ES2282142T3 - Una secuencia de micobacterium tuberculosis para la expresion de proteinas heterologas. - Google Patents
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Abstract
Un método para la expresión estable y de alto rendimiento de un polipéptido heterólogo recombinante; dicho método comprende la expresión en una célula huésped una molécula de un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión, en donde dicho polipéptido de fusión comprende un polipéptido Ra12 y un polipéptido heterólogo, en donde al polipéptido Ra12 se le codifica una secuencia Ra12 de polinucleótidos que hibrida a una secuencia complementaria a SEQ ID NO:3 bajo condiciones exigentes y en donde la secuencia Ra12 de polinucleótidos se posiciona 5'' respecto a la secuencia heteróloga de polinucleótidos que codifica el polipéptido heterólogo.
Description
Una secuencia de Mycobacterium
tuberculosis para la expresión de proteínas heterólogas.
La presente invención se refiere en general a
secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de un polipéptido
de fusión que comprende un polipéptido de Mycobacterium
tuberculosis, y un polipéptido heterólogo de interés, a
vectores de expresión, y células huésped que comprenden dichos
ácidos nucleicos, y a métodos para la elaboración de estos
polipéptidos de fusión. En concreto, la invención se refiere a los
materiales y los métodos de utilizar dichas secuencias de M.
tuberculosis como una pareja de fusión para facilitar la
expresión estable y de alto rendimiento de polipéptidos
recombinantes heterólogos de origen tanto eucariótica como
procariótica.
\vskip1.000000\baselineskip
La aparición de la tecnología de ADN
recombinante ha conducido a la clonación molecular de un gran número
de secuencias codificadoras o genes procedentes de diversos tipos
de células. Con tal de estudiar la función de estos genes o de
elaborar los productos codificados por estas secuencias, dichos
genes se insertan en vectores de expresión bajo el control de las
secuencias reguladoras indicadas. Esta transferencia del vector de
expresión en unas células huésped eucarióticas o procarióticas
generalmente resulta en la expresión del producto codificado que se
puede purificar posteriormente. La producción a gran escala de
muchos productos génicos es especialmente importante en casos en
que los dichos productos son de valor médico o industrial.
Sin embargo, a pesar de los avances en la
expresión génica, ciertas secuencias codificadoras no producen sus
productos fácilmente de forma estable. Por ejemplo, la expresión en
E. coli de proteínas recombinantes podría ser problemática
sobre todo para las proteínas con dominios transmembranares o largas
secuencias hidrófobas. Además, puede que las proteínas
recombinantes no contengan los residuos de aminoácidos
N-terminal con el sesgo indicado de codones. Por
tanto, todavía existe la necesidad de disponer de materiales y
métodos mejorados para la expresión de proteínas recombinantes.
Los documentos WO99/42076 y WO99/51748 describen
el antígeno de M. tuberculosis Ra12 y las proteínas de
fusión que lo contienen.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona por primera
vez los métodos para usar moléculas de ácidos nucleicos
recombinantes que codifican los polipéptidos de fusión que
comprenden un polipéptido Ra12 y un polipéptido heterólogo,
polipéptidos de fusión, vectores de expresión y células huésped que
comprenden las moléculas de ácido nucleico, para producir una
expresión estable y de alto rendimiento de los polipéptidos de
fusión de interés.
Por un lado, la presente invención proporciona
un método para la expresión estable y de alto rendimiento de un
polipéptido heterólogo recombinante, en que dicho método comprende
la expresión en una célula huésped de una molécula de ácido
nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión, en que
dicho polipéptido de fusión comprende un polipéptido Ra12 y un
polipéptido heterólogo, en donde la secuencia Ra12 de polipéptidos
la codifica una secuencia Ra12 de polinucleótidos que hibrida a una
secuencia complementaria a la secuencia SEQ ID NO: 3 bajo
condiciones exigentes y en donde la secuencia Ra12 de
polinucleótidos está localizada 5' con respecto a la secuencia
heteróloga de polinucleótidos, que codifican el polipéptido
heterólogo. En otra realización, las moléculas de ácido nucleico
recombinante además comprenden una secuencia de polinucleótidos que
codifica un péptido enlazador entre la secuencia Ra12 de
polinucleótidos y la secuencia heteróloga de polinucleótidos, en
donde dicho péptido enlazador puede comprender un sitio de escisión.
En una realización adicional, las moléculas de ácido nucleico
recombinante codifican polipéptidos de fusión que adicionalmente
comprenden una etiqueta de afinidad. En una realización adicional,
las moléculas de ácido nucleico recombinante codifican un
polipéptido de fusión que comprende un DPPD, un WT1, una
mamaglobina, o un polipéptido heterólogo H9-32A. En
otra realización adicional, las moléculas de ácido nucleico
recombinante comprenden una secuencia Ra12 de polinucleótidos que
comprende al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos
aproximadamente 60 nucleótidos, o al menos aproximadamente 100
nucleótidos. En otra realización adicional, las moléculas de ácido
nucleico recombinante comprenden una secuencia Ra12 de
polinucleótidos tal como se indica en SEQ ID NO: 3. En otra
realización adicional, las moléculas de ácido nucleico recombinante
comprenden una secuencia Ra12 de polinucleótidos que codifica un
polinucleótido Ra12 tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:
17 o SEQ ID NO: 18.
En una realización preferida, la célula huésped
es E. coli.
En una realización, el polipéptido Ra12
comprende al menos aproximadamente 10 aminoácidos, al menos
aproximadamente 30 aminoácidos, o al menos aproximadamente 100
aminoácidos. En otra realización, el polipéptido Ra12 tiene la
secuencia mostrada en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO:
18.
En una realización, el método también comprende
la purificación de los polipéptidos de fusión después de su
expresión. En otra realización, el método adicionalmente comprende
la escisión de un polipéptido de fusión entre un polipéptido Ra12 y
un polipéptido heterólogo.
Estos y otros aspectos de la presente invención
se manifestarán al hacer referencia a la descripción detallada y
los dibujos anejos.
La Figura 1 ilustra una secuencia de nucleótidos
(SEQ ID NO: 1) y una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de
MTB32A.
La Figura 2 ilustra una secuencia de nucleótidos
(SEQ ID NO: 3) y una secuencia Ra12 de aminoácidos (SEQ ID NO:
4).
La Figura 3 ilustra una secuencia de ácido
nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos
(SEQ ID NO: 5) y una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) del
polipéptido de fusión Ra12-DPPD.
La Figura 4 ilustra una secuencia de ácido
nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos
(SEQ ID NO: 7) y una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) del
polipéptido de fusión Ra12-WT1.
La Figura 5 ilustra una secuencia de ácido
nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos
(SEQ ID NO: 9) y una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) del
polipéptido de fusión Ra12-mamaglobina.
La Figura 6 ilustra una secuencia de ácido
nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos
(SEQ ID NO: 11) y una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) del
polipéptido de fusión
Ra12-H9-32A.
La Figura 7 ilustra el polipéptido Ra12 (corto)
(SEQ ID NO: 17), que tiene los aminoácidos 1-30 de
SEQ ID
NO: 3.
NO: 3.
La Figura 8 ilustra el polipéptido Ra12 (largo)
(SEQ ID NO: 18), que tiene los aminoácidos 1-128 de
SEQ ID
NO: 4.
NO: 4.
La Figura 9 ilustra un constructo del
polinucleótido Ra12 (corto) fusionado con un gen humano de
mamaglobina.
Tal como se apunta arriba, la presente invención
proporciona por primera vez métodos para usar secuencias Ra12 como
una pareja de fusión para facilitar la expresión estable y con alto
rendimiento de polipéptidos heterólogos de origen tanto eucariótico
como procariótico.
MTB32A es una serina proteasa con un peso
molecular de 32 kD y la codifica un gen en cepas virulentas y no
virulentas de M. tuberculosis. La secuencia completa de
nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de
MTB32A se describen en la Figura 1. Véase también Skeiky et
al., Infection and Immun. (1999) 67:3998-4007.
Esta proteína se libera de forma natural en el sobrenadante de los
cultivos bacterianos. El marco abierto de lectura de la secuencia
codificadora contiene señales de secreción del extremo N hidrófobo.
Estimula la proliferación de las células mononucleares de sangre
periférica procedente de la proteína purificada positiva para el
derivado (PPD) de donantes sanos y éstas liberan el interferón. De
este modo, MTB32A es un antígeno candidato para el uso en el
desarrollo de vacunas contra la tuberculosis.
