ES2368899T3 - Composiciones para el tratamiento y el diagnóstico de cáncer de mama y métodos para el uso de las mismas. - Google Patents

Abstract

Un polipeptido aislado que comprende al menos una porci6n de una protefna de tumor de mama, en que el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la secuencia polinucleotfdica expuesta en la ID. SEC. nO 175, o una variante de dicho polipeptido en que la variante comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por una secuencia polinucleotfdica que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a una secuencia de ID. SEC. nO 175, y la capacidad de la variante para reaccionar con antisueros antigenicamente especfficos esta potenciada, inalterada o disminuida en menos de un 50% con respecto a la de un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la ID. SEC. nO 175; con tal de que el polipeptido no tenga la secuencia expuesta en la ID. SEC. nO 176 con la sustituci6n de Val Ile por Asn Ser en las posiciones 316 y 317.

Description

Composiciones para el tratamiento y el diagn6stico de cancer de mama y metodos para el uso de las mismas

Campo tecnico

El presente invento se refiere, en general, a composiciones y metodos para el tratamiento del cancer de mama. Mas particularmente, el invento esta relacionado con polipeptidos que comprenden al menos una porci6n de una protefna que se expresa preferentemente en tejido de tumor de mama, y a polinucle6tidos que codifican dichos polipeptidos. Dichos polipeptidos y polinucle6tidos pueden ser utilizados en vacunas para el tratamiento del cancer de mama. Fundamento del invento El cancer de mama es un problema sanitario significativo para las mujeres de los Estados Unidos y de todo el mundo. Aunque se han realizado progresos en la detecci6n y el tratamiento de la enfermedad, el cancer de mama sigue siendo la segunda causa principal de muerte relacionada con el cancer en las mujeres, afectando a mas de

180.000 mujeres cada ano en los Estados Unidos. Para las mujeres de America del Norte, la probabilidad de verse afectadas en su vida por un cancer de mama es de uno entre ocho. No se dispone actualmente de vacuna alguna ni de otro metodo universalmente satisfactorio para la prevenci6n o el tratamiento del cancer de mama. El control de la enfermedad se basa actualmente en una combinaci6n de un diagn6stico precoz (por medio de procedimientos de exploraci6n de mama rutinarios) y un tratamiento agresivo, el cual puede incluir uno o mas de diversos tratamientos tales como cirugfa, radioterapia, quimioterapia y terapia hormonal. El programa de tratamiento para un cancer de mama particular es a menudo seleccionado basandose en una diversidad de parametros de pron6stico, incluyendo un analisis de marcadores tumorales especfficos. Vease, por ejemplo, Porter-Jordan y Lippman, Breast Cancer 8: 73-100 (1994). Sin embargo, el uso de marcadores establecidos conduce a menudo a un resultado que es diffcil de interpretar, y la elevada mortalidad observada en los pacientes con cancer de mama indica que son necesarias mejorfas en el tratamiento, el diagn6stico y la prevenci6n de la enfermedad. En el Documento EP1144449 se describe un conjunto de secuencias de cDNA parcialmente solapante y de polipeptidos codificados por ellas, transcritas a partir de tejido de mama. Estas secuencias son descritas como utiles para diagnosticar el cancer de mama. En consecuencia, existe en la tecnica la necesidad de metodos mejorados para el tratamiento y el diagn6stico del cancer de mama. El presente invento satisface estas necesidades y proporciona ademas otras ventajas relacionadas.

Sumario del invento

El presente invento proporciona compuestos y metodos para el tratamiento y el diagn6stico del cancer, tal como el cancer de mama. En un aspecto, se proporcionan polipeptidos aislados que comprenden al menos una porci6n de una protefna de tumor de mama o una variante de la misma. Ciertas porciones y otras variantes son inmunogenicas, por lo que la capacidad de la variante para reaccionar con antisueros especfficos de protefnas no se ve sustancialmente disminuida. El invento proporciona un polipeptido aislado que comprende al menos una porci6n de una protefna de tumor de mama, en que el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la secuencia polinucleotfdica expuesta en la ID. SEC. nO 175, o una variante de dicho polipeptido en que la variante comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por una secuencia polinucleotfdica que tiene una identidad de al menos 90% con una secuencia de ID. SEC. nO 175, y la capacidad de la variante para reaccionar con antisueros antigenicamente especfficos esta potenciada, inalterada o disminuida en menos de un 50% con respecto a un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la ID. SEC. nO 175; con tal de que el polipeptido no tenga la secuencia expuesta en la ID. SEC. nO 176 con la sustituci6n de Val Ile por Asn Ser en las posiciones 316 y 317. En realizaciones especfficas, los polipeptidos del invento comprenden al menos una porci6n de un antfgeno tumoral que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en la ID. SEC. NO 176. En aspectos relacionados, se proporcionan polinucle6tidos aislados que codifican los polipeptidos anteriores, o una porci6n de los mismos (tal como una porci6n que codifica al menos 15 restos de aminoacido contiguos de una protefna de tumor de mama). En realizaciones especfficas, dichos polinucle6tidos comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias proporcionadas en la ID. SEC. nO 175, y variantes de la misma. El presente invento proporciona ademas vectores de expresi6n que comprenden los polinucle6tidos anteriores, junto con celulas huesped transformadas o transfectadas con dichos vectores de expresi6n. En realizaciones preferidas, las celulas huesped son seleccionadas del grupo que consiste en celulas de E. coli,

levadura y mamffero.

En otro aspecto, el presente invento proporciona protefnas de fusi6n que comprenden unos polipeptidos primero y segundo del invento o, alternativamente, un polipeptido del invento y un conocido antfgeno de tumor de mama.

El presente invento proporciona vacunas, para uso profilactico o terapeutico, que comprende al menos uno de los polipeptidos anteriores o un polinucle6tido que codifica dicho polipeptido, en combinaci6n con un agente inmunoestimulante. Se describen composiciones farmaceuticas que comprenden al menos uno de los polipeptidos anteriores o un polinucle6tido que codifica dicho polipeptido, y un vehfculo fisiol6gicamente aceptable. Tambien se proporcionan vacunas y composiciones farmaceuticas que comprenden una o mas de las anteriores protefnas de fusi6n.

Se describen composiciones farmaceuticas que comprenden: (a) un anticuerpo o un fragmento ligante de antfgenos del mismo, que se une especfficamente a una protefna de tumor de mama; y (b) un vehfculo fisiol6gicamente aceptable.

Se describen composiciones farmaceuticas que comprenden: (a) una celula presentadora de antfgeno, que expresa un polipeptido como el anteriormente descrito, y (b) un excipiente o vehfculo farmaceuticamente aceptable. Las celulas presentadoras de antfgeno incluyen celulas dendrfticas, macr6fagos, monocitos, fibroblastos y celulas B.

En aspectos relacionados, el presente invento proporciona vacunas que comprenden: (a) una celula presentadora de antfgeno, que expresa un polipeptido como el anteriormente descrito, y (b) un agente inmunoestimulante.

En aun otro aspecto, se describen metodos para inhibir el desarrollo de un cancer de mama en un paciente, que comprende administrar una cantidad eficaz de al menos una de las composiciones farmaceuticas y/o vacunas anteriores.

El presente invento proporciona ademas, en otros aspectos, metodos para eliminar celulas tumorales de una muestra biol6gica, que comprende poner una muestra biol6gica en contacto con celulas T que reaccionan especfficamente con una protefna de tumor de mama, en que la operaci6n de puesta en contacto se lleva a cabo bajo unas condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la eliminaci6n de las celulas que expresan la protefna, de la muestra.

En aspectos relacionados, se describen metodos para inhibir el desarrollo de un cancer en un paciente, que comprenden administrar al paciente una muestra biol6gica tratada del modo anteriormente descrito.

En otros aspectos, se proporcionan ademas metodos para estimular y/o multiplicar celulas T especfficas para una protefna de tumor de mama, que comprenden poner celulas T en contacto con uno o mas de: (i) un polipeptido como el anteriormente descrito; (ii) un polinucle6tido que codifica dicho polipeptido; y/o (iii) una celula presentadora de antfgeno, que expresa dicho polipeptido; bajo unas condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la estimulaci6n y/o multiplicaci6n de las celulas T. Tambien se proporcionan poblaciones aisladas de celulas T que comprenden celulas T preparadas del modo anteriormente descrito.

En otros aspectos, se describen metodos para inhibir el desarrollo de un cancer en un paciente, que comprenden administrar al paciente una cantidad eficaz de una poblaci6n de celulas T como la anteriormente descrita.

Se describen metodos para inhibir el desarrollo de un cancer en un paciente, que comprenden las operaciones de:

(a) incubar celulas T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente, con uno o mas de: (i) un polipeptido que comprende al menos una porci6n inmunogenica de una protefna de tumor de mama; (ii) un polinucle6tido que codifica dicho polipeptido; y (iii) una celula presentadora de antfgeno, que expresa dicho polipeptido; y (b) administrar al paciente una cantidad eficaz de las celulas T proliferadas, e inhibir por ello el desarrollo de un cancer en el paciente. Las celulas proliferadas pueden ser clonadas, aunque no es necesario, antes de la administraci6n al paciente.

Los polipeptidos aquf descritos pueden ser utilmente empleados en el diagn6stico y control del cancer de mama. En un aspecto del presente invento, se proporcionan metodos para detectar un cancer de mama en un paciente, que comprenden: (a) poner una muestra biol6gica obtenida del paciente en contacto con un agente ligante que es capaz de unirse a uno de los polipeptidos anteriores; y (b) detectar en la muestra una cantidad de un polipeptido que se une al agente ligante; y (c) comparar la cantidad del polipeptido con un valor de corte predeterminado y determinar, a partir de la comparaci6n, la presencia o ausencia de un cancer de mama en el paciente. En realizaciones preferidas, el agente ligante es un anticuerpo, muy preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

En aspectos relacionados, se proporcionan metodos para controlar el progreso de un cancer de mama en un paciente, que comprenden: (a) poner una muestra biol6gica obtenida del paciente en contacto con un agente ligante que es capaz de unirse a uno de los polipeptidos anteriores; (b) detectar en la muestra una cantidad de un polipeptido que se une al agente ligante; (c) repetir las operaciones (a) y (b) usando una muestra biol6gica obtenida del paciente en un tiempo posterior; y (d) comparar las cantidades de polipeptido detectadas en las operaciones (b) y (c).

En aspectos relacionados, el presente invento proporciona anticuerpos, preferiblemente anticuerpos monoclonales, que se unen a los polipeptidos del invento, asf como kits diagn6sticos que comprenden dichos anticuerpos, para inhibir el desarrollo del cancer de mama. Tambien se describen metodos para utilizar dichos anticuerpos.

En otros aspectos, el presente invento proporciona ademas metodos para determinar la presencia o ausencia de un cancer de mama en un paciente, que comprenden las operaciones de: poner una muestra biol6gica obtenida del paciente en contacto con un oligonucle6tido que se hibrida con un polinucle6tido que codifica una protefna de tumor de mama; (b) detectar en la muestra un nivel de un polinucle6tido, preferiblemente mRNA, que se hibrida con el oligonucle6tido; y (c) comparar el nivel del polinucle6tido que se hibrida con el oligonucle6tido, con un valor de corte predeterminado y determinar, a partir de la comparaci6n, la presencia o ausencia de un cancer de mama en el paciente. En ciertas realizaciones, la cantidad de mRNA es detectada por medio de una reacci6n en cadena de la polimerasa utilizando, por ejemplo, al menos un cebador oligonucleotfdico que se hibrida con un polinucle6tido que codifica un polipeptido como el anteriormente indicado, o con un complemento de dicho polinucle6tido. En otras realizaciones, la cantidad de mRNA es detectada utilizando una tecnica de hibridaci6n en que se emplea una sonda oligonucleotfdica que se hibrida con un polinucle6tido que codifica un polipeptido como el anteriormente indicado, o con un complemento de dicho polinucle6tido.

En aspectos relacionados, se proporcionan kits diagn6sticos que comprenden los anteriores cebadores o sondas oligonucleotfdicos.

Estos y otros aspectos del presente invento resultaran evidentes tras la referencia a la descripci6n detallada siguiente.

Breve descripcion de los identificadores de dibujos y secuencias

La ID. SEC. nO 71 es la determinada secuencia de cDNA de B726P.

La ID. SEC. nO 175 es la determinada secuencia de cDNA de B726P-20.

La ID. SEC. nO 176 es la prevista secuencia de aminoacidos de B726P-20.

La ID. SEC. nO 177 es un cebador de PCR.

La ID. SEC. nO 178 es la determinada secuencia de cDNA de B726P-74.

La ID. SEC. nO 179 es la prevista secuencia de aminoacidos de B726P-74.

La ID. SEC. nO 180 es la determinada secuencia de cDNA de B726P-79.

La ID. SEC. nO 181 es la prevista secuencia de aminoacidos de B726P-79.

La ID. SEC. nO 463 es una secuencia de DNA de consenso de B7226P (a la que se hace referencia como B726Pspliced seq B726P).

La ID. SEC. nO 464 es la determinada secuencia de DNA de una segunda forma de corte y empalme de B7226P (a la que se hace referencia como 27490.seq B726P).

La ID. SEC. nO 465 es la determinada secuencia de DNA de una tercera forma de corte y empalme de B7226P (a la que se hace referencia como 27068.seq B726P).

La ID. SEC. nO 466 es la determinada secuencia de DNA de una segunda forma de corte y empalme de B7226P (a la que se hace referencia como 23113.seq B726P).

La ID. SEC. nO 467 es la determinada secuencia de DNA de una segunda forma de corte y empalme de B7226P (a la que se hace referencia como 23103.seq B726P).

La ID. SEC. nO 468 es la determinada secuencia de DNA de una segunda forma de corte y empalme de B7226P (a la que se hace referencia como 19310.seq B726P).

La ID. SEC. nO 469 es la prevista secuencia de aminoacidos codificada por el ORF cadena arriba de la ID. SEC. nO

463.

La ID. SEC. nO 470 es la prevista secuencia de aminoacidos codificada por la ID. SEC. nO 464.

La ID. SEC. nO 471 es la prevista secuencia de aminoacidos codificada por la ID. SEC. nO 465.

La ID. SEC. nO 472 es la prevista secuencia de aminoacidos codificada por la ID. SEC. nO 466.

La ID. SEC. nO 473 es la prevista secuencia de aminoacidos codificada por la ID. SEC. nO 467.

Descripcion detallada del invento

Como se indic6 anteriormente, el presente invento se dirige, en general, a composiciones y a su uso para la terapia y el diagn6stico del cancer, tal como el cancer de mama. Las composiciones aquf descritas pueden incluir polipeptidos de tumor de mama, polinucle6tidos que codifican dichos polipeptidos, agentes ligantes tales como anticuerpos, celulas presentadoras de antfgeno (APCs; del ingles, antigen presenting cells) y/o celulas del sistema inmune (por ejemplo, celulas T). Los polipeptidos del presente invento comprenden generalmente al menos una porci6n (tal como una porci6n inmunogenica) de una protefna de tumor de mama o una variante de la misma. Una "protefna de tumor de mama" es una protefna que se expresa en celulas de tumor de mama en un nivel que es al menos dos veces, y preferiblemente al menos cinco veces, mayor que el nivel de expresi6n en un tejido normal, segun se determina utilizando un ensayo representativo aquf proporcionado. Ciertas protefnas de tumor de mama son protefnas tumorales que reaccionan detectablemente (en un inmunoensayo, tal como un ELISA o una transferencia Western) con antisueros de un paciente aquejado de cancer de mama. Los polinucle6tidos del invento objetivo comprenden generalmente una secuencia de DNA o RNA que codifica todo, o una porci6n de, dicho polipeptido, o una secuencia que es complementaria de dicha secuencia. Los anticuerpos son generalmente protefnas del sistema inmune, o fragmentos ligantes de antfgeno de las mismas, que son capaces de unirse a un polipeptido como el anteriormente descrito. Las celulas presentadoras de antfgeno incluyen celulas dendrfticas, macr6fagos, monocitos, fibroblastos y celulas B que expresan un polipeptido como el anteriormente descrito. Las celulas T que se pueden emplear en dichas composiciones son generalmente celulas T que son especfficas para un polipeptido como el anteriormente descrito.

El presente invento se basa en el descubrimiento de protefnas de tumor de mama humanas. En la ID. SEC. nO 175 se proporcionan secuencias de polinucle6tidos que codifican protefnas tumorales especfficas.

