MXPA05001452A - Epitopes de celulas en eritropoyetina. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a la identificacion de epitopes para celulas T en EPO humana asi como a peptidos de epitopes de celulas T derivados de EPO por medio de los cuales es posible crear nuevas variantes de EPO modificadas con inmunogenicidad reducida.

Description

EPITOPES DE CELULAS T EN ERITROPOYETINA Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de inmunología. La invención identifica determinantes en eritropoyetina humana (EPO) capaces de evocar una respuesta inmune. En particular, la invención está relacionada con la identificación de epítopes para células T en EPO humana. La invención se refiere además a péptidos de epítopes de células T derivadas de EPO por medio de los cuales es posible crear variantes de EPO modificadas con inmunogenicidad reducida. Antecedentes de la invención Existen muchos casos en los que la eficacia de una proteína terapéutica está limitada por una reacción inmune no deseada a la proteína terapéutica. Varios anticuerpos monoclonales de ratón han mostrado ser promisorios como terapias en un número de escenarios de enfermedad humana, pero en ciertos casos han fallado debido a la inducción de grados significativos de una respuesta a anticuerpo anti-murino humano (HAMA) [Schroff, R. W. et al (1985) Cáncer Res. 45: 879-885; Sha ler, D.L. et al (1985) J. Xmmunol . 135 ¦¦ 1530-1535] . Para anticuerpos monoclonales, se ha desarrollado un número de técnicas en un intento por reducir la respuesta a HAMA [WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; O 91/06667] . Estos enfoques de ADN recombinante generalmente REP-: 160925 han reducido la información genética de ratón en la construcción de anticuerpo final incrementando al mismo tiempo la información genética humana en la construcción final. No obstante, los anticuerpos "humanizados" resultantes han, en muchos casos, desarrollado aún una respuesta inmune en pacientes. [Issacs J. D. (1990) Sem. Immunol . 2: 449, 456; Rebello, P. R. et al (1999) Transplantation Gñ_: 1417-1420] . Los anticuerpos no son la única clase de moléculas de polipéptidos administradas como un agente terapéutico contra las cuales pueda establecerse una respuesta inmune. Incluso las proteínas de origen humano y con las mismas secuencias de aminoácidos que las que ocurren en los humanos pueden inducir aún una respuesta inmune en humanos. Ejemplos notables entre otros incluyen el uso terapéutico del factor estimulador de colonia de granulocitos-macrófagos [Wadhwa, . et al (1999) Clin. Cáncer Res . 5:1353-1361] e interferón alfa 2 [Russo, D. et al (1996) Bri . J. Haew. 94:300-305; Stein, R. et al (1988) New Engl . J. Med. 318: 1409-1413]. En situaciones en las que estas proteínas humanas son inmunogénicas, existe una presunta alteración o ruptura de la tolerancia inmunológica a estas proteínas que de otra manera hubiera estado operando en estos sujetos. Un reciente ejemplo prominente de este problema se observa con el uso terapéutico de eritropoyetina humana recombinante (EPO) . Este es un factor de crecimiento de gl icoprotelnas crítico toda vez que promueve la formación de glóbulos rojos in vivo. La proteína se usa terapéuticamente en el tratamiento de pacientes anémicos sujetos a diálisis y en otros pacientes para quienes la anemia es un problema. La proteína ha probado ser segura y efectiva en el manejo de la anemia para la gran mayoría de los pacientes. Sin embargo, en 1997 Prabhakar y Muhlfeider [Prabhakar, S. & Muhlfeider, T. Clin. Nephrol. 47: 331-335] describieron un solo caso de aplasia de glóbulos rojos puros que enfrentaba altas concentraciones de anticuerpos anti-EPO. Posteriormente se han reportado muchos otros casos de aplasia de glóbulos rojos puros ligados con el desarrollo de anticuerpos para la EPO recombinante. Se ha concluido que los anticuerpos inducidos tienen una reacción cruzada con la proteína endógena que lleva a un bloqueo completo de la diferenciación de los glóbulos rojos (véase Indiveri F. & Murdaca, G para revisión; Rev. Clin. Exp. Hematol. (2002) Supl. 1: 7-11) . Los pacientes sobreviven sólo por medio de transfusiones sanguíneas frecuentes y aunque los niveles de anticuerpos disminuyen cuando el tratamiento se detiene alrededor de la mitad de los pacientes afectados siguen dependiendo de transfusiones. Una respuesta de anticuerpos prolongada a una proteína terapéutica tal como EPO requiere la estimulación de la proliferación y activación de células T auxiliares. La estimulación de células T requiere del establecimiento de una sinapsis de células T entre una célula T y una célula presentadora de antígeno (APC, por sus siglas en inglés) . En el núcleo de la sinapsis está el receptor de células T (TCR, por sus siglas en inglés) sobre la célula T acoplada con un complejo HC clase II de péptidos sobre la superficie de la APC. El péptido se deriva del procesamiento intracelular de la proteína antigénica. Las secuencias de péptidos de antígenos de proteínas que pueden estimular la actividad de células T por medio de su presentación sobre moléculas MHC clase II son los llamados "epítopes de células T" . Estos epítopes de células T son comúnmente definidos como cualquier secuencia de residuos de aminoácidos con la capacidad de unirse a moléculas MHC clase II. En forma implícita, un "epítope de células T" significa un epítope que cuando se une a moléculas MHC puede ser reconocido por un TCR, y el cual puede, por lo menos en principio, causar la activación de estas células T al acoplarse a un TCR para promover una respuesta a células T. Se entiende que para muchas proteínas un pequeño número de epítopes de células T auxiliares puede conducir la señalización de células T auxiliares para dar como resultado respuestas de anticuerpos prolongadas, de alta afinidad y de clase cambiada, para las cuales podría haber un repertorio muy grande de determinantes de superficie expuestos sobre la proteína terapéutica.

La identificación de epítopes de células T se reconoce como la primera etapa para la eliminación de epítopes, y es altamente deseada para identificar epítopes de células T en proteínas terapéuticas tales como EPO. Las solicitudes de patente W098/52976 y O00/34317 muestran enfoques de enhebrado computaciones para identificar secuencias de polipéptidos con el potencial de unirse a un subconjunto de alotipos DR MHC clase II humanos. En estas enseñanzas, epítopes de células T predichos son removidos mediante el uso de una sustitución de aminoácidos juiciosa con la proteína de interés. Sin embargo, con este esquema y otros procedimientos a base de computadoras para la identificación de epítopes [Godkin, A. J. et al (1998) J. Immunol. 161:850-858; Sturniolo, T. Et al (1999) Wat. Biotechnol. 3/7:555-561], los péptidos predichos como capaces de unirse a moléculas MHC clase II podrían no funcionar como epítopes de células T en todas las situaciones, particularmente in vivo, debido a las vías de procesamiento u otros fenómenos. Además, los enfoques computacionales para la predicción de epítopes de células T en general no han sido capaces de producir epítopes con restricción DP o DQ. Igualmente, los métodos in vitro para medir la capacidad de péptidos sintéticos para unirse a moléculas MHC clase II, por ejemplo usando líneas de células B de alotipo MHC definido como una fuente de superficie de unión MHC clase II [Marshall K. W. et al. (1994) J. Immunol . 152 :4946-4956; O'Sullivan et al (1990) J. Immunol . 145: 1799-1808; Robadey C. et al (1997) J. Imniunol 159 : 3238-3246], se pueden aplicar a la identificación de ligandos MHC clase II. Sin embargo, estas técnicas no están adaptadas para dirigir varios epítopes potenciales a una amplia diversidad de alotipos MHC, ni pueden confirmar la capacidad de un péptido de unión para funcionar como un epítope de células T. Recientemente han entrado en uso técnicas que explotan complejos solubles de moléculas MHC recombinantes en combinación con péptidos sintéticos [Kern, F. et al (1998) Wature Medicine 4:975-978; Kwok, W.W. et al (2001) TRENDS in Inmuno1. 22: 583-588] . Estos reactivos y procedimientos se usan para identificar la presencia de clones de células T a partir de muestras de sangre periférica de sujetos humanos o animales experimentales que son capaces de unirse a complejos MHC-péptido particulares y que no están adaptados para la dirección de varios epítopes potenciales a una amplia diversidad de alotipos MHC. Los ensayos biológicos de la activación de células T permanecen como la mejor opción práctica para proporcionar una lectura de la capacidad de una secuencia de péptidos/proteínas de prueba para evocar una respuesta inmune. Ejemplos de este tipo de enfoque incluyen el trabajo de Petra et al usando ensayos de proliferación de células T para la proteína bacteriana estafilocinasa, seguidos por el mapeo de epítopes usando péptidos sintéticos para estimular líneas de células T [Petra, A. M. et al (202) J. Immunol . 168 : 155-161] . Similarmente , los ensayos de proliferación de células T usando péptidos sintéticos de la proteína de toxina del tétanos han dado como resultado la definición de regiones de epítopes inmunodominantes de la toxina [Reece J. C. Et al (1993) J. Immunol. 151: 6175-6184]. O99/53038 describe un enfoque en el cual epítopes de células T en una proteína de prueba pueden determinarse usando subconj untos aislados de células inmunes humanas, promoviendo su diferenciación in vitro y el cultivo de las células en presencia de péptidos de interés sintéticos y la medición de cualquier proliferación inducida en las células T cultivadas. La misma técnica se describe también por Stickler et al [Stickler, M. M. et al (2000) J. Immunotherapy 23_: 654-660] , en donde en ambos casos el método se aplica a la detección de epítopes de células T dentro de subtilisina bacteriana. Esta técnica requiere de la aplicación cuidadosa de técnicas de aislamiento de células y cultivo de células con varios suplementos de citocinas para obtener los subconjuntos de células inmunes deseados (células dendríticas, células T CD4+ y/o CD8+) . En una variación de estos enfoques, Hiemstra et al [Hiemstra, H. S. (1997) Proc. Nati. ñcad. Sci USA 94: 10313-10318] han descrito un procedimiento para identificar un epítope de péptido capaz de estimular una célula T conocida, este procedimiento es valioso en la detección de clones de células T autorreactivos para los cuales se desconozca el (auto) antígeno.