Sorprendentemente, los presentes inventores
descubrieron que el fragmento del extremo C de 14 kD de la secuencia
codificadora de MTB32A es capaz de un alto nivel de expresión por
sí sola y que permanece como una proteína soluble durante todo el
proceso de purificación. Este fragmento del extremo C de 14 kD de
MTB32A se denomina en este documento como Ra12 (que tiene los
residuos de aminoácidos 192 a 323 de MTB32A). Las secuencias Ra12
de ácidos nucleicos y de aminoácidos naturales se muestran, por
ejemplo, en las Figuras 2-6. Tal como se describen
en detalle más abajo, el término "polipéptido Ra12" o
"polinucleótido Ra12" se utiliza de ahora en adelante en
referencia a las secuencias Ra12 naturales (p.e. SEQ ID NO: 3 o SEQ
ID NO: 4), las variantes de las mismas, o los fragmentos de las
mismas (p.e., SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18). La presente invención
utiliza estas propiedades de los polipéptidos Ra12 y proporciona
métodos para la expresión estable con alto rendimiento de los
polipéptidos de fusión que comprenden el polipéptido Ra12 y un
polipéptido heterólogo de interés. Los métodos de la presente
invención son de utilidad especial en la expresión de ciertos
polipéptidos heterólogos (p.e. DPPD) que otros métodos de expresión
convencionales no han podido expresar en una cantidad
sustanciosa.
Los ácidos nucleicos recombinantes, que
codifican un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido Ra12
y un polipéptido heterólogo de interés, pueden construirse
fácilmente mediante técnicas convencionales de manipulación
genética. Los ácidos nucleicos recombinantes se construyen de tal
forma que una secuencia Ra12 de polinucleótidos se localiza 5' a
una secuencia heteróloga seleccionada de polinucleótidos.
En la presente invención, un polinucleótido
heterólogo apropiado de interés puede seleccionarse como una pareja
de fusión de ácidos nucleicos Ra12 para producir un polipéptido de
fusión. Una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico
heterólogo" tal como se utiliza en el presente documento, es
aquél que se origina de una fuente extraña a la célula huésped en
cuestión, o, si procede de la misma fuente, se modifica con respecto
a su forma original. De este modo, un ácido nucleico heterólogo en
una célula huésped procariótica incluye un ácido nucleico
heterólogo que es endógeno a la célula huésped particular que se ha
modificado. La modificación de la secuencia heteróloga puede
ocurrir, por ejemplo, mediante el tratamiento del ADN con una enzima
de restricción para generar un fragmento de ADN que es capaz de
ligarse operacionalmente con el promotor. Las técnicas tales como
la mutagénesis dirigida al sitio también son útiles para la
modificación de una secuencia heteróloga.
Puede seleccionarse un ácido nucleico heterólogo
de origen tanto eucariótico como procariótico como una pareja de
fusión. Estos ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a,
ácidos nucleicos que codifican antígenos patogénicos, antígenos
bacterianos, antígenos virales, antígenos contra el cáncer,
antígenos tumorales, y supresores de tumores. Ejemplos de ácidos
nucleicos heterólogos de interés incluyen DPPD, WT1, mamaglobina,
ácidos nucleicos H9-32a, y otros ácidos nucleicos de
Mycobacterium tuberculosis (véanse por ejemplo Cole et
al. Nature (1999) 393:537-544;
http://www.sanger.ac.uk; y http://www.pasteur.fr/mycdb/ para las
secuencias genómicas completas de M. tuberculosis; véanse
también los documentos WO98/53075 y WO98/53076, ambos publicados el
26 de Noviembre de 1998, para secuencias de ácidos nucleicos que
codifican las proteínas de M. tuberculosis). Cualquiera de
los ácidos nucleicos descritos en el presente documento puede
utilizarse solo o en combinación con un ácido nucleico heterólogo
que puede seleccionarse como una pareja de fusión.
Además, puede utilizarse cualquier
polinucleótido Ra12 apropiado (p.e. polinucleótido Ra12 natural con
SEQ ID NO: 3, y variantes o fragmentos del mismo) para la
construcción de los ácidos nucleicos recombinantes de fusión de la
presente invención. Los polinucleótidos de Ra12 preferidos
comprenden al menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos, al
menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 60
nucleótidos, al menos aproximadamente 100 nucleótidos, al menos
aproximadamente 200 nucleótidos, o al menos aproximadamente 300
nucleótidos. Los polinucleótidos pueden ser mono- o bicatenarios, y
pueden ser moléculas de ADN (génico, ADNc, o sintético) o de
ARN.
En una realización, la secuencia del polipéptido
Ra12 es la mostrada en SEQ ID NO: 3. En otra realización, la
secuencia del polinucleótido Ra12 codifica una secuencia de
polipéptido Ra12 tal como se indica en SEQ ID NO: 4. En algunas
realizaciones, la secuencia polinucleótido Ra12 comprende una
porción de SEQ ID NO: 3 o codifica una porción de SEQ ID NO: 4. Por
ejemplo, un polinucleótido Ra12 que comprende 90 nucleótidos (p.e.
los nucleótidos 1-90 de SEQ ID núm. 3) o un
polinucleótido que comprende 384 nucleótidos (por ejemplo, los
nucleótidos 1-384 de SEQ ID NO: 3) puede utilizarse
como pareja de fusión. Véanse los ejemplos 2 y 3 más adelante.
Los polinucleótidos pueden comprender una
secuencia natural (es decir, una secuencia endógena que codifica un
polipéptido Ra12 SEQ ID NO: 3 o una porción del mismo) o puede
comprender una variante de semejante secuencia. Las variantes de
polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones,
deleciones y/o inserciones de tal forma que la actividad biológica
del polipéptido de fusión codificado no se ve mermada con respecto
a un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido Ra12
natural. Las variantes preferiblemente exhiben una identidad de al
menos el 70%, más preferiblemente de al menos el 80% y más
preferiblemente aún de al menos el 90% con una secuencia de
polinucleótidos que codifica un polipéptido Ra12 natural (SEQ ID NO:
4) o una porción del mismo. Opcionalmente, la identidad existe a lo
largo de una región que tiene una longitud de al menos 25 hasta
aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos, u opcionalmente a lo
largo de una región que tiene una longitud de
75-100 aminoácidos o nucleótidos
Se consideran dos secuencias de polinucleótidos
o polipéptidos "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o
aminoácidos en las dos secuencias es la misma al alinearse para
conseguir la máxima correspondencia tal como se describe más
adelante. Las comparaciones entre las dos secuencias se realizan
típicamente mediante la comparación de las secuencias en una
ventana de comparación para identificar y comparar las regiones
locales de similitud en las secuencias. Una "ventana de
comparación", tal como se usa en el presente documento, se
refiere a un segmento de al menos 20 posiciones contiguas,
generalmente con una longitud de 30 a 75 unidades y por ejemplo de
40 a 50, en que se puede comparar la secuencia con una secuencia de
referencia con el mismo número de posiciones contiguas después de
una alineación óptima de las dos secuencias.
La alineación óptima de las secuencias para su
comparación puede realizarse con el programa Megalign en el paquete
de software Lasergene para la bioinformática (DNASTAR, Inc.,
Madison, WI) con los parámetros por defecto. Este programa contiene
varios abordajes de alineación descritos en las siguientes
referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in
proteins - Matrices for detecting distant relationships. En Dayhoff,
M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National
Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, pp.
345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to
Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in
Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins,
D.G. y Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers,
E.W. y Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson,
E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol.
Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R.
(1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of
Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, WJ. y
Lipman, D.J.(1983) Proc. Natl. Acad, Sci. USA
80:726-730.
Alternativamente, la alineación óptima de las
secuencias para su comparación puede realizarse mediante el
algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL.
Math 2:482, mediante el algoritmo de identidad de alineación de
Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante los métodos
de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85: 2444, mediante implementación informatizada de
estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el
paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group
(GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante la inspección.
Los ejemplos preferidos de algoritmos que son
apropiados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias
y la similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y LBAST2.0,
que se describen en Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res.
25: 3389-3402 y en Altschul et al. (1990) J.
Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. Pueden
utilizarse BLAST y BLAST 2.0, por ejemplo con los parámetros
descritos en este documento, para determinar el porcentaje de
identidad de la secuencia para los polinucleótidos o polipéptidos de
la invención. El software para realizar el análisis de BLAST está
en el dominio público a través del National Center for Biotechnology
Information. Para las secuencias de aminoácidos, puede utilizarse
una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La
extensión de las coincidencias de palabras en cada sentido se para
cuando: la puntuación de alineación se caiga en una cantidad X del
valor máximo conseguido; la puntuación acumulada llegue a cero o
menos debido a la acumulación de una o más puntuaciones negativas
para alineaciones de residuos; o se llega al final de alguna de las
secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan
la sensibilidad y la velocidad de la alineación.
En un abordaje preferido, el "porcentaje de
identidad de la secuencia" viene determinado por una comparación
de dos secuencias con una alineación óptima con una ventana de
comparación de al menos 20 posiciones, en donde la porción de la
secuencia de polipéptido en la ventana de comparación puede
comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por
ciento a menos, generalmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12
por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (que no
comprenden las adiciones o deleciones) para la alineación óptima de
dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante la determinación
del número de posiciones en que los residuos idénticos de
aminoácidos se producen en ambas secuencias para proporcionar un
número de posiciones pareadas, dividiendo el número de posiciones
pareadas entre el número total de posiciones en la secuencia de
referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los
resultados por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de
las secuencias.
Las variantes pueden también, como alternativa,
ser substancialmente homólogas con un polinucleótido Ra12 natural
(por ejemplo, SEQ ID NO: 3), o una porción o complemento del mismo.
Dichas variantes de polinucleótidos son capaces de hibridar en
condiciones exigentes con la secuencia de ADN natural que codifica
un polinucleótido Ra12 natural (o una secuencia
complementaria).