Polinucle6tidos de protefnas de tumor de mama

Todo polinucle6tido que codifique una protefna de tumor de mama o una porci6n u otra variante de la misma como las aquf descritas queda abarcado por el presente invento. Los polinucle6tidos preferidos comprenden al menos 15 nucle6tidos consecutivos, preferiblemente al menos 30 nucle6tidos consecutivos y mas preferiblemente al menos 45 nucle6tidos consecutivos, que codifican una porci6n de una protefna de tumor de mama. Mas preferiblemente, un polinucle6tido codifica una porci6n inmunogenica de una protefna de tumor de mama. Los polinucle6tidos complementarios de cualesquiera de dichas secuencias quedan tambien abarcados por el presente invento. Los polinucle6tidos pueden ser de cadena sencilla (codificadores o antisentido) o de cadena doble y pueden ser moleculas de DNA (gen6mico, cDNA o sintetico) o RNA. Las moleculas de RNA incluyen moleculas de HnRNA, que contienen intrones y corresponden a una molecula de DNA segun un modo de uno a uno, y moleculas de mRNA, que no contienen intrones. Pueden estar presentes, aunque no es necesario, secuencias codificadoras o no codificadoras adicionales en un polinucle6tido del presente invento, y un polinucle6tido puede estar enlazado, aunque no es necesario, a otras moleculas y/o materiales de soporte.

Los polinucle6tidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia end6gena que codifica una protefna de tumor de mama o una porci6n de la misma) o pueden comprender una variante de dicha secuencia. Las variantes polinucleotfdicas pueden contener una o mas sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones para que la inmunogenicidad del polipeptido codificado no resulte disminuida con respecto a la de una protefna tumoral nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipeptido codificado puede ser generalmente evaluada del modo aquf descrito. Las variantes presentan preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente 70%, mas preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente 80% y muy preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente 90%, con respecto a una secuencia polinucleotfdica que codifica una protefna nativa de tumor de mama o una porci6n de la misma. El termino "variantes" tambien abarca genes hom6logos de origen xenogenico.

Se dice que dos secuencias polinucleotfdicas o polipeptfdicas son "identicas" si la secuencia de nucle6tidos o aminoacidos de las dos secuencias es la misma cuando estas son alineadas para una maxima correspondencia, como se describe mas adelante. Las comparaciones entre dos secuencias se llevan tfpicamente a cabo comparando las secuencias sobre una ventana de comparaci6n para identificar y comparar regiones locales de similitud secuencial. Como aquf se utiliza, una "ventana de comparaci6n" se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 a aproximadamente 75, de 40 a aproximadamente 50, en el que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas una vez que las dos secuencias estan 6ptimamente alineadas.

El alineamiento 6ptimo de secuencias para la comparaci6n puede ser llevado a cabo utilizando el programa Megalign de la colecci6n Lasergene de softtare para bioinformatica (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin, EE.UU.), usando los parametros por omisi6n. Este programa realiza diversos esquemas de alineamiento descritos en las referencias siguientes: M. O. Dayhoff (1978), A model of evolutionary change in proteins -Matrices for detecting distant relationships, en M. O. Dayhoff (redactor), Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, volumen 5, suplemento 3, paginas 345-358; J. Hein (1990), Unified Approach to Alignment and Phylogenes, paginas 626-645, Methods in Enzymology, volumen 183, Academic Press, Inc., San Diego, California; D. G. Higgins y P. M. Sharp (1989), CABIOS 5: 151-153; E. W. Myers y W. Muller (1988), CABIOS

4:

11-17; E. D. Robinson (1971), Comb. Theor. 11: 105; N. Santou y M. Nes (1987), Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; P. H.

A.

Sneath y R. R. Sokal (1973), Numerical Taxonomy -the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, California; W. J. Wilbur y D. J. Lipman (1983), Proc. Natl. Acad, Sci. USA 80: 726-730.

Preferiblemente, el "porcentaje de identidad de secuencias" es determinado comparando dos secuencias 6ptimamente alineadas sobre una ventana de comparaci6n de al menos 20 posiciones, en que la porci6n de la secuencia polinucleotfdica o polipeptfdica de la ventana de comparaci6n puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos, normalmente del 5 al 15 por ciento, o del 10 al 12 por ciento, en comparaci6n con las secuencias de referencia (que no comprenden adiciones ni supresiones) para el alineamiento 6ptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el numero de posiciones en que se presentan bases de acido nucleico o restos de aminoacido identicos en ambas secuencias para obtener el numero de posiciones coincidentes, dividiendo el numero de posiciones coincidentes por el numero total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamano de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencias.

Las variantes pueden ser tambien, o alternativamente, sustancialmente hom6logas a un gen nativo o a una porci6n o complemento del mismo. Dichas variantes polinucleotfdicas son capaces de hibridarse bajo condiciones moderadamente rigurosas con una secuencia de DNA presente en la naturaleza que codifica una protefna nativa de tumor de mama (o una secuencia complementaria). Las condiciones moderadamente rigurosas adecuadas incluyen prelavado en una disoluci6n de SSC 5x, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH de 8,0); hibridaci6n a 50 °C-65 °C, SSC 5x, durante la noche; y luego lavado dos veces a 65 °C durante 20 minutos con cada uno de SSC 2x, 0,5x y 0,2x que contienen SDS al 0,1%.

Quienes tienen una experiencia normal en la tecnica apreciaran que, como resultado de la degeneraci6n del c6digo genetico, hay muchas secuencias de nucle6tidos que codifican un polipeptido como el aquf descrito. Algunos de estos polinucle6tidos poseen una homologfa mfnima con la secuencia de nucle6tidos de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucle6tidos que varfan a causa de diferencias en la utilizaci6n de codones estan especfficamente contemplados por el presente invento. Ademas, los alelos de los genes que comprenden las secuencias polinucleotfdicas aquf proporcionadas estan dentro del alcance del presente invento. Los alelos son genes end6genos que estan alterados como resultado de una o mas mutaciones, tales como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucle6tidos. El mRNA y la protefna resultantes pueden tener, aunque no es necesario, una estructura o funci6n alterada. Los alelos pueden ser identificados usando tecnicas estandares (tales como hibridaci6n, multiplicaci6n y/o comparaci6n de secuencias de bases de datos).

Se pueden preparar polinucle6tidos usando cualquiera de una diversidad de tecnicas. Por ejemplo, se puede identificar un polinucle6tido, como se describe mas adelante con mayor detalle, explorando una micromatriz de cDNAs para la expresi6n asociada con tumores (es decir, una expresi6n que es al menos cinco veces mayor en un tumor de mama que en un tejido normal, segun se determina utilizando un ensayo representativo aquf proporcionado). Dichas exploraciones pueden ser llevadas a cabo utilizando una micromatriz de Synteni (Palo Alto, California) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (y esencialmente del modo descrito por Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10.614-10.619, 1996, y Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2150-2155, 1997). Alternativamente, se pueden multiplicar polipeptidos a partir de cDNA preparado a partir de celulas que expresan las protefnas aquf descritas, tales como celulas de tumor de mama. Dichos polinucle6tidos pueden ser multiplicados por medio de la reacci6n en cadena de la polimerasa (PCR; del ingles, polymerase chain reaction). Para este procedimiento, los cebadores secuencialmente especfficos pueden ser disenados basandose en las secuencias aquf proporcionadas y pueden ser adquiridos o sintetizados.

Una porci6n multiplicada puede ser utilizada para aislar un gen de longitud completa a partir de un banco adecuado (por ejemplo, un banco de cDNA de tumor de mama) usando tecnicas bien conocidas. En dichas tecnicas, se explora un banco (de cDNA o gen6mico) utilizando uno o mas cebadores o sondas polinucleotfdicos adecuados para la multiplicaci6n. Preferiblemente, se selecciona un banco por tamanos para incluir moleculas mas grandes. Tambien se pueden preferir bancos aleatoriamente cebados para identificar regiones 5' y cadena arriba de genes. Se prefieren bancos gen6micos para obtener intrones y extender secuencias 5'.

Para las tecnicas de hibridaci6n, se puede etiquetar una secuencia parcial (por ejemplo, por traslado de mellas o marcaci6n de extremos con 32P) usando tecnicas bien conocidas. Luego se explora un banco bacteriano o de bacteri6fagos hibridando filtros que contienen colonias bacterianas desnaturalizadas (o cespedes que contienen placas de fagos) con la sonda etiquetada (vease Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Net York, 1989). Se seleccionan y multiplican las placas o colonias de hibridaci6n y se afsla el DNA para un analisis posterior. Se pueden analizar clones de cDNA para determinar la cantidad de secuencia adicional mediante, por ejemplo, una PCR en que se utiliza un cebador de la secuencia parcial y un cebador del vector. Se pueden generar mapas de restricci6n y secuencias parciales para identificar uno

o mas clones solapantes. Luego se puede determinar la secuencia completa utilizando tecnicas estandares, las cuales pueden implicar la generaci6n de una serie de clones de deleci6n. Las secuencias solapantes resultantes son luego ensambladas en una unica secuencia contigua. Se puede generar una molecula de cDNA de longitud completa por ligaci6n de fragmentos adecuados utilizando tecnicas bien conocidas.

Alternativamente, hay numerosas tecnicas de multiplicaci6n para obtener una secuencia de codificaci6n de longitud completa a partir de una secuencia parcial de cDNA. En dichas tecnicas, la multiplicaci6n es llevada generalmente a cabo por medio de PCR. Para llevar a cabo la operaci6n de multiplicaci6n, se puede utilizar cualquiera de una diversidad de kits comercialmente asequibles. Se pueden disenar cebadores utilizando, por ejemplo, un softtare bien conocido en la tecnica. Los cebadores tienen preferiblemente una longitud de 22-30 nucle6tidos, tienen un contenido de GC de al menos 50% y se hibridan con la secuencia diana a temperaturas de aproximadamente 68 °C a 72 °C. La regi6n multiplicada puede ser secuenciada del modo anteriormente descrito, y se pueden ensamblar las secuencias solapantes en una secuencia contigua.

Una de dichas tecnicas de multiplicaci6n es la PCR inversa (vease Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16: 8186, 1988), en la que se utilizan enzimas de restricci6n para generar un fragmento en la regi6n conocida del gen. El fragmento es luego circularizado por ligaci6n intramolecular y es utilizado como molde para una PCR con cebadores divergentes procedentes de la regi6n conocida. En un procedimiento alternativo, se pueden recuperar secuencias adyacentes a una secuencia parcial por multiplicaci6n con un cebador para una secuencia conectora y un cebador especffico para una regi6n conocida. Las secuencias multiplicadas son tfpicamente sometidas a un segundo ciclo de multiplicaci6n con el mismo cebador de conector y un segundo cebador especffico para la regi6n conocida. En el Documento WO 96/38591 se describe una variaci6n de este procedimiento en que se emplean dos cebadores que inician la extensi6n en direcciones opuestas a partir de la secuencia conocida. Otra de dichas tecnicas es conocida como "multiplicaci6n rapida de extremos de cDNA" o RACE ( del ingles, rapid amplification of cDNA ends). Esta tecnica implica el uso de un cebador interno y un cebador externo, que se hibrida con una regi6n de poliA o una secuencia vector, para identificar secuencias que estan en 5' y 3' de una secuencia conocida. Tecnicas adicionales incluyen la PCR de captura (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-19, 1991) y la PCR ambulante ("talking PCR") (Parker et al., Nucl. Acids Res. 19: 3055-60, 1991). Para obtener una secuencia de cDNA de longitud completa, tambien se pueden emplear otros metodos en que se usa multiplicaci6n.

En ciertos casos, es posible obtener una secuencia de cDNA de longitud completa por analisis de secuencias proporcionadas en una base de datos de etiquetas de secuencia expresada (EST; del ingles, expressed sequence tag), tal como la disponible en GenBank. Las busquedas de ESTs solapantes pueden ser llevadas generalmente a cabo usando programas bien conocidos (por ejemplo, busquedas NCBI BLAST), y dichas ESTs pueden ser utilizadas para generar una secuencia contigua de longitud completa. Tambien se pueden obtener secuencias de DNA de longitud completa por analisis de fragmentos gen6micos.

En las ID. SEC. numeros 71, 175, 178, 180 y 464-468 se proporcionan ciertas secuencias de acido nucleico de moleculas de cDNA que codifican porciones de protefnas de tumor de mama. Mas adelante se describe con detalle el aislamiento de estas secuencias.

Se pueden preparar generalmente variantes polinucleotfdicas mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo la sfntesis qufmica mediante, por ejemplo, la sfntesis qufmica de fosforamiditas en fase s6lida. Tambien se pueden introducir modificaciones en una secuencia polinucleotfdica utilizando tecnicas de mutagenesis estandares, tal como la mutagenesis especffica del sitio y dirigida a oligonucle6tidos (vease Adelman et al., DNA 2: 183, 1983). Alternativamente, se pueden generar moleculas de RNA mediante la transcripci6n in vitro o in vivo de secuencias de DNA que codifican una protefna de tumor de mama, o una porci6n de la misma, con tal de que el DNA se incorpore a un vector con un adecuado promotor de RNA polimerasa (tal como T7 o SP6). Se pueden utilizar ciertas porciones para preparar un polipeptido codificado, como aquf se describe. Ademas o alternativamente, se puede administrar una porci6n a un paciente para que se genere in vivo el polipeptido codificado (por ejemplo, transfectando celulas presentadoras de antfgeno, tales como celulas dendrfticas, con una construcci6n de cDNA que codifica un polipeptido de tumor de mama, y administrando las celulas transfectadas al paciente).

Tambien se puede utilizar una porci6n de una secuencia complementaria de una secuencia de codificaci6n (es decir, un polinucle6tido antisentido) como una sonda o para modular la expresi6n genica. Construcciones de cDNA que se pueden transcribir en RNA antisentido pueden ser tambien introducidas en celulas de tejidos para facilitar la producci6n de RNA antisentido. Se puede utilizar un polinucle6tido antisentido, como aquf se describe, para inhibir la expresi6n de una protefna tumoral. Se puede usar la tecnologfa antisentido para controlar la expresi6n genica a traves de la formaci6n de triples helices, lo que compromete la capacidad de la doble helice para abrirse suficientemente para la uni6n de polimerasas, factores de transcripci6n o moleculas reguladoras [vease Gee et al. en Huber y Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, Net York, 1994)]. Alternativamente, se puede disenar una molecula antisentido para que se hibride con una regi6n de control de un gen (por ejemplo, un promotor, un potenciador o un sitio de inicio de la transcripci6n) y bloquee la transcripci6n del gen; o para que bloquee la traducci6n al inhibir la uni6n de un transcrito a ribosomas.

Tambien se puede disenar una porci6n de una secuencia de codificaci6n, o de una secuencia complementaria, como una sonda o cebador para detectar la expresi6n genica. Se pueden etiquetar sondas con una diversidad de grupos informadores, tales como radionucleidos y enzimas, y tienen preferiblemente una longitud de al menos 10 nucle6tidos, mas preferiblemente una longitud de al menos 20 nucle6tidos, y aun mas preferiblemente una longitud de al menos 30 nucle6tidos. Como se indic6 anteriormente, los cebadores tienen preferiblemente una longitud de 2230 nucle6tidos.

Todo polinucle6tido puede ser adicionalmente modificado para aumentar su estabilidad in vivo. Las modificaciones posibles incluyen, pero no se limitan a, la adici6n de secuencias flanqueadoras en los extremos 5' y/o 3'; el uso de enlaces fosforotioato o 2'-O-metflicos en lugar de enlaces fosfodiesterasa en la cadena principal; y/o la inclusi6n de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y tybutosina, asi como de formas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina modificadas con acetilo, metilo, tio y otros.

Se pueden unir secuencias de nucle6tidos como las aquf descritas a una diversidad de otras secuencias de nucle6tidos utilizando tecnicas de DNA recombinante establecidas. Por ejemplo, se puede clonar un polinucle6tido en cualquiera de una diversidad de vectores de clonaci6n, incluyendo plasmidos, fag6midos, derivados del fago lambda, y c6smidos. Los vectores de particular interes incluyen vectores de expresi6n, vectores de replicaci6n, vectores para generaci6n de sondas y vectores de secuenciaci6n. En general, un vector contendra un origen de replicaci6n funcional en al menos un organismo, sitios convenientes para endonucleasas de restricci6n, y uno o mas marcadores seleccionables. Otros elementos dependeran del uso deseado y seran evidentes para quienes tienen una experiencia normal en la tecnica.