Abundan los ejemplos anteriores y otros ensayos biológicos que incluyen variaciones técnicas en el tema de medir un evento de activación de células T in vitro, usualmente por la medición de una respuesta de proliferación inducida. Sin embargo, ninguno de los procedimientos proporciona un esquema unificado para la detección de epítopes biológicamente relevantes en proteínas de origen humano ni son fácilmente replicables para la detección de epítopes significativos para una amplia población de alotipos MHC. La presente invención proporciona un esquema para la identificación de epítopes de células T en EPO humana y análogos de EPO en los cuales los epítopes de células T están comprometidos en su capacidad para interactuar con moléculas MHC clase II humanas. Los ligandos MHC clase II potenciales dentro de la secuencia de EPO humana han sido descritos anteriormente por los presentes inventores en WO 02/062843. En contraste con la presente invención, el conjunto de datos de posibles ligandos MHC clase II descritos en WO 02/062843 se deriva usando medios computacionales únicamente, es muy grande y representa el universo de ligandos MHC posibles. Por razones tales como el requerimiento de un procesamiento proteolítico de la proteína EPO completa y otras etapas fisiológicas que lleven a la presentación de péptidos EPO in vivo, es claro que sólo un subconjunto menor del repertorio completo de péptidos tendrá una relevancia biológica final y la presente invención en forma del mapa de epítopes de células T de EPO, se concibe como la solución para este problema en la técnica.

Como se indicó anteriormente, EPO recombinante se usa como un tratamiento efectivo de anemia que resulta de insuficiencia renal crónica. EPO es una hormona de glicoproteína implicada en la maduración de células progenitoras eritroides en eritrocitos. La EPO que ocurre naturalmente se produce por el hígado durante la vida fetal y por el riñon de los adultos. La hormona circula en la sangre para estimular la producción de glóbulos rojos en la médula ósea. La anemia es casi invariablemente una consecuencia de la insuficiencia renal debido a una producción reducida de EPO por el riñon. La producción de EPO usando técnicas de ADN recombinantes ha sido descrita anteriormente [Jacobs et al «ature, 313:806-810; Lin, F.- . et al (1985) Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 2:7580-7585] y cantidades terapéuticas pueden producirse por ejemplo de acuerdo con los procedimientos descritos en la publicación de PCT WO 85/02610 de Kirin-Amgen y otros ejemplos. La secuencia de aminoácidos madura de EPO humana contiene 165 residuos de aminoácidos, e ilustrada en código de una sola letra comprende la siguiente secuencia: APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAV EVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPP DAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR La EPO humana recombinante (expresada en células de mamífero) contiene tres cadenas de oligosacáridos N-enlazadas y una O-enlazada que contienen cada una residuos de ácido siálico terminales. Estas últimas son significativas para hacer posible que la EPO evada una rápida eliminación de la circulación por la proteína de unión a asialoglicoproteínas hepáticas. Se han llevado a cabo varios estudios en los cuales la modificación mutacional de la proteína ha sido aplicada para obtener un entendimiento de la estructura y función de la molécula. Por ejemplo, estudios por Yamaguchi [Yamaguchi, K. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266 20434-20439], Delorme [Delorme, E. et al. (1991) Biochemistry 31:9871-9876] y por Bill [Bill, R. Et al (1995) Biochim. Biophys . Acta .1261 : 35-43] se han enfocado en los sitios de glicosilación N-enlazados y O-enlazados dentro de la proteína al hacer sustituciones en N24, N38, N83 y S126. Este trabajo ha indicado que alguna glicosilación N-enlazada se requiere para la actividad de EPO, los azúcares N-enlazados en particular incrementan el peso molecular aparente de EPO y prolongan su vida media circulante. En el caso de Bill et al, la sustitución fue de cisteína por N24, 238 y N83 dando como resultado una actividad funcional ampliamente reducida.

La sustitución con cisteína también se describe por WO99/03887 en donde el propósito es el de proporcionar variantes de EPO con cisteína agregada y su uso para preparar conjugados usando PEGs reactivas con cisteína y otras porciones reactivas con cisteína. La solicitud muestra que ciertos aminoácidos en EPO son no esenciales para la actividad biológica y pueden ser mutados a residuos de cisteína sin alterar el patrón de unión por disulfuro normal y la conformación completa de la molécula. Las sustituciones ejemplares contempladas en O 99/03887 incluyen: S126C, N24C, I25C, T26C, N38C, I39C, T40C, N83C, S84C, A1C, P2C, P3C, R4C, D8C, S9C, T27C, G28C, A30C, E31C, H32C, S34C, N36C, D43C, T44C, K45C, N47C, A50C, K52C, E55C, G57C, Q58C, G77C, Q78C, A79C, Q86C, W88C, E89C, T107C, R110C, A111C, G113C, A114C, Q115C, 116C, E117C, A118, S120C, P121C, P122C, D123C, A124C, A125C, A127C, A128C, T132C, K154C, T157C, G158C, E159C, A160C, T163C, G164C, D165C, R166C y S85C. La presente invención describe análogos de EPO que incorporan sustituciones en una o más de las posiciones anteriores identificadas para la incorporación de cisteína libre. Sin embargo, la presente invención se aleja específicamente de cualquiera de las sustituciones contempladas presentadas arriba y no se enfoca en absoluto en la incorporación de residuos de cisteína libres adecuados para la derivación con porciones de PEG. La patente de E.U.A. 4,703,008 proporciona variantes de EPO que ocurren naturalmente, así como sustituciones de aminoácido que están presentes en proteínas EPO de mamíferos. EP0357804 proporciona composiciones de EPO que comprenden sustitución de M54. La sustitución que se prefiere es M54L y otra modalidad preferida especifica la sustitución en N38. La sustitución M54L se considera que hace a la composición de EPO menos susceptible a oxidación y reduce al mínimo la incorporación errónea de norleucina durante la biosíntesis. Otros también han proporcionado moléculas EPO modificadas, ejemplos incluyen US 5,856,298 y US 5,955,422, pero se entiende que estos enfoques y otros ejemplos están dirigidos hacia mejoras en la producción comercial de EPO y enfoques hacia influenciar el estado de glicosilación de la proteína como una molécula recombinante . Ninguna de estas enseñanzas reconoce la importancia de los epítopes de células T para las propiedades inmunogénicas de la proteína ni se han concebido para influenciar directamente las propiedades de una manera específica y controlada de acuerdo con el esquema de la presente invención.