La frase "hibridar selectivamente (o
específicamente) con" se refiere a la unión, la formación de
dúplex, o la hibridación de una molécula sólo con una secuencia
específica de nucleótidos bajo condiciones exigentes de hibridación
cuando dicha secuencia está presente en una mezcla compleja (por
ejemplo, una célula completa o una biblioteca de ADN o ARN).
La frase "condiciones exigentes de
hibridación" se refiere a las condiciones en que una sonda se
hibrida con su secuencia diana, típicamente en una mezcla compleja
de ácidos nucleicos, pero no con otras secuencias. Las condiciones
exigentes dependen de la secuencia y variarán con función de las
circunstancias. Las secuencias más largas hibridan específicamente
a temperaturas más altas. Una guía extensa sobre la hibridación de
ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization
with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and
the strategy of nucleic acid assays" (1993). Generalmente, las
condiciones exigentes se seleccionan para ser aproximadamente
5-10°C más bajas que el punto de fusión térmica
(Tm) para la secuencia específica a un pH definido de fuerza iónica.
La Tm es la temperatura (en una fuerza iónica, pH, y concentración
nucleica definidos) a que el 50% de las sondas que complementan la
diana hibridan a la otra secuencia diana en equilibrio (ya que las
secuencias diana están presentes en exceso, a la Tm, el 50% de las
sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones exigentes
serán aquellas en los que la concentración de la sal es menor de
aproximadamente 1,0 M del ión de sodio, típicamente aproximadamente
de 0,01 a 1,0 M del ión de sodio (u otras sales) a un pH de 7,0 a
8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30ºC para las
sondas cortas (p.e. de 10 a 50 nucleótidos) y de al menos
aproximadamente 60ºC para las sondas largas (p.e. más que 50
nucleótidos). Las condiciones exigentes pueden conseguirse mediante
la adición de agentes desestabilizantes tales como la formamida.
Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es
al menos dos veces la del fondo, preferiblemente 10 veces la
hibridación de fondo. Ejemplos de condiciones exigentes de
hibridación pueden ser las siguientes: el formamida al 50%, 5x SSC,
y SDS al 1%, una incubación a 42ºC, ó 5x SSC, SDS al 1%, una
incubación a 65ºC con un lavado en 0,2x SCC y SDS al 0,1% a
65ºC.
Los expertos en la técnica podrán apreciar que,
como resultado de una equivalencia en el código genético, existen
muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido Ra12
tal como se describe en la presente invención. Algunos de estos
polinucleótidos llevan una homología mínima con la secuencia de
nucleótidos de cualquier gen natural. No obstante, los
polinucleótidos que varían debido a diferencias en la utilización
de codones se consideran específicamente en la presente invención.
Es más, los alelos de los genes que comprenden las secuencias de
polinucleótidos proporcionadas en el presente documento caen dentro
del alcance de la presente invención. Los alelos son genes
endógenos que se modifican como resultado de una o más mutaciones,
tales como deleciones, adiciones, y/o sustituciones de nucleótidos.
El ARNm resultante y la proteína pueden, aunque no necesariamente,
tener una estructura o función modificada. Los alelos pueden
identificarse con técnicas estándar (tales como la hibridación,
amplificación y/o comparación de secuencias en bases de datos).
Así, los términos tales como "polinucleótido
Ra12" o "secuencia de polinucleótidos Ra12" tal como se
utilizan en el presente documento se refieren a secuencias de
polinucleótidos Ra12 naturales (p.e., SEQ ID NO: 3), fragmentos de
las mismas, o cualquier variante de las mismas. Funcionalmente,
cualquier polinucleótido Ra12 tiene la capacidad de producir una
proteína de fusión, y su capacidad de producir una proteína de
fusión en células huésped puede ser potenciada o sin cambios con
respecto al polinucleótido Ra12 natural (p.e., SEQ ID NO: 3), o
puede ser disminuida en menos del 50%, y preferiblemente en menos
del 20% relativo al polinucleótido Ra12 natural.
Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos
Ra12 de esta invención pueden prepararse mediante cualquier técnica
apropiada del estado de la técnica. Los ejemplos de métodos incluyen
la clonación y la restricción de las secuencias apropiadas o la
síntesis directa mediante métodos tales como el método de
fosfotriéster de Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:
90-99; el método de fosfodiéster de Brown et
al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151; el
método de dietil fosforamidito de Beaucage et al. (1981)
Tetra. Lett., 22: 1859-1862; y el método con
suporte sólido de la Patente Estadounidense núm. 4.458.066.
En una realización, un ácido nucleico que
codifica MTB32A o Ra12 se aísla mediante métodos rutinarios de
clonación. Las secuencias de nucleótidos de MTB32A o Ra12 tal como
se describen en el presente documento se utilizan para proporcionar
sondas que se hibridan específicamente con otros ácidos nucleicos
MTB32A o Ra12 en una muestra de ADN genómico, o a un ARNm de MTB32A
o ARMm Ra12 en una muestra de ARN total (por ejemplo, en una
transferencia Southern or Northern). Una vez
identificados los ácidos nucleicos MTB32A o Ra12, se pueden aislar
de acuerdo con los métodos estándares conocidos por los expertos en
la técnica.
Los ácidos nucleicos deseados pueden clonarse
con técnicas de amplificación bien conocidas. Los ejemplos de los
protocolos que pueden guiar expertos en la técnica por los métodos
de amplificación in vitro, que incluyen la reacción de
polimerasa en cadena (RPC), la reacción de ligasa en cadena (RLC),
la amplificación de Q\beta-replicasa y otras
técnicas mediadas por la polimerasa de ARN pueden encontrarse en
Berger, Sambrook, y Ausubel, así como en Mullis et al.
(1987) Patente Estadounidense núm. 4.683.202; PCR Protocols A Guide
to Methods and Applications (Innis et al. eds) academia
Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim y Levinson (October
1, 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH
Research (1991) 3: 81-94; (Kwoh et al. (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al. (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874; Lomell et al. (1989) J.
Clin. Chem. 35: 1826; Landegren et al. (1988) Science 241:
1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:
291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4: 560; y
Barringer et al. (1990) Gene 89: 117 Los métodos mejorados
para clonar ácidos nucleicos amplificados in vitro se
describen en Wallace et al., Patente Estadounidense núm.
5.426.039. Los cebadores indicados para utilizar en la
amplificación de los ácidos nucleicos de la invención pueden
diseñarse en función de las secuencias descritas en el presente
documento.
Los ácidos nucleicos MTB32A y Ra12 pueden
clonarse detectando su producto expresado mediante un ensayo basado
en las propiedades físicas, químicas o inmunológicas de la proteína
expresada. Por ejemplo, se puede identificar un ácido nucleico
clonado de MTB32A o Ra12 mediante la capacidad de un polipéptido
codificado por el ácido nucleico a unirse con antisueros o
anticuerpos purificados producidos contra los polipéptidos MTB32A o
Ra12 proporcionados en el presente documento, que también reconocen
y se unen selectivamente a los homólogos de MTB32A o Ra12.
En algunas realizaciones, puede resultar
deseable modificar los ácidos nucleicos MTB32A o Ra12 de la
invención. Las secuencias de nucleótidos modificados que pueden
usarse de acuerdo con la invención incluyen deleciones, adiciones,
o sustituciones de residuos de nucleótidos diferentes que resultan
en una secuencia que codifica el mismo producto génico o un
producto que tenga la misma funcionalidad. El producto génico mismo
puede contener deleciones, adiciones, o sustituciones de residuos
de aminoácidos, que resultan en un cambio sinónimo, lo que da lugar
a un epitopo antigénico funcionalmente equivalente. Estas
sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden hacerse
atendiendo a la similitud en la polaridad, carga, solubilidad,
hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza amfipática de los
residuos implicados. Preferiblemente, pueden emplearse los ácidos
nucleicos Ra12 que son más cortos que la SEQ ID NO: 3 y que
codifican una pareja de fusión biológicamente activa. Dichos
equivalentes funcionales de los polipéptidos Ra12 pueden ser
deseables para aumentar la cantidad de recursos de las células
huésped disponibles para la producción de polipéptidos heterólogos
de interés.
Un experto en el tema reconocerá muchas maneras
de generar cambios en un constructo dado de ácido nucleico.
Ejemplos de estos métodos conocidos incluyen la mutagénesis dirigida
contra el sitio, la amplificación por RCP con oligonucleótidos
degenerados, la exposición de las células que contienen el ácido
nucleico a agentes mutagénicos o a la radiación, la síntesis
química de un oligonucleótido deseado (p.e. en combinación con la
ligación y/o la clonación para generar ácidos nucleicos grandes) y
otras técnicas muy conocidas. Véase, por ejemplo, Giliman y Smith
(1979) Gene 8:81-97, Roberts et al. (1987)
Nature 328:731-734. Los ácidos nucleicos
recombinantes que codifican un polipéptido de fusión que comprende
un polipéptido Ra12 y un polipéptido heterólogo seleccionado pueden
prepararse con cualquiera de los métodos conocidos en el estado de
la técnica. Tal como se describe anteriormente, los ácidos
nucleicos recombinantes se construyen para que una secuencia de
polinucleótidos Ra12 se localice en la posición 5' respecto a una
secuencia heteróloga seleccionada de polinucleótidos. Secuencias
heterólogas Ra12 de polinucleótidos pueden modificarse también para
facilitar su fusión y la posterior expresión de polipéptidos de
fusión. Por ejemplo, el codón 3' de terminación de la secuencia Ra12
de polinucleótidos puede sustituirse con una secuencia de enlace
dentro del marco, que puede proporcionar sitios de restricción y/o
sitios de escisión. Los ácidos nucleicos recombinantes pueden además
comprender otras secuencias de nucleótidos tales como secuencias
que codifican etiquetas de afinidad para facilitar protocolos de
purificación de proteínas.
