KR20030021178A - 신규 화합물 - Google Patents

Abstract

표 I에 나타낸 유전자의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드, 및 재조합 기술에 의해 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법을 개시한다. 또한, 표 I에 나타낸 유전자의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 진단 검정에 사용하는 방법을 개시하다.

Description

신규 화합물{New Compounds}

약품 개발 과정은 현재 "기능적 유전체학", 즉 고투여량 게놈- 또는 유전자 기재 생물학을 포함하면서 기본적 변혁을 겪고 있다. 치료적 표적으로 유전자 및 유전자 산물을 확인하기 위한 수단으로서 상기 접근법은 "위치상의 클로닝"을 기초로하는 초기 접근법을 급속히 교체하고 있다. 생물학적 기능 또는 유전적 질환인 표현형의 확인될 수 있으며, 이는 유전적 지도 위치에 기초하여 근원적 유전자를 다시 추적한다.

기능적 유전체학은 현재 이용가능한 많은 분자 생물학 데이타베이스로부터 얻은 잠재적으로 관심있는 유전자 서열을 확인하기 위하여 다양한 생물정보학(bioinformatics)의 도구 및 고투여량 DNA 서열분석 기술에 크게 의존한다. 약품 개발의 표적으로서 추가 유전자 및 이들과 연관된 폴리펩티드/단백질을 확인하고 특성화하기 위한 요구는 계속되고 있다.

천연적으로 혈액, 림프 및 다른 체액으로 분비되거나, 또는 세포막으로 분비되는 단백질 및 폴리펩티드는 제약 연구 및 개발에서 일차 관심의 대상이었다. 상기 관심의 이유는 작용 부위 (체액 또는 세포막)으로의 단백질 요법의 상대적 표적화가 용이하다는 것이다. 세포외 공간으로의 단백질의 방출을 위한 천연 경로는 진핵세포의 소포체 및 원핵세포의 내막이다 (Palade 1975, Science, 189, 347; Milstein, Brownlee, Harrison, and Mathews, 1972, Nature New Biol. 239, 117; Blobel, and Dobberstein, 1975, J. Cell. Biol., 67, 835). 한편, 단백질을 세포의 외부로부터 세포질로 방출하기 위한 천연 경로는 알려진 것이 없다 (단, 세포 내로의 뱀독소 침입의 기전인 음세포작용(pinocytosis)은 제외함). 따라서, 세포 내로의 단백질 치료법의 표적화는 극히 어렵다.

분비 및 막결합 단백질은 모든 펩티드 호르몬 및 이들의 수용체 (인슐린, 성장 호르몬, 케모카인, 사이토카인, 뉴로펩티드, 인테그린, 칼리크레인, 라미닌, 멜라닌, 나트륨이뇨 펩티드, 뉴롭신, 뉴로트로핀, 뇌하수체 호르몬, 플레이오트로핀, 프로스타글란딘, 세크레토그라닌, 셀렉틴, 트롬보글로불린, 티모신을 포함하나 이에 한정되지 않음), 유방 및 결장암 유전자 산물, 렙틴, 비만 유전자 단백질 및 이의 수용체, 혈청 알부민, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 스플라이세오솜(spliceosome) 단백질, 7TM (막통과) 단백질 (또한, G-단백질 커플링 수용체로 지칭됨), 면역글로불린, 세린 프로티나제의 다수 과 (혈액 응고 케스케이드의 단백질, 소화 효소를포함하나 이에 한정되지 않음), 데옥시리보뉴클레오제 I 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

FDA 또는 외국 기관에 의해 승인된 분비 또는 막결합된 단백질에 기초한 치료법은 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬, 융모막 성선 자극 호르몬, 난포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 칼시토닌, 부신피질자극 호르몬 (ACTH), 바소프레신, 인터류킨, 인터페론, 면역글로불린, 락토페린 (여러 회사에서 시판되는 다양한 제품), 조직형 플라스미노겐 활성화인자 (Genentech의 Alteplase), 하이아우로니다제 (Wyeth-Ayerst의 Wydase), 도르나제 알파 (Genentech의 Pulmozyme), 키모디악틴 (Knoll의 chymopapain), 알글루세라제 (Genzyme의 Ceredase), 스트렙토키나제 (Pharmacia의 Kabikinase) (Astra의 Streptase) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이는 분비 및 막결합 단백질이 치료 표적으로서 확립되고 증명된 역사를 갖는다는 것을 나타낸다. 명백하게, 당뇨병, 유방암, 전립선암, 결장암 및 다른 악성 종양, 고혈압 및 저혈압, 비만, 과식증, 거식증, 성장 이상, 천식, 조증, 치매, 섬망, 정신 지체, 헌팅톤병, 튜렛 증후군(Tourette's syndrome), 정신분열증, 성장, 정신 또는 성적 발달 장애, 및 뇌졸중에 이르게 하는 것을 포함하는 혈액 캐스케이드 시스템의 기능장애를 포함하나 이에 한정되지 않는 기능장애 또는 질환을 예방, 개선 또는 교정하는데 역할을 할 수 있는 추가 분비 및 막결합 단백질의 확인 및 특성화에 대한 요구가 있다. 신호 서열을 포함하는 본 발명의 단백질은 또한 현재 완전히 이해되지 않고 있는 단백질 수송의 기전을 더 명확하게 하는데 유용하고, 따라서 검색 도구로 사용될 수 있다.

본 발명은 새롭게 확인된 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 치료에 잠재적으로 유용할 수 있는 아고니스트(agonist), 길항제일 수 있는 화합물을 확인하고 진단하는 이들의 용도, 상기 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 또한 세포외 분비되거나 또는 막-연관 (이하, 종종 총체적으로 분비 단백질 또는 분비 폴리펩티드로 지칭함)되게하는 신호 서열을 갖는 단백질에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명은 재조합 물질 및 그 제조 방법을 포함하는, 표 I에 나타낸 유전자의 특정 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 표 III 및 V에 나타낸 질환을 포함하나 이에 한정되는 않는 일정 질환 (이하, "본 발명의 질환"으로 지칭함)의 치료 방법과 관련하여 중요하다. 추가 측면에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 물질을 이용하여 아고니스트(agonist) 및 길항제 (즉, 억제제)를 확인하는 방법, 및 확인된 화합물로 표 I에 나타낸 유전자의 폴리펩티드 및(또는) 폴리뉴클레오티드의 불균형과 연관된 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 표 I에 나타낸 유전자의 부적절한 활성 또는 수준과 연관된 질환을 검출하는 진단 검정법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 측면은 서열 목록에 나타낸 모든 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 서열 목록에 나타낸 모든 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드, 및 이를 제조하기 위한 재조합 물질 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 측면은 상기 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 용도는 본 발명의 유전자의 비정상 발현, 생성, 기능 및(또는) 기전에 의해 야기되는 질환, 이상 및 장애 (이하, 단순히 "질환"으로 지칭함)의 치료 방법을 포함하고, 상기 질환은 각 첨부된 서열에 대해 개시된 기타 단백질에 상동체로부터 당업자들에게 명백하다. 또 다른 측면에서,본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 물질을 사용하여 아고니스트 및 길항제를 확인하는 방법, 및 확인된 화합물로 불균형과 연관된 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 분비 단백질의 부적절한 활성 또는 수준과 연관된 질환을 검출하기 위한 진단 검정법에 관한 것이다.