La colocación o localización de epítopes de células T dentro de una secuencia de proteínas lineal se refiere en la presente como un "mapa de epítopes". Un objetivo de la presente invención es proporcionar un mapa de epítopes para EPO humana . Un objetivo más de la invención es proporcionar análogos de EPO en los cuales los epítopes de células T mapeados anteriormente sean comprometidos en su capacidad para funcionar como ligandos HC clase II y/o para activar células T en combinación con moléculas MHC clase II. Es altamente deseable proporcionar EPO con potencial reducido o ausente para inducir una respuesta inmune en el sujeto humano y es por lo tanto un objetivo particular de la presente invención proporcionar proteínas EPO modificadas en las cuales la característica inmune sea modificada por medio de números reducidos de epítopes de células T potenciales. En resumen, la invención se refiere a los siguientes aspectos: • usar un panel de péptidos sintéticos en un ensayo de células T inmaduras para mapear las regiones inmunogénícas de EPO humana ; • construcción de un mapa de epítopes de células T de proteína EPO usando PBMC aisladas de 20 o más donadores saludables y un método de análisis que incluye las etapas que comprenden : i) estimulación de antígenos in vi t o usando inmunógenos de péptido sintéticos en dos o más concentraciones de péptidos durante un periodo de cultivo de hasta siete días; usando preparaciones de PBMC que contienen relaciones fisiológicas de células T a células presentadoras de antígenos y ii) medición del índice de proliferación inducido mediante cualquier método adecuado; • secuencias de péptidos derivadas de EPO capaces de evocar un índice de estimulación de más de 1.8 y de preferencia más de 2.0 en un ensayo de células T inmaudras; • secuencias de péptidos derivadas de EPO que tienen un índice de estimulación de más de 1.8 y de preferencia más de 2.0 en un ensayo de células T inmaduras en donde el péptido se modifica hasta un grado mínimo y se prueba en el ensayo de células inmaduras y se encuentra que tiene un índice de estimulación de menos de 2.0; • secuencias de péptidos derivadas de EPO que comparten 100% de identidad de aminoácidos con la secuencia de proteínas tipo silvestre y capaces de evocar un índice de estimulación de 1.8 o mayor, y de preferencia mayor que 2.0 en un ensayo de células T; • una secuencia de péptidos EPO especificada en consecuencia y modificada para que contenga menos de 100% de identidad de aminoácidos con la secuencia de proteínas tipo silvestre y que evoque un índice de estimulación de menos de 2.0 cuando se pruebe en un ensayo de células T; • una molécula de EPO que contiene una secuencia de péptidos modificada la cual cuando se prueba individualmente evoca un índice de estimulación de menos de 2.0 en un ensayo de células T; • una molécula de EPO que contiene modificaciones de tal manera que cuando se pruebe en un ensayo de células T evoque un índice de estimulación reducido en comparación con una molécula de proteína no modificada. • una molécula de EPO en la cual las regiones inmunogénicas hayan sido mapeadas usando un ensayo de células T y luego modificadas de tal manera que después de una prueba adicional en un ensayo de células T la proteína modificada evoque un índice de estimulación menor que el de la molécula progenitora (no modificada) y muy preferiblemente menor que 2.0 o incluso menos que 1.8; · una molécula modificada que tenga la actividad biológica de EPO y que sea sustancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que cualquier otra molécula no modificada que tenga la misma actividad biológica cuando se use in vivo; • una molécula especificada en consecuencia en la que la alteración se lleve a cabo en uno o más residuos de la hebra de residuos contiguos definida en la presente como regiones de epítopes y que comprenda una de las secuencias : a) RVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVP, b) RGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTL, o c) RTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRT • una molécula especificada en consecuencia en la que la alteración se lleva a cabo en uno o más residuos de la hebra de residuos contiguos definida en la presente como región de epítope Rl y que comprende la secuencia AKEAENITTGCAEHCSLNENI ; • una molécula especificada en consecuencia en la que la alteración se lleva a cabo en uno o más residuos de la hebra de residuos contiguos definida en la presente como región de epítope R2 y que comprende la secuencia RGQALLVNSSQPWEPLQLHVD ; • una molécula especificada en consecuencia en la que la alteración se lleva a cabo en uno o más residuos de la hebra de residuos contiguos definida en la presente como la región de epítope R3 y que comprende la secuencia TFRKLFRVYSNFLRGKLKLYT; • una molécula de péptido que comprende 13-15 residuos consecutivos de cualquiera de las secuencias R1-R3; • una molécula de péptido que comprende 13-15 residuos consecutivos de cualquiera de las secuencias identificadas en la tabla 1 en la presente; • una molécula de péptido anterior que comparte más de 80% de identidad de aminoácido con cualquiera de las secuencias de péptidos derivadas de las regiones de epítope R1-R3; • una molécula de péptido anterior que comparte más de 80% de identidad de aminoácido con cualquiera de las secuencias de péptidos derivadas de las secuencias de péptidos identificadas en la tabla 1 en la presente; • secuencias de péptidos como las anteriores que son capaces de unirse a MHC clase II; • una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los péptidos o péptidos modificados anteriores que tienen la actividad de unirse a MHC clase II • una secuencia o molécula de ADN que codifica para cualquiera de las moléculas modificadas especificadas como las definidas arriba y abajo; • una composición farmacéutica que comprende una molécula modificada que tiene la actividad biológica de EPO; • una composición farmacéutica como la definida arriba y/o en las reivindicaciones, opcionalmente junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable; • un método para fabricar una molécula modificada que tiene la actividad biológica de EPO, que comprende las siguientes etapas: i) determinar la secuencia de aminoácidos del polipéptido o parte de la misma; ii) identificar uno o más epítopes de células T potenciales dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína mediante cualquier método que incluye la determinación de la unión de los péptidos a moléculas MHC usando técnicas o ensayos biológicos ín vitro o in silico; iii) diseñar nuevas variantes de secuencia con uno o más aminoácidos dentro de los epítopes de células T potenciales identificados modificados de tal manera que reduzcan o eliminen sustancialmente la actividad del epítope de células T como se determina por la unión de los péptidos a moléculas MHC usando técnicas o ensayos biológicos in vi tro o in silico; iv) construir estas variantes de secuencia mediante técnicas de ADN recombinante y probar estas variantes para identificar así una o más variantes con propiedades deseables; y v) repetir opcionalmente las etapas ii)-iv); • un método especificado en consecuencia, en el que la etapa iii) se lleva a cabo mediante sustitución, adición o supresión de 1-9 residuos de aminoácido en cualquiera de los epítopes de células T presentes originalmente; • un método especificado en consecuencia, en el que la alteración se hace con referencia a una secuencia de proteínas homologa y/o técnicas de modelado in silico; • una secuencia de péptidos que consiste en por lo menos nueve residuos de aminoácido consecutivos de un péptido de epítope de células T como el especificado arriba y su uso para la fabricación de EPO que tenga sustancialmente ninguna o menos inmunogenicidad que cualquier molécula no modificada y que tenga la actividad biológica de EPO cuando se use in vivo; • un método concertado para mapear la localización de epítopes de células T en EPO usando ensayos de activación de células T inmaduras y un esquema computacional que simule la unión de ligando de péptido con uno o más alotipos MHC; • un método para localizar epítopes de células T en EPO que comprende las siguientes etapas; i) uso de ensayos de activación de células T inmaduras y péptidos sintéticos que abarquen colectivamente la secuencias de proteínas de interés para identificar las regiones de epítopes capaces de activar células T; ii) uso de un esquema computacional que simule la unión del ligando de péptido con uno o más alotipos HC para analizar las regiones de epítopes identificadas en la etapa i) y de esta manera identificar ligandos MHC clase II dentro de la región de epítope; iii) uso de un esquema computacional que simule la unión del ligando de péptido con uno o más alotipos MHC para identificar análogos de secuencia de los ligandos MHC abarcados dentro de las regiones de epítope que ya no se unan a MHC clase II o que se unan con afinidad reducida a un número menor de alotipos MHC; iv) uso de ensayos de activación de células T inmaduras y péptidos sintéticos que abarquen completamente o que en colección abarquen las regiones de epítope identificadas dentro de la proteína de interés y prueba de los análogos de secuencia en el ensayo de activación de células T inmaduras en paralelo con secuencias (progenitores) tipo silvestre; • un método de acuerdo con el esquema anterior, en el que las etapas ii) e iii) se llevan a cabo usando un enfoque computacional como el mostrado por WO 02/069232; • un método de acuerdo con el esquema anterior, en el que la etapa iv) se lleva a cabo opcionalmente ; • un método de acuerdo con el esquema anterior, en el que el ensayo dé activación de células T inmaduras se lleva a cabo usando células PBMC derivadas de alrededor de 20 o más donadores no emparentados; • un método de acuerdo con el esquema anterior, en el que la localización de un epítope de células T se encuentra cuando una puntuación de índice de estimulación de alrededor de 2.0 se observa en dos o más muestras de donadores independientes; • un método de acuerdo con el esquema anterior, en el que la localización de un epítope de células T se encuentra cuando una puntuación de índice de estimulación de alrededor de 2.0 se observa en dos o más muestras de donadores independientes y en donde uno o más ligandos MHC clase II pueden identificarse dentro del mismo lugar de la secuencia usando un sistema computacional ,- • un método de acuerdo con el esquema anterior, en el que el sistema computacional es de acuerdo con el método mostrado por WO 02/069232; • una molécula EPO en la cual las regiones inmunogénicas han sido mapeadas usando un ensayo de células T y luego modificadas de tal manera que después de una prueba adicional en un ensayo de células T la proteína modificada evoque un índice de estimulación menor que el de la molécula progenitora (no modificada) y muy preferiblemente de menos de 2.0, de preferencia menos de 1.8 y • una molécula de EPO con una estructura como la mostrada en la figura 4 en la presente. Descripción detallada de la invención De acuerdo con la primera modalidad de la invención se proporciona un mapa de epítopes de células T de EPO humana. El mapa de epítopes de EPO tiene utilidad para hacer posible el diseño de análogos de EPO en los cuales las sustituciones de aminoácidos hayan sido llevadas a cabo en posiciones específicas y con residuos específicos para dar como resultado una reducción sustancial en la actividad o eliminación de uno o más epítopes de células T potenciales de la proteína. La presente invención proporciona ejemplos de sustituciones adecuadas dentro de las regiones más inmunogénicas de la molécula progenitora, y estas sustituciones se consideran modalidades de la invención. La solicitud en copropiedad WO 02/062843 ha descrito previamente el conjunto de datos de péptidos derivados de EPO que comprende el universo de ligandos clase MHC permisibles y ha sugerido sustituciones de aminoácidos capaces de comprometer la capacidad de cada péptido para que funcione como un ligando MHC clase II. WO 02/062843 se publicó el 15 de agosto de 2002 y se incorpora a manera de referencia completamente de la presente. La solicitud WO 02/062843 usó una técnica in silico para definir ligandos MHC clase II y por razones tales como el requerimiento de un procesamiento proteolítico y otras etapas fisiológicas que llevan a la presentación de péptidos inmunogénicos in vivo, es claro que un subconjunto relativamente menor del repertorio completo de péptidos tendrá relevancia biológica final. Los inventores han establecido que pueden usarse ensayos de activación de células T humanas ex vivo para identificar las regiones dentro de la secuencia de proteínas de EPO que sean capaces de soportar la activación de células T y de esta manera más biológicamente relevantes para el problema de inmunogenicidad en esta proteína. El mapa de epítopes de EPO humana descrito en la presente ha sido derivado por la aplicación de este enfoque, y el método descrito es en consecuencia también una modalidad de la presente invención. De acuerdo con el método, péptidos sintéticos se prueban para verificar su capacidad para evocar una respuesta proliferativa en células T humanas cultivadas in vitro. Las células T están presentes dentro de la capa de células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) fácilmente obtenible mediante medios bien conocidos de muestras de sangre entera. Más aún, la preparación de PBMC contiene relaciones fisiológicas de células T y células presentadoras de antígenos y es por lo tanto una fuente adecuada de materiales con la cual se lleve a cabo una reacción inmune in vi tro subrogada. Los inventores han establecido que en la operación de este ensayo, un índice de estimulación que se acerca cercanamente o que excede 2.0 es una medida útil de proliferación inducida. El índice de estimulación (SI) se deriva convencionalmente mediante la división de la puntuación de proliferación (por ejemplo, conteos por minuto de radioactividad si se usa por ejemplo incorporación de 3H-timidina) medida para el péptido de prueba entre la puntuación medida en células no puestas en contacto ccn un péptido de prueba. Los péptidos que no evocan alguna respuesta dan SI = 1.0 aunque en la práctica valores SI en la escala de 0.8 - 1.2 son no notorios. Un número de procedimientos técnicos pueden construirse en la operación de estos ensayos para asegurar una confianza en las puntuaciones registradas. Típicamente, todas las determinaciones se hacen al menos por triplicado y la puntuación promedio puede ser computada. Cuando un SI computado =>2.0 las puntuaciones individuales del triplicado pueden examinarse para evidencia de datos resultantes. Los péptidos de prueba se ponen en contacto con células en por lo menos dos concentraciones diferentes y las concentraciones típicamente abarcarían una diferencia de concentración doble mínima. Esta escala de concentraciones proporciona una desviación para la dimensión cinética del ensayo y es especialmente importante cuando una determinación de un solo punto de tiempo, por ejemplo en más día 7, se está llevando a cabo. En algunos ensayos varias determinaciones de curso de tiempo pueden llevarse a cabo pero en cualquier caso éstas también podrían hacerse usando un inmunógeno péptido provisto en un mínimo de dos concentraciones diferentes. De manera similar, la inclusión de péptidos de control para los cuales haya expectativa de que la mayoría de muestras de donadores de PBMC sean responsivas puede incluirse en cada placa de ensayo. El péptido de hemaglutinina de influenza 307-309, secuencia PKYVKQNTLKLA; y la secuencia de péptidos HSP 60 de Chlamydia KWDQIKKI SKPVQH son péptidos de control particularmente adecuados, aunque pueden explotarse muchos otros ejemplos. Los ensayos deben de preferencia usar también un antígeno de proteína entera potente tal como hemocianina de lapa en forma de cerradura a la cual todas las muestras de PBMC pueda esperarse que exhiban un SI significativamente mayor que 2.0. Se desea particularmente proporcionar un mapa de epítopes de EPO humana en donde el mapa tenga relevancia para un amplio espectro de alotipos MHC posibles. Se desea que el mapa sea lo suficientemente representativo como para permitir el diseño o selección de la proteína modificada para la cual la capacidad de la proteína para evocar una respuesta inmune conducida por células T sea eliminada o por lo menos reducida para la mayoría de los pacientes a quienes probablemente se vaya a administrar la proteína. En consecuencia, en la práctica de los procesos de análisis, células T derivadas de PB C de donadores inmaduros se toman de un fondo de donadores de diversidad inmunológica suficiente como para proporcionar una muestra de por lo menos más de 90% del repertorio de MHC clase II (HLA-DR) existente en la población humana. Cuando una respuesta de células T inmaduras va a detectarse para un péptido sintético dado, el péptido en la práctica se pone en contacto con preparaciones de PBMC derivadas de varios donadores en aislamiento, los números de donadores (o tamaño del "fondo de donadores"), son por propósitos prácticos probablemente no menores que 20 individuos no emparentados, y todas las muestras en el fondo de donadores pueden ser preseleccionadas de acuerdo con su haplotipo MHC clase II. El término "donador inmaduro" en el contexto de la presente invención significa que las células T obtenidas del individuo que no ha recibido ninguna fuente terapéutica o exógena de 3P0. La presente invención describe en la presente un método para el mapeo de epítopes de células T explotando células T inmunológicamente inmaduras. Las células T son provistas de una muestra de sangre periférica de una multiplicidad de diferentes donadores saludables para quienes la proteína de interés pueda ser una molécula endógena pero quienes no hayan recibido la proteína de interés de ninguna fuente exógena, por ejemplo, administrada terapéuticamente. En ensayo se lleva a cabo usando PBMC cultivadas in vi tro usando procedimientos comunes de la técnica e incluye poner en contacto las PBMC con especies de péptidos sintéticos representativos de la proteína de interés, y seguir un periodo de incubación adecuado, la medición de la activación de células T inducida por péptidos, tal como la proliferación celular. La medición es mediante cualquier medio adecuado y puede por ejemplo llevarse a cabo usando incorporación de 3H-timidina con lo cual la acumulación de 3H en material celular sea fácilmente medida usando instrumentos de laboratorio. El grado de proliferación celular para cada combinación de muestra de PBMC y péptidos sintéticos se examina en relación con el observado en una muestra de PBMC no tratada con péptidos. También se puede hacer referencia a la respuesta proliferativa observada después del tratamiento con un péptido o péptidos para los cuales exista un efecto proliferativo esperado. A este respecto se considera particularmente adecuado usar péptidos con restricción de MHC amplia conocida y especialmente epítopes de péptidos con restricción de MHC para los isotipos DP o DQ .