Los ácidos nucleicos recombinantes tal como se
describen en el presente documento pueden unirse a una variedad de
otras secuencias mediante técnicas recombinantes de ADN
establecidas. Por ejemplo, un polinucleótido puede clonarse en
diversos vectores de clonación, entre ellos plásmidos, fagemidos,
derivados del fago lambda y cósmidos. Los vectores de especial
interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación,
vectores que generan sondas y vectores secuenciadores. En general,
un vector contendrá un origen de replicación funcional en al menos
un organismo, sitios accesibles de restricción mediante endonucleasa
y uno o más marcadores seleccionables. Otros elementos dependerán
del uso deseado, y serán obvios para los que tienen conocimientos
medios del estado de la técnica.
Las secuencias de ADN que codifican los
componentes de polipéptidos pueden elaborarse por separado, y
ligarse en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de la
secuencia de ADN que codifica un componente del polipéptido se
liga, con o sin una secuencia de polinucleótidos codificadora de un
enlazador de péptidos, al extremo 5' de la secuencia de ADN que
codifica el segundo componente de polipéptidos de tal forma que los
marcos de lectura de las secuencias están en fase. Esto permite la
traducción de una única proteína de fusión que retiene la actividad
biológica de ambos componentes de polipéptidos.
Las secuencias de ADN ligadas se enlazan
operacionalmente con elementos reguladores apropiados de
trascripción o traducción. Los elementos reguladores responsables
para la expresión de ADN se localizan solo 5' con respecto a la
secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. Asimismo,
los codones de terminación necesarios para terminar la traducción y
las señales de terminación de trascripción sólo están presentes 3'
respecto a la secuencia de ADN que codifica el segundo
polipéptido.
En función del sistema de huésped/vector que se
utilice, se puede emplear diversos elementos de trascripción y
traducción apropiados, entre ellos promotores constitutivos e
inducibles en el vector de expresión. Por ejemplo, cuando se
realiza una clonación en sistemas bacterianos, los promotores
inducibles tales como pL de bacteriofago \lambda, plac, ptrp,
ptac (ptrp-lac promotor híbrido; promotor
citomegalovirus) y semejantes pueden utilizarse; cuando se realiza
una clonación en sistemas de células de levaduras, pueden emplearse
los promotores tales como el promotor baculovirus del tipo
poliedro; cuando se realiza una clonación en sistemas de células de
plantas, se pueden emplear promotores derivados del genoma de las
células de la planta (p.e., promotores de choque térmico; el
promotor para la subunidad pequeña de RUBISCO; el promotor para la
proteína de unión al clorofilo \alpha/\beta) o de los virus de
plantas (p.e., el promotor 35S ARN de CaMV; el promotor de la
proteína de capa de TMV); cuando se realiza una clonación en
sistemas de células mamíferas, se pueden emplear los promotores
derivados del genoma de las células mamíferas (p.e. el promotor de
metalotioneina) o de los virus mamíferos (p.e. el promotor tardío
de adenvirus; el promotor del virus vaccinia 7,5K); cuando se
generan líneas celulares que contienen múltiples copias de una
secuencia codificadora de antígenos, pueden emplearse vectores
basados en SV40, BPV y EBV con un marcador seleccionable
apropiado.
apropiado.
Pueden emplearse diversos sistemas de expresión
en el huésped para expresar las secuencias codificadoras de la
proteína de fusión Ra12. Estos incluyen, pero no se limitan a, los
microorganismos tales como las bacterias (por ejemplo, E.
coli, B. subtilis), transformadas con vectores de
expresión de ADN recombinante de bacteriofago, ADN plásmido o ADN
cósmido que contienen una secuencia codificadora; levadura (p.e.
Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de
expresión de levadura recombinantes que contienen una secuencia
codificadora; sistemas de células de insectos infectados con los
vectores de expresión de virus recombinantes (p.e., baculovirus)
que contiene una secuencia codificadora; sistemas de células de
plantas infectadas con los vectores de expresión de virus
recombinantes (p.e. el virus mosaico de flor de col, CaMV; el virus
mosaico de tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión
de plásmidos recombinantes (p.e., plásmido Ti) que contiene una
secuencia codificadora; o sistemas de células mamíferas (p.e.
células de COS, CHO, BHK, 293, 3T3). Los elementos de expresión de
estos sistemas varían en cuanto a su potencia y su
especificidad.
Se prefieren los sistemas bacterianos para la
expresión de polipéptidos de fusión Ra12. Las secuencias
procarióticas de control habitualmente utilizadas, que se definen
en el presente documento de tal forma que se incluyan promotores
para la iniciación de trascripción, opcionalmente con un operador,
junto con secuencias de unión ribosómicas, incluyen promotores
habitualmente utilizados como los sistemas de promoción de la
beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac)
(Change et al., Nature (1977) 198:1056), el sistema de
promoción triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids
Res. (1980) 8: 4057), el promotor tac (DeBoer et al., Proc.
Natl. Acad Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25); y el
promotor lambda derivado PL y el sitio de unión ribosómico del
N-gen (Shimatake et al., Nature (1981) 292:
128). El sistema de promoción en sí no es crítico para la invención;
se puede emplear cualquier promotor disponible que funciona en
procariotas.
Pueden emplearse promotores bien constitutivos o
bien regulados en la presente invención. Los promotores reguladores
pueden ser ventajosos ya que las células huésped pueden cultivarse
hasta altas densidades antes de que se induzca la expresión de los
polipéptidos de fusión Ra12. El alto nivel de expresión de proteínas
heterólogas frena el crecimiento celular en algunas situaciones.
Los promotores regulados especialmente apropiados para su uso en
E. coli incluyen el promotor bacteriofago lambda PL, el
promotor híbrido trp-lac (Amann et al., Gene
(1983) 25: 167; de Boer et al., Proc. Natl Acad Sci. USA
(1983) 80: 21, y el promotor bacteriofago T7 (Studier et
al., J. Mol. Biol. (1986); Tabor et al., (1985). Se
describen estos promotores y su utilización en Sambrook et
al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.,
Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory.
Para la expresión de los polipéptidos de fusión
Ra12 en células procarióticas que no sean E. coli, se
necesita un promotor que funcione en las especies procarióticas
específicas. Dichos promotores pueden obtenerse de los genes que se
han clonado de la especie, o pueden emplearse promotores
heterólogos. Por ejemplo, el promotor híbrido
trp-lac funciona en Bacilo además de E.
coli.
Un sitio de unión ribosómico (RBS) se incluye de
forma apropiada en los casetes de expresión de la invención. Un RBS
en E. coli, por ejemplo, consiste en una secuencia de
nucleótidos de longitud 3-9 localizados de
3-11 nucleótidos aguas arriba del codón de
iniciación (Shine y Dalgarno, Nature (1975) 254: 34; Steitz, En
Biological regulation and development: Gene expression (ed. R.F.
Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenum Publishing, NY).
Cuando se precisan grandes cantidades de la
proteína de fusión Ra12, vectores que dirigen la expresión de altos
niveles de los productos de fusión susceptibles a la purificación
podrían ser deseables. Dichos vectores incluyen pero no se limitan
al vector de expresión pUR278 para E. coli (Ruther et
al. (1983) EMBO J.2:1791), en que una secuencia codificadora
puede ligarse en el vector en un marco con la región codificadora de
lacZ de tal forma que se produce una proteína híbrida; vectores pIN
(Inouye y Inouye (1985) Nucleic Acids Res.
13:3101-3109; VanHeeke y Schuster (1989) J. Biol.
Chem. 264:5503-5509); y semejantes. Pueden emplearse
también vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños como
proteínas de fusión con glutationa S-transferasa
(GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles y pueden
purificarse fácilmente de células lisadas mediante la absorción a
microesferas de glutationa-agarosa seguido de la
elución con presencia de glutationa libre. En algunas aplicaciones,
puede resultar deseable escindir el polipéptido heterólogo de
interés del polipéptido de fusión Ra12 después de la purificación.
Esto puede llevarse a cabo con cualquiera de los diversos métodos
disponibles en el estado de la técnica. Por ejemplo, los vectores
pGEX se diseñan para incluir la trombina o los sitios de escisión
del factor Xa proteasa de tal forma que el polipéptido de fusión
clonado de interés puede liberarse del grupo GST. Véase, por
ejemplo, Sambrook et al., supra.; Itakura et
al., Science (1977) 198:1056; Goeddel et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76:106; Nagai et al., Nature
(1984) 309:810; Sung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1986) 83:561. Los sitios de escisión pueden elaborarse en los
ácidos nucleicos recombinantes para las proteínas de fusión en el
punto deseado de escisión.