발명의 설명

제1 측면에서, 본 발명은 표 I에 나타낸 유전자의 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는

(a) 서열 목록에 나타낸 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드 (본원에서 서열 목록의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭하는 경우, 서열 목록에 언급된 서열 목록을 또한 참조로 함);

(b) 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드;

(c) 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드;

(d) 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 단리된 폴리펩티드;

(e) 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드 서열; 및

(f) 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드 서열과 비교하여 0.95, 0.96, 0.97, 0.98 또는 0.99의 동일성 지수(Identity Index)를 갖는 폴리펩티드 서열을 갖거나 또는 포함하는 단리된 폴리펩티드;

(g) 상기 (a) 내지 (f)의 폴리펩티드의 단편 및 변종

을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 표 II에 나타낸 유전자 과의 일원인 것으로 여겨진다. 따라서, 이들은 표 III 및 IV에 나타낸 이유에 대하여 치료 및 진단적으로 중요하다. 표 I에 나타낸 유전자의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 생물학적 성질은 이하 표 I에 나타낸 유전자의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 "생물학적 활성"으로 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 표 I에 나타낸 유전자의 생물학적 활성 1 이상을 나타낸다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 모든 대립유전자 형태 및 스플라이스(splice) 변종을 포함하는, 상기 폴리펩티드의 변종을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 보존성 또는 비보전성일 수 있는 삽입, 결실 및 치환에 의해 대조 폴리펩티드, 또는 이의 조합과 달라진다. 특히 바람직한 변종은 임의의 조합으로 수개의, 예를 들면 50 내지 30, 30 내지 20, 20 내지 10, 10 내지 5, 5 내지 3, 3 내지 2, 2 내지 1 또는 1개의 아미노산이 삽입, 치환 또는 결실된 것이다.

본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 단편은 서열 목록에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 30, 50 또는 100개의 인접(contiguous) 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드, 또는 서열 목록에 나타낸 아미노산 서열로부터 절단 또는 결실된 적어도 30, 50 또는 100개의 인접 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함한다. 바람직한 단편은 유사한 활성 또는 개선된 활성을 갖거나, 또는 감소된 바람직하지 않은 활성을 갖는 것을 포함하는,표 I에 나타낸 유전자의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 생물학적 활성을 매개하는 생물학적 활성 단편이다. 또한 바람직한 것은 동물, 특히 인간에서 항원성 또는 면역원성인 단편이다.

본 발명의 폴리펩티드의 단편은 펩티드 합성에 의해 상응하는 전장(full-length) 폴리펩티드를 제조하기 위하여 이용될 수 있고, 따라서 이들의 변종은 본 발명의 전장 폴리펩티드를 제조하기 위한 중간체로 이용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 "성숙" 단백질의 형태일 수 있거나, 또는 전구체 또는 융합 단백질과 같은 더 큰 단백질의 부분일 수 있다. 분비성 또는 리더(leader) 서열, 전서열(prosequence), 정제를 돕는 서열, 예를 들면 히스티딘 잔기를 포함하는 추가 아미노산 서열, 또는 재조합 생산 도중 안정성을 위한 추가 서열을 포함하는 것이 종종 유리하다.

본 발명의 폴리펩티드는 모든 적당한 방법, 예를 들면 천연 발생원 또는 발현계를 포함하는 유전적으로 처리된 숙주 세포로부터의 단리 (하기 참조)에 의하거나, 또는 예를 들면 자동화 펩티드 합성화기를 사용한 화학적 합성법에 의하거나 또는 상기 방법의 조합에 의해 제조될 수 있다. 상기 폴리펩티드의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 표 I에 나타낸 유전자의 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는

(a) 서열 목록에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열 목록에 나타낸 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드;

(c) 서열 목록에 나타낸 폴리뉴클레오티드와 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드;

(d) 서열 목록에 나타낸 단리된 폴리뉴클레오티드;

(e) 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드;

(f) 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드;

(g) 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드;

(h) 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드;

(i) 서열 목록에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 0.95, 0.96, 0.97, 0.98 또는 0.99의 동일성 지수를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖거나 또는 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드;

(j) 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드 서열과 비교하여 0.95, 0.96, 0.97, 0.98 또는 0.99의 동일성 지수를 갖는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖거나 또는 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 및

상기 폴리뉴클레오티드의 단편 및 변종이거나, 또는 전체 길이체 걸쳐서 상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드의 바람직한 단편은 서열 목록에 나타낸 서열과 적어도 15, 30, 50 또는 100개의 인접 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 목록에 나타낸 서열로부터 절단 또는 결실된 적어도 30, 50 또는 100개의 인접 뉴클레오티드를 갖는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드의 바람직한 변종은 스플라이스 변종, 대립유전자 변종, 및 다형 (1 이상의 단일 염기 변이 (Single Nucleotide Polymorphism; SNP)를 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함함)을 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 서열 목록에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 임의의 조합으로 수개의, 예를 들면 50 내지 30, 30 내지 20, 20 내지 10, 10 내지 5, 5 내지 3, 3 내지 2, 2 내지 1 또는 1개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 첨가된 폴리펩티드 변종을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 DNA 서열의 RNA 전사물인 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 따라서,

(a) 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 RNA 전사물을 포함하거나;

(b) 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 RNA전사물이거나;

(c) 서열 목록에 나타낸 DNA 서열의 RNA 전사물을 포함하거나; 또는

(d) 서열 목록에 나타낸 DNA 서열의 RNA 전사물인

RNA 폴리뉴클레오티드, 및 이에 상보적인 RNA 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

서열 목록에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열은 표 II에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열과 상동성을 나타낸다. 서열 목록에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA 서열이다. 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드 코딩 서열과 동일하거나, 또는 유전적 코드의 중복성 (축퇴(degeneracy))로 인하여 또한 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는, 서열 목록에 나타낸 서열 이외의 서열일 수 있다. 서열 목록에 나타낸 서열의 폴리펩티드는 표 II에 나타낸 폴리펩티드와 상동성 및(또는) 구조적 유사성을 갖는, 표 II에 나타낸 유전자 과의 다른 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 특히 이들 상동성 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드와 유사한 생물학적 기능/성질을 갖는 것으로 예상된다. 나아가, 본 발명의 바람직한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 표 I에 나타난 유전자의 활성 1 이상을 갖는다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 표 IV에 나타낸 조직으로부터 얻은 mRNA에서 유도된 cDNA 라이브러리로부터 표준 클로닝 및 스크리닝 기술을 사용하여 얻을 수 있다 (예를 들면, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 참조). 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 게놈 DNA 라이브러리와 같은 천연원으로부터 얻을 수 있거나, 또는 공지되고 상업적으로 입수가능한 기술을 사용하여 합성할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 생산을 위하여 사용되는 경우, 폴리뉴클레오티드는 단독으로 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함하거나, 또는 리더 또는 분비성 서열, 프리-, 또는 프로- 또는 프리프로-단백질 서열, 또는 융합 펩티드 부분을 코딩하는 것과 같은 다른 코딩 서열과 함께 리딩 프레임 내에 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 마커 서열이 코딩될 수 있다. 본 발명의 상기 측면의 특정 바람직한 실시태양에서, 마커 서열은 pQE 벡터 (Qiagen, Inc.)에서 제공되고 문헌[Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86:821-824]에 기술된 것과 같은 헥사-히스티딘 펩티드이거나, 또는 HA 태그이다. 폴리뉴클레오티드는 또한 전사되는 비해독 서열, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호, 리보솜 결합 부위 및 mRNA를 안정화하는 서열과 같은 비코딩 5' 및 3' 서열을 포함할 수 있다.

서열 목록에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나, 또는 충분한 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 cDNA 및 게놈 DNA에 대한 혼성화 탐침으로, 또는 핵산 증폭 반응 (예: PCR)용 프라이머로 사용될 수 있다. 이러한 탐침 및 프라이머를 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 전장 cDNA 및 게놈 클론을 단리하고, 서열 목록에 나타낸 서열과 높은 서열 유사성, 통상적으로 95% 이상 동일성을 갖는 다른 유전자 (인간 기원의 파라로그(paralog) 및 다른 종 기원의 오르쏘로그(ortholog) 및 파라로그를 코딩하는 유전자를 포함함)의 cDNA 및 게놈 클론을 단리할 수 있다. 바람직한 탐침 및 프라이머는 15개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 30개 이상의 뉴클레오티드를 일반적으로 포함할 수 있으며, 50 내지 100개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 특히 바람직한 탐침은 30 내지 50개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 특히 바람직한 프라이머는 20 내지 25개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다.