Para facilitar el ensamble de un mapa de epítopes para EPO humana, se produjo un conjunto de péptidos sintéticos. Cada uno de los péptidos tenía 15 residuos de aminoácido de longitud y cada uno traslapaba el siguiente péptído en la serie por 12 residuos de aminoácido; es decir, cada péptido sucesivo en la serie añadió a incrementos tres aminoácidos adicionales al análisis. De esta manera cualquier par adyacente de péptidos dado mapeó 18 aminoácidos de secuencia contigua. Para EPO un total de 51 péptidos fue requerido para hacer posible un escaneo de la proteína madura completa. Un método particularmente efectivo para definir un mapa de células T para EPO usando ensayo de células T inmaduras se proporciona en el ejemplo 1. Los presentes estudios han descubierto 16 secuencias de péptidos capaces de evocar una respuesta proliferativa significativa. Estos péptidos se listan en la tabla 1 y son una modalidad de la invención. Dentro de este conjunto de péptidos, se identificó un subconjunto adicional de péptidos, cada péptido del cual evocó una respuesta proliferativa significativa en dos o más muestras de donadores individuales. Estos péptidos se listan en la tabla 2 y son una modalidad más de la invención.

Tabla 1 Secuencias de péptidos de EPO capaces de estimular células T humanas ex vivo Tabla 2 Secuencias de péptidos de EPO capaces de estimular células T humanas ex vivo de dos o más muestras de donadores ID de Residuo Secuencia de Región de péptido # # péptidos epitope P7 19 AKEAENITTGCAEHC P8 22 AENITTGCAEHCSLN Rl P9 25 ITTGCAEHCSLNENI P26 76 RGQALLVNSSQPWEP R2 P46 137 TFRKLFRVYSNFLRG P47 140 KLFRVYSNFLRGKLK R3 P50 149 LRGKLKLYTGEACRT Cada uno de los péptidos identificado en la tabla 1 se sugiere como capaz de unirse a HC clase II y de acopiar por lo menos un TCR cognado con suficiente capacidad como para evocar un estallido proliferativo detectable en el sistema de ensayo. Para los péptidos de la tabla 2 estos criterios han sido logrados usando PBMC derivadas de dos o tres muestras de PBMC no emparentadas. Se considera que estos péptidos abarcan las regiones de epítope principales de la molécula y se acumulan en tres zonas en la secuencia de EPO llamada en la presente regiones de epítope Rl , R2 y R3. La región de epítope Rl es abarcada por los péptidos P7 , P8 y P9 que comprenden la secuencia AKEAENITTGCAEHCSLNENI . La región de epítope R2 es abarcada por el péptído P26 que comprende la secuencia RGQALLVNSSQPWEP. Nótese que para el epítope R2 , péptidos sucesivos P27 y P28 también son reactivos cada uno con una muestra de donador de PBMC. En el caso del péptido P27 el donador también es reactivo con el péptido P26 y es probable que una sola secuencia central común dentro de R2 sea responsable de esta estimulación. Debido al faseo de cada péptido sucesivo en la secuencia, es posible que la misma secuencia nonámera central sea compartida (es decir, sea común) entre ya sea 2 6 3 péptidos adyacentes. El faseo exacto depende de la proximidad al término N y está relacionado con la longitud de los péptidos y el número de residuos "nuevos" escaneados por cada incremento sucesivo de la secuencia. En el caso del epítope R2 , el límite C-terminal de la región de epítope ha sido establecido para incluir una secuencia cubierta por los péptidos P27 y P28 no menos ya que esta región muestra contener ligandos HC clase II significativos en esta región C-terminal (véase más adelante y la figura 2) . La región de epítope R2 es en consecuencia definida por la secuencia RGQALLVNSSQPWEPLQLHVD .

La región de epítope R3 es abarcada por los péptidos P46 y P47 y se extiende hacia el término C de la secuencia de EPO. El límite C-terminal del epítope R3 es limitado por el término natural de la proteína de EPO, notablemente el péptido P50 es también reactivo en dos muestras de donadores y estos donadores son los mismos que reaccionan con los péptidos P46 y P47. El centro del epítope R3 se considera que comprende la secuencia TFRKLFRVYSNFLRGKLK, pero un ligando MHC clase II adicional y péptido reactivo conocido comprende la secuencia de péptidos P50 traslapante LRGKLKLYTGEACRT para dar una secuencia de R3 total que comprende TFRKLF VYSNFLRGKLKLY . Las secuencias de péptidos descritas en la presente representan la información crítica requerida para la construcción de moléculas de EPO modificadas en las cuales uno o más de estos epítopes está comprometido. Bajo el esquema de la presente, los epítopes son comprometidos por mutación para dar como resultado secuencias que ya no sean capaces de funcionar como epítopes de células T. Es posible usar métodos de ADN recombinante para lograr la mutagénesis dirigida de las secuencias objetivo, y muchas de estas técnicas están disponibles y se conocen bien en la técnica.