En el contexto de la presente invención, un
polipéptido de "fusión" comprende al menos dos partes: un
polipéptido Ra12 tal como se describe en el presente documento, y
un polipéptido heterólogo de interés. En un polipéptido de fusión,
preferiblemente un polipéptido Ra12 se fusiona, directamente o
indirectamente, con el extremo amino de un polipéptido heterólogo
de interés, aunque la fusión al extremo carboxi del polipéptido
heterólogo o la inserción del polipéptido heterólogo en un sitio en
el polipéptido Ra12 puede ser indicado también.
Cualquier polipéptido heterólogo de interés, sea
de origen eucariótico o procariótico, puede seleccionarse como la
pareja de fusión al polipéptido Ra12. Estos polipéptidos heterólogos
incluyen, pero no se limitan a, antígenos patogénicos, antígenos
bacterianos, antígenos virales, antígenos contra el cáncer,
antígenos tumorales, y supresores de tumores. Ejemplos de
polipéptidos heterólogos incluyen DPPD, WT1, mamaglobina,
polipéptidos H9-32A, u otras proteínas de M.
tuberculosis. Cualquiera de estos polipéptidos pueden emplearse
solo o en combinación como un polipéptido heterólogo que puede
seleccionarse como una pareja de fusión.
Tal y como se ha apuntado anteriormente, un
polipéptido de fusión puede comprender un polipéptido Ra12 natural
(p.e. SEQ ID NO: 4), una variante del mismo, o un fragmento del
mismo. Un polipéptido "variante" tal como se utiliza en el
presente documento es un polipéptido que se diferencia de un
polipéptido Ra12 natural en una o más sustituciones, deleciones,
adiciones y/o inserciones, de tal forma que la actividad biológica
del polipéptido no se ve sustancialmente reducida. Dicho de otra
forma, la capacidad de una variante de producir un polipéptido de
fusión en células huésped puede potenciarse o permanecer sin cambios
con respecto a la proteína Ra12 natural, o puede disminuirse en
menos del 50%, y preferiblemente en menos del 20%, con respecto a la
proteína Ra12 natural. Estas variantes pueden generalmente
identificarse mediante la modificación de las secuencias de
polipéptido descritas anteriormente y la determinación del nivel de
producción del polipéptido de fusión en las células huésped, como
es el caso de E. coli. Ejemplos de variantes incluyen
aquellas en que se ha quitado una pequeña porción (p.e.
1-30 aminoácidos, preferiblemente
5-15 aminoácidos) del extremo N y/o C de los
polipéptidos Ra12 naturales. En una realización, las variantes de
los polipéptidos Ra12 comprenden al menos aproximadamente 5
aminoácidos, al menos aproximadamente 10 aminoácidos, al menos
aproximadamente 30 aminoácidos, al menos aproximadamente 50
aminoácidos, o al menos aproximadamente 100 aminoácidos. En una
realización, la secuencia del polipéptido Ra12 es la mostrada en
SEQ ID NO: 4. En otra realización, la secuencia del polipéptido Ra12
comprende una porción de SEQ ID NO: 4. Por ejemplo, un polipéptido
Ra12 que comprende 30 aminoácidos (p.e. aminoácidos
1-30 de SEQ ID NO: 4) o un polipéptido Ra12 que
comprende 128 aminoácidos (p.e. aminoácidos 1-128
de SEQ ID NO: 4) puede utilizarse como una pareja de fusión. Véanse
los ejemplos 2 y 3 más abajo.
Las variantes de polipéptidos preferiblemente
exhiben una identidad de al menos aproximadamente el 70%, más
preferiblemente al menos aproximadamente el 80% o al menos
aproximadamente el 90%, y más preferiblemente aún al menos
aproximadamente el 95% (determinado tal como se ha descrito
anteriormente) con los polipéptidos identificados. Opcionalmente,
la identidad existe a lo largo de una región que tiene una longitud
de al menos 20 hasta aproximadamente 50 aminoácidos, u
opcionalmente a lo largo de una región que tiene una longitud de
75-100 aminoácidos.
Preferiblemente, una variante contiene
sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es
aquella en la que se sustituye el aminoácido por otro aminoácido
con propiedades similares, de tal forma que un experto en las
técnicas de la química peptídica anticiparía que la estructura
secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no tendrían
apenas cambios. Pueden generalmente realizarse las sustituciones de
aminoácidos en función de la similitud en la polaridad, la carga,
la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la
naturaleza amfipática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos
negativamente cargados incluyen los ácidos aspártico y glutámico;
los aminoácidos negativamente cargados incluyen lisina y arginina; y
los aminoácidos con grupos de cabeza no cargados con valores de
hidrofilicidad incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y
alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y
tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar
cambios conservadores incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln,
asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala,
phe; (4) lys, arg, his; and (5)phe, tyr, trp, his. Una
variante puede también, o como alternativa, contener cambios no
conservadores. En una realización preferida, variantes de
polipéptidos difieren de una secuencia natural en una sustitución,
deleción o adición de cinco o menos aminoácidos. Las variantes
pueden también (o como alternativa) modificarse, por ejemplo,
mediante la deleción o adición de aminoácidos que tienen una
influencia mínima en la inmunogenicidad, la estructura secundaria y
la naturaleza hidropática del polipéptido.
Así, los términos tales como "polipéptido
Ra12" o "secuencia de polipéptidos Ra12" tal como se
utilizan en el presente documento se refieren a secuencias de
polinucleótidos Ra12 naturales (p.e., SEQ ID NO: 4), fragmentos de
las mismas (p.e. SEQ ID NO: 17 ó 18), o cualquier variante de los
mismos. Funcionalmente, cualquier polipéptido Ra12 tiene la
capacidad de producir una proteína de fusión, y su capacidad de
producir una proteína de fusión en células huésped puede
potenciarse o dejarse sin cambios con respecto al polipéptido Ra12
natural (p.e., SEQ ID NO: 4), o puede ser disminuida en menos del
50%, y preferiblemente en menos del 20% relativo al polipéptido
Ra12 natural.
Tal como se ha apuntado anteriormente, los
polipéptidos de fusión pueden conjugarse con un enlazador o otra
secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación
del polipéptido o para potenciar la unión del polipéptido a un
suporte sólido. Por ejemplo, una secuencia enlazadora polipéptica
puede emplearse para separar un polipéptido Ra12 y un polipéptido
heterólogo de interés hasta una distancia suficiente como para
asegurar que cada polipéptido pliegue en sus estructuras secundarias
y terciarias. Esta secuencia enlazadora peptídica se incorpora en
una proteína de fusión con técnicas estándar conocidas en el estado
de la técnica. Las secuencias enlazadoras peptídicas indicadas
pueden seleccionarse de acuerdo con los siguientes factores: (1) su
capacidad para adoptar una conformación flexible extendida; (2) su
incapacidad de adoptar una estructura secundaria que podría
interaccionarse con epitopos funcionales en los polipéptidos primero
y segundo; y (3) la falta de residuos hidrófobos o cargados que
podrían interaccionarse con los epitopos polipeptídicos funcionales.
En ciertas realizaciones, las secuencias enlazadoras polipeptídicas
pueden contener grupos de Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos casi
neutrales, tales como Thr y Ala pueden también emplearse en la
secuencia enlazadora. Las secuencias de aminoácidos que pueden
aprovecharse como enlazadores incluyen las descritas en Maratea
et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA83:8258-8262,
1986; la Patente Estadounidense núm. 4.935.233 y la Patente
Estadounidense núm. 4.751.180. La secuencia enlazadora puede
generalmente tener una longitud de 1 a aproximadamente 50
aminoácidos. No se precisan las secuencias enlazadoras cuando los
polipéptidos primero y segundo tienen regiones de aminoácidos del
extremo N no esenciales que pueden utilizarse para separar los
dominios funcionales y para evitar la interferencia estérica.
En una realización preferida, un enlazador puede
proporcionar un sitio de escisión específica entre el polipéptido
Ra12 y un polipéptido heterólogo de interés. Este sitio de escisión
puede contener una diana para una enzima proteolítica que incluye,
por ejemplo, enteroquinasa, Factor Xa, tripsina, colagenasa,
trombina, ubiquitina hidrolasa; o para agentes de escisión químicos
tale como, por ejemplo, bromuro de cianageno o hidroxiamina.
Un polipéptido de fusión puede opcionalmente
contener una etiqueta de afinidad que se enlaza con un polipéptido
de fusión de tal forma que se puede simplificar la purificación de
polipéptidos recombinantes. Por ejemplo, residuos múltiples de
histidina codificados por la etiqueta permiten la aplicación de
métodos cromatográficos de afinidad a quelatos de metales para la
purificación de polipéptidos de fusión. Otros ejemplos de moléculas
etiqueta de afinidad incluyen Strep-tag, PinPoint,
proteína de unión a la maltosa, glutationa
S-transferasa, etc. Véase, por ejemplo, Glick y
Pasternak (1999) Molecular Biotechnology Principles and Applications
of Recombinant DNA, 2ª Ed., American Society for Microbiology,
Washington, DC.