En ciertas realizaciones, se pueden formular polinucle6tidos para permitir su entrada en una celula de un mamffero y su expresi6n en ella. Dichas formulaciones son particularmente utiles con fines terapeuticos, como se describe mas adelante. Quienes tienen una experiencia normal en la tecnica apreciaran que hay muchas maneras de conseguir la expresi6n de un polinucle6tido en una celula diana, y se puede emplear cualquier metodo adecuado. Por ejemplo, se puede incorporar un polinucle6tido a un vector vfrico tal como, pero sin limitarse a, un adenovirus, virus adenoasociado, retrovirus, o virus vaccinia u otro poxvirus (por ejemplo, el virus de la viruela aviar). Tambien se pueden administrar los polinucle6tidos como vectores plasmfdicos desnudos. Las tecnicas para incorporar DNA a dichos vectores son bien conocidas por quienes tienen una experiencia normal en este campo tecnico. Un vector retrovfrico puede ademas transferir o incorporar un gen para un marcador seleccionable (para facilitar la identificaci6n o selecci6n de celulas transducidas) y/o un componente para transporte dirigido, tal como un gen que codifica un ligando para un receptor de una celula diana especffica, para hacer que vector sea especffico de la diana. El transporte dirigido puede ser llevado tambien a cabo usando un anticuerpo, mediante metodos conocidos por quienes tienen una experiencia normal en la tecnica.

Otras formulaciones para fines terapeuticos incluyen sistemas de dispersi6n coloidal, tales como complejos macromoleculares, nanocapsulas, microesferas, gl6bulos y sistemas de base lipfdica que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido para uso como vehfculo de distribuci6n in vitro e in vivo es un liposoma (es decir, una vesfcula artificial de membrana). La preparaci6n y el uso de dichos sistemas son bien conocidos en la tecnica.

Polipeptidos de tumor de mama

En el contexto del presente invento, los polipeptidos pueden comprender al menos una porci6n inmunogenica de una protefna de tumor de mama o una variante de la misma, como aquf se describe. Como se indic6 anteriormente, una "protefna de tumor de mama" es una protefna que es expresada por celulas de tumor de mama. Las protefnas que son protefnas de tumor de mama tambien reaccionan detectablemente en un inmunoensayo (tal como un ELISA) con antisueros de un paciente con cancer de mama. Los polipeptidos, como aquf se describen, pueden tener cualquier longitud. Pueden estar presentes secuencias adicionales procedentes de la protefna nativa y/o secuencias heter6logas, y dichas secuencias pueden poseer (aunque no es necesario) otras propiedades inmunogenicas o antigenicas.

Como aquf se utiliza, una "porci6n inmunogenica" es una porci6n de una protefna que es reconocida por (es decir, se une especfficamente a) un receptor antigenico superficial de celula B y/o celula T. Dichas porciones inmunogenicas comprenden generalmente al menos 5 restos de aminoacido, mas preferiblemente al menos 10, y aun mas preferiblemente al menos 20, restos de aminoacido de una protefna de tumor de mama o una variante de la misma. Ciertas porciones inmunogenicas preferidas incluyen peptidos en que se han suprimido una secuencia lfder N-terminal y/o un dominio transmembranal. Otras porciones inmunogenicas preferidas pueden contener una pequena supresi6n N-terminal y/o C-terminal (por ejemplo, 1-30 aminoacidos, preferiblemente 5-15 aminoacidos) con respecto a la protefna madura.

Se pueden identificar generalmente porciones inmunogenicas usando tecnicas bien conocidas, tales como las resumidas en Paul, Fundamental Immunology, 3a edici6n, 243-247 (Raven Press, 1993) y las referencias allf citadas. Dichas tecnicas incluyen la exploraci6n de polipeptidos en cuanto a la capacidad para reaccionar con anticuerpos, antisueros y/o lfneas o clones de celulas T antigenicamente especfficos. Como aquf se usan, los antisueros y anticuerpos son "antigenicamente especfficos" si se unen especfficamente a un antfgeno (es decir, reaccionan con la protefna en un ELISA u otro inmunoensayo y no reaccionan detectablemente con protefnas no relacionadas). Dichos antisueros y anticuerpos pueden ser preparados del modo aquf descrito, y utilizando tecnicas bien conocidas. Una porci6n inmunogenica de una protefna nativa de tumor de mama es una porci6n que reacciona con dichos antisueros y/o celulas T en un nivel que no es sustancialmente inferior a la reactividad del polipeptido de longitud completa (por ejemplo, en un ELISA y/o un ensayo de reactividad de celulas T). Dichas porciones inmunogenicas pueden reaccionar en dichos ensayos en un nivel que es similar o superior a la reactividad del polipeptido de longitud completa. Dichas exploraciones pueden ser llevadas generalmente a cabo usando metodos bien conocidos por quienes tienen una experiencia normal en la tecnica, tales como los descritos en Harlot y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Por ejemplo, un polipeptido puede ser inmovilizado sobre un soporte s6lido y ser puesto en contacto con sueros de pacientes para permitir la uni6n de anticuerpos de los sueros con el polipeptido inmovilizado. Luego se pueden separar los sueros no unidos y detectar los anticuerpos unidos utilizando, por ejemplo, protefna A marcada con 125I.

Como se indic6 anteriormente, una composici6n puede comprender una variante de una protefna nativa de tumor de mama. Una "variante" polipeptfdica, como aquf se usa, es un polipeptido que difiere de una protefna nativa de tumor de mama en una o mas sustituciones, supresiones, adiciones y/o inserciones, de tal modo que la inmunogenicidad del polipeptido no resulta sustancialmente disminuida. En otras palabras, la capacidad de una variante para reaccionar con antisueros antigenicamente especfficos puede resultar potenciada o inalterada con respecto a la de la protefna nativa, o puede ser disminuida en menos del 50%, y preferiblemente menos del 20%, con respecto a la de la protefna nativa. Dichas variantes pueden ser generalmente identificadas modificando una de las secuencias polipeptfdicas anteriores y evaluando, con anticuerpos o antisueros antigenicamente especfficos como los aquf descritos, la reactividad del polipeptido modificado. Las variantes preferidas incluyen aquellas en que se han separado una o mas porciones, tal como una secuencia lfder N-terminal o un dominio transmembranal. Otras variantes preferidas incluyen las variantes en que se ha separado una pequena porci6n (por ejemplo, 1-30 aminoacidos, preferiblemente 5-15 aminoacidos) de los extremos N y/o C de la protefna madura.

Las variantes polipeptfdicas presentan preferiblemente una identidad (determinada del modo anteriormente descrito) de al menos aproximadamente 70%, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 90% y muy preferiblemente de al menos aproximadamente 95%, con respecto a los polipeptidos identificados.

Preferiblemente, una variante contiene sustituciones conservativas. Una "sustituci6n conservativa" es una en que un aminoacido es sustituido por otro aminoacido que tiene propiedades similares, de forma que un experto en la tecnica de la qufmica peptfdica esperarfa que la estructura secundaria y la naturaleza hidropatica del polipeptido permanecieran sustancialmente inalteradas. Las sustituciones de aminoacidos se pueden realizar, en general, basandose en la similitud de la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidroflia y/o naturaleza anfpatica de los restos. Por ejemplo, los aminoacidos negativamente cargados incluyen acido aspartico y acido glutamico; los aminoacidos positivamente cargados incluyen lisina y arginina; y los aminoacidos con grupos de cabeza polar sin carga que tienen valores de hidroflia similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicocola y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoacidos que pueden representar cambios conservativos incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser y thr; (2) cys, ser, tyr y thr; (3) val, ile, leu, met, ala y phe; (4) lys, arg e his; y (5) phe, tyr, trp e his. Un variante puede contener tambien, o alternativamente, cambios no conservativos. En una realizaci6n preferida, los polipeptidos variantes difieren de una secuencia nativa por sustituci6n, supresi6n o adici6n de cinco aminoacidos o menos. Las variantes pueden ser tambien (o alternativamente) modificadas mediante, por ejemplo, la supresi6n o adici6n de aminoacidos que ejercen una influencia mfnima sobre la inmunogenicidad, estructura secundaria y naturaleza hidropatica del polipeptido.

Como se indic6 anteriormente, los polipeptidos pueden comprender una secuencia senal (o lfder) en el extremo Nterminal de la protefna, que dirige cotraduccionalmente o postraduccionalmente la transferencia de la protefna. El polipeptido puede ser tambien conjugado con un conector u otra secuencia para facilitar la sfntesis, purificaci6n o identificaci6n del polipeptido (por ejemplo, poliHis) o para potenciar la uni6n del polipeptido a un soporte s6lido. Por ejemplo, se puede conjugar un polipeptido con una regi6n inmunoglobulfnica Fc.

Se pueden preparar polipeptidos utilizando cualquiera de una diversidad de tecnicas bien conocidas. Los polipeptidos recombinantes codificados por secuencias de DNA como las anteriormente descritas pueden ser facilmente preparados a partir de las secuencias de DNA utilizando cualquiera de una diversidad de vectores de expresi6n conocidos por quienes tienen una experiencia normal en la tecnica. La expresi6n puede ser llevada a cabo en cualquier celula huesped apropiada que haya sido transformada o transfectada con un vector de expresi6n que contiene una molecula de DNA que codifica un polipeptido recombinante. Las celulas huesped adecuadas incluyen procariontes, celulas de levadura, celulas eucari6ticas superiores y celulas vegetales. Preferiblemente, las celulas huesped empleadas son E. coli, levadura o una lfnea celular de mamffero tal como COS o CHO. Los sobrenadantes de sistemas de huesped/vector adecuados que secretan la protefna o polipeptido recombinante al medio de cultivo pueden ser primero concentrados utilizando un filtro comercialmente asequible. Despues de la concentraci6n, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificaci6n adecuada, tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio i6nico. Finalmente, se pueden emplear una o mas operaciones de HPLC en fase inversa para purificar mas un polipeptido recombinante.

Tambien se pueden generar porciones y otras variantes que tengan menos de aproximadamente 100 aminoacidos, y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoacidos, por medios sinteticos utilizando tecnicas bien conocidas por quienes tienen una experiencia normal en este campo tecnico. Por ejemplo, se pueden sintetizar dichos polipeptidos utilizando cualquiera de las tecnicas en fase s6lida comercialmente asequibles, tal como el metodo de Merrifield para sfntesis en fase s6lida, mediante el cual se anaden sucesivamente aminoacidos a una cadena de aminoacidos en crecimiento. Vease Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156, 1963. El equipo para la sfntesis automatizada de polipeptidos es comercialmente obtenible de proveedores tales como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, California), y puede ser hecho funcionar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En ciertas realizaciones especfficas, un polipeptido puede ser una protefna de fusi6n que comprenda multiples polipeptidos como los aquf descritos, o que comprenda al menos un polipeptido como el aquf descrito y una secuencia no relacionada, tal como una protefna tumoral conocida. Una pareja de fusi6n puede ayudar, por ejemplo, a proporcionar epftopos T cooperadores (una pareja inmunol6gica de fusi6n), preferiblemente epftopos T cooperadores reconocidos por seres humanos, o puede ayudar a que se exprese la protefna (un potenciador de la expresi6n) con mayores rendimientos que los de la protefna recombinante nativa. Ciertas parejas de fusi6n preferidas son parejas de fusi6n tanto inmunol6gicas como potenciadoras de la expresi6n. Otras parejas de fusi6n pueden ser seleccionadas con objeto de aumentar la solubilidad de la protefna o de permitir que la protefna sea dirigida a compartimentos intracelulares deseados. Aun otras parejas de fusi6n incluyen etiquetas de afinidad, las cuales facilitan la purificaci6n de la protefna.

Las protefnas de fusi6n pueden ser generalmente preparadas utilizando tecnicas estandares, incluyendo la conjugaci6n qufmica. Preferiblemente, una protefna de fusi6n se expresa como una protefna recombinante, lo que permite la producci6n de niveles aumentados, con respecto a los de una protefna no fusionada, en un sistema de expresi6n. En pocas palabras, secuencias de DNA que codifican los componentes polipeptfdicos pueden ser ensambladas separadamente y ser ligadas en un vector de expresi6n apropiado. El extremo 3' de la secuencia de DNA que codifica un componente polipeptfdico es ligado, con o sin un conector peptfdico, al extremo 5' de una secuencia de DNA que codifica el segundo componente polipeptfdico para que los marcos de lectura de las secuencias esten en fase. Esto permite la traducci6n en una sola protefna de fusi6n que conserva la actividad biol6gica de ambos polipeptidos componentes.

Se puede emplear una secuencia conectora peptfdica para separar los componentes polipeptfdicos primero y segundo por una distancia suficiente para asegurar que cada polipeptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria. Dicha secuencia conectora peptfdica se incorpora a la protefna de fusi6n utilizando tecnicas estandares bien conocidas en este campo tecnico. Las secuencias conectoras peptfdicas adecuadas se pueden elegir basandose en los factores siguientes: (1) su capacidad para adoptar una conformaci6n extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pueda interaccionar con epftopos funcionales de los polipeptidos primero y segundo; y (3) la carencia de restos hidr6fobos o cargados que pudieran reaccionar con los epftopos polipeptfdicos funcionales. Las secuencias conectoras peptfdicas preferidas contienen restos de Gly, Asn y Ser. Tambien se pueden utilizar otros aminoacidos casi neutros, tales como Thr y Ala, en la secuencia conectora. Las secuencias de aminoacidos que se pueden emplear utilmente como conectores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 83; 8258-8262, 1986; Patente de EE.UU. nO 4.935.233 y Patente de EE.UU. nO 4.751.180. La secuencia conectora puede tener generalmente una longitud de 1 a aproximadamente 50 aminoacidos. No se requieren secuencias conectoras cuando los polipeptidos primero y segundo tienen regiones de aminoacidos N-terminales no esenciales que se pueden utilizar para separar los dominios funcionales y evitar una interferencia esterica.

Las secuencias de DNA ligadas estan operativamente enlazadas con elementos reguladores de la transcripci6n o traducci6n adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresi6n de DNA estan situados s6lo en 5' con respecto a la secuencia de DNA que codifica los polipeptidos primeros. Similarmente, los codones de parada requeridos para que finalice la traducci6n y las senales de terminaci6n de la transcripci6n estan s6lo presentes en 3' con respecto a la secuencia de DNA que codifica el polipeptido segundo.

Tambien se proporcionan protefnas de fusi6n que comprenden un polipeptido del presente invento junto con una protefna inmunogenica no relacionada. Preferiblemente, la protefna inmunogenica es capaz de provocar una respuesta de memoria. Los ejemplos de dichas protefnas incluyen protefnas del tetanos, la tuberculosis y la hepatitis (vease, por ejemplo, Stoute et al., New England J. Med. 336: 86-91, 1997).

En realizaciones preferidas, una pareja de fusi6n inmunol6gica procede de la protefna D, una protefna superficial de la bacteria Gram negativa Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Preferiblemente, un derivado de la protefna D comprende aproximadamente el primer tercio de la protefna (por ejemplo, los primeros 100-110 aminoacidos Nterminales), y el derivado de la protefna D puede estar lipidado. En ciertas realizaciones preferidas, los primeros 109 restos de una pareja de fusi6n de lipoprotefna D estan incluidos en el extremo N para proporcionar epftopos ex6genos adicionales de celulas T al polipeptido y aumentar el nivel de expresi6n en E. coli (actuando asf como un potenciador de la expresi6n). La cola lipfdica asegura la presentaci6n 6ptima del antfgeno a celulas presentadoras de antfgeno. Otras parejas de fusi6n incluyen la protefna no estructural NS1 (hemaglutinina) de influenzavirus. Tfpicamente, se usan los 81 aminoacidos N-terminales, aunque se pueden utilizar diferentes fragmentos que incluyan epftopos T cooperadores.

En otra realizaci6n, la pareja de fusi6n inmunol6gica es la protefna conocida como LYTA o una porci6n de la misma (preferiblemente, una porci6n C-terminal). LYTA procede de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetilL-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gene 43: 265-292, 1986). LYTA es una autolisina que degrada especfficamente ciertos enlaces de la cadena principal de peptidoglicano. El dominio Cterminal de la protefna LYTA es responsable de la afinidad por la colina o por ciertos compuestos analogos de colina, tal como el DEAE. Esta propiedad ha sido explotada para el desarrollo de plasmidos que expresan C-LYTA de E. coli, utiles para la expresi6n de protefnas de fusi6n. Se ha descrito la purificaci6n de protefnas hfbridas que contienen el fragmento de C-LYTA en el extremo amfnico (vease Biotechnology 10: 795-798, 1992). En una realizaci6n preferida, se puede incorporar una porci6n de repetici6n de LYTA a una protefna de fusi6n. Se encuentra una porci6n de repetici6n en la regi6n C-terminal que comienza en el resto 178. Una porci6n de repetici6n particularmente preferida incorpora los restos 188-305.