다른 종 기원의 호모로그(homolog)를 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건하에서 서열 목록에 나타낸 서열 또는 이의 단편, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 라벨링된 탐침으로 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 및 서열 목록에 나타낸 폴리뉴클레오티드를 함유하는 전장 cDNA 및 게놈 클론을 단리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 이러한 혼성화 기술은 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 엄격한 혼성화 조건은 50% 포름아미드, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM 트리소듐 시트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.6), 5x덴하르트 용액(Denhardt's solution), 10% 덱스트란 술페이트 및 20 ㎍/ml 변성된 전단을 가한 연어 정자 DNA 를 포함하는 용액 중에서 42℃에서 밤새 배양하고; 이어서 여과물을 0.1xSSC로 약 65℃에서 세척하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 언격한 혼성화 조건하에서 서열 목록에 나타낸 서열 또는 이의 단편, 바람직하게는 15개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 라벨링된 탐침으로 라이브러리를 스크리닝하여 얻은 단리된 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 100개 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

당업자는 많은 경우 코딩 영역이 5' 말단을 통하여 모든 방향으로 확장되지 않는다는 점에서 단리된 cDNA 서열이 불완전할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이는 제1 가닥 cDNA 합성 도중 mRNA 주형의 DNA 사본을 완성하지 못하는, 본래 낮은 "가공성" (중합 반응 도중 효소가 주형에 부착된 채 남아 있는 능력의 척도)을 갖는 효소인 역 전사효소로 인한 것이다.

cDNA 말단의 급속 증폭 (Rapid amplication of cDNA ends; RACE)에 기초한 것 (예를 들면, 문헌[Frohman et al., Proc Nat Acad Sci USA 85, 8998-9002, 1988] 참조)과 같이 전장 cDNA를 얻거나, 짧은 cDNA를 연장하기 위해 여러 방법이 당업계에서 이용가능하고 공지되어 있다. 예를 들면 마라톤(Marathon(등록상표)) 기술 (Clontech Laboratories Inc.)의 예와 같은 근래 기술의 변형은 더 긴 cDNA에 대한 검색을 상당히 단순화하였다. 마라톤(등록상표) 기술에서, cDNA는 선택된 조직으로부터 추출된 mRNA 및 각 말단에 결찰된(ligated) "어댑터(adaptor)"서열로부터 제조된다. 이어서, 핵산 증폭 (PCR)을 수행하여 유전자 특이적이고 어댑터 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합을 사용하여 cDNA의 "결손된" 5' 말단을 증폭한다. 이어서, "포개어진(nested)" 프라이머, 즉 증폭된 상물 내에 어닐링되도록 고안된 프라이머 (통상적으로, 어댑터 서열에서 추가로 3'을 어닐링하는 어댑터 특이적 프라이머 및 알려진 유전자 서열을 추가로 5'을 어닐링하는 유전자 특이적 프라이머)를 사용하여 PCR을 반복한다. 본 반응의 생성물은 DNA 서열분석,및 완전 서열을 얻도록 생성물을 기존 cDNA에 직접 접합하거나 또는 5' 프라이머의 디자인에 대한 신규 서열 정보를 사용하여 별개 전장 PCR을 수행하는 것에 의해 구성된 전장 cDNA에 의해 분석될 수 있다.

본 발명의 재조합 폴리펩티드는 발현 시스템을 포함하는 유전적으로 처리된 숙주 세포로부터 당업계에 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 또는 발현 시스템으로 숙주 세포를 유전적으로 처리하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 시스템, 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 무세포 해독 시스템을 이용하여 본 발명의 DNA 구성으로부터 유도된 RNA를 사용하여 상기 단백질을 제조할 수 있다.

재조합 생산용으로, 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 위한 발현 시스템 또는 이의 일부를 도입하도록 유전적으로 처리될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 많은 표준 연구실 매뉴얼, 예를 들면 문헌[Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) 및 Sambrook et al.(ibid).]에 기술된 방법에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 바람직한 방법은 예를 들면, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 트랜스벡션(transvection), 미세주입, 양이온성 지질 매개 트랜스펙션, 일렉트로포레이션, 트랜스덕션, 스크레이프 로딩, 탄도(ballistic) 도입 또는 감염을 포함한다.

적합한 숙주의 대표적 예로는 스트렙토코커스종(Streptococci), 스타필로코커스종(Staphylococci), 이. 콜라이(E.coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포와 같은 세균 세포; 효모 세포 및 아스페르길루스(Aspergillus) 세포와 같은 곰팡이 세포; 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9 세포와 같은 곤충 세포; CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 및 바우스 흑색종(Bowes melanoma) 세포와 같은 동물 세포; 및 식물 세포를 들 수 있다.

염색체, 에피솜 및 바이러스 유래 시스템, 예를 들면 세균 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 효소 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 요소, 바이러스 (예를 들면, 바쿨로바이러스, 파포바 바이러스(예: SV40), 우두 바이러스, 아데노바이러스, 계두(fowl pox) 바이러스, 위광견병(pseudorabies) 바이러스 및 레트로바이러스)로부터 유래한 벡터, 및 이의 조합으로부터 유래한 벡터 (예를 들면, 플라스미드 및 박테리오파지 유전 요소(예: 코스미드 및 파게미드))로부터 유래한 것)와 같은 매우 다양한 발현 시스템을 사용할 수 있다. 발현 시스템은 발현을 조절할 뿐만 아니라 초래하는 조절 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 숙주에서 폴리펩티드를 생산하기 위하여 폴리뉴클레오티드를 유지, 증식 또는 발현할 수 있는 모든 시스템 또는 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 폴리뉴클레오티드 서열은 모든 다양한 공지되고 통상적인 기술, 예를 들면 문헌[Sambrook et al., (ibid).]에 나타난 것과 같은 기술에 의해 발현 시스템 내로 삽입될 수 있다. 적합한 분비 신호가 목적 폴리펩티드 내로 도입되어 해독된 단백질이 소포체의 관강, 세포외 환경의 주변세포질 공간으로 분비되게할 수 있다. 이들 신호는 폴리펩티드에 대해 내생일 수있거나, 이들이 이종 신호일 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드가 스크리닝 검정에 사용되도록 발현되어야 한다면, 일반적으로 폴리펩티드가 세포의 표면에서 생산되는 것이 바람직하다. 이러한 경우, 세포는 스크리닝 검정에서 사용되기 앞서 수확될 수 있다. 폴리펩티드가 배지 내로 분비된다면, 폴리펩티드를 회수하고 정제하기 위하여 배지를 회수할 수 있다. 세포내적으로 생산된다면, 폴리펩티드를 회수하기 전 세포를 먼저 용해(lysis)하여야 한다.

본 발명의 폴리펩티드는 암모늄 술페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 히드록실아페타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯한 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양으로부터 회수 및 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 고성능 액체 크로마토그래피가 정제를 위하여 이용된다. 폴리펩티드가 세포내 합성, 단리 및(또는) 정제 도중 변성된 경우 단백질 재주름형성을 위한 공지된 기술을 이용하여 활성 입체구조를 재생할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 연관 유전자에서 돌연변이를 검출하는 것을 통하여 진단 시약으로 사용될 수 있다. 유전자의 돌연변이 형태의 검출은 cDNA 또는 게놈 서열에서 서열 목록에 나타내고, 기능장애와 연관된 폴리뉴클레오티드에 의해 특징지워진다. 이는 유전자의 부족한 발현, 과발현 또는 변화된 공간적 또는 시간적 발현으로 인한 질환 또는 질환에 대한 감수성의 진단에 첨가되거나 또는 명확히할 수 있는 진단 도구로 제공될 수 있다. 유전자에 돌연변이를 지닌 개체는 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출될 수 있다.