Los polipéptidos de fusión pueden prepararse de
acuerdo con cualquiera de una variedad de técnicas conocidas. Los
polipéptidos de fusión recombinantes codificados por secuencias de
ADN tal como se ha descrito anteriormente pueden prepararse
fácilmente de las secuencias de ADN con cualquiera de una variedad
de vectores de expresión conocidos a expertos en la técnica. Es
posible conseguir la expresión en cualquier célula huésped apropiada
que se ha transformado o transfectado con un vector de expresión
que contiene una molécula de ADN que codifica un polipéptido
recombinante. Células huésped apropiadas incluyen procariotas,
levaduras, y las células eucarióticas superiores descritas
anteriormente. Preferiblemente, la célula huésped empleada e E.
coli. Los sobrenadantes de sistemas de huésped/vector
apropiados que segregan una proteína o un polipéptido recombinante
en medios de cultivo pueden concentrarse primero con un filtro
disponible comercialmente. Después del paso de concentración, el
concentrado puede aplicarse a una matriz indicada de purificación
tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico.
Por último, una o más etapas de HPLC en fase inversa pueden
emplearse para adicionalmente purificar un polipéptido
recombinante.
Las porciones de otras variantes con menos de
100 aminoácidos, y generalmente menos de aproximadamente 50
aminoácidos, pueden generarse también mediante métodos sintéticos
con técnicas conocidos para los expertos en el estado de la
técnica. Por ejemplo, estos polipéptidos pueden sintetizarse con
cualquiera de las técnicas en fase sólida comercialmente
disponible, tales como el método de síntesis en fase sólida de
Merrifield, en que los aminoácidos se añaden de forma secuencial a
una cadena creciente de aminoácidos. Véase Merrifield, J. Am. Chem.
Soc. 85:2149-2146, 1963. El equipamiento para la
síntesis automatizada de los polipéptidos está disponible
comercialmente en suministradores tales como Perkin Elmer/Divisón de
biosistemas aplicados (Foster City, CA), y puede operarse de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
En general, se aíslan los polipéptidos
(incluidas las proteínas de fusión) y los polinucleótidos tal como
se describe en el presente documento. Un polipéptido o
polinucleótido "aislado" es aquél que se extrae de su entorno
original. Por ejemplo, una proteína que ocurre en la naturaleza se
aísla si no se separa de uno o todos los materiales con que
coexiste en el sistema natural. Las variantes de polipéptidos
preferiblemente exhiben una pureza de al menos aproximadamente el
90%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% y más
preferiblemente aún de al menos aproximadamente el 99%. Un
polinucleótido se considera aislado si, por ejemplo, se clona en un
vector que no forma parte del medio natural.
Además de proporcionar una expresión estable y
de alto rendimiento de los polipéptidos de fusión de interés, los
ácidos nucleicos y los polipéptidos recombinantes de fusión de la
invención pueden emplearse en diversos métodos. Por ejemplo, la
secuencia codificadora del polipéptido de fusión de la invención
pueden utilizarse para codificar un producto proteico para usar
como un antígeno para la detección de anticuerpos séricos. Por
ejemplo, la presencia de anticuerpos séricos contra los antígenos de
M. tuberculosis en un individuo indica que este individuo
está infectado con M. tuberculosis. En las pruebas
diagnósticas estándares, se detectan los anticuerpos contra M.
tuberculosis detectando la unión de anticuerpos séricos a las
proteínas de M. tuberculosis. Los polipéptidos de fusión de
la invención son útiles como fuentes de proteínas para detectar la
unión de anticuerpos séricos a las proteínas de fusión.
Alternativamente, el polipéptido de fusión puede
utilizarse como un inmunógeno para inducir y/o potenciar las
respuestas inmunitarias. Estas secuencias codificadoras pueden
ligarse con una secuencia codificadora de otra molécula tal como un
antígeno de M. tuberculosis, una citoquina, o un adyuvante.
Estos polinucleótidos pueden utilizarse in vivo como una
vacuna de ADN (Patente Estadounidense núm. 5.589.466; 5.679.647; y
5.703.055). Alternativamente, pueden emplearse polipéptidos de
fusión purificados o parcialmente purificados o fragmentos como
vacunas u otras composiciones terapéuticas. Cualquiera de una
variedad de métodos conocidos en el estado de la técnica puede
emplearse para producir vacunas o composiciones terapéuticas que
comprenden los polipéptidos de fusión de la presente invención.
Una vez expresada una proteína recombinante,
puede identificarse mediante ensayos basados en las propiedades
físicas o funcionales del producto, tales como el marcaje
radioactivo del producto seguido de un análisis por electrofóresis
en gel, radioinmunoensayo, ELISA, bioensayos, etc.
Una vez identificada la proteína codificada, se
puede aislar y purificar de acuerdo con métodos estandares como la
cromatografía (p.e. cromatografía liquida de alto rendimiento,
intercambio iónico, afinidad, y cromatografía de tamizado en
columna), centrifugación, solubilidad diferencial, o cualquier otra
técnica estandar para la purificación de proteínas. Véase, para una
vista general, R. Scopes, Protein Purification,
Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in
Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press,
Inc. N.Y. (1990). Las condiciones actualmente utilizadas dependerán
en parte de factores tales como la carga neta, la hidrofobicidad,
la hidrofilicidad, etc., y serán obvios para los expertos en el
tema. Las propiedades funcionales pueden evaluarse mediante
cualquier ensayo apropiado.
Las propiedades funcionales de la proteína de
fusión pueden evaluarse con cualquier ensayo indicado tal como un
ensayo de unión de anticuerpos, inducción de proliferación de las
células T, estimulación de la producción de las citoquinas tales
como IL2, IL4 y IFN-\gamma. Para realizar la
presente invención, es preferible que cada proteína de fusión tenga
una purificación de al menos el 80% respecto a otras proteínas. Más
preferible aún es que estén purificadas hasta al menos el 90%. Para
una administración in vivo, es preferible que las proteínas
se purifiquen hasta al menos el 95%. Las proteínas purificadas
pueden someterse a un procesamiento adicional antes del uso. Por
ejemplo, las proteínas pueden digerirse con una enzima específica
para separar el polipéptido Ra12 del polipéptido heterólogo.
Un experto reconocería que las modificaciones
efectuadas a los ácidos nucleicos recombinantes y los polipéptidos
de fusión no perjudican su actividad biológica. Algunas medicaciones
pueden hacerse para facilitar la clonación, expresión, o
incorporación de la molécula etiqueta en un polipéptido de fusión.
Estas modificaciones son conocidas por expertos en la materia e
incluyen, por ejemplo, un metionino añadido en el extremo amino para
proporcionar un sitio de interacción, o aminoácidos adicionales
(p.e. poli His) colocados en cada extremo para crear sitios de
restricción estratégicamente situados o codones de terminación o
secuencias de purificación.
Los siguientes Ejemplos se ofrecen con fines
ilustrativos y no limitan el alcance de la invención.
Los siguientes Ejemplos describen experimentos
que ilustrarán que los constructos de fusión Ra12 produjeron una
expresión estable de alto rendimiento de los polipéptidos de fusión.
Los siguientes ejemplos también ilustran que varias secuencias de
Ra12 pueden emplearse como pareja de fusión.
Las secuencias codificadores de los antígenos de
M. tuberculosis se modificaron mediante RCP con tal de
facilitar su fusión y la posterior expresión de la proteína de
fusión. El vector pET 17b (Novagen) se modificó para incluir Ra12,
un fragmento terminal de 14 kDaC del antígeno de serina proteasa
MTB32A de M. tuberculosis. El codón 3' de terminación de la
secuencia Ra12 se sustituyó con un sitio EcoRI en el marco y el
extremo N se modificó para codificar seis residuos
His-etiqueta inmediatamente después del Met
iniciador para facilitar un protocolo de purificación sencillo de
un paso de proteínas recombinantes Ras12 mediante la cromatografía
de afinidad sobre una matriz de
Ni-NTA.
Ni-NTA.
Específicamente, el fragmento del extremo C del
antígeno MTB32A se amplificó mediante métodos estándar de RCP con
cebadores de oligonucleótidos 5' CAA TTA CAT ATG CAT CAC
CAT CAC CAT CAC ACG GCC GCG TCC GAT AAC TTC (SEQ ID NO: 13) y
la secuencia de oligonucleótidos 3' es 5'-CTA ATC
GAA TTC GGC CGG GGG TCC CTC GGC CAA (SEQ ID NO: 14). El
producto de 450 bp se digirió con NdeI y EcoRI y se clonó en el
vector de expresión pET 17b, también digerido con las mismas
enzimas. La expresión de la proteína recombinante Ra12 se realizó
después de la transformación en las células huésped de E.
coli BL-21 (pLysE) (Novagen) y la inducción con
IPTG. Después de lisis de las células de E. coli y
centrifugación a 10K rpm, el Ra12 recombinante se encontró en la
fracción soluble del sobrenadante. La proteína del sobrenadante
soluble se purificó mediante cromatografía de afinidad sobre una
columna Ni-NTA que permaneció soluble después de
diálisis en 1 x PBS. La cantidad de proteína purificada obtenida
fue generalmente del orden de 60 a 100 mg por litro.