En general, se afslan polipeptidos (incluyendo protefnas de fusi6n) y polinucle6tidos como los aquf descritos. Un polipeptido o polinucle6tido "aislado" es uno que ha sido separado de su ambiente original. Por ejemplo, una protefna presente en la naturaleza esta aislada si ha sido separada de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferiblemente, dichos polipeptidos tienen una pureza de al menos aproximadamente 90%, mas preferiblemente una pureza de al menos aproximadamente 95% y muy preferiblemente una pureza de al menos aproximadamente 99%. Se considera que un polinucle6tido esta aislado si, por ejemplo, esta clonado en un vector que no es parte del ambiente natural.

Agentes ligantes

El presente invento proporciona ademas agentes, tales como anticuerpos y fragmentos ligantes de antfgeno de los mismos, que se unen especfficamente a una protefna de tumor de mama. Como aquf se utiliza, se dice que un anticuerpo, o un fragmento ligante de antfgenos del mismo, "se une especfficamente" a una protefna de tumor de mama si reacciona con una protefna de tumor de mama en un nivel detectable (en, por ejemplo, un ELISA) y no reacciona detectablemente con protefnas no relacionadas bajo condiciones similares. Como aquf se utiliza, "uni6n" se refiere a una asociaci6n no covalente entre dos moleculas separadas de tal modo que se forma un complejo. La capacidad para unirse puede ser evaluada, por ejemplo, determinando una constante de uni6n para la formaci6n del complejo. La constante de uni6n es el valor obtenido cuando se divide la concentraci6n del complejo por el producto de las concentraciones de los componentes. En general, en el contexto del presente invento, se dice que dos compuestos "se unen" cuando la constante de uni6n para la formaci6n del complejo excede de aproximadamente 103 l/mol. La constante de uni6n puede ser determinada usando metodos bien conocidos en la tecnica.

Los agentes ligantes pueden permitir ademas diferenciar entre pacientes con y sin un cancer, tal como un cancer de mama, al usar los ensayos representativos aquf proporcionados. En otras palabras, los anticuerpos u otros agentes ligantes que se unan a una protefna de tumor de mama generaran una senal que indica la presencia de un cancer en al menos aproximadamente el 20% de los pacientes con la enfermedad y generaran una senal negativa que indica la ausencia de la enfermedad en al menos aproximadamente el 90% de los individuos sin el cancer. Para determinar si un agente ligante satisface este requisito, se pueden examinar muestras biol6gicas (por ejemplo, sangre, sueros, orina y/o biopsias tumorales) de pacientes con y sin un cancer (segun se determina usando ensayos clfnicos estandares), del modo aquf descrito, en cuanto a la presencia de polipeptidos que se unen al agente ligante. Es evidente que se debe examinar un numero estadfsticamente significativo de muestras con y sin la enfermedad. Cada agente ligante deberfa satisfacer los criterios anteriores; sin embargo, quienes tienen una experiencia normal en la tecnica reconoceran que se pueden usar agentes ligantes en combinaci6n para mejorar la sensibilidad.

Todo agente que satisfaga los requisitos anteriores puede ser un agente ligante. Por ejemplo, un agente ligante puede ser un ribosoma, con o sin un componente peptfdico, una molecula de RNA o un polipeptido. En una realizaci6n preferida, un agente ligante es un anticuerpo o un fragmento ligante de antfgenos del mismo. Los anticuerpos pueden ser preparados mediante cualquiera de una diversidad de tecnicas conocidas por quienes tienen una experiencia normal en este campo tecnico. Vease, por ejemplo, Harlot y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, los anticuerpos pueden ser producidos mediante tecnicas de cultivo celular, incluyendo la generaci6n de anticuerpos monoclonales como aquf se describe, o por medio de la transfecci6n de celulas huesped de bacteria o mamffero adecuadas con genes de anticuerpos, con objeto de permitir la producci6n de anticuerpos recombinantes. En una tecnica, se inyecta inicialmente un agente inmun6geno que comprende el polipeptido en cualquiera de una gran diversidad de mamfferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En esta operaci6n, los polipeptidos de este invento pueden servir como agente inmun6geno sin modificaci6n. Alternativamente, y particularmente para polipeptidos relativamente cortos, se puede provocar una respuesta inmune superior si se une el polipeptido a una protefna vehicular, tal como albumina serica bovinao hemocianina de lapa Fissurella. Se inyecta el agente inmun6geno al huesped animal, preferiblemente de acuerdo con un programa predeterminado que lleva incorporadas una o mas inmunizaciones de refuerzo, y se sangran peri6dicamente los animales. Los anticuerpos policlonales especfficos para el polipeptido pueden ser entonces purificados a partir de dichos antisueros mediante, por ejemplo, cromatograffa de afinidad usando el polipeptido conectado a un soporte s6lido adecuado.

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales especfficos para un polipeptido antigenico de interes usando, por ejemplo, la tecnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976, y mejoras de la misma. En pocas palabras, estos metodos acarrean la preparaci6n de lfneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tienen la especificidad (es decir, reactividad con el polipeptido de interes) deseada. Dichas lfneas celulares se pueden producir, por ejemplo, a partir de celulas esplenicas obtenidas de un animal inmunizado del modo anteriormente descrito. Las celulas esplenicas son luego inmortalizadas mediante, por ejemplo, fusi6n con una pareja de fusi6n de celula de mieloma, preferiblemente una que es singenica con respecto al animal inmunizado. Se puede emplear una diversidad de tecnicas de fusi6n. Por ejemplo, se pueden combinar las celulas esplenicas y las celulas de mieloma con un detergente no i6nico durante unos pocos minutos y luego se puede sembrar la combinaci6n, con baja densidad, en un medio selectivo que soporta el crecimiento de celulas hfbridas pero no de celulas de mieloma. En una tecnica de selecci6n preferida se utiliza la selecci6n por HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Despues de un tiempo suficiente, normalmente de aproximadamente 1 a 2 semanas, se observan colonias de hfbridos. Se seleccionan colonias individuales y se examinan los sobrenadantes de sus cultivos en cuanto a su actividad ligante frente al polipeptido. Se prefieren los hibridomas que tienen una reactividad y una especificidad elevadas.

Se pueden aislar anticuerpos monoclonales de los sobrenadantes de las colonias de hibridomas en crecimiento. Ademas, se pueden emplear diversas tecnicas para aumentar el rendimiento, tal como la inyecci6n de la lfnea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un huesped vertebrado adecuado, tal como un rat6n. Luego se pueden recolectar anticuerpos monoclonales del fluido ascftico o la sangre. Los contaminantes pueden ser separados de los anticuerpos mediante tecnicas convencionales, tales como cromatograffa, filtraci6n en gel, precipitaci6n y extracci6n. Los polipeptidos de este invento se pueden usar en el proceso de purificaci6n, tal como, por ejemplo, en una operaci6n de cromatograffa de afinidad.

En ciertas realizaciones, se puede preferir el uso de fragmentos ligantes de antfgeno de los anticuerpos. Dichos fragmentos incluyen fragmentos Fab, que se pueden preparar usando tecnicas estandares. En pocas palabras, se pueden purificar inmunoglobulinas a partir de suero de conejo mediante cromatograffa de afinidad en columnas con gl6bulos de protefna A (Harlot y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) y se pueden someter a digesti6n por papafna para obtener los fragmentos Fab y Fc. Los fragmentos Fab y Fc pueden ser separados por cromatograffa de afinidad en columnas con gl6bulos de protefna A.

Los anticuerpos monoclonales del presente invento pueden ser copulados con uno o mas agentes terapeuticos. A este respecto, los agentes adecuados incluyen radionucleidos, agentes inductores de diferenciaci6n, farmacos, toxinas, y derivados de los mismos. Los radionucleidos preferidos incluyen 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At y 212Bi. Los farmacos preferidos incluyen metotrexato y compuestos analogos de pirimidina y purina. Los agentes inductores de diferenciaci6n preferidos incluyen acido butfrico y esteres de forbol. Las toxinas preferidas incluyen ricina, abrina, toxina difterica, toxina colerica, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Shigella y protefna antiviral de Phytolacca americana.

Se puede copular (por ejemplo, enlazar covalentemente) un agente terapeutico con un anticuerpo monoclonal adecuado, directa o indirectamente (por ejemplo, por medio de un grupo conector). Es posible una reacci6n directa entre un agente y un anticuerpo cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucle6filo, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, de uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, tal como un anhfdrido o un haluro de acido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo labil (por ejemplo, un haluro), del otro.

Alternativamente, puede ser deseable copular un agente terapeutico con un anticuerpo por medio de un grupo conector. Un grupo conector puede actuar como espaciador para alejar un anticuerpo de un agente con objeto de evitar interferencias en las capacidades ligantes. Un grupo conector tambien puede servir para aumentar la reactividad qufmica de un sustituyente de un agente o de un anticuerpo y, de este modo, aumentar la eficacia de la copulaci6n. Un aumento de reactividad qufmica tambien puede facilitar el uso de agentes, o grupos funcionales de agentes, que, de lo contrario, no podrfan ser usados.

Es evidente para los expertos en la tecnica que, como grupo conector, se puede emplear una diversidad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homofuncionales como heterofuncionales (tales como los descritos en el catalogo de la Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, EE.UU.). La copulaci6n se puede efectuar, por ejemplo, a traves de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo o restos de hidrato de carbono oxidados. Hay numerosas referencias en que se describe dicha metodologfa, tal como, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nO 4.671.958, concedida a Rodtell et al.

Cuando un agente terapeutico es mas potente cuando esta libre de la porci6n de anticuerpo de los productos de inmunoconjugaci6n del presente invento, puede ser deseable usar un grupo conector que sea escindible durante o despues de la internalizaci6n en una celula. Se ha descrito un numero de diferentes grupos conectores escindibles. Los mecanismos para la liberaci6n intracelular de un agente desde estos grupos conectores incluyen la escisi6n por reducci6n de un enlace disulfuro (por ejemplo, la Patente de EE.UU. nO 4.489.710, concedida a Spitler), por irradiaci6n de un enlace fotolabil (por ejemplo, la Patente de EE.UU. nO 4.625.014, concedida a Senter et al.), por hidr6lisis de cadenas laterales de aminoacido derivatizadas (por ejemplo, la Patente de EE.UU. nO 4.638.045, concedida a Kohn et al.), por hidr6lisis mediada por complemento serico (por ejemplo, la Patente de EE.UU. nO 4.671.958, concedida a Rodtell et al.), y por hidr6lisis catalizada por acidos (por ejemplo, la Patente de EE.UU. nO 4.569.789, concedida a Blattler et al.).

Puede ser deseable copular mas de un agente con un anticuerpo. En una realizaci6n, se copulan multiples moleculas de un agente con una molecula de anticuerpo. En otra realizaci6n, se puede copular mas de un tipo de agente con un anticuerpo. Al margen de la realizaci6n concreta, se pueden preparar productos de inmunoconjugaci6n con mas de un agente de diversas maneras. Por ejemplo, se puede copular directamente mas de un agente con una molecula de anticuerpo o se pueden usar conectores que proporcionen multiples sitios para fijaci6n. Alternativamente, se puede utilizar un vehfculo.

Un vehfculo puede llevar los agentes de diversas maneras, incluyendo el enlace covalente directamente o por medio de un grupo conector. Los vehfculos adecuados incluyen protefnas tales como albuminas (por ejemplo, la Patente de EE.UU. nO 4.507.234, concedida a Kato et al.), peptidos y polisacaridos, tal como el aminodextrano (por ejemplo, la Patente de EE.UU. nO 4.699.784, concedida a Shih et al.). Un vehfculo puede llevar tambien un agente por enlace no covalente o por encapsulaci6n, tal como dentro de una vesfcula lipos6mica (por ejemplo, las Patentes de EE.UU. numeros 4.429.008 y 4.873.088). Los vehfculos especfficos para agentes radionuclefdicos incluyen compuestos quelantes y pequenas moleculas radiohalogenadas. Por ejemplo, en la Patente de EE.UU. nO 4.735.792 se describen pequenas moleculas radiohalogenadas representativas y su sfntesis. Se puede formar un quelato radionuclefdico a partir de compuestos quelantes que incluyen aquellos que contienen atomos de nitr6geno y azufre como atomos dadores para unirse al radionucleido de metal u 6xido metalico. En, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nO 4.673.562, concedida a Davison et al., se describen compuestos quelantes representativos y su sfntesis.

Se puede utilizar una diversidad de vfas de administraci6n para los anticuerpos y productos de inmunoconjugaci6n. Tfpicamente, la administraci6n sera intravenosa, intramuscular, subcutanea o en el lecho de un tumor resecado. Es evidente que la dosis precisa del anticuerpo/producto de inmunoconjugaci6n variara dependiendo del anticuerpo usado, la densidad antigenica en el tumor y la velocidad de aclaramiento del anticuerpo.

Celulas t

Las composiciones inmunoterapeuticas pueden tambien, o alternativamente, comprender celulas T especfficas para una protefna de tumor de mama. Dichas celulas pueden ser generalmente preparadas in vitro o ex vivo usando procedimientos estandares. Por ejemplo, se pueden aislar celulas T de medula 6sea, sangre periferica, o una fracci6n de medula 6sea o sangre periferica de un paciente, usando un sistema de separaci6n celular comercialmente asequible, tal como el sistema ISOLEXT, asequible de Nexell Therapeutics Inc., Irvine, California (veanse tambien la Patente de EE.UU. nO 5.240.856, la Patente de EE.UU. nO 5.215.926 y los Documentos WO 89/06280, WO 91/16116 y WO 92/07243). Alternativamente, se pueden obtener celulas T de seres humanos relacionados o no relacionados, mamfferos no humanos, lfneas celulares o cultivos.

Las celulas T pueden ser estimuladas con un polipeptido de tumor de mama, un polinucle6tido que codifica un polipeptido de tumor de mama, y/o una celula presentadora de antfgeno (APC) que expresa dicho polipeptido. Dicha estimulaci6n es llevada a cabo bajo unas condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la generaci6n de celulas T que sean especfficas para el polipeptido. Preferiblemente, un polinucle6tido o polipeptido de tumor de mama esta presente dentro de un vehfculo de distribuci6n, tal como una microesfera, para facilitar la generaci6n de celulas T especfficas.

Se considera que las celulas T son especfficas para un polipeptido de tumor de mama si las celulas T matan celulas diana revestidas con el polipeptido o que expresan un gen que codifica el polipeptido. La especificidad de las celulas T puede ser evaluada utilizando cualquiera de una diversidad de tecnicas estandares. Por ejemplo, en un ensayo de liberaci6n de cromo o un ensayo de proliferaci6n, un fndice de estimulaci6n superior a un aumento de dos 6rdenes de magnitud en la lisis y/o la proliferaci6n, en comparaci6n con testigos negativos, indica especificidad de celulas T. Dichos ensayos pueden ser llevados a cabo, por ejemplo, del modo descrito por Chen et al., Cancer Res. 54: 10651070, 1994. Alternativamente, se puede llevar a cabo la detecci6n de la proliferaci6n de celulas T mediante una diversidad de tecnicas conocidas. Por ejemplo, se puede detectar proliferaci6n de celulas T al medir una velocidad aumentada de sfntesis de DNA (por ejemplo, mediante la marcaci6n de cultivos de celulas T con pulsos de timidina tritiada y medici6n de la cantidad de timidina tritiada incorporada al DNA). El contacto con un polipeptido de tumor de mama (100 ng/ml - 100 Ig/ml, preferiblemente 200 ng/ml - 25 Ig/ml) durante 3 - 7 dfas deberfa dar lugar a un aumento de proliferaci6n de las celulas T de al menos dos 6rdenes de magnitud. Un contacto como el anteriormente descrito durante 2-3 horas deberfa dar lugar a la activaci6n de las celulas T, segun se mide usando ensayos estandares de citocinas en que un aumento del nivel de liberaci6n de citocinas (por ejemplo, TNF o IFN-y) de dos 6rdenes de magnitud es indicativo de activaci6n de celulas T [vease Coligan et al., Current Protocols in Immunology, volumen 1, Wiley Interscience (Greene, 1998)]. Las celulas T que han resultado activadas en respuesta a un polipeptido o polinucle6tido de tumor de mama o a APCs que expresan el polipeptido pueden ser CD4+ y/o CD8+. Las celulas T especfficas de protefna de tumor de mama pueden ser multiplicadas usando tecnicas estandares. En realizaciones preferidas, las celulas T proceden de un paciente o de un donante relacionado o no relacionado y son administradas al paciente despues de la estimulaci6n y la multiplicaci6n.