진단용 핵산은 혈액, 소변, 타액, 조직 생검 또는 부검 물질과 같은 대상의 세포로부터 얻을 수 있다. 게놈 DNA는 검출용으로 직접사용될 수 있거나, 분석에 앞서 PCR, 바람직하게는 RT-PCR 또는 다른 증폭 기술을 사용하는 것에 의해 효소적으로 증폭될 수 있다. RNA 또는 cDNA는 또한 유사한 양식으로 사용될 수 있다. 결실 및 삽입은 정상 표현형과 비교하여 증폭된 생성물의 크기의 변화에 의해 검출될 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 표 I에 나타낸 유전자의 라벨링된 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 것에 의해 확인될 수 있다. 바람직하게 짝지워진 서열은 잘못 짝지워진 듀플렉스로부터 RNase 소화에 의하거나, 또는 용융 온도의 차이에 의해 구별될 수 있다. DNA 서열 차이는 또한 변성화제와 함께 또는 변성화제 없이 겔에서의 DNA 단편의 전기영동 이동에서의 변화에 의하거나, 또는 직접 DNA 서열분석 (예를 들면, 문헌[Myers et al., Science (1985) 230:1241] 참조)에 의해 검출될 수 있다. 특정 위치에서의 서열 변화는 또한 RNase 및 S1 보호와 같은 뉴클라제 보호 검정, 또는 화학적 분해(cleavage) 방법 (문헌[Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85:4397-4401] 참조)에 의해 밝힐 수 있다.

표 I에 나타낸 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 올리고뉴클레오티드 탐침의 배열(array)을 작성하여 예를 들면, 유전적 돌연변이의 효율적 스크리닝을 수행할 수 있다. 이러한 배열은 바람직하게는 고밀도 배열 또는 그리드(grid)이다. 배열 기술 방법은 공지되어 있으며 일반적 이용가능성을 가지고, 유전자 발현, 유전적 연결 및 유전적 변이성을 비롯한 분자 유전학의 여러 문제를 다루기 위하여 사용될 수 있다 (예를 들면, 문헌[M.Chee et al., Science, 274, 610-613 (1996)] 및 본원에 이용된 다른 참고문헌 참조).

비정상적으로 감소 또는 증가된 수준의 폴리펩티드 또는 mRNA 발현의 검출은 또한 본 발명의 질환에 대한 대상의 감수성을 진단 또는 측정하기 위해 사용될 수 있다. 감소 또는 증가된 발현은 핵산 증폭, 예를 들면 PCR, RT-PCR, RNase 보호, 노던 블롯(Northern blotting) 및 다른 혼성화 방법과 같은 폴리뉴클레오티드의 정량화에 대해 당업계에 공지된 모든 방법을 사용하여 RNA 수준에서 측정될 수 있다. 숙주로부터 유래한 샘플에서 본 발명의 폴리펩티드와 같은 단백질의 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있는 검정 기술은 당업자들에게 공지되어 있다. 이러한 검정 방법으로는 방사성-면역검정, 경쟁적-결합 검정, 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA 분석을 들 수 있다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은

(a) 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 서열 목록에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 RNA 전사물;

(b) 상기 (a)에 상보적인 뉴클레오티드 서열;

(c) 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드, 또는 이의 단편; 또는

(d) 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 서열 목록에 나타낸 폴리펩티드에 대한 항체를 포함하는 진단 키트에 관한 것이다.

임의의 상기 키트에서, (a), (b), (c) 또는 (d)는 실질적 요소를 포함할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 키트는 다른 것 중에서 질환 또는 질환에 대한 감수성, 특히 본 발명의 질환을 진단하는데 유용할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 염색체 위치 연구에서 유용하다. 서열 목록에 나타낸 서열은 개별 인간 염색체에 특이적으로 표적화되고, 상기의 특정 위치와 혼성화될 수 있다. 본 발명에 따른 염색체의 관련 서열의 매핑(mapping)은 이들 서열을 유전자 연관 질환과 상호관련시키는데 중요한 제1 단계이다. 일단 서열이 정확한 염색체 위치에 매핑되면, 염색체 상의 서열의 물리적 소재는 유전적 지도 데이타와 상호관련시킬 수 있다. 이러한 데이타는 예를 들면[V.McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins University Welch Medical Library를 통하여 온라인으로 이용가능)]에서 발견된다. 이어서, 동일 유전자 영역에 매핑된 유전자 및 질환의 관계는 연관 분석 (물리적으로 인접한 유전자의 공동유전성)을 통하여 확인된다. 게놈 서열 (유전자 단편 등)에 대한 정확한 인간 염색체 국재화는 방사성 하이브리드 (RH) 매핑 (Walter, M. Spillett, D., Thomas, P., Weissenbach, J., and Goodfellow, P., (1994) A method for constructing radiation hybrid maps of whole genomes, Nature Genetics 7, 22-28)을 사용하여 측정할 수 있다. GeneBridge4 RH 패널 (Hum Mol Genet 1996 Mar; 5(3):339-46 A radiation hybrid map of the human genome. Gyapay G, Schmitt K, Fizames C, Jones H, Vega-Czarny N, Spillett D, Muselet D, Prud'Homme JF, Dib C, Auffay C, Morissette J, Weissenbach J, Goodfellow PN)와 같이 리서치제네틱스(Research Genetics; Huntsville, AL, USA)로부터 여러 RH 패널이 입수가능하다. 상기 패널을 사용하여 유전자의 염색체 위치를 측정하기 위하여, RH DNA 상의 목적 유전자로부터 고안된 프라이머를 사용하여 93 PCR을 수행한다. 이들 각각의 DNA는 햄스터 배경 (인간/햄스터 하이브리드 세포주)에서 유지되는 무작위 인간 게놈 단편을 포함한다. 이들 PCR 결과로 93점을 얻고 이는 목적 유전자의 PCR 산물의 존재 또는 부재를 나타낸다. 이들 점수를 공지된 위치의 게놈 서열로부터 얻은 PCR 산물을 사용하여 생성된 점수와 비교한다. 상기 비교는 http://www.genome.wi.mit.edu/에서 수행한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 조직 발현 연구에 유용한 도구이다. 이러한 연구는 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 검출하는 것에 의해 조직에서 상기 코딩되는 폴리펩티드의 발현 패턴에 대해 지적할 수 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현 패턴의 측정을 가능하게 한다. 사용되는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, cDNA 미세정렬 혼성화 (Schena et al, Science, 270, 467-470, 1995 및 Shalon et al, Genome Res, 6, 639-645, 1996)와 같은 그리드 상에 정렬된 클론에 대한 제자리(in situ) 혼성화 기술, 및 PCR과 같은 뉴클레오티드 증폭 기술을 포함한다. 바람직한 방법은 펄킨 엘머(Perkin Elmer)로부터 입수가능한 TAQMAN (등록상표) 기술을 사용한다. 이들 연구로부터 얻은 결과는 유기체에서 폴리펩티드의 정상 기능을 지적해줄 수 있다. 또한, mRNA의 정상 발현 패턴과 동일 유전자의 별도 형태에 의해 코딩되는 mRNA (예를 들면, 폴리펩티드 코딩 능력의 변화 또는 조절 돌연변이를 갖는 것)의 발현 패턴의 비교 연구는 본 발명의 폴리펩티드의 역할또는 질환에서 이의 부적합한 발현의 역할에 대한 유용한 식견을 제공할 수 있다. 이러한 부적합한 발현은 시간적, 공간적 또는 단순히 정량적 성질일 수 있다.