La secuencia de DPPD se modificó para expresarse
como una proteína de fusión con Ra12 mediante el diseño de
cebadores de oligonucleótidos para amplificar específicamente la
forma madura segregada. El oligonucleótido 5' que contiene el sitio
de reconocimiento de enteroquinasa (DDDK) tiene las secuencias
5'-CAA TTA GAA TTC GAC GAC GAC GAC AAG GAT
CCA CCT GAC CCG CAT CAG-3' (SEQ ID NO: 15) y la
secuencia 3' de oligonucleótidos es 5'CAA TTA GAA TTC TCA
GGG AGC GTT GGG CTG CTC (SEQ ID NO: 16). El producto amplificado por
RCP se digirió con EcoRI y se subclonó en el sitio EcoRI del vector
pET-Ra12. Después de la transformación en la cepa de
E. coli huésped (XL1-blue; Stratagene), los
clones que contenían la inserción del tamaño correcto se sometieron
para secuenciar con tal de identificar los que estaban en el marco
con la fusión de Ra12. Posteriormente, el ADN de interés (Fig. 3)
se transformó en el huésped bacteriano BL-21 (pLysE)
y la proteína de fusión se expresó después de inducción del cultivo
con IPTG.
La proteína de fusión recombinante
(His-etiqueta) Ra12-DPPD se purificó
de 500 ml de cultivos discontinuos inducidos con IPTG del
sobrenadante soluble mediante la cromatografía de afinidad con la
matriz de agarosa de un paso QIAexpress Ni-NTA
(QIAGEN, Chatsworth, CA) en presencia de 8M de urea. Resumiendo, 20
ml de un cultivo saturado y dejado durante la noche de BL21 que
contenían el constructo pET se añadió a 500 ml del medio 2xYT que
contenía 50 \mug/ml de ampicilina y 34 \mug/ml de cloranfenicol,
cultivado a 37ºC sin agitación. Los cultivos bacterianos se
indujeron con IPTG a 2 mM a una DO a 560 de 0,3 y se cultivaron
durante otras 3 h (DO = 1,3 a 1,9).
Las células se recogieron de los cultivos
discontinuos de 500 ml mediante centrifugación y se resuspendieron
en 20 ml de tampón de unión (0,1 M de fosfato de sodio, pH 8,0; 10
mM Tris-HCl, pH 8,0) que contenía 2 mM de PMSF y 20
\mug/ml de leupeptina. La E. coli se lisó mediante la
adición de 15 mg de lisozima y agitación durante 30 min a 4ºC
después de sonicación (4 x 30 seg.). Las células lisadas se
centrifugaron a 12 k rpm durante 30 min. Y la urea se añadió
directamente al sobrenadante a una concentración final de 8M.
El sobrenadante se unió de forma discontinua a
la resina agarosa Ni-NTA (5 ml de resina por 500 ml
de inducciones) mediante agitación a temperatura ambiente durante 1
hora y la matriz se pasó por encima de una columna. El flujo se
pasó dos veces por la misma columna seguido de tres lavados de 30 ml
cada uno de tampón de lavado (0,1 M de fosfato de sodio y 10 mM de
Tris-HCl, pH 6,3) que también contenía 8 M de urea.
La proteína unida se eluyó con 30 ml de 100 mM de imidazol en
tampón de lavado y se recogieron fracciones de 5 ml. Las fracciones
que contenían el antígeno recombinante se unieron y se dializaron
contra 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), se unieron de nuevo
a la matriz Ni-NTA, se eluyeron y se dializaron con
1xPBS (pH 7,4) o 10 mM Tris-HCl (pH 7,8). El
rendimiento de la proteína de fusión purificada fue de 50 a 75 mg
por litro de cultivo bacteriano inducido con una pureza de más del
95% en una banda única. Las proteínas recombinantes se ensayaron
para contaminación con endotoxinas con el ensayo de Limulus
(BioWhittaker) y se mostró que contenían < 10 E.U./mg (< 1 ng
LPS/mg).
La proteína de fusión purificada (100 \mug) se
mezcló con 100 \mug de muramil dipéptido, se llevó hasta un 1 ml
con 1 X PBS y se emulsificó con 1 ml de IFA (Adyuvante de Freund no
completo; Life Technologies). La emulsión se inyectó por vía
subcutánea en sitios múltiples de un conejo hembra de raza Nueva
Zelanda (R&R Rabbitry, Stanwood, WA). El conejo recibió dos
dosis de recuerdo posteriores (100 \mug de antígeno en IFA)
separado por 6 semanas y una inyección final intravenosa con 100
\mug de la proteína recombinante de nuevo después de 6 semanas.
Una semana después de la inyección de recuerdo final, se sacrificó
el conejo y el suero se recogió y se almacenó a -20ºC.
El lisado complete de M. tuberculosis
(cepa H37Rv) o PPD (2,5 Pg cada uno) y 25 ng de proteína de fusión
recombinante Ra12-DPPD se separaron mediante
electroforesis sobre geles de SDS-PAGE al 16% y se
transfirieron a nitrocelulosa con un equipo semiseco de
transferencia (BioRad). Las transferencias, en duplicado, se
bloquearon durante un mínimo de 1 hora con PBS/Tween al 0,1% y se
sondeó con sueros policlonales del mismo conejo antes o después de
inmunización con la proteína de fusión recombinante purificada
(diluida 1:500 en PBS/Tween al 0,1%. La reactividad se evaluó como
se hizo anteriormente con [125I]-proteína A, seguida
de la autorradiografía.
Varios sistemas de expresión se evaluaron
inicialmente para la expresión de DPPD en E. coli. Este
proceso incluyó la subclonación de la secuencia codificadora de
DPPD como constructos de no fusión en 1) pET 17b (Novagen) y pQ30
(Qiagen, Santa Clarita, CA) o 2) como constructos de fusión con
pET32A (Novagen, Madison, WI) o pGEX-2T (Pharmacia
Biotech, Piscataway, NJ). En todos de estos sistemas, se expresó y
se purificó muy poca cantidad de DPPD.
En cambio, cuando la secuencia codificadora de
DPPD se insertó en la posición 3' en la secuencia Ra12 en un vector
de expresión y se transformó en E. coli, se produjo una gran
cantidad de proteína de fusión Ra12-DPPD. La
secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) y la secuencia de
aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de Ra12-DPPD se
describen en la Figura 3. La inmunogenicidad de DPPD se mantuvo tal
como evidenció la capacidad del antisuero para reaccionar con la
proteína purificada en el análisis de inmunotransferencia. Además,
otras tres proteínas de origen eucariótica o procariótica (véanse
las Figuras 4-6) también se expresaron con éxito
mediante los constructos de fusión Ra12. De esta forma, la
secuencia codificadora Ra12 es útil como pareja de fusión en un
constructo de expresión para facilitar la expresión de una
secuencia heteróloga.
En este Ejemplo, un polipéptido Ra12 que
comprende los aminoácidos 1-30 de SEQ ID NO: 4 se
empleó como pareja de fusión para ligarse con un gen humano
completo de mamaglobina. La forma corta del polipéptido Ra12 tiene
la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 17, y se refiere
en el presente documento como "Ra12 (corto)".
Tal como se muestra en la Figura 9, el extremo
3' de la secuencia Ra12 (corto) se fusiona con el gen humano
completo de mamaglobina. Específicamente, el gen humano de
mamaglobina se amplificó mediante métodos estándar de RCP con los
siguiente cebadores de oligonucleótidos: el cebador 5', sitio Hind
III: 5'-gcgaagcttATGAAGTTGCT
GATGGTCCTCATGC-3' (SEQ ID NO: 19); el cebador 3', sitio XhoI: 5'-cggctcgagTTAAAATAAATCACAAA
GACTGCTGTC-3'(SEQ ID NO: 20). Los sitios 5' Hind III y 3' Xho I se añadieron para facilitar la subclonación en un vector. El extremo N del constructo de fusión se modificó para codificar seis residuos de His-etiqueta inmediatamente después de Met para facilitar los protocolos de purificación. La expresión del constructo de fusión se llevó a cabo mediante la transformación de E. coli con procedimientos similares a aquellos descritos en el Ejemplo 1. Comparado con un constructo sin la secuencia Ra12 (corto), el constructo de fusión con una secuencia Ra12 (corto) sustancialmente aumentó la expresión de la proteína de fusión Ra12(corto)-mamaglobina.
GATGGTCCTCATGC-3' (SEQ ID NO: 19); el cebador 3', sitio XhoI: 5'-cggctcgagTTAAAATAAATCACAAA
GACTGCTGTC-3'(SEQ ID NO: 20). Los sitios 5' Hind III y 3' Xho I se añadieron para facilitar la subclonación en un vector. El extremo N del constructo de fusión se modificó para codificar seis residuos de His-etiqueta inmediatamente después de Met para facilitar los protocolos de purificación. La expresión del constructo de fusión se llevó a cabo mediante la transformación de E. coli con procedimientos similares a aquellos descritos en el Ejemplo 1. Comparado con un constructo sin la secuencia Ra12 (corto), el constructo de fusión con una secuencia Ra12 (corto) sustancialmente aumentó la expresión de la proteína de fusión Ra12(corto)-mamaglobina.