Para fines terapeuticos, el numero de celulas T CD4+ o CD8+ que proliferan en respuesta a un polipeptido, polinucle6tido o APC de tumor de mama puede ser aumentado in vitro o in vivo. La proliferaci6n de dichas celulas T in vitro puede ser llevada a cabo de diversas maneras. Por ejemplo, las celulas T pueden ser expuestas de nuevo a un polipeptido de tumor de mama, o a un peptido corto que corresponda a una porci6n inmunogenica de dicho polipeptido, con o sin la adici6n de factores de crecimiento de celulas T, tal como la interleucina 2, y/o a celulas estimuladoras que sintetizan un polipeptido de tumor de mama. Alternativamente, el numero de una o mas celulas T que proliferan en presencia de una protefna de tumor de mama puede ser aumentado por clonaci6n. Los metodos para clonar celulas son bien conocidos en la tecnica e incluyen la clonaci6n por diluci6n limitante.

Composiciones farmaceuticas y vacunas

En ciertos aspectos, los polipeptidos, polinucle6tidos, celulas T y/o agentes ligantes aquf descritos pueden ser incorporados a composiciones farmaceuticas o composiciones inmunogenicas (es decir, vacunas). Las composiciones farmaceuticas comprenden uno o mas de dichos compuestos y un vehfculo fisiol6gicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o mas de dichos compuestos y un agente inmunoestimulante. Un agente inmunoestimulante puede ser cualquier sustancia que potencie una respuesta inmune hacia un antfgeno ex6geno. Los ejemplos de agentes inmunoestimulantes incluyen adyuvantes, microesferas biodegradables [por ejemplo, poli(galactida lactica)] y liposomas (a los que se incorpora el compuesto; vease, por ejemplo, Fullerton, Patente de EE.UU. nO 4.235.877). En general, la preparaci6n de vacunas se describe en, por ejemplo, M. F. Potell y

M. J. Netman (redactores), "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press (Net York, 1995). Las composiciones farmaceuticas y vacunas dentro del alcance del presente invento pueden contener tambien otros compuestos, los cuales pueden ser biol6gicamente activos o inactivos. Por ejemplo, en la composici6n o la vacuna puede estar presente una o mas porciones inmunogenicas de otros antfgenos tumorales, ya sea incorporada a un polipeptido de fusi6n o ya sea como un compuesto separado.

Una composici6n farmaceutica o vacuna puede contener DNA que codifique uno o mas de los polipeptidos anteriormente descritos para que el polipeptido se genere in situ. Como se indic6 anteriormente, el DNA puede estar presente dentro de cualquiera de una diversidad de sistemas de distribuci6n conocidos por quienes tienen una experiencia normal en la tecnica, incluyendo sistemas de expresi6n de acido nucleico, bacterias y sistemas de expresi6n vfricos. Numerosas tecnicas de distribuci6n genica son bien conocidas en la tecnica, tales como las descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198, 1998, y las referencias allf citadas. Los sistemas de expresi6n de acido nucleico apropiados contienen las necesarias secuencias de DNA para expresi6n en el paciente (tal como un promotor y una senal de terminaci6n adecuados). Los sistemas de distribuci6n bacterianos implican la administraci6n de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expresa una porci6n inmunogenica del polipeptido en su superficie celular o secreta dicho epftopo. En una realizaci6n preferida, se puede introducir el DNA utilizando un sistema de expresi6n vfrico (por ejemplo, un virus vaccinia u otro poxvirus, un retrovirus o un adenovirus), lo que puede implicar el uso de un virus no pat6geno (defectuoso), competente en cuanto a la replicaci6n. Se describen sistemas adecuados en, por ejemplo, Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321, 1989; Flexner et al., Ann. NY. Acad. Sci. 569: 86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8: 17-21, 1990; Patentes de EE.UU. numeros 4.603.112, 4.769.330 y 5.017.487; Documento WO 89/01973; Patente de EE.UU. nO 4.777.127; Documentos GB 2.200.651, EP 0.345.242 y WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252: 431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11.498-11.502, 1993; Guzman et al., Circulation 88: 2838-2848, 1993; y Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202-1207, 1993. Las tecnicas para incorporar DNA a dichos sistemas de expresi6n son bien conocidas por quienes tienen una experiencia normal en la tecnica. El DNA puede ser tambien "desnudo", como se describe en, por ejemplo, Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993, y revisa Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993. La incorporaci6n de DNA desnudo puede ser aumentada al revestir gl6bulos biodegradables con el DNA, gl6bulos que son eficazmente transportados a las celulas.

Aunque en las composiciones farmaceuticas se puede emplear cualquier vehfculo adecuado conocido por quienes tienen una experiencia normal en la tecnica, el tipo de vehfculo variara dependiendo del modo de administraci6n. Las composiciones pueden ser formuladas para cualquier modo apropiado de administraci6n, incluyendo, por ejemplo, las administraciones t6pica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutanea e intramuscular. Para administraci6n parenteral, tal como una inyecci6n subcutanea, el vehfculo comprende preferiblemente agua, disoluci6n salina, alcohol, una grasa, una cera o un tamp6n. Para administraci6n oral, se puede emplear cualquiera de los vehfculos anteriores o un vehfculo s6lido tal como manitol, lactosa, almid6n, estearato magnesico, sacarina s6dica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa o carbonato magnesico. Tambien se pueden emplear microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato-poliglicolato) como vehfculos para las composiciones farmaceuticas de este invento. En, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. numeros 4.897.268 y

5.075.109 se describen microesferas biodegradables adecuadas.

Dichas composiciones pueden comprender tambien tampones (por ejemplo, disoluci6n salina tamponada neutra y disoluci6n salina tamponada con fosfato), hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa y dextranos), manitol, protefnas, polipeptidos o aminoacidos tales como glicocola, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA y glutati6n, adyuvantes (por ejemplo, hidr6xido de aluminio) y/o conservantes. Alternativamente, las composiciones del presente invento pueden ser formuladas como un producto liofilizado. Los compuestos pueden ser tambien encapsulados en liposomas usando una tecnologfa bien conocida.

En las vacunas de este invento se puede emplear cualquiera de una diversidad de agentes inmunoestimulantes. Por ejemplo, se puede incluir un adyuvante. La mayorfa de los adyuvantes contienen una sustancia destinada a proteger al antfgeno de un rapido metabolismo, tal como hidr6xido de aluminio o aceite mineral, y un agente estimulador de respuestas inmunes, tal como lfpido A o protefnas derivadas de Bordetella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Los adyuvantes adecuados son comercialmente asequibles como, por ejemplo, los adyuvantes completo e incompleto de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EE.UU.); adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahtay, Net Jersey, EE.UU.); sales de aluminio tales como fosfato de aluminio y gel de hidr6xido de aluminio (alumina); sales de calcio, hierro o zinc; una suspensi6n de tirosina acilada insoluble; azucares acilados; polisacaridos cati6nica o ani6nicamente derivatizados; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforillfpido A y Quil A. Tambien se pueden usar citocinas, tales como GM-CSF e interleucina 2, 7 6 12, como adyuvantes.

En las vacunas aquf proporcionadas, la composici6n adyuvante es preferiblemente disenada para que provoque predominantemente una respuesta inmune del tipo Th1. Niveles elevados de citocinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFNy, TNF-, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducci6n de respuestas inmunes mediadas por celulas hacia un antfgeno administrado. Por contraste, niveles elevados de citocinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducci6n de respuestas inmunes humorales. Despues de la aplicaci6n de una vacuna como la aquf proporcionada, el paciente sostendra una respuesta inmune que incluira respuestas de tipos Th1 y Th2. En una realizaci6n preferida en que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citocinas de tipo Th1 aumentara en mayor medida que el nivel de citocinas de tipo Th2. Los niveles de estas citocinas pueden ser facilmente evaluados usando ensayos estandares. Para una revisi6n de las familias de citocinas, vease Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173, 1989.

Los adyuvantes preferidos para uso en la provocaci6n de una respuesta de tipo predominantemente Th1 incluyen, por ejemplo, una combinaci6n de monofosforil-lfpido A (MPL; del ingles, monophosphoryl lipid A), preferiblemente monofosforil-lfpido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), junto con una sal de aluminio. Los adyuvantes de MPL son asequibles de Ribi ImmunoChem Research Inc. (Hamilton, Montana, EE.UU.) (veanse las Patentes de EE.UU. numeros 4.436.727, 4.877.611, 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucle6tidos que contienen CpG (en que el dinucle6tido CpG esta sin metilar) tambien provocan una respuesta predominantemente Th1. Dichos oligonucle6tidos son bien conocidos y son descritos en, por ejemplo, el Documento WO 96/02555. Otro adyuvante preferido es una saponina, preferiblemente Qs21, que puede ser usada sola o en combinaci6n con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema potenciado implica la combinaci6n de un monofosforil-lfpido A y un derivado de saponina, tal como la combinaci6n de QS21 y 3D-MPL, como se describe en el Documento WO 94/00153, o una composici6n menos reactiva en que QS21 esta sofocado con colesterol, como se describe en el Documento WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden tocoferol y una emulsi6n de aceite en agua. En el Documento WO 95/17210 se describe una formulaci6n adyuvante particularmente potente que incluye QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsi6n de aceite en agua. Se puede preparar cualquier vacuna aquf proporcionada usando metodos bien conocidos que den lugar a una combinaci6n de un antfgeno, un potenciador de la respuesta inmune y un vehfculo o excipiente adecuado.

Las composiciones aquf descritas pueden ser administradas como parte de una formulaci6n de liberaci6n continua [es decir, una formulaci6n tal como una capsula, esponja o gel (compuesta de, por ejemplo, polisacaridos) que efectue una liberaci6n lenta del compuesto despues de la administraci6n]. En general, dichas formulaciones se pueden preparar usando una tecnologfa bien conocida y se pueden administrar mediante, por ejemplo, implantaci6n oral, rectal o subcutanea o mediante implantaci6n en el sitio diana deseado. Las formulaciones de liberaci6n continua pueden contener un polipeptido, polinucle6tido o anticuerpo disperso en una matriz vehicular y/o contenido en un dep6sito rodeado por una membrana que controla la velocidad de liberaci6n. Los vehfculos para uso en dichas formulaciones son biocompatibles y pueden ser tambien biodegradables; preferiblemente, la formulaci6n proporciona un nivel relativamente constante de liberaci6n del componente activo. La cantidad de compuesto activo contenido en una formulaci6n de liberaci6n continua depende del lugar de implantaci6n, la velocidad y la duraci6n esperada de liberaci6n, y la naturaleza del estado que se va a tratar o prevenir.

En las composiciones farmaceuticas y vacunas se puede emplear cualquiera de una diversidad de vehfculos de distribuci6n para facilitar la producci6n de una respuesta inmune antigenicamente especffica que se dirija a celulas tumorales. Los vehfculos de distribuci6n incluyen celulas presentadoras de antfgeno (APCs), tales como celulas dendrfticas, macr6fagos, celulas B, monocitos y otras celulas que se pueden disenar para que sean APCs eficaces. Dichas celulas pueden ser geneticamente modificadas, aunque no es necesario, para aumentar la capacidad para presentar el antfgeno, para mejorar la activaci6n y/o el mantenimiento de la respuesta de celulas T, para que tengan per se efectos antitumorales y/o para que sean inmunol6gicamente compatibles con el receptor (es decir, haplotipo de HLA coincidente). Las APCs pueden ser generalmente aisladas a partir de cualquiera de una diversidad de 6rganos y fluidos biol6gicos, incluyendo tejidos tumorales y peritumorales, y pueden ser aut6logas, alogenicas, singenicas o xenogenicas.

En ciertas realizaciones preferidas del presente invento se usan celulas dendrfticas o progenitores de las mismas como celulas presentadoras de antfgeno. Las celulas dendrfticas son APCs muy potentes (Banchereau y Steinman, Nature 392: 245-251, 1998) y se ha mostrado que son eficaces como adyuvantes fisiol6gicos para provocar una inmunidad antitumoral profilactica o terapeutica (vease Timmerman y Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507-529, 1999). En general, las celulas dendrfticas pueden ser identificadas basandose en su forma tfpica [estrellada in situ, con acusadas proyecciones citoplasmicas (dendritas) visibles in vitro], su capacidad para incorporar, procesar y presentar antfgenos con elevada eficacia, y su capacidad para activar respuestas de celulas T naff. Por supuesto, las celulas dendrfticas pueden ser geneticamente modificadas para que expresen ligandos o receptores de superficie celular especfficos que no se encuentran habitualmente en celulas dendrfticas in vivo ni ex vivo, y dichas celulas dendrfticas modificadas son contempladas por el presente invento. Como una alternativa a las celulas dendrfticas, se pueden usar celulas dendrfticas cargadas de antfgeno de vesfculas secretadas (llamadas exosomas) en una vacuna (vease �itvogel et al., Nature Med. 4: 594-600, 1998).

Las celulas dendrfticas y los progenitores pueden obtenerse de sangre periferica, medula 6sea, celulas que se infiltran en tumores, celulas que se infiltran en tejidos peritumorales, ganglios linfaticos, bazo, piel, sangre de cord6n umbilical o cualquier otro tejido o fluido adecuado. Por ejemplo, las celulas dendrfticas se pueden diferenciar ex vivo al anadir una combinaci6n de citocinas tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o TNF-a cultivos de monocitos recolectados de sangre periferica. Alternativamente, celulas CD34 positivas recolectadas de sangre periferica, sangre de cord6n umbilical o medula 6sea se pueden diferenciar en celulas dendrfticas al anadir al medio de cultivo combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNF-, ligando de CD40, LPS, ligando de flt3 y/u otro(s) compuesto(s) que provoque(n) la diferenciaci6n, maduraci6n y proliferaci6n de celulas dendrfticas.

Las celulas dendrfticas son convenientemente categorizadas como celulas "inmaduras" y "maduras", lo que permite una manera sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, no se deberfa interpretar que esta nomenclatura excluye todas las posibles fases intermedias de diferenciaci6n. Las celulas dendrfticas inmaduras se caracterizan como APCs con una elevada capacidad para la incorporaci6n y el procesamiento de antfgenos, lo que se correlaciona con la elevada expresi6n del receptor de Fcy y el receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza tfpicamente por una menor expresi6n de estos marcadores pero una elevada expresi6n de moleculas de la superficie celular responsables de la activaci6n de celulas T, tales como MHC de clase I y clase II, moleculas de adhesi6n (por ejemplo, CD54 y CD11) y moleculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1BB).

Las APCs pueden ser generalmente transfectadas con un polinucle6tido que codifica una protefna de tumor de mama (o una porci6n u otra variante de la misma) para que el polipeptido de tumor de mama, o una porci6n inmunogenica del mismo, se exprese en la superficie celular. Dicha transfecci6n puede tener lugar ex vivo, y luego se puede usar una composici6n o vacuna que comprenda dichas celulas transfectadas con fines terapeuticos, como aquf se describe. Alternativamente, se puede administrar a un paciente un vehfculo de distribuci6n genica que se dirija a una celula dendrftica u otra celula presentadora de antfgeno, lo que origina que la transfecci6n se produzca in vivo. La transfecci6n in vivo y ex vivo de celulas dendrfticas puede ser llevada generalmente a cabo, por ejemplo, usando cualesquier metodos conocidos en la tecnica, tales como los descritos en el Documento WO 97/24447, o el procedimiento de la pistola genica descrito por Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75: 456-460, 1997. La carga antigenica de las celulas dendrfticas puede ser llevada a cabo incubando celulas dendrfticas o celulas progenitoras con el polipeptido, DNA (desnudo o dentro de un vector plasmfdico) o RNA de tumor de mama, o con bacterias o virus recombinantes que expresan el antfgeno (por ejemplo, vectores de virus vaccinia, virus de la viruela aviar, adenovirus o lentivirus). Antes de la carga, el polipeptido puede ser covalentemente conjugado con una pareja inmunol6gica que proporcione la cooperaci6n de celulas T (por ejemplo, una molecula vehicular). Alternativamente, se puede impulsar una celula dendrftica con una pareja inmunol6gica no conjugada, separadamente o en presencia del polipeptido.

Terapia del cancer

En otros aspectos, las composiciones aquf descritas pueden ser utilizadas para la inmunoterapia del cancer, tal como el cancer de mama. En dichos metodos, se administran tfpicamente composiciones farmaceuticas y vacunas a un paciente. Como aquf se usa, un "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un ser humano. El paciente puede estar aquejado de cancer o no. En consecuencia, las anteriores composiciones farmaceuticas y vacunas pueden ser utilizadas para prevenir el desarrollo de un cancer o para tratar a un paciente aquejado de un cancer. Se puede diagnosticar un cancer usando criterios generalmente aceptados en la tecnica, incluyendo la presencia de un tumor maligno. Las composiciones farmaceuticas y vacunas se pueden administrar antes o despues de la extirpaci6n quirurgica de tumores primarios y/o de un tratamiento tal como la administraci6n de radioterapia o farmacos quimioterapeuticos convencionales.