Aunque el objetivo de esta invención es modificar las secuencias de aminoácidos de por lo menos uno o más de los péptidos listados arriba en la tabla 1, se prefiere más modificar la secuencia de uno o más de los péptidos identificados en la tabla 2. En la presente se describen modificaciones adecuadas que logran el objetivo de reducir o eliminar las capacidades de la presente secuencia de péptidos para funcionar como un epítope de células T, al nivel de ser un ligando para uno o más alotipos de CH clase II. Uno de estos conjuntos de modificaciones adecuado se proporciona en la figura 4. De acuerdo con esta segunda modalidad, las modificaciones adecuadas a la proteína pueden incluir sustitución con aminoácidos de residuos o combinaciones de residuos particulares. Para la eliminación de epítopes de células T, las sustituciones de aminoácido se hacen de preferencia en puntos adecuados dentro de la secuencia de péptidos que se prediga logre la reducción o eliminación sustancial de la actividad del epítope de células T. En la práctica, un punto adecuado equivaldrá de preferencia a un residuo de aminoácido que se una dentro de una o más de las cavidades provistas dentro de la ranura de unión HC clase II. Se prefiere más alterar la unión dentro de la primera cavidad del saco en la llamada posición "Pl" o "ancla Pl" del péptido. La calidad de la interacción de unión entre el residuo de ancla Pl del péptido y la primera cavidad de la ranura de unión MHC clase II se reconoce como un principal determinante de la afinidad de unión completa para el péptido entero. Una sustitución adecuada en esta posición del péptido será para un residuo menos fácilmente acomodado dentro de la cavidad, por ejemplo, la sustitución a un residuo más hidrofílico. Los residuos de aminoácido en el péptido en las posiciones que equivalen a la unión dentro de otras regiones de cavidad en el saco de unión MHC también se consideran y están dentro del alcance de la presente. Se entiende que sustituciones de aminoácidos individuales dentro de un epítope de células T potencial son la ruta más preferida mediante la cual el epítope puede ser eliminado. Combinaciones de sustitución dentro de un solo epítope pueden contemplarse y por ejemplo pueden ser particularmente adecuados cuando epítopes individualmente definidos estén traslapándose uno con otro. Más aún, sustituciones de aminoácidos ya sea individualmente dentro de un epítope dado o en combinación con un solo epítope pueden hacerse en posiciones que no equivalgan a los "residuos de cavidad" con respecto a la ranura de unión MHC clase II, pero en cualquier punto dentro de la secuencia de péptidos. Las sustituciones pueden hacerse con referencia a una estructura homologa o método estructural producido usando técnicas in silico conocidas en la técnica y pueden basarse en características estructurales conocidas de la molécula. El modelo de estructura de cristal de EPO contenido en el Banco de Datos de Proteínas es particularmente útil a este respecto [PDB ID: 1CN4; Syed, R. et al (1998) Nature 395 : 511-516] . Se puede contemplar un cambio para restablecer la estructura o actividad biológica de la molécula variante. Estos cambios compensatorios y cambios también pueden incluir la supresión o adición de residuos de aminoácido particulares del polipéptido . Un medio particularmente efectivo para remover epítopes de moléculas de proteína es el uso concertado del esquema de ensayo de activación de células T inmaduras como el descrito en la presente junto con una herramienta in silico desarrollada de acuerdo con el esquema descrito en la solicitud en copropiedad WO 02/069232 la cual también se incorpora completamente en la presente a manera de referencia . El software simula el proceso de presentación de antigenos al nivel de la interacción de unión MHC clase II del péptido para proporcionar una puntuación de unión para cualquier secuencia de péptidos dada. Esta puntuación se determina para muchos de los alotipos MHC clase II predominantes que existen en la población. Ya que este esquema es capaz de probar cualquier secuencia de péptidos, las consecuencias de las sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos con respecto a la capacidad de un péptido para interactuar con una ranura de unión MHC clase II pueden ser predichas . En consecuencia, se pueden diseñar nuevas composiciones de secuencia que contengan números reducidos de péptidos capaces de interactuar con la MHC clase II y de esta manera funcionar como epítopes de células T inmunogénicos . Aunque el ensayo biológico usando cualquier muestra de donador dada puede establecer la unión a un máximo de cuatro alotipos D , el proceso in silico puede probar la misma secuencia de péptidos usando >40 alotipos simultáneamente. En la práctica, este enfoque es capaz de dirigir el diseño de nuevas variantes de secuencia que estén comprometidas en su capacidad para interactuar con varios alotipos MHC. El ensayo de células T fue capaz de definir tres regiones inmunogénicas R1-R3 dentro de la molécula y el sistema de software de acuerdo jon el esquema de WO 02/069232 fue capaz de identificar ligandos MHC clase II predichos dentro de cada uno de los epítopes. Más aún, el sistema fue capaz además de identificar sustituciones de aminoácidos dentro de los epítopes que dieron como resultado la pérdida significativa de la afinidad de unión entre la secuencia de péptidos y esencialmente todos los alotipos MHC clase II representados en el sistema. Un ejemplo de este conjunto de modificaciones se proporciona por la ruptura de la región de epítope Rl . El conjunto de sustitución I25A y L35A da como resultado un compromiso de los principales ligandos MHC clase II dentro del epítope Rl . Similarmente para ligandos MHC clase II identificados dentro de la región de epítope R2 , las sustituciones V82A, Q88W, L91G, L93P y V95A son cambios ejemplarmente posibles. Para la región de epítope R3 una serie traslapante de ligandos MHC se identifica. Una serie de sustitución adecuada comprende uno o más de los cambios L141T, F142A, V144T, Y145P, F148A, L149S y/o L153A. En todos los casos anteriores, conjuntos de mutación alternativos pueden ser discernidos con base en la capacidad de un péptido dado para unirse dentro de la ranura de unión MHC clase II y las consideraciones estructurales con base en el examen del modelo de estructura de cristal de EPO [PDB ID: 1CN4; Syed, R. et al (1998) Nature 395:511-516] . Cada una de las sustituciones anteriores son ejemplares del método y son composiciones preferidas bajo el esquema de la presente invención. Como será claro para la persona capacitada en la técnica, varios conjuntos de sustituciones alternativos pueden obtenerse con los cuales se logre el objetivo de remover epítopes no deseados. Las secuencias resultantes serían sin embargo reconocidas como estrechamente homologas con las composiciones específicas descritas en la presente y por lo tanto estarían dentro del alcance de la presente invención. La forma de proteína madura de EPO puede contener 165 ó 166 aminoácidos debido a la remoción post-traduccional de la arginina C-terminal. D165 es el término C de la forma de aminoácido 165 y R166 es el aminoácido C-terminal de la forma de aminoácido 166. Los análogos de EPO descritos en la presente pueden comprender ya sea las formas de aminoácido 165 ó 166 de EPO. El enfogue combinado de usar una herramienta in silico para la identificación de ligandos MHC clase II y el diseño de análogos de secuencia que carezcan de ligandos MHC clase II, en conjunto con el mapeo de epítopes y las pruebas adicionales usando opcionalmente ensayos biológicamente basados de activación de células T es un método particularmente efectivo y una modalidad muy preferida de la invención. El método general de acuerdo con esta modalidad comprende las siguientes etapas: i) uso de ensayos de activación de células T inmaduras y péptidos sintéticos que abarquen colectivamente la secuencia de proteínas de interés para identificar regiones de epítope capaces de activar células T; ii) uso de un esquema computacional que simule la unión de ligando de péptido con uno o más alotipos MHC para analizar las regiones de epítope identificadas en la etapa i) y de esta manera identificar ligandos MHC clase II dentro de la región de epítope; iii) uso de un esquema computacional que simule la unión de ligando de péptido con uno o más alotipos MHC para identificar análogos de secuencia de los ligandos MHC abarcados dentro de las regiones de epítope que ya no se unan a MHC clase II o que se unan con afinidad reducida a un número menor de alotipos MHC, y opcionalmente ; iv) uso de ensayos de activación de células T inmaduras y péptidos sintéticos que abarquen completamente o en colección las regiones de epítope identificadas dentro de la proteína de interés, y prueba de los análogos de secuencia en ensayo de activación de células T inmaduras en paralelo con las secuencias (progenitoras) tipo silvestre. El término "epítope de células T" significa de acuerdo con el entendimiento de esta invención una secuencia de aminoácidos que es capaz de unirse a MHC clase II, capaz de estimular células T y/o también de unirse (sin necesariamente activar en forma medible) células T a un complejo con MHC clase II.