본 발명의 추가 측면은 항체에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편, 또는 이를 발현하는 세포는 본 발명의 폴리펩티드에 대해 면역특이적인 항체를 제조하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. "면역특이적"이라는 용어는 항체가 선행 문헌의 다른 관련 폴리펩티드에 대한 친화도보다 본 발명의 폴리펩티드에 대해 실질적으로 더 큰 친화도를 갖는다는 것을 의미한다.

본 발명의 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 폴리펩티드 또는 에피토프를 지닌 단편, 또는 세포를 동물, 바람직하게는 인간이 아닌 동물에 통상적인 프로토콜을 사용하여 투여하는 것에 의해 얻을 수 있다. 단일클론 항체의 제조를 위하여, 연속 세포주 배양에 의해 생상되는 항체를 제공하는 모든 기술을 사용할 수 있다. 예로는 하이브리도마 기술 (Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256:495-497), 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)를 들 수 있다.

미국 특허 재4,946,778호에 기술된 것과 같은 단쇄 항원을 제조하기 위한 기술은 또한 본 발명의 폴리펩티드에 대한 단쇄 항체를 제조하기 위해 적응될 수 있다. 또한, 다른 포유동물을 포함하여, 트랜스제닉 생쥐 또는 다른 유기체를 사용하여 인간화(humanized) 항체를 사용할 수 있다.

상기 항체는 이용하여 폴리펩티드를 발현하는 클론을 단리하거나 또는 확인하거나, 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는 또한 다른 것 중에서 본 발명의 질환을 치료하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 또한 백신으로 사용될 수 있다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 개체가 이미 질환에 걸렸거나 걸리지 않았거나 간에 동물을 질환으로부터 보호하기 위하여 항체 및(또는) T 세포 (예를 들면, 사이토카인-생성 T 세포 또는 세포독성 T 세포를 포함함) 면역 반응을 생성하기 적합한, 본 발명의 폴리펩티드로 포유동물을 접촉하는 것을 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 포유동물에서 면역 반응은 또한 항체를 생성하기 위한 면역 바응을 유도하여 동물을 본 발명의 질환으로부터 보호하기 위하여 폴리뉴클레오티드의 발현에 관한 것이고, 생체내에서 폴리펩티드를 위하여 코딩하는 벡터를 통하여 본 발명의 폴리펩티드를 송달하는 것을 포함하는 방법에 의해 유도될 수 있다. 벡터를 투여하는 한가지 방법은 입자 상의 코팅 또는 다른 방법으로 이를 목적하는 세포 내로 촉진하는 것에 의한 것이다. 이러한 핵산 벡터는 DNA, RNA, 변형된 핵산 또는 DNA/RNA 하이브리드를 포함할 수 있다. 백신을 사용하기 위하여, 폴리펩티드 또는 핵산 벡터는 통상적으로 백신 제제 (조성물)로 제공될 수 있다. 제제는 적합한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 위에서 분해될 수 있기 때문에, 비경구적으로 (예를 들면, 경피, 근육내, 정맥내 또는 피부내 주사) 투여하는 것이 바람직하다. 비경구 투여에 적합한 제제로는 산화방지제, 완충액, 진균제(bacteriostats) 및 제제를 수용체의 혈액과 등장이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 무균 주사 용액; 및 현탁화제 또는 점증화제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 무균 현탁액을 들 수 있다. 제제는 단일 용량 또는 다회 용량 컨테이너 (예: 봉인된 앰퓰 및 바이알)에 존재할 수 있고, 사용 직전 무균 액상 담체의 첨가만을 요하는 동결 건조 조건에 저장될 수 있다. 백신 제제는 또한 수중유형 시스템 및 당업계에 공지된 다른 시스템과 같은 제제의 면역원성을 증강시키기 위한 아주반트(adjuvant) 시스템을 포함할 수 있다. 용량은 백신의 특이적 활성에 의존할 수 있고, 통상적 실험에 의해 용이하게 측정될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 1 이상의 질환 상태, 특히 상기 언급한 본 발명의 질환에 관련된 1 이상의 생물학적 기능을 갖는다. 이는 폴리펩티드의 기능 또는 수준을 자극 또는 억제하는 화합물을 확인하는데 유용하다. 따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드의 기능 또는 수준을 자극 또는 억제하는 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 언급한 바와 같은 본 발명의 질환을 치료 및 예방할 목적으로 이용될 수 있는 아고니스트 또는 길항제를 확인한다. 다양한 원천, 예를 들면 세포, 무세포 제제, 화학적 라이브러리, 화합물의 콜렉션 및 천연 산물 혼합물로부터 화합물이 확인될 수 있다. 이와 같이 확인된 아고니스트 또는 길항체는 폴리펩티드; 이의 구조 또는 기능적 모방체 (문헌[Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2); Chapter 5 (1991)] 참조) 또는 소분자의 경우와 같을 수 있는 천연 또는 변형된 기질(substrate), 리간드, 수용체, 효소 등일 수 있다. 이러한 소분자는 바람직하게는 2,000 달톤 미만, 더욱 바람직하게는 300 내지 1,000 달톤, 가장 바람직하게는 400 내지 700 달톤의 분자량을 갖는다. 이들 소분자는 유기 분자인 것이 바람직하다.

스크리닝 방법은 후보 화합물이 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드를 갖는 세포 또는 막, 또는 이의 융합 단백질에 후보 화합물과 직접 또는 간접적으로 연관된 라벨에 의한 결합을 단순히 측정할 수 있다. 별법으로, 스크리닝 방법은 라벨링된 경쟁물 (예: 아고니스트 또는 길항제)에 대하여 후보 화합물의 폴리펩티드에 대한 경쟁적 결합을 측정 또는 검출 (정성적 또는 정량적으로) 하는 것을 포함할 수 있다. 나아가, 이들 스크리닝 방법은 후보 화합물이 폴리펩티드를 갖는 세포에 대한 적합한 검출 시스템을 사용하여 폴리펩티드의 활성화 또는 억제에 의해 발생되는 신호를 일으키던지 간에 시험할 수 있다. 활성화의 억제제는 일반적으로 공지된 아고니스트의 존재하에 검정되고, 후보 화합물의 존재에 의한 아고니스트에 의한 활성화에 대한 효과가 관찰된다. 나아가, 스크리닝 방법은 후보 화합물을 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 용액과 단순히 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계, 혼합물 중의 표 I에 나타낸 유전자의 활성을 측정하는 단계, 및 표 I에 나타낸 유전자의 혼합물을 후보 화합물을 함유하지 않는 대조 혼합물과 활성을 비교하는 단계를 단순히 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 통상적인 저용량 스크리닝 방법 및 또한 고처리량 스크리닝 (HTS) 형식으로 이용될 수 있다. 이러한 HTS 형식은 확립된 96-웰, 및 보다 근래에는 384-웰 마이크로타이터 플레이트의 사용 뿐만 아니라 문헌[Schulleket al, Anal Biochem., 246,20-29, (1997)]에 기술된 나노웰(nanowell) 방법과 같은 최근의 방법을 포함한다.

상기 기술한 바와 같은 표 I에 나타낸 유전자의 폴리펩티드 및 Fc 부분으로부터 제조한 것과 같은 융합 단백질은 또한 본 발명의 폴리펩티드에 대한 길항제를 확인하기 위한 고처리량 스크리닝 검정에 사용될 수 있다 (문헌[D.Bennett et al., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); and K. Johanson et al., J. Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995)] 참조).