En ciertas realizaciones, la inmunoterapia puede ser una inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la estimulaci6n in vivo del sistema inmune end6geno del huesped para que reaccione contra tumores con la administraci6n de agentes modificadores de la respuesta inmune (tales como los polipeptidos y polinucle6tidos aquf descritos).

En otras realizaciones, la inmunoterapia puede ser una inmunoterapia pasiva, en la que el tratamiento implica la distribuci6n de agentes con una establecida reactividad inmune sobre tumores (tales como celulas efectoras o anticuerpos) que puede transmitir directa o indirectamente efectos antitumorales y no depende necesariamente de un sistema inmune intacto del huesped. Los ejemplos de celulas efectoras incluyen celulas T como las anteriormente discutidas, linfocitos T (tales como linfocitos T citot6xicos CD8+, y linfocitos T cooperadores CD4+ que se infiltran en tumores), celulas asesinas (tales como celulas asesinas naturales y celulas asesinas activadas por linfocinas), celulas B y celulas presentadoras de antfgeno (tales como celulas dendrfticas y macr6fagos) que expresan un polipeptido aquf proporcionado. Los receptores de celulas T y receptores de anticuerpo especfficos para los polipeptidos aquf citados pueden ser clonados, expresados y transferidos a otros vectores o celulas efectoras para una inmunoterapia adoptiva. Los polipeptidos aquf proporcionados pueden ser tambien utilizados para generar anticuerpos o anticuerpos antiidiotfpicos (como se describi6 anteriormente y en la Patente de EE.UU. nO 4.918.164) para una inmunoterapia pasiva.

Mediante crecimiento in vitro, como aquf se describe, se pueden obtener generalmente celulas efectoras en cantidades suficientes para una inmunoterapia adoptiva. Las condiciones de cultivo para multiplicar celulas efectoras individuales antigenicamente especfficas hasta un numero de varios miles de millones con conservaci6n del reconocimiento antigenico in vivo son bien conocidas en la tecnica. Dichas condiciones de cultivo in vitro implican tfpicamente la estimulaci6n intermitente con antfgeno, a menudo en presencia de citocinas (tales como IL-2) y celulas nutrientes ("feeder") que no se dividen. Como se indic6 anteriormente, se pueden usar polipeptidos inmunorreactivos como los aquf proporcionados para multiplicar rapidamente cultivos de celulas T antigenicamente especfficas con objeto de generar un numero suficiente de celulas para inmunoterapia. En particular, celulas presentadoras de antfgeno, tales como celulas dendrfticas, macr6fagos, monocitos, fibroblastos y celulas B, pueden ser estimuladas con polipeptidos inmunorreactivos o ser transfectadas con uno o mas polinucle6tidos usando tecnicas estandares bien conocidas en este campo tecnico. Por ejemplo, se pueden transfectar celulas presentadoras de antfgeno con un polinucle6tido que tenga un promotor apropiado para aumentar la expresi6n en un virus recombinante u otro sistema de expresi6n. Las celulas efectoras cultivadas para uso en terapia deben ser capaces de crecer y distribuirse ampliamente y de sobrevivir mucho tiempo in vivo. Ciertos estudios han mostrado que se puede inducir el crecimiento in vivo y la supervivencia de larga duraci6n en numeros sustanciales de las celulas efectoras cultivadas, mediante la estimulaci6n repetida con antfgeno complementado con IL-2 (vease, por ejemplo, Cheever et al., Immunological Reviews 157; 177, 1997).

Alternativamente, un vector que expresa un polipeptido aquf citado puede ser introducido en celulas presentadoras de antfgeno obtenidas de un paciente y clonalmente propagadas ex vivo para su trasplante de vuelta en el mismo paciente. Las celulas transfectadas pueden ser reintroducidas en el paciente usando cualquier medio conocido en la tecnica, preferiblemente en forma esteril mediante administraci6n intravenosa, intracavitaria, intraperitoneal o intratumoral.

Las vfas y la frecuencia de administraci6n de las composiciones terapeuticas aquf descritas, asf como la dosificaci6n, variaran de individuo a individuo y podran ser facilmente establecidas usando tecnicas estandares. En general, las composiciones farmaceuticas y vacunas pueden ser administradas por inyecci6n (por ejemplo, intracutanea, intramuscular, intravenosa o subcutanea), intranasalmente (por ejemplo, por aspiraci6n) u oralmente. Preferiblemente se pueden administrar entre 1 y 10 dosis a lo largo de un periodo de 52 semanas. Preferiblemente, se administran 6 dosis a intervalos de 1 mes, y mas tarde se pueden administrar peri6dicamente vacunaciones de refuerzo. Protocolos alternativos pueden ser apropiados para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de un compuesto que, cuando se administra del modo anteriormente descrito, es capaz de provocar una respuesta inmune antitumoral, que esta al menos 10-50% por encima del nivel basal (es decir, sin tratamiento).

Dicha respuesta puede ser verificada midiendo los anticuerpos antitumorales en el paciente o por la generaci6n, dependiente de vacuna, de celulas efectoras citolfticas capaces de matar las celulas tumorales del paciente in vitro. Dichas vacunas tambien deberfan ser capaces de causar una respuesta inmune que condujera a un resultado clfnico mejorado (por ejemplo, remisiones mas frecuentes o una supervivencia completa o parcial o mas duradera sin enfermedad) en los pacientes vacunados en comparaci6n con los pacientes no vacunados. En general, para las composiciones farmaceuticas y vacunas que comprenden uno o mas polipeptidos, la cantidad de cada polipeptido presente en una dosis varfa de aproximadamente 100 Ig a 5 mg por kg de huesped. Los tamanos adecuados de las dosis variaran con el tamano del paciente, pero se extenderan tfpicamente de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 5 ml.

En general, un regimen de dosificaci6n y tratamiento apropiado proporciona el(los) compuesto(s) activo(s) en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapeutico y/o profilactico. Dicha respuesta puede ser verificada estableciendo un resultado clfnico mejorado (por ejemplo, remisiones mas frecuentes o una supervivencia completa

o parcial o mas duradera sin enfermedad) en los pacientes tratados en comparaci6n con los pacientes no tratados. Los aumentos de respuestas inmunes preexistentes hacia una protefna de tumor de mama se correlacionan generalmente con un resultado clfnico mejorado. Dichas respuestas inmunes pueden ser generalmente evaluadas usando ensayos estandares de proliferaci6n, citotoxicidad o citocinas, los cuales pueden ser llevados a cabo usando muestras obtenidas de un paciente antes y despues del tratamiento.

Metodos para detectar el cancer

En general, se puede detectar un cancer en un paciente basandose en la presencia de una o mas protefnas de tumor de mama y/o polinucle6tidos que codifican dichas protefnas en una muestra biol6gica (por ejemplo, sangre, sueros, orina y/o biopsias tumorales) obtenida del paciente. En otras palabras, dichas protefnas se pueden utilizar como marcadores para indicar la presencia o ausencia de un cancer tal como un cancer de mama. Ademas, dichas protefnas pueden ser utiles para la detecci6n de otros canceres. Los agentes ligantes aquf proporcionados permiten generalmente la detecci6n del nivel de antfgeno que se une al agente en la muestra biol6gica. Se pueden usar cebadores y sondas polinucleotfdicos para detectar el nivel de mRNA que codifica una protefna tumoral, lo que es tambien indicativo de la presencia o ausencia de un cancer. En general, deberfa estar presente una secuencia de tumor de mama en un nivel que fuera al menos tres veces mayor en el tejido tumoral que en el tejido normal.

Hay una diversidad de formatos de ensayo conocidos por quienes tienen una experiencia normal en la tecnica en los que se usa un agente ligante para detectar marcadores polipeptfdicos en una muestra. Vease, por ejemplo, Harlot y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, la presencia o ausencia de un cancer en un paciente puede ser determinada (a) poniendo una muestra biol6gica obtenida del paciente en contacto con un agente ligante; (b) detectando en la muestra un nivel de polipeptido que se une al agente ligante; y

(c) comparando el nivel de polipeptido con un valor de corte predeterminado.

En una realizaci6n preferida, el ensayo implica el uso de un agente ligante inmovilizado en un soporte s6lido para que se una al polipeptido y lo separe del resto de la muestra. El polipeptido unido puede ser luego detectado usando un reactivo de detecci6n que contiene un grupo informador y se une especfficamente al complejo de agente ligante/polipeptido. Dichos reactivos de detecci6n pueden comprender, por ejemplo, un agente ligante que se une especfficamente al polipeptido, o un anticuerpo u otro agente que se une especfficamente al agente ligante tal como una antiinmunoglobulina, protefna G, protefna A o una lectina. Alternativamente, se puede utilizar un ensayo competitivo en el que un polipeptido es etiquetado con un grupo informador y es dejado que se una al agente ligante inmovilizado despues de la incubaci6n del agente ligante con la muestra. El grado en que los componentes de la muestra inhiben la uni6n del agente ligante con el polipeptido etiquetado es indicativo de la reactividad de la muestra con el agente ligante inmovilizado. Los polipeptidos adecuados para uso en dichos ensayos incluyen protefnas de tumor de mama de longitud completa y porciones de las mismas a las que se une el agente ligante, como se describi6 anteriormente.

El soporte s6lido puede ser cualquier material conocido por quienes tienen una experiencia normal en la tecnica, al que se puede fijar la protefna tumoral. Por ejemplo, el soporte s6lido puede ser un pocillo de ensayo de una placa de microtitulaci6n, o una membrana de celulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser un gl6bulo o un disco, tal como de vidrio, fibra de vidrio, latex o un material plastico tal como poliestireno o poli(cloruro de vinilo). El soporte tambien puede ser una partfcula magnetica o un sensor de fibra 6ptica, tales como los descritos en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nO 5.359.681. El agente ligante puede ser inmovilizado en el soporte s6lido usando una diversidad de tecnicas conocidas por quienes tienen experiencia en este campo tecnico, las cuales son ampliamente descritas en la bibliograffa cientffica y de patentes. En el contexto del presente invento, el termino "inmovilizaci6n" se refiere tanto a la asociaci6n no covalente, tal como la adsorci6n, como a la fijaci6n covalente (que puede ser un enlace directo entre el agente y grupos funcionales del soporte o puede ser un enlace por medio de un agente entrecruzante). Se prefiere la inmovilizaci6n por adsorci6n a un pocillo de una placa de microtitulaci6n o a una membrana. En tales casos, se puede conseguir la adsorci6n al poner el agente ligante, en un tamp6n adecuado, en contacto con el soporte s6lido durante un periodo adecuado de tiempo. El tiempo de contacto varfa con la temperatura, pero es tfpicamente de entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 1 dfa. En general, la puesta en contacto de un pocillo de una placa de microtitulaci6n de plastico [tal como de poliestireno o poli(cloruro de vinilo)] con una cantidad de agente ligante que varfa de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 10 Ig, y preferiblemente de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 1 Ig, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de agente ligante.

La fijaci6n covalente del agente ligante a un soporte s6lido puede ser llevada generalmente a cabo haciendo reaccionar primero el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionara tanto con el soporte como con un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, del agente ligante. Por ejemplo, el agente ligante puede ser covalentemente fijado a soportes que tienen un revestimiento apropiado de polfmero usando benzoquinona o por condensaci6n de un grupo aldehfdo del soporte con una amina y un hidr6geno activo de la pareja ligante (vease, por ejemplo, Pierce Immunotechnology Catalog and Handboo�, 1991, en A12-A13).

En ciertas realizaciones, el ensayo es un ensayo de tipo sandtich con dos anticuerpos. Este ensayo puede ser llevado a cabo poniendo primero un anticuerpo que ha sido inmovilizado en un soporte s6lido, comunmente el pocillo de una placa de microtitulaci6n, en contacto con la muestra para permitir que los polipeptidos de la muestra se unan al anticuerpo inmovilizado. Luego se separa la muestra no unida de los complejos de polipeptido-anticuerpo inmovilizados y se anade un reactivo de detecci6n (preferiblemente un segundo anticuerpo capaz de unirse a un sitio diferente del polipeptido) que contiene un grupo informador. Luego se determina la cantidad de reactivo de detecci6n que permanece unido al soporte s6lido usando un metodo apropiado para el grupo informador especffico.

Mas especfficamente, una vez que se ha inmovilizado el anticuerpo en el soporte del modo anteriormente descrito, se bloquean tfpicamente los sitios ligantes de protefna restantes del soporte. Se puede usar cualquier agente bloqueante adecuado conocido por quienes tienen una experiencia normal en la tecnica, tal como albumina serica bovina o Tteen 20T (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, EE.UU.). Luego se incuba la muestra con el anticuerpo inmovilizado y se deja que el polipeptido se una al anticuerpo. La muestra puede ser diluida con un agente diluyente adecuado, tal como disoluci6n salina tamponada con fosfato (PBS; del ingles, phosphate buffered saline), antes de la incubaci6n. En general, un tiempo de contacto apropiado (es decir, el tiempo de incubaci6n) es un periodo de tiempo que es suficiente para detectar la presencia de un polipeptido en una muestra obtenida de un individuo con cancer de mama. Preferiblemente, el tiempo de contacto es suficiente para alcanzar un nivel de uni6n que es al menos aproximadamente el 95% del alcanzado en el equilibrio entre el polipeptido unido y el no unido. Quienes tienen una experiencia normal en la tecnica reconoceran que el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio puede ser facilmente determinado examinando el nivel de uni6n que tiene lugar a lo largo de un periodo de tiempo. A temperatura ambiental, basta generalmente un tiempo de incubaci6n de aproximadamente 30 minutos.

La muestra no unida puede ser luego separada lavando el soporte s6lido con un tamp6n apropiado, tal como PBS que contiene Tteen 20T al 0,1%. Luego se puede anadir el segundo anticuerpo, que contiene un grupo informador, al soporte s6lido. Los grupos informadores preferidos incluyen los grupos anteriormente citados.

El reactivo de detecci6n es luego incubado con el complejo de anticuerpo inmovilizado-polipeptido durante un espacio de tiempo suficiente para detectar el polipeptido unido. En general, se puede determinar un espacio de tiempo apropiado examinando el nivel de uni6n que tiene lugar a lo largo de un periodo de tiempo. Luego se separa el reactivo de detecci6n no unido y se detecta el reactivo de detecci6n unido usando el grupo informador. El metodo empleado para detectar el grupo informador depende de la naturaleza del grupo informador. Para grupos radiactivos, los metodos autorradiograficos o de recuento de centelleo son generalmente apropiados. Se pueden usar metodos espectrosc6picos para detectar colorantes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. Se puede detectar biotina usando avidina copulada con un grupo informador diferente (comunmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos informadores enzimaticos pueden ser generalmente detectados mediante la adici6n de un sustrato (generalmente durante un periodo especffico de tiempo), seguida del analisis espectrosc6pico u otro analisis de los productos de reacci6n.

Para determinar la presencia o ausencia de un cancer, tal como un cancer de mama, la senal detectada procedente del grupo informador que permanece unido al soporte s6lido es generalmente comparada con una senal que corresponde a un valor de corte predeterminado. En una realizaci6n preferida, el valor de corte para la detecci6n de un cancer es la senal media obtenida cuando el anticuerpo inmovilizado es incubado con muestras de pacientes sin el cancer. En general, se considera que una muestra que genere una senal que este tres desviaciones estandares por encima del valor de corte predeterminado es positiva para el cancer. En una realizaci6n alternativa preferida, el valor de corte es determinado utilizando una Curva Operativa del Receptor, de acuerdo con el metodo de Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brotn and Co., 1985, paginas 106-7. En pocas palabras, en esta realizaci6n, se puede determinar el valor de corte a partir de un grafico de pares de fndices de verdaderos positivos (es decir, sensibilidad) e fndices de falsos positivos (100%-especificidad) que corresponden a cada posible valor de corte para el resultado del ensayo diagn6stico. El valor de corte del grafico que sea el mas pr6ximo a la esquina superior izquierda (es decir, el valor que encierra la mayor superficie) es el valor de corte mas preciso, y se puede considerar que una muestra que genere una senal que sea superior al valor de corte determinado mediante este metodo es positiva. Alternativamente, el valor de corte puede ser desplazado a la izquierda a lo largo del grafico para minimizar el fndice de falsos positivos, o a la derecha para minimizar el fndice de falsos negativos. En general, se considera que una muestra que genere una senal que sea superior al valor de corte determinado mediante este metodo es positiva para un cancer.