El término "péptido" según se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, es un compuesto que incluye dos o más aminoácidos. Los aminoácidos son ligados juntos por un enlace péptido (definido en la presente abajo) . Existen 20 aminoácidos que ocurren naturalmente diferentes implicados en la producción biológica de péptidos, y cualquier número de ellos puede estar enlazado en cualquier orden para formar una cadena o anillo de péptidos. Los aminoácidos que ocurren naturalmente empleados en la producción biológica de péptidos tienen todos la configuración L. Péptidos sintéticos pueden prepararse empleando métodos sintéticos convencionales, utilizando L-aminoácidos, D-aminoácidos o varias combinaciones de aminoácidos de las dos configuraciones diferentes. Algunos péptidos contienen sólo pocas unidades de aminoácido. Los péptidos cortos, por ejemplo, que tienen menos de 10 unidades de aminoácidos, son algunas veces referidos como "oligopéptidos" . Otros péptidos contienen un gran número de residuos de aminoácido, por ejemplo, hasta 100 o más, y son referidos como "polipéptidos" . Por convención, un "polipéptido" se puede considerar como cualquier cadena de péptidos que contenga tres o más aminoácidos, mientras que un "oligopéptido" se considera normalmente como un tipo particular de polipéptido "corto" . De esta manera, según se usa en la presente, se entiende que cualquier referencia a un "polipéptido" también incluye un oligopéptido . Además, cualquier referencia a un "péptido" incluye polipéptidos , oligopéptidos y proteínas. Cada disposición diferente de aminoácidos forman diferentes polipéptidos o proteínas. El número de polipéptidos -y por consiguiente el número de proteínas diferentes- que pueden formarse es prácticamente ilimitado. Las moléculas de EPO de esta invención se pueden preparar en cualquiera de varias formas, pero se lleva a cabo muy preferiblemente explotando métodos recombinantes de rutina. Es un procedimiento relativamente fácil usar las secuencias de proteínas e información provista en la presente para deducir un polinucleótido (ADN) que codifique para cualquiera de las secuencias de proteínas preferidas. Esto puede lograrse por ejemplo usando herramientas de software de computadora tales como la suite de software DNSstar [DNAstar Inc, Madison, WI , E.U.A.] o similar. Cualquiera de estas secuencias de ADN con la capacidad de codificar para los polipéptidos preferidos de la presente u homólogos significativos de los mismos, se debe considerar como modalidades de esta invención. Como un esquema general, genes que codifiquen para cualquiera de las secuencias de proteínas de EPO pueden hacerse usando síntesis génica y clonarse en un método de expresión adecuado. A su vez, el vector de expresión se introduce en una célula huésped y las células se seleccionan y se cultivan. Las moléculas preferidas se purifican del medio de cultivo y se formulan en una preparación para administración terapéutica. Como alternativa, una secuencia de genes EPO tipo silvestre puede obtenerse por ejemplo siguiendo una estrategia de clonación de ADNc usando ARN preparado de tejidos de hígado o riñon o líneas de células humanas adecuados. El gen tipo silvestre puede usarse como una plantilla para la mutagénesis y construcción de las secuencias variantes preferidas. A este respecto es particularmente conveniente el uso de la estrategia de "PCR de expresión de traslape" como la descrito por Higuchi et al [Higuchi et al (1988) Wucleio Acíds Res. 16: 7351] aunque otras metodologías y sistemas pueden aplicarse fácilmente. El ADN de codificación alterado es expresado después por medios convencionales en un sistema de células huésped seleccionado del cual la EPO deseada se recupere y se purifique. Las células huésped, purificación y esquemas de ensayo adecuados se conocen bien en la técnica y pueden incluir cualquiera de los esquemas provistos en WO 85/02610, WO 86/03520, WO 99/03887, EP0357804 u otros ejemplos. Cuando la constitución de la molécula de EPO pueda lograrse mediante técnicas de ADN recombinante , esto puede incluir moléculas de EPO fusionadas con otros dominios de proteína o por ejemplo un dominio de región constante de anticuerpo. Los métodos para purificar y manipular proteínas recombinantes que incluyen proteínas de fusión se conocen bien en la técnica. Las técnicas necesarias se explican completamente en la literatura, tales como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed. , 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.), "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds . ) ; "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction" , (Mullís et al., eds., 1994); "Current Protocole in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991) . Ya que esta invención se refiere a EPO modificada, las composiciones que contienen estas proteínas de EPO modificadas o fragmentos de proteínas EPO modificadas y composiciones relacionadas deben considerarse dentro del alcance de la invención. Un ejemplo pertinente a este respecto sería el desarrollo de estrategias de inducción de tolerancia mediadas por péptidos en las que uno o más de los péptidos descritos se administre a un paciente con un intento inmunoterapéutico . En consecuencia, las moléculas de péptido sintéticas, por ejemplo una o más de aquellas listadas en la tabla 1 o muy preferiblemente secuencias que comprendan toda o parte de cualquiera de las regiones de epítope R1-R3 como las definidas arriba e incorporadas en la tabla 2. Esos péptidos se consideran modalidades de la invención. En otro aspecto, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican para entidades de EPO modificadas. En un aspecto más, la presente invención se refiere a métodos para el tratamiento terapéutico de humanos usando las proteínas EPO modificadas. En este aspecto la EPO modificada puede producirse como una proteína de fusión recombinante . La invención se ilustrará ahora por medio de los siguientes ejemplos experimentales. Los ejemplos se refieren a las siguientes figuras: La figura 1 es una ilustración de los ligandos MHC clase II identificados dentro de la región de epítope Rl . Los ligandos se identifican usando el sistema in sílico del ejemplo 2. En este caso el perfil de unión de 18 alotipos DR humanos se despliega como columnas. Los ligandos detectados son 13 -meros y el número de residuo 1 de cada 13 -mero se identifica por un bloque coloreado. La intensidad de la interacción de unión (Alta, Media o Baja) para cada péptido con respecto a cada uno de los 18 alotipos se indica de acuerdo con la clave desplegada. La figura 2 es una ilustración de los ligandos MHC clase II identificados dentro de la región de epítope R2. Los ligandos se identifican usando el sistema in silico del ejemplo 2. En este caso el perfil de unión de 18 alotipos DR humanos se despliega como columnas. Los ligandos detectados son 13 -meros y el número de residuo 1 de cada 13 -mero se identifica por un bloque coloreado. La intensidad de la interacción de unión (Alta, Media o Baja) para cada péptido con respecto a cada uno de los 18 alotipos se indica de acuerdo con la clave desplegada. La figura 3 es una ilustración de los ligandos MHC clase II identificados dentro de la región de epítope R3. Los ligandos se identifican usando el sistema in silico del ejemplo 2. En este caso el perfil de unión de 18 alotipos DR humanos se despliega como columnas. Los ligandos detectados son 13 -meros y el número de residuo 1 de cada 13 -mero se identifica por un bloque coloreado. La intensidad de la interacción de unión (Alta, Media o Baja) para cada péptido con respecto a cada uno de los 18 alotipos se indica de acuerdo con la clave desplegada. La figura 4 ilustra una estructura de EPO más preferida en la cual ligandos MHC clase II son eliminados mediante la sustitución dentro de las regiones de epítope Rl, R2 y R3. Ejemplo 1 La interacción entre MHC, péptido y receptor de células T (TCR) proporciona la base estructural para la especificidad de antígenos del reconocimiento de células T.

Los ensayos de proliferación de células T prueban la unión de los péptidos a MHC y el reconocimiento de complejos MHC/péptido por el TCR. Los ensayos de proliferación de células T in vitro del presente ejemplo incluyen la estimulación de células mononucleares de sangre periférica (PB Cs), que contienen células presentadoras de antígenos (APCs) y células T. La estimulación se lleva a cabo in vitro usando antígenos de péptidos sintéticos, y en algunos experimentos antígenos de proteínas enteras. La proliferación de células T estimuladas se mide usando ¾-timidina (3H-Thy) y la presencia de 3H-Thy incorporada se establece usando conteo por centelleo de células fijas lavadas. Cubiertas amarillas de sangre humana almacenada durante menos de 12 horas fueron obtenidos del Servicio de Sangre Nacional (Addenbrooks Hospital, Cambridge, Reino Unido) . Se obtuvo Ficoll-paque de Amersham Pharmacia Biotech (Amersham, Reino Unido) . El medio AIM V libre de suero para el cultivo de linfocitos humanos primarios y que contenía L-glutamina, 50 fig/ml de estreptomicina, 10 9/p?1 de gentomicina y 0.1% de albúmina de suero humano fue de Gibco-BRL {Paisley, Reino Unido) . Los péptidos sintéticos se obtuvieron de Pepscan (Holanda) y Babraham Technix (Cambridge, Reino Unido) . Los eritrocitos y leucocitos se separaron del plasma y plaquetas mediante la centrifugación suave de las cubiertas amarillas. La fase superior (que contenía plasma y plaquetas) se removió y se descartó. Los eritrocitos y leucocitos se diluyeron 1:1 en solución salina de pH regulado con fosfato (PBS) antes de colocarlos sobre ficoll-paque de 15 mi (Amersham Pharmacia, Amersham Reino Unido) . La centrifugación se hizo de acuerdo con las condiciones recomendadas por el fabricante y las PBMCs fueron cosechadas de la interfaz suero+PBS/ficoll paque . Las PBMCs fueron mezcladas con PBS (1:1) y recogidas mediante centrifugación. El sobrenadamente se removió y se descartó y la pella de PBMC se resuspendió en 50 mi de PBS. Las células se peletizaron de nuevo mediante centrifugación y el sobrenadamente de PBS se descartó. Las células se resuspendieron usando 50 mi de medio AIM V y en este punto se contaron y la viabilidad se estableció usando exclusión por colorante azul tripano. Las células se recogieron de nuevo mediante centrifugación y el sobrenadamente se descartó. Las células se resuspendieron para el almacenamiento criogénico a una densidad de 3xl07 por mi. El medio de almacenamiento fue 90% (v/v) de suero humano AB inactivado con calor (Sigma, Poole, Reino Unido) y 10% (v/v) de DMSO (Sigma, Poole, Reino Unido) . Las células se transfirieron a un recipiente de congelamiento regulado (Sigma) y se pusieron a -70 °C durante la noche antes de transferirlas a N2 líquido para el almacenamiento a largo plazo. Cuando se necesitó usarlas, las células fueron descongeladas rápidamente en un baño de agua a 37°C antes de transferirlas a 10 mi de medio AIM V precalentado. Las PBMC fueron estimuladas con antigenos de proteínas y péptidos en una placa de fondo plano de 96 pocilios a una densidad de 2xl05 PBMC por pocilio. Las PBMC fueron incubadas durante 7 días a 37°C antes del pulseo con 3H-Thy (Amersham- Phamacia, Amersham, Reino Unido) . Para el presente estudio, péptidos sintéticos (15meros) que traslapaban cada péptido sucesivo por 12 aminoácidos fueron generados para abarcar la secuencia completa de EPO. Los números de identificación de péptido (ID#) y las secuencias se dan en la tabla 3. Cada péptido fue analizado individualmente contra PBMCs aisladas de 20 donadores inmaduros. Dos péptidos de control que previamente habían mostrado ser inmunogénicos y una potente KLH antígeno de no repetición se usaron en cada ensayo de donador. Los antígenos de control usados en este estudio fueron Flu hemaglutinina 307-319 (secuencia: PKYV QNTL LA ) péptido HSP 60 de Chlamydia (secuencia: KWDQIK ISKPVQH) y hemocianina de lapa en forma de cerradura.