본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 또한 세포 중 mRNA 및 폴리펩티드의 생산에 대한 첨가된 화합물의 효과를 검출하기 위한 스크리닝 방법을 구성할 수 있다. 예를 들면, ELISA 검정은 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 사용하여 분비 또는 세포 연관된 폴리펩티드의 수준을 측정하기 위해 구성될 수 있다. 이를 사용하여 적절하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 폴리펩티드의 생산을 억제 또는 증강시킬 수 있는 제제 (또한 각각 길항제 또는 아고니스트로 지칭됨)를 발견할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 당업계에 공지된 표준 수용체 결합 기술을 통하여 막결합 또는 (존재하는 경우) 가용성 수용체를 학인할 수 있다. 이는 폴리펩티드가 방사성활성 동위원소 (예:¹²⁵I)로 라벨링되거나, 화학적으로 변형 (예: 비오티닐화)되거나, 또는 검출 또는 정제에 적합한 펩티드 서열에 융합되고 추정 수용체의 원천 (세포, 세포막, 세포 상층액, 조직 추출물, 체액)과 인큐베이션되는리간드 결합 및 가교결합 검정을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 방법으로는 표면 플라스몬 공명 및 분광분석법과 같은 생물물리적 기술을 들 수 있다. 이들 스크리닝 방법을 사용하여 또한 존재하는 경우 그 수용체에 대한 폴리펩티드의 결합과 경쟁하는 폴리펩티드의 아고니스트 및 길항제를 확인할 수 있다. 상기 검정을 수행하기 위한 표준 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드의 길항제의 예로는 항체, 또는 일부 경우 폴리펩티드의 경우와 같을 수 있는, 리간드, 기질, 수용체 효소 등과 밀접히 관련된 올리고뉴클레오티드 또는 단백질, 예를 들면 리간드, 기질, 수용체, 효소 등의 단편; 또는 폴리펩티드의 활성이 예방되도록, 반응을 유발하지는 않으나 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 소분자를 들 수 있다.

스크리닝 방법은 또한 트랜스제닉 기술 및 표 I에 나타낸 유전자를 사용하는 것을 포함한다. 트랜스제닉 동물을 구성하는 분야는 확립되어 있다. 에를 들면, 표 I에 나타낸 유전자는 수정된 난모세포의 남성 생식핵으로 미세주입(microinjection), 착상전 또는 착상후 배 내로 레트로바이러스 전달, 또는 일렉트로포레이션에 의한 것과 같이 유전적으로 변형된 배아 줄기 세포의 숙주 낭포 내로의 주입을 통하여 도입될 수 있다. 특히 유용한 트랜스제닉 동물은 동물 유전자가 동물 게놈 내의 인간 등가물에 의해 대체된, 이른바 "녹-인(knock-in)" 동물이다. 녹-인 트랜스제닉 동물은 화합물이 인간 표적에 대해 특이적인 표적 확인용으로 약물 개발 과정에서 유용하다. 다른 유용한 트랜스제닉 동물은 세포에서 내생 DNA 서열에 의해 코딩되고 본 발명의 폴리펩티드의 동물 오르쏘로그의 발현이부분적으로 또는 완전히 소멸된, 이른바 "녹-아웃(knock-out)" 동물이다. 유전자 녹-아웃은 특이적 세포 또는 조직에 표적화될 수 있거나, 기술의 한정의 결과로서 특정 세포 또는 조직에서만 발생할 수 있거나, 또는 동물의 모든, 또는 실질적으로 모든 세포에서 발생할 수 있다. 트랜스제닉 동물 기술은 또한 본 발명의 폴리펩티드 많은 양을 얻도록 도입된 유전자가 발현되는 전체 동물 발현-클로닝 시스템을 제공한다.

상기 방법에 사용되는 스크리닝 키트는 본 발명의 추가 측면을 형성한다. 상기 스크리닝 키트는 다음을 포함한다:

(a) 본 발명의 폴리펩티드;

(b) 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포;

(c) 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 세포막; 또는

(d) 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체

(여기서, 폴리펩티드는 바람직하게는 서열 목록에 나타낸 것임).

임의의 상기 키트에서 (a), (b), (c) 또는 (d)는 실질적 요소를 포함할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

<용어>

하기 정의는 본원에 종종 사용되는 특정 용어의 이해를 용이하게 하기 위한 것이다.

본원에 사용된 "항체"는 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 키메릭, 단쇄, 및인간화 항체 뿐만 아니라 Fab 또는 다른 면역글로불린 발현 라이브러리의 산물을 비롯한 Fab 단편을 포함한다.

"단리된"은 천연 상태로부터 "인간의 손에 의해" 변경된 것, 즉 천연에서 발생되는 경우 최초 환경으로부터 변화 및(또는) 제거되었음을 의미한다. 예를 들면, 생존 유기체에 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니나, 천연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는, 본원에 사용된 용어와 같이, "단리된" 것이다. 나아가, 형질전환(transformation), 유전적 조작 또는 모든 다른 재조합 방법에 의해 유기체 내로 도입된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 유기체가 생존할 수 있거나 생존할 수 없거나 간에 상기 유기체에 여전히 존재할지라도 "단리된" 것이다.

"분비된 단백질 활성 또는 분비된 폴리펩티드 활성" 또는 "분비된 단백질 또는 분비된 폴리펩티드의 생물학적 활성"은 유사한 활성 또는 개선된 활성 또는 감소된 바람직하지 않은 부작용과 함께 이들 활성을 포함하는 상기 분비된 단백질의 대사적 또는 물리적 기능을 지칭한다. 또한, 상기 분비된 단백질의 항원성 및 면역원성 활성을 포함한다.

"분비된 단백질 유전자"는 첨부된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 대립유전자 변종 및(또는) 이의 상보물 모두를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

"폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 변형되지 않았거나 또는 변형된 RNA 또는 DAN일 수 있는 모든 폴리리보뉴클레오티드(RNA) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNA)를 지칭한다. "폴리뉴클레오티드"는 한정됨이 없이 단일- 또는 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥, 또는 더욱 전형적으로는 이중 가닥, 또는 단일- 및 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 및 DNA 모두를 포함하는 3중 가닥 영역을 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 또한 안정성 또는 다른 이유로 골격이 변형된 DNA 또는 RNA, 및 1 이상의 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는 예를 들면 트리틸화 염기 및 이노신과 같은 비통상적인 염기를 포함한다. DNA 및 RNA에는 여러 변형을 가할 수 있고, 따라서 "폴리뉴클레오티드"는 천연에서 통상적으로 발견되는 것과 같은 폴리뉴클레오티드의 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태 뿐만 아니라 바이러스 및 세포의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다. "폴리뉴클레오티드"는 또한 종종 올리고뉴클레오티드로 지칭되는 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

"폴리펩티드"는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합 (즉, 펩티드 이소스테어(isostere))에 의해 서로 연결된 2 이상의 아미노산을 포함하는 모든 폴리펩티드를 지칭한다. "폴리펩티드"는 단쇄 (통상적으로, 펩티드, 올리고펩티드 또는 올리고머로 지칭됨) 및 장쇄 (일반적으로 단백질로 지칭됨)를 모두 지칭한다. 폴리펩티드는 20개의 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있다. "폴리펩티드"는 천연적 방법 (예: 후해독 가공)에 의하거나, 또는 당업계에 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변경된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변형은 교과서에 잘 기술되어 있으며, 더욱 상세하게는 전공 논문 뿐만 아니라 방대한 연구 문헌에 기술되어 있다. 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함하여 폴리펩티드 어디에서나 발생할 수 있다. 동일 유형의 변형이 주어진 폴리펩티드 중의 여러 부위에서 동일 또는 다양한 정도로 존재할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 많은 유형의 변형을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 유비퀴틴화(ubiquitination)의 결과로 분지될 수 있거나, 이들은 분지가 있거나 없는 시클릭일 수 있다. 시클릭, 분지 및 분지된 시클릭 폴리펩티드는 천연 후해독 과정에서 기인할 수 있거나, 또는 합성법에 의해 제조될 수 있다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-라이보실화, 아미드화, 비오틴화, 플라빈의 공유 부착, 헴(heme) 부분의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교결합, 사이클화, 디술피드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커(anchor) 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질 가수분해 가공, 포스포릴화, 프레닐화, 라세미화, 셀레오일화, 황화, 아르기닐화와 같이 아미노산의 단백질에 대한 전달-RNA 매개 첨가 및 유비퀴틴화를 포함한다 (예를 들면, 문헌[Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12, in Post-translational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed.,Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990] 및 [Rattan et al., "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci, 663,48-62, 1992] 참조).