En una realizaci6n relacionada, el ensayo se lleva a cabo en un formato de ensayo en tira o de flujo a traves, en el que el agente ligante esta inmovilizado en una membrana, tal como una de nitrocelulosa. En el ensayo de flujo a traves, los polipeptidos de la muestra se unen al agente ligante inmovilizado conforme la muestra atraviesa la membrana. Luego se une un segundo agente ligante etiquetado al complejo de agente ligante-polipeptido conforme una disoluci6n que contiene el segundo agente ligante atraviesa la membrana. Luego se puede llevar a cabo la detecci6n del segundo agente ligante unido, del modo anteriormente descrito. En el formato de ensayo en tira, se sumerge un extremo de la membrana a la cual esta unido el agente ligante, en una disoluci6n que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a traves de una regi6n que contiene el segundo agente ligante y a la zona del agente ligante inmovilizado. La concentraci6n del segundo agente ligante en la zona del anticuerpo inmovilizado indica la presencia de un cancer. Tfpicamente la concentraci6n del segundo agente ligante en ese sitio genera un dibujo, tal como una lfnea, que se puede leer visualmente. La ausencia de dicho dibujo indica un resultado negativo. En general, la cantidad de agente ligante inmovilizado en la membrana es seleccionada para que se genere un dibujo visualmente discernible cuando la muestra biol6gica contiene un nivel de polipeptido que bastarfa para generar una senal positiva en el ensayo de tipo sandtich con dos anticuerpos, en el formato anteriormente discutido. Los agentes ligantes preferidos para uso en dichos ensayos son anticuerpos y fragmentos ligantes de antfgeno de los mismos. Preferiblemente, la cantidad de anticuerpo inmovilizado en la membrana varfa de aproximadamente 25 ng a aproximadamente 1 Ig, y mas preferiblemente de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 500 ng. Dichos ensayos pueden ser llevados tfpicamente a cabo con una pequenfsima cantidad de muestra biol6gica.

Por supuesto, existen otros numerosos protocolos de ensayo que son adecuados para uso con las protefnas tumorales o agentes ligantes del presente invento. Se pretende que las anteriores descripciones s6lo sean ejemplares. Por ejemplo, resultara evidente a quienes tienen una experiencia normal en la tecnica que los protocolos anteriores pueden ser facilmente modificados para usar polipeptidos de tumor de mama para detectar anticuerpos que se unen a dichos polipeptidos en una muestra biol6gica. La detecci6n de dichos anticuerpos especfficos para protefnas de tumor de mama se puede correlacionar con la presencia de un cancer.

Un cancer puede ser tambien o alternativamente detectado basandose en la presencia de celulas T que reaccionan especfficamente con una protefna de tumor de mama en una muestra biol6gica. En ciertos metodos, una muestra biol6gica que comprende celulas T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente es incubada con un polipeptido de tumor de mama, un polinucle6tido que codifica dicho polipeptido, y/o una APC que expresa al menos una porci6n inmunogenica de dicho polipeptido, y se detecta la presencia o ausencia de una activaci6n especffica de las celulas

T. Las muestras biol6gicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulas T aisladas. Por ejemplo, se pueden aislar celulas T de un paciente mediante tecnicas rutinarias (tal como por centrifugaci6n de linfocitos de sangre periferica en un gradiente de densidades de Ficoll/Hypaque). Las celulas T pueden ser incubadas in vitro con el polipeptido (por ejemplo, 5 - 25 Ig/ml) durante 2-9 dfas (tfpicamente 4 dfas) a 37 °C. Puede resultar deseable incubar otra parte alfcuota de una muestra de celulas T en ausencia del polipeptido de tumor de mama, para que sirva como testigo. Para celulas T CD4+, la activaci6n es preferiblemente detectada evaluando la proliferaci6n de las celulas T. Para celulas T CD8+, la activaci6n es preferiblemente detectada evaluando la actividad citolftica. Un nivel de proliferaci6n que sea al menos dos veces mayor y/o un nivel de actividad citolftica que sea al menos un 20% mayor que dichos niveles en pacientes exentos de enfermedad indica la presencia de un cancer en el paciente.

Como se indic6 anteriormente, un cancer puede ser tambien o alternativamente detectado basandose en el nivel de mRNA que codifica una protefna de tumor de mama en una muestra biol6gica. Por ejemplo, se pueden emplear al menos dos cebadores oligonucleotfdicos en un ensayo basado en la reacci6n en cadena de la polimerasa (PCR) para multiplicar una porci6n de un cDNA de tumor de mama procedente de una muestra biol6gica, en que al menos uno de los cebadores oligonucleotfdicos es especffico para (es decir, se hfbrida con) un polinucle6tido que codifica la protefna de tumor de mama. El cDNA multiplicado es luego separado y detectado usando tecnicas bien conocidas en este campo tecnico, tal como una electroforesis en gel. Similarmente, se pueden usar sondas oligonucleotfdicas que se hibridan especfficamente con un polinucle6tido que codifica una protefna de tumor de mama, en un ensayo de hibridaci6n, para detectar la presencia de un polinucle6tido que codifica la protefna tumoral en una muestra biol6gica.

Para permitir la hibridaci6n bajo las condiciones de ensayo, los cebadores y sondas oligonucleotfdicos deberfan comprender una secuencia oligonucleotfdica que tuviera una identidad de al menos aproximadamente 60%, preferiblemente al menos aproximadamente 75% y mas preferiblemente al menos aproximadamente 90%, con respecto a una porci6n de un polinucle6tido que codifica una protefna de tumor de mama que tiene una longitud de al menos 10 nucle6tidos, y preferiblemente al menos 20 nucle6tidos. Preferiblemente, los cebadores y/o sondas oligonucleotfdicos se hibridaran con un polinucle6tido que codifica un polipeptido aquf descrito bajo unas condiciones moderadamente rigurosas, como se defini6 anteriormente. Los cebadores y/o sondas oligonucleotfdicos que se pueden emplear utilmente en los metodos diagn6sticos aquf descritos tienen preferiblemente una longitud de al menos 10-40 nucle6tidos. En una realizaci6n preferida, los cebadores oligonucleotfdicos comprenden al menos 10 nucle6tidos contiguos, mas preferiblemente al menos 15 nucle6tidos contiguos, de una molecula de DNA que tiene una secuencia expuesta en las ID. SEC. numeros 1-175, 178, 180 y 182-468. Las tecnicas tanto para los ensayos basados en PCR como para los ensayos de hibridaci6n son bien conocidas en este campo tecnico (veanse, por ejemplo, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263, 1987; y Erlich (redactor), PCR Technology, Stockton Press, Net York, 1989).

En un ensayo preferido se emplea una RT-PCR, en la que se aplica una PCR junto con una transcripci6n inversa. Tfpicamente, se extrae RNA de una muestra biol6gica, tal como tejido de biopsia, y se somete a transcripci6n inversa para producir moleculas de cDNA. Una multiplicaci6n por PCR utilizando al menos un cebador especffico genera una molecula de cDNA que puede ser separada y visualizada usando, por ejemplo, electroforesis en gel. La multiplicaci6n puede ser llevada a cabo sobre muestras biol6gicas tomadas de un paciente de ensayo y de un individuo que no esta aquejado de cancer. La reacci6n de multiplicaci6n puede ser llevada a cabo sobre diversas diluciones de cDNA que abarquen dos 6rdenes de magnitud. Tfpicamente, se considera positivo un aumento de expresi6n del doble o mas en las diversas diluciones de la muestra del paciente de ensayo en comparaci6n con las mismas diluciones de la muestra no cancerosa.

En otra realizaci6n, las composiciones descritas pueden ser usadas como marcadores para el progreso del cancer. En esta realizaci6n, se pueden llevar a cabo a lo largo del tiempo ensayos como los anteriormente descritos para el diagn6stico de un cancer y se puede evaluar el cambio en el nivel del (de los) polipeptido(s) o del polinucle6tido reactivos. Por ejemplo, los ensayos pueden ser llevados a cabo cada 24-72 horas durante un periodo de 6 meses a 1 ano y, mas adelante, conforme sea necesario. En general, un cancer progresa en aquellos pacientes en que el nivel del polipeptido o polinucle6tido detectado aumenta con el tiempo. Por contraste, el cancer no progresa cuando el nivel del polipeptido o polinucle6tido reactivo permanece constante o disminuye con el tiempo.

Se pueden llevar directamente a cabo ciertos ensayos diagn6sticos in vivo sobre un tumor. Uno de dichos ensayos implica poner celulas tumorales en contacto con un agente ligante. El agente ligante unido puede ser luego directa o indirectamente detectado por medio de un grupo informador. Dichos agentes ligantes pueden ser tambien usados en aplicaciones histol6gicas. Alternativamente, se pueden usar sondas polinucleotfdicas en dichas aplicaciones.

Como se indic6 anteriormente, para mejorar la sensibilidad, se pueden examinar multiples marcadores de protefnas de tumor de mama en una muestra dada. Resultara evidente que en un solo ensayo se pueden combinar agentes ligantes especfficos para diferentes protefnas aquf proporcionadas. Ademas, se pueden usar concurrentemente multiples cebadores o sondas. La selecci6n de los marcadores de protefnas tumorales se puede basar en experimentos rutinarios para determinar las combinaciones que dan lugar a una sensibilidad 6ptima. Ademas, o alternativamente, los ensayos para protefnas tumorales aquf proporcionados se pueden combinar con ensayos para otros antfgenos tumorales conocidos.

Kits diagn6sticos

El presente invento proporciona ademas kits para uso en cualquiera de los anteriores metodos diagn6sticos. Dichos kits comprenden tfpicamente dos o mas componentes necesarios para llevar un ensayo diagn6stico a cabo. Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, recipientes y/o un equipo. Por ejemplo, un recipiente de un kit puede contener un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que se une especfficamente a una protefna de tumor de mama. Dichos anticuerpos o fragmentos se pueden proporcionar fijados a un material de soporte, como se describi6 anteriormente. Uno o mas recipientes adicionales pueden encerrar elementos, tales como reactivos o tampones, que se van a usar en el ensayo. Dichos kits pueden contener tambien, o alternativamente, un reactivo de detecci6n como el anteriormente descrito que contenga un grupo informador adecuado para la detecci6n directa o indirecta de la uni6n de anticuerpos.

Alternativamente, se puede disenar un kit para detectar el nivel de mRNA que codifica una protefna de tumor de mama en una muestra biol6gica. Dichos kits comprenden generalmente al menos una sonda o cebador oligonucleotfdico, como se describi6 anteriormente, que se hibrida con un polinucle6tido que codifica una protefna de tumor de mama. Dicho oligonucle6tido se puede utilizar, por ejemplo, en una PCR o un ensayo de hibridaci6n. Los componentes adicionales que pueden estar presentes en dichos kits incluyen un segundo oligonucle6tido y/o un reactivo diagn6stico o recipiente para facilitar la detecci6n de un polinucle6tido que codifica una protefna de tumor de mama.

Los ejemplos siguientes se presentan a modo de ilustraci6n y no a modo de limitaci6n.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Aislamiento y caracterizaci6n de polipeptidos de tumor de mama En este ejemplo se describe el aislamiento de polipeptidos de tumor de mama procedentes de un banco de cDNA de tumor de mama.

Se aislaron clones de cDNA que estan sobreexpresados en tejido de tumor de mama, a partir de bancos de sustracci6n de cDNA de mama, del modo siguiente. Se prepararon bancos de sustracci6n de mama, del modo anteriormente descrito, por sustracci6n basada en PCR empleando colecciones de cDNA de tumor de mama como comprobador y colecciones de cDNA de mama normal o cDNA de otros tejidos normales como conductor. Se tomaron aleatoriamente clones de cDNA de la sustracci6n de mama y se multiplicaron mediante PCR de colonias, y se determinaron sus niveles de expresi6n de mRNA en tumor de mama, mama normal y otros diversos tejidos normales usando la tecnologfa de micromatrices anteriormente descrita. Se hall6 que veinticuatro clones de cDNA distintos estaban sobreexpresados en tumor de mama y expresados con bajos niveles en todos los tejidos normales examinados (mama, cerebro, hfgado, pancreas, pulm6n, glandula salival, est6mago, colon, rin6n, medula 6sea, musculo esqueletico, PBMC, coraz6n, intestino delgado, glandula suprarrenal, medula espinal, intestino grueso y piel). En la ID. SEC. nO 71 se proporciona la determinada secuencia parcial de cDNA de uno de estos clones. No se hallaron homologfas significativas al comparar la secuencia de ID. SEC. nO 71 con las secuencias del banco de genes usando las bases de datos de EMBL y GenBank (Emisi6n 97).

Se aislaron tres isoformas de DNA para el clon B726P (secuencia parcial proporcionada en la ID. SEC. nO 71) del modo siguiente. Se sintetiz6 una sonda radiactiva a partir de B726P cortando DNA de B726P de un vector pT7Blue (Novagen) mediante una digesti6n de restricci6n con BamHI/XbaI, y usando el DNA resultante como molde en una PCR de cadena sencilla en presencia de [ -32P]dCTP. En la ID. SEC. nO 177 se proporciona la secuencia del cebador empleado para esta PCR. Se us6 la sonda radiactiva resultante para sondar un banco de cDNA direccional y un banco de cDNA aleatoriamente cebado, preparados usando RNA aislado de tumores de mama. Ochenta y cinco clones fueron identificados, escindidos, purificados y secuenciados. Se hall6 que, de estos 85 clones, tres contenfan un significativo marco de lectura abierto. En la ID. SEC. nO 175 se proporciona la determinada secuencia de cDNA de la isoforma B726P-20, proporcionandose en la ID. SEC. nO 176 la correspondiente secuencia prevista de aminoacidos. En la ID. SEC. nO 178 se proporciona la determinada secuencia de cDNA de la isoforma B726P-74, proporcionandose en la ID. SEC. nO 179 la correspondiente secuencia prevista de aminoacidos. En la ID. SEC. nO 180 se proporciona la determinada secuencia de cDNA de la isoforma B726P-79, proporcionandose en la ID. SEC. nO 181 la correspondiente secuencia prevista de aminoacidos.

Los esfuerzos para obtener un clon de longitud completa de B726P usando tecnicas estandares condujeron al aislamiento de cinco clones adicionales que representan una secuencia 5' adicional de B726P. Parece que estos clones son formas de corte y empalme alternativas del mismo gen. En las ID. SEC. numeros 464-468 se proporcionan las determinadas secuencias de cDNA de estos clones, proporcionandose en las ID. SEC. numeros 470-473, respectivamente, las previstas secuencias de aminoacidos codificadas por las ID. SEC. numeros 464-467. Utilizando tecnicas informaticas estandares, se cre6 una secuencia de DNA de consenso de 3681 pares de bases (ID. SEC. nO 463) que contiene dos grandes marcos de lectura abiertos. El ORF cadena abajo codifica la prevista secuencia de aminoacidos de ID. SEC. nO 181. En la ID. SEC. nO 469 se proporciona la prevista secuencia de aminoacidos codificada por el ORF cadena arriba.

Ejemplo 2

Sfntesis de polipeptidos

Se pueden sintetizar polipeptidos en un sintetizador peptfdico Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 430a usando la qufmica de FMOC con activaci6n por HPTU (hexafluorofosfato de O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronio. Se puede fijar una secuencia Gly-Cys-Gly al extremo amfnico del peptido para proporcionar un metodo de conjugaci6n, uni6n a una superficie inmovilizada, o marcaci6n del peptido. La escisi6n de los peptidos del soporte s6lido puede ser llevada a cabo usando la siguiente mezcla de escisi6n: acido trifluoroacetico:etanoditiol:tioanisol:agua:fenol (40:1:2:2:3). Despues de una escisi6n durante 2 horas, los peptidos pueden ser precipitados en metil-t-butil-eter frfo. Luego se pueden disolver los sedimentos peptfdicos en agua que contiene acido trifluoroacetico (TFA) al 0,1% y se pueden liofilizar antes de una purificaci6n por HPLC en fase inversa C18. Para eluir los peptidos, se puede usar un gradiente de acetonitrilo al 0%-60% (que contiene TFA al 0,1%) en agua (que contiene TFA al 0,1%). Despues de la liofilizaci6n de las fracciones puras, los peptidos pueden ser caracterizados usando electropulverizaci6n u otros tipos de espectrometrfa de masas y mediante un analisis de aminoacidos.

A partir de lo precedente, se apreciara que, aunque aquf se han descrito realizaciones especfficas del invento con fines de ilustraci6n, se pueden realizar diversas modificaciones.

LIS�� DE SEC�ENCI�S

�110� Corixa Corporation Yuqie, Jiang Dillon, Davin C.