En este Ejemplo, se empleó un polipéptido Ra12
que comprende los aminoácidos 1-128 de SEQ ID NO: 4
como pareja de fusión para ligarse con el gen humano completo de
mamaglobina. Esta forma larga del polipéptido Ra12 tiene la
secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 18, y en este
documento, se le refiere como "Ra12 (largo)". Se utilizaron
procedimientos de clonación y de expresión similares a aquellos
descritos en el Ejemplo 2. Comparado con un constructo sin una
secuencia Ra12 (largo), el constructo de fusión con una secuencia
Ra12 (largo) sustancialmente aumentó la expresión de la proteína de
fusión Ra12 (largo)-mamaglobina.
La presente invención no se limita en su alcance
a los ejemplos de realizaciones, cuyo fin es ilustrar los aspectos
de la invención, y cualesquiera clones, secuencias de nucleótidos o
aminoácidos que son funcionalmente equivalentes pueden usarse
también. De hecho, varias modificaciones de la invención además de
aquellas descritas en el presente documento se desvelarán a los
expertos en el tema a partir de esta descripción y los dibujos que
la acompañan. También se entiende que todos los tamaños de pares de
bases dados para los nucleótidos son aproximados y se utilizan para
describir la invención.
<110> Corixa Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos para usar una secuencia
codificadora de Mycobacterium Tuberculosis para
facilitar la expresión estable y de alto rendimiento de las
proteínas heterólogas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> AHB/FP6050272
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 00970619.3
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2000-10-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US00/27652
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-10-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/158,585
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-10-07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1872
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Mycobacterium
tuberculosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 32 KD serina proteasa MTB32A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (89)..(1156)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MTB32A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (89)..(184)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de señal hidrófoba
secretora del extremo N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mat_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (185)..(153)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 355
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mycobacterium
tuberculosis
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 32 KD serina proteasa MTB32A
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 396
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<212> ADN
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<213> Mycobacterium
tuberculosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Fragmento del extremo C de 14 KD de
MTB32A Ra12
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(396)
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<223> Ra12
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 132
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<212> PRT
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<213> Mycobacterium
tuberculosis
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento del extremo C de 14 KD de
MTB32A Ra12
\newpage
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<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 702
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
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<222> (4)..(696)
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<223> Polipéptido de fusión
Ra12-DPPD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: polipéptido de fusión Ra12-DPPD
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 230
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: polipéptido de fusión Ra12-DPPD
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 1746
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: fusión Ra12-WT1
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> CDS
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<222> (4)..(1740)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido de fusión
Ra12-WT1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 578
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: polipéptido de fusión Ra12-WT1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 672
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: fusión Ra12-mamaglobina humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(666)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido de fusión
Ra12-mamaglobina humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: polipéptido de fusión Ra12-mamaglobina
humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: fusión Ra12-H9-32A
(fusión
Ra12-MTB39-MYB32A(N-ter))
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(2190)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido de fusión
Ra12-H9-32A
(Ra12-MTH39-MTH32A(N-ter))
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 729
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: polipéptido de fusión
Ra12-H9-32A (polipéptido de fusión
Ra12-MTB39-MTB32A(N-ter))
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de oligonucleótido para amplificación de PCR del
fragmento del extremo C de MYB32A Ra12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaattacata tgcatcacca tcaccaatcac acggccgcgt ccgataactt c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de oligonucleótido 3' para amplificación de PCR
del fragmento del extremo C de MTB32A Ra12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaatcgaat tcggccgggg gtccctcggc caa
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de oligonucleótido 5' que contiene el sitio de
reconocimiento de enteroquinasa para amplificación de la forma
secretada madura de DPPD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaattagaat tcgacgacga cgacaaggat ccacctgacc cgcatcag
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de oligonucleótido 3' que contiene el sitio de
reconocimiento de enteroquinasa para amplificación de la forma
secretada madura de DPPD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaattagaat tctcagggag cgttgggctg ctc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: polipéptido Ra12 (corto)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln
Gly Gly Gln Gly Phe}
\sac{Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile
Ala Gly Gln Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: polipéptido Ra12 (largo)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de oligonucleótido 5', sitio HIndIII, para
amplificación de PCR de mamaglobina humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgaagctta tgaagttgct gatggtcctc atgc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador de oligonucleótido 3', sitio XhoI, para
amplificación de PCR de mamaglobina humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggctcgagt taaaataaat cacaaagact gctgtc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Met-His tag 6aa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met His His His His His His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sitio de reconocimiento
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipde enteroquinasa
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asp Asp Lys}
Claims (23)
1. Un método para la expresión estable y
de alto rendimiento de un polipéptido heterólogo recombinante;
dicho método comprende la expresión en una célula huésped una
molécula de un ácido nucleico recombinante que codifica un
polipéptido de fusión, en donde dicho polipéptido de fusión
comprende un polipéptido Ra12 y un polipéptido heterólogo, en donde
al polipéptido Ra12 se le codifica una secuencia Ra12 de
polinucleótidos que hibrida a una secuencia complementaria a SEQ ID
NO: 3 bajo condiciones exigentes y en donde la secuencia Ra12 de
polinucleótidos se posiciona 5' respecto a la secuencia heteróloga
de polinucleótidos que codifica el polipéptido hete-
rólogo.
rólogo.
2. El método según la reivindicación 1,
en donde el polipéptido de fusión adicionalmente comprende una
etiqueta de afinidad que se enlaza con el polipéptido de fusión.
3. El método según la reivindicación 1 ó
2, en donde el polipéptido de fusión se purifica de la célula
huésped.
4. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la célula huésped es E.
coli.
5. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde la molécula de ácido nucleico
recombinante adicionalmente comprende una secuencia de
polinucleótidos que codifica un péptido enlazador entre la
secuencia Ra12 de polinucleótidos y la secuencia heteróloga de
polinucleótidos.
6. El método según la reivindicación 5,
en donde el péptido enlazador comprende un sitio de escisión.
7. El método según la reivindicación 1,
en donde la secuencia heteróloga de ácido nucleico codifica un
polipéptido DPPD, WT1, mamaglobina, o H9-32a.
8. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde la secuencia Ra12 de
polinucleótidos comprende al menos 30 nucleótidos.
9. El método según la reivindicación 8,
en donde la secuencia Ra12 de polinucleótidos comprende al menos 60
nucleótidos.
10. El método según la reivindicación 8,
en donde la secuencia Ra12 de polinucleótidos comprende al menos
100 nucleótidos.
11. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en donde la secuencia Ra12 de
polinucleótidos codifica un polipéptido Ra12 tal como se indica en
la SEQ ID NO: 17.
12. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en donde la secuencia Ra12 de
polinucleótidos codifica un polipéptido Ra12 tal como se indica en
la SEQ ID NO: 18.
13. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en donde la secuencia Ra12 de
polinucleótidos es como se indica en la SEQ ID NO: 3.
14. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en donde la secuencia Ra12 de
polinucleótidos codifica un polipéptido Ra12 tal como se indica en
la SEQ ID NO: 4 o una variante con una identidad con la misma en
cuanto a los aminoácidos de al menos un 90%.
15. El método según la reivindicación 14,
en donde la secuencia Ra12 de polinucleótidos codifica un
polipéptido Ra12 tal como se indica en la SEQ ID NO: 4 o una
variante con una identidad con la misma en cuanto a los aminoácidos
de al menos un 95%.
16. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde la secuencia Ra12 de polipéptidos
comprende al menos 10 aminoácidos.
17. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 16, en donde la secuencia Ra12 de polipéptidos
comprende al menos 30 aminoácidos.
18. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 16, en donde la secuencia Ra12 de polipéptidos
comprende al menos 100 aminoácidos.
19. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde la secuencia Ra12 de polipéptidos
tiene la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 4.
20. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde la secuencia Ra12 de polipéptidos
tiene la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 17.
21. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde la secuencia Ra12 de polipéptidos
tiene la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 18.
22. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21, en donde el método adicionalmente comprende
el polipéptido de fusión entre el polipéptido Ra12 y el polipéptido
heterólogo.
23. El uso de una secuencia Ra12 de
polinucleótidos que hibrida con una secuencia complementaria a SEQ
ID NO: 3 bajo condiciones exigentes en un método para la expresión
estable y de alto rendimiento de un polipéptido heterólogo
recombinante, en donde dicho método comprende la expresión en una
célula huésped de una molécula que codifica un polipéptido de
fusión, en donde dicho polipéptido de fusión comprende un
polipéptido Ra12 codificado por dicho polinucleótido Ra12 y un
polipéptido heterólogo, en donde dicha secuencia Ra12 de
polinucleótidos está posicionada 5' respecto a la secuencia
heteróloga de polinucleótidos que codifica el polipéptido
heterólogo.
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2007
- 2007-05-14 CY CY20071100656T patent/CY1106593T1/el unknown
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