폴리펩티드 서열의 "단편"은 대조 서열보다 짧으나 대조 폴리펩티드와 본질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 유지하는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드 서열의 "단편"은 서열 목록에 나타낸 대조 서열보다 짧은 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

"변종"은 대조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 상이하나, 이의 본질적 성질을 유지하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 전형적인 변종은 대조 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 서열이 상이하다. 변종의 뉴클레오티드 서열에서의 변화는 대조 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시킬 수 있거나 또는 변경시킬 수 없다. 뉴클레오티드 변화는 하기 논의되는 바와 같이 아미노산 치환, 첨가, 결실, 대조 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드에서의 융합 및 절단을 일으킬 수 있다. 폴리펩티드의 전형적인 변종은 대조 폴리펩티드와 아미노산 서열이 상이하다. 일반적으로, 대조 폴리펩티드 및 변종의 서열이 전반적으로 밀접히 유사하고 많은 영역에서 동일하도록 변화는 제한적이다. 변종 및 대조 폴리펩티드는 1 이상의 치환, 삽입, 결실의 모든 조합으로 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 치환 또는 삽입된 아미노산 잔기는 유전적 코드에 의해 코딩될 수 있거나 코팅될 수 없다. 전형적인 보존적 치환은 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe 및 Tyr을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 변종은 대립유전자와 같이 천연적으로 발생할 수 있거나, 또는 천연적으로 발생한다고 알려지지 않은 변종일 수 있다. 천연적으로 발생하지 않은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 변종은 돌연변이발생 기술에 의하거나 또는 직접 합성에 의해 제조할 수 있다. 또한, 변종으로는 글리코실화, 포스포릴화, 메틸화, ADP 라이보실화 등과 같은 1 이상의 후해독 변경을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다. 실시태양으로는 N-말단 아미노산의 메틸화, 세린 및 트레오닌의 포스포릴화 및 C-말단 글리신의 변경을 들 수 있다.

"대립유전자"는 게놈의 주어진 위치에서 발생하는 유전자의 2 이상의 별도 형태 중 하나를 지칭한다.

"다형"은 집단 내의 게놈 중의 주어진 위치에서 뉴클레오티드 서열 (및 적절한 경우 코딩되는 폴리펩티드 서열)에서의 변이를 지칭한다.

"단일 염기 변이" (SNP)는 집단 내의 게놈 중의 단일 뉴클레오티드 위치에서의 뉴클레오티드 변이성의 발생을 지칭한다. SNP는 유전자 내에서, 또는 게놈의 유전자간 영역에서 발생할 수 있다. SNP는 대립유전자 특이적 증폭 (Allele Specific Amplification; ASA)를 사용하여 검정할 수 있다. 3 이상의 프라이머가 필요한 과정에 대하여, 검정되는 다형에 대한 역 상보물에서 공통적 프라이머가 사용된다. 상기 공통적 프라이머는 50 내지 1500 bps의 다형성 염기일 수 있다. 다른 2개 (또는 그 이상)의 프라이머는 다형을 이루는 2개 (또는 그 이상)의 대립유전자 중 1개를 잇기 위한 최종 3' 염기 우블(wobble)을 제외하고는 서로 동일하다. 각각 공통적 프라이머 및 대립유전자 특이적 프라이머 하나를 사용하여 2회 (또는 그 이상) PCR 반응을 수행한다.

본원에서 사용된 "스플라이스 변종"은 동일한 게놈 DNA 서열로부터 초기 전사되나 별도 RNA 스플라이싱을 거친 RNA 분자로부터 제조된 cDNA 분자를 지칭한다. 제1 RNA 전사물이 일반적으로 인트론의 제거를 위한 스플라이싱을 겪는 경우 별도 RNA 스플라이싱이 일어나고, 이는 각각 상이한 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 1 보다 많은 mRNA 분자를 제조하게 된다. 용어 스플라이스 변종은 또한 상기 cDNA 분자에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다.

"동일성"은 서열을 비교하는 것에 의해 측정되는, 2 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 간의 관계를 반영한다. 일반적으로, 동일성은 비교되는 서열의 길이에 걸쳐 각각 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 일치를 지칭한다.

"% 동일성" - 정확히 일치하지 않는 서열에 대하여 "% 동일성"이 측정될 수 있다. 일반적으로, 비교되는 2개의 서열을 정렬하여 서열 간에 최대 상관성을 얻는다. 이는 1개 또는 모든 서열에 "갭(gap)"을 삽입하여 정렬도를 증가시키는 것을 포함한다. % 동일성은 동일 또는 매우 유사한 길이의 서열에 대해 특히 적합한 비교되는 서열 각각의 전체 길이에 걸쳐 측정될 수 있거나 (이른바 전체 정렬), 또는 같지 않은 길이의 서열에 더욱 적합한 더 짧고 한정된 길이에 걸쳐 측정될 수있다 (이른바 국소 정렬).

"유사성"은 2개의 폴리펩티드 서열 간의 관계의 추가의 더욱 복잡한 척도이다. 일반적으로 "유사성"은 비교되는 서열 각각의 잔기 쌍 간의 (동일성에 대한) 정확한 일치 뿐만 아니라 정확한 일치가 존재하지 않는 경우 진화적 기준에서 한 잔기가 다른 것으로 치환되었을 것 같은지 아닌지를 고려하여 잔기 대 잔기 기준에서 2 폴리펩티드 쇄의 아미노산 간의 비교를 의미한다. 이는 2 서열의 "% 유사성"이 얻어질 수 있는 연관 "점수"를 가질 가능성이 있다.

2 이상의 서열의 동일성 및 유사성의 비교 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 프로그램 BESTFIT 및 GAP와 같은 위스콘신 서열 분석 패키지 버전 9.1 (Wisconsin Sequence Analysis package, version 9.1; Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984, 미국 위스콘신주 매디슨 소재 제네틱스 컴퓨터 그룹으로부터 입수가능함)으로 입수가능한 프로그램을 사용하여 2개의 폴리뉴클레오티드 간의 % 동일성 및 2개의 폴리펩티드 서열 간의 % 동일성 및 % 유사성을 측정할 수 있다. BESTFIT는 스미스(Smith) 및 워터만(Waterman)의 "국소 상동성" 알고리즘 [J Mol Biol, 147, 195-197, 1981]을 사용하여 2 서열 간의 최선의 단일 유사성 영역을 발견한다. BESTFIT는 길이가 유사하지 않은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열을 비교하는데 더욱 적합하고, 상기 프로그램은 더 짧은 서열이 더 긴 부분을 나타낸다고 추정한다. 이와 비교하여, GAP는 2 서열을 정렬하여 네들만(Neddleman) 및 분쉬(Wunsch)의 알고리즘 [J Mol Biol, 48, 443-453, 1970]에 따라서 "최대 유사성"을 발견한다. GAP는 대략 동일 길이인 서열을 비교하는데 더욱 적합하고, 정렬은 전체 길이에 걸친 것으로 예상된다. 바람직하게는 각 프로그램에서 사용되는 "갭 중량" 및 "길이 중량"은 각각 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 50 및 3, 폴리펩티드 서열에 대하여 12 및 4이다. 바람직하게는, % 동일성 및 유사성은 비교되는 2 서열이 최적 정렬되는 경우 측정된다.