Tabla 3 Péptidos de EPO ID de EPO ; secuencia de Residuo # péptido # péptido 15mero Pl APPRLICDSRVLERY 1 ?2 RLICDSRVLERYLLE 4 P3 CDSRVLERYLLEAKE 7 P4 RVLERYLLEAKEAEN 10 P5 ERYLLEAKEAENITT 13 P6 LLEAKEAENITTGCA 16 P7 AKEAENITTGCAEHC 19 P8 AENITTGCAEHCSLN 22 P9 ITTGCAEHCSLNENI 25 PIO GCAEHCSLNENITVP 28 Pll EHCSLNENITVPDTK 31 P12 SLNE ITVPDTKVNF 34 P13 ENITVPDTKVNFYAW 37 P14 TVPDTKVNFYAWKRM 40 P15 DTKVNFYAWKRMEVG 43 P16 VNFYAWKRMEVGQQA 46 P17 YAWKRMEVGQQAVEV 49 P18 KRMEVGQQAVEVWQG 52 P19 EVGQQAVEVWQGLAL 55 P20 QQAVEVWQGLALLSE 58 P21 VEVWQGLALLSEAVL 61 P22 WQGLALLSEAVLRGQ 64 P23 LALLSEAVLRGQALL 67 P24 LSEAVLRGOALLVNS 70 ID de EPO; secuencia de Residuo # péptido # péptido 15mero P25 AVLRGQALLVNSSQP 73 P26 RGQALLVNSSQPWEP 76 P28 VNSSQPWEPLQLHVD 82 P29 SQPWEPLQLHVD AV 85 P30 WEPLQLHVDKAVSGL 88 P31 LQLHVDKAVSGLRSL 91 P32 HVDKAVSGLRSLTTL 94 P33 KAVSGLRSLTTLLRA 97 P34 SGLRSLTTLLRALGA 100 P35 RSLTTLLRALGAQ E 103 P36 TTLLRALGAQKEAIS 106 P37 LRALGAQKEAISPPD 109 P38 LGAQKEAISPPDAAS 112 P39 QKEAISPPDAASAAP 115 P40 AISPPDAASAAPLRT 118 P41 PDAASAAPLRTITAD 122 P42 ASAAPLRTITADTFR 125 P43 APLRTITADTFRKLF 128 P44 RTITADTFRKLFR Y 131 P45 TADTFRKLFRVYSNF 134 P46 TFRKLFRVYSNFLRG 137 P47 KLFRVYSNFLRGKLK 140 P48 RVYSNFLRGKLKLYT 143 P49 SNFLRGKLKLYTGEA 146 P50 LRGKLKLYTGEACRT 149 P51 KLKLYTGEACRTGDR 152 Los péptidos fueron disueltos en DMSO hasta una concentración final de 10 mM, y estas soluciones de abastecimiento se diluyeron después 1/500 en medio AIM V (concentración final 20 µ?) . Los péptidos se añadieron a una placa de 96 pocilios de fondo plano para dar una concentración final de 2 y 20 µ? en 100 µ? . La viabilidad de las PBMCs descongeladas se determinó mediante exclusión con colorante azul tripano, las células fueron después resuspendidas a una densidad de 2xl06 células/ml, y 100 µ? (2x 105 PBMC/pocillo) se transfirieron a cada pocilio que contenía péptidos. Los cultivos de pocilio por triplicado se ensayaron en cada concentración de péptidos. Las placas se incubaron durante 7 días en una atmósfera humidificada de 5% de C02 a 37°C. Las células se pulsaron durante 18-21 horas con 1 µ?? de 3H-Thy/pocillo antes de cosecharlas sobre esteras de filtro. Los valores CP se determinaron usando un contador de placa superior beta de microplaca Wallac (Perkin Elmer) . Los resultados se expresaron como índices de estimulación, en donde índice de estimulación (SI) se deriva por la división de la puntuación de proliferación (por ejemplo conteos por minutos de radioactividad) medida para el péptido de prueba entre la puntuación medida en células no contactadas con un péptido de prueba. El mapeo de epítopes de células T en la secuencia de EPO usando el ensayo de proliferación de células T dio como resultado la identificación de tres regiones inmunogénicas Rl , R2 y R2. Los péptidos capaces de estimular una respuesta significativa en por lo menos una muestra de donador de PBMC se listan dentro de la tabla 1. Los péptidos capaces de estimular una respuesta significativa en dos o más muestras de donadores de PBMC se listan en la tabla 2. La restricción alotipica de los donadores responsivos a péptidos EPO se da en la tabla 4.

