos estéricos, la
formación de enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas y su
acoplamiento general en la estructura. Las sustituciones que dieron
origen a impedimentos estéricos fueron eliminadas. Las sustituciones
que se acoplaban cuando la cadena lateral adoptaba una
configuración similar (rotámero) a la del resto original se
consideraron aceptables. Si más de una sustitución cumplía estos
criterios, se preferían los restos que potencialmente formaban
enlaces de hidrógeno con cadenas laterales o átomos del esqueleto
adyacentes, o que formaban contactos hidrófobos favorables u otras
asociaciones. El procedimiento anterior se realizó de forma
interactiva usando Swiss Prot Deep View v3.7 [Guex, N. y Peitsch,
M.C. (1997) Electrophoresis 18:
2714-2723]. Este procedimiento dio como resultado
un grupo preferido de sustituciones para cada una de las regiones de
epítopes R1-R3. Se reunieron los grupos de
sustituciones para producir la estructura representada en la Figura
4. Se confirmó que todas las sustituciones originaban la
eliminación de ligandos de MHC clase II dentro de cada una de las
regiones de epítopes R1-R3.
La estructura de la EPO de la presente invención
contiene el grupo de sustituciones según se ilustra a continuación
y en la Figura 4.
\vskip1.000000\baselineskip
- APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENX^{1}TTGCAEHCSX^{2}NENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEV WQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPX^{3}EPX^{4}QX^{5}HX^{6}DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAAS AAPLRTITADTFRKX^{7}X^{8}RX^{9}X^{10}SNX^{11}X^{12}RGKX^{13}KLYTGEACRTGDR
\vskip1.000000\baselineskip
donde
X^{1} = A, pero también se considera G o
P;
X^{2} = A, pero también se consideran D, E, G,
H, K, N, P, Q, R, S y T;
X^{3} = T, pero también se consideran A y
G;
X^{4} = A pero también se consideran P, D, E,
G, H, K, N, P, Q, R, S y T;
X^{5} = A pero también se consideran P, D, E,
G, H, K, N, P, Q, R, S y T;
X^{6} = A pero también se consideran P, D, E,
G, H, K, N, P, Q, R, S y T;
X^{7} = T;
X^{8} = A, pero también se consideran P y
G;
X^{9} = T;
X^{10} = A, pero también se consideran A y
G;
X^{11} = A, pero también se consideran P y
G;
X^{12} = S, pero también se consideran A, D,
E, G, H, K, N, P, Q, R y T;
X^{13} = A, pero también se consideran D, E,
G, H, K, N, P, Q, R, S y T;
\vskip1.000000\baselineskip
Como realización preferida se proporciona una
molécula EPO modificada, donde
X^{1} = A, X^{2} = A, X^{3} = T, X^{4} =
A, X^{5} = A, X^{6} = A, X^{7} = T, X^{8} = A, X^{9} = T;
X^{10} = P, X^{11} = A, X^{12} = S y X^{13} = A, según la
invención.
Claims (4)
1. Una molécula modificada que tiene la
actividad biológica de la eritropoyetina (EPO) humana y que es
sustancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que cualquier
molécula sin modificar con la misma actividad biológica en un
individuo cuando se usa in vivo, en la que dicha pérdida de
inmunogenicidad se consigue eliminando uno o más epítopes de
células T procedentes de la molécula originalmente sin modificar,
siendo dichos epítopes de células T ligandos del MHC clase II o
secuencias peptídicas que muestras la capacidad de estimular o
unirse a células T por medio de su presentación en clase II;
dicha molécula modificada tiene la secuencia de
aminoácidos:
\vskip1.000000\baselineskip
- APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENX^{1}TTGCAEHCSX^{2}NENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEV WQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPX^{3}EPX^{4}QX^{5}HX^{6}DKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAAS AAPLRTITADTFRKX^{7}X^{8}RX^{9}X^{10}SNX^{11}X^{12}RGKX^{13}KLYTGEACRTGDR
\vskip1.000000\baselineskip
donde
X^{1} = A, G, P;
X^{2} = A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y
T;
X^{3} = T, A y G;
X^{4} = A, P, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y
T;
X^{5} = A, P, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y
T;
X^{6} = A, P, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y
T;
X^{7} = T;
X^{8} = A, P y G;
X^{9} = T;
X^{10} = P, A y G;
X^{11} = A, P y G;
X^{12} = S, A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R y
T;
X^{13} = A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y
T;
y
cuando se analiza como una proteína completa en
un ensayo biológico de proliferación de células T, muestra un
índice de estimulación (IE) menor de 2,0 y menor que el de la
molécula parental sin modificar.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Una molécula EPO modificada de la
reivindicación 1, en la que
X^{1} = A, X^{2} = A, X^{3} = T, X^{4} =
A, X^{5} = A, X^{6} = A, X^{7} = T, X^{8} = A, X^{9} = T;
X^{10} = P, X^{11} = A, X^{12} = S y X^{13} = A.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Una molécula de ADN que codifica una proteína
EPO modificada como se especifica en cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2.
4. Una composición farmacéutica que comprende
una molécula EPO como se especifica en cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2 junto con un vehículo, diluyente o
excipiente farmacéuticamente aceptable.
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