서열 간의 동일성 및(또는) 유사성을 측정하기 위한 다른 프로그램은 당업계에 공지되어 있으며, BLAST 프로그램 패밀리 (Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재 내셔날 센터 포 바이오테크놀러지 인포메이션 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)로부터 입수가능하고 www.ncbi.nlm.nih.gov에서 NCBI의 홈페이지를 통하여 접근가능함) 및 FASTA (Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990; Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448, 19988, 위스콘신 서열 분석 팩키지의 일부로 입수가능함)를 예로 들 수 있다.

바람직하게는, BLOSUM62 아미노산 치환 매트릭스 (Henikoff S and Henikoff J G, Proc. Nat. Acad Sci. USA, 89, 10915-10919, 1992)는 뉴클레오티드 서열이 비교 전에 아미노산 서열로 최초록 해독된 경우를 포함하여 폴리펩티드 서열 비교에 사용된다.

바람직하게는 프로그램 BESTFIT를 사용하여 대조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 관하여 의문의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 % 동일성을 확인하고, 여기서 의문 서열 및 대조 서열은 최적 정렬되고, 프로그램의 파라미터는 상기 기술한 바와 같이 디폴트 값으로 설정한다.

"동일성 지수"는 후보 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드) 및 대조 서열을 비교하는데 사용될 수 있는 서열 관련성의 척도이다. 따라서, 예를 들면, 대조 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 0.95의 동일성 지수를 갖는 후보 폴리뉴클레오티드 서열은 후보 폴리뉴클레오티드 서열이 대조 서열의 각 100개의 뉴클레오티드 당 평균 5개 이하의 차이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는 대조 서열과 동일하다. 이러한 차이는 뉴클레오티드 결실, 치환 (전이 및 전환을 포함함) 또는 삽입 중 1 이상으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 이들 차이는 대조 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치, 또는 대조 서열에서 뉴클레오티드 중에 각각 개별적으로 산재된 이들 말단 위치 사이 임의의 지점, 또는 대조 서열 내의 1 이상의 연속 군 중에서 발생할 수 있다. 바꾸어 말하면, 대조 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 0.95의 동일성 지수를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 얻기 위하여, 대조 서열 중의 각 100개의 뉴클레오티드에서 평균 5개 이하가 상기 기술한 바와 같이 결실, 치환 또는 삽입되거나, 또는 이들이 조합될 수 있다. 이는 필요한 변경을 가하여 다른 유용한 동일성 지수, 예를 들면 0.96, 0.97, 0.98 및 0.99에 동일하게 적용된다.

유사하게, 폴리펩티드에 대하여, 예를 들어 대조 폴리펩티드 서열과 비교하여 0.95의 동일성 지수를 갖는 후보 폴리펩티드 서열은 폴리펩티드 서열이 대조 서열의 각 100개의 아미노산 당 평균 5개 이하의 차이를 포함할 수 있는 것을 제외하고는 대조 서열과 동일하다. 이러한 차이는 아미노산 결실, 치환 (보존성 및 비보전성 치환을 포함함) 또는 삽입 중 1 이상으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 이들 차이는 대조 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치, 또는 대조 서열에서 아미노산 중에 각각 개별적으로 산재된 이들 말단 위치 사이의 임의의 지점, 또는 대조 서열 내의 1 이상의 연속 군에서 발생할 수 있다. 바꾸어 말하면, 대조 폴리펩티드 서열과 비교하여 0.95의 동일성 지수를 갖는 폴리펩티드 서열을 얻기 위하여, 대조 서열에서 각 100개의 아미노산 당 평균 5개 이하가 상기 기술한 바와 같이 결실, 치환 또는 삽입되거나, 또는 이들이 조합될 수 있다. 이는 필요한 변경을 가하여 다른 유용한 동일성 지수, 예를 들면 0.96, 0.97, 0.98 및 0.99에 동일하게 적용된다.

뉴클레오티드 또는 아미노산 차이의 수와 동일성 지수 간의 관계는 하기 식으로 표현될 수 있다.

n_a≤x_a- (x_a·I)

상기 식에서,

n_a는 뉴클레오티드 또는 아미노산 차이의 수이고,

x_a는 서열 목록에 나타낸 서열 중의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총수이고,

I는 동일성 지수이고,

·는 곱셉 연산기호에 대한 기호이며,

여기서 x_a및 I의 모든 정수가 아닌 곱은 이를 x_a로부터 빼기 전에 가장 근접한 정수로 반내림한다.

"호모로그(homolog)"는 당업계에서 대조 서열에 대하여 높은 정도의 서열 관련성을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리페티드 서열을 나타내기 위하여 사용되는 일반적인 용어이다. 이러한 관련성은 상기 기술한 바와 같이 2 서열 간의 동일성 및(또는) 유사성의 정도를 측정하는 것에 의해 정량화될 수 있다. 상기 일반적 용어에 속하는 것으로는 용어 "오르쏘로그(ortholog)" 및 "파라로그(paralog)"가 있다. "오르쏘로그"는 다른 종의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 기능적 등가물인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. "파라로그"는 동일 종 내에서 기능적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다.

"융합 단백질"은 2개의, 대개 관련되지 않은, 융합된 유전자 또는 이의 단편에 의해 코딩되는 단백질을 지칭한다. 일례로, EP-A-0 464 533-A는 다른 인간 단백질 또는 이의 일부와 함께 면역글로불린 분자의 불변 영역의 다양한 부분을 포함하는 융합 단백질을 개시한다. 많은 경우, 융합 단백질의 일부로 면역글로불린 Fc 영역을 적용하는 것은 예를 들면 개선된 약동학적 성질을 유발하는 치료 및 진단에서 사용되기에 잇점이 있다 (예를 들면, EP-A 023 262 참조). 다른 한편으로는, 동일 용도로서, 이는 융합 단백질이 발현, 검출 및 정제된 후 Fc 부분을 제거할 수 있는 것이 바람직할 수 있다.

특허 및 특허 출원에 한정되지 않고 본원에 인용된 모든 간행물 및 참고문헌은 이들 각각의 간행물 또는 참고문헌이 충분히 설명한 바와 같이 본원에 참고문헌으로 삽입되었다고 명확하고 개별적으로 지적한 것과 같이 본원에 전체로서 참고문헌으로 삽입된다. 본 출원이 우선권으로 주장한 모든 특허 출원 또한 상기 간행물 및 참고문헌에 대해 기술한 것과 같이 본원에 전체로서 참고문헌으로 삽입된다.

Claims (7)

1. (a)표 I에 나타낸 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드;

   (b) 표 I에 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드; 및

   (c) 표 I에 나타낸 유전자의 폴리펩티드 서열

   로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단리된 폴리펩티드.
2. (a) 표 I에 나타낸 폴리펩티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드;

   (b) 표 I에 나타낸 유전자의 단리된 폴리뉴클레오티드;

   (c) 표 I에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드;

   (d) 표 I에 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드;

   (e) (a) 내지 (d)의 폴리뉴클레오티드의 RNA 등가물인 폴리뉴클레오티드

   로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이 단리된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열.
3. 적합한 숙주 세포에 존재하는 경우 제1항의 폴리펩티드를 생산할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
4. 적절한 배양 조건하에서 숙주 세포가 폴리펩티드를 생산할 수 있도록 제1항의 폴리펩티드를 생산할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 재조합 숙주 세포의 제조 방법.
5. 제4항의 방법에 의해 제조된 재조합 숙주 세포.
6. 폴리펩티드를 발현하는 제5항의 재조합 숙주 세포의 막.
7. 폴리펩티드를 생산하기 충분한 조건하에서 제5항의 숙주 세포를 배양하고 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법.