5 Mitcham, Jennifer L. Xu, Jiangchun Harlocker, Susan L.

�120� COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO Y DIAGN�STICO DE C�NCER DE MAMA, Y M�TODOS 10 PARA SU USO

�130� 210121.47001PC

�140� PCT 15 �141� 2000-02-15

�160� 474

�170� FastSEQ para Windots, versi6n 3.0

20 �210� 71 �211� 618 �212� DNA �213� Homo sapiens

25 �400� 71

�210� 175 30 �211� 1206

�212� DNA

�213� Homo sapiens

�400� 175

5

�210� �211� �212� �213� 176 317 PRT Homo sapiens

�400�

176

10

�210�

177

�211�

20

�212�

DNA

�213�

Secuencia artificial

15

�220�

�223�

Hecho en el Laboratorio

�400� 177

5

�210� �211� �212� �213� 178 1665 DNA Homo sapiens

�400�

178

15 �213� Homo sapiens

�400� 179

5

�210� �211� �212� �213� 180 1681 DNA Homo sapiens

�400�

180

�400� 181

5

�210� �211� �212� �213� 463 3681 DNA Homo sapiens

�400�

463

�210�

464

�211�

1424

�212�

DNA

5

�213� Homo sapiens

�400�

464

10

�210� �211� �212� �213� 465 674 DNA Homo sapiens

�400�

465

20 �213� Homo sapiens

�220� �221� incierto �222� (11)

25 �223� n�A,T,CoG �221� incierto �222� (1128) �223� n�A,T,CoG

�400� 466

5 �210� 467 �211� 1337 �212� DNA �213� Homo sapiens

10 �400� 467

�210�

468

�211�

2307

�212�

DNA

5

�213� Homo sapiens

�400�

468

10 �210� 469 �211� 650 �212� PRT �213� Homo sapiens

15 �220� �221� incierto �222� (310) �223� Xaa � cualquier aminoacido �221� incierto

20 �222� (429) �223� Xaa � cualquier aminoacido �221� incierto �222� (522) �223� Xaa � cualquier aminoacido

�400� 469

�210�

470

�211�

228

�212�

PRT

5

�213� Homo sapiens

�400�

470

10

�210�

471

�211�

154

�212�

PRT

15

�213� Homo sapiens

�220�

�221�

incierto

�222�

(148)

20

�223� Xaa � cualquier aminoacido

�400�

471

�210�

5 �211� �212� �213�

�220�

10 �221� �222� �223�

�400� 472 467 PRT

Homo sapiens

incierto

(329) Xaa � cualquier aminoacido

�400� 473

Claims (59)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polipeptido aislado que comprende al menos una porci6n de una protefna de tumor de mama, en que el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la secuencia polinucleotfdica expuesta en la ID. SEC. nO 175, o una variante de dicho polipeptido en que la variante comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por una secuencia polinucleotfdica que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a una secuencia de ID. SEC. nO 175, y la capacidad de la variante para reaccionar con antisueros antigenicamente especfficos esta potenciada, inalterada o disminuida en menos de un 50% con respecto a la de un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la ID. SEC. nO 175; con tal de que el polipeptido no tenga la secuencia expuesta en la ID. SEC. nO 176 con la sustituci6n de Val Ile por Asn Ser en las posiciones 316 y 317.

2. 2.

   Un polipeptido aislado de acuerdo con la Reivindicaci6n 1, en que el polipeptido es un polipeptido variante que comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por un polinucle6tido que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a la secuencia de ID. SEC. nO 175, y la capacidad de la variante para reaccionar con antisueros antigenicamente especfficos esta disminuida en menos de un 20% con respecto a la de un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la ID. SEC. nO 175.

3. 3.

   Un polipeptido aislado de acuerdo con la Reivindicaci6n 1, en que el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la secuencia polinucleotfdica expuesta en la ID. SEC. nO 175.

4. 4.

   Un polipeptido aislado que comprende la secuencia de ID. SEC. nO 176.

5. 5.

   Un polinucle6tido aislado que codifica un polipeptido de acuerdo con la Reivindicaci6n 1.

6. 6.

   Un polinucle6tido aislado que codifica una protefna de tumor de mama, en que la protefna tumoral comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por un polinucle6tido que comprende la secuencia expuesta en la ID. SEC. nO 175.

7. 7.

   Un polinucle6tido aislado que comprende una secuencia expuesta en la ID. SEC. nO 175.

8. 8.

   Un polinucle6tido aislado que comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a la secuencia expuesta en la ID. SEC. nO 175, y que codifica un polipeptido que tiene una capacidad para reaccionar con antisueros antigenicamente especfficos que esta potenciada, inalterada o disminuida en menos de un 50% con respecto a la de un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la ID. SEC. nO 175.

9. 9.

   Un polinucle6tido aislado de acuerdo con la Reivindicaci6n 8, en que el polipeptido codificado por ese polinucle6tido tiene una capacidad para reaccionar con antisueros antigenicamente especfficos que esta disminuida en menos de un 20% con respecto a la de un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la ID. SEC. nO 175.

10. 10.

    Un polinucle6tido aislado, complementario de un polinucle6tido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 5-9.

11. 11.

    Un vector de expresi6n que comprende un polinucle6tido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 5

12. 9.

13. 12.

    Una celula huesped transformada o transfectada con un vector de expresi6n de acuerdo con la Reivindicaci6n

14. 11.

15. 13.

    Un vector de expresi6n que comprende un polinucle6tido de acuerdo con la Reivindicaci6n 10.

16. 14.

    Una celula huesped transformada o transfectada con un vector de expresi6n de acuerdo con la Reivindicaci6n

17. 13.

18. 15.

    Una vacuna que comprende un polipeptido de acuerdo con la Reivindicaci6n 1, en combinaci6n con un agente inmunoestimulante.

19. 16.

    Una vacuna que comprende un polinucle6tido de acuerdo con la Reivindicaci6n 5, en combinaci6n con un agente inmunoestimulante.

20. 17.

    Un anticuerpo aislado, o un fragmento ligante de antfgenos del mismo, que se une especfficamente a la porci6n de una protefna de tumor de mama que comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la secuencia polinucleotfdica expuesta en la ID. SEC. nO 175.

21. 18.

    Una vacuna que comprende una celula presentadora de antfgenos que expresa un polipeptido de acuerdo con la Reivindicaci6n 1, en combinaci6n con un agente inmunoestimulante.

22. 19.

    Una vacuna de acuerdo con la Reivindicaci6n 18, en que la celula presentadora de antfgeno es una celula dendrftica.

23. 20.

    Un polipeptido de acuerdo con la Reivindicaci6n 1, para uso en un metodo para inhibir el desarrollo de un cancer de mama en un paciente.

24. 21.

    Un polinucle6tido de acuerdo con la Reivindicaci6n 5, para uso en un metodo para inhibir el desarrollo de un cancer de mama en un paciente.

25. 22.

    Un anticuerpo o fragmento ligante de antfgenos del mismo de la Reivindicaci6n 17, para uso en un metodo para inhibir el desarrollo de un cancer de mama en un paciente.

26. 23.

    Una celula presentadora de antfgenos que expresa un polipeptido de acuerdo con la Reivindicaci6n 1, para uso en un metodo para inhibir el desarrollo de un cancer de mama en un paciente.

27. 24.

    Una celula de acuerdo con la Reivindicaci6n 23, en que la celula presentadora de antfgeno es una celula dendrftica.

28. 25.

    Una protefna de fusi6n que comprende al menos un polipeptido de acuerdo con la Reivindicaci6n 1.

29. 26.

    Una protefna de fusi6n de acuerdo con la Reivindicaci6n 25, en que la protefna de fusi6n comprende un potenciador de expresi6n que aumenta la expresi6n de la protefna de fusi6n en una celula huesped transfectada con un polinucle6tido que codifica la protefna de fusi6n.

30. 27.

    Una protefna de fusi6n de acuerdo con la Reivindicaci6n 26, en que la protefna de fusi6n comprende un epftopo T cooperador que no esta presente en el polipeptido de la Reivindicaci6n 1.

31. 28.

    Una protefna de fusi6n de acuerdo con la Reivindicaci6n 26, en que la protefna de fusi6n comprende una etiqueta de afinidad.

32. 29.

    Un polinucle6tido aislado que codifica una protefna de fusi6n de acuerdo con la Reivindicaci6n 25.

33. 30.

    Una vacuna que comprende una protefna de fusi6n de acuerdo con la Reivindicaci6n 25, en combinaci6n con un agente inmunoestimulante.

34. 31.

    Una vacuna que comprende un polinucle6tido de acuerdo con la Reivindicaci6n 29, en combinaci6n con un agente inmunoestimulante.

35. 32.

    Una vacuna de acuerdo con la Reivindicaci6n 15, 16, 18, 30 o 31, en que el agente inmunoestimulante es un adyuvante.

36. 33.

    Una vacuna de acuerdo con la Reivindicaci6n 15, 16, 18, 30 o 31, en que el agente inmunoestimulante provoca una respuesta predominantemente de Tipo I.

37. 34.

    Una vacuna de acuerdo con la Reivindicaci6n 30 o la Reivindicaci6n 31, para uso en un metodo para inhibir el desarrollo de un cancer de mama en un paciente.

38. 35.

    Un metodo para eliminar celulas tumorales de una muestra biol6gica, que comprende poner la muestra biol6gica en contacto con celulas T que reaccionan especfficamente con una protefna de tumor de mama, en que la protefna tumoral comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la secuencia polinucleotfdica expuesta en la ID. SEC. nO 175, en que la operaci6n de puesta en contacto es llevada a cabo bajo unas condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la eliminaci6n de las celulas que expresan el antfgeno, de la muestra.

39. 36.

    Un metodo de acuerdo con la Reivindicaci6n 35, en que la muestra biol6gica es sangre o una fracci6n de la misma.

40. 37.

    Un metodo para estimular y/o multiplicar celulas T especfficas para una protefna de tumor de mama, llevado a cabo ex vivo, que comprende poner celulas T en contacto con uno o mas de:

    (i)

    un polipeptido de acuerdo con la Reivindicaci6n 1;

    (ii)

    un polinucle6tido que codifica dicho polipeptido; y/o

    (iii) una celula presentadora de antfgenos que expresa dicho polipeptido;

    bajo unas condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la estimulaci6n y/o multiplicaci6n de las celulas T.

41. 38.

    Una poblaci6n aislada de celulas T especffica para una protefna de tumor de mama de acuerdo con la Reivindicaci6n 1, que comprende celulas T obtenibles de acuerdo con el metodo de la Reivindicaci6n 37.

42. 39.

    Una poblaci6n de celulas T de acuerdo con la Reivindicaci6n 38, para uso en un metodo para inhibir el desarrollo de un cancer de mama en un paciente.

43. 40.

    Celulas T CD4+ y/o CD8+ proliferadas, aisladas de un paciente con al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en:

    (i)

    un polipeptido de acuerdo con la Reivindicaci6n 1;

    (ii)

    un polinucle6tido que codifica dicho polipeptido; o

    (iii) una celula presentadora de antfgenos que expresa dicho polipeptido;

    e incubadas de modo que las celulas T proliferen para uso en un metodo para inhibir el desarrollo de un cancer de mama en un paciente.
44. 41. Celulas T de acuerdo con la Reivindicaci6n 40 para uso en un metodo para inhibir el desarrollo de un cancer en un paciente, que comprende las operaciones de:

    (a)

    clonar al menos una celula proliferada; y

    (b)

    administrar al paciente una cantidad eficaz de las celulas T clonadas, e inhibir por ello el desarrollo de un cancer de mama en el paciente.

45. 42. Un metodo para determinar la presencia o ausencia de un cancer de mama en un paciente, que comprende las operaciones de:

    (a)

    poner una muestra biol6gica obtenida del paciente en contacto con un anticuerpo, o un fragmento ligante de antfgenos del mismo, que se une especfficamente a la porci6n, de una protefna de tumor de mama, que es codificada por la secuencia polinucleotfdica expuesta en la ID. SEC. nO 175; y

    (b)

    detectar en la muestra una cantidad de un polipeptido que se une especfficamente al anticuerpo y/o al fragmento ligante de antfgenos del mismo, comparar la cantidad de polipeptido con un valor de corte predeterminado y determinar, a partir de la comparaci6n, la presencia o ausencia de un cancer de mama en el paciente.

46. 43. Un metodo para controlar el progreso de un cancer de mama en un paciente, que comprende las operaciones de:

    (a)

    poner una muestra biol6gica que se obtiene del paciente en un primer punto temporal en contacto con un anticuerpo, o un fragmento ligante de antfgenos del mismo, que se une especfficamente a la porci6n, de una protefna de tumor de mama, que es codificada por la secuencia polinucleotfdica expuesta en la ID. SEC. nO 175;

    (b)

    detectar en la muestra una cantidad de un polipeptido que se une especfficamente al anticuerpo o al fragmento ligante de antfgenos del mismo;

    (c)

    repetir las operaciones (a) y (b) usando una muestra biol6gica obtenida del paciente en un punto temporal posterior; y

    (d)

    comparar la cantidad de polipeptido detectada en la operaci6n (c) con la cantidad detectada en la operaci6n (b) y controlar, a partir de la comparaci6n, el progreso del cancer de mama en el paciente.

47. 44.

    Un metodo de acuerdo con la Reivindicaci6n 42 6 43, en que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

48. 45.

    Un metodo para determinar la presencia o ausencia de un cancer de mama en un paciente, que comprende las

    operaciones de:

    (a)

    poner una muestra biol6gica obtenida del paciente en contacto con un oligonucle6tido que se hibrida con un polinucle6tido que codifica una protefna de tumor de mama, en que la protefna tumoral comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la secuencia polinucleotfdica expuesta en la ID. SEC. nO 175;

    (b)

    detectar en la muestra una cantidad de un polinucle6tido que se hibrida con el oligonucle6tido; y

    (c)

    comparar la cantidad de polinucle6tido que se hibrida con el oligonucle6tido, con un valor de corte predeterminado y determinar, a partir de la comparaci6n, la presencia o ausencia de un cancer de mama en el paciente.

49. 46. Un metodo para controlar el progreso de un cancer de mama en un paciente, que comprende las operaciones de:

    (a)

    poner una muestra biol6gica obtenida del paciente en contacto con un oligonucle6tido que se hibrida con un polinucle6tido que codifica una protefna de tumor de mama, en que la protefna tumoral comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la secuencia polinucleotfdica expuesta en la ID. SEC. nO 175;

    (b)

    detectar en la muestra una cantidad de un polinucle6tido que se hibrida con el oligonucle6tido;

    (c)

    repetir las operaciones (a) y (b) usando una muestra biol6gica obtenida del paciente en un punto temporal posterior; y

    (d)

    comparar la cantidad del polinucle6tido detectado en la operaci6n (c) con la cantidad detectada en la operaci6n (b) y controlar, a partir de la comparaci6n, el progreso del cancer de mama en el paciente.

50. 47.

    Un metodo de acuerdo con la Reivindicaci6n 45 6 46, en que la cantidad del polinucle6tido que se hibrida con el oligonucle6tido se determina utilizando una reacci6n en cadena de la polimerasa.

51. 48.

    Un metodo de acuerdo con la Reivindicaci6n 45 6 46, en que la cantidad del polinucle6tido que se hibrida con el oligonucle6tido se determina usando un ensayo de hibridaci6n.

52. 49.

    Un kit diagn6stico que comprende:

    (a)

    uno o mas anticuerpos de acuerdo con la Reivindicaci6n 17; y

    (b)

    un reactivo de detecci6n que comprende un grupo informador.

53. 50.

    Un kit de acuerdo con la Reivindicaci6n 49, en que los anticuerpos estan inmovilizados sobre un soporte s6lido.

54. 51.

    Un kit de acuerdo con la Reivindicaci6n 50, en que el soporte s6lido comprende nitrocelulosa, latex o un material plastico.

55. 52.

    Un kit de acuerdo con la Reivindicaci6n 49, en que el reactivo de detecci6n comprende una antiinmunoglobulina, protefna G, protefna A o lectina.

56. 53.

    Un kit de acuerdo con la Reivindicaci6n 49, en que el grupo informador es seleccionado del grupo que consiste en radiois6topos, grupos fluorescentes, grupos luminiscentes, enzimas, biotina y partfculas colorantes.

57. 54.

    Un oligonucle6tido que comprende de 10 a 40 nucle6tidos contiguos de un polinucle6tido que codifica una protefna de tumor de mama, en que la protefna tumoral comprende una secuencia de aminoacidos que es codificada por la secuencia polinucleotfdica expuesta en la ID. SEC. nO 175.

58. 55.

    Un oligonucle6tido de acuerdo con la Reivindicaci6n 54, en que el oligonucle6tido comprende 10-40 nucle6tidos contiguos expuestos en la ID. SEC. nO 175.

59. 56.

    Un kit diagn6stico que comprende:

    (a)

    un oligonucle6tido de acuerdo con la Reivindicaci6n 54; y

    (b)

    un reactivo diagn6stico para uso en una reacci6n en cadena de la polimerasa o un ensayo de hibridaci6n.