Tabla ' 1 ID de Secuencia de Alot pos responsivos péptido # péptidos P4 RVLERYLLEAKEAEN DRBim, DRB1*0103, DRB3 P7 AKEAENITTGCAEHC DRB1÷04, DRB1*07, DRB4*01 DRB*01, DRB1*08 DRB1*10, DRB1*13, DRB3 P8 AENITTGCAEHCSLN DRB1*01, DRB1*08 DRB1*10, DRB*13, DRB3 DRB1*11, DRB1*15, DRB3, DRB5 P9 ITTGCAEHCSLNENI DRB1*01, DRB1*08 DRB1*10, DRB1*13, DRB3 PIO GCAEHCSLNENITVP DRB1*01, DRB1*08 P16 VNFYAWKRMEVGQQA DRBl*il, DRB1*0103, DRB* 3 ID de Secuencia de Alotipos responsivos péptido # péptidos P26 RGQALLVNSSQPWEP DRB1*10, DRB1*13, DRB3 DRB1*11, DRB1+15, DRB3 , DRB5 P27 ALLVNSSQPWEPLQL DRB1*11, DRB1*1S, DRB3 , DRB5 P28 VNSSQPWEPLQLHVD DRB1*10, DRB1*13, DRB3 P32 HVDKAVSGLRSLTTL DRB1*04, DRB1*07, DRB4*01 P41 PDAASAAPLRTITAD DRB1*15, DRB1*0103, DRB5 P44 RTITADTFRKLFRVY DRB1*11, DRB*0103, DRB3 P46 TFRKLFRVYSNFLRG DRB*13, DRB*14 o DRB*14 solo, DRB3 DRB1*11, DRB1*0103, DRB3 P47 KLFRVYSNFLRGKLK DRB1*13, DRB1*14 o DRB1*14 sólo, DRB3 DRB1+11, DRB1*0103, DRB3 P48 RVYSNFLRGKLKLYT DRBV1*11, DRB1*0103, DRB3 P50 LRGKL LYTGEACRT DRB1*13, DRB1*14 o DRB1*14 solo, DRB3 DRB1*11, DRB1*0103, DRB3 Ejemplo 2 Diseño de secuencias de EPO modificadas con, perfiles de inmunogenicidad mejorados El método de la solicitud WO 02/069232 se usó en un análisis de las regiones de epítope Rl , R2 y R3. El sistema hace posible la predicción de los ligandos HC particulares abarcados dentro de las regiones de epítope biológicamente detectadas y proporciona una "puntuación" con respecto a la capacidad de un ligando MHC clase II dado para interactuar con un alotipo MHC particular. El patrón de restricción alotípico para los ligandos MHC puede ilustrarse usando los despliegues de gráfica de restricción alotípica como los provistos para cada una de las regiones de epítope R1- 3 en las figuras 1-3 anexas . El análisis se extendió a la consideración de modificaciones de secuencia dentro de cada uno de los epítopes R1-R3. Las variantes de secuencia fueron probadas para verificar la capacidad continua de unirse a MHC clase II y sus puntuaciones de unión en donde éstas permanecieron. Se definieron varias sustituciones de aminoácidos las cuales lograron la eliminación de la unión de MHC clase II con la mayoría de los alotipos MHC probados. Las sustituciones particulares identificadas fueron probadas más para verificar su capacidad para ser recibidas dentro del modelo estructural de la molécula de EPO [PDB ID: 1CN4; Syed, R. et al (1998) Nature 395 ; 511-516] . Las mutaciones designadas en los residuos seleccionados de la secuencia tipo silvestre se revisaron para verificar choques estéricos, la formación de enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y su acomodo general en la estructura. Las sustituciones que dieron origen a choques estéricos fueron eliminadas. Las sustituciones que fueron acomodadas cuando la cadena lateral adoptaba una configuración similar (rotámero) a la del residuo original se consideraron aceptables. Si más de una sustitución satisfacía estos criterios, se prefirieron los residuos que potencialmente forman enlaces de hidrógeno con cadenas laterales o átomos de estructura de base adyacentes, y/o forman contactos hidrofóbicos favorables u otras asociaciones. El procedimiento anterior se llevó a cabo de manera interactiva usando Swiss Prot Deep View v3.7 [Guex, N y Peitsch, M. C. (1997) Electrophoresis 18_: 2714-2723] . Este procedimiento dio como resultado un conjunto de sustitución preferido para cada una de las regiones de epítope R1-R3. Los conjuntos de sustitución fueron compilados para producir la estructura ilustrada en la figura 4. Se confirmó que todas las sustituciones daban como resultado la remoción de ligandos HC clase II dentro de cada una de las regiones de epítope R1-R3. Una estructura de ??? que contenía el conjunto de sustituciones más preferido de acuerdo con el esquema anterior se ilustra abajo y en la figura 4. APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENX1TTGCAEHCSX2NENITVPDTKV FYAWKRMEVGQ QAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV SSQPX3EPX4QX5HX6DKAVSGLRSLTTLLRALGAQ KEAISPPDAASAAPLRTITADTFR X7X8RX9X10SNXl:LX12RGKX13 LYTGEACRTGDR en donde XI = A pero G o P también se consideran; X2 = A pero D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y T también se consideran; X3 = T, pero A y G también se consideran; X* = A pero P, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y T también se consideran; X5 = A pero P, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y T también se consideran; X6 = A pero P, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y T también se consideran; X7 = T; X8 = A pero P y G también se consideran; X9 = T; X10 = P pero A y G también se consideran; XII = A pero P y G también se consideran; X12 = S pero A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R y T también se consideran; X13 = A pero D, E, G , H, K, N, P, Q, R, S y T también se consideran; y con lo cual simultáneamente X1 = I , X2 = L, X3 = W, X4 = L, X5 = L, X6 = V, X7 = I, Xs = F , X9 = V, X10 = Y, X11 = F, X12 = L y X13 = L son excluidos. Como una modalidad preferida se proporciona de acuerdo con la invención una molécula de EPO modificada, en donde X1 = A, X2 = A, X3 = T, X4 = A, X5 = A, X6 = A, X7 = T, Xs = A, X9 = T; X10 = P, X11 = A, X12 = S y X13 = A. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una molécula modificada que tiene la actividad biológica de eritropoyetina humana (EPO) y que es sustancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que cualquier molécula no modificada que tiene la misma actividad biológica en un individuo cuando se usa in vivo, caracterizada porque i) la pérdida de inmunogenicidad se logra al remover uno o más epítopes de células T derivados de la molécula originalmente no modificada y los epítopes de células T son ligandos MHC clase II o secuencias de péptidos que muestran la capacidad de estimular o unirse a células T por medio de su presentación sobre clase II, ii) la molécula modificada, cuando se prueba como una proteína entera en un ensayo biológico de proliferación de células T humanas, exhibe un índice de estimulación (SI) más pequeño que el de la molécula no modificada progenitora y más pequeño que 2.0, y iii) los epítopes de células T a ser removidos se localizan en hebras de residuos contiguos de la molécula de EPO originalmente no modificada, las hebras se seleccionan de: a) RVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVP, b) RGQALLWSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTL, c ) RTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRT . 2. La molécula de EPO modificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los epítopes de células T a ser removidos se localizan en las siguientes sub-hebras de las hebras a) , b) y e) : al ) AKEAENITTGCAEHCSLNENI ; a2) RGQALLVNSSQPWEPLQLHVD; a3) TFRKLFRVYSNFLRGKLKLYT . 3. La molécula de EPO modificada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los epítopes de células T a ser removidos se localizan en las hebras ilustradas en la tabla 1. . La molécula de EPO modificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque los epítopes de células T a ser removidos se localizan en 13 a 15 residuos consecutivos de cualquiera de las hebras. 5. La molécula de EPO modificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque los epítopes de células T han sido removidos mediante la sustitución de uno o más residuos de aminoácido dentro de las hebras. 6. Una molécula modificada que tiene la actividad biológica de eritropoyetina humana (EPO) y que es sustancialmente no inmunogénica o menos inmunogénica que cualquier molécula no modificada que tiene la misma actividad biológica en un individuo cuando se usa in vivo, caracterizada porque i) la pérdida de inmunogenicidad se logra al remover uno o más epítopes de células T derivados de la molécula originalmente no modificada y los epítopes de células T son ligandos MHC clase II o secuencias de péptidos que muestran la capacidad de estimular o unirse a células T por medio de su presentación sobre clase II, y ii) la molécula modificada tiene la secuencia de aminoácidos .- APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENX1TTGCAEHCSX2NENITVPDT V FYAWKRMEVGQ QAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPX3EPX4QX5HX6D AVSGLRSLTTLLRALGAQ KEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKX7XeRX9X10SNX11X12RG X13KLYTGEACRTGDR en donde X1 = A, G, P; X2 = A, D, E, G, H, K, N, p, Q, R, S y T; X3 = T, A y G; X4 = A, P, D, E, G, H, , N, P, Q, R, S y T; X5 = A, P, D, E, G, H, , N, P, Q, R, S y T; X6 = A, P, D, E, G, H, , N, P, Q, R, S y T; X7 = T; xe = A, P y G; x9 = T; X10 = P, A Y G; X11 = A, P y G; X12 = s, , D , E, G, H, K, N, P, Q, R y T ; x" = A, D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S y T ; y con lo cual simultáneamente X1 = I , X2 = L, X3 = W, X4 = L, X5 = L, X6 = V, X7 = I, XB = F, Xs = V, X10 = Y, X11 = F, X12 = L y X13 = L son excluidos. 7. La molécula de EPO modificada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque X1 = A, X2 = A, X3 = T, X4 = A, X5 = A, X6 = A, X7 = T, XB = A, X9 = ?,· X10 = P, X11 = A, X12 = S y X13 = A. 8. La molécula de EPO modificada de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizada porque la molécula, cuando se prueba como una proteína completa en un ensayo biológico de proliferación de células T, exhibe un índice de estimulación (SI) más pequeño que el de la molécula no modificada progenitora y más pequeño que 2. 9. Una molécula de ADN caracterizada porque codifica para la proteína de EPO modificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 10. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la molécula de EPO modificada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. 11. Una secuencia de péptidos que es parte de una molécula que tiene la actividad biológica de eritropoyetina humana (EPO) y que comprende uno o más epítopes de células T que son ligandos o secuencias MHC clase II que muestran la capacidad de estimular o unirse a células T por medio de su presentación sobre clase II, el péptido se caracteriza porque se selecciona del grupo que consiste en: a) RVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITV , b) RGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTL, c) RTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRT . 12. La secuencia de péptidos de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la secuencia es una sub-hebra de las hebras a) , b) y c) seleccionada de-, al) AKEAENITTGCAEHCSLNENI ; a2 ) RGQALLV SSQP EPLQLHVD ; a3 ) TFRKLFRVYSNFLRGKLKLYT . 13. La secuencia de péptidos de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la secuencia se selecciona de la tabla 1. 14. La secuencia de péptidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizada porque comprende 13 a 15 residuos de aminoácido consecutivos de cualquiera de las hebras. 15. La secuencia de péptidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizada porque exhibe, cuando se prueba en un ensayo biológico de proliferación de células T humanas, un Indice de estimulación (SI) mayor que 2.0. 16. La secuencia de péptidos modificada de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la modificación da como resultado la eliminación de epítopes de células T potenciales que son ligandos HC clase II mediante la sustitución de uno o más residuos de aminoácido, el péptido exhibe, cuando se prueba en un ensayo biológico de proliferación de células T humanas, un índice de estimulación (SI) más pequeño que 2.0, de preferencia 1.8. 17. Uso del péptido de conformidad con la reivindicación 16 en la fabricación de la molécula de EPO humana modificada de conformidad con la reivindicación 1. 1S. Una molécula de ADN caracterizada porque codifica para la secuencia de péptidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16. 19. Un método para construir un mapa de epítopes de células T de EPO humana al localizar epítopes de células T en EPO humana, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: i) estimulación de antígenos in vi tro usando inmunógenos de péptido sintéticos usando preparaciones de PBMC de muestras de donadores no emparentados que contienen relaciones fisiológicas de células T a células presentadoras de antígenos, ii) aplicación de esquemas computacionales que estimulen la unión del ligando de péptido con uno o más alotipos MHC para de esta manera analizar las regiones de epítopes identificadas en la etapa i) y de esta manera identificar ligandos MHC clase II dentro de las regiones de epí opes ,- ii) aplicación de esquemas computacionales que estimulen la unión del ligando de péptido con uno o más alotipos MHC para identificar análogos de secuencia de los ligandos MHC abarcados dentro de las regiones de epítopes que ya no se unan a MHC clase II o que se unan con afinidad reducida a un menor número de alotipos MHC, y opcionalmente iv) uso de ensayos de activación de células T inmaduras y péptidos sintéticos que abarquen completamente o en colección las regiones de epítopes identificadas dentro de la molécula de EPO y probar los análogos de secuencia en ensayos de activación de células T inmaduras en paralelo con las secuencias de EPO humana progenitoras . 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la localización de un epítope de células T específico se encuentra cuando un índice de estimulación (SI) de 2.0 o más se observa en al menos dos muestras de donadores